CN119735820B - 一种含硒超支化聚合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种含硒超支化聚合物及其制备方法和应用，属于智能仿生材料制备技术领域。该制备方法包括如下步骤：制备化合物M1；制备超支化聚合物；M1溶于无水二氯甲烷，加入无水DMF和草酰氯，搅拌，减压去除溶剂和过量草酰氯，得反应物A；氮气保护下，超支化聚合物和三乙胺悬浮于无水四氢呋喃，搅拌，得反应物B；反应物A溶解于无水四氢呋喃，滴加至反应物B中，升温至室温，搅拌，除去溶剂，溶解于无水四氢呋喃，透析，得含硒超支化聚合物。本发明提供了一种含硒超支化聚合物及其制备方法和应用，该含硒超支化聚合物在抗癌活性方面表现出色，能够快速改变细胞内pH值，诱导癌细胞凋亡。

Description

一种含硒超支化聚合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于智能仿生材料制备技术领域，具体涉及一种含硒超支化聚合物及其制备方法和应用。

背景技术

天然通道蛋白，如酸感应离子通道(ASIC)、ATP敏感钾离子通道(KATP)和人类电压门控质子通道(Hv1)，在细胞膜上形成通道，控制离子和水分子等物种的跨膜运输，对维持生物体的正常生理功能至关重要。这些通道蛋白的病变失常通常会导致心肌病、囊性纤维化病等一系列疾病的产生。Hv1通道特别重要，因为它能有效调节细胞内质子外流，影响活性氧的产生，进而调节其他生理活动的正常运转，其功能障碍与包括慢性疼痛在内的多种疾病有关。

受此启发，仿生化学家们一直致力于开发人工跨膜传输系统，以模拟天然通道蛋白的高传输效率、显著的离子选择性和门控特性。然而，开发同时满足这些特征的人工系统极具挑战性，尤其是人工质子通道的选择性和传输速率。超支化聚合物(HBPs)作为一种具有内腔和大量功能基团的三维大分子，在药物输送、纳米材料、分子传感等领域引起了极大的兴趣和应用。HBPs的三维结构和丰富的功能基团使其在模拟天然质子通道的选择性质子传输方面具有潜力，并且硒化物的引入可能通过调节HBPs嵌入磷脂膜的能力来影响离子运输，显示出整合天然通道蛋白多种特性的潜力。因此，以含硒HBPs为基础的合成系统可能在脂质双分子层和细胞膜上高效和选择性地传输质子，同时表现出可控的行为，为开发新型人工质子通道提供了一个有前景的研究方向。

发明内容

本发明旨在提供一种超支化聚合物及其制备方法和应用，该含硒超支化聚合物在抗癌活性方面表现出色，能够快速改变细胞内pH值，诱导癌细胞凋亡，对黑色素瘤B16F10和恶性胶质瘤U87MG两种癌细胞株显示出显著的毒性。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种含硒超支化聚合物的制备方法，包括以下步骤：

S1、制备化合物M1；

S2、制备超支化聚合物；

S3、将步骤S1得到的化合物M1溶于无水二氯甲烷，加入无水DMF和草酰氯，加热搅拌过夜，减压去除溶剂和过量草酰氯，得反应物A；

S4、在氮气保护下，将步骤S2得到的超支化聚合物和三乙胺悬浮于无水四氢呋喃，0℃搅拌5min，得反应物B；

S5、将步骤S3得到的反应物A溶解于无水四氢呋喃，搅拌均匀，滴加至步骤S4中的反应物B中，滴加结束，升温至室温，搅拌过夜，旋转蒸发仪除去溶剂，溶解于无水四氢呋喃，在体积比为1:1的四氢呋喃-水混合体系透析24h，得到含硒超支化聚合物。

优选的，步骤S1中，所述化合物M1制备方法包括如下步骤：

A1、将二甲基二硒化物溶于无水乙醇，搅拌均匀，0℃下缓慢加入硼氢化钠，0℃搅拌30min，得混合物A；

A2、将2-氯乙酯溶于无水乙醇，搅拌均匀，加入到步骤A1得到的混合溶液A中，0℃搅拌1h，得混合物B；

A3、向步骤A2得到的混合物中依次蒸馏水和无水乙醇，萃取分离有机层，依次用蒸馏水和盐水洗涤，保留有机相，减压去除溶剂，得混合物C；

A4、将步骤A3得到的混合物C溶解于质量份数为99％的乙醇中，加入KOH水溶液，室温下搅拌过夜，再依次加入蒸馏水和乙醚，浓盐酸酸化至pH＝2，乙醚萃取，蒸馏水洗涤有机层，无水Na2SO4干燥，旋转蒸发仪除去溶剂，得到M1。

