CN119736186A - 一株拟无枝酸菌yinm00005及其在制备安莎霉素类化合物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株拟无枝酸菌YINM00005及其在制备安莎霉素类化合物中的应用，属于微生物技术领域。所述拟无枝酸菌YINM00005为云南昆明石蝉草内生菌，发酵后可大量代谢新颖的安莎霉素类化合物；发酵步骤主要包括：在适合的培养条件下发酵该菌株得到发酵液，经过溶剂提取浓缩后，结合柱层析法，可制备得到4种安莎霉素类化合物，发酵液中4种安莎霉素类化合物总浓度可达4.5‑8.6mg/L，提取分离后纯度可达98%以上，4种化合物均具有很强的抗肿瘤细胞毒活性。该方法成本较低，过程简单，环境友好，可用于该类安莎霉素类化合物的大量生产制备，不仅满足了低碳经济的需求，而且为后期安莎霉素类化合物的生产和相关产品开发奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及一株拟无枝酸菌YINM00005及其在制备安莎霉素类化合物中的应用，属于微生物技术领域。
背景技术
近年来，因为微生物具有代谢周期短、反应条件温和、副产物少、立体选择性强等特点，通过微生物发酵来制备目标活性化合物的方法越来越受到人们的重视。在实际生产中，已经有大量的应用实例通过微生物发酵来生产一些具有药用价值或经济价值的化合物。
安莎霉素（ansamycins）是一类聚酮类化合物。这类抗生素的毒性低、疗效高且抗菌谱较广，可特异性地与依赖DNA的RNA聚合酶作用，抑制细菌DNA的转录过程；而且对肿瘤RNA病毒的依赖RNA的DNA逆转录酶有抑制作用。广泛应用于治疗G＋（革兰氏阳性菌）、结核病、麻风病和与艾滋病有关的分枝杆菌感染。综上所述，安莎霉素类化合物作为药物先导化合物具有较好的研究开发潜力。
目前安莎霉素类化合物的获得主要通过微生物发酵代谢产物的分离纯化，而能够代谢产生安莎霉素类化合物的菌株多为植物或土壤来源放线菌，它们代谢安莎霉素类化合物的产量低，过低的产量使得对安莎霉素类化合物的开发利用受到制约。
拟无枝酸菌（Amycolatopsis sp.）YINM00005是从云南昆明石蝉草中获得的内生放线菌，对其次级代谢产物的分析发现，新颖的安莎霉素类化合物的产量较大且易于分离纯化，因此该菌株具有作为工程菌生产新型安莎霉素类化合物的开发潜力。
发明内容
本发明的目的之一是提供一株拟无枝酸菌YINM00005，所述拟无枝酸菌YINM00005已于2023年7月19日保藏于广东省微生物菌株保藏中心（简称GDMCC）保藏，保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC No.63669，分类学命名为：Amycolatopsis sp.。
本发明的目的之二是提供一种拟无枝酸菌YINM00005在制备新型安莎霉素类化合物中的应用。
本发明制备得到的新型安莎霉素类化合物有4种，其中第一种化合物结构如式Ⅰ所示；
式Ⅰ。
第二种化合物结构如式Ⅱ所示；
式Ⅱ。
第三种化合物结构如式Ⅲ所示；
式Ⅲ。
第四种化合物结构如式Ⅳ所示；
式Ⅳ。
本发明的第三个目的是提供一种拟无枝酸菌YINM00005制备新型安莎霉素类化合物的方法，主要包括如下步骤：
（1）菌体活化：将拟无枝酸菌YINM00005接种到菌株活化培养基中活化备用。
（2）菌种制备：将步骤（1）中活化好的菌体接入种子培养基中进行培养得到菌种。
（3）发酵过程：将步骤（2）中制备好的菌种接种于发酵培养基中进行发酵培养，得到发酵液。
（4）发酵结束后，发酵液用等体积的乙酸乙酯萃取，浓缩得到粗提物，粗提物用二氯甲烷-甲醇溶解后与硅胶混合均匀，采用二氯甲烷-甲醇溶液进行正向硅胶柱层析梯度洗脱，得到洗脱液。
（5）选取步骤（4）得到的洗脱液与硅胶混合均匀，采用水-甲醇进行反向硅胶柱层析梯度洗脱，最后使用半制备高效液相色谱纯化得到式Ⅰ~式Ⅳ所示的化合物。
优选的，步骤（1）中活化培养基的成分为：酵母提取物4.0g/L，葡萄糖4.0g/L，麦芽提取物10.0g/L，琼脂15.0g/L，pH7.0，培养温度为28℃，培养时间为3d。
优选的，步骤（2）中种子培养基的成分为：酵母提取物4.0g/L，葡萄糖4.0g/L，麦芽提取物10.0g/L，pH7.0；培养温度为28℃，培养时间为3d。
优选的，步骤（3）中发酵培养基的成分为：丙三醇50g/L，玉米粉25g/L，酵母粉5g/L，pH7.0；菌种的接种量为发酵培养基体积的5~10%；培养温度为28℃，培养时间为10~15d。
