CN119677867A

CN119677867A - 用于使用微有机球测试肝细胞毒性的方法和装置

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Publication number: CN119677867A
Application number: CN202380036421.7A
Authority: CN
Inventors: 沈锡龄; 王朝晖
Original assignee: Xilis Co
Current assignee: Xilis Co
Priority date: 2022-04-29
Filing date: 2023-04-28
Publication date: 2025-03-21
Also published as: KR20250004858A; EP4514990A2; MX2024013252A; CA3255461A1; US20250320462A1; WO2023212732A3; WO2023212732A2; JP2025514291A

Abstract

与本发明一致的系统和方法总体上涉及微有机球(MOS)，以及用于形成和使用MOS的方法和装置。更具体地说，在一些实施例中，与本发明一致的系统和方法涉及用于形成和使用从肝细胞生成的MOS的方法和装置。从肝细胞生成的MOS适用于测试各种药剂的肝毒性和药物诱导的肝损伤效应。

Description

用于使用微有机球测试肝细胞毒性的方法和装置

技术领域

领域讨论

模型细胞和组织系统可以用于生物和医学研究。最常见的做法是从组织中获得经永生化的细胞系并且在二维(2D)条件中(例如，在培养皿或孔板中)培养它们。然而，尽管2D细胞系对基础研究非常有用，但它与个体患者对治疗的反应并不完全相关。特别是，三维细胞培养模型证明在发育生物学、疾病病理学、再生医学、药物毒性和疗效测试以及个性化医疗方面特别有用。例如，球体和类器官是已经研究过的三维细胞聚集体。然而，传统形成的类器官和球体两者具有局限性，降低了它们在某些应用中的效用。

多细胞肿瘤球体首先在70年代早期被描述并且通过在非粘附条件下培养癌细胞系获得。球体通常由癌细胞系形成，作为超低附着板中的自由漂浮细胞聚集体。与2D细胞培养相比，球体已被证明能维持更多的干细胞相关特性。

类器官是体外来源的细胞聚集体，其包括可以分化成主要细胞谱系的细胞的干细胞的群体。类器官通常具有超过一毫米的直径，并且通过传代培养。类器官培养的生长和扩展通常比2D细胞培养更慢。要从临床样本中生成类器官，首先需要足够数量的活细胞(例如，数百到数千)，因此从少量样本(诸如活检样本)中获取类器官通常具有挑战性，并且即使成功，扩展培养以用于诸如药物测试等应用也需要相当长的时间。此外，类器官的尺寸、形状和细胞数量存在很大的可变性。类器官可能需要生长因子和培养条件的复杂混合物才能生长和表达期望的细胞类型。

肿瘤球体和类器官都不是快速和可靠筛选的最佳选择，特别是对于个性化医疗，诸如进行药物反应的离体测试。例如，肿瘤学实践不断面临着将正确的治疗方案与正确的患者相匹配的巨大挑战，此外还要平衡相对效益与风险以实现最有利的结果。患者来源的癌症模型(PDMC)可以包括使用类器官(包括患者来源的类器官)促进更个性化的治疗靶点的鉴定和开发。然而，尽管回顾性研究表明，源自切除或活检患者肿瘤的类器官与患者对治疗的反应相关，但使用类器官指导治疗仍存在很大的局限性。如上所述，从用于药物敏感性测试的肿瘤样本中衍生和扩展类器官，特别是患者来源的类器官，需要数月时间，这降低了临床适用性，因为患者不能等待那么长时间才接受治疗。此外，目前无法在临床可行的时间内从核心活检样本中获得对数十种以上化合物进行药物筛选所需的类器官数量，而核心活检样本通常是来自转移性或无法手术的癌症患者的唯一可用组织形式。从活检中提取类器官的显著失败率也阻碍了其作为可靠的诊断测定的用途。此外，类器官的尺寸(以及潜在的反应，特别是药物反应)可能存在高度的变异性，特别是培养时间较长，因此传代次数较多。

由于PDMC与患者结果具有更好的相关性，PDMC也被用来替代2D细胞系作为用于药物发现的高通量筛选平台，诸如RNAi、CRISPR和药理学小分子筛选。然而，与细胞系相比，这些PDMC模型(包括球体和类器官)的扩展和操作通常要慢得多，这使得高通量应用具有挑战性并且成本高昂。扩展这些模型以扩增细胞数量所需的较长时间也往往会使塑料中生长最快的克隆占据主导地位并且在竞争中胜过其他克隆，从而使模型更加均质并且失去原始组织组合物和克隆多样性。此外，它们相对较大并且异质的尺寸以及有限的扩散性使得它们对于许多自动荧光和基于成像的读出测定具有挑战性。

因此，需要用于从切除术、活检和其他组织来源生成患者来源的组织模型(例如，肿瘤模型和/或非肿瘤组织模型)的方法、组合物和装置。具体地，提供可以使得能够从单次活检(诸如18号核心活检)获得具有可预测的和临床相关特性的大量患者来源的组织模型的方法和装置将是有用的，其可以在以下时间内完成：例如，获得活检后7天至10天。这将允许进行稳健并且可靠的测试并且使指导患者特异性治疗中的延迟最小化。此外，生成患者来源的模型也将很有用，这些模型可以以高度并行的方式快速扩展，针对高通量筛选应用生成具有更小并且更均匀的尺寸、针对每个单元的细胞数量的更好的可控性、以及更好的扩散性(例如，经由增加表面与体积比)的单元。此外，具有更好的肝细胞模型用于测试各种药物的肝毒性和药物诱导的肝损伤效应将是有用的。

发明内容

本文描述的是微有机球(MOS)、制造MOS的装置和方法、以及使用MOS的装置和方法。本文还描述的是用于使用这些MOS筛选患者的方法和系统，包括个性化医疗方法。

一般而言，本文描述的是形成和生长包含源自患者的细胞的MOS的方法和装置，例如，从小患者活检中提取的细胞(例如，用于快速诊断以指导治疗)、从切除的患者组织中提取的细胞(包括切除的原发性肿瘤或部分功能性或功能障碍器官)(例如，用于高通量筛选)和/或从已经建立的PDMC中提取的细胞(包括患者来源的异种移植(PDX)和类器官(例如，用于生成用于高通量筛选的MOS)。

这些MOS可以由正常的原代细胞(例如，正常器官组织)或肿瘤组织形成。例如，在一些实施例中，这些方法和装置可以由癌性肿瘤活检组织形成MOS，从而实现可以使用所检查的特定肿瘤组织来选择的定制治疗。令人惊讶的是，这些方法和装置允许在从患者体内取出活检组织后的几个小时内，由单个组织活检组织形成数百、数千或甚至数万(例如，500、750、1000、2000、5000、10,000或更多)个MOS。从患者活检中解离的原代细胞可以与流体基质材料(诸如基底膜基质(例如，MATRIGEL))组合以形成MOS。所得到的多个MOS可以具有预定义的尺寸范围(诸如直径，例如从10μm至700μm以及其内的任何子范围)和初始原代细胞数量(例如，在1个与1000个之间，特别是较少数量的细胞，诸如在1个与200个之间)。细胞的数量和/或直径可以被控制在例如，+/-5％、10％、15％、20％、25％、30％等范围内。当这些MOS按照本文描述被形成时，它们具有极高的存活率(>75％、>80％、>85％、>90％、>95％)并且在非常短的时间内(包括形成后的前1天至10天内(例如，1天内、2天内、3天内、4天内、5天内、6天内、7天内、8天内、9天内、10天内等)稳定用于使用和测试。这允许对潜在大量的患者特异性和生物学相关的MOS进行快速测试，这可以节省开发和部署患者治疗(诸如，癌症治疗计划)的关键时间。本文描述的MOS迅速形成3D细胞结构，这些结构复制并且对应于从其中对它们活检的组织环境，诸如三维(3D)肿瘤微环境。本文描述的MOS也可以被称为“液滴”。每个MOS可以包括，例如，作为流体基质材料的一部分，可以模仿原始组织(例如，肿瘤)环境的生长因子和结构蛋白(例如，胶原蛋白、层粘连蛋白、巢蛋白等)。每个MOS还可以包括原始组织的免疫细胞。可以使用实际上任何原代细胞组织，包括实际上任何肿瘤组织或正常组织。

例如，迄今为止，所有经测试的肿瘤类型和位点均已成功产生MOS(例如，目前成功率为100％，n＝32，包括来自原发部位或转移部位(包括肝脏、大网膜和膈肌)的结肠癌、食道癌、皮肤癌(黑色素瘤)、子宫癌、骨癌(肉瘤)、肾癌、卵巢癌、肺癌和乳腺癌)。用于成功生成MOS的组织类型可以是从其他位置转移的。在一些实施方案中，本文描述的MOS可以从细针抽吸物(FNA)或从循环肿瘤细胞(CTC)生长，例如从液体活检。通常在短短3天至4天内即可看到增殖和生长，并且MOS可以维持和传代数月，或者可以将它们冷冻保存和/或立即用于测定(例如，在前7天至10天内)。

特别地，本文描述的是形成患者来源的MOS的方法。在一些实施方案中，这些方法包括将经解离的原代组织细胞(包括但不限于癌症/异常组织、正常组织等)与液体基质材料组合以形成未经聚合的材料，并且然后聚合该未经聚合的材料以形成经解离的原代组织细胞分布在其中的直径通常小于约1000μm(例如，小于约900μm、小于约800μm、小于约700μm、小于约600μm、并且特别是小于约500μm)的MOS。如上所述，经解离的细胞的数量可以在预定范围内(例如，约1个与约500个细胞之间、约1个至200个细胞之间、约1个至150个细胞之间、约100个细胞之间、约1个至75个细胞之间、约1个至50个细胞之间、35个约1个至30个细胞之间、约1个至20个细胞之间、约1个至10个细胞之间、约5个至15个细胞之间、约20个至30个细胞之间、约30个至50个细胞之间、约40个至60个细胞之间、约50个至70个细胞之间、约60个至80个细胞之间、约70个至90个细胞之间、约80个至100个细胞之间、约90个至110个细胞之间等，包括约1个细胞、约10个细胞、约20个细胞、约30个细胞、约40个细胞、约50个细胞、约60个细胞、约70个细胞等)。这些方法中的任一者可以如本文描述配置成产生可重复尺寸(例如，具有窄尺寸分布)的MOS，以及包括免疫细胞的MOS。

经解离的细胞可以是新鲜活检或切除的，并且可以以任何适当的方式解离，包括机械和/或化学解离(例如，通过使用一种或多种酶，诸如胶原酶、胰蛋白酶等进行酶促解聚)。经解离的细胞可以任选地被处理、选择和/或修饰。例如，细胞可以被分选或选择以鉴定和/或分离具有一种或多种特征(例如，尺寸、形态等)的细胞。细胞可以被标记(例如，使用一种或多种标记物)以可以用于辅助选择。在一些实施例中，细胞可以通过已知的细胞分选技术来分选，包括但不限于微流体细胞分选、荧光激活细胞分选、磁激活细胞分选等。或者，细胞可以在不分选的情况下被使用。

在一些实施方案中，经解离的细胞可以通过使用一种或多种试剂处理来修饰。例如，细胞可以经基因修饰。在一些实施方案中，细胞可以使用CRISPR-Cas9或其他基因编辑技术来修饰。在一些实施方案中，细胞可以通过任何适当的方法(例如，电穿孔、细胞挤压、纳米颗粒注射、磁转染、化学转染、病毒转染等)来转染，包括使用质粒、RNA、siRNA等转染。或者，细胞可以不加修饰地被使用。

一种或多种另外的材料可以与经解离的细胞和流体(例如液体)基质材料组合以形成未经聚合的混合物。例如，未经聚合的混合物可以包括另外的细胞或组织类型，包括支持细胞。另外的细胞或组织可以源自不同的活检组织(例如，来自不同的经解离的组织的原代细胞)和/或经培养的细胞。另外的细胞可以是例如免疫细胞、基质细胞、内皮细胞等。另外的材料可以包括培养基(例如，生长培养基、冷冻培养基等)、生长因子、支持网络分子(例如，胶原蛋白、糖蛋白、细胞外基质等)等。在一些实施例中，另外的材料可以包括药物组合物。在一些实施例中，未经聚合的混合物仅包括经解离的组织样本(例如，原代细胞)和流体基质材料。

该方法可以由单个组织活检迅速形成多个MOS，使得每个活检形成大于约500个患者来源的MOS(例如，大于约600、大于约700、大于约800、大于约900、大于约1000、大于约2000、大于约2500、大于约3000、大于约4000、大于约5000、大于约6000、大于约7000、大于约8000、大于约9000、大于约10,000、大于约11,000、大于约12,000等)。活检可以是标准尺寸活检，诸如18G(例如，14G、16G、18G等)核心活检。例如，通过活检去除并且用于形成多个MOS的组织的体积可以是直径约1/32与1/8英寸之间并且长约3/4英寸至1/4英寸的小圆柱体(使用活检针取得)，诸如直径约1/16英寸、长约1/2英寸的圆柱体。活检可以通过针活检取得，例如通过空心针活检。在一些实施例中，活检可以通过细针抽吸取得。可以使用的其他活检类型包括刮取活检、穿刺活检、切开活检、切除活检等。通常，来自单个患者活检的材料可以用于产生多个(例如，大于约2000、大于约5000、大于约7500、大于约10,000等)MOS，如上所述。多个患者MOS可以使用可以配置成生成如本文描述的大量高度规则(尺寸、细胞数量等)的MOS的装置(如本文描述)来形成。在一些实施例中，这些方法和装置可以迅速生成多个MOS(例如，每分钟大于约1个MOS、每10秒大于约1个MOS、每5秒大于约1个MOS、每2秒大于约1个MOS、每秒大于约1个MOS、每秒大于约2个MOS、每秒大于约3个MOS、每秒大于约4个MOS、每秒大于约5个MOS、每秒大于约10个MOS、每秒大于50个MOS、每秒大于100个MOS、每秒大于125个MOS等)。

例如，在一些实施例中，这些方法可以通过将未经聚合的混合物同与未经聚合的材料不混溶的材料(例如，液体材料)组合来进行。该方法和装置可以通过至少部分地控制未经聚合的混合物(和/或经解离的组织和流体基质)和与未经聚合的混合物不混溶的材料(例如，疏水材料、油等)中的一者或多者的流动来控制MOS的尺寸和/或细胞密度。例如，在一些实施例中，这些方法可以使用微流体装置来进行。在一些实施例中，多个MOS可以被并联形成(例如，2个并联、3个并联、4个并联等)。因此，同一装置可以包括多个平行通道，其可以联接至未经聚合的材料的同一源、或经解离的原代组织的同一源和/或流体基质的源。

未经聚合的材料可以被聚合以便以各种不同的方式形成MOS。在一些实施例中，该方法可以包括通过改变温度来聚合MOS(例如，将温度升高至阈值以上，诸如例如大于约20摄氏度、大于约25摄氏度、大于约30摄氏度、大于约35摄氏度等)。

一旦MOS被聚合，即可允许其例如通过培养来生长和/或可以在培养之前或之后被测定和/或可以在培养之前或之后被冷冻保存。MOS可以被培养任何合适的时间长度，但特别地，可以被培养1天与10天之间(例如，1天与9天之间、1天与8天之间、1天与7天之间、1天与6天之间、3天与9天之间、3天与8天之间、3天与7天之间等)。在一些实施方案中，MOS可以在六次传代之前被冷冻保存或测定，这可以保存MOS内细胞的异质性；限制传代的次数可以阻止分裂较快的细胞超过分裂较慢的细胞。

一般而言，由于同一患者活检可以提供大量(例如，大于2,000、大于3,000、大于4,000、大于5,000、大于6,000、大于7,000、大于8,000、大于9,000、大于10,000等)细胞，因此MOS中的一些MOS可以被冷冻保存(例如，超过一半)，而一些MOS可以被培养和/或测定。如本文将更详细地描述的，被冷冻保存的MOS可以在以后储存和使用(例如，被分析、被传代等)。

因此，本文描述的是方法，包括形成多个MOS的方法。例如，形成多个MOS的方法可以包括：将经解离的组织样本和流体基质材料组合以形成未经聚合的混合物；形成未经聚合的混合物的多个液滴；并且聚合液滴以形成多个MOS，各自具有50μm与500μm之间的直径，其中分布有1个与200个之间的经解离的细胞。

一种例如形成多个MOS的方法，可以包括将经解离的组织样本和流体基质材料组合以形成未经聚合的混合物；从未经聚合的混合物的连续流形成多个液滴，其中这些液滴具有小于25％实施例的尺寸；并且通过加热使液滴聚合以形成多个MOS，各自具有分布在每个MOS内的1个与200个之间的经解离的细胞。

