CN119700657A - 一种pdrn非交联透明质酸钠凝胶组合物、制备方法、有关产品及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种PDRN非交联透明质酸钠凝胶组合物、制备方法、有关产品及应用，属于医药、医疗器械和化妆品技术领域。本发明的PDRN凝胶组合物按重量份由以下成分组成：5‑15份透明质酸钠1、1‑3份透明质酸钠2、1‑2.7份PDRN、0.05‑0.15份植酸、0.025‑0.075份氯化锌和200‑300份水；其中，透明质酸钠1的分子量为1000kDa‑2000kDa；透明质酸钠2的分子量小于10kDa。本发明提供的组合物能够制备一种不含有化学交联剂的PDRN透明质酸钠凝胶，能够实现PDRN的控制释放及更好的储存稳定性。

Description

一种PDRN非交联透明质酸钠凝胶组合物、制备方法、有关产品 及应用

技术领域

本发明属于医药、医疗器械和化妆品技术领域，涉及一种PDRN非交联透明质酸钠凝胶组合物、制备方法、有关产品及应用。

背景技术

透明质酸钠（Sodium hyaluronate）是一种葡聚糖醛酸的钠盐，天然存在于哺乳动物结缔组织、皮肤、眼和关节液中，是一种重要的生物高分子。其对应的酸为透明质酸（Hyaluronic acid），又称玻尿酸，是细胞外基质的主要构成成分之一。透明质酸和透明质酸钠的生物相容性好，已广泛应用于美容、美妆、日化等领域。

为了提升透明质酸钠的物理和化学性能，以适应不同场景下含有透明质酸钠成分的产品的特性，常常采用化学交联法对透明质酸钠的微观结构进行改造。由于透明质酸钠中含有羧基（钠盐）、羟基等活性基团，常常采用与其能够发生化学反应的化学试剂对其进行交联。如米鹏程等在《二乙烯基砜交联透明质酸钠凝胶的制备及其生物相容性》一文（中国组织工程研究与临床康复，2008,12（14）:4）中提供了采用二乙烯基砜作为交联剂的方式，制备交联透明质酸钠的技术。制得的透明质酸钠具备良好的生物相容性较好，且稳定性得到了一定的提升。然而，采用化学交联剂对透明质酸钠进行共价交联引入了生物体系中不存在的交联剂小分子物质，虽然透明质酸钠交联材料在宏观下（肉眼）可以降解，但不代表降解后含有交联剂的分子片段不会产生生物相容性风险。另外，交联反应的程度是有限的，因此化学交联剂可能存在残余。这都影响了化学交联透明质酸钠材料的生物相容性。

植酸，又名肌醇六磷酸、环己六醇六磷酸，是一种从植物种子中提取的有机磷酸酯化合物。植酸是一种天然小分子，其化学结构具有多个磷酸根基团，能与蛋白质、多糖、多肽、核酸等多种生物分子产生分子间相互作用，同时是一种保湿剂、抗氧化剂，广泛应用于化妆品工业中。植酸与生物大分子之间的作用力属于分子间相互作用，不影响生物大分子本身的共价结构。然而，由于分子间相互作用相对共价键的结合力较弱，包含多种生物大分子的复杂凝胶体系中，植酸本身对凝胶体系的稳定性的作用较为复杂且难以预测。

PDRN（polydeoxyribonucleotide），又称为“聚脱氧核糖核苷酸”，是一类天然来源的DNA衍生物，由链长50-2000个碱基对的DNA片段的混合物组成。目前，PDRN主要从鲑鱼的精细胞中提取和纯化。PDRN在抗炎、伤口愈合、组织恢复、抗缺血等方面均显示出确切的效果。

中国发明专利CN118873426A提供了一种PDRN-交联透明质酸钠组合物及其应用，该组合物包括PDRN、氧化透明质酸钠、聚氨基酸和去离子水。该技术采用高碘酸钠对透明质酸钠进行氧化，氧化后的透明质酸钠含有醛基；然后将PDRN与含有醛基的透明质酸钠进行交联反应，构成的PDRN-交联透明质酸钠组合物。该方法虽然未添加化学交联剂，但改变了透明质酸钠的化学结构，且生成的PDRN-交联透明质酸钠交联位置不确定，对PDRN本身的抗炎、组织恢复等性质存在的潜在影响。最后，对凝胶本身进行氧化改性从整体上提升了凝胶的氧化价，不利于凝胶抗炎、抗氧化效果的体现。