优选的，步骤（4）中乙酸乙酯萃取3次；溶解粗提物使用的二氯甲烷-甲醇溶液中，二氯甲烷与甲烷的体积比为1:1；所用硅胶为200-300目硅胶。
优选的，步骤（4）正向硅胶柱层析梯度洗脱中二氯甲烷-甲醇洗脱液中二氯甲烷与甲醇的体积比依次为100:0、50:1、30:1、10:1、5:1、0:100，选取二氯甲烷与甲醇的体积比为30:1的洗脱液进行步骤（5）的操作。
优选的，步骤（5）中所用硅胶的粒度为40-60μm。
优选的，步骤（5）反向硅胶柱层析梯度洗脱中水-甲醇洗脱液中水与甲醇的体积比依次为90:10、80:20、70:30、60:40、50:50、40:60、30:70、20:80、10:90、0:100，其中体积比为60:40的水-甲醇洗脱液中含式Ⅰ所示化合物；其中体积比为50:50的水-甲醇洗脱液中含有式Ⅱ所示化合物；其中体积比为40:60的水-甲醇洗脱液中含有式Ⅲ所示化合物；其中体积比为30:70的水-甲醇洗脱液中含有式Ⅳ所示化合物。
本发明的第四个目的是提供了一种新型安莎霉素类化合物在制备治疗白血病、肺癌、肝癌、乳腺癌或结肠癌药物中的应用。
本发明的有益效果
（1）本发明提供了一株能高产安莎霉素的拟无枝酸菌（Amycolatopsis sp.）YINM00005，该菌株可产生4种新型的安莎霉素，且产量高。
（2）本发明首次合成了4种新型安莎霉素，丰富了安莎霉素的种类。
（3）本发明方法采用的原料便宜易得，反应条件温和、过程简单，设备要求简单，环境无污染，适宜扩大化生产安莎霉素类化合物。
附图说明
图1为本发明提供的化合物amycolansamycin A的1H-NMR谱。
图2为本发明提供的化合物amycolansamycin A的13C-NMR谱。
图3为本发明提供的化合物amycolansamycin A的1H-1H COSY谱。
图4为本发明提供的化合物amycolansamycin A的HMBC谱。
图5为本发明提供的化合物amycolansamycin A的HSQC谱。
图6为本发明提供的化合物amycolansamycin A的ROESY谱。
图7为本发明提供的化合物amycolansamycin A的HR-ESI-MS谱。
图8为本发明提供的化合物amycolansamycin B的1H-NMR谱。
图9为本发明提供的化合物amycolansamycin B的13C-NMR谱。
图10为本发明提供的化合物amycolansamycin B的1H-1H COSY谱。
图11为本发明提供的化合物amycolansamycin B的HMBC谱。
图12为本发明提供的化合物amycolansamycin B的HSQC谱。
图13为本发明提供的化合物amycolansamycin B的ROESY谱。
图14为本发明提供的化合物amycolansamycin B的HR-ESI-MS谱。
图15为本发明提供的化合物amycolansamycin C的1H-NMR谱。
图16为本发明提供的化合物amycolansamycin C的13C-NMR谱。
图17为本发明提供的化合物amycolansamycin C的1H-1H COSY谱。
图18为本发明提供的化合物amycolansamycin C的HMBC谱。
图19为本发明提供的化合物amycolansamycin C的HSQC谱。
图20为本发明提供的化合物amycolansamycin C的ROESY谱。
图21为本发明提供的化合物amycolansamycin C的HR-ESI-MS谱。
图22为本发明提供的化合物amycolansamycin D的1H-NMR谱。
图23为本发明提供的化合物amycolansamycin D的13C-NMR谱。
图24为本发明提供的化合物amycolansamycin D的1H-1H COSY谱。
图25为本发明提供的化合物amycolansamycin D的HMBC谱。
图26为本发明提供的化合物amycolansamycin D的HSQC谱。
图27为本发明提供的化合物amycolansamycin D的ROESY谱。
图28为本发明提供的化合物amycolansamycin D的HR-ESI-MS谱。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。但下述的实施例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准，未经特殊说明的技术操作为本领域技术人员熟知的操作。