在一些实施例中，如本文描述的用于形成多个MOS的方法可以包括：将经解离的组织样本和流体基质材料组合以形成未经聚合的混合物；通过使未经聚合的混合物的流同与未经聚合的混合物不混溶的流体的一个或多个流会聚，形成具有小于25％实施例的尺寸的多个液滴；聚合液滴以形成多个MOS，这些MOS具有50μm与500μm之间的直径，其中分布有1个与200个之间的经解离的细胞；并且将多个MOS与不混溶的流体分离。

这些方法中的任一者可以包括在形成液滴之前修饰经解离的组织样本内的细胞。

形成多个液滴可以包括形成均匀尺寸的未经聚合的混合物的多个液滴，其尺寸小于约25％实施例(例如，尺寸小于约20％实施例、尺寸小于约15％实施例、尺寸小于约10％实施例、尺寸小于约8％实施例、尺寸小于约5％实施例等)。尺寸实施例也可以被描述为尺寸实施例的窄分布。例如，尺寸分布可以包括具有低标准差(例如，标准差为15％或更小、标准差为12％或更小、标准差为10％或更小、标准差为8％或更小、标准差为6％或更小、标准差为5％或更小等)的MOS尺寸分布(例如，MOS直径与被形成的MOS的数量)。

这些方法中的任一者还可以包括铺板或分布MOS。例如，在一些实施例中，该方法可以包括在测定之前将来自各种来源的MOS组合到容器中。例如，MOS可以被放置在多孔板中。因此，这些方法中的任一者可以包括在测定MOS之前将MOS分配到多孔板中。每个孔可以包括一个或多个(或在一些实施例中等量的)MOS。

在一些实施例中，将MOS施加到容器中可以包括将MOS放置到由至少部分可渗透的膜分隔的多个室中以允许上清液材料在室之间循环。这可以允许MOS共享相同的上清液。

在这些方法中的任一者中，MOS可以被测定。测定通常包括将个体MOS暴露或处理于某种条件下(例如，药物组合物或药物组合物的组合，包括但不限于本文描述的药物组合物中的任一者)以确定该条件是否对MOS的细胞有影响(以及在某些情况下，有何种影响)。测定可以包括将MOS的子集(单独或成组)暴露于一种或多种浓度的药物组合物，并且允许MOS保持暴露预定的时间段(分钟、小时、天等)和/或暴露并除去药物组合物，然后将MOS培养预定的时间段。此后，可以检查MOS以鉴定任何影响，特别包括对MOS中的细胞的毒性，或MOS中的细胞的形态和/或生长的变化。在一些实施例中，测定可以包括标记(例如，通过免疫组织化学)MOS内的活细胞或固定细胞。可以手动或自动地测定(例如，检查)细胞。例如，可以使用自动读取装置检查细胞以确定任何毒性(细胞死亡)。在一些实施例中，测定多个MOS可以包括针对分泌因子和其他效应采样MOS的上清液、环境和微环境中的一者或多者。在这些实施例中的任一者中，MOS可以在测定后被回收以用于进一步测定、扩展或保存(例如，冷冻保存、固定等)以用于随后的检查。

如上所述，可以使用实际上任何测定法。例如，可以使用本文描述的MOS来测定基因组、转录组、蛋白质组或宏基因组标记物(诸如甲基化)。因此，本文描述的这些组合物和方法中的任一者可以用于鉴定或检查一种或多种标记物和生物/生理学途径，包括例如外来体，其可以有助于鉴定用于患者治疗的药物和/或疗法。

可以使用任何适当的组织样本。在一些实施例中，组织可以是来自身体任何部分的正常非癌组织。在一些实施例中，组织可以是来自肝脏的组织。在一些实施例中，组织样本可以包括来自转移性肿瘤的活检样本。例如，组织样本可以包括临床肿瘤样本；临床肿瘤样本可以包含癌细胞和基质细胞。在一些实施方案中，组织样本包含肿瘤细胞和以下项中的一项或多项：间充质细胞、内皮细胞和免疫细胞。

本文描述的方法中的任一者可以包括最初将来自组织活检的经解离的细胞以任何适当的浓度均匀地或在一些实施例中非均匀地分布在整个流体基质材料中。例如，在一些实施例中，本文描述的方法可以包括将经解离的组织样本和流体基质材料组合使得经解离的组织细胞以小于1x10⁷细胞/ml(例如，小于9x 10⁶细胞/ml、7x 10⁶细胞/ml、5x10⁶细胞/ml、3x 10⁶细胞/ml、1x 10⁶细胞/ml、9x 10⁵细胞/ml、7x 10⁵细胞/ml、5x 10⁵细胞/ml等。)的密度分布在流体基质材料内。

一般而言，形成液滴可以包括从未经聚合的混合物的连续流形成液滴。例如，形成液滴可以包括可以将与未经聚合的混合物不混溶的流体的一个或多个会聚流施加到未经聚合的混合物的流中。这些流可以在微流体设备中被组合，例如具有多个会聚通道的设备，未经聚合的混合物和不混溶的流体在该会聚通道中相互作用以形成具有精确控制体积的液滴。在一些实施例中，液滴在过量的不混溶的材料中被形成(例如，夹断)，并且液滴可以同时和/或随后被聚合以形成MOS。例如，其中流会聚的区域可以配置成在液滴形成(例如通过加热)之后聚合未经聚合的混合物，和/或下游区域可以配置成在液滴形成之后并且被不混溶的材料包围之后聚合未经聚合的混合物。在一些实施例中，不混溶的材料被加热(或替代地被冷却)至促进未经聚合的材料聚合的温度，形成MOS。例如，聚合可以包括将液滴加热至大于35摄氏度。

因此，在这些方法中的任一者中，形成液滴可以包括在与未经聚合的混合物不混溶的流体中形成液滴。此外，这些方法中的任一者可以包括将不混溶的流体与MOS分离。此外，这些方法中的任一者可以包括从MOS去除不混溶的流体。一般而言，不混溶的流体可以包括液体(例如，油、聚合物等)，特别地包括疏水材料或与未经聚合(例如，水性)的材料不混溶的其他材料。

流体基质材料可以是合成或非合成的未经聚合的基底膜材料。在一些实施例中，未经聚合的基底材料可以包含聚合水凝胶。在一些实施方案中，流体基质材料可以包括MATRIGEL。因此，组合经解离的组织样本和流体基质材料可以包括将经解离的组织样本与基底膜基质组合。

组织样本可以在从患者体内取出组织样本后的六小时内或更早(例如，约5小时内、约4小时内、约3小时内、约2小时内、约1小时内等)与流体基质材料组合。

本文还描述的是测定或保存MOS的方法。例如，方法可以包括：将经解离的组织样本和流体基质材料组合以形成未经聚合的混合物；形成多个未经聚合的混合物的液滴，这些液滴的尺寸小于25％实施例；聚合液滴以形成多个MOS，这些MOS具有50μm与700μm之间的直径，其中分布有1个与1000个之间的经解离的细胞；并且测定或冷冻保存多个MOS。

在一些实施例中，方法可以包括：将经解离的组织样本和流体基质材料组合以形成未经聚合的混合物；形成未经聚合的混合物的多个液滴；聚合液滴以形成多个MOS，各自具有50μm与500μm之间的直径，其中分布有1个与200个之间的经解离的细胞；并且在15天内冷冻保存或测定多个MOS，其中MOS被测定以确定一种或多种试剂在MOS内的细胞上的效应。

例如，方法可以包括：将经解离的组织样本和流体基质材料组合以形成未经聚合的混合物；通过使未经聚合的混合物的流同与未经聚合的混合物不混溶的流体的一个或多个流会聚，形成具有小于25％实施例的尺寸的多个液滴；通过加热使液滴聚合以形成MOS，各自具有50μm与500μm之间的直径，其中分布有1个与200个之间的经解离的细胞；并且在六次传代之前测定或冷冻保存MOS，由此MOS内的细胞的异质性被维持，进一步其中测定包括测定以便确定一种或多种试剂在MOS内的细胞上的效应。

在这些方法中的任一者中，多个MOS可以在六次传代之前被冷冻保存或测定，由此MOS内的细胞的异质性被维持。这些方法中的任一者可以包括在形成液滴之前修饰经解离的组织样本内的细胞。

形成液滴可以包括形成均匀尺寸的未经聚合的混合物的多个液滴，其尺寸小于约25％实施例(例如，小于约20％、小于35约15％、小于约10％、小于约7％、小于约5％等)。

这些方法中的任一者可以包括将MOS培养适当长度的时间，如上所述(例如，在测定之前将MOS培养2天至14天之间)。例如，这些方法可以包括在培养之前从MOS中去除不混溶的流体。在一些实施例中，培养MOS包括悬浮培养MOS。

一般而言，测定MOS可以包括在测定或冷冻保存MOS之前和/或之后对MOS中的细胞进行基因组学、转录组学、表观基因组学和/或代谢学分析。这些方法中的任一者可以包括通过将MOS暴露于药物(例如，药物组合物)来测定MOS。

在这些方法中的任一者中，测定可以包括手动和/或自动目视测定一种或多种试剂在MOS中的细胞上的效应。这些方法中的任一者可以包括在MOS中标记或标记细胞以进行可视化。例如，测定可以包括荧光测定一种或多种试剂在细胞上的效应。

本文描述的MOS本身是新型的并且可以表征为物质的组合物。例如，物质组合物可以包含多个经冷冻保存的MOS，其中每个MOS具有50μm与500μm之间的直径的球形形状并且包含经聚合的基础材料，以及分布在基底材料内的传代次数少于六次的约1个与1000个之间的经解离的原代细胞，由此MOS内细胞的异质性被维持。在一些实施例中，MOS包括肝细胞。在一些实施例中，MOS包括肝细胞。在一些实施例中，MOS包括原代人肝细胞(PHH)。在一些实施例中，MOS由单个供体的PHH形成。在一些实施例中，MOS由从多个供体汇集的PHH形成。在一些实施方案中，MOS由成体肝细胞形成。在一些实施例中，MOS由成体PHH形成。在一些实施方案中，MOS是通过将肝细胞(例如PHH)与基质材料(例如，本文描述类型)混合而形成的，由此形成混合物，并且然后将混合物的流与不混溶的流体的流相交叉，如本文描述，由此形成MOS。在一些实施例中，MOS然后根据本文描述的方法被破乳化。因此，在组织源经过机械和/或酶消化后，肝细胞(包括PHH)可以以与本文描述的任何组织源相同的方式用于形成MOS，以便可以将其与流体基质材料混合。

本文还描述的是包含多个经冷冻保存的MOS的物质的组合物，其中每个MOS具有50μm与500μm之间的直径的球形形状，其中这些MOS具有小于25％实施例的尺寸，并且其中每个MOS包含经聚合的基础材料，以及分布在基础材料内的传代次数少于六次的约1个至500个之间的经解离的原代细胞，由此MOS内细胞的异质性被维持。在一些实施例中，MOS包括来自原始组织的肝细胞。

原代细胞可以是原代肿瘤细胞。例如，经解离的原代细胞可能已被遗传或生物化学修饰。多个经冷冻保存的MOS可以具有均匀的尺寸，其尺寸小于25％实施例。在一些实施例中，多个经冷冻保存的MOS可以包括来自各种来源的MOS。在这些MOS中的任一者中，每个MOS中的细胞中的大多数细胞可以包含不是干细胞的细胞。在一些实施方案中，原代细胞包括转移性肿瘤细胞。原代细胞可以包括癌细胞和基质细胞。在一些实施方案中，原代细胞包含肿瘤细胞和以下项中的一项或多项：间充质细胞、内皮细胞和免疫细胞。

原代细胞可以以小于例如5x 10⁷细胞/ml、1x 10⁷细胞/ml、9x 10⁶细胞/ml、7x10⁶10细胞/ml、5x 10⁶细胞/ml、1x 10⁶细胞/ml、9x 10⁵细胞/ml、7x 10⁵细胞/ml、5x 10⁵细胞/ml、1x 10⁵细胞/ml等的密度分布在经聚合的基质材料内。

一般而言，经聚合的基础材料可以包含基底膜基质(例如，MATRIGEL)。在一些实施例中，经聚合的基础材料包括合成材料。

MOS可以具有在50μm与1000μm之间、或更优选地在50μm与700μm之间、或更优选地在50μm与500μm之间、或在50μm与400μm之间，或者在50μm与300μm之间、或在50μm与250μm之间等(例如，小于约500μm、小于约400μm、小于约300μm、小于约250μm、小于约200μm等)的直径。

如上所述，本文描述的MOS可以在每个MOS中最初包括任何适当数量的原代组织细胞，例如少于约200个原代细胞、或更优选地少于约150个原代细胞、或更优选地少于约100个原代细胞、或更优选地少于约75个原代细胞、或少于约50个细胞、或少于约30个细胞、或少于约25个细胞、或少于约20个细胞、或少于约10个细胞、或少于约5个细胞等。在一些实施方案中，每个MOS包括约1个与500个细胞之间、约1个至400个细胞之间、约1个至300个细胞之间、约1个至200个细胞之间、约1个至150个细胞之间、约1个至100个细胞之间、约1个至75个细胞之间、约30个1个至50个细胞之间、约1个至30个细胞之间、约1个至25个细胞之间、约1个至20个细胞之间等。

本文还描述的是用于形成MOS的装置以及操作这些装置以形成MOS的方法。例如，本文描述的是操作MOS形成装置的方法，包括：在第一端口中接收包含经解离的组织样本和第一流体基质材料的经冷冻的混合物的未经聚合的混合物；在第二端口中接收与未经聚合的混合物不混溶的第二流体；将未经聚合的混合物的流与第二流体的一个或多个流组合以形成具有均匀尺寸的变化小于25％的未经聚合的混合物的液滴；并且聚合未经聚合的混合物的液滴以形成多个MOS。

一种操作MOS形成装置的方法可以包括：在第一端口中接收包含经解离的组织样本和第一流体基质材料的经冷冻的混合物的未经聚合的混合物；在第二端口中接收与未经聚合的混合物不混溶的第二流体；将第一速率的未经聚合的混合物的流与第二速率的第二流体的一个或多个流组合以形成具有均匀尺寸的变化小于25％的未经聚合的混合物的液滴，其中液滴的直径在50μm与500μm之间；并且聚合未经聚合的混合物的液滴以形成多个MOS。

这些方法中的任一者可以包括将含有未经聚合的混合物的第一储存器与第一端口流体连通地联接。例如，该方法可以包括将经解离的组织样本和第一流体基质材料组合以形成未经聚合的混合物。在一些实施例中，该方法包括将未经聚合的混合物添加至与第一端口流体连通的第一储存器中。这些方法可以包括将包含第二流体的第二储存器与第二端口流体连通地联接。这些方法中的任一者可以包括将第二流体添加至与第二端口流体连通的第二储存器。在一些实施例中，接收第二流体包括接收油。

一般而言，这些方法可以包括将第二流体(例如，不混溶的流体)与多个MOS分离。该流体可以手动或自动分离。例如，第二(不混溶的)流体可以通过洗涤、过滤、与疏水膜接触或任何其他适当的方法来去除。

组合流可以包括以第一流速驱动未经聚合的混合物流穿过以第二流速行进的第二流体的一个或多个流。在一些实施例中，第一流速大于第二流速。在一些实施例中，第二流速大于第一流速。材料(例如，未经聚合的混合物)的流量和/或量中的任何一者或两者可以以比第二流体更小的量存在，使得未经聚合的混合物被封装在精确控制的液滴中，如本文描述，使得然后可以例如在第二流体内被聚合。

在一些实施例中，组合流包括驱动未经聚合的混合物的流穿过结点，第二流体的一个或多个流也汇聚到该结点中。聚合液滴可以包括将液滴加热至高于未经聚合的材料在其聚合的温度(例如，大于约20摄氏度、大于约25摄氏度、大于约30摄氏度、大于约35摄氏度等)。

这些方法中的任一者可以包括等分多个MOS。例如，等分到多孔皿中。

本文还描述的是使用这些MOS治疗患者的方法，以及测定它们的方法。例如，方法可以包括：接收来自肿瘤的患者活检；并且在进行活检后2周内确定肿瘤将对药物制剂产生反应，具体方法为：从患者活检中形成具有50μm与500μm之间的直径的多个MOS，其中具有1个与200个之间的分布在聚合基材中的经解离的肿瘤细胞，并且在经解离的肿瘤细胞经历五次以上传代之前将MOS中的至少一些MOS暴露于药物制剂中；并且测量药物制剂在MOS中的至少一些MOS内的细胞上的效应以基于经确定的效应确定药物是否将治疗肿瘤。

