CN119680703B - 一种大环内酯类抗生素发酵废弃物残留抗生素降解的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种大环内酯类抗生素发酵废弃物残留抗生素降解的方法，所述方法包括以抗生素菌渣为降解原料、不锈钢珠为研磨介质，以氧化剂和助氧化剂作为球磨助剂。上述混合物在球磨罐中，研磨反应，完成菌渣的处理，球磨后的菌渣中抗生素的含量降低到99％以下，其中抗生素的抗生活性消失，并且可以进一步用于红霉素的再发酵。本发明具有工艺路线简短、试剂用量少且价格低廉、操作简单、全工艺在固相条件下进行，无需溶剂，降解效率好，是一种具有较好推广应用前景的大环内酯类抗生素菌渣的治理方法。

Description

一种大环内酯类抗生素发酵废弃物残留抗生素降解的方法

技术领域

本发明属于有机固废处理及综合利用技术领域，具体涉及一种大环内酯类抗生素发酵废弃物残留抗生素降解的方法。

背景技术

大环内酯类抗生素是一类广谱抗菌药物，通过抑制细菌蛋白质合成来发挥作用。它们通常包含一个12至16碳原子的大环内酯环，并通过糖苷键连接到糖基团上。这类药物主要针对革兰氏阳性菌和部分革兰氏阴性菌，如肺炎链球菌和金黄色葡萄球菌。大环内酯类抗生素的代表药物包括红霉素、克拉霉素和阿奇霉素等。这些药物在临床上广泛用于治疗呼吸道感染、皮肤软组织感染以及幽门螺杆菌感染等。然而，细菌对大环内酯类抗生素的耐药性问题日益严重，主要表现为亲和力降低，可通过细菌核糖体修饰或药物外排增加等机制实现。抗药性的主要原因是来自于抗生素的滥用以及抗生素工艺废弃物排放引起。

工业上生产大环内酯类抗生素就是将链霉菌、放线菌等抗生素生产菌接种在培养基上进行培养，通过对其发酵过程进行调控，使其通过微生物发酵生产抗生素。发酵结束后，对发酵液进行固液分离，目标抗生素则存在于滤液之中，而留下的滤饼就是抗生素菌渣。据统计抗生素菌渣其主要成分包括一部分抗生素产生菌的菌丝体、发酵过程中产生的代谢产物、大量的有机培养基和培养基的降解物，除此之外，还有少量残留的抗生素等。抗生素菌渣如不进行合理的处置，仅环境中残留的抗生素及其代谢产物都会对水生生物和人类造成慢性毒性和内分泌干扰，并增加细菌的耐药性。

传统上，对于菌渣的处理方法有焚烧法、填埋法、饲料化和肥料化。近年来，抗生素菌渣的无害化处理越发引人关注，水热处理技术、电子束辐照技术、厌氧发酵、氧化降解等技术也被越来越多的用于抗生素菌渣的无害化处理。而机械化学(Mechanochemistry)，作为一种新兴高效技术，在冶金、材料合成、天然产物的提取、药物合成与制剂等多方面均有较多的应用，但近年来也在有机污染物降解领域展示出巨大发展潜力。专利CN110951637A公开了一种处理红霉素菌渣的新方法，首先将红霉素菌渣用强酸酸化，再调节pH至6.5～7.5之后用反渗透装置浓缩，浓缩液经预冷冻、真空冷冻干燥、粉碎后即得红霉素菌渣粉末。所得菌渣粉末可作为红霉素发酵的营养成分，替代部分黄豆饼粉添加于红霉素发酵培养基中，虽然该发明解决了红霉素污染的难题实现菌渣的资源化利用，但操作过程繁琐，且有发明中使用大量的磷酸，存在这一定的安全隐患。专利CN219792952U公开了一种抗生素发酵菌渣的处理装置，该发明装置包括依次连接的预调节池、全混式厌氧发酵罐和沉淀池。该装置中全混式厌氧发酵罐优化进水形式，可直接将菌渣送入全混式厌氧发酵罐，无需其他废水稀释混合,无需气液混合，无喷嘴形式，结构更简单，避免长期运行后的堵塞问题，使菌渣进行内部循环混合，无需机械搅拌，节约原菌渣加热成本。厌氧发酵虽然对菌渣进行了资源化利用，但在厌氧发酵过程中会产生大量的废水及有害气体，同时无法对抗生素菌渣中残留抗生素进行彻底的降解，后续还存在着一定的环境危害性。专利CN105624074A公开了一种抗生素菌渣的无害化处理方法，该发明在抗生素菌渣加葡萄糖、微生物复合菌种和草粉，混匀，培养制成固体发酵菌种。然后，将此菌种、草粉和新鲜抗生素菌渣按重量比例混合，发酵72-96h，获得高蛋白的抗生素无害化发酵菌渣。菌渣发酵产物经烘干、研磨粉碎、60目过筛后获得发酵的高蛋白菌粉。该发明虽然实现了抗生素的降解及菌渣的资源化利用，但该方法所需时间长，且微生物复合菌种的的选择具有特异性。专利CN201611114029.8公开了一种发酵类抗生素菌渣的无害化处理方法，发明采用嗜热水解产酸菌对发酵类抗生素菌渣进行高温厌氧产酸发酵处理，菌渣水解酸化，菌渣中的抗生素产生菌灭活，残留的抗生素降解，然后再进行生化处理，将抗生素菌渣无害化、资源化。该方法虽然能将菌渣中抗生素产生菌完全杀灭，无抗生素残留，生化处理后的菌渣无抗药菌及抗药基因产生危险，但处理时间长，且会产生大量有毒有害气体及废水增加了二次处理的成本。