将采自云南昆明的石蝉草通过次氯酸钠溶液（有效氯浓度5.0%）、75%乙醇浸泡和无菌水洗涤工艺进行表面灭菌，然后把处理成小块的植物组织植入121°C灭菌的活化培养基中，28°C培养7天后使用121°C灭菌的活化培养基连续纯化得到内生菌Amycolatopsis sp.YINM00005，保藏编号为GDMCC No.63669。
本发明所述无枝酸菌YINM00005为稀有放线菌，在MS培养基上其表面光滑，有少量灰色孢子产生，有大量白色菌丝体生成。拟无枝酸菌YINM00005的16s RNA序列如SEQ IDNo.1所示：
TTGGAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGCTGAACCACTTCGGTGGGGATGAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTAATCTGCCCTGCACTCTGGGATAAGCCTTGGAAACGAGGTCTAATACCGGATATCACTTCTCTAGGCATCTAGAGTTGTTGAAAGTTCTGGCGGTGCAGGATGAACCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCGCCAGGGACGAAGCGCAAGTGACGGTACCTGGATAAGAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGTTTGTCGCGTCGGCCGTGAAATCTCCACGCTTAACGTGGAGCGTGCGGTCGATACGGGCAGACTTGAGTTCGGTAGGGGAGACTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGGTCTCTGGGCCGATACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGTTGGGCGCTAGGTGTGGGCGACATCCACGTTGTCCGTGCCGTAGCTAACGCATTAAGCGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGGCTTGACATGCGCCAGACATCCCCAGAGATGGGGCTTCCCTTGTGGTTGGTGTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTACGTTGCCAGCGCGTTATGGCGGGGACTCGTGGGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCCAGGGCTTCACACATGCTACAATGGCTGGTACAGAGGGCTGCGATACCGCGAGGTGGAGCGAATCCCTTAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCATGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCCATGGCCCAACCCGCAAGGGAGGGAGTGGTCGAAGGTGGGACTGGCGATTGGGACGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTACCGGAAGGTGCGGCTGGATCACCTCCTTT。
实施例中所用培养基的配方如下所述，所有培养基需要在121°C高温灭菌20min后使用。
（1）活化培养基的成分为：酵母提取物4.0g/L，葡萄糖4.0g/L，麦芽提取物10.0g/L，琼脂15.0g/L，pH7.0；
（2）种子培养基的成分为：酵母提取物4.0g/L，葡萄糖4.0g/L，麦芽提取物10.0g/L，pH7.0；
（3）发酵培养基的成分为：丙三醇50g/L，玉米粉25g/L，酵母粉5g/L，pH7.0。
实施例1
用无枝酸菌YINM00005在制备新型安莎霉素类化合物，具体包括以下步骤：
（1）菌体活化：将拟无枝酸菌YINM00005接种到活化培养基中，置于28°C恒温培养箱中培养3d后，置于4°C冰箱中备用。
（2）菌种制备：将活化的菌体接入种子培养基中，28°C，180rpm下进行发酵3d。
（3）发酵过程：将步骤（2）制备好的菌种按照体积分数5%加入20L发酵培养基中（丙三醇50g/L，玉米粉25g/L，酵母粉5g/L，pH7.0），28°C，180rpm下进行发酵15d，得到发酵液。