综上，现有技术尚未提供一种不经共价交联、不改变各原料共价结构，同时能够稳定存在的PDRN-透明质酸钠凝胶体系。

发明内容

有鉴于此，针对现有技术存在的问题，本发明的目的是提供一种PDRN非交联透明质酸钠凝胶组合物、有关产品、制备方法及应用。

为实现上述发明目的，一方面，本发明提供一种PDRN非交联透明质酸钠凝胶组合物，按重量份由以下成分组成：

5-15份透明质酸钠1、1-3份透明质酸钠2、1-2.7份PDRN、0.05-0.15份植酸、0.025-0.075份氯化锌和200-300份水；

其中，透明质酸钠1的分子量为1000kDa-2000kDa；透明质酸钠2的分子量小于10kDa。

优选地，所述的PDRN非交联透明质酸钠凝胶组合物按重量份由以下成分组成：

8-12份透明质酸钠1、1.5-2.5份透明质酸钠2、1.4-2.3份PDRN、0.08-0.12份植酸、0.04-0.06份氯化锌和200-250份水。

更优选地，所述的PDRN非交联透明质酸钠凝胶组合物按重量份由以下成分组成：

10份透明质酸钠1、2份透明质酸钠2、1.85份PDRN、0.1份植酸、0.05份氯化锌和236份水。

优选地，且作为本发明的一个具体实例，所述透明质酸钠1的分子量为1500kDa±1kDa。

另一方面，本发明提供采用上述的PDRN非交联透明质酸钠凝胶组合物制备PDRN非交联透明质酸钠凝胶的方法，包括以下步骤：

S1、将配方量的透明质酸钠2、PDRN、氯化锌与水混合，搅拌，得溶液1；

S2、将配方量植酸与水混合，得溶液2；

S3、将溶液2滴加入搅拌中的溶液1中，得溶液3；

S4、将配方量的透明质酸钠1与配方量余量的水混合，再加入溶液3，混匀，得PDRN非交联透明质酸钠凝胶。

优选地，步骤S1中，所述水的重量为透明质酸钠2、PDRN和氯化锌的重量之和的16-24倍，更优选为20倍。

优选地，步骤S2中，所述水的重量为植酸重量的20-40倍，更优选为30倍。

优选地，步骤S1中，所述搅拌的速度为800-1200rpm，更优选为1000rpm。

优选地，步骤S1中，所述搅拌的时间为8-18h，更优选为9h。

优选地，步骤S3中，所述滴加的速度为0.01-0.05mL/min，更优选为0.03mL/min。

优选地，步骤S3中，所述搅拌的速度为800-1200rpm，更优选为1000rpm。

优选地，步骤S4中，所述混匀具体为搅拌24-48h，更优选地，搅拌的速度为500-800rpm。

上述方法中，小分子量的透明质酸钠、氯化锌、PDRN和植酸之间能够形成亚微米/微米级小型交联体，一方面能够对PDRN起到一定的稳定和包缚作用，另一方面在与大分子量透明质酸钠混合后，上述微米级小型交联体可作为大分子量透明质酸钠通过非共价作用联系的节点，即通过小型交联体表面的基团与大分子量透明质酸钠间的分子间相互作用，提升凝胶的成胶性能。而在这个过程中，PDRN和透明质酸钠的共价结构未发生改变。