在抗生素污染日益严重，并且固相材料中的大环内酯类抗生素缺乏有效的治理技术与治理手段的前提下，开发低成本、高效率的消除固体中大环内酯类抗生素污染问题的新技术，对于环保和废物治理而言，其意义重大。

发明内容

本发明的目的是为了彻底降解菌渣中残留大环内酯抗生素，同时降解后的抗生素菌渣可以再度用于发酵中，实现资源的综合利用。为了克服现有在降解抗生素菌渣过程中存在的化学试剂用量较大、工艺繁琐、成本高、降解不彻底、缺乏对抗生素菌渣再利用等问题，提出一种大环内酯类抗生素发酵废弃物残留抗生素降解的方法。

基于前期基础研究结论，本发明通过使用可变价态过渡金属及其盐作为氧化剂，具有吸水能力和固体电子转移能力且廉价的非氧化性金属氧化物作为反应体系的助剂，两者共同组成球磨助剂。通过使用行星式球磨仪，菌渣加入一定比例的球磨助剂，在一定频率下球磨一段时间，达到直接降解抗生素的目的。在机械化学处理过程中，机械力活化球磨助剂中的过渡金属盐化其为强氧化剂，通过与助氧化剂和菌渣生物质的络合，延长自由基寿命，促进大环内酯类抗生素的氧化降解。由于本发明全部为固相下进行，够避免沉淀作用和巯基、羟基等络合物对芬顿过程的干扰，而且使用试剂价格低廉，方法简便且便于实施。处理后无需外加溶液洗涤，更环保经济。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种大环内酯类抗生素发酵废弃物残留抗生素降解的方法，包括如下步骤：称取抗生素菌渣，加入球磨助剂和球磨介质，调节球磨机转速，设定球磨时间，球磨完的抗生素菌渣通过提取后HPLC含量分析其中抗生素的残留量。

进一步地，抗生素菌渣为大环内酯类抗生素发酵废弃物，为下列之一：红霉素菌渣、阿维菌素菌渣。

进一步地，球磨助剂包括氧化剂与助氧化剂，氧化剂为氯化铁、氯化亚铁、硫酸铁、硫酸亚铁、高铁酸钾、氯化铜、氧化铜、二氧化锰、铁粉中的一种或几种的混合物，优选为氯化铁；助氧化剂为氧化钙、氧化镁、氧化锌和二氧化硅的一种，优选为氧化钙；其中氧化剂质量占球磨助剂总质量的10％-90％，优选为40％。进一步地，球磨助剂的质量与抗生素菌渣的质量比为5％～90％优选为50％；球磨介质为不锈钢球磨珠，球料比为1：1～10：1，优选为8：1。

进一步地，不锈钢球磨珠的直径为10～25mm，优选为15mm；球磨频率为100～500rpm，优选为350rpm；球磨时间为50～250min，优选为150min。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：