（4）发酵结束后，用等体积的乙酸乙酯萃取发酵液三次，真空浓缩得到粗提物（32.90g），经高效液相色谱检测粗提物，将浓缩得到粗提物溶解于适量二氯甲烷-甲醇混合溶液，得到粗提物溶液；将准备好的粗提物溶液与200-300目硅胶用玻璃棒搅拌混匀，缓慢搅拌待溶剂完全挥干，依次采用体积比为100:0、50:1、30:1、10:1、5:1、0:100的二氯甲烷-甲醇溶液进行正向硅胶（200-300目）柱层析梯度洗脱，分别得到6份洗脱液。
（5）取适量6份洗脱液进行TLC点板和HPLC分析，依据TLC点板及HPLC分析结果选取二氯甲烷-甲醇体积比为30:1的洗脱液，用滴管将该洗脱液缓慢滴加在准备好的脱脂棉上，室温放置待溶剂完全挥干，上样之后依次采用体积比为90:10、80:20、70:30、60:40、50:50、40:60、30:70、20:80、10:90、0:100的水-甲醇溶液进行反向硅胶柱（40-60μm）层析梯度洗脱，得到10份洗脱液。
依据TLC点板及HPLC分析结果选取水-甲醇体积比为60:40的洗脱液，进行半制备高效液相色谱（Semi-preparative HPLC）纯化得到化合物A（172.0mg）。经HPLC分析化合物A的纯度达到98%以上。
依据TLC点板及HPLC分析结果选取水-甲醇体积比为50:50的洗脱液，进行半制备高效液相色谱（Semi-preparative HPLC）纯化得到化合物B（132.0mg）；经HPLC分析化合物B的纯度达到98%以上。
依据TLC点板及HPLC分析结果选取水-甲醇体积比为40:60的洗脱液，进行半制备高效液相色谱（Semi-preparative HPLC）纯化得到化合物C（116.0mg）；经HPLC分析化合物C的纯度达到98%以上。
依据TLC点板及HPLC分析结果选取水-甲醇体积比为30:70的洗脱液，进行半制备高效液相色谱（Semi-preparative HPLC）纯化得到化合物D（90.0mg）；经HPLC分析化合物D的纯度达到98%以上。
最终经高效液相色谱分析，发酵液中化合物A浓度为8.6mg/L；化合物B浓度为6.6mg/L；化合物C浓度为5.8mg/L；化合物D浓度为4.5mg/L。
实施例2
用无枝酸菌YINM00005在制备新型安莎霉素类化合物，具体包括以下步骤：
（1）菌体活化：将拟无枝酸菌YINM00005接种到活化培养基中，置于28°C恒温培养箱中培养3d后，置于4°C冰箱中备用。
（2）菌种制备：将活化的菌体接入种子培养基中，28°C，200rpm下进行发酵3d。
（3）发酵过程：将步骤（2）制备好的菌种按照体积分数10%加入20L发酵培养基中（丙三醇50g/L，玉米粉25g/L，酵母粉5g/L，pH7.0），28°C，200rpm下进行发酵10d，得到发酵液。
（4）发酵结束后，用等体积的乙酸乙酯萃取发酵液三次，真空浓缩得到粗提物（18.90g），经高效液相色谱检测粗提物，将浓缩得到粗提物溶解于适量二氯甲烷-甲醇混合溶液，得到粗提物溶液；将准备好的粗提物溶液与200-300目硅胶用玻璃棒搅拌混匀，缓慢搅拌待溶剂完全挥干，依次采用体积比为100:0、50:1、30:1、10:1、5:1、0:100的二氯甲烷-甲醇溶液进行正向硅胶（200-300目）柱层析梯度洗脱，分别得到6份洗脱液。
（5）取适量6份洗脱液进行TLC点板和HPLC分析，依据TLC点板及HPLC分析结果选取二氯甲烷-甲醇体积比为30:1的洗脱液，用滴管将该洗脱液缓慢滴加在准备好的脱脂棉上，室温放置待溶剂完全挥干，上样之后依次采用体积比为90:10、80:20、70:30、60:40、50:50、40:60、30:70、20:80、10:90、0:100的水-甲醇溶液进行反向硅胶柱（40-60μm）层析梯度洗脱，得到10份洗脱液。
依据TLC点板及HPLC分析结果选取水-甲醇体积比为60:40的洗脱液，进行半制备高效液相色谱（Semi-preparative HPLC）纯化得到代谢产物安莎霉素类化合物A（148.0mg）。经HPLC分析化合物A的纯度达到98%以上。
依据TLC点板及HPLC分析结果选取水-甲醇体积比为50:50的洗脱液，进行半制备高效液相色谱（Semi-preparative HPLC）纯化得到化合物B（104.0mg）；经HPLC分析化合物B的纯度达到98%以上。
依据TLC点板及HPLC分析结果选取水-甲醇体积比为40:60的洗脱液，进行半制备高效液相色谱（Semi-preparative HPLC）纯化得到化合物C（92.0mg）；经HPLC分析化合物C的纯度达到98%以上。