再一方面，本发明提供了一种PDRN非交联透明质酸钠凝胶，由上述的方法制成。

再一方面，本发明提供了上述的PDRN非交联透明质酸钠凝胶组合物或上述的方法制得的PDRN非交联透明质酸钠凝胶在制备药品、医疗器械或化妆品中的应用。

再一方面，本发明提供了一种药品，所述产品含有上述PDRN非交联透明质酸钠凝胶组合物或上述的方法制得的PDRN非交联透明质酸钠凝胶。

再一方面，本发明提供了一种医疗器械，所述产品含有上述PDRN非交联透明质酸钠凝胶组合物或上述的方法制得的PDRN非交联透明质酸钠凝胶。

最后一方面，本发明提供了一种化妆品，所述产品含有上述PDRN非交联透明质酸钠凝胶组合物或上述的方法制得的PDRN非交联透明质酸钠凝胶。

所述药品、医疗器械及化妆品可以是作用于皮肤的外敷产品，也可以是适合于皮内导入、植入的产品，优选敷料、乳剂、膏剂、喷剂、注射剂及微针等剂型。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

（1）本发明提供了一种PDRN非交联透明质酸钠凝胶组合物，通过PDRN与不同分子量的透明质酸钠、氯化锌和植酸进行复配，能够得到一种具有PDRN缓释性能、储存稳定性好且生物安全性良好的PDRN非交联透明质酸钠凝胶。

（2）本发明提供了一种PDRN非交联透明质酸钠凝胶的制备方法，该制备方法简单易行，利于工业生产。

具体实施方式

本发明的术语和声明：

1、冠词“一个”、“一种”和“所述”：除非以其它方式明确地限定到一个(种)对象，否则包括复数的对象。

2、数值范围：除非以其他方式明确指出，本文中公开的所有范围或比率将会被理解为包括其中包含的任何和所有的子范围或子比率。例如，声明的1至30的范围或比率应当被认为包含在最小值1和最大值30之间，并且包括断端点在内的任何子范围或子比率、整数、小数或由整数或小数构成的子范围或子比率。

以下非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面的理解本发明，但不以任何方式限制本发明。下述内容仅仅是对本发明要求保护的范围的示例性说明，本领域技术人员可以根据所公开的内容对本发明出多种改变和修饰，而其也应当属于本发明要求保护的范围之中。

下面以具体实施例的方式对本发明作进一步的说明。本发明实施例中所使用的各种化学试剂如无特殊说明均通过常规商业途径获得。若无特殊说明，下文中所述含量均为质量含量。若无特殊说明，理解为在室温下进行。

下述实施例中，部分试剂来源如下表1：

表1

下述实施例中，使用的仪器设备如下表2：

表2

实施例1

PDRN非交联透明质酸钠凝胶的制备，步骤如下。

S1、将透明质酸钠（分子量＜10kDa）200mg、PDRN 185mg、氯化锌5mg在1000rpm搅拌下依次加入8mL（8g）去离子水中，密闭条件下，搅拌9h充分分散均匀，得溶液1。

S2、取20mg植酸水溶液（重量分数50%，含有植酸10mg、水10mg）与290mg水混合稀释，得溶液2。

S3、将溶液2吸入注射器中，使用微量注射泵将注射器中的溶液2以0.03mL/min的速度匀速滴入1000rpm搅拌下的溶液1中，得溶液3。

S4、将1000mg透明质酸钠（1500kDa±1kDa）与15.3g水混合，1000rpm条件下搅拌过夜，混合均匀，再将溶液3倒入该混合溶液中，混匀（600rpm搅拌36h）得PDRN非交联透明质酸钠凝胶。

实施例2

PDRN非交联透明质酸钠凝胶的制备，步骤如下。

S1、将透明质酸钠（分子量＜10kDa）250mg、PDRN 230mg、氯化锌4mg在1000rpm搅拌下依次加入9.68mL（9.68g）去离子水中，密闭条件下，搅拌9h充分分散均匀，得溶液1。

S2、取24mg植酸水溶液（重量分数50%，含有植酸12mg、水12mg）与348mg水混合稀释，得溶液2。

S3、将溶液2吸入注射器中，使用微量注射泵将注射器中的溶液2以0.03mL/min的速度匀速滴入1000rpm搅拌下的溶液1中，得溶液3。

S4、将800mg透明质酸钠（1500kDa±1kDa）与9.96g水混合，1000rpm条件下搅拌过夜，混合均匀，再将溶液3倒入该混合溶液中，混匀（600rpm搅拌36h）得PDRN非交联透明质酸钠凝胶。