优选的，步骤S2中，所述超支化聚合物制备方法包括如下步骤：

B1、在氮气保护下，圆底烧瓶中加入无水二氯甲烷和三氟化硼二乙醚，得混合物D；

B2、通过滴液漏斗在5min内将3-乙基-3-(羟甲基)-氧杂环丁烷加入到步骤B1得到的混合物D中，-20-30℃反应48-54h，乙醇猝灭反应，加入到超纯水中，过滤，80℃真空干燥180min，得到超支化聚合物。

优选的，步骤S3中，所述将步骤S1得到的化合物M1溶于无水二氯甲烷，加入无水DMF和草酰氯，在氮气保护下，60℃加热回流搅拌过夜。

优选的，步骤S5中，四氢呋喃-水混合体系中无水四氢呋喃和蒸馏水体积比为1:1。

优选的，步骤S5中，所述透析过程中，每隔3h更换一次四氢呋喃-水混合体系，透析膜的截留分子量为1000Da。

本发明还提供了所述的制备方法制备所得含硒超支化聚合物。

本发明还提供了所述的制备方法制备所得含硒超支化聚合物或所述的含硒超支化聚合物在制备治疗和/或预防抗肿瘤药物中的应用。

本发明还提供了一种药物组合物，包含一种以上如所述的制备方法制备所得含硒超支化聚合物或所述的含硒超支化聚合物。

优选的，所述的药物组合物，包括以所述含硒超支化聚合物作为活性成分和药学上可接受的载体。

一种药物制剂，包含治疗有效量的以上任一项所述的含硒超支化聚合物，以及在药学上可接受的赋形剂。

所述的药物制剂，包括如下剂型：口服制剂(如片剂，胶囊剂，溶液或混悬液)；可注射的制剂(如可注射的溶液或混悬液，或者是可注射的干燥粉末，在注射前加入注射用水可立即使用)局部制剂(如软膏或溶液)。

用于本发明的药物组合物的载体是药学领域可得到的常见载体，包括：口服制剂用的粘合剂、润滑剂、崩解剂、助溶剂、稀释剂、稳定剂、悬浮剂、无色素、矫味剂等；可注射制剂用的防腐剂、加溶剂、稳定剂等；局部制剂用的基质、稀释剂、润滑剂、防腐剂等。药物制剂可以经口服或胃肠外方式(例如静脉内、皮下、腹膜内或局部)给药，如果某些药物在胃部条件下是不稳定的，可将其配制成肠衣片剂。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和技术效果：

(1)本发明公开了一种超支化聚合物，该超支化聚合物能够快速且高选择性地传输质子，其速率与天然短杆菌肽相当，同时具有极高的离子选择性，能够有效区分质子与其他离子如钾离子、钠离子和氯离子。通过在超支化聚合物表面引入硒化物，得到的含硒超支化聚合物不仅保持了高效和选择性的质子传输能力，还具备了氧化还原调控的特性，能够在GSH和H₂O₂的作用下实现原位氧化还原切换，控制质子的传输。

(2)该含硒超支化聚合物在抗癌活性方面表现出色，能够快速改变细胞内pH值，诱导癌细胞凋亡，对黑色素瘤B16F10和恶性胶质瘤U87MG两种癌细胞株显示出显著的毒性。本发明的技术效果不仅体现在其卓越的质子传输效率和选择性，还在于其独特的氧化还原调控机制和显著的抗癌效果，为开发新型智能仿生材料药物提供了重要的科学依据和应用前景。