依据TLC点板及HPLC分析结果选取水-甲醇体积比为30:70的洗脱液，进行半制备高效液相色谱（Semi-preparative HPLC）纯化得到化合物D（96.0mg）；经HPLC分析化合物D的纯度达到98%以上。
最终经高效液相色谱分析，发酵液中化合物A浓度为7.4mg/L；化合物B浓度为5.2mg/L；化合物C浓度为4.6mg/L；化合物D浓度为4.8mg/L。
实施例3
所得到的新型安莎霉素化合物结构的鉴定
取实施例1分离得到的化合物A，通过一维核磁共振波谱（1D-NMR）、二维核磁共振波谱（2D-NMR）和高分辨电喷雾电离质谱（HR-ESI-MS）（图1-7）鉴定其结构。
由HSQC谱结合碳谱可以得到，化合物A的H和与之相连接的C的化学位移δ归属如表一所示：
表1为实施例1分离得到的化合物A的1H（500MHz）和13C（125MHz）NMR数据，methanol-d4为溶剂。
表1实施例1分离得到的化合物A的1H（500MHz）和13C（125MHz）NMR数据
如图7所示，化合物 A的HR-ESI-MS m/z：[M+H]+准分子离子峰为487.2802（C27H39N2O6[M+H]+，calc m/z：487.2803）表明其分子式为C27H38N2O6，含有9个不饱和度。通过对该化合物的1H-NMR（图1），13C-NMR（图2）和HSQC（图5）谱图分析可知，化合物A中含有4个甲基[δH 0.68（H3-22），δH 0.92（H3-23），δH 1.23（H3-25），δH 0.81（H3-27）分别对应δC 17.2（C-22），δC 21.4（C-23），δC 17.5（C-25），δC 14.1（C-27）]，6个亚甲基[δH 2.05（Ha-8），1.25（Hb-8），δH 2.03（Ha-10），1.41（Hb-10），δH 1.58（Ha-11），0.88（Hb-11），δH 1.31（Ha-13），1.14（Hb-13），δH 2.89（Ha-15），1.80（Hb-15），δH 2.26（Ha-26），1.96（Hb-26）分别对应δC 41.7（C-8），δC38.1（C-10），δC 29.2（C-11），δC 47.9（C-13），δC 42.3（C-15），δC 21.6（C-26）]，9个次甲基[δH 5.86（H-2），δH 7.06（H-3），δH 5.47（H-5），δH 2.72（H-6），δH 4.11（H-7），δH 1.49（H-12），δH 1.89（H-14），δH 6.49（H-19），δH 6.53（H-21）分别对应δC 119.2（C-2），δC 146.0（C-3），δC 140.1（C-5），δC 40.0（C-6），δC 78.7（C-7），δC 32.0（C-12），δC 30.7（C-14），δC 113.3（C-19），δC 119.7（C-21）]以及8个季碳[δC 171.9（C-1），δC 142.6（C-4），δC 81.6（C-9），δC126.4（C-16），δC 132.9（C-17），δC 146.3（C-18），δC 150.9（C-20），δC 156.0（C-24）]。
分析1H-1H COSY（图3）谱图相关可知，H-5/H-6/H-7/Ha/b-8有明确的相关性，Ha/b-10/ Ha/b-11/H-12/ Ha/b-13/H-14/ Ha/b-15有明确的相关性，可归属两个碎片分别从C-5到C-8和C-10到C-15，进一步分析HMBC谱图（图4）可知，H3-22对C-13/C-14/C-15有明显相关信号，H3-23对C-11/C-12/C-13有明显相关信号，Ha/b-8和Ha/b-10对C-9有明显相关信号，H3-25对C-5/C-6/C-7有明显相关信号，以上相关表明从C-5到C-15是连续的且有三个甲基连接在碳链上。由1H-NMR可知，δH 6.49和δH 6.53都为二重峰，再根据HMBC相关可知，H-19对C-18/C-20/C-21有相关，H-21对C-16/C-20/C-19有相关，以上相关表明可能存在一个苯环发色团。根据HMBC相关中Ha/b-15对C-21有明显相关性，因此证明C-5到C-15片段连接在苯环发色团上。根据H-2、H-3和H-5的化学位移值及耦合常数可判断C-2/C-3可能为双键连接，C-4/C-5可能为双键连接且C-4为季碳，以上假设通过1H-1H COSY（H-2/H-3和H-5/H-6）相关及HMBC（H-3对C-2/C-4/C-5）相关证实。根据13C-NMR可知，δC 156.0（C-24）和δC 171.9（C-1）可能为酰胺碳的共振，根据HMBC（-NH-到C-24、-NH-到C-1）相关可证明酰胺碳的存在。根据HMBC（-NH-到C-17/C-18/C-19）相关证明该化合物类型是大环内酰胺类，查询相关文献该分子为未报道新安莎霉素类化合物，命名为amycolansamycin A。
