CN119685167A

CN119685167A - 藻-菌共培养复合体及其培养方法和利用其生产生物质的方法、生物质和相关产品

Info

Publication number: CN119685167A
Application number: CN202411762417.1A
Authority: CN
Inventors: 庄国强; 王�锋; 马安周; 赵宇嵘
Original assignee: Binzhou Lvdong Thermal Power Co ltd; Binzhou Weiqiao National Institute Of Advanced Technology
Current assignee: Binzhou Lvdong Thermal Power Co ltd; Binzhou Weiqiao National Institute Of Advanced Technology
Priority date: 2024-12-03
Filing date: 2024-12-03
Publication date: 2025-03-25

Abstract

本申请涉及生物工程技术领域，公开一种藻‑菌共培养复合体，由微藻与趋磁细菌共培养获得。微藻表面生物烃的组成能够为趋磁细菌提供相对厌氧的生长环境，实现两者的附着共生。同时，趋磁细菌在细胞内合成的磁小体颗粒、糖肽等物质能够通过胞吞作用进入微藻细胞内，促进其烃的合成，从而增加了藻细胞烃的积累；表面附着的趋磁细菌和藻细胞内的磁小体使微藻被赋予了磁性细胞的特性，通过外加磁场即可实现细胞的回收，磁性分离回收操作简单、分离速度快、能耗低，且回收率高。本申请还公开一种藻‑菌共培养复合体的培养方法及利用其生产生物质的方法、生物质和相关产品。

Description

藻-菌共培养复合体及其培养方法和利用其生产生物质的方法、生物质和相关产品

技术领域

本申请涉及生物工程技术领域，例如涉及一种藻-菌共培养体系及其培养方法和利用其生产生物质的方法、生物质和相关产品。

背景技术

随着能源需求的增加，化石燃料的生产和使用造成了严重的环境问题和碳排放危机，工业化造成温室气体迅速增加而引起的全球变暖对全球的可持续性发展构成了重大挑战，带来了包括海平面上升、物种灭绝与生物多样性危机、食品安全危机等诸多问题。光合作用是生物以光能作为能量来源，将CO₂吸收到体内并转化为有机物的过程，是自然界在长达数十亿年的时间内进化形成的CO₂高效固定手段，也是生物圈物质与能量流动的原动力。近年来，利用光合自养微藻进行CO₂生物固定，越来越引起了人们的关注。利用微藻固碳有许多优点，可以在不竞争耕地的情况下，通过光自养培养获得高细胞密度。其次，许多微藻物种通常对高浓度的CO₂有很好的耐受性，并能以生态友好的方式固定不同来源的CO₂。微藻利用CO₂生产的生物活性物如脂质、蛋白质、维生素和类胡萝卜素等，可用于食品、饲料、生物燃料和医药产品等，从而降低了固碳成本。

微藻可通过自身的光合作用，利用光能将CO₂和水转化成多种化学物质，包括糖类、蛋白、脂质、维生素等，可广泛应用于食品、药品及食品添加剂等的生产。微藻还可积累大量的油脂及烃类物质，是一种优良的能源生物。与其他能源生物相比，微藻具有生长速度快、油脂含量高、分布范围广、产生的能量形式多样等优点，微藻生产油脂的组成中不含硫元素，燃烧时不排放有害有毒气体，有利于生态环境，因此利用微藻生产生物燃料具有重要的应用前景。微藻生长又可以消耗大量的二氧化碳，从微藻到油的生产过程也可以实现零排放，具有良好的环保效益，对缓解人类面临的粮食、能源、环境三大危机有着巨大的潜力。迄今所发现具有产烃能力的藻类至少有布朗葡萄球藻、盐藻、小球藻、倒囊藻、网翼藻、小环藻等，烃含量最高、研究最多、最可望成为工业藻种的还是葡萄藻。

微藻的采收一直是微藻生产过程的瓶颈，寻求一种高效、经济、适用于多数微藻的采收方法对于微藻生物能源的生产具有重要意义。

需要说明的是，在上述背景技术部分公开的信息仅用于加强对本申请的背景的理解，因此可以包括不构成对本领域普通技术人员已知的现有技术的信息。

发明内容

为了对披露的实施例的一些方面有基本的理解，下面给出了简单的概括。所述概括不是泛泛评述，也不是要确定关键/重要组成元素或描绘这些实施例的保护范围，而是作为后面的详细说明的序言。

本公开实施例提供了一种藻-菌共培养复合体及其培养方法和利用其生产生物质的方法、生物质和相关产品，由微藻与趋磁细菌共培养获得的藻-菌共培养复合体被赋予了磁性细胞的特性，通过外加磁场实现细胞的回收，回收简便；而且能够促进烃的合成，从而增加了藻细胞烃的积累。

在一些实施例中，一种藻-菌共培养复合体，由微藻与趋磁细菌共培养获得。

在一些实施例中，所述藻-菌共培养复合体的培养方法，包括：将微藻细胞分散至微藻培养基中，获得微藻细胞悬浮液；将趋磁细菌培养混合液接种至微藻细胞悬浮液中，共培养，获得藻-菌共培养复合体。

在一些实施例中，所述利用藻-菌共培养复合体获取生物质的方法，包括：向藻-菌共培养复合体中加入提取剂，提取处理后，利用磁力分离出提取后的藻-菌共培养复合体，获得提取液；将提取液进行处理，获得生物质。

在一些实施例中，所述生物质，由前述的藻-菌共培养复合体提取获得；或者，由前述的藻-菌共培养复合体的培养方法培养获得的藻-菌共培养复合体提取获得；或者，通过前述的利用藻-菌共培养复合体获取生物质的方法获取。