在一些实施方案中，这些方法可以包括通过在患者使用药物制剂治疗后接收第二次患者活检并且从第二次患者活检中形成第二组多个MOS、将第二组多个MOS中的至少一些MOS暴露于药物制剂、并且测量药物制剂在第二组多MOS中的至少一些MOS内的细胞上的效应来确定在对患者施用一次或多次药物之后肿瘤仍然对药物制剂产生反应。

确定肿瘤将对药物制剂产生反应可以包括将MOS中的至少一些MOS暴露于多种药物制剂，并且报告针对药物制剂中的每种药物制剂的经测量的效应。在一些实施例中，确定进一步包括在测定MOS之前将MOS分配到多孔板中。

这些方法中的任一者可以包括活检患者以收集患者活检(或以其他方式获取来自患者的组织样本或患者来源的组织或细胞的样本)和/或使用药物制剂治疗患者、或协助医生治疗患者(例如，建议医生哪种药物制剂有效)。一般而言，接收活检与报告之间的时间可以小于约21天(例如，少于约15天、少于约14天、少于约13天、少于约12天、少于约11天、少于约10天、少于约9天、少于约8天、少于约7天等)。

原代组织来源的肝细胞被广泛用于评定药物诱导的肝损伤(DILI)效应，其仍然是批准药物撤回的主要原因。然而，在体外培养细胞时，缺乏强大的高通量系统来维持肝细胞的细胞活力和生物学功能。

本文提供的是一种用于基于MOS技术体外培养原代组织源性肝细胞的新方法。通过这种方法生成的肝细胞保留了肝特异性功能，包括：维持活力和生物功能(白蛋白和尿素分泌)至少3周。这是使用传统的2D肝细胞培养方法不可能实现的。

在MOS(HepatoMOS)中培养的肝细胞在HepatoMOS培养的第3天形成适当的结构并且随时间维持这些结构。

此外，HepatoMOS培养能够区分DILI阳性化合物与所关注的非DILI药物并且捕获与长期和重复给药方案相关的DILI。由于基于HepatoMOS的DILI检测所需的细胞质量比2D培养系统少得多(5倍至10倍)，因此与2D培养系统相比，基于HepatoMOS的检测的通量显著更高。HepatoMOS系统的主要改进包括；通过MOS培养提供的改进的3D环境；肝细胞/液滴的最佳密度；以及通过MOS培养提供的高效生长因子/氧气扩散。

HepatoMOS对于DILI评定特别有利。HepatoMOS将所关注的DILI化合物和与DILI效应无关的化合物区分开来。该系统示出了更高的灵敏度并且可以捕获长期给药方案的长期效应。可以选择从单个供体传代/扩展HepatoMOS以进行无限的DILI测定。与其他3D球体培养系统相比，基于HepatoMOS培养的DILI检测的周转时间更短。

从肝细胞生成的MOS(HepatoMOS)可以用于测试以前难以测试的某些疗法。与传统的大块类器官的形成不同，存在于经活检的患者来源的组织(例如，来自肿瘤)中的肝细胞也可以在其形成时存在并且持续存在于MOS中，甚至在针对本文描述的MOS形成的广泛处理之后。MOS也可以直接从患者来源的肝细胞生成。此外，当使用传统的大块类器官时，某些疗法可能很难渗透、到达患者体内来源的组织(例如，来自肿瘤)并且与之相互作用。相比之下，MOS允许更容易地渗透和测试这些疗法。

因为如本文描述的MOS形成允许来自患者来源的组织的肝细胞(包括肝细胞)被掺入，所以在MOS中测试上述药物制剂的准确性优于在传统的块状类器官中的测试。另外，由于易于渗透，源自患者的肝细胞可以单独引入到已经形成的MOS中。患者来源的组织(例如，来自肿瘤)将包括患者身体天然产生的各种肝细胞。患者对特定药物配方和疗法的反应可能会直接受到目标部位存在的肝细胞的影响。因为本文描述的药物可以在包括来自原始组织的肝细胞的MOS中进行测试，或者在包括MOS形成后引入的肝细胞的MOS中进行测试，所以如本文描述生产的MOS对于此类药物测试可能是有利的。使用肝细胞生成的MOS可以用于测试各种药物的肝毒性和药物诱导的肝损伤效应。

期望利用由肝细胞(例如，PHH)生成的MOS来筛选各种药剂的肝毒性和各种药剂的药物诱导的肝损伤效应。MOS的尺寸、性质、组成和改进的细胞活力允许各种试剂的高通量筛选。

附图说明

并入本公开并且构成本公开的一部分的附图展示了本发明的各种实施例和方面。在附图中：

图1A至图1C展示了如本文描述形成的患者来源的MOS，其每个MOS包含单个经解离的原代组织细胞，在形成后培养一天(图1A)，在形成后培养三天(图IB)，并且在形成后培养七天(图1C)。这些细胞源自结直肠癌(CRC)组织。

图2A至图2C展示了如本文描述形成的患者来源的MOS，其每个MOS包含五个经解离的原代组织细胞，在形成后培养一天(图2A)，在形成后培养三天(图2B)，并且在形成后培养七天(图2C)。这些细胞源自结直肠癌(CRC)组织。

图3A至图3C展示了如本文描述形成的患者来源的MOS，其每个MOS包含二十个经解离的原代组织细胞，在形成后培养一天(图3A)，在形成后培养三天(图3B)，并且在形成后培养七天(图3C)。如图1A至图1C和图2A至图2C所示，细胞源自结直肠癌(CRC)组织。

图4A至图4E展示了如本文描述形成的患者来源的MOS的实例，其每个MOS包括十个经解离的原代组织细胞。图4A示出了形成后不久的MOS(低放大倍率)。图4B示出了所拍摄的图4A的培养两天之后的MOS中的一些MOS的较高放大倍数视图。图4C示出了培养三天后的MOS。图4D示出了培养四天后的MOS。图4E示出了培养五天后的MOS。

图5A至图5B展示了如本文描述从正常小鼠肝脏肝细胞形成的MOS的实例，在形成后培养一天(图1A)，或在形成后培养十天(图IB)。小鼠肝细胞取自正常(例如，未患病)小鼠肝脏。

图6展示了如本文描述的从原代组织(例如，活检)样本形成患者来源的MOS的方法。

图7A示意性地展示了用于形成本文描述的患者来源的MOS的装置的一个实例，包括作为组件的一部分的微流体芯片。图7B是诸如图7A所示的装置的微流体芯片部分的一个实例的透视图。图7C示意性地展示了用于形成诸如图7A所示的患者来源的MOS的装置的微流体组件的一部分。

图8示出了图像的一个实例，该图像示出了使用诸如图7A所示的装置形成的多个患者来源的MOS，示出了聚合后不久的患者来源的MOS，其在从装置中等分之前悬浮在含有不混溶的流体(例如，油)的通道内。

图9是用于形成患者来源的MOS的装置的原型微流体组件的一部分的图像，与图7C所示的类似，展示了患者来源的MOS的形成。

图10展示了聚合后不久的如本文描述的多个患者来源的MOS；患者来源的MOS悬浮在不混溶的液体中。

图11A至图11B以低放大倍数(图11A)和较高放大倍数(图11B)展示了在形成后不久并且悬浮在不混溶的流体(例如，油)中的多个患者来源的MOS的另一个实例。

图12A至图12B以低放大倍数(图12A)和较高放大倍数(图12B)示出了在患者来源的MOS形成后的几个小时内与不混溶的流体分离后的多个患者来源的MOS。

图13是示出了如本文描述形成的多个患者来源的MOS的图像的另一个实例。

图14是展示由示例性活检样本形成的多个患者来源的MOS的直径的尺寸分布的图表。

图15A至图15B分别展示了由经解离的组织活检样本和流体基质材料在聚合之后形成的多个患者来源的MOS的一个实例的低和较高放大倍数视图。图15A是未经染色的图像，而在图15B中MOS已用台盼蓝染色以示出MOS中经解离的细胞是活的。

图16A至图16B是另一个实例，类似于图15A至图15B所示的实例，分别示出了多个患者来源的MOS的一个实例的低和较高放大倍率视图。图16A是未经染色的图像，而在图16B中，MOS已用台盼蓝染色(箭头)以示出MOS中经解离的细胞表明该细胞在MOS内重新存活(例如，活的)。

图17A至图17E展示了一种测定由患者肿瘤活检形成的多个患者来源的MOS以确定对多种药物制剂的药物反应概况的方法的一个实例。所展示的过程从活检到结果花费不到两周(例如，大约一周)。

图18示意性地展示了用于治疗患者的方法的实例，包括作为治疗过程的一部分形成和使用多个患者来源的MOS。

图19示意性地展示了用于治疗患者的方法的实例，包括作为治疗过程的一部分的迅速形成和测定多个患者来源的MOS的多次迭代。

图20示意性地展示了用于形成如本文描述的多个患者来源的MOS的装置的一部分的一个实施例。

图21示意性地展示了操作用于形成类似于图20所示的多个患者来源的MOS的装置的方法。

图22A至图22D展示了使用本文描述的多个患者来源的MOS来鉴定耐药性的方法的验证的一个实例。图22A展示了使用传统(“2D”)肿瘤细胞测定方法以用于预测耐药性。图22B展示了使用如本文描述的患者来源的MOS方法的一个实例来测定耐药性以用于预测药物敏感性。图22C和图22D示出了，与传统培养细胞不同，基于患者来源的MOS的方法准确地预测了肿瘤的实际反应(药物反应)。

图23A至图23D展示了验证使用如本文描述的患者来源的MOS来鉴定耐药性的另一个实例，示出了对奥沙利铂和伊立替康两者的所预测药物反应与用这些药物治疗后的实际肿瘤反应一致。

图24展示了使用如本文描述的患者来源的MOS的药物筛选的一个实例，其中单个肿瘤活检可以极快地(例如，在不到两周内)大量生成多个几乎相同的MOS并且针对大量药物制剂(例如，示出了27种)进行并行测试。

图25A至图25B展示了由小鼠肝脏组织形成的小鼠肝脏MOS的实例，这些小鼠肝脏MOS具有300pm的直径，并且每个MOS具有1个细胞。图25A示出了第1天的MOS，并且图25B示出了第10天的MOS。

图26A至图26B展示了由部分肝切除的小鼠肝脏组织形成的小鼠肝脏MOS的实例，这些小鼠肝脏MOS具有300pm的直径，并且每个MOS具有25个细胞，类似于图25A至图25B所示的。图26A示出了第1天的MOS，并且图26B示出了第10天的MOS。

图27A至图27C展示了由人类肝脏组织形成的人类肝脏MOS的实例。图27A示出了第1天的MOS，以40个细胞/液滴接种。图27B和图27C示出了第18天的MOS。在图27B中MOS是肝细胞样结构，而图27C示出了胆管细胞样MOS。

图28A至图28D示出了从患者来源的异种移植肿瘤系生成的MOS的实例，这些MOS具有300pm的直径，并且每个MOS具有1个细胞。图28A示出了第1天的MOS，图28B示出了第3天的MOS，图28C示出了第5天的MOS，图28D示出了第7天的MOS。

图29A至图29D示出了从患者来源的异种移植模型生成的MOS的实例，这些MOS具有300pm的直径，并且每个MOS具有5个细胞。图29A示出了第1天的MOS，图29B示出了第3天的MOS，图29C示出了第5天的MOS，图29D示出了第7天的MOS。

图30是比较传统类器官和由结肠直肠癌患者来源的类器官形成的MOS对奥沙利帕汀的反应的图，示出了针对传统类器官和MOS的可比较的反应。

图31是比较传统类器官和由两个结肠直肠癌患者来源的异种移植模型形成的MOS对SN38(7-乙基-10-羟基-喜树碱)的反应的图，示出了可比较的反应。

图32是比较传统类器官和源自结肠直肠癌患者的异种移植模型形成的MOS对5-FU(氟尿嘧啶)的反应的图，示出了可比较的反应。

图33A和图33B示出了使用小鼠肝脏MOS的毒性测定的实例。图33A示出了对照组中的小鼠肝脏MOS中的组织的尺寸相对较大(如箭头所示)。相反，在图33A中，示出了对乙酰氨基酚(10mM)治疗组，MOS中的大多数MOS中的组织较小并且含有许多死细胞。

图34A和图34B示出了使用人肝脏MOS的毒性测定的实例。图34A示出了在对照组中观察到的典型人肝脏MOS，包括组织结构(由箭头指示)。图34B示出了对乙酰氨基酚(10mM)治疗组中的MOS，示出了非典型组织结构(箭头)和碎片。

图35示出了HepatoMOS在第0天封装后仍然存活。100和200个肝细胞被封装在MOS液滴中。使用活细胞染料钙黄绿素AM(绿色通道)和死细胞染料乙锭同型二聚体(红色通道)监测活力评定。染色结果表明，包封后的肝细胞是存活的。

图36示出了第3天的HepatoMOS活力。

图37示出了HepatoMOS随时间的监测。

图38示出了HepatoMOS在3周内维持了非常高的细胞活力。

图39示出了肝细胞在2D培养条件下失去活力。

图40示出了HepatoMOS保持稳定水平的尿素和白蛋白分泌，表明HepatoMOS含有功能性肝细胞。

图41示出了基于HepatoMOS的DILI评定的结果。

图42示出了2D肝细胞单层培养中的DILI评定结果。

图43示出了从汇集自10个个体供体的PHH建立和表征HepatoMOS。A)测试HepatoMOS培养中不同细胞密度的影响；B)评估用于成功的HepatoMOS培养的四种培养基选择；C)CTG测定测量了在不同细胞密度和培养基条件下的HepatoMOS培养的活力；D)CDFDA染色证实了HepatoMOS中的胆小管形成；E)ELISA结果示出了HepatoMOS培养中随时间的白蛋白产量；F)尿素ELISA结果示出了HepatoMOS培养中随时间的尿素分泌。G)IF染色证实了HepatoMOS培养中的关键标记物表达；H)HepatoMOS的H&E染色和Ki67 IHC染色。

图44示出了在各种条件下培养的HepatoMOS(汇集自10个个体供体)上的活和死细胞染料染色。A)具有四种不同细胞密度的HepatoMOS活和死细胞染料染色；B)HepatoMOS在三种培养基条件下的活体和死体染料染色；C)在圆顶条件下以三种匹配的细胞密度培养的PHH的活体和死体染料染色；D)同一孔中培养的不同尺寸和密度的HepatoMOS的活体和死体染料染色。

图45示出了来自单个供体的肝细胞(PHH)的HepatoMOS培养建立和表征。A)HepatoMOS培养随时间的代表性图像；B)在圆顶条件下以四种匹配的细胞密度培养的PHH的活体和死体染料染色；C)培养第14天的HepatoMOS的活体和死体染料染色。D)CDFDA染色示出了HepatoMOS中胆小管的形成；E)在不同条件下培养的HepatoMOS中随时间的白蛋白产量；F)在不同条件下培养的HepatoMOS中随时间的尿素分泌。

图46示出了来自单个儿科供体的肝细胞(PHH)的HepatoMOS培养建立和表征。A)HepatoMOS培养随时间的代表性图像；B)以不同细胞密度培养的HepatoMOS的活体和死体染料染色；C)以不同细胞密度培养的HepatoMOS的活体和死体染料染色；D)在圆顶条件下培养的肝细胞的活体和死体染料染色；E)CDFDA染色示出了HepatoMOS中的胆小管的形成；F)IF染色证实了HepatoMOS培养中的关键标记物表达。

图47示出了活体/死体染色检测到的DILI效应具有与基于ATP含量的读数相似的特异性和灵敏度。

图48示出了HepatoMOS预测DILI效应。A)通过2D或HepatoMOS方法测量的DILI反应；B)使用HepatoMOS或Spheroid方法的DILI预测的比较；C)表总结了基于HepatoMOS的DILI预测的特异性和敏感性。

具体实施方式

一般而言，本文描述的是MOS、用于形成它们的方法和装置、以及使用它们例如以测定组织(包括癌性组织和非癌性组织)反应的方法和装置。

本文描述的MOS通常是由分布在基础材料内的经解离的原代细胞形成的球体。这些MOS可以具有约50μm与约500μm之间的直径(例如，约50μm与约400μm之间、约50μm与约300μm之间、约50μm与约250μm之间等)，并且可以初始包含分布在基底材料内的约1个与1000个之间经解离的原代细胞(例如，约1个与750个之间、约1个与500个之间、约1个与400个之间、约1个与300个之间、约1个与200个之间、约1个与150个之间、约1个与100个之间、约1个与75个之间、约1个与50个之间、约1个与40个之间、约1个与30个之间、约1个与20个之间等)。