为确定其相对构型，结合NOESY谱及相关文献分析，鉴定amycolansamycin A的相对构型为6R*， 7S*， 9R*，12R*，14S*。为了确定amycolansamycin A的绝对立体构型，对其两种可能的立体异构体[(6R，7S，9R，12R，14S)和(6S，7R，9S，12S，14R)]进行构象搜索，并对分布比例大于1%的构象利用TD-DFT理论在B3LYP/6-31G(d)水平下应用计算软件进行ECD计算，通过与实验ECD谱图进行比较，发现其中的异构体(6S，7S，9R，12R，14S)-amycolansamycin A的计算结果和实验结果高度匹配，都具有相同的Cottons效应。因此鉴定化合物amycolansamycin A的绝对构型为6R，7S，9R，12R，14S。
综上所述，可以确定实施例1中分离得到的化合物结构式为：
取实施例1分离得到的化合物B，通过一维核磁共振波谱（1D-NMR）、二维核磁共振波谱（2D-NMR）和高分辨电喷雾电离质谱（HR-ESI-MS）（图8-14）鉴定其结构。
由HSQC谱结合碳谱可以得到，化合物B的H和与之相连接的C的化学位移δ归属如表二所示：
表2实施例1分离得到的化合物B的1H（500MHz）和13C（125MHz）NMR数据，methanol-d4为溶剂。
表2实施例1分离得到的化合物B的1H（500MHz）和13C（125MHz）NMR数据
如图14所示，化合物B的HR-ESI-MS m/z：[M+H]+准分子离子峰为501.2964（C28H41N2O6[M+H]+，calc m/z：501.2959）表明其分子式为C28H40N2O6，含有9个不饱和度。根据HR-ESI-MS、1H-NMR和13C-NMR和化合物amycolansamycin A比较可知，化合物B多一个甲氧基，根据1H-NMR及HMBC（H3-28到C-9）相关可知，C-9位上连接的羟基替换成-OCH3，将化合物B命名为amycolansamycin B，为确定其相对构型，结合NOESY谱及相关文献分析，鉴定amycolansamycin B的相对构型为6R*，7S*，9R*，12R*，14S*。为了确定amycolansamycin B的绝对立体构型，对其两种可能的立体异构体[(6R，7S，9R，12R，14S)和(6S，7R，9S，12S，14R)]进行构象搜索，并对分布比例大于1%的构象利用TD-DFT理论在B3LYP/6-31G(d)水平下应用计算软件进行ECD计算，通过与实验ECD谱图进行比较，发现其中的异构体(6R，7S，9R，12R，14S)-amycolansamycin B的计算结果和实验结果高度匹配，都具有相同的Cottons效应。因此鉴定化合物amycolansamycin B的绝对构型为6R，7S，9R，12R，14S。
综上所述，可以确定实施例1中分离得到的化合物结构式为：
取实施例1分离得到的化合物C，通过一维核磁共振波谱（1D-NMR）、二维核磁共振波谱（2D-NMR）和高分辨电喷雾电离质谱（HR-ESI-MS）（图15-21）鉴定其结构。
由HSQC谱结合碳谱可以得到，化合物C的H和与之相连接的C的化学位移δ归属如表三所示：
表3实施例1分离得到的化合物C的1H（600MHz）和13C（150MHz）NMR数据，methanol-d4为溶剂。
表3实施例1分离得到的化合物C的1H（600MHz）和13C（150MHz）NMR数据