(1)相比于传统方法焚烧法、填埋法、饲料化和肥料化法，本发明不仅实现了抗生素的廉价且高效降解，同时处理后的菌渣能够直接机型再利用，发酵产生抗生素。

(2)本发明所使用的氧化剂与助剂在自然界中大量存在，不会造成环境二次污染。

(3)本发明在固相条件下进行，不会产生废气及废液，固体粉末易于方便保存，且处理后的菌渣粉末可直接作为发酵原料投入使用。

(4)本发明所述降解条件，操作简单、处理时间短、降解效率高。

附图说明

图1是氧化剂与助氧化剂选择对于红霉素降解效果图；

图2是氧化剂与助氧化剂配比以及球磨助剂与菌渣比对于红霉素降解效果；

图3是球料比、球磨转数、球磨时间及球磨珠直径对于红霉素降解的影响；

图4样品的抑菌效果评价(以金黄色葡萄球菌的生长影响来计算)。

具体实施方式

下面结合实施例和说明书附图对本发明做进一步地说明，但本发明的保护范围并不仅限于此。

实施例1

红霉素的降解率采用下述方法测定，被测样品用提取液(5mL 0.01M/LTris-0.02M/L CaCl₂，pH＝6)，2500rpm涡旋提取2min，然后加入萃取剂(15mL)于上述50mL离心管中，继续涡旋3min以确保完全分散，最后以10000rpm离心5min。将离心后的下层液体旋干用10mL甲醇溶液复溶后过0.45um有机膜，转移至2mL琥珀色玻璃小瓶进液相分析。采用高效液相色谱测定红霉素含量，使用安捷伦C₁₈(250mm×4.6mm，1.7μm)柱，柱温度保持在25℃，等度洗脱，采用流动相A(0.01M，KH₂PO₄)/B(乙腈)＝60％：40％，进样量10uL，流速0.68mL/min，运行时间45min。根据标准曲线外标法获得红霉素的含量，进而计算样品红霉素的残留量(g/Kg)。

降解率(红霉素)％＝(降解后菌渣抗生素含量/降解前菌渣抗生素含量)*100％

实施例2

以红霉素菌渣作为研究对象，称取5g抗生素菌渣，加入1.5g氯化铁(FeCl₃)，1.5g氧化钙(CaO)，15mm不锈钢钢珠63g。调节球磨机转速350rpm，球磨时间150min。球磨完的抗生素菌渣通过提取后HPLC含量分析，根据实施例1所述方法计算菌渣中红霉素降解率。

实施例3

以红霉素菌渣作为研究对象，称取5g抗生素菌渣，加入1.5g氯化亚铁(FeCl₂)，1.5gCaO，15mm不锈钢钢珠63g。调节球磨机转速350rpm，球磨时间150min。球磨完的抗生素菌渣通过提取后HPLC含量分析，根据实施例1所述方法计算菌渣中红霉素降解率。

实施例4

以红霉素菌渣作为研究对象，称取5g抗生素菌渣，加入1.5g硫酸铁(Fe₂(SO₄)₃)，1.5gCaO，15mm不锈钢钢珠63g。调节球磨机转速350rpm，球磨时间150min。球磨完的抗生素菌渣通过提取后HPLC含量分析，根据实施例1所述方法计算菌渣中红霉素降解率。

实施例5

以红霉素菌渣作为研究对象，称取5g抗生素菌渣，加入1.4g硫酸亚铁(FeSO₄)，1.5gCaO，15mm不锈钢钢珠63g。调节球磨机转速350rpm，球磨时间150min。球磨完的抗生素菌渣通过提取后HPLC含量分析，根据实施例1所述方法计算菌渣中红霉素降解率。

实施例6

以红霉素菌渣作为研究对象，称取5g抗生素菌渣，加入1.5g氯化铜(CuCl₂)，1.5gCaO，15mm不锈钢钢珠63g。调节球磨机转速350rpm，球磨时间150min。球磨完的抗生素菌渣通过提取后HPLC含量分析，根据实施例1所述方法计算菌渣中红霉素降解率。