在一些实施例中，所述生物柴油，包括前述的生物质。

在一些实施例中，所述航天煤油，包括前述的生物质。

在一些实施例中，所述饲料，包括前述的藻-菌共培养复合体；或者，包括前述的藻-菌共培养复合体的培养方法培养获得的藻-菌共培养复合体；或者，包括前述的生物质。

本公开实施例提供的藻-菌共培养复合体及其培养方法和利用其生产生物质的方法、生物质和相关产品，可以实现以下技术效果：

本公开实施例的藻-菌共培养复合体，由微藻与趋磁细菌按照预设比例共培养获得，微藻表面生物烃的组成能够为趋磁细菌提供相对厌氧的生长环境，实现两者的附着共生。同时，趋磁细菌在细胞内合成的磁小体颗粒、糖肽等物质能够通过胞吞作用进入微藻细胞内，磁小体等趋磁细菌胞内物的进入能够引起具有生产生物质能力的微藻胞内活性氧(ROS)升高等应激反应，促进其烃(或油脂)的合成，从而增加了藻细胞生物质(烃或油脂)的积累。表面附着的趋磁细菌和藻细胞内的磁小体使微藻被赋予了磁性细胞的特性，通过外加磁场即可实现细胞的回收，磁性分离回收操作简单、分离速度快、能耗低，且回收率高。

本公开实施例的藻-菌共培养复合体的培养方法简便易行，且藻-菌共培养复合体的带磁性使其回收方便，且回收率高。而且在利用藻-菌共培养复合体获取生物质(生物烃、生物油脂等)的过程中，提取后的藻-菌共培养复合体的带磁性亦使得其回收方便，且回收率高。

本公开实施例中包括生物质的相关产品，例如，生物航空煤油、生物柴油和饲料等，减少碳排放和改善环境质量，绿色环保；添加至饲料后能够提高饲料的营养价值。

以上的总体描述和下文中的描述仅是示例性和解释性的，不用于限制本申请。

附图说明

一个或多个实施例通过与之对应的附图进行示例性说明，这些示例性说明和附图并不构成对实施例的限定，附图中具有相同参考数字标号的元件示为类似的元件，附图不构成比例限制，并且其中：

图1是本公开实施例提供的一种藻-菌共培养复合体的培养方法的流程框图；

图2是本公开实施例提供的一种利用藻-菌共培养复合体获取生物质的方法的流程框图；

图3是本公开实施例提供的另一种利用藻-菌共培养复合体获取生物质的方法的流程框图；

图4是本公开实施例的实施例3的不同培养体系的生物量、总烃产量和总烃产率的测定结果图；

图5是本公开实施例的实施例3的不同藻-菌比例下的藻体磁性分离回收率的测定结构柱状图；

图6是本公开实施例的实施例4的不同一元醇的提取剂下的生物烃提取率和再培养后的总烃产量的测定结果图；

图7是本公开实施例的实施例4的不同的正己烷与乙醇体积比下的生物烃提取率和再培养后的总烃产量的测定结果图；

图8是本公开实施例的实施例4的藻-菌共培养体系重复利用产生物烃的稳定性的测定结果图。

具体实施方式

为了能够更加详尽地了解本公开实施例的特点与技术内容，下面结合附图对本公开实施例的实现进行详细阐述，所附附图仅供参考说明之用，并非用来限定本公开实施例。在以下的技术描述中，为方便解释起见，通过多个细节以提供对所披露实施例的充分理解。然而，在没有这些细节的情况下，一个或多个实施例仍然可以实施。在其它情况下，为简化附图，熟知的结构和装置可以简化展示。

本公开实施例的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的术语在适当情况下可以互换，以便这里描述的本公开实施例的实施例。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。

除非另有说明，术语“多个”表示两个或两个以上。

本公开实施例中，字符“/”表示前后对象是一种“或”的关系。例如，A/B表示：A或B。

术语“和/或”是一种描述对象的关联关系，表示可以存在三种关系。例如，A和/或B，表示：A或B，或，A和B这三种关系。

需要说明的是，在不冲突的情况下，本公开实施例中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

本公开实施例提供一种藻-菌共培养复合体，由微藻与趋磁细菌共培养获得。

本公开实施例的藻-菌共培养复合体，由微藻与趋磁细菌按照预设比例共培养获得，趋磁细菌能够在细胞内合成由生物膜包被、链状排列、纳米级、单磁畴的磁铁矿(Fe₃O₄)的磁小体颗粒、糖肽等物质，具有良好的生物相容性，通过胞吞作用进入微藻细胞内，磁小体等趋磁细菌胞内物的进入引起微藻胞内活性氧(ROS)升高等应激反应，促进微藻的生长，表面附着的趋磁细菌和藻细胞内的磁小体使微藻被赋予了磁性细胞的特性，通过外加磁场实现细胞的回收/采收，利用磁性进行微藻的回收/采收高效、经济、适用于多种微藻，对微藻的生产，尤其是微藻生物能源的生产具有重要意义。

本公开实施例中，微藻包括具有生产生物质能力的微藻。其中，生物质包括但不限于生物烃(烃类物质)、生物油脂、糖类、蛋白、脂质、维生素等。微藻表面生物质(生物烃/生物油脂等)的组成能够为趋磁细菌提供相对厌氧的生长环境，实现两者的附着共生；藻-菌共培养体系下藻细胞的细胞膜完整性发生改变，胞内外传质能力增强，有利于微藻的代谢产物合成；微藻(例如，布朗葡萄球藻)生长过程中会释放多糖和蛋白等胞外代谢物，可被周围的趋磁细菌利用，促进趋磁细菌的生长；而趋磁细菌能够在细胞内合成由生物膜包被、链状排列、纳米级、单磁畴的磁铁矿(Fe₃O₄)的磁小体颗粒、糖肽等物质，具有良好的生物相容性，通过胞吞作用进入微藻细胞内，磁小体等趋磁细菌胞内物的进入引起微藻胞内活性氧(ROS)升高等应激反应，促进其烃的合成，从而增加了藻细胞烃的积累；表面附着的趋磁细菌和藻细胞内的磁小体使微藻被赋予了磁性细胞的特性，通过外加磁场实现细胞的回收。

本公开实施例中，经共培养后的藻-菌共培养复合体通过合适的溶剂体系提取生物烃后，该藻-菌共培养复合体可继续进入培养基培养，实现藻-菌细胞的重复利用，进行生物烃的生产。