令人惊讶的是，尽管它们的尺寸小(通常在约50μm至250μm之间)和细胞密度低(例如，通常每个MOS少于100个细胞)，但这些MOS可以立即使用或培养非常短的时间段(例如，14天或更短、10天或更短、7天或更短、5天或更短等)并且可以允许MOS内的细胞存活，同时维持从其中提取它们的组织(包括肿瘤组织和非肿瘤组织)的大部分(如果不是全部)特征。MOS内的细胞存活率非常高，并且MOS可以通过多次传代培养数天(或数周)，细胞会分裂、聚集并且形成类似于母体组织的结构。而且，令人惊讶的是，在一些实施例中，来自MOS内的经解离的组织的细胞在甚至最小的MOS内部形成形态结构；尽管在一些应用中，此类结构的存在对于这些MOS的使用来说并不是必需的(例如，它们可以在发生实质性结构重组之前使用)，但在一些实施例中，它们可能特别有用。

本文描述的用于形成和使用MOS的方法和装置可以用于从单个活检创建许多(例如，大于10,000个)MOS。这些MOS可以用于筛选药物组合物，该药物组合物可以预测哪些疗法可以有效地应用于从其中取得活检的患者。例如，这可能对来自健康正常组织和/或癌变(例如肿瘤)组织的药物或其他化学组分的毒性筛选有用。具体地，MOS、用于形成它们的方法和装置以及用于测试它们的方法和装置可以用于筛选以鉴定可以在接受药物治疗之前有效地治疗患者(例如，癌症患者)的一种或多种药物组合物或药物组合物的组合。例如，这可以允许对癌症患者进行非常迅速的筛查，否则他们将接受数月可能对他们无效的化疗。

因此，本文描述的是使用单个患者特异性活检(或其他适当的组织/细胞来源)的高通量药物筛选方法(以及用于执行这些方法的装置)。本文描述的是液滴形成的MOS，其可以由经解离并且悬浮在基底基质(例如，MATRIGEL)中的患者来源的肿瘤样本形成。MOS可以被图案化到微流体微孔阵列上，被孵育，并且被施用药物化合物。这种小型化检测使肿瘤样本的使用最大化，并且能够以更低的每个样本成本从核心活检中筛选更多的药物化合物。

患者来源的癌症模型(PDMC)，诸如细胞系、类器官和患者来源的异种移植物(PDX)日益被接受为“标准”临床前模型以促进新疗法的鉴定和开发。例如，对源自癌症患者的细胞系和类器官的大规模药物筛选已被用于鉴定对大量潜在疗法的敏感性。PDX还用于预测药物反应和鉴定新型药物组合。尽管精准医疗策略正在通过探索这些不同的PDMC模型而发展，但其有效使用仍存在很大障碍。例如，患者来源的类器官(PDO)被认为是描述患者肿瘤最准确的，因为研究表明类器官的表型和基因型分析通常与原始患者肿瘤表现出高度的相似性。不幸的是，至少有两个限制阻碍了使用PDO指导治疗。首先，类器官的药物敏感性开发和测试需要几个月的时间，这降低了临床适用性。其次，从临床相关的18号核心活检中获得的类器官数量不足以进行高通量药物筛选。理想情况下，应在7天至10天内对单芯活检进行检测。本文描述的MOS以及制造和使用它们的方法可以解决这些临床限制。

本文中阐述了本公开的主题的一个或多个实施例的细节。对于本领域的普通技术人员来说，在研究了本文所提供的信息之后，对本文描述的实施例以及其他实施例进行的修改将是显而易见的。本文中提供的信息，特别是所描述的示例性实施例的具体细节，主要是为了清楚理解而提供的，并且不应从中理解为不必要的限制。在有冲突的情况下，以本文的规范(包括定义)为准。

尽管相信本文中使用的术语是本领域普通技术人员很好理解的，但本文中阐述的定义是为了便于解释本公开的主题。

除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开的主题所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的任何方法、设备和材料可以用于本公开主题的实践或测试，但是现在描述代表性的方法、设备和材料。

术语“未经聚合的混合物”在本文中用于指包含生物相关材料的组合物，包括经解离的组织样本和第一流体基质材料。流体基质材料通常是可以被聚合以形成用于分散在其内的经解离的组织(细胞)的支持或支持网络的材料。一旦被聚合，经聚合的材料可以形成水凝胶并且可以被形成或和/或可以包括除细胞之外的形成生物相容性介质的蛋白质。根据本公开的主题使用的合适的生物相容性介质通常可以由任何生物相容性材料形成，该材料在室温(例如，25℃)为凝胶、半固体或液体(诸如低粘度液体)并且可以用作用于细胞、组织、蛋白质和其他感兴趣的生物材料的三维基质。可以用于根据当前公开的主题形成生物相容性介质的示例性材料包括但不限于包含胶原蛋白、纤维蛋白、壳聚糖、MATRIGEL^TM(BDBiosciences,San Jose,Calif.)、聚乙二醇、葡聚糖(包括可化学交联或可光交联的葡聚糖)等的聚合物和水凝胶，以及电纺生物、合成物或生物合成混合物。在一些实施例中，生物相容性介质由水凝胶组成。

本文使用的术语“水凝胶”是指包含聚合物链的三维网络的二组分或多组分凝胶，其中水充当分散介质并且填充聚合物链之间的空间。根据本公开的主题使用的水凝胶通常基于结构的预期用途而针对特定应用进行选择，同时考虑到要用于形成MOS的参数以及所选水凝胶将在并入要放置在结构中的生物悬浮液中的生物材料(例如细胞)的行为和活性上具有的效应。本公开的主题的示例性水凝胶可以由聚合材料组成，这些聚合材料包括但不限于：藻酸盐、胶原蛋白(包括I型和VI型胶原蛋白)、弹性蛋白、角蛋白、纤连蛋白、蛋白聚糖、糖蛋白、聚丙交酯、聚乙二醇、聚己内酯、聚共交酯、聚二恶烷酮、聚丙烯酸酯、聚氨酯、聚砜、肽序列、蛋白质和衍生物、寡肽、明胶、弹性蛋白、纤维蛋白、层粘连蛋白、聚甲基丙烯酸酯、聚乙酸酯、聚酯、聚酰胺、聚碳酸酯、聚酸酐、聚氨基酸碳水化合物、多糖和改性多糖、以及它们的衍生物和共聚物以及无机材料(诸如玻璃(诸如生物活性玻璃)、陶瓷、二氧化硅、氧化铝、方解石、羟基磷灰石、磷酸钙、骨和所有前述材料的组合)。

进一步关于用于产生本文描述的MOS的水凝胶，在一些实施例中，水凝胶由选自琼脂糖、藻酸盐、I型胶原蛋白、聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物(例如，F127(BASFCorporation,Mount Olive,N.J.))、硅酮、多糖、聚乙二醇和聚氨酯组成的组的材料组成。在一些实施例中，水凝胶由藻酸盐组成。

本文描述的MOS还可以包括生物学相关材料。短语“生物相关材料”可以描述能够被包含在如本文所定义的生物相容性介质中并且随后与生物系统相互作用和/或影响生物系统的材料。例如，在一些实施方式中，生物相关材料是磁珠(即，本身具有磁性或包含反应磁场的材料(诸如铁颗粒)的珠子)，其可以组合为未经聚合的材料的一部分产生可以用于该方法和组合物中的MOS(例如，用于MOS的分离和纯化)。作为另一个实例，在其他实施方式中，除了经解离的组织样本(例如，活检)材料之外，生物相关材料还可以包括另外的细胞。在未经聚合的混合物中，经解离的组织样本和另外的生物相关材料可以存在于均匀混合物中或作为分布混合物存在(例如，仅在MOS的一半或其他部分上，包括仅在核心中或仅在所形成的MOS的外部区域中)。在一些实施例中，例如在形成MOS的液滴聚合之前，未经聚合的材料内的另外的生物相关材料可以与悬浮液中的经解离的组织样本一起悬浮。

在一些实施例中，可以包含在经解离的组织样本(例如，活检)材料中的生物学相关材料可以含有多种细胞类型，包括前脂肪细胞、间充质干细胞(MSC)、内皮祖细胞、T细胞、B细胞、肥大细胞和脂肪组织巨噬细胞，以及基质血管部分内发现的小血管或微血管碎片。

一般而言，对于包含在本文描述的MOS中的经解离的组织样本(例如，活检材料)，这些组织可以是来自患者的任何合适的组织，通常通过活检取得。虽然可以使用非活检组织，但一般而言，这些组织(以及所得的经解离的细胞)可以是取自如上所述的患者活检(例如通过针活检)的原代细胞。组织可以来自健康组织活检或来自癌性(例如，肿瘤)细胞活检。基于MOS的预期用途，经解离的细胞可以并入当前公开主题的MOS中。例如，相关组织(例如，经解离的活检组织)通常可以包括在该组织或器官(或肿瘤等)中常见的细胞。在这方面，可以并入本公开的主题的MOS中的示例性相关细胞包括神经元、心肌细胞、肌细胞、软骨细胞、胰腺腺泡细胞、胰岛、骨细胞、肝细胞、库普弗细胞、成纤维细胞、成肌细胞、卫星细胞、内皮细胞、脂肪细胞、前脂肪细胞、胆管上皮细胞等。这些类型的组织可以通过本领域已知的常规技术来解离。合适的经活检的组织可以源自：骨髓、皮肤、软骨、肌腱、骨、肌肉(包括心肌)、血管、角膜、神经、脑、胃肠道、肾、肝、胰腺(包括胰岛细胞)、肺、垂体、甲状腺、肾上腺、淋巴、唾液、卵巢、睾丸、宫颈、膀胱、子宫内膜、前列腺、外阴和食道组织。可以使用正常或患病(例如，癌性)组织。在一些实施方案中，组织可以源自肿瘤组织，包括源自这些正常组织中的任一者的肿瘤。

一旦被形成，MOS可以被冷冻保存和/或培养。经培养的MOS可以维持悬浮状态，可以是静态的(例如，在孔中、在小瓶中等)，也可以是运动的(例如，滚动或被搅动)。可以使用已知的培养技术来培养MOS。示例性技术可在以下地方中找到；Freshney,Culture ofAnimal Cells,A Manual of Basic Techniques,第4版.,Wiley Liss,John Wiley&Sons,2000；Basic Cell Culture:A Practical Approach,Davis编,Oxford University Press,2002；Animal Cell Culture:A Practical Approach,Masters编,2000；以及U.S.Pat.Nos.5,516,681和5,559,022。

在一些实施例中，MOS是通过在不混溶的材料(诸如流体疏水性材料(例如，油))中形成经解离的组织样本和流体基质材料的未经聚合的混合物(例如，在一些实施例中为经冷冻的混合物)的液滴来形成的。例如，MOS可以通过将未经聚合的材料的流与不混溶的材料的一个或多个流组合以形成液滴来形成。存在于液滴中的细胞的密度可以通过未经聚合的材料中的经解离的材料(例如，细胞)的稀释来确定。MOS的尺寸可以与所形成的液滴的尺寸相关。一般而言，MOS是具有稳定几何形状的球形结构。

除非另有说明，本公开的主题的实践可以采用细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，这些技术属于本领域的技术范围。此类技术在文献中被充分地解释。参见例如，Molecular Cloning A LaboratoryManual(1989),第2版.,Sambrook、Fritsch和Maniatis编,Cold Spring HarborLaboratory Press,第16章和第17章；U.S.Pat.No.4,683,195；DNA Cloning,第I卷和第II卷,Glover编,1985；Oligonucleotide Synthesis,M.J.Gait编,1984；Nucleic AcidHybridization,15D.Hames和S.J.Higgins编,1984；Transcription and Translation,B.D.Hames和S.J.Higgins编,1984；Culture Of Animal Cells,R.I.Freshney,AlanR.Liss,Inc.,1987；Immobilized Cells And Enzymes,IRL Press,1986；Perbal(1984),APractical Guide To Molecular Cloning；参见Methods In Enzymology(AcademicPress,Inc.,N.Y.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells,J.H.Miller和M.P.Calos编,Cold Spring Harbor 20Laboratory,1987；Methods In Enzymology,第154卷和第155卷,Wu等人编,Academic Press Inc.,N.Y.；Immunochemical Methods In CellAnd Molecular Biology(Mayer和Walker编,Academic Press,London,1987；Handbook OfExperimental Immunology,第I卷至第IV卷,D.M.Weir和C.C.Blackwell编,1986。

如本文所使用的，药物组合物可以包括任何药物、药物稀释液、药物制剂、包括多种药物(例如，多种活性组分)的组合物、药物制剂、药物形式、药物浓度、联合疗法等。在一些实施方案中，药物制剂是指包含药物和一种或多种非活性组分的混合物的制剂。如本文所使用的，术语“传代”可以指MOS内细胞倍增的平均数量。尽管传统的传代数是指将细胞从一个培养容器转移或传代培养到另一个培养容器，但是MOS内的细胞可以稳定地保留在同一MOS内，并且可以继续生长和分裂。因此，如本文所使用的传代数通常是指来自MOS内的经活检的组织的经解离的细胞所经历的平均倍增次数。群体倍增数是细胞群体自分离以来(例如，自从经新鲜解离的活检组织形成MOS以来)已经历的倍增的近似次数。一般而言，相对于MOS内的细胞中的一些或全部细胞的生长(例如，加倍)，本文描述的MOS可以培养较短的时间段(例如，少于10次传代、少于9次传代、少于8次传代、少于7次传代、少于6次传代、少于5次传代、少于4次传代、少于3次传代等)。

在培养期间，来自MOS中经解离的经活检的组织的细胞可以在MOS内聚集、成簇或组装。细胞的聚集可以是高度组织化的，并且可以形成所确定的形态或者可以是已成簇或粘附在一起的细胞的团。该组织化可以反映原始组织。在一些实施例中，MOS可以包含单一细胞类型(同型)，然而，MOS可以包含多于一种细胞类型(异型)。

如上所述，用于形成MOS(例如，经解离的组织)的(例如，活检)组织可以源自正常或健康的生物组织，或者源自患有疾病或病症的生物组织，诸如源自肿瘤的组织或流体。MOS中使用的组织可以包括免疫系统的细胞，诸如T淋巴细胞、B淋巴细胞、多形核白细胞、巨噬细胞和树突细胞。细胞可以是干细胞、祖细胞或体细胞。如下文进一步详细描述的，这些免疫细胞的存在可以用于增强药物/生物测试的功效和准确性。该组织可以是诸如人类细胞等哺乳动物细胞或来自诸如小鼠、大鼠、兔等动物的细胞。

一般而言，组织(和所得细胞)通常可以取自活检以形成MOS。因此，组织可以源自活检、手术标本、抽吸物、引流物或含细胞流体中的任一者。合适的含细胞流体包括血液、淋巴液、皮脂液、尿液、脑脊液或腹膜液中的任一者。例如，在患有种植性转移的患者中，可以从腹膜液中分离出卵巢癌细胞或结肠癌细胞。类似地，在患有宫颈癌的患者中，宫颈癌细胞可以例如通过转化区的大切除或通过锥形活检取自子宫颈。通常，这样的MOS将包含驻留在原始组织或流体中的多种细胞类型。细胞可以直接从受试者获得，无需传代培养的中间步骤，或者它们可以首先经历中间培养步骤以产生原代培养物。从生物组织和/或含细胞流体中收获细胞的方法是本领域众所周知的。例如，用于从生物组织获得细胞的技术包括R.Mahesparan(Extracellular matrix-induced cell migration from glioblastomabiopsy specimens in vitro.Acta Neuropathol(1999)97:231-239)所描述的技术。

一般而言，在形成MOS之前，首先使细胞彼此解离或分离。细胞的解离可以通过本领域已知的任何常规方法来完成。优选地，对细胞进行机械和/或化学处理，诸如通过用酶处理。通过“机械地”，我们包括破坏相关细胞之间的连接的含义，例如，使用手术刀或剪刀或通过使用诸如均质器之类的机器。通过“酶促地”，我们包括使用一种或多种酶处理细胞的含义，所述酶破坏相关细胞之间的连接，包括例如胶原酶、分散酶、DNA酶和/或透明质酸酶中的任一者。一种或多种酶可以在不同的反应条件下使用，诸如在37℃水浴中或在室温下孵育。