下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。

附图说明

图1为实施例1-3提供的超支化聚合物H1、H2、H3的化学结构、合成路线、分子量(Mn)和支化度(DB)；

图2为实施例1提供的超支化聚合物H1的核磁氢谱图；

图3为实施例1提供的超支化聚合物H1的核磁碳谱图；

图4为实施例1提供的超支化聚合物H1的凝胶色谱图；

图5为实施例2提供的超支化聚合物H2的核磁氢谱图；

图6为实施例2提供的超支化聚合物H2的核磁碳谱图；

图7为实施例2提供的超支化聚合物H2的凝胶色谱图；

图8为实施例3提供的超支化聚合物H3的核磁氢谱图；

图9为实施例3提供的超支化聚合物H3的核磁碳谱图；

图10为实施例3提供的超支化聚合物H3的凝胶色谱图；

图11为囊泡活性测试结果，其中，图11中的A为HPTS探针囊泡实验示意图，图11中的B为在相同浓度(3.18μM)下，实施例1-3提供的H1-H3和gA的质子传输活性比较，图11中的C为实施例3提供的H3和gA的EC₅₀(半最大效应浓度)值，图11中的D为实施例1和实施例2提供的H1和H2的EC₅₀值；

图12为实施例3提供的H3的脂双层质子传输速率测试结果，其中，图12中的A为平面脂双层工作站示意图，图12中的B为顺式和反式槽室都为0.25M盐酸水溶液时，不同电压下H3的通道电流信号，图12中的C为用于测定H3的质子电导率(γH⁺)的电流-电压(I-V)曲线，图12中的D为H3通道持续开放超过70秒，传输稳定性结果，图12中的E为顺式和反式槽室都为0.25M盐酸水溶液时，不同电压下gA的通道电流信号，图12中的F为电流-电压(I-V)曲线用于测定gA的质子电导率(γH⁺)；

图13为实施例3提供的H3的脂双层H⁺/Na⁺,H⁺/K⁺和H⁺/Cl^-选择性测试结果，其中，图13中的A为顺式槽为0.25M盐酸水溶液以及反式槽为0.25M氯化钾水溶液时，不同电压下H3的通道电流信号，图13中的B为用于测定H3的H⁺/K⁺选择性的电流-电压(I-V)曲线，图13中的C为顺式槽为0.25M盐酸水溶液以及反式槽为0.25M氯化钠水溶液时，不同电压下H3的通道电流信号，图13中的D为用于测定H3的H+/Na+选择性的电流-电压(I-V)曲线，图13中的E为顺式和反式槽室都为0.25M盐酸水溶液时，不同电压下gA的通道电流信号，图13中的F为用于测定gA的质子电导率(γH⁺)的电流-电压(I-V)曲线；

图14为实施例1-3及实施例4分别提供的H1-H3和H3-Se的化学结构及传输质子并诱导癌细胞凋亡示意图，其中，图14中的A为实施例1-3提供的H1、H2和H3的化学结构、合成路线、分子量(Mn)和支化度(DB)，图14中的B为实施例4提供的H3-Se的化学结构及氧化还原调控结构变化，图14中的C为H3通过多条路径高选择性传输质子，图14中的D为实施例4提供的H3-Se氧化还原调控质子传输示意图，图14中的E为实施例3提供的H3诱导癌细胞凋亡过程；

图15为实施例4中M1和H3-Se的合成路线；

图16为实施例4提供的M1的核磁氢谱图；

图17为实施例4提供的M1的核磁碳谱图；

图18为实施例4提供的M1的核磁硒谱图；

图19为实施例4提供的M1的质谱图；

图20为实施例4提供的H3-Se的核磁氢谱图；

图21为实施例4提供的H3-Se的核磁硒谱图；

图22为M1氧化还原调控的硒谱和碳谱，H3-Se的EC₅₀值及氧化还原调控质子传输图，其中，图22中的A为M1的⁷⁷Se NMR谱，图22中的B为M1的¹³C NMR谱，图22中的C为H3-Se的EC₅₀值，图22中的D为在H3-Se(3.5μM)中加入不同量的H₂O₂并随后加入不同量的GSH后，HPTS探针相对荧光强度的变化，图22中的E为循环加入H₂O₂和GSH，H3-Se(3.5μM)传输活性的变化；

图23为H3的细胞毒性及诱导凋亡图，其中图23中的A为B16F10和U87MG癌细胞与H3培养24小时后的细胞活力剂量依赖性曲线，图23中的B为U87MG细胞与H3或DMSO培养24小时，然后利用膜粘连蛋白-5(抗体)(AnnexinV)和碘化丙啶(PI)染色进行流式细胞术分析结果。