本公开实施例通过微藻与趋磁细菌共培养，构建稳定的可持续利用的藻-菌共培养复合体用于生物烃的生产，生物相容性好的趋磁细菌磁小体能够促进微藻生物烃的积累，提高生物烃产量，同时赋予复合体磁特性，可以利用磁性分离技术进行分离，实现细胞的高效回收和重复利用。而且磁性分离具有操作简单、分离速度快、能耗低等优点。

本公开实施例中，微藻包括具有生产生物质能力的微藻。例如，布朗葡萄球藻、盐藻、小球藻、倒囊藻、网翼藻、小环藻和微拟球藻等工业藻种。

可选地，微藻包括以下微藻中的一种或几种：布朗葡萄球藻、盐藻、小球藻、倒囊藻、网翼藻、小环藻和微拟球藻。

可选地，微藻包括布朗葡萄球藻。布朗葡萄球藻是属于绿藻口、绿藻纲、绿球藻目、布朗葡萄球藻科、布朗葡萄球藻属的一种淡水或微咸水单细胞微藻，含有胞外多糖、脂肪酸和烃类等产物，自身具有高烃产率，高于其它微藻和微生物的产烃，而且布朗葡萄球藻所产烃的组成和结构与石油极其相似，因此利用布朗葡萄球藻能够生产无污染、可再生的石油替代品，具有潜在的应用价值。布朗葡萄球藻具有明显的细胞壁，细胞壁分内外两层，内层由粘性多糖构成纤维状，外层由三层薄层形成鞘。且布朗葡萄球藻可以将3％的太阳能转化为烃类物质，而布朗葡萄烃的热值可达30,000～42,000KJ/Kg。布朗葡萄球藻积累的烃类物质储存在细胞的外壁上。

本公开实施例中，微藻的藻种购买即可，例如，可于中国科学院淡水藻种库(FACHB)购买。

本公开实施例中，趋磁细菌购买即可。例如，可于中国普通微生物保藏管理中心购买。

可选地，趋磁细菌包括α-变形菌纲趋磁细菌。该α-变形菌纲趋磁细菌容易获得，且α-变形菌纲趋磁细菌都是微好氧或厌氧菌，最适生长温度通常低于30℃，还具有向低氧区运动的特点。

可选地，趋磁细菌包括形状为螺旋状的趋磁螺旋菌。

可选地，趋磁细菌包括α-变形菌纲的形状为螺旋状的趋磁螺旋菌。

可选地，趋磁细菌包括磁螺菌。磁螺菌购买即可。例如，趋磁细菌包括格利菲斯瓦尔德镇磁螺菌(Magnetospirillum gryphiswaldense)，可购买于中国普通微生物保藏管理中心。

在一些实施例中，藻-菌共培养复合体由微藻与趋磁细菌共培养获得，包括：将微藻细胞悬浮液与趋磁细菌培养混合液按预设比例进行共培养获得。其中，预设比例包括微藻细胞悬浮液与趋磁细菌的培养液的体积比为100﹕1至1000﹕1。可选地，微藻细胞悬浮液与趋磁细菌的培养液的体积比可以是100﹕1、200﹕1、300﹕1、400﹕1、500﹕1、600﹕1、700﹕1、800﹕1、900﹕1、1000﹕1或者在上述体积比区间内的任意比例。

本实施例中，微藻细胞悬浮液是将微藻细胞分散于微藻培养基中获得的悬浮液。其中分散比例不限，依据实际情况确定。可选地，微藻细胞悬浮液中，微藻细胞占比为2～5g细胞干重/L。可选地，微藻细胞占比为2、3、4、5或者2～5内任意数值，不限。

本实施例中，微藻细胞悬浮液中的微藻细胞是培养至对数生长期时收集的对数生长期微藻细胞。

本实施例中，趋磁细菌培养混合液为将趋磁细胞加入趋磁细胞培养基中进行培养获得的。可选地，趋磁细菌培养混合液为将趋磁细胞加入趋磁细胞培养基中进行培养至对数生长期时的培养混合液。

可选地，趋磁细菌培养混合液是通过将趋磁细菌培养至对数生长期时的趋磁细菌培养混合原液经预设稀释倍数稀释后的趋磁细菌培养混合液。本实施例中，预设稀释倍数不限，依据实际情况确定。可选地，预设稀释倍数为2～6倍。可选地，预设稀释倍数为2～5倍。可选地，预设稀释倍数为3～4倍。

在一些实施例中，藻-菌共培养复合体由微藻与趋磁细菌共培养获得，共培养条件包括以下3项中的一项或多项：培养温度为20～30℃；光照强度为30～50μmol/(m²·s)；光暗周期为14～20h(L)/7～10h(D)。其中，14～20h(L)/7～10h(D)是指光照下培养14～20h和黑暗中培养7～10h的交替变化的培养方式。即，“L”表示光照条件，“D”表示黑暗条件。可以理解的是，共培养条件中不限于上述各项以及各项的范围，在实际共培养过程中，可根据实际情况确定。

可选地，共培养条件包括以下3项中的一项或多项：培养温度为23～28℃；光照强度为30～40μmol/(m²·s)；光暗周期为15～18h L/7～9h D。

可选地，共培养条件包括以下3项中的一项或多项：培养温度为25℃；光照强度为35μmol/(m²·s)；光暗周期为16h(L)/8h(D)。

结合图1所示，本公开实施例提供一种藻-菌共培养复合体的培养方法，包括以下步骤：

S11、将微藻细胞分散至微藻培养基中，获得微藻细胞悬浮液；

S12、将趋磁细菌培养混合液接种至微藻细胞悬浮液中，共培养，获得藻-菌共培养复合体。

本公开实施例的藻-菌共培养复合体的培养方法中，在微藻细胞与趋磁细菌共培养过程中，趋磁细菌与微藻附着共生，同时趋磁细菌在其细胞内合成的磁小体颗粒等物质基于胞吞作用进入微藻细胞内，形成了藻-菌共培养复合体。该藻-菌共培养复合体中，表面附着的趋磁细菌和微藻细胞内的磁小体使复合体被赋予了磁性细胞的特性，通过外加磁场实现藻-菌共培养复合体的回收。