可以处理经解离的组织以去除死亡和/或将死的细胞和/或细胞碎片。此类死亡和/或将死的细胞的去除可以通过本领域技术人员已知的任何常规方法来完成，例如使用珠子和/或抗体方法。例如，已知磷脂酰丝氨酸在凋亡或死亡细胞中从内质膜小叶重新分布到外质膜小叶。使用膜联蛋白V-生物素结合，然后将生物素与链霉亲和素磁珠结合，可以将凋亡细胞与活细胞分离。类似地，细胞碎片的去除可以通过本领域任何合适的技术来实现，包括例如过滤。

在与流体基质材料混合之前，经解离的细胞可以悬浮在载体材料中，和/或流体基质材料可以被称为载体材料。在一些实施例中，载体材料可以是具有在聚合和形成MOS之前延迟细胞悬浮液中的细胞沉降的粘度水平的材料。载体材料可以具有足够的粘度以允许经解离的活检组织细胞保持悬浮在悬浮液中直至聚合。实现这一点所需的粘度可以由技术人员通过监测在不同粘度的沉降速率并且选择粘度来优化，该粘度针对将细胞悬浮液加载到通过聚合包括细胞在内的未经聚合的材料的液滴而形成MOS的装置之间的预期时间延迟给出适当的沉降速率。在一些实施例中，即使在使用较低粘度材料的情况下，也可以通过装置使未经聚合的材料流动或摇动，以使细胞保持悬浮和/或根据需要分布。

如上所述，在一些实施例中，包括经解离的组织样本和流体基质材料的未经聚合的混合物可以包括一种或多种组分，例如，生物相关材料。例如，可以被包括的生物相关材料可以是以下项中的任何一项：细胞外基质蛋白(例如纤连蛋白)、药物(例如小分子)、肽或抗体(例如，用于调节细胞存活、增殖或分化中的任一者)；和/或特定细胞功能的抑制剂。这样的生物学相关材料可以用于例如通过减少细胞死亡和/或细胞生长/复制的激活来增加细胞活力或以其他方式模拟体内环境。生物相关材料可以包括或可以模拟以下组分中的一种或多种组分：血清、白细胞介素、趋化因子、生长因子、葡萄糖、生理盐、氨基酸和激素。例如，生物相关材料可以补充流体基质材料中的一种或多种试剂。在一些实施例中，流体基质材料是合成凝胶(水凝胶)并且可以补充有一种或多种生物相关材料。在一些实施例中，流体基质是天然凝胶。因此，凝胶可以由一种或多种细胞外基质组分组成，诸如胶原、纤维蛋白原、层粘连蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白、透明质酸、纤维蛋白、藻酸盐、琼脂糖和壳聚糖中的任一者。例如，MATRIGEL包含对细胞活力、增殖、发育和迁移很重要的生物活性聚合物。例如，基质材料可以是包含1型胶原蛋白(诸如从大鼠尾部获得的1型胶原蛋白)的凝胶。凝胶可以是纯1型胶原蛋白凝胶，或者可以是除了其他组分(诸如其他细胞外基质蛋白)之外还含有1型胶原蛋白的凝胶。合成凝胶可以指自然界中不天然存在的凝胶。合成凝胶的实例包括源自聚乙二醇的凝胶中的任一者(PEG)、聚甲基丙烯酸羟乙酯(PHEMA)、聚乙烯醇(PVA)、聚环氧乙烷(PEO)。

MOS

图1A至图1C、图2A至图2C、图3A至图3C和图4A至图4E示出了MOS的实例。例如，图1A至图1C展示了所形成的每个MOS具有单个细胞的MOS。如图所示，MOS的尺寸都大致相同，例如，直径约300μm。图1B示出了培养3天后同时形成的MOS。细胞尺寸增大，在某些情况下加倍和/或生长。通过培养七天，如图1C所示，细胞多次倍增，示出了细胞簇或细胞团。

图2A至图2C和图3A至图3C示出了类似的结果，分别示出了每个MOS由五个细胞形成或每个MOS由20个细胞形成。在图4A至图4E中，示出了在形成后立即形成并且培养五天的MOS，其中几乎相同的MOS(例如，具有相同的直径)各自包括每个MOS具有10个细胞。在图4A中，示出了MOS在第0天形成后立即仍被不混溶的流体(在本例中为油)包围。从不混溶的流体中取出MOS并且洗涤，并且培养五天。图4B示出了2天后的MOS，图4C示出了3天后的MOS，而图4D和图4E分别示出了4天和5天的MOS。图4A至图4E示出了来自MOS内的活检的经解离的组织(细胞)是有活力的并且在几乎所有MOS内以相当的速率生长。正如将在那里更详细描述的，即使是单个平均大小的活检也可以大量形成这些MOS，并且可以产生数百或数千个(例如，500个、750个、1000个、2000个、5000个、10,000个或更多个)包含大量活细胞的MOS，从而允许并行进行多个快速测定。

图5A和图5B展示了如本文描述从小鼠肝脏的经解离的活检形成的MOS的实例，例如，示出了分布在经聚合的流体基质材料(在该实例中，MATRIGEL)内的小鼠肝细胞。每个MOS包括形成为具有例如约300μm的直径的球体的经聚合的基质材料503，其中分散有设定数量的肝细胞507。在图5A中，示出了在活检、解离和形成MOS之后一天的MOS。这些MOS然后被培养10天，在此期间细胞(肝细胞)保持存活并且生长，在许多情况下加倍多次以形成结构505，如图5B所示。

MOS通常可以包括MOS内固定或已知数量的细胞和/或浓度(细胞/ml或细胞/mm3)的经解离(例如，活检)的组织(例如，细胞)。如上所述，该基质材料可以是天然聚合物，诸如海藻酸盐、琼脂糖、透明质酸、胶原蛋白、明胶、纤维蛋白、弹性蛋白中的一种或多种；或合成聚合物，诸如聚乙二醇(PEG)和聚丙烯酰胺中的一种或多种。可以使用有机和无机合成聚合物。

在一些实施例中，最初包括在MOS中的细胞的数量可以从1个细胞到数百个细胞之间选择。具体地，在一些测定(例如，药物毒性测定)中，包括约1个至75个或约1个至50个(例如，较低数量的细胞)可能是有益的。每个MOS的细胞数量可以由用户设置或选择。在一些实施例中，如下所述，该装置将包括一个或多个控制以设置要包括在每个MOS中的来自原代组织的细胞的数量。细胞的数量可以根据用户打算如何使用MOS来选择或设置。例如，具有非常低数量的细胞的MOS(例如，每个MOS具有1个细胞、每个MOS具有1个至5个细胞等)可能特别适合研究克隆多样性(例如，用于肿瘤异质性)。由于每个MOS都是从单个细胞中生长出来的，因此我们可以观察哪些克隆具有耐药性并且可以检查这些特定的MOS(例如，通过基因组测序)以确定与特定克隆相关的基因组(突变)多样性。每个MOS的低至中等数量的细胞(例如，约3个至30个细胞之间、5个至30个细胞、5个至25个细胞、5个至20个细胞、10个至25个细胞等)对于快速药物测试可能特别有用，包括毒性测试，因为这些MOS通常会快速生长。每个MOS的较大数量的细胞(例如，约20个与100个细胞之间，例如30个至100个细胞、40个至100个细胞、大于50个细胞等)可能特别适合于模拟每个MOS中的组织组成，因为MOS可能包含不同的谱系，可以包括上皮细胞(或癌症等)和间充质细胞(或基质细胞、免疫细胞、血管细胞等)。

MOS可以以任何适当的尺寸形成，该尺寸可以与要包括的细胞的数量相匹配。例如，尺寸可以小至约20μm，直径高达500μm(例如，平均50μm或100μm，例如，约100μm至200μm之间，等)。在一些实施例中，尺寸为约300μm，其中每个MOS中包括约10个至50个之间的细胞(例如，约10个至30个之间的细胞)。细胞的数量和尺寸可以被改变和/或可以被控制。在一些实施例中，细胞的数量和/或MOS的尺寸可以通过对形成MOS的装置的一个或多个控制来设置。例如，MOS的尺寸和/或MOS内的细胞密度可以通过调节经解离的组织样本(例如，来自活检的细胞)的流速和/或浓度来调节。

如图1A至图5B所示，即使在培养本文描述的MOS之后，也允许存活并且健康的细胞遍布MOS的整个体积。MOS的尺寸和/或将被包含在MOS中的细胞的数量可以基于预期或打算如何使用MOS来选择。例如，在其中MOS将用于检查活检材料的细胞之间的关系的实施例中，MOS可以形成为具有多个细胞并且可以培养延长的时间段(例如，长达一周或更长)。

本文描述的MOS可以通过将经解离的组织样本(例如，活检样本)与流体基质组合来制备，所述流体基质可以以受控方式聚合以形成MOS。图6展示了形成MOS的一种方法。任选地，该方法可以包括从患者获取样本，诸如从患者组织601获取活检。如上所述，活检可以例如使用活检针或穿孔器取得。例如，活检可以使用插入患者组织以移除活检的14号、16号、18号等针来取得。从患者体内取出组织后，可以对组织进行机械和/或化学处理以解离材料。经解离的细胞可以立即用于形成MOS，如上所述；在一些实施方案中，可以修饰细胞中的所有或一些细胞，诸如通过遗传修饰细胞603，例如通过转染、电穿孔等。

来自活检材料的经解离的组织样本可以与流体(例如，液体)基质材料组合以形成未经聚合的混合物605。该未经聚合的混合物可以保持在未经聚合的状态，使得来自经解离的组织的细胞可以保持悬浮在混合物内。在一些实施方案中，通过保持细胞冷却，例如在低于室温下(例如，1摄氏度至25摄氏度之间)，可以使细胞保持悬浮和未经聚合。

然后可以将未经聚合的混合物作为液滴分配例如到不混溶的材料(诸如油)中，使得控制液滴尺寸的形成并且因此控制所形成的MOS的尺寸607。例如，可以通过将未经聚合的材料的流组合为不混溶的材料(例如，油)的一个或多个(例如，两个会聚的)流来形成均匀尺寸的液滴，使得两种材料的流速和/或压力可以确定当未经聚合的材料与不混溶的材料相交时如何形成未经聚合的材料的液滴。液滴可以被聚合609以在不混溶的材料中形成MOS。在一些实施例中，可以将不混溶的材料加热或加温至导致未经聚合的混合物(例如，未经聚合的材料中的流体基质材料)聚合的温度。一旦被形成，MOS可以与不混溶的流体分离，例如，MOS可以被洗涤以除去不混溶的流体611，并且被放置于培养基中以允许MOS内的细胞生长。MOS可以培养任何期望的时间，或者可以立即被冷冻保存和/或测定。在一些实施方案中，可以将MOS培养短暂的时间段(例如，1天至3天之间、1天至4天之间、1天至5天之间、1天至6天之间、1天至7天之间、1天至8天之间、1天至9天之间、1天至10天之间、1天至11天之间、1天至14天之间等)。这可以允许源自经解离的活检组织的细胞生长和/或分裂(例如，加倍)最多五次或六次传代。培养后，细胞可以被冷冻保存615和/或被测定617两者或其中一者。本文还描述了可以使用的测定的实例。

在本文描述的这些方法和装置中的任一者，可以在聚合之后从不混溶的流体(例如，油)中回收MOS。例如，在一些实施例中，可以通过反乳化来回收MOS，例如通过形成经乳化的液滴并且在形成液滴后回收MOS以除去任何油(和其他污染物)。这可以使细胞在经聚合的液滴(MOS)内生长，而不受不混溶的流体的抑制。

尽管本文描述的方法和装置展示了通过将未经聚合的混合物流入不混溶的流体(诸如油或其他疏水材料)的一个或多个流中来形成多个液滴并且因此形成多个MOS的方法，在一些实施例中，液滴可以通过可以允许如本文描述控制液滴的尺寸的其他方法来形成。例如，在一些实施例中，液滴可以通过打印(例如，通过将液滴打印到表面上)来形成。这可以减少或消除对另外的乳化/反乳化回收步骤的需要。例如，液滴可以被打印到表面(诸如平坦的或成形的表面)上，并且被聚合。在这些实施例中的任一者中，液滴可以使用压力、声音、电荷等来分配。在一些实施例中，液滴可以使用自动分配器(例如，移液设备)来形成，该自动分配器适于将少量未经聚合的混合物释放到表面上、空气中和/或液体介质中(包括不混溶的流体)。

用于形成MOS的方法可以是自动化的，或者使用一个或多个装置来执行。具体地，形成MOS的方法可以通过允许选择和/或控制MOS尺寸(以及因此单元数量的密度)的设备来执行。例如，图7A展示了用于形成所描述的MOS的装置700的一个实例。

在图7A中，该装置通常包括输入端，该输入端用于输入经解离的组织样本和流体基质材料(已经组合)的未经聚合的混合物，或者可以单独接收经解离的组织样本(例如，在保持溶液中)和流体基质材料。在一些实施例中，该装置包括用于保持未经聚合的混合物的保持室706和/或用于保持经解离的组织(例如，活检)样本和保持流体基质材料的保持室(未示出)。这些保持室中的任何一个或全部保持室可以被加压以控制和/或加速流体流出这些室并且进入设备。该装置可以接收未经聚合的混合物或者可以接收组分并且将其混合。在一些实施方案中，该装置可以控制未经聚合的混合物中的细胞的浓度并且可以稀释混合物(例如，通过添加另外的流体基质材料以实现期望的密度。例如，该装置可以包括用于读取未经聚合的混合物(未示出)中的细胞的密度(例如，光密度)的传感器(例如，光学读取器)。传感器还可以连接至控制器724，该控制器可以自动或半自动(例如，通过向用户指示)控制细胞在未经聚合的混合物中的稀释。该装置还可以包括用于接收未经聚合的混合物的端口。该端口可以包括阀或者可以联接到阀并且该阀可以由控制器724(或单独的控制器)控制。

装置700可以包括用于保持和/或接收不混溶的流体的室708和/或端口。在一些实施例中，不混溶的流体可以被保持在加压室中，使得可以控制流速。加压室中的任一者可以由控制器724控制，该控制器可以使用一个或多个泵726来控制压力并且因此控制通过装置的流量。系统中可以包括一个或多个压力和/或流量传感器以监测通过设备的流量。

在图7A中，整个装置700可以被封装在外壳702中，或者装置704的一部分可以被封装在外壳中。在一些实施例中，外壳可以包括设备上的一个或多个开口或进入部分，例如用于添加不混溶的流体和/或未经聚合的混合物。

如上所述，这些装置700中的任一者还可以包括一个或多个传感器728，该传感器用于监视制造过程的所有或关键部分。在一些实施例中，传感器可以包括光学传感器、机械传感器、电压和/或电阻(或电容、或电感)传感器、力传感器等。这些传感器可以用于监测组件的正在进行的操作，包括MOS的形成。装置700还可以包括一个或多个热量/温度调节器718，该热量/温度调节器用于控制不混溶的流体和/或未经聚合的混合物(和/或流体基质材料)中的一者或两者的温度。

这些装置中的任一者还可以包括可以被监测(例如，使用一个或多个传感器)的一个或多个液滴形成组件720，如下面将在图7C和图9中所展示。液滴MOS形成组件可以包括(或可以与其联接)分配器(例如，MOS分配器)722。分配器可以分配例如到多孔板716中。

一般而言，液滴MOS形成组件720可以包括一个或多个微流体芯片730或形成和控制未经聚合的混合物流并且形成实际液滴的结构。图7B展示了用于形成MOS 730的微流体芯片的一个实例。在图7B中，芯片730包括用于形成MOS的一对平行结构。图7C展示了用于形成MOS的微流体芯片的液滴形成区域，包括未经聚合的通道出口741，其打开(在该示例中为直角)通向通道出口741和不混溶的流体出口743、743'的“+”结点或交叉区域737。在一些实施例中，来自不混溶的流体通道的输入可以相对于与未经聚合的材料的角度(和交叉点)成一定角度。在图7C中，与本说明书中所有显示尺寸的图一样，所示的尺寸仅是示例性的，并且不旨在限制，除非另有规定。

在图7A中，微流体芯片730包括用于不混溶的流体进入芯片的入口(输入端口)733(例如，从图7A所示的入口端口或储存室)。进入芯片的第二入口端口735可以配置成接收未经聚合的材料并且将其沿着半曲折路径输送到结点区域。类似地，用于不混溶的流体的入口端口可以牢固地联接至来自不混溶的流体室的出口或入口，如上所述。

用于将未经聚合的材料进入芯片的入口端口735可以通过将入口连接到结点区域的输送路径741联接(如图7C所示)。类似地，不混溶的流体的入口733可以连接至两个(或更多个)连接路径743、743'以到达结点区域737。离开结点区域737的通道可以使所形成的MOS(在不混溶的流体中)沿着通道向下传递到出口731，该出口可以连接到分配器(未示出)，该分配器用于从MOS分配到一个或多个室中，例如，用于培养和/或测定。