具体实施方式

以下通过附图和实施例对本发明的技术方案做进一步说明。

除非另外定义，本发明使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。

在本发明中，若无特殊说明，其他试验材料及仪器设备均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。

实施例1本实施例提供了一种超支化聚合物H1，制备方法包括如下步骤：

B1、在氮气保护下，圆底烧瓶中加入80mL无水二氯甲烷和6.4mL 0.05mol三氟化硼二乙醚，得混合物D；

B2、通过滴液漏斗在5min内将11.6mL 0.1mol 3-乙基-3-(羟甲基)-氧杂环丁烷加入到步骤B1得到的混合物D中，-20℃反应54h，乙醇猝灭反应，加入到超纯水中，过滤，80℃真空干燥180min，得到超支化聚合物H1，产率为83％。

实施例2本实施例提供了一种超支化聚合物H2，制备方法同实施例1，区别之处在于步骤B2中，-20℃反应48h，超支化聚合物H2产率为85％。

实施例3本实施例提供了一种超支化聚合物H3，制备方法同实施例1，区别之处在于步骤B2中，30℃反应48h，超支化聚合物H3产率为91％。

1.对上述实施例1-3得到的超支化聚合物H1、H2、H3进行核磁及凝胶色谱仪表征。结果如图1-10。

由图1-图10可知，H1、H2和H3的聚合物(Mn)分别为6273、3129和3057，而相应的支化度(DB)值分别为23.5％、20.1％和45.7％。

H1:¹H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ4.15(s,1H),3.30–3.03(m,3H),1.26(t,J＝11.8Hz,1H),0.80(t,J＝7.4Hz,2H).¹³C NMR(500MHz,DMSO-d6)δ72.08,62.62,43.77,26.58,23.07,22.49,8.08.GPC(THF):Mn＝6273,PDI＝1.80.DB＝23.5％.

H2:¹H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ4.22–4.11(m,1H),3.31–3.02(m,3H),1.37–1.18(m,1H),0.79(dd,J＝9.6,5.2Hz,2H).¹³C NMR(500MHz,DMSO-d6)δ72.10,62.51,43.78,23.66,23.08,22.49,8.09.GPC(THF):Mn＝3129,PDI＝1.79.DB＝20.1％.

H3:¹H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ4.15(s,1H),3.32–2.98(m,3H),1.25(dd,J＝12.2,4.6Hz,1H),0.79(d,J＝4.0Hz,2H).¹³C NMR(500MHz,DMSO-d6)δ72.11,62.52,43.78,23.39,23.07,22.49,8.04.GPC(THF):Mn＝3057,PDI＝1.60.DB＝45.7％.

2.囊泡活性测试：为了评估实施例1-3提供的H1-H3的离子传输活性，用包含了pH敏感的8-羟基芘-1,3,6-三磺酸(HPTS)探针的大单层囊泡(LUVs)进行实验。LUVs的制备过程如下：将11mg从Sigma购买的蛋黄L-α-磷脂酰胆碱(EYPC)溶解在1mL氯仿中，然后用油泵抽真空3小时，此时可以看到一层明显的白色薄膜。随后加入1mL的4-(2-羟乙基)-1-哌嗪-乙烷磺酸(HEPES)缓冲溶液(10mM HEPES，pH＝7.0)和HPTS探针(1mM)，在37℃水浴下水合3h。接着用液氮和恒温水浴(37℃)对该溶液进行反复冻融，整个冻融过程循环10次。接着用0.22μm的聚碳酸酯膜对该溶液过膜10次，最后用不含HPTS探针的HEPES缓冲溶液作为洗脱液，用Sephadex G-50葡萄糖柱进行纯化，即可得到包含HPTS探针的LUVs溶液。该囊泡保存在4℃，为保证囊泡的尺寸均一，在两天内使用该囊泡溶液。结果如图11。

如图11中的A所示：囊泡外部的缓冲液为10mM HEPES，pH＝6.4，受pH梯度的影响，外部的质子由囊泡外向囊泡内传输，可以通过囊泡内部HPTS探针的荧光强度变化来监测质子的传输效率。如图11中B所示：在同等浓度(3.18μM)下，H3表现出更高的质子传输活性，在300秒内达到gA的80％左右。H2的传输活性约等于H1，表明聚合物对传输活性影响不大，而支化度的提升能够提高传输活性。最后我们采用希尔方程(Y＝1/1+EC₅₀/[C]n)测定其EC₅₀(半最大效应浓度)值，由图11中的C和图11中的D可知，gA、H3、H2和H1的EC₅₀值分别为0.07μM、1.43μM、2.36μM和2.60μM。表明H3的质子传输活性特别高，媲美于天然的短杆菌肽(≈1/20)。目前人工质子通道几乎达不到如此高的活性。