本公开实施例的步骤S11中，微藻细胞悬浮液中微藻细胞的分散量不限，依据实际需要确定。在一些实施例中，步骤S10的微藻细胞悬浮液的细胞干重浓度为2～5g/L。可选地，细胞干重浓度为2g/L、3g/L、4g/L、5g/L或者2～5g/L内任意数值，不限。

步骤S11中，微藻细胞为处于对数生长期时收集的对数生长期微藻细胞。也即，对数生长期微藻细胞是在对微藻进行培养并在培养至对数生长期时收集的微藻细胞。对数生长期一般是指微藻细胞的数量呈倍数增殖的生长阶段。

步骤S11中的微藻培养基不限，采用与微藻种类适配的常规培养基。例如，微藻包括布朗葡萄球藻时，微藻培养基采用Chu13×2培养基(Chu13培养基组分加倍)。可选地，Chu13培养基中还包括矿物质混合液；其中，矿物质混合液的浓度为2～10mL/L。可选地，矿物质混合液的浓度为4～8mL/L。可选地，矿物质混合液的浓度为5～6mL/L。

在一些实施例中，如图2所示，在步骤S11之前，还包括步骤S10，将微藻加入微藻培养基中，在预设微藻培养条件下培养，培养第一预设时间后，离心，获得微藻细胞。本实施例中，预设微藻培养条件不限，根据微藻种类确定适配的培养条件即可。第一预设时间也根据微藻种类确定，例如，微藻为布朗葡萄球藻时，第一预设时间为20～25天，此时间范围内布朗葡萄球藻处于对数生长期。

可选地，步骤S10中，预设微藻培养条件包括以下中的一项或多项：培养温度为20～30℃；转速为80～150rpm；光照强度为30～50μmol/(m²·s)；光暗周期为14～20h(L)/7～10h(D)。

本实施例中，步骤S10中的离心操作根据微藻种类确定适配的离心条件即可，不限。可选地，离心的条件包括：6000～8000g离心8～15min。可选地，步骤S10中，离心的条件包括：7000g离心10min。

本公开实施例中，微藻的藻种购买即可，例如，可以购买于中国科学院水生生物研究所淡水藻种库。将液体藻种进行纯化处理，获得无菌微藻；然后将无菌微藻进行步骤S10的培养操作获得微藻细胞。

本公开实施例的步骤S12中，趋磁细菌培养混合液是将趋磁细菌加入趋磁细菌培养基中进行培养获得的。在一些实施例中，趋磁细菌培养混合液的获取方法，包括：将趋磁细菌加入趋磁细菌培养基中，在25～30℃，80～150rpm的培养条件下，培养第二预设时间，获得趋磁细菌培养混合液。其中，第二预设时间不限，依据趋磁细菌的具体种类确定。

可选地，第二预设时间为趋磁细菌培养至对数生长期所需的培养时间。本实施例中，趋磁细菌培养混合液为趋磁细菌处于对数生长期的对数期培养混合液。例如，可以通过对趋磁细菌培养混合液的OD₅₆₅值进行检测来确定趋磁细菌是否进入对数生长期，具体地，OD₅₆₅值为1.5～2.5范围内可确定趋磁细菌处于对数生长期。

可选地，步骤S12中，趋磁细菌培养混合液是通过将趋磁细菌培养至对数生长期时的趋磁细菌培养混合原液经预设稀释倍数稀释后的趋磁细菌培养混合液。即，通过稀释可以调整用于接种的趋磁细菌培养混合液中的菌量，调整藻菌细胞比例，提升共培养效果。本实施例中，预设稀释倍数不限定，依据实际情况确定即可。可选地，预设稀释倍数为2～6倍。可选地，预设稀释倍数为2～5倍。可选地，预设稀释倍数为3～4倍。其中，趋磁细菌购买即可，例如，可于中国普通微生物保藏管理中心购买。

可选地，步骤S12中，趋磁细菌包括α-变形菌纲趋磁细菌。

可选地，步骤S12中，趋磁细菌包括形状为螺旋状的趋磁螺旋菌。

可选地，步骤S12中，趋磁细菌包括α-变形菌纲的形状为螺旋状的趋磁螺旋菌。

可选地，趋磁细菌包括磁螺菌。例如，趋磁细菌包括格利菲斯瓦尔德镇磁螺菌(Magnetospirillum gryphiswaldense)，可购买于中国普通微生物保藏管理中心。

本实施例步骤S12中，将趋磁细菌培养混合液接种至微藻细胞悬浮液中，控制微藻细胞悬浮液与趋磁细菌的培养液的体积比为100﹕1至1000﹕1。合适的比例能够确保各自所需生长或诱导因子的比例合适，保证微藻的光合作用，且合适的趋磁细菌比例能够保证后续的回收和对烃及油脂合成的增强作用。

可选地，将趋磁细菌的培养液接种至微藻细胞悬浮液中，控制微藻细胞悬浮液与趋磁细菌的培养液的体积比为200﹕1至800﹕1。

可选地，将趋磁细菌的培养液接种至微藻细胞悬浮液中，控制微藻细胞悬浮液与趋磁细菌的培养液的体积比为400﹕1至600﹕1。

在一些实施例中，步骤S12中，将趋磁细菌培养混合液接种至微藻细胞悬浮液中，共培养，获得藻-菌共培养复合体；包括：将趋磁细菌培养混合液接种至微藻细胞悬浮液中，共培养，获得具有藻-菌共培养复合体的共培养体系；利用磁力将共培养体系中的藻-菌共培养复合体进行分离，获得藻-菌共培养复合体。本实施例中，将藻-菌共培养复合体从培养体系的培养液中分离出来，以便于后续生物质的提取。

可选地，利用磁力将共培养体系中的藻-菌共培养复合体进行分离，包括：将盛装有共培养体系的容器置于强磁磁铁上，藻-菌共培养复合体被磁铁吸引，实现磁性分离，去除上清，获得藻-菌共培养复合体。

本公开实施例的藻-菌共培养复合体的存在形式不限，可以是存在于共培养体系中与培养液共存在混合形式，也可以是分离出来的单独的藻-菌共培养复合体，不限，根据实际情况确定即可。