如图21所示，化合物C的HR-ESI-MS m/z：[M+H]+准分子离子峰为487.2804（C27H39N2O6[M+H]+，calc m/z：487.2803）表明其分子式为C27H38N2O6，含有9个不饱和度。根据HR-ESI-MS、1H-NMR和13C-NMR和化合物amycolansamycin B比较可知，化合物C的C-4位上的-CH2CH3替换成一个甲基，根据1H-NMR及HMBC（H3-26到C-3/C-4/C-5、-OCH3-9到C-9）相关可知，C-4位上连接的-CH2CH3替换成一个-CH3，将化合物C命名为amycolansamycin C。为确定其相对构型，结合NOESY谱及相关文献分析，鉴定amycolansamycin C的相对构型为6R*，7S*，9R*，12R*，14S*。为了确定amycolansamycin C的绝对立体构型，对其两种可能的立体异构体[(6R，7S，9R，12R，14S)和(6S，7R，9S，12S，14R)]进行构象搜索，并对分布比例大于1%的构象利用TD-DFT理论在B3LYP/6-31G(d)水平下应用计算软件进行ECD计算，通过与实验ECD谱图进行比较，发现其中的异构体(6R，7S，9R，12R，14S)-amycolansamycin C的计算结果和实验结果高度匹配，都具有相同的Cottons效应。因此鉴定化合物amycolansamycin C的绝对构型为6R，7S，9R，12R，14S。
综上所述，可以确定实施例1中分离得到的化合物结构式为：
取实施例1分离得到的化合物D，通过一维核磁共振波谱（1D-NMR）、二维核磁共振波谱（2D-NMR）和高分辨电喷雾电离质谱（HR-ESI-MS）（图22-28）鉴定其结构。
由HSQC谱结合碳谱可以得到，化合物amycolansamycin D的H和与之相连接的C的化学位移δ归属如表四所示：
表4实施例1分离得到的化合物D的1H（600MHz）和13C（150MHz）NMR数据，methanol-d4为溶剂。
表4实施例1分离得到的化合物D的1H（600MHz）和13C（150MHz）NMR数据
如图28所示，化合物D的HR-ESI-MS m/z：[M+H]+准分子离子峰为426.2637（C26H36NO4[M+H]+，calc m/z：426.2639）表明其分子式为C26H35NO4，含有10个不饱和度。根据HR-ESI-MS、1H-NMR和13C-NMR和化合物amycolansamycin A比较可知，化合物amycolansamycin D在C-7/C-8/C-9上少了一个氨基甲酸酯片段，C-9（δC 205.0）变为羰基碳且在C-7/C-8之间多一个双键，根据1H-NMR及HMBC（H-7/H-8/Ha/b-10到C-9）相关可证明以上推断，将化合物D命名为amycolansamycin D。为确定其相对构型，结合NOESY谱及相关文献分析，鉴定amycolansamycin D的相对构型为6R*，12R*，14S*。为了确定amycolansamycinD的绝对立体构型，对其两种可能的立体异构体[(6R，12R，14S)和(6S，12S，14R)]进行构象搜索，并对分布比例大于1%的构象利用TD-DFT理论在B3LYP/6-31G(d)水平下应用计算软件进行ECD计算，通过与实验ECD谱图进行比较，发现其中的异构体(6R，12R，14S)-amycolansamycin D的计算结果和实验结果高度匹配，都具有相同的Cottons效应。因此鉴定化合物amycolansamycin D的绝对构型为6R，12R，14S。
综上所述，可以确定实施例1中分离得到的化合物结构式为：
实施例4
实施例1制备得到的Amycolansamycins A-D抗肿瘤细胞毒活性筛选
MTS法检测细胞活性原理：MTS为一种全新的MTT类似物，全称为3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-5(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfopheny)-2H-tetrazolium（3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-5-（3-羧甲基苯氧基）-2-（4-磺基苯基）-2H-四唑），是一种黄颜色的染料。活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶能够代谢还原MTS，生成可溶性的甲臜（Formazan）化合物，甲臜的含量可以用酶标仪在490nm处进行测定。在通常情况下，甲臜生成量与活细胞数成正比，因此可根据光密度OD值推测出活细胞的数目。
本实施例使用的细胞有白血病HL-60细胞、肺癌A549细胞、肝癌SMMC-7721细胞、乳腺癌MDA-MB-231细胞和结肠癌SW480细胞。
实验方法如下：
接种细胞：用含10％胎牛血清的培养液（DMEM或者RMPI1640）配成单个细胞悬液，以每孔3000~15000个细胞接种到96孔板，每孔体积100μL，细胞提前24小时接种培养。