3.脂双层传输机制，传输速率及离子选择性测试：为了确定该质子传输系统是以通道还是以载体的形式传输质子，用平面脂双层实验进行验证。脂双层所用的磷脂制备过程如下：首先称量甘油单油酸酯(GMO，15mg)胆固醇(15mg)溶解在20mL的氯仿中，充分混合均匀并等体积分装在10个玻璃瓶中。然后用油泵抽真空4小时除去溶剂，同样也可以看到一层薄膜。这些小瓶中分装好的脂质体保存在-20℃冰箱里。每次使用前，将其中一个小瓶恢复到室温，加入50μL正癸烷溶解使用，此时若未使用完的溶液同样保存在-20℃冰箱里，并在7天内使用。在测试之前，用0.5μL的制备好的溶液涂膜，当电容值为80pF左右测试效果最佳。为了测定传输速率，在顺式和反式槽中都加入0.25M盐酸(HCl)水溶液，结果如图12和图13。

由图12中的A可知，可以检测到明显的方形质子通道信号，表明H3传输质子是以通道的机制而不是以载体的机制。图12中的B、图12中的C、图12中的E和图12中的F可知，通过改变不同的电压，测出其相应的电流值，可以发现H3的电导值(γH⁺)为180.5±4.4pS。而gA的电导值为213.0±4.1pS，表明H3传输质子的速率非常快，与gA属于同一个数量级。由图12中的D可知，在本实验中偶尔观察到异常长且稳定的通道电流信号，表明H3能稳定地传输质子。H3通道连续打开超过70秒，是迄今为止已知的最稳定的合成通道之一。

由图13中的A和图13中的B可知，最后在不对称槽中，顺式槽中含有0.25M盐酸水溶液，反式槽中含有0.25M氯化钾水溶液，使用简化的Goldman-Hodgkin-Katz(GHK)公式测定H3的H⁺/K⁺选择性(PH⁺/PK⁺)。根据记录的I-V曲线和获得的反转电位(εrev＝-112.0mV)，计算出PH⁺/PK⁺为78.4，说明H3具有高的H+/K+选择性。由图13中的C和图13中的D可知，通过在反式槽中用0.25M NaCl取代0.25M KCl，考察了H⁺对Na⁺的选择性(PH⁺/PNa⁺)。根据同样方法得到的I-V曲线和反转电位(εrev＝-140.0mV)，计算出PH⁺/PNa⁺为233.2。由图13中的E和图13中的F可知，最后在不对称盐酸水溶液(顺式槽＝0.25M盐酸，反式槽＝0.1M盐酸)中测量了H⁺/Cl^-选择性(PH⁺/PCl^-)。考虑到从0.1M到0.25M的质子梯度，以及从I-V曲线得出的反转电位(εrev＝-46.7mV)，H3的H⁺/Cl^-选择性值达到了167.8。这些结果最终有力地证实了H3不仅能快速传输质子，而且还具有显著的H⁺/K⁺、H⁺/Na⁺和H⁺/Cl^-选择性。

实施例4本实施例提供了一种含硒超支化聚合物，制备方法包括如下步骤：

S1、制备化合物M1：A1、将0.75g 4mmol二甲基二硒化物溶于30mL无水乙醇，搅拌均匀，0℃下缓慢加入454mg 12mmol硼氢化钠，0℃搅拌30min，溶液由黄色变为无色，得混合物A；

A2、1.23g 10mmol 2-氯乙酯溶于5mL无水乙醇，搅拌均匀，加入到步骤A1得到的混合溶液A中，0℃搅拌1h，得混合物B；

A3、向步骤A2得到的混合物中依次50mL蒸馏水和50mL无水乙醇，萃取分离有机层，依次用50mL蒸馏水和50mL盐水洗涤，保留有机相，减压去除溶剂，得混合物C；

A4、将步骤A3得到的混合物C溶解于10mL质量分数为99％的乙醇中，加入10mL8mol KOH水溶液，室温下搅拌过夜，再依次加入30mL蒸馏水和30mL乙醚，浓盐酸酸化至pH＝2，30mL乙醚萃取，30mL蒸馏水洗涤有机层，无水Na₂SO₄干燥，旋转蒸发仪除去溶剂，得到M1(0.43g，70％)。