在图7B和图7C所示的实例中，所形成的液滴一旦被聚合就可以变成MOS，在从装置(未示出)被分配之前可以沿着长的、温度受控的微流体环境被传输。例如，图8展示了被示为透明的通道区域839(例如，图7B中的元件739)的一个实例，该通道区域包含多个MOS803，每个MOS包含预定数量的细胞805。

在图9中，结点区域937的形状如上所述，使得携带未经聚合的混合物911的通道与携带与未经聚合的混合物不混溶的流体(诸如油)的一个或多个(例如，两个)通道909相交。当未经聚合的混合物被加压以第一速率流出第一通道911时，交叉通道909、909'中流动的不混溶的流体允许预定量的未经聚合的混合物通过，然后将其夹断以形成液滴903被传送到出口通道939中。因此，在一些实施例中，经切碎的(例如，经解离的)临床(例如，活检或经切除的)组织样本，诸如直径<1mm，可以与温度敏感凝胶(即MATRIGEL，在4摄氏度混合)形成未经聚合的混合物。可以将该未经聚合的混合物放入微流体设备中，该微流体设备可以生成体积和材料组成物均匀的液滴(例如，油包水液滴)。同时，经解离的肿瘤细胞可以被分配到这些液滴中。未经聚合的材料中的凝胶可以在加热时(例如，在37摄氏度)固化，并且可以形成所得的MOS。在一些实施例中，该方法可以用于从组织(例如，活检材料)产生超过10,000个(例如，超过20,000个、超过30,000个、超过40,000个、超过50,000个、超过60,000个、超过70,000个、超过80,000个、超过90,000个、超过100,000个)均匀液滴(MOS)。这些MOS与传统的3D细胞培养技术兼容。图10展示了如上所述形成的多个MOS1005，其悬浮在不混溶的材料1008(例如，油)中。

在上面展示的示例性微流体芯片中，连接被示出为T-或X-连接，其中微流体的流动聚焦形成MOS的可控制尺寸。在一些实施例中，除了微流体芯片之外，液滴可以通过机器人微移液形成，例如，到不混溶的流体和/或固体中或到凝胶基底上。或者，在一些实施例中，未经聚合的材料的液滴可以通过微毛细管生成以所需的尺寸和再现性形成。可以替代地用于从未经聚合的材料形成指定尺寸范围和可再现性的MOS的技术的其他实例可以包括胶体操纵，例如，通过诸如声学、磁学、惯性、电润湿或重力的外力。

图11A和图11B示出了如上所述形成的油中的MOS的实例。这些MOS内的细胞源自单个活检样本，通过活体染料染色可见，是存活的，如图15A至图15B和图16A至图16B所示。例如，图12A至图12B展示了具有肿瘤细胞的MOS(类似于图11A至图11B所示的那些)，这些MOS可以被洗涤以去除不混溶的材料(例如，油)。这种不混溶的材料可以在形成MOS之后相对快速地去除以便防止对MOS内的细胞造成损害。

如以下实例所述，本文描述的MOS提供了各种药物制剂的有效性的良好模型。可以针对肝毒性和药物诱导的肝损伤效应测试药剂(包括各种药物和其他疗法)的效应。

在一些实施例中，凝胶液滴从油相中回收并且经由PFO(全氟辛醇)和离心重新悬浮于例如PBS中。这可以将不混溶的流体与MOS分离。因此，这些MOS，包括基于肿瘤的MOS，可以成功生长，如上面的图1A至图1C、图2A至图2C、图3A至图3C和图4A至图4E以及图13所示。这是一项重要的改进，因为必须对存活并且生长的原代肿瘤细胞进行药物筛选，这些细胞保持了患者肿瘤的特性以预测患者的结果。这些MOS的数量多并且均匀，使得筛选既可行又可靠，如下所述。

在本文描述的微流体芯片或设备中的任一者中，通道可以被涂覆。例如，微流体设备的通道可以涂有疏水材料。

一般而言，本文描述的MOS的直径上高度均匀，并且可以具有非常低的尺寸(例如，直径)变化。例如，这在图14中所展示，示出了液滴直径尺寸的一个示例的分布。

如上所述，图15A至图15B示出了如本文描述形成的MOS；在图16A至图16B中，这些MOS已被台盼蓝(箭头)染色，示出它们是活的。以这种方式形成为液滴的MOS可以含有生长因子和基质以模拟组织产生的生物环境。患者样本(例如，活检样本)可以在获取组织后的几个小时内形成MOS(包括数百、数千或数万个MOS)。每个MOS可能有少至1个或4个至6个之间的细胞(例如，对肿瘤取样时的癌细胞)或多至数百个细胞。这些方法已被证明适用于迄今为止测试的几乎所有类型的癌症和非癌组织(n＝32)，包括结肠、食道、黑色素瘤、子宫、肉瘤、肾、肝、卵巢、肺、横膈膜、大网膜、纵隔肺和乳腺癌组织。MOS可以培养任意时间，一般只需3天至4天即可增殖和生长。它们可能会被维持和传代数月。如下文将更详细描述的，它们可以用于在获取组织(例如活检)后短短4天至6天内筛选数千种药物组合物。

本文描述的MOS可以在它们形成之后的任何时刻被储存，例如通过冷冻保存它们。肿瘤MOS可以从许多不同的患者收集，并且可以被单独或共同使用来筛选多种药物制剂以确定毒性和/或功效。非肿瘤细胞(健康组织)可以并行地被活检、条带化和/或筛选。因此，这些方法和装置可以允许高通量筛选。在一些实施例中，MOS可以被形成并且被允许两次传代(例如，两次加倍)，并且被冷冻保存。如前所述，正常、健康的组织可以用于形成这些相同的MOS以生成数百、数千或数万个MOS，这些MOS可以用于测定药物效应、药物反应、生物标记物、蛋白质组信号、基因组信号等。

特别重要的是，这些MOS以生物学上有意义的方式存活，允许它们提供临床和生理学相关数据，特别是关于药物反应，如将在图22A至图22D和图23A至图23D中描述的。特别地，本文描述的MOS允许组织提取物/活检来源的细胞生长得异常良好并且提供更具代表性的数据，尤其是与类器官或球体相比。不受特定理论的束缚，这可能是因为细胞在MOS中可能具有更受限制的细胞密度，允许细胞在共享信号的同时进行通信而不会互相抑制。MOS还具有非常大的表面与体积比，更容易允许生长因子和其他信号的传输渗透到MOS中(例如，MOS的扩散限制较小)。

测定

本文描述的MOS可以用于多种不同的测定中，并且具体地可以用于确定药物制剂对正常和/或异常(例如，癌性)组织的影响，包括毒性。例如，药物筛选可以包括将MOS应用到多孔(例如，96孔)板的全部或一些孔中。或者，可以使用定制板(例如，10,000微孔阵列可以由100个x 100个孔形成)。MOS(例如，凝胶液滴)可以施加到多个微孔阵列中，或在一些实施例中施加到多个微孔阵列上，并且与培养基一起孵育。MOS可以培养3天至5天。在一些实施方案中，在第5天，可以然后向孔(例如，微反应器)施用药物化合物，例如，基于一组FDA批准的抗癌药物，以检查药物组的效应。例如，所编写的药物可能基于国家癌症研究所(癌症治疗和诊断部门)的筛选，其中包含147种药物，旨在实现癌症研究、药物发现和组合药物研究。在第7天，MOS可以经由标准荧光显微镜被成像，并且根据药物反应被排名。

图17A至图17E示出了该测定技术的一个实例。

在该实例中，筛选测定可以是自动化的。这可能实现可重复和自动化的工作流程，从而可能将筛选的药物数量从几种增加到数百种。图17A至图17E展示了该工作流程的一个实例。在图17A中，取得肿瘤活检并且进行多次(例如，>10,000)MOS按如上所述形成(在图17A中展示了形成MOS的结点区域)。此后，可以回收并且洗涤MOS(例如，以去除形成它们的不混溶(例如，油)的材料)。MOS可以然后被铺板到一个或多个微孔板中。如图17C所示，MOS可以被培养一代或多代(例如，一次或多次传代)。这被示出为发生在第0天到第3天、第4天或第5天。此后，MOS可以被筛选，如图17D所示，例如，通过将药物施用于复制孔的子集。之后，如图17E所示，在第7天，MOS中的细胞可以被成像和/或自动或手动评分以鉴定药物效应(例如，药物筛选和生长概况)。

图17A至图17E所示的工作流程可以使所集成的设备能够用于生长、定量和/或检查MOS。在一种示例性设备中，经新鲜活检或经切除的患者肿瘤样本可以被解离并且被接种到具有试剂的凝胶中以形成MOS(如上所述)。所形成的MOS的一部分可以被冷冻保存。其余可以被回收并且被孵育，直到被接种到微孔板中以进行药物测试或筛选，如刚才所述。可以在MOS上进行生长和活力测定，这些MOS可以被成像并且被跟踪。可以测量它们对药物治疗的反应，诸如IC-50、细胞毒性和生长曲线，以确定针对患者肿瘤的有效疗法。

本文描述的方法和装置具有许多优点，包括再现性。样本制备过程可以通过微流体样本分配实现自动化，这可以减少对专业人员进行诊断测试和手动移液的需求。这在临床环境中可能特别有帮助。此外，这可以实现信号液滴之间的一致性，提高检测灵敏度。此外，这些测定可以使生成MOS所需的时间最大化。根据初步数据，这些方法可能能够在不到15分钟的时间内生成超过100,000个MATRIGEL肿瘤液滴(MOS)的库。这些方法还具有高度可扩展性，并且可以被多重使用以并行运行多个患者活检。

最后，这些方法是灵活的并且与其他技术兼容。作为一种研究工具，基于液滴的微流体通常与多种水凝胶材料兼容，诸如琼脂糖、藻酸盐、PEG和透明质酸。因此，起始凝胶组合物可以容易被修饰以伴随和促进MOS生长。此外，可以通过修饰微流体设备的尺寸来调整液滴尺寸。总之，这些允许选择大量的凝胶材料组合物和微反应器尺寸。

这里描述的微型化测定(例如使用MOS)可以最大化患者肿瘤活检，从而能够筛选更多药物化合物。例如，600uL的肿瘤样本可以分成约143,000个单独的微反应器，每个微反应器的体积为约4nL。通过最大化组织样本，可以检查多个实验重复，从而提高统计能力。这些技术可以用于检查肿瘤内异质性、药物扰动并且识别罕见细胞事件，诸如耐药性。MOS通常可以与下游测定兼容，包括单细胞RNA转录组分析和表观遗传分析。此外，通过最大化MOS提供的组织(例如，活检)样本效率，可以将部分MOS储存(例如，通过低温保存用于生物库)用于未来的新型药物测定和/或确认分析，包括基因筛查。

例如，图18和图19展示了使用本文描述方法和装置(包括MOS)的治疗方法。对于精准和个性化医疗，这些方法和装置可以用作选择合适药物的临床指标以改善临床结果和药物反应。作为一个实施方案，被诊断患有转移性癌症的患者将进行活检以进行组织病理学检查，并且筛选本文描述活检形成的多个MOS。在7天至10天内，可以从活检中进行筛选以确定最有效的标准治疗，以便患者可以在大约14天开始治疗。

图18展示了这种情况的一个实例。在这个实例中，可以在第0天(例如，通过CT扫描)鉴定肿瘤1801，并且在第5天取得活检1805，并且在同一天可以形成和培养数百、数千或数万个MOS持续1天至5天并且被筛选1805以鉴定可以使用的一种或多种药物组合物。同样的步骤(形成MOS和筛选)可以用于在整个疾病进展的多个临床决策点指导精准医疗。在这个实例中，使用所鉴定的一种或多种药物组合物的治疗可以在第14天开始(1809)，并且随后可以在治疗过程中监测患者(例如，在大约第90天的后续CT扫描)以确认肿瘤对治疗有反应1811。如果是，则可以继续治疗1813并且监测正在进行的进展1815。

如上所述，使用MOS进行测定可以在整个治疗期间和治疗过程期间在多个点重复。这在图19中展示。例如，当患者首次被诊断出1907患有可切除的原发性肿瘤时，该技术(例如，MOS的生成和筛查1905)可以用于确定最有效的新辅助治疗1921。因此，可以取得活检，并且可以形成数百、数千或数万个MOS并且使用一组潜在的药物组合物进行筛选。一旦原代肿瘤被切除1923，这项技术1905’可以表明是否应该选择辅助治疗以及应该选择哪种辅助治疗1925。如果在手术切除原代肿瘤后发生复发或转移1927，可以使用相同的技术(例如，从新鲜活检中生成和筛选MOS1905”、1905”′、195””)来指导标准护理疗法，包括第1线1929、第2线1931和第3线1933疗法。如果患者最终对所有标准护理疗法产生耐受或耐药，则可以执行该技术1905””'来鉴定标签外药物以治疗耐药性肿瘤1935。该技术还可以用作伴随诊断来鉴定患者进行特异性治疗。最后，该技术可以用于衍生和保存患者来源的MOS以建立基于Organosphere的活体癌症库用于筛查、基因组分析、新药发现、药物测试和临床试验设计。

因为这些技术以及大量MOS的产生可以以相对低的侵入性(例如，通过切除术或活检)来完成，以提供相当快速的筛选结果，所以这些方法可以容易地适应于护理标准。例如，来自组织(例如，活检)输入的细胞材料的体积相当小，并且可以解离成例如10μL与5ml之间的体积。

一般而言，使用本文描述的MOS进行筛选可以自动或手动进行。实际上可以使用任何筛选技术，包括通过以下项中的一项或多项进行成像：共焦显微镜、荧光显微镜、液体透镜、全息术、声纳、明视场和暗场成像、激光、平面激光片，包括基于图像的高通量实施例分析方法(例如，使用计算机视觉和/或监督或无监督模型，例如，CNN)。下游筛选可以包括对培养基取样和/或对来自MOS的细胞进行遗传或蛋白质筛选(例如，scRNA-seq、ATAC-seq、蛋白质组学等)。

实例

实例1

图20和图21展示了用于形成如本文描述的多个MOS的装置的另一个实例。在图20中，该装置可以包括形成结点的多个MOS，其中不混溶的材料(例如，油)2002可以被添加至设备中的储存器和/或端口2004。类似地，未经聚合的材料2006(在该实例中，包括经解离的活检细胞和流体基质材料)可以被添加至装置中的储器或端口2008。在一些实施例中，第二或另外的材料(例如，生物活性剂)可以经由第三组端口被添加2010。这些组分可以在结点处组合(类似于上述)，从而在不混溶的材料中形成液滴，该液滴可以聚合成MOS。在图20中，示出了具有相应输入和输出的三个(或更多)并联结点。

图21展示了使用如图20所示的装置形成MOS的方法。在该实施例中，所得的MOS既包括目标(例如，肿瘤)活检细胞，也包括被组合以形成MOS的一种或多种另外的生物活性剂。例如，第一通道2103可以包括未经聚合的材料(包括经解离的活检细胞和基质材料)，第二通道2107包括附加的活性生物材料，以及携带不混溶的材料(例如，油)的一对交叉通道2109、2109'在结点处会聚以形成尺寸受控的液滴，所述液滴被聚合以形成MOS2107。

在该实例中，另外的活性生物材料可以是例如冷冻培养基(例如，以帮助储存MOS)和/或与另外的细胞(例如，免疫细胞、基质细胞、内皮细胞等)、另外的支持网络分子(例如，ECM、胶原蛋白、酶、糖蛋白、仿生支架等)、另外的生长因子和/或药物化合物的共培养物。

实例2：筛选结果

如上所述，MOS和使用它们筛选药物组合物的方法可以用于准确预测患者肿瘤对一种或多种药物疗法的反应。在某些情况下，传统培养药物筛选无法准确预测药物反应，而MOS的使用可能会提供准确的结果。例如，在图22A至图22D中，MOS而非细胞系能够与患者反应相关。在图22A中，检查了被施用药物(例如奥沙利汀)的传统细胞系；细胞系未示出了任何效应，这表明肿瘤在所有检查剂量范围内都会对药物产生耐药性。

为了比较，从患者活检中产生多个MOS，如图22B所示。在此实例中，MOS示出了肿瘤MOS的细胞存活率显著下降，这预示着药物敏感性。事实上，当用药物治疗时，肿瘤对治疗有反应，如图22C(治疗前)和图22D(治疗后)所示。