实施例7

以红霉素菌渣作为研究对象，称取5g抗生素菌渣，加入1.5g高铁酸钾(K₂FeO₄)，1.5gCaO，15mm不锈钢钢珠63g。调节球磨机转速350rpm，球磨时间150min。球磨完的抗生素菌渣通过提取后HPLC含量分析，根据实施例1所述方法计算菌渣中红霉素降解率。

实施例8

以红霉素菌渣作为研究对象，称取5g抗生素菌渣，加入1.5g铁粉，1.5gCaO，15mm不锈钢钢珠63g。调节球磨机转速350rpm，球磨时间150min。球磨完的抗生素菌渣通过提取后HPLC含量分析，根据实施例1所述方法计算菌渣中红霉素降解率。

实施例9

以红霉素菌渣作为研究对象，称取5g抗生素菌渣，加入1.5g二氧化锰，1.5gCaO，15mm不锈钢钢珠63g。调节球磨机转速350rpm，球磨时间150min。球磨完的抗生素菌渣通过提取后HPLC含量分析，根据实施例1所述方法计算菌渣中红霉素降解率。

实施例10

以红霉素菌渣作为研究对象，称取5g抗生素菌渣，加入1.5g氧化铜，1.5gCaO，15mm不锈钢钢珠63g。调节球磨机转速350rpm，球磨时间150min。球磨完的抗生素菌渣通过提取后HPLC含量分析，根据实施例1所述方法计算菌渣中红霉素降解率。

如图1中的A所示，可以发现采用不同的氧化剂，对于菌渣中抗生素的降解效果差异较大，其中二价与三价的铁盐降解效果最佳，其中氯化铁效果明显优于其他铁盐，符合芬顿氧化的规律。

实施例11

以红霉素菌渣作为研究对象，称取5g抗生素菌渣，加入1.5gFeCl₃，1.5g氧化锌(ZnO)，15mm不锈钢钢珠63g。调节球磨机转速350rpm，球磨时间150min。球磨完的抗生素菌渣通过提取后HPLC含量分析，根据实施例1所述方法计算菌渣中红霉素降解率。

实施例12

以红霉素菌渣作为研究对象，称取5g抗生素菌渣，加入1.5gFeCl₃，1.5g氧化镁(MgO)，15mm不锈钢钢珠63g。调节球磨机转速350rpm，球磨时间150min。球磨完的抗生素菌渣通过提取后HPLC含量分析，根据实施例1所述方法计算菌渣中红霉素降解率。

实施例13

以红霉素菌渣作为研究对象，称取5g抗生素菌渣，加入1.5gFeCl₃，1.5g二氧化硅(SiO₂)，15mm不锈钢钢珠63g。调节球磨机转速350rpm，球磨时间150min。球磨完的抗生素菌渣通过提取后HPLC含量分析，根据实施例1所述方法计算菌渣中红霉素降解率。

如图1中的B所示，可以发现采用不同的助氧化剂同样影响降解的效果，辅助氧化剂的作用在于吸水及辅助固相电子传递，所以具有吸水和电子传递作用的氧化钙效果最佳。

实施例14

以红霉素菌渣作为研究对象，称取5g抗生素菌渣，加入不同比例FeCl₃，CaO，维持总质量为3g，15mm不锈钢钢珠63g，调节球磨机转速350rpm，球磨时间150min。球磨完的抗生素菌渣通过提取后HPLC含量分析，通过红霉素降解率优化氧化剂和助剂的配比，如图2中的A所示，结果表明，降解效率随着CaO的量增加而改变，当FeCl₃占试剂总量40％时降解率最大，说明该条件下能够最好的激活氧化剂，并且有足够的助剂来介导反应过程中固相系统的电子转移。

实施例15

以红霉素菌渣作为研究对象，称取5g抗生素菌渣，按照FeCl₃与CaO,2:3的比例混合(FeCl₃占总质量40％)，改变球磨助剂的总添加量，15mm不锈钢钢珠63g，调节球磨机转速350rpm，球磨时间150min。球磨完的抗生素菌渣通过提取后HPLC含量分析，通过红霉素降解率优化球磨助剂与菌渣的配比，如图2中的B所示，结果表明，降解效率随着球磨助剂的量增加而改变，当球磨助剂占总研磨物50％时降解率最大，并且不会随着添加量增加，说明该条件下氧化剂足够催化氧化反应，氧化所有的抗生素，为了增大处理量，选择50％作为球磨助剂用量。