实施例3

PDRN非交联透明质酸钠凝胶的制备，步骤如下。

S1、将透明质酸钠（分子量＜10kDa）150mg、PDRN 140mg、氯化锌6mg在1000rpm搅拌下依次加入5.92mL（5.92g）去离子水中，密闭条件下，搅拌9h充分分散均匀，得溶液1。

S2、取16mg植酸水溶液（重量分数50%，含有植酸8mg、水8mg）与232mg水混合稀释，得溶液2。

S3、将溶液2吸入注射器中，使用微量注射泵将注射器中的溶液2以0.03mL/min的速度匀速滴入1000rpm搅拌下的溶液1中，得溶液3。

S4、将1200mg透明质酸钠（1500kDa±1kDa）与18.84g水混合，1000rpm条件下搅拌过夜，混合均匀，再将溶液3倒入该混合溶液中，混匀（600rpm搅拌36h）得PDRN非交联透明质酸钠凝胶。

实施例4

PDRN非交联透明质酸钠凝胶的制备，步骤如下。

S1、将透明质酸钠（分子量＜10kDa）300mg、PDRN 270mg、氯化锌2.5mg在1200rpm搅拌下依次加入9.16mL（9.16g）去离子水中，密闭条件下，搅拌8h充分分散均匀，得溶液1。

S2、取30mg植酸水溶液（重量分数50%，含有植酸15mg、水15mg）与585mg水混合稀释，得溶液2。

S3、将溶液2吸入注射器中，使用微量注射泵将注射器中的溶液2以0.05mL/min的速度匀速滴入800rpm搅拌下的溶液1中，得溶液3。

S4、将500mg透明质酸钠（1500kDa±1kDa）与10.24g水混合，800rpm条件下搅拌过夜，混合均匀，再将溶液3倒入该混合溶液中，混匀（600rpm搅拌36h）得PDRN非交联透明质酸钠凝胶。

实施例5

PDRN非交联透明质酸钠凝胶的制备，步骤如下。

S1、将透明质酸钠（分子量＜10kDa）100mg、PDRN 100mg、氯化锌7.5mg在800rpm搅拌下依次加入4.98mL（4.98g）去离子水中，密闭条件下，搅拌18h充分分散均匀，得溶液1。

S2、取10mg植酸水溶液（重量分数50%，含有植酸5mg、水5mg）与95mg水混合稀释，得溶液2。

S3、将溶液2吸入注射器中，使用微量注射泵将注射器中的溶液2以0.01mL/min的速度匀速滴入1200rpm搅拌下的溶液1中，得溶液3。

S4、将1500mg透明质酸钠（1500kDa±1kDa）与24.92g水混合，1200rpm条件下搅拌过夜，混合均匀，再将溶液3倒入该混合溶液中，混匀（600rpm搅拌36h）得PDRN非交联透明质酸钠凝胶。

实施例1-实施例5中得到的PDRN非交联透明质酸钠凝胶依次分别记作凝胶1-凝胶5，凝胶1-凝胶5对应的PDRN非交联透明质酸钠凝胶组合物的组方汇总于表3：

表3

对比例1

与实施例1相比，步骤S1中，透明质酸钠（分子量＜10kDa）的用量改为600mg；步骤S4中，透明质酸钠（1500kDa±1kDa）的用量改为600mg，其余条件皆相同。