实例3：MOS与患者反应之间的相关性

在一组类似的实验中，从活检材料产生MOS(图23A)，并且使用所得的MOS进行药效筛选。图23B示出了第一种药物(奥沙利帕汀)对这些MOS的效应，示出了在药物存在下MOS的存活百分比没有变化，从而预测了耐药性。类似地，用第二种药物伊立替康治疗，示出了对预测耐药性的MOS缺乏效应，如图23C所示。该患者同时接受奥沙利帕汀和伊立替康治疗，并且，治疗6个月后，没有出现任何反应。因此，MOS与患者对标准护理药物的反应密切相关。在这种情况下，患者忍受了六个月的副效应和毒性，而这些副效应和毒性本来可以通过MOS的预测反应来避免，这表明(活检后7天至10天内)肿瘤不会对这些药物产生反应。

实例4：多药物筛选

图24示出了可以使用如本文描述的患者来源的多个MOS产生的一组药物(例如，化疗剂)的实例。在该实例中，通过对多种(27)药物中的每一种药物进行多次重复给药来运行使用患者来源的MOS的药物筛选。使用单个肿瘤活检来极快地(例如，在不到两周内)大量生成多个MOS，并且针对一组药物制剂(例如，示出了27种制剂)测试了这些MOS。该测试是并行完成的，并且可以自动量化(例如，通过光学检测和量化)。在此实例中，针对该特定肿瘤，示出了最大毒性的药物是帕唑帕尼。

可以并行地检查药物的组合以及不同的药物浓度。由于同一肿瘤活检可能产生数百、数千或数万个MOS，因此通过本文描述的方法和装置可以实现这种阵列测试。

实例5：活检样本制备

材料：如上所述的用于形成MOS的装置，包括液滴微流控芯片(200um)；用于EvaGreen的Bio-rad液滴生成油(目录号#186-4006)，每次运行3mL至5mL，全氟辛醇(PFO)，Sigma，Novec HFE 7500中的10％全氟辛醇(PFO)，PBS，细胞培养基(即含10％ FBS和1％PenStrep的RPMI)，70um或100um过滤器，50mL锥形、培养皿。

活检样本解离：使用活检样本(人/动物)产生来自患者的经解离的样本(即单细胞组织)。涂覆微流控芯片，并且组装微流控芯片和支架。将微流体管和配件连接到MOS和废油的输出(例如，多层板、15mL Eppendorf等)。

运行设备以形成MOS。从培养箱中取出包含液滴的输出(例如板、Eppendorf管等)(至少15分钟后)。从输出除去多余的油。液滴应该有浮力，因此油应该位于小瓶的底部。小心不要从管中除去液滴。将100uL 10％(v/v)PFO添加至输出。小心旋转并且等待约1min。请勿移液或干扰样本。以300g离心60sec。除去上清液(多余的油/PFO)。请勿移液或干扰样本。尽可能多地去除PFO，因为这种化学物质会降低培养过程中的细胞活力。添加1mL的细胞培养基。请勿移液或干扰样本。以300g离心60sec。去除上清液和任何多余的油/PFO。添加1mL的细胞培养基。使用1mL移液器吸头小心地上下移液样本(约30次)。小心不要过度移液或扰乱液滴样本。使用1mL移液器吸头，将液滴培养基溶液通过70um或100um过滤器(连接到50mL锥形)。一些液滴会粘附在输出的内部(例如，15mL Eppendorf)。用2mL至3mL的PBS冲洗每个管，并且上下移液。将冲洗过的PBS和液滴通过过滤器。重复此步骤两次，或直到管子看起来清澈，并且液滴已转移到过滤器中。使用1mL移液器吸头，用约5mL的PBS仔细清洗含有液滴的过滤器。尝试覆盖过滤器的整个表面区域。此清洗步骤可以去除样本中多余的油和PFO，并且最终将凝胶液滴回收到细胞培养基中。

一旦正确排出(约1分钟至2分钟)，小心地从50mL锥形中取出过滤器。将过滤器翻转过来，用新鲜的细胞培养基清洗背面，并且将溶液收集在新鲜的培养皿中。这会将液滴从过滤器上分离，并且将它们放入细胞培养基中。建议使用1mL移液器吸头，并且用约5mL培养基清洗

在显微镜下检查液滴的质量。应除去大部分/全部油。若回收率不佳，可以将样本重新过滤。回收的MOS密度可以通过血细胞计数器检查

实例6：肾组织MOS

在另一个实例中，MOS可以由活检肾组织形成。例如，使用的仪器可以包括：管旋转器或100μm和70μm细胞过滤器、15mL锥形管、50mL锥形管、刀片、镊子和手术剪刀、培养皿(100mm x 15mm)或组织培养皿。试剂可以包括：EBM-2培养基、胶原酶(5mg/mL库存)、Hank平衡盐溶液(HBSS)、氯化钙(10mM库存溶液)、磷酸盐缓冲溶液(1X PBS)、MATRIGEL、0.4％台盼蓝溶液和胰蛋白酶。

肾组织始终储存在冷运输介质中并且保存在冰上。可以将2mL酶消化溶液放入15mL锥形管中。添加600uL氯化钙(最终浓度：3mM)并添加200uL胶原酶(最终：0.5mg/mL)。将肾脏样本转移到培养皿中。用无菌纸巾或刀片去除所有多余或非肿瘤组织。将1mL的酶溶液添加至组织中。用无菌刀片(<2mm2)将样本切成小块。用镊子或用手按住板。将切碎的组织和酶溶液转移回含有酶溶液的15mL管中。将管放入管旋转器或15mL管旋转器中，在37℃培养箱中放置30分钟至60分钟。从培养箱中取出管子。用至少6mL EBM-2(至少是酶消化溶液量的3倍)淬灭酶消化。用移液器吸取以混合。将100μm或70μm细胞过滤器放置到50mL锥形管上。通过过滤器转移样本。将溶液转移至新的15mL锥形管中。将样本以1500rpm离心5分钟。弃去上清液，留下细胞沉淀。将颗粒重新悬浮在1mL EBM-2培养基中。将10μL细胞混合物添加至封口膜上的10μL台盼蓝中，然后转移到细胞计数板或血细胞计数器上。计算细胞浓度(#/mL)。以1500RPM离心5分钟，弃去上清液，留下沉淀。每1.25个x 105个细胞将细胞沉淀物重新悬浮在50uL MATRIGEL中。在冰上进行。将50uL圆顶MATRIGEL细胞悬浮液铺板在经预热的24孔平底板的孔中心中。将板转移至37℃细胞培养箱并且孵育至少20分钟。确认圆顶已聚合。沿着孔壁轻轻添加500μL经预热的EBM-2培养基。在37℃培养箱中培养。每2天执行一次完整的培养基更换以扩展MOS。

实例7：肝脏微有机球

如上所述，MOS可以由正常(例如，非癌性)和/或异常组织形成。例如，图25A至图25和图26A至图26B展示了由已经脱位的小鼠肝脏组织形成的MOS的一个实例，该MOS与流体基质材料组合以形成未经聚合的混合物，然后聚合该未经聚合的混合物的液滴以形成MOS。在该实例中，MOS的直径约为300μm。在图25A至图25B中，MOS形成为每个液滴具有单个细胞。在图26A至图26B中，每个液滴形成有25个细胞的MOS。在图25A中，示出了形成一天后的MOS；图25B示出了培养十天后的MOS。一些MOS中的细胞已经分裂，形成簇状结构；其他MOS包括分裂速度较慢或不分裂的细胞。类似地，在图26A至图26B中，MOS最初在每个MOS中包括大约25个细胞。培养十天后，一些MOS示出了大量细胞生长，形成结构，而其他MOS仅示出了适度的生长。在这两种情况下，MOS内的细胞都表现出它们起源的原始组织(例如肝细胞)的特性。

相同的程序已成功地在人肝脏组织上进行，如图27A至图27C中所示。在该实例中，MOS最初由大约五十个细胞形成，如图27A所示。培养第18天时，MOS中的一些示出了细胞具有簇并且形成结构，而另一些则具有较小的结构或细胞不分裂。

实例8：经培养的细胞微有机球

除了例如在形成MOS之前立即或不久之前从患者取出的原代组织之外，MOS可以由经培养的细胞形成，包括2D培养的细胞或3D培养的细胞。

在一些实施例中，MOS可以由作为患者来源的异种移植物((PDX)的一部分生长的细胞系形成。例如，图28A至图28D展示了由经培养的PDX240细胞形成的MOS。PDX240细胞是患者来源的异种移植(PDX)肿瘤细胞系(根据患者来源编号为240)，是在免疫缺陷小鼠(PDX)中生长以形成体内肿瘤的人类肿瘤。异种移植组织被提取分离，并且用于形成如上所述的MOS。在此实例中，每个MOS形成时都包含一个细胞。图28A示出了培养一天后的MOS，而图28B示出了培养三天后的MOS，并且图28C和图28D分别示出了培养五天和七天后的MOS。随着培养时间的推移，MOS中的至少一些示出了细胞分裂并且形成结构。

图29A至图29D示出了类似的实验，其中五个PDX240细胞最初被包含在形成每个MOS的每个液滴中。随着培养时间的推移(例如，从第1天、第3天、第5天和第7天，分别如图29A至图29所示)，细胞可以分裂并且形成结构。

实例9：MOS与传统类器官的比较

类器官由患者来源的异种移植细胞(包括上面描述的PDX240细胞和第二个PDX细胞系PDX19187)形成，并且与使用相同细胞形成的MOS进行了比较。使用其中将细胞接种到孔或培养皿中的大量MATRIGEL中并且培养直至确认生长的常规技术形成类器官。MOS是由传统的类器官生成的。

然后使用相同的药物(例如，奥沙利铂或SN38)处理传统(“块状”)类器官和MOS，并且在处理3天后测量细胞活力。图30和图31所示的药物反应曲线被生成，并且示出相似的反应曲线。例如，在图30中，PDO19187块状类器官和MOS的药物反应曲线示出了与奥沙利铂浓度相似的反应曲线，PDX240块状类器官和MOS也是如此。在图31中，用于PDX19187和PDX240的药物反应曲线也示出了针对用于SN38的块状类器官和MOS两者的相似结果。图32示出了另一种抗癌药物5-FU(氟尿嘧啶)的反应曲线，再次示出了针对PDZ-19187和PDX-240传统类器官和MOS两者的相似药物反应曲线。

因此，与传统的类器官相比，本文描述的MOS可以更快速并且更可靠地形成，并且可以具有更高的总体存活率，可以提供与使用相同细胞形成的块状类器官的药物反应相当的药物反应。然而，如本文所描述的，MOS可以被更快地使用并且可以以大得多的数量形成。

实例10：药物在MOS上的效应

一般而言，本文描述的MOS可以用于进行一种或多种测定，包括毒性测定。可以进行任何适当的测定，如通过分析悬浮在MOS内的组织(例如，细胞、组织结构)确定的结果。本文描述的MOS可以通过光学、化学、电学、遗传或本领域已知的任何其他方式测定或分析。

光学(手动或自动)检测可能特别有用，并且可以包括光学分析一种或多种药物配方在MOS内的组织(包括细胞、细胞簇、细胞结构等)上的效应。在一些实施方案中，如上所述，可以对药物制剂测定经测试的MOS内的细胞死亡(例如，组织的数量和/或尺寸)。在其他实施例中，可以对MOS测定细胞生长，包括尺寸、类型和/或生长速率的减少。在一些实施例中，可以对MOS测定所形成的组织结构的变化。

例如，图33A至图33B展示了一种药物制剂(本例中为对乙酰氨基酚(10mM))在小鼠肝脏MOS上的效应。图33A是对照组，其中MOS未经处理，示出了培养时生长的MOS内的组织(箭头)。图33B示出了改为用10mM对乙酰氨基酚处理的由小鼠肝脏形成的一组相似的MOS。与治疗组相比，对照组中MOS内的组织结构相对较大。对乙酰氨基酚组的MOS中的大多数中的组织较小并且含有许多死细胞。

类似地，图34A至图34B还示出了使用人肝脏MOS的毒性测定。图34A示出了在对照组中观察到的典型人肝脏MOS，包括其中形成的组织结构(由箭头指示)。图34B示出了治疗组，其中用对乙酰氨基酚(10mM)处理人肝脏MOS。与对照组相比，经过处理的MOS中的组织示出了非典型组织结构(箭头)和碎片显著增加。

这些评论中的任一者，包括光学评论，可以被评分、分级、排名或以其他方式量化。例如，在图33A至图33B和34A至图34B所示，这两个测定的结果可以被量化以指示尺寸差异、活/死细胞/组织的数量等。在一些实施例中，评分可以是自动化的。

实例11：HepatoMOS的活力

使用每个MOS液滴50个细胞、100个细胞和200个细胞来评定HepatoMOS的形态。使用100个细胞/MOS观察最佳条件，根据基于明视场(BF)成像和活力染色的改进形态、细胞组织和活力来定义。HepatoMOS示出了至少24天的持续活力。

图35示出了HepatoMOS在第0天封装后仍然存活。100和200个肝细胞被封装在MOS液滴中。使用活细胞染料Calcein AM(绿色通道)和死细胞染料乙锭同二聚体(红色通道)监测活力评定。染色结果表明，包封后的肝细胞是存活的。

图36示出了第3天的HepatoMOS活力。活细胞染料(Calcein AM)和死细胞染料乙锭同二聚体(红色通道)表明，100个细胞/液滴条件示出了最佳的细胞活力。

肝细胞被包装到MOS液滴中并且基于细胞密度成熟。根据BF图像，在100个细胞/液滴时，当长时间密切接触时，细胞开始联合并且形成类器官结构。适当的细胞密度范围是80个至160个细胞/液滴(直径200uM至300uM)。可以使用被确定适合培养肝细胞的任何培养基。

图37示出了HepatoMOS随时间的监测。

图38示出了HepatoMOS在3周内维持非常高的细胞活力。

与2D培养条件的肝细胞相比，来自HepatoMOS的结果得到改善。

图39示出了肝细胞在2D培养条件下失去活力。图39A示出了根据明视场图像在2D培养条件下第7天观察到大量死亡肝细胞。图39B示出了具有明视场的对照孔的代表性活/死图像，示出了2D条件下肝细胞培养物的低活力。

实例12：HepatoMOS的功能

HepatoMOS保持稳定水平的尿素和白蛋白分泌，表明HepatoMOS包含功能性肝细胞，如图40所示。HepatoMOS表现出至少24天的持续功能。

实例11和实例12表明，在384孔板中每300um液滴使用100个细胞和每孔40个液滴的方法提供了足够的实验信号以用于毒理学评定测定。细胞生物量的显著减少为高通量筛选提供了扩展的用途。

与通常每孔接种30,000个细胞的常规2D方法相比，本文描述的MOS生成系统能够在384孔板中仅使用4,000个细胞进行筛选。

实例13：药物诱导的肝损伤评定

使用HepatoMOS和2D肝细胞培养物来评定各种药剂的药物诱导的肝损伤(DILI)效应。

将来自Lonza的冷冻人肝细胞以每孔30,000个细胞铺板并使其在铺板培养基中建立。第2天，除去平板培养基并用维持培养基替换并培养1天。第三天，用处理培养基替换培养基并将细胞处理72小时。在收获之前，用CTG试剂处理HepatoMOS以监测活力。

选择具有已知临床肝毒性的化合物来评定HepatoMOS 3D模型中的毒性参数。已发布的IC50值针对3D球体和2D HepG2模型显示(表1)。在报告的测定中，高于199的值表明没有毒性。

表1：HepatoMOS 3D模型中的毒性参数

使用基于荧光的图像分析观察细胞毒性并且提供对已知毒物的剂量依赖性反应。

图41示出了基于HepatoMOS的DILI评定显示出更敏感的药物反应并且与临床环境中的DILI效应具有更好的相关性。本实验使用100个细胞/液滴，通过Celltiter Glo 3D测定细胞活力。