实施例16

以红霉素菌渣作为研究对象，称取不同质量抗生素菌渣，加入菌渣质量40％的FeCl₃与CaO，氧化剂和助氧化剂的质量为2：3，15mm不锈钢钢珠的63g，改变球料比，分别为1:1、2:2、4:1、8:1、10:1、20:1，调节球磨机转速350rpm，球磨时间150min。球磨完的抗生素菌渣通过提取后HPLC含量分析，通过红霉素降解率优化球料比，如图3中的A所示，结果表明，随着球料比增加降解效率先增加后减少，当球料比8：1的时候最大，说明该条件下球磨罐内有足够的运动空间，并且球磨可以提供足够的机械能催化氧化反应。

实施例17

以红霉素菌渣作为研究对象，称取5g抗生素菌渣，加入1.0gFeCl₃，1.5gCaO，15mm不锈钢钢珠63g。调节球磨机转速，分别为100rpm，150rpm，200rpm，250rpm，300rpm，350rpm，400rpm，450rpm，500rpm.球磨时间150min。球磨完的抗生素菌渣通过提取后HPLC含量分析，通过红霉素降解率优化球磨时间，如图3中的B所示，结果表明，随着球磨频率增加降解效率增加，当球磨频率350rpm时候最大并平衡，说明该条件下提供足够的反应能量，而避免能量转化为热能导致能量浪费。

实施例18

以红霉素菌渣作为研究对象，称取5g抗生素菌渣，加入1.0gFeCl₃，1.5gCaO，分别加入5mm、10mm、15mm、20mm、25mm直径的不锈钢钢珠63g，调节球磨机转速350rpm，球磨时间150min。球磨完的抗生素菌渣通过提取后HPLC含量分析，通过红霉素降解率优化不锈钢珠的直径，如图3中的D所示，结果表明，随着球磨珠直径的增加，提供的机械力显著提升，降解率呈现增大的状态，但当球磨珠直径大于15mm后，由于运动空间减小，提供的动能显著下降，所以降解率下降，所以最佳的球磨珠直径为15mm。

实施例19

以红霉素菌渣作为研究对象，称取5g抗生素菌渣，加入1.0gFeCl₃，1.5gCaO，15mm不锈钢钢珠63g。调节球磨机转速350rpm.设定球磨时间分别为50min,100min,150min,200min,250min。球磨完的抗生素菌渣通过提取后HPLC含量分析，通过红霉素降解率优化球磨时间，如图3中的C所示，结果表明，随着球磨时间的增加降解效率增加，当球磨150分钟的时候降解率最大并平衡，说明该条件下提供足够的反应能量，为了增加效率优选150分钟

实施例20

最佳降解工艺，称取5g抗生素菌渣，加入1.0g FeCl3，1.5g CaO，15mm不锈钢钢珠63g。调节球磨机转速350rpm.设定球磨时间150min。球磨完的抗生素菌渣通过提取后HPLC含量分析，对比球磨前浓度获得红霉素的降解率，实验重复3次，测得红霉素降解率为99.53±0.12％，进一步经液质联用分析，如表1所示，降解产物的种类主要为无抗生活性的开环和氧化后红霉素。

表1红霉素降解产物得确认

实施例21

阿维菌素的降解效果，称取5g抗生素菌渣，加入1.0g FeCl₃，1.5g CaO，15mm不锈钢钢珠63g。调节球磨机转速350rpm.设定球磨时间150min。球磨完的抗生素菌渣通过提取后HPLC含量分析，对比球磨前的阿维菌素浓度获得阿维菌素的降解率，实验重复3次，阿维菌素菌渣中阿维菌素的降解率为99.65±0.07％。进一步经液质联用分析，如表2所示，降解产物的种类主要为无抗生活性的开环和氧化后阿维菌素。