本公开实施例的步骤S12中，在一些实施例中，共培养条件包括以下中的一项或多项：培养温度为20～30℃，光照强度为30～50μmol/(m²·s)；光暗周期为14～20h(L)/7～10h(D)；培养时间为5～10天。

可选地，共培养条件包括以下中的一项或多项：培养温度为23～28℃，光照强度为30～40μmol/(m²·s)；光暗周期为15～18h(L)/7～9h(D)；培养时间为6～9天。

可选地，共培养条件包括以下中的一项或多项：培养温度为25℃，光照强度为35μmol/(m²·s)；光暗周期为16h(L)/8h(D)；培养时间为8天。

结合图3所示，本公开实施例还提供了一种利用藻-菌共培养复合体获取生物质的方法，包括以下步骤：

S21、向藻-菌共培养复合体中加入提取剂，提取处理后，利用磁力分离出提取后的藻-菌共培养复合体，获得提取液。其中，藻-菌共培养复合体为由共培养体系中分离出来的单纯的藻-菌共培养复合体。

S22、将提取液进行处理，获得生物质。

本公开实施例的获取生物质的方法中，利用提取剂将藻-菌共培养复合体中的生物质提取至提取液中，并利用藻-菌共培养复合体的带磁性，利用磁力吸取固定藻-菌共培养复合体，从而与提取液分离，分离操作简便，从而便于对提取液进行处理获得生物质。其中，生物质包括生物烃、生物油脂、、糖类、蛋白、脂质、维生素等。

本公开实施例中，步骤S21中提取剂的确定根据微藻种类确定，不限。在一些实施例中，提取剂包括正己烷-一元醇体系，其中正己烷与一元醇的体积比为100﹕5至100﹕25。本实施例的正己烷-一元醇体系提取剂可以保证生物质的有效提取。

可选地，正己烷与一元醇的体积比为100﹕10至100﹕20。

可选地，正己烷与一元醇的体积比为100﹕13至100﹕18。

可选地，正己烷与一元醇的体积比为100﹕15。

可选地，一元醇包括碳原子数为1至3的一元醇。例如，一元醇包括：甲醇、乙醇、异丙醇、正丙醇，等等。

在一些实施例中，步骤S21中，将提取液进行处理，获得生物质；包括：将提取液进行真空蒸发处理，除去提取剂，收集烃粗提物；再将烃粗提物经纯化处理后，获得生物质。

其中，纯化处理包括：将烃粗提物上硅胶柱纯化，收集黄色条带出来之前的所有样品，真空蒸发除去洗脱溶剂，惰性气体吹所剩残余。

在一些实施例中，如图3所示，利用藻-菌共培养复合体获取生物质的方法，还包括：S23、将步骤S21中利用磁力分离出的提取后的藻-菌共培养复合体加入培养基，重悬获得悬浮液，进行再培养，获得再培养的共培养体系；将再培养的共培养体系利用磁力分离出再培养的藻-菌共培养复合体；S24、将再培养的藻-菌共培养复合体采用步骤S21和步骤S22的操作进行处理获得生物质和提取后的藻-菌共培养复合体。步骤S24获得的提取后的藻-菌共培养复合体可以通过步骤S23进行再培养，依此重复培养，实现生物质的循环获取以及藻-菌共培养复合体的重复利用。

本公开实施例还提供了一种生物质，由前述任一实施例的藻-菌共培养复合体提取获得；或者，由前述任一实施例的藻-菌共培养复合体的培养方法培养获得的藻-菌共培养复合体提取获得；或者，通过前述任一实施例的利用藻-菌共培养复合体获取生物质的方法获取。

本公开实施例的生物质包括但不限于生物烃(烃类物质)、生物油脂、糖类、蛋白、脂质、维生素等，根据实际需求对藻-菌共培养复合体进行提取即可。

本公开实施例还提供了一种生物柴油，包括前述的生物质。本实施例的生物柴油由包括前述的生物质的原料制成，是“绿色能源”，具有环保性能好、发动机启动性能好、燃料性能好、可再生等特性。

本公开实施例还提供了一种生物航空煤油，包括前述的生物质。

本实施例的生物航空煤油由包括前述生物质的原料制成，减少碳排放和改善环境质量。本实施例中，生物质包括生物烃和/或生物油脂。

本公开实施例还提供了一种饲料，包括前述任一实施例的藻-菌共培养复合体；或者，前述任一实施例的藻-菌共培养复合体的培养方法培养获得的藻-菌共培养复合体；或者，前述的生物质。

本公开实施例中，藻-菌共培养复合体可以直接添加至饲料中，生物质含量高，使得饲料营养更丰富。也可以将由藻-菌共培养复合体提取获得的生物质作为添加剂添加至饲料中，提高饲料的营养价值。本公开实施例的饲料包括动物饲料。

下面提供具体实施例，更具体地说明本公开实施例的藻-菌共培养体系及其培养方法和利用其生产生物质的方法。

实施例1获取布朗葡萄球藻细胞

将布朗葡萄球藻液体藻种吸取100μL布朗葡萄球藻藻液均匀涂布至含有20～50mg/L羧苄青霉素钠Chu13固体平板上进行纯化，培养10天后挑取小球藻单藻落，划线至新的Chu13培养基琼脂平板上，重复3次并通过显微镜镜检以获得无菌布朗葡萄球藻。其中，布朗葡萄球藻液体藻种购买于中国科学院淡水藻种库(FACHB)。

采用Chu13×2培养基(Chu13培养基组分加倍)，培养温度、光照强度、光暗周期和转速分别是25℃、35μmol/(m²·s)、16h L/8h D和100rpm对布朗葡萄球藻培养3周后(微藻处于对数生长期)，将培养液在7000×g离心10min，收集布朗葡萄球藻细胞，获得布朗葡萄球藻细胞。

本实施例1中，Chu13培养基的组分及用量如下表1所示。

表1

成分	浓度(g/L)	微量元素	浓度(g/L)
				KNO₃	0.2	H₃BO₃	0.572
K₂HPO₄﹒3H₂O	0.052	ZnSO₄﹒7H₂O	0.044
				CaCl₂	0.0407	CuSO₄﹒5H₂O	0.016
Na₂-EDTA	0.01	Na₂MoO₄﹒2H₂O	0.012
				微量元素溶液	5mL	CoSO₄﹒7H₂O	0.018