对比例2

与实施例1相比，步骤S1中，氯化锌改为使用等质量的氯化钙，其余皆相同。

对比例3

与实施例1相比，步骤S1中，氯化锌改为使用等质量的氯化镁，其余皆相同。

对比例4

与实施例1相比，步骤S1中，省略使用氯化锌，PDRN用量改为190mg，其余皆相同。

对比例5

与实施例1相比，步骤S2中，溶液2为310mg去离子水，其余皆相同。

对比例6

与实施例1相比，步骤S3中，不采用滴加方式而采用直接混合的方式将溶液2和溶液1进行混合，其余条件皆相同。

对比例7

与实施例1相比，步骤S1中，透明质酸钠（分子量＜10kDa）改为使用等重量的透明质酸钠（Mw 100kDa-200kDa），其余皆相同。

对比例8

与实施例1相比，步骤S4中，透明质酸钠（1500kDa±1kDa）改为使用等重量的透明质酸钠（Mw 100kDa-200kDa），其余皆相同。

对比例1-对比例8得到的PDRN非交联透明质酸钠凝胶依次分别记作凝胶d1-凝胶d8。

效果评价

1、透明质酸钠、氯化锌、植酸和PDRN形成小型交联体的表征。

取实施例1-实施例5、对比例1-对比例7的步骤S3中得到的溶液3，在玻棒搅拌下用水稀释，逐级稀释至原体积的100倍。取适量稀释后的溶液使用DLS粒径分析仪对其平均粒径进行检测，结果如表4所示：

表4

可见，本发明实施例1-实施例5中，分子量＜10kDa的透明质酸钠与PDRN、植酸、氯化锌能够形成亚微米级颗粒溶液。对比例1中，透明质酸钠用量过大，干扰了稳定的小型交联体的形成。对比例2、对比例3中，分别采用氯化钙、氯化镁替代等量氯化锌。虽然钙离子和镁离子与锌离子一样都是二价金属阳离子，然而对比例2、对比例3两个对比例显示使用氯化钙和氯化镁无法实现稳定的亚微米级颗粒溶液的形成。对比例4省略使用氯化锌；对比例5省略使用植酸。结果可见，未使用氯化锌或植酸的情况下溶液中未见亚微米级颗粒溶液的形成，这说明氯化锌和植酸是形成透明质酸钠-PDRN小型交联体必不可少的成分。对比例6中，采用直接混合的方式将溶液2与溶液1进行混合而非滴加，由于混合过程不够均匀，生成的透明质酸钠-PDRN交联体颗粒显著更大。对比例7中，采用重均分子量更大的透明质酸钠与PDRN、植酸和氯化锌进行交联，由于透明质酸钠的分子量更大，单个透明质酸钠分子上可能产生多个小型交联体的位点，进而形成类似网络的结构，这进一步导致交联体的沉降。

2、凝胶1-凝胶5、凝胶d1-凝胶d8的缓释作用

首先通过测定260nm处吸光度的方式测定单位浓度凝胶1-凝胶5、凝胶d1-凝胶d8中核酸含量。然后取凝胶1-凝胶5、凝胶d1-凝胶d8各1g，分别置于截留分子量5000Da的透析袋中，将透析袋置于100mL的pH为7.4的PBS水溶液中，搅拌速度为350rpm。分别在不同时间取透析袋外的缓冲溶液1mL，测定260nm处吸光度，以确定透析袋外的核酸浓度及核酸总量，每次测试完后将溶液倒回缓冲液烧杯中。计算核酸释放百分率。

核酸浓度（μg/mL）=A÷0.020。

其中，A为溶液1cm光径比色皿中在260nm处光吸收峰值，0.020为DNA的光吸收浓度系数。

采用上述方法测得各组凝胶的24h、48h、72h的核酸释放百分率如表5所示（“-”表示接近完全释放未检测）：

表5

可见本发明提供的凝胶1-凝胶5能够实现更好的核酸缓释效果，其在24h内的核酸释放百分率仅为46.90%-58.10%、48h内的核酸释放百分率仅为62.84%-78.81%。而各个对比例提供的凝胶d1-凝胶d8的则不具备各实施例所达到的缓释效果。

3、储存稳定性评价

取300μL无菌凝胶注于1mL玻璃透明西林瓶中，分别在20℃、40℃下储存1天、15天、30天和60天，目视观察其颜色、透明度和凝胶状态。20℃下储存稳定性实验结果汇总于表6：