S2、制备超支化聚合物：制备方法同实施例3，得超支化聚合物H3；

S3、将224mg 1.46mmol步骤S1得到的化合物M1溶于10mL无水二氯甲烷，加入10μL无水DMF和1.85g 14.6mmol草酰氯，氮气保护下，60℃加热回流搅拌过夜，减压去除溶剂和过量草酰氯，得反应物A；

S4、在氮气保护下，将20mg 0.007mmol步骤S2得到的超支化聚合物和6.83mg0.07mmol三乙胺悬浮于5mL无水四氢呋喃，0℃搅拌5min，得反应物B；

S5、将步骤S3得到的反应物A溶解于2mL无水四氢呋喃，搅拌均匀，滴加至步骤S4中的反应物B中，滴加结束，升温至室温，搅拌过夜，旋转蒸发仪除去溶剂，溶解于1mL无水四氢呋喃，四氢呋喃-水混合体系(无水四氢呋喃和蒸馏水体积比为1:1)透析24h，透析过程中每隔3h更换一次四氢呋喃-水混合体系，透析膜的截留分子量为1000Da，得到含硒超支化聚合物H3-Se(23.2mg，50％)。

对上述实施例4得到的化合物M1和含硒超支化聚合物H3-Se进行核磁及凝胶色谱仪表征。

图14为H1-H3和H3-Se的化学结构及传输质子并诱导癌细胞凋亡示意图。

图15为实施例4中M1和H3-Se的合成路线。

M1结果如图16-19。

由图16-19可知，M1成功合成。

M1：¹H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ12.31(s,1H),3.17–3.08(m,2H),2.15–2.05(m,3H).

¹³C NMR(500MHz,DMSO-d6)δ172.91,24.35,5.68.

⁷⁷Se NMR(500MHz,DMSO-d6)δ114.53.

HR-MS(ESI,m/z):calculated for C3H6O2Se[M-H]-:152.9449；found,152.9449.

含硒超支化聚合物H3-Se，核磁表征数据如图20-21。

由图20-21可知，

H3-Se：¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ3.34(s,3H),2.98(s,2H),1.29(dd,J＝39.8,20.2Hz,1H),1.13(s,2H),0.78(s,2H).

⁷⁷Se NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ123.20.

通过核磁共振(NMR)光谱分析单体1(M1)的氧化还原行为，随后用基于LUVs的HPTS实验(囊内溶液：10mM HEPES，pH 7.0；囊外溶液：10mM HEPES，pH 7.0)来评估H3-Se的传输活性和“ON-OFF”开关特性。结果如图22。

由图22中的A可知，⁷⁷Se NMR谱显示含有硒醚的M1的化学位移为114.53ppm。M1被H₂O₂氧化后，化学位移移至1047.12ppm，表明硒醚转变为硒氧化物基团。加入GSH后，化学位移恢复到114.53ppm。图22中的B可知，¹³C NMR谱显示，加入H₂O₂后，M1的三个不同峰(C1、C2和C3)发生了明显的化学位移，例如，C3的化学位移从172.95ppm变为161.40ppm。加入DTT后，这三个峰的化学位移又回到了原来的位置，表明硒醚和硒氧化物之间发生了可逆转变。

图22中的C可知，H3-Se的EC₅₀值为1.41μM，活性与H3相当。为了测量氧化还原调控H3-Se的质子传输活性，在将H3-Se加入LUVs溶液之前，先将其与不同浓度的H₂O₂预孵育1分钟。图22中的D可知，HPTS探针的相对荧光强度随着添加的H₂O₂浓度升高而增加，这意味着质子转运活性相应降低。在H₂O₂浓度为180μM时，H3-Se的质子传输活性极低，与DMSO对照组相当。随后，将不同浓度的GSH加入H₂O₂处理过的H3-Se溶液(预培养1min)中，质子转运能力得以恢复。由图22中的E可知，H3-Se的质子传输活性可以多次循环操作。推断含H3-Se的疏水性硒化物分子可融入疏水性磷脂双分子层，而转化为亲水性硒氧化物部分会阻碍这一过程。