(说明：培养基总体积为1000mL，固体培养基添加1.5％的琼脂)

实施例2获取趋磁细菌培养混合液

将磁螺菌加入趋磁细菌培养基中，进行培养，培养条件：30℃，100rpm；获得对数期的磁螺菌培养液。其中，磁螺菌购买于中国普通微生物保藏管理中心的格利菲斯瓦尔德镇磁螺菌。培养基在121℃灭菌20min。

本实施例2中采用的培养基配方如下表2所示。

表2

(说明：加蒸馏水至1L，用0.1mol/L NaOH调pH至6.5～7)

实施例3

一种藻-菌共培养复合体的培养方法，包括以下步骤：

S31、将实施例1获取的布朗葡萄球藻细胞分散至添加5mL/L矿物质混合液的Chu13培养基(具体配方参见表1)中，得布朗葡萄球藻细胞悬浮液，并调节细胞干重浓度为2～5g/L。例如，调节细胞干重浓度为3g/L。

S32、将实施例2获得的培养至对数期的磁螺菌培养液加入磁螺菌培养液稀释调节OD₅₆₅至0.5～1(或者，控制稀释倍数为2～5)，获得待接种磁螺菌培养液；将待接种磁螺菌培养液分别按照藻菌比例100:1、200:1、400:1、600:1和800:1的体积比例接种至布朗葡萄球藻细胞悬浮液中，进行共培养，获得具有藻-菌共培养复合体的共培养体系；其中，共培养条件包括：培养温度为25℃；光照强度为35μmol/(m²·s)；光暗周期为16h(L)/8h(D)；培养时间为6天。

S33、将共培养体系置于强磁性磁铁上，藻-菌共培养复合体被磁铁吸引，实现细胞的磁性分离，去除上清，获得藻-菌共培养复合体。

本实施例3中，步骤S32中，接种容器可以采用锥形摇瓶。方便后续的共培养旋转培养。

本实施例3中，根据共培养体系中不同藻-菌比例(即接种体积比例)，步骤S32共培养后获得的共培养体系对应记为共培养体系Ⅰ(100:1)、共培养体系Ⅱ(200:1)、共培养体系Ⅲ(400:1)、共培养体系Ⅳ(600:1)和共培养体系Ⅴ(800:1)。对应地，各共培养体系经步骤S33的磁性分离后获得的藻-菌共培养复合体分别记为复合体Ⅰ、复合体Ⅱ、复合体Ⅲ、复合体Ⅳ和复合体Ⅴ。

本实施例3中进行了单独微藻的纯藻培养，纯藻培养为将步骤S31中的布朗葡萄球藻细胞悬浮液在步骤S32的共培养条件下进行培养，得到纯藻培养体系。

本实施例3中还进行了单独磁螺菌纯菌培养，纯菌培养是采用实施例2进行培养获得的纯菌培养体系。

本实施例3中，对共培养体系Ⅰ至共培养体系Ⅴ、以及纯藻培养体系和纯菌培养体系的微藻体系生物量和微藻总烃进行了测定(测定方法参见后面相应内容)，测定结果如图4所示，以及如表3中所示的相应数据。

以及，基于步骤S33的磁性分离方式，对藻体磁性分离回收率进行了测定(测定方法参见后面相应内容)，具体为取等量共培养液(步骤S32的共培养体系、纯藻培养体系、纯菌培养体系)于烧杯，于磁铁上静置5s使藻-菌共培养复合体(藻-菌细胞)迅速聚集并贴于底部，磁性分离除去上清，收集藻-菌共培养复合体，而后步骤同生物量测定方法，测定磁性分离获得的磁性分离回收生物量，计算藻体的磁性分离回收率。测定结果如图5所示，以及如表3所示的数据。其中，磁性分离回收率＝(磁性分离回收生物量/体系生物量)×100％。

表3

由表3可见，在布朗葡萄球藻与趋磁细菌接种体积比为400:1的共培养体系Ⅲ中，布朗葡萄球藻的生物量(4.12g/L)、总烃含量(72.1％)、总烃产率(3g/L)，与单一布朗葡萄球藻相比，共培养对葡萄藻生物量没有影响，共培养使葡萄藻的烃含量和烃产量提高100％以上。在布朗葡萄球藻与趋磁细菌-400:1共培养体系Ⅲ中，微藻磁性分离的藻体回收率达到98.5％。

实施例4

利用藻-菌共培养复合体获取生物质的方法，包括以下步骤：

S41、向藻-菌共培养复合体中加入正己烷-一元醇体系提取剂，提取处理后，利用磁力分离出提取后的藻-菌共培养复合体，获得提取液；其中，藻-菌共培养复合体分别为实施例3中的复合体Ⅰ至复合体Ⅴ，对应地，分别获得提取液Ⅰ至提取液Ⅴ。

S42、将提取液进行处理，获得生物烃(记为一次生物烃)。

S43、将步骤S41利用磁力分离出的提取后的藻-菌共培养复合体加入至添加5mL/L矿物质混合液的Chu13培养基中，重新悬浮，获得3g细胞干重/L的悬浮液，进行再培养，培养条件同实施例3中的共培养条件，获得再培养的共培养体系；将再培养的共培养体系置于强磁性磁铁上，再培养后的藻-菌共培养复合体被磁铁吸引，实现磁性分离，去除上清，获得再培养的藻-菌共培养复合体；

S44、将经步骤S43获得的再培养的藻-菌共培养复合体进行步骤S41和步骤S42的操作，获得生物烃(记为二次生物烃)和提取后的藻-菌共培养复合体。

本实施例4中，步骤S44获得的提取后的藻-菌共培养复合体可以循环进行步骤S43的再培养，依此重复进行，实现生物烃的循环获取以及藻-菌共培养复合体的重复利用。

本实施例4中，以藻-菌比例为400﹕1的接种体积比例共培养获得的复合体Ⅲ为例，针对步骤S41采用不同一元醇的正己烷-一元醇体系提取剂(正己烷与一元醇的体积比为100﹕15)，测试了对藻-菌共培养复合体Ⅲ的生物烃提取率(测试方法参见后面相应内容)以及经步骤S43的再培养的共培养体系的总烃产量。其中测试结果分别如图6所示，以及如表4所示的数据。