表6

40℃下储存稳定性实验结果汇总于表7：

表7

可见，本发明实施例1-实施例5提供的透明质酸钠-PDRN凝胶在20℃、40℃具有更好的储存稳定性。

4、生物安全性评价

对人类永生化角质形成细胞HaCaT细胞毒性评价。

培养液：DMEM培养基+10%胎牛血清（FBS）+1%青霉素-链霉素。

培养条件：37℃、5%CO₂，湿度95%。

实验方法：

将复苏后的HaCaT细胞进行传代培养至对数生长期，消化细胞，用培养液重悬，进行细胞计数。用培养液调节细胞浓度后，在96孔板中接种10000个细胞/孔（含0.1mL培养液）。定植24h后吸除培养液，每孔加入0.1mL含有不同浓度的凝胶的培养液混合物，培养24h。吸除培养液，使用MTT细胞活力试剂盒对HaCaT细胞的活性进行检测，以凝胶浓度为0μg/mL的组别作为相对活力的基准计算其他浓度凝胶下HaCaT细胞的相对活力。实验结果如下表8所示（相对活力平均值，无量纲量，以各自凝胶浓度为0μg/mL时的细胞相对活力平均值为1）：

表8

可见，各实施例、对比例提供的凝胶对HaCaT细胞均未体现出显著毒性。

最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (12)

1.一种PDRN非交联透明质酸钠凝胶组合物，其特征在于，按重量份由以下成分组成：

5-15份透明质酸钠1、1-3份透明质酸钠2、1-2.7份PDRN、0.05-0.15份植酸、0.025-0.075份氯化锌和200-300份水；

其中，透明质酸钠1的分子量为1000kDa-2000kDa；透明质酸钠2的分子量小于10kDa。

2.根据权利要求1所述的PDRN非交联透明质酸钠凝胶组合物，其特征在于，按重量份由以下成分组成：

8-12份透明质酸钠1、1.5-2.5份透明质酸钠2、1.4-2.3份PDRN、0.08-0.12份植酸、0.04-0.06份氯化锌和200-250份水。

3.根据权利要求2所述的PDRN非交联透明质酸钠凝胶组合物，其特征在于，按重量份由以下成分组成：

10份透明质酸钠1、2份透明质酸钠2、1.85份PDRN、0.1份植酸、0.05份氯化锌和236份水。

4.根据权利要求1所述的PDRN非交联透明质酸钠凝胶组合物，其特征在于，所述透明质酸钠1的分子量为1500kDa±1kDa。

5.采用权利要求1-4中任意一项所述的PDRN非交联透明质酸钠凝胶组合物制备PDRN非交联透明质酸钠凝胶的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、将配方量的透明质酸钠2、PDRN、氯化锌与水混合，搅拌，得溶液1；

S2、将配方量植酸与水混合，得溶液2；

S3、将溶液2滴加入搅拌中的溶液1中，得溶液3；

S4、将配方量的透明质酸钠1与配方量余量的水混合，再加入溶液3，混匀，得PDRN非交联透明质酸钠凝胶。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤S1中，所述水的重量为透明质酸钠2、PDRN和氯化锌的重量之和的16-24倍；步骤S2中，所述水的重量为植酸重量的20-40倍。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤S1中，所述搅拌的速度为800-1200rpm，所述搅拌的时间为8-18h；步骤S3中，所述滴加的速度为0.01-0.05mL/min；所述搅拌的速度为800-1200rpm；步骤S4中，所述混匀具体为搅拌24-48h。

8.一种PDRN非交联透明质酸钠凝胶，其特征在于，由权利要求5-7中任意一项所述的方法制成。

9.权利要求1-4中任意一项所述的PDRN非交联透明质酸钠凝胶组合物或权利要求5-7中任意一项所述的方法制得的PDRN非交联透明质酸钠凝胶在制备药品、医疗器械或化妆品中的应用。

10.一种药品，其特征在于，含有权利要求1-4中任意一项所述的PDRN非交联透明质酸钠凝胶组合物或权利要求5-7中任意一项所述的方法制得的PDRN非交联透明质酸钠凝胶。

11.一种医疗器械，其特征在于，含有权利要求1-4中任意一项所述的PDRN非交联透明质酸钠凝胶组合物或权利要求5-7中任意一项所述的方法制得的PDRN非交联透明质酸钠凝胶。

12.一种化妆品，其特征在于，含有权利要求1-4中任意一项所述的PDRN非交联透明质酸钠凝胶组合物或权利要求5-7中任意一项所述的方法制得的PDRN非交联透明质酸钠凝胶。