表2阿维菌素及其主要降解产物

实施例22

降解菌渣抗菌活性，取实施例20方法降解后的红霉素菌渣，以常见用金黄色葡萄球菌来评价红霉素菌渣的脱抗情况。首先将配制好100mg/L红霉素标准液，然后分别称取5g样品溶于30mL水，2500rpm，涡旋3min，后在4000rpm的离心机上离心20min，取上清液，在超净工作台里面过0.45μm的滤膜，除去反应液中微生物的影响。然后，分别添加不同比例的红霉素菌渣上清过滤液和金黄色葡萄球菌一起生长，接着用SHIMADZU UV-1800每间隔一段时间测定测金黄色葡萄球菌的OD₆₀₀值，如图4所示。实验结果表明未处理红霉素菌渣组几乎完全抑制金黄色葡萄球菌的生长，22小时内金黄色葡萄球菌的生长量不到空白组的30％。而实施例20，金黄色葡萄球菌的生长态势仅微微受到影响，前期虽然受到轻微抑制，但是24小时后金黄色葡萄球菌的生长量基本与空白组一致。从抑菌性能来看，实施例20所述的处理工艺对于红霉素菌渣的脱抗效果，明显要好于未处理前的脱抗效果，说明该方法能够实际脱去抗生素并且避免其转化为还具有抗生活性的物质，彻底消灭其抗菌活性，便于菌渣的再利用。

实施例23

取60g蛋白胨、实施例20所述降解后的菌渣及原菌渣，20g/L蛋白胨，0.2g/LKH₂PO₄，0.25g/L硫酸镁，制成红霉素摇瓶发酵培养基。灭菌后，取50mL发酵培养液至250mL锥形瓶中。菌株选取BNCC红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)153143，进行活化，从已经生长好的平板上挖出一块大小为1cm²的孢子接种，接种结束后将其在34℃，220rpm条件下发酵120h。其中，在摇瓶发酵至24h时补加1％的正丙醇。发酵结束后使用HPLC测得红霉素A含量。实验结果如下表3，结果表明，原菌渣与实施例20所述的脱抗降解菌渣均能够作为红霉素发酵的培养基材料，但是处理后的菌渣接种BNCC红色糖多孢菌后，其生长并未受到抑制，并且菌渣降解丰富蛋白质为菌丝生长提供了优质氮源，其红霉素得率均明显高于蛋白胨以及未降解菌渣作为氮源的发酵水平，说明上述发酵菌渣可以作为红霉素培养的培养基氮源，并且效果优于未降解的菌渣。

表3：菌渣降解培养再发酵红霉素的效果

Claims (6)

1.一种大环内酯类抗生素发酵废弃物残留抗生素降解的方法，其特征在于，包括如下步骤：称取抗生素菌渣，加入球磨助剂和球磨介质，调节球磨机转速，设定球磨时间，球磨完的抗生素菌渣通过提取后HPLC含量分析其中抗生素的残留量；

球磨助剂包括氧化剂与助氧化剂，氧化剂为氯化铁、氯化亚铁、硫酸铁、硫酸亚铁、高铁酸钾、氯化铜、氧化铜、二氧化锰、铁粉中的一种或几种的混合物，助氧化剂为氧化钙、氧化镁、氧化锌和二氧化硅的一种，其中氧化剂质量占球磨助剂总质量的10%-90%；

球磨助剂的质量与抗生素菌渣的质量比为5%~90%，球料比为1：1~10：1。

2.如权利要求1所述的一种大环内酯类抗生素发酵废弃物残留抗生素降解的方法，其特征在于，抗生素菌渣为大环内酯类抗生素发酵废弃物，为下列之一：红霉素菌渣、阿维菌素菌渣。

3.如权利要求1所述的一种大环内酯类抗生素发酵废弃物残留抗生素降解的方法，其特征在于，氧化剂为氯化铁；助氧化剂为氧化钙；氧化剂质量占球磨助剂总质量的40%。

4.如权利要求1所述的一种大环内酯类抗生素发酵废弃物残留抗生素降解的方法，其特征在于，球磨助剂的质量与抗生素菌渣的质量比为50%；球磨介质为不锈钢球磨珠，球料比为8：1。

5.如权利要求4所述的一种大环内酯类抗生素发酵废弃物残留抗生素降解的方法，其特征在于，不锈钢球磨珠的直径为10~25 mm ；球磨频率为100~500 rpm；球磨时间为50~250min。

6.如权利要求5所述的一种大环内酯类抗生素发酵废弃物残留抗生素降解的方法，其特征在于，不锈钢球磨珠的直径为15mm，球磨频率为350 rpm，球磨时间为150 min。