表4

结合图6和表4可知，不同一元醇对藻-菌共培养复合体(藻-菌细胞)生物烃回收率和细胞重复使用性能的影响表明，乙醇对藻-菌细胞生物烃的回收率最高，达到70.3％；烃提取后细胞重复使用，进行培养后的烃产量达到2.96g/L，未见显著下降。

本实施例4中，以藻-菌比例为400﹕1的接种体积比例共培养获得的复合体Ⅲ为例，采用正己烷与乙醇不同体积比的不同正己烷-乙醇体系提取剂，测试了对藻-菌共培养复合体Ⅲ的生物烃提取率(测试方法参见后面相应内容)以及经步骤S43的再培养的共培养体系的总烃产量。其中测试结果分别如图7所示以及如表5所示的数据。

表5

结合图7和表5，可知，不同提取剂溶剂组成对烃提取率和细胞重复使用性能的影响表明，100:15条件下烃回收率为70.5％，烃提取后的藻-菌共培养复合体(藻-菌细胞)重复培养后的烃产量达到2.96g/L；100:20条件下烃回收率提高至75.9％，但烃提取后藻-菌细胞重复培养后的烃产量显著降低到2.01g/L。

同时，本实施例4中，以藻-菌比例为400﹕1的接种体积比例共培养获得的复合体Ⅲ为例，采用正己烷与乙醇体积比为100﹕15的正己烷-乙醇体系提取剂，测定藻-菌共培养体系重复利用产生物烃的稳定性，测定结果如图8所示。具体地，实施例3的共培养体系为第一次循环，步骤S43获得的再培养的共培养体系为第二次循环，如此，将步骤S44获得的提取后的藻-菌共培养复合体循环进行步骤S43的再培养和步骤S44的，将如步骤S44的提取操作，依次进行第三次至第十次循环。可见，藻-菌共培养体系重复利用产生物烃的稳定性表明，藻-菌共培养复合体的重复利用10次，采用100:15的正己烷-乙醇体系提取，其烃回收率保持在70％以上，烃提取后细胞重复培养后的烃产量稳定在2.95-3.02g/L，未见显著波动，说明该体系具有很好的重复使用性能。

本公开实施例中，对于复合体Ⅰ、复合体Ⅱ、复合体Ⅳ和复合体Ⅴ的采用实施例4的利用藻-菌共培养复合体获取生物质的方法进行生物烃提取时，能够达到同实施例4中记载的复合体Ⅲ一致的测试结果，在此不再赘述。

本公开实施例中，培养体系的布朗葡萄球藻的生物量测定步骤如下：取100mL培养液(实施例3步骤S32的共培养体系、纯藻培养体系、纯菌培养体系)7000×g离心10min收集细胞，细胞用去离子水洗涤2次后用95％甲醇反复研磨萃取，然后测定甲醇溶液在652nm和665nm下的吸光值，根据吸光度值计算叶绿素含量，而后根据叶绿素-微藻干重之间的标准曲线计算生物量。微藻总烃的测定步骤如下：取等量培养液(实施例3步骤S32的共培养体系、纯藻培养体系、纯菌培养体系)离心收集藻细胞或藻-菌细胞，洗涤2次后进行冷冻干燥，冻干藻粉或藻-菌固体(即，提取所用细胞干重)，加入正己烷超声15min，5000×g离心15min收集上清正己烷提取液，提取过程重复3次，合并正己烷提取液，真空蒸发除去正己烷，收集烃粗提物，经硅胶柱纯化，收集黄色条带出来之前的所有样品，真空蒸发除去正己烷，氮吹所剩残余，称重即得到烃质量，计算烃产量和细胞烃含量，其中，细胞烃含量＝(提取获得烃质量/提取所用细胞干重)×100％，烃产量＝培养液细胞干重浓度×细胞烃含量。

本公开实施例中，藻-菌共培养复合体(藻-菌细胞)的生物烃提取率测定步骤如下：取100mL共培养液(实施例3步骤S32的共培养体系)，磁铁磁性分离除去上清，收集藻-菌共培养复合体(藻-菌细胞)，洗涤2次后进行冷冻干燥，冻干藻粉或藻-菌固体，加入3倍湿细胞体积的提取剂，超声15min，磁性分离藻-菌细胞并收集上清提取液，真空蒸发除去提取剂，收集烃粗提物，经硅胶柱纯化，收集黄色条带出来之前的所有样品，真空蒸发除去洗脱溶剂，氮吹所剩残余，称重即得到不同提取剂的提取烃质量，获得提取烃量。取等量培养液(实施例3步骤S32的共培养体系)根据前述的总烃的测定步骤测定总烃含量(此步骤可省略，可直接采用实施例3中获得的总烃含量)，计算提取率。提取率＝(提取烃量/总烃含量)×100％。进一步地，提取后的湿藻-菌细胞(即步骤S41获得的提取后的藻-菌共培养复合体)加入原培养体积的新鲜添加矿物质混合液的Chu13培养基中培养7天，采用前述的总烃的测定步骤测定再培养后的共培养体系中的总烃产量，判定其重复使用性能。

实施例5

一种生物航空煤油，由包括实施例4提取获得的生物烃的原料制备获得。本实施例的生物航空煤油利用生物烃作为原料，绿色环保，减少碳排放和改善环境质量。

实施例6

一种生物柴油，由包括实施例4提取获得的生物烃的原料制备获得。本实施例的生物柴油利用生物烃作为原料，绿色环保，而且生物柴油具有发动机启动性能好、燃料性能好、可再生等特性。

实施例7

一种饲料，包括实施例3培养获得的利用磁力分离出来的藻-菌共培养复合体。实施例3获得的藻-菌共培养复合体中生物烃含量高，则包括其的饲料营养更丰富。本实施例7的饲料包括动物饲料。