在脂质体模型中证实了H3的快速质子传输能力后，对其潜在的抗癌特性进行了调查。首先采用CCK-8(细胞计数试剂盒-8)测定法评估了H3对黑色素瘤B16F10和恶性胶质瘤U87MG这两种癌细胞株的细胞毒性。结果如图23。

由图23中的A可知，H3对B16F10细胞的半数最大抑制浓度(IC50)为1.04μM，对U87MG细胞的半数最大抑制浓度(IC₅₀)为0.23μM，表明对这两种癌细胞株都有显著毒性。为了确定H3是否通过凋亡机制导致细胞死亡，我们结合膜粘连蛋白-5(抗体)(Annexin V)和碘化丙啶(PI)染色法进行了流式细胞术实验。由图23中的B可知，与H3培养24小时后，早期和晚期凋亡细胞的百分比分别为5.45％和89.8％，大大高于DMSO处理的对照组(1.02％和0.34％)。这些实验可以清晰的表明H3高效的传输质子，改变细胞的pH值，最终导致癌细胞凋亡。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其进行限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而这些修改或者等同替换亦不能使修改后的技术方案脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims (8)

1.一种含硒超支化聚合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、制备化合物M1；

S2、制备超支化聚合物；

S3、将步骤S1得到的化合物M1溶于无水二氯甲烷，加入无水DMF和草酰氯，加热搅拌过夜，减压去除溶剂和过量草酰氯，得反应物A；

S4、在氮气保护下，将步骤S2得到的超支化聚合物和三乙胺悬浮于无水四氢呋喃，0℃搅拌5 min，得反应物B；

S5、将步骤S3得到的反应物A溶解于无水四氢呋喃，搅拌均匀，滴加至步骤S4中的反应物B中，滴加结束，升温至室温，搅拌过夜，旋转蒸发仪除去溶剂，溶解于无水四氢呋喃，在体积比为1:1的四氢呋喃-水混合体系透析24h，得到含硒超支化聚合物；

步骤S1中，所述化合物M1制备方法包括如下步骤：

A1、将二甲基二硒化物溶于无水乙醇，搅拌均匀，0℃下缓慢加入硼氢化钠，0℃搅拌30min，得混合物A；

A2、将2-氯乙酯溶于无水乙醇，搅拌均匀，加入到步骤A1得到的混合溶液A中，0℃搅拌1h，得混合物B；

A3、向步骤A2得到的混合物B中依次蒸馏水和无水乙醇，萃取分离有机层，依次用蒸馏水和盐水洗涤，保留有机相，减压去除溶剂，得混合物C；

A4、将步骤A3得到的混合物C溶解于质量份数为99%的乙醇中，加入KOH水溶液，室温下搅拌过夜，再依次加入蒸馏水和乙醚，浓盐酸酸化至pH=2，乙醚萃取，蒸馏水洗涤有机层，无水Na₂SO₄干燥，旋转蒸发仪除去溶剂，得到M1；

步骤S2中，所述超支化聚合物制备方法包括如下步骤：

B1、在氮气保护下，圆底烧瓶中加入无水二氯甲烷和三氟化硼二乙醚，得混合物D；

B2、通过滴液漏斗在5min内将3-乙基-3-（羟甲基）-氧杂环丁烷加入到步骤B1得到的混合物D中，-20-30℃反应48-54h，乙醇猝灭反应，加入到超纯水中，过滤，80℃真空干燥180min，得到超支化聚合物。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S3中，所述将步骤S1得到的化合物M1溶于无水二氯甲烷，加入无水DMF和草酰氯，在氮气保护下，60℃加热回流搅拌过夜。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S5中，四氢呋喃-水混合体系中无水四氢呋喃和蒸馏水体积比为1:1。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S5中，所述透析过程中，每隔3h更换一次四氢呋喃-水混合体系，透析膜的截留分子量为1000 Da。

5.如权利要求1-4任一项所述的制备方法制备所得含硒超支化聚合物。

6.如权利要求1-4任一项所述的制备方法制备所得含硒超支化聚合物或权利要求5所述的含硒超支化聚合物在制备治疗和/或预防抗肿瘤药物中的应用。

7.一种药物组合物，包含一种以上如权利要求1-4中任一项所述的制备方法制备所得含硒超支化聚合物或权利要求5所述的含硒超支化聚合物。

8.根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，包括以所述含硒超支化聚合物作为活性成分和药学上可接受的载体。