加入待测化合物溶液：化合物用DMSO溶解，化合物以40μM浓度初筛，每孔终体积200μL，每种处理均设3个复孔。
显色：37摄氏度培养48小时后，贴壁细胞弃孔内培养液，每孔加MTS溶液20μL和DMEM培养液100μL；悬浮细胞弃100μL培养上清液，每孔加20μL的MTS溶液；设3个空白复孔（MTS溶液20μL和培养液100μL的混合液），继续孵育2~4小时，使反应充分进行后测定光吸收值。
比色：选择492nm波长，多功能酶标仪（MULTISKAN FC）读取各孔光吸收值，记录结果，数据处理后以化合物编号为横坐标，细胞抑制率为纵坐标绘制细胞的抑制率图。
阳性对照化合物：每次实验均设顺铂（DDP）和紫杉醇（Taxol）两个阳性化合物，以浓度为横坐标，细胞存活率为纵坐标绘制细胞生长曲线，应用两点法（Reed and Muench法）计算化合物的IC50值。初筛结果见表5。
表5化合物amycolansamycins A-D在40μM浓度下细胞抑制率（%）初筛结果
在40μM浓度下，化合物amycolansamycins A-D对白血病HL-60、肺癌A549、肝癌SMMC-7721、乳腺癌MDA-MB-231和结肠癌SW480的体外肿瘤生长有较好的抑制活性，接下来继续做肿瘤细胞毒活性化合物筛选（IC50检测）。
与初筛同样的方法，化合物分别以40μM、8μM、1.6μM、0.32μM、0.064μM浓度复筛，以顺铂为阳性对照，复筛结果见表6。
表6化合物Amycolansamycins A-D对5株肿瘤细胞株半数抑制浓度值（μM）
化合物amycolansamycins A-D对白血病HL-60、肺癌A549、肝癌SMMC-7721、乳腺癌MDA-MB-231和结肠癌SW480的体外肿瘤生长半数抑制浓度如表2所示，IC50值在0.149±0.017至25.11±0.68μM之间。
Claims (7)
1.一株拟无枝酸菌（Amycolatopsissp.）YINM00005，保藏编号为GDMCC No.63669。
2.权利要求1所述拟无枝酸菌YINM00005在制备安莎霉素类化合物中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：制备的安莎霉素类化合物如下：
式Ⅰ；式Ⅱ；
式Ⅲ；式Ⅳ。
4.权利要求3所述应用，其特征在于：所述安莎霉素类化合物的具体制备步骤如下：
（1）菌体活化：将拟无枝酸菌YINM00005接种到活化培养基中活化备用；
（2）菌种制备：将步骤（1）中活化好的菌体接入种子培养基中摇床培养得到菌种；
（3）发酵过程：将步骤（2）中制备好的菌种接种于发酵培养基中摇床发酵培养，得到发酵液；
（4）发酵结束后，发酵液用等体积的乙酸乙酯萃取，浓缩得到粗提物，粗提物用二氯甲烷-甲醇溶解后与硅胶混合均匀，采用二氯甲烷-甲醇洗脱液进行正向硅胶柱层析梯度洗脱，得到洗脱液；
（5）选取步骤（4）得到的洗脱液与硅胶混合均匀，采用水-甲醇洗脱液进行反向硅胶柱层析梯度洗脱，最后使用半制备高效液相色谱纯化得到式Ⅰ~式Ⅳ所示的化合物。
5.根据权利要求4所述应用，其特征在于：步骤（4）正向硅胶柱层析梯度洗脱中所用二氯甲烷-甲醇洗脱液中二氯甲烷与甲醇的体积比依次为100:0、50:1、30:1、10:1、5:1、0:100，选取二氯甲烷与甲醇的体积比为30:1的洗脱液进行步骤（5）的操作。
6.根据权利要求4所述应用，其特征在于：步骤（5）反向硅胶柱层析梯度洗脱中所用水-甲醇洗脱液中水与甲醇的体积比依次为90:10、80:20、70:30、60:40、50:50、40:60、30:70、20:80、10:90、0:100，其中体积比为60:40的水-甲醇洗脱液中含式Ⅰ所示化合物；其中体积比为50:50的水-甲醇洗脱液中含有式Ⅱ所示化合物；其中体积比为40:60的水-甲醇洗脱液中含有式Ⅲ所示化合物；其中体积比为30:70的水-甲醇洗脱液中含有式Ⅳ所示化合物。
7.权利要求3所述应用制得的安莎霉素类化合物在制备治疗白血病、肺癌、肝癌、乳腺癌或结肠癌药物中的应用。
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| CN119613337A (zh) * | 2024-11-21 | 2025-03-14 | 云南大学 | 新型安莎霉素类化合物及其制备方法和应用 |
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