实施例8

一种饲料，包括实施例4提取获得的生物烃。本实施例的饲料中，生物烃作为添加剂添加至饲料中，提高饲料的营养价值。本实施例8的饲料包括动物饲料。

本申请并不局限于上面已经描述并在附图中示出的结构，并且可以在不脱离其范围进行各种修改和改变。本申请的范围仅由所附的权利要求来限制。

本申请中，每个实施例重点说明的可以是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分可以互相参见。

Claims

1.一种藻-菌共培养复合体，其特征在于，藻-菌共培养复合体由微藻与趋磁细菌共培养获得。

2.根据权利要求1所述的藻-菌共培养体系，其特征在于，微藻包括具有生产生物质能力的微藻。

3.根据权利要求2所述的藻-菌共培养体系，其特征在于，具有生产生物质能力的微藻包括以下微藻中的一种或几种：布朗葡萄球藻、盐藻、小球藻、倒囊藻、网翼藻、小环藻和微拟球藻。

4.根据权利要求1所述的藻-菌共培养体系，其特征在于，趋磁细菌包括α-变形菌纲趋磁细菌。

5.根据权利要求4所述的藻-菌共培养体系，其特征在于，α-变形菌纲趋磁细菌包括磁螺菌。

6.一种藻-菌共培养复合体的培养方法，其特征在于，包括：

将微藻细胞分散至微藻培养基中，获得微藻细胞悬浮液；

将趋磁细菌培养混合液接种至微藻细胞悬浮液中，共培养，获得藻-菌共培养复合体。

7.根据权利要求6所述的培养方法，其特征在于，微藻细胞为培养至对数生长期时收集的对数生长期微藻细胞。

8.根据权利要求6所述的培养方法，其特征在于，微藻细胞悬浮液的细胞干重浓度为2～5g细胞干重/L。

9.根据权利要求8所述的培养方法，其特征在于，微藻细胞悬浮液的细胞干重浓度为3～4g/L。

10.根据权利要求6所述的培养方法，其特征在于，趋磁细菌培养混合液为将趋磁细菌培养至对数生长期时的趋磁细菌培养混合原液。

11.根据权利要求6所述的培养方法，其特征在于，趋磁细菌培养混合液是通过将趋磁细菌培养至对数生长期时的趋磁细菌培养混合原液经预设稀释倍数稀释后的趋磁细菌培养混合液。

12.根据权利要求11所述的培养方法，其特征在于，预设稀释倍数为2～6倍。

13.根据权利要求6所述的培养方法，其特征在于，将趋磁细菌培养混合液接种至微藻细胞悬浮液中，控制微藻细胞悬浮液与趋磁细菌的培养液的体积比为100﹕1至1000﹕1。

14.根据权利要求13所述的培养方法，其特征在于，将趋磁细菌的培养液接种至微藻细胞悬浮液中，控制微藻细胞悬浮液与趋磁细菌的培养液的体积比为200﹕1至800﹕1。

15.根据权利要求13所述的培养方法，其特征在于，将趋磁细菌的培养液接种至微藻细胞悬浮液中，控制微藻细胞悬浮液与趋磁细菌的培养液的体积比为400﹕1至600﹕1。

16.根据权利要求6至15任一项所述的培养方法，其特征在于，共培养条件包括以下中的一项或多项：培养温度为20～30℃，光照强度为30～50μmol/(m²·s)；光暗周期为14～20h(L)/7～10h(D)；培养时间为5～10天。

17.根据权利要求6至15任一项所述的培养方法，其特征在于，将趋磁细菌培养混合液接种至微藻细胞悬浮液中，共培养，获得藻-菌共培养复合体；包括：

将趋磁细菌培养混合液接种至微藻细胞悬浮液中，共培养，获得具有藻-菌共培养复合体的共培养体系；利用磁力将共培养体系中的藻-菌共培养复合体进行分离，获得藻-菌共培养复合体。

18.一种利用藻-菌共培养复合体获取生物质的方法，其特征在于，包括：

向藻-菌共培养复合体中加入提取剂，提取处理后，利用磁力分离出提取后的藻-菌共培养复合体，获得提取液；

将提取液进行处理，获得生物质。

19.根据权利要求18所述的获取生物质的方法，其特征在于，提取剂包括正己烷-一元醇体系，其中正己烷与一元醇的体积比为100﹕5至100﹕25。

20.根据权利要求19所述的获取生物质的方法，其特征在于，正己烷与一元醇的体积比为100﹕15至100﹕20。

21.根据权利要求18至20任一项所述的获取生物质的方法，其特征在于，一元醇包括碳原子数为1至3的一元醇。

22.根据权利要求18至20任一项所述的获取生物质的方法，其特征在于，将提取液进行处理，获得生物质；包括：

将提取液进行真空蒸发处理，除去提取剂，收集烃粗提物；再将烃粗提物经纯化处理后，获得生物质。

23.根据权利要求18至20任一项所述的获取生物质的方法，其特征在于，还包括：

将利用磁力分离出的提取后的藻-菌共培养复合体加入培养基，重悬获得悬浮液，进行再培养，获得再培养的共培养体系；

将再培养的共培养体系利用磁力分离出再培养的藻-菌共培养复合体；

将再培养的藻-菌共培养复合体进行处理获得生物质和提取后的藻-菌共培养复合体。

24.一种生物质，其特征在于，

由如权利要求1至5任一项所述的藻-菌共培养复合体提取获得；或者，

由如权利要求6至17任一项所述的藻-菌共培养复合体的培养方法培养获得的藻-菌共培养复合体提取获得；或者，

通过如权利要求18至23任一项所述的利用藻-菌共培养复合体获取生物质的方法获取。

25.一种生物柴油，其特征在于，包括如权利要求24所述的生物质。

26.一种生物航空煤油，其特征在于，包括如权利要求24所述的生物质。

27.一种饲料，其特征在于，

包括如权利要求1至5任一项所述的藻-菌共培养复合体；或者，

包括如权利要求6至17任一项所述的藻-菌共培养复合体的培养方法培养获得的藻-菌共培养复合体；或者，包括如权利要求24所述的生物质。