相反，如图42所示，基于2D肝细胞培养物的DILI测定没有捕获临床DILI效应。

从这些结果可以清楚地看出，HepatoMOS培养物能够将DILI阳性化合物与不关心DILI效应的药物区分开。

实例14：HepatoMOS培养物的建立和功能表征

为了评价MOS的独特特征是否提供了用于维持肝细胞，特别是原代人肝细胞(PHH)的有利3D环境，使用了含有来自十个个体供体(包括五名成年女性和五名成年男性)的汇集PHH的商业冷冻保存产品，更好地代表性别并且消除个体差异。据报道，肝细胞彼此形成紧密的细胞间连接，这对于PHH的正常功能和极性至关重要。为了确定成功HepatoMOS培养所需的最佳细胞密度，将PHH封装在不同密度的基质胶液滴中：每个液滴10个、50个、100个和200个细胞，直径为约240μm。肝细胞培养基(HCM)是一种无血清市售培养基，首先被选择用于测试HepatoMOS培养。对HepatoMOS的形态变化和活力进行长达21天的监测。图43a显示了七天后的HepatoMOS培养物，揭示了PHH簇的数量随着细胞密度的增加而增加。在测试的四种密度中，HepatoMOS在100个细胞/液滴密度条件下形成最均匀、致密的微组织样结构。活细胞和死细胞染料染色(Calcein AM和EtH)进一步证实，100个细胞/MOS在所有四种测试密度中表现出最均匀和最有活力的培养物(图44a)，表明约100个细胞/液滴的最佳密度对于HepatoMOS来说是最佳的培养。与这一观察结果一致，在使用相同培养基和条件培养的具有异质液滴尺寸的孔中，我们还观察到含有非常高密度PHH的大液滴和含有稀疏PHH的液滴示出了更多的死细胞，如Calcein AM和EtH染色所示，建议最佳的细胞密度，可以提供紧密的细胞间相互作用，而且还可以有效地营养/氧气渗透。相反，在匹配的圆顶培养条件下，活细胞染料Calcein AM仅在圆顶外围区域示出了阳性信号，而圆顶中心的大多数PHH在第7天和第14天均被死细胞染料EtH染色(图44c)，表明基质胶圆顶内的PHH活力下降。我们进一步使用其他三种无血清培养基选项(InSphero、INVITROGRO HI和William's E)测试了HepatoMOS培养物，并且HepatoMOS在InSphero或HCM培养基条件下表现出长期培养活力，而HepatoMOS中的大多数在INVITROGRO HI和William's E培养基条件中在14天内死亡(图43b和图44b)。在InSphero和HCM培养基条件下，我们观察到从第4天到第7天CTG信号增加更快，从第7天到第14天CTG信号相对稳定增加(图43c)。因此，在本研究中进行的大部分工作中，我们使用100个细胞/液滴的密度条件和HCM或InSphero培养基来培养PHH。

另外，在HepatoMOS培养物中观察到CDFDA阳性染色(图43d)，其是胆小管形成的重要指标。为了进一步确认HepatoMOS培养物中肝脏特异性功能的保存，在所有测试的生长条件下，检查了白蛋白和尿素分泌物，这是肝脏特异性功能的两个最广泛使用的指标。如图43e和43f所示，在所有HepatoMOS培养条件中观察到白蛋白产量从第4天到第7天增加，而在相应的2D培养条件中从第4天到第7天发生白蛋白产量快速下降。同样，从第4天到第21天，HepatoMOS培养物中的尿素产量稳定，但在相应的2D条件下观察到尿素产量快速下降。值得注意的是，白蛋白和尿素产量的水平均显著高于相应的2D PHH培养条件长达21天。白蛋白和CYP的免疫荧光染色证实了在HepatoMOS培养物中保留了PHH的主要功能(图43g)。

在HepatoMOS培养物中观察到从第4天到第10天CTG信号和白蛋白产生的增加，为了确认HepatoMOS培养物中是否存在PHH的任何扩增，通过H&E(苏木精和曙红)检查HepatoMOS培养物的组织学，并且IHC(免疫组织化学)染色。H&E染色结果证实了HepatoMOS培养物中存在多倍体，这是体内观察到的PHH的典型特征性细胞特征之一。更有趣的是，在第7天的HepatoMOS培养物中观察到了Ki67阳性细胞，这表明CTG信号和白蛋白产量的增加可能是由于HepatoMOS培养物中PHH的扩增所致。

此外，证实了来自两个个体供体(包括一名成人和一名儿科供体)的商业冷冻PHH中的这种HepatoMOS培养条件的再现性和稳健性(表2)。所有个体供体结果示出了与汇集供体一致的培养基、密度偏好和生长模式(图45和图46)。上述结果表明使用MOS技术培养PHH具有明显的优势。

表2：源自PHH的HepatoMOS培养物的重现性和稳健性来自汇集供体或单个供体。

PHH的培养和HepatoMOS生成：PHH的汇集供体和个体供体购自BioIVT(www.bioivt.com)。用于比较球体法与非球体法的DILI预测能力的PHH。HepatoMOS方法与InSphero试剂盒一起使用。本研究中选择了四种不同的无血清培养基(InSphero、HCMTM肝细胞培养基BulletKitTM、BioIVT INVITROGRO HI培养基和William E)用于初始HepatoMOS培养。PHH可以作为2D单层在胶原蛋白包被的96孔板上培养，也可以封装在MOS中以创建不同细胞密度的HepatoMOS。为了比较HepatoMOS与圆顶培养方法，使用了用于圆顶和制备HepatoMOS的匹配细胞密度。

HepatoMOS培养物中白蛋白和尿素产量的定量：收获来自2D单层或HepatoMOS培养物的上清条件培养基并分析白蛋白和尿素产量。在2D培养条件下，将肝细胞以20,000个细胞/孔直接铺板在胶原蛋白包被的96孔板上，并且使用肝细胞培养基(HCM，Lonza)进行培养。对于MOS条件，将含有10、50、100或200个肝细胞/MOS的HepatoMOS以50个MOS/孔的HCM培养基铺板到96孔板中，一式三份。含有100个细胞/MOS的HepatoMOS也以50个MOS/孔一式三份铺板在作为3D InSight人类肝脏微组织套件组件提供的培养基中来自InSphero(以下简称InSphero培养基)作为比较培养基配方。在第1天、第4天、第7天、第10天、第14天和第21天收集条件培养基，并且储存在-80℃。

为了定量白蛋白产生，将条件培养基在室温(25℃)下解冻并且使用人白蛋白ELISA试剂盒(Invitrogen)进行分析。稀释样本以使白蛋白浓度进入测定的动态范围：50个细胞/MOS-所有时间点均为1:50；100个细胞/MOS–第1天、第4天、第21天为1:50，第4天、第7天、第10天为1:100；200个细胞/MOS–第1天、第4天、第21天为1:50，第4天、第7天、第10天为1:100；InSphero培养基中100个细胞/MOS–所有时间点均为1:50；2D培养–所有时间点均为1:50。使用尿素氮BUN比色检测试剂盒(Invitrogen)评定尿素产量，样本按以下比例稀释：HCM培养基中50个、100个、200个细胞/MOS，HCM培养基中100个细胞/MOS InSphero培养基，第1天和第4天-1:5；HCM培养基中50个、100个、200个细胞/MOS和100个InSphero培养基中的细胞/MOS，第7天、第10天、第14天和第21天–1:10，2D培养，所有时间点–1:5。对于白蛋白ELISA和尿素检测试剂盒，均按照测定制造商所写的程序进行，并且使用ClarioSTAR读板器(BMG)捕获最终测量结果。

实例15：HepatoMOS平台能够进行灵敏且快速的测定以精确预测DILI

鉴于HepatoMOS培养物中细胞活力、维持和肝特异性功能保存的高保真度，评估了在药物开发过程中预测DILI效应的潜在应用。将HepatoMOS的敏感性和特异性与两种广泛使用的DILI检测方法进行了比较：i)2D培养；ii)球状PHH。如图48a所示，在被测试的化合物中，HepatoMOS表现出明显更高的灵敏度与基于2D的DILI测定在预测药物DILI效应方面的比较。基于HepatoMOS的DILI测定也优于基于球体的DILI测定，在检测两种严重DILI药物托卡彭和曲格列酮方面表现出更好的灵敏度，如较低的IC50值和较大的安全裕度所示(图48b和图48c)。三种方法均未示出了对非DILI相关化合物的任何DILI担忧。

除了通过CTG测定检测到的活力读数之外，基于HepatoMOS的DILI测定结合了活细胞和死细胞染料染色的组合以确定化合物的急性细胞毒性效应。如图47所示，我们观察到活/死染色检测DILI效应的特异性和灵敏度与基于ATP含量的读数相似。

为了进一步验证HepatoMOS测定的预测性，对AMG-510的DILI问题进行了评估。AMG-520是FDA批准的一种新型KRAS G12C抑制剂，用于治疗具有Kras G12C突变的成人NSCLC。最近的一项1期临床试验研究报告称，该药物与免疫疗法联合使用时，会导致严重肝脏副效应的发生率更高。2D和基于球体的DILI检测均未能捕获该药物的任何DILI问题。然而，基于HepatoMOS的检测示出了，10个供体批次中AMG-510的IC50低于10μM，单个供体中的IC50低于3.7μM，甚至低于该药物报道的C_max(13.4μM)。这表明如果患者服用过量的AMG-510可能会导致肝毒性，由于该药物的突变体特异性，最初认为该剂量是可以耐受的。

细胞活力测定：通过CellTiter-3D细胞活力测定(Promega)测量2D单层培养物或HepatoMOS培养物中PHH的细胞活力。对于HepatoMOS活力测量，除了之前报道的CTG检测外，我们还联合应用了Calcein AM和EtH染色。

2D PHH和HepatoMOS中的DILI评定：对于PHH培养物的2D单层中的DILI评定，将PHH以20,000个活细胞/孔的细胞密度接种在胶原包被的96孔板中。培养24h后，将PHH暴露于不同浓度的DILI化合物。然后通过使用CTG测定测量PHH的细胞活力，并且通过CTG读数的变化评定DILI效应。对于HepatoMOS培养物中的DILI评定，HepatoMOS以100个细胞/液滴封装，并且在HCM或InSphero培养基中培养4天。然后将HepatoMOS分配到96孔板中并进行药物处理。

结果讨论：HepatoMOS为PHH的产生和长期培养提供简单、快速、高通量和自动化兼容的平台。研究发现HepatoMOS培养物可保持高细胞活力并形成均一的PHH细胞簇。从第4天到第14天观察到显著增长。重要的是，PHH在圆顶培养的相同条件下无法存活或生长，这表明MOS技术提供的三个关键要素，包括细胞间相互作用、周围的细胞外基质和有效的营养/氧气渗透系统，所有这些都使成功PHH的3D培养。HepatoMOS培养物在几个不同层面复制了PHH的真实功能：1)形态和结构：HepatoMOS保留了PHH的形态和关键特征，诸如胆小管和多核细胞；2)肝脏特异性功能：在HepatoMOS培养物中检测到持续高水平的白蛋白和尿素分泌长达21天。所有这三个功能使HepatoMOS成为一个独特且强大的模型，可用于体外研究肝脏疾病和肝脏特异性功能。

近年来，3D球体或类器官中生长的PHH的开发已取得显著进展。与之前报道的人肝脏类器官3D长期培养不同，我们这里建立的HepatoMOS培养不需要富集EpCAM+细胞进行初始扩增，因此不需要使用分化培养基将祖细胞转化为成熟的肝细胞，这显著简化了程序并减少了培养时间。将PHH培养成球体也面临一些挑战，包括1)细胞活力：在球体形成过程中维持PHH的活力可能很困难；2)细胞功能：在球体中维持肝脏特有的功能，诸如新陈代谢和胆汁分泌，可能具有挑战性；3)球体尺寸和均匀性：实现一致的球体尺寸和均匀性可能很困难，这会影响结果的再现性；4)长期维护：长时间维护球体可能具有挑战性，并且可能影响结果的准确性；5)可扩展性：可扩展性是球体培养的一个挑战，因为单个球体中可以培养的细胞数量是有限的。基于上述结果，HepatoMOS针对上述每个问题提供了新的解决方案，并且通过多种方式提高了PHH培养的效率和可靠性。

用于预测DILI的体外2D模型具有有限的准确性和再现性，使得准确预测人类的DILI具有挑战性。3D培养系统有潜力提供更多生理相关信息，从而提高DILI预测的准确性。然而，目前的3D培养系统仍面临几个挑战：1)肝脏特异性功能的维持；2)缺乏标准化协议；3)维持细胞活力的困难：由于氧气和营养物质的可用性有限，在3D培养中长时间维持细胞活力可能具有挑战性；4)药物测试困难：由于系统的复杂性以及监测和测量工具的局限性，在3D培养中准确评定药物对PHH的影响可能具有挑战性。HepatoMOS对DILI相关药物表现出更敏感的反应，并且具有与商业PHH球体试剂盒类似的性能。与其他PHH 3D培养物相比，HepatoMOS还示出了多种优势，包括其能够重现人类肝脏的许多特征和肝脏特异性功能。

MOS技术实现类器官培养的高通量和自动化。同样，HepatoMOS平台还允许同时培养源自单个供体或汇集供体的数千个统一的PHH微组织样结构。使用HepatoMOS系统进行PHH培养的高通量和自动化具有多种优势，并且有可能极大地增进我们对肝脏生物学和疾病的理解。

本文描述的方法中的任一者(包括用户界面)可以被实现为软件、硬件或固件，并且可以被描述为存储能够由处理器执行的指令集的非暂时性计算机可读存储介质(例如计算机、平板电脑、智能手机等)，当由处理器执行时导致处理器控制/执行任何步骤，包括但不限于：显示、与用户通信、分析、修改参数(包括时间、频率、强度等)、确定、警报等。

当特征或元件在本文中被称为在另一特征或元件“上”时，其可以直接在另一特征或元件上，或者也可以存在中间特征和/或元件。相反，当一个特征或元件被称为直接位于另一特征或元件“之上”，不存在中间特征或元件。还应当理解，当一个特征或元件被称为“连接”、“附接”或“联接”到另一特征或元件时，它可以直接连接、附接或联接到另一特征或元件，或者可能存在中间特征或元素。相反，当特征或元件被称为“直接连接”、“直接附接”或“直接联接”到另一特征或元件时，不存在中间特征或元件。尽管针对一个实施例进行了描述或示出了，但是如此描述或示出了的特征和元件可以应用于其他实施例。本领域技术人员还应当理解，提及与另一特征“相邻”设置的结构或特征可以具有与相邻特征重叠或位于相邻特征下方的部分。

本文使用的术语仅用于描述特定实施例的目的，而不旨在是限制性的。例如，如本文所使用的，单数形式“一个(a/an)”和“所述(the)”预期同样包含复数形式，除非上下文另有明确指示。应当进一步理解的是，当在本说明书中使用时，术语“包括”指定所陈述的特征、步骤、操作、元件和/或部件的存在，但不排除存在或添加一个或多个其他特征、步骤、操作、元件、部件和/或其组。如本文所使用的，术语“和/或”包含相关联列举项中的一个或多个的任何和所有组合并且可以缩写为“/”。

在本文中可以使用空间上相对的术语，诸如“底下”、“下方”、“下面”，“上方”、“上面”等，以便于描述在图中所绘示的一个元件或特征与另一个或另一些元件或者一个或多个特征的关系。将理解的是，除了在附图中描绘的朝向之外，空间相对术语还旨在涵盖设备在使用时或操作时的不同朝向。例如，如果图中的设备被倒置，则被描述为在其他元件或特征“底下”或“下方”的元件将被定向为在其他元件或特征“上方”。因此，示例性术语“底下”可以涵盖上方和下方两种方向。设备可以以其他方式定向(旋转90度或以其他定向)并且本文使用的空间相对描述符被相应地解释。类似地，术语“向上”、“向下”、“垂直”、“水平”等在本文中仅用于解释的目的，除非另外具体指出。

虽然术语“第一”和“第二”可以在本文中用于描述各种特征/元件(包括步骤)，但是这些特征/元件不应受这些术语限制，除非上下文另有指示。这些术语可以用于将一个特征/元素与另一特征/元素区分开。因此，本文讨论的第一特征/元素可以被称为第二特征/元素，并且类似地，本文讨论的第二特征/元素可以被称为第一特征/元素，而不脱离本发明的教导。

在整个本说明书中，除非上下文另有要求，词语“包含”以及诸如“包含”和“包含”的实施例意指可以在方法和制品(例如，组合物和装置，包括设备和方法)中共同使用的各种组件。例如，术语“包括”将被理解为暗示包括任何所述的元件或步骤，但不排除任何其他元件或步骤。

一般而言，本文描述的装置和方法中的任一者应被理解为是包括性的，但其组件和/或的全部或子集步骤可以替代地是排他性的，并且可以被表达为“由......组成”或替代地“基本上由......组成”各种组件、步骤、子组件或子步骤。

如本文中在说明书中所使用的，包括如在实例中所使用的，并且除非另有明确说明，所有数字可以被理解为以单词“约”或“大约”开头，即使该术语没有明确出现。当描述幅度和/或位置时可以使用短语“大约”或“大约”来指示所描述的值和/或位置在值和/或位置的合理预期范围内。例如，数值的值可以具有这样的值，该值是规定的值(或值的范围)的+/-0.1％、规定的值(或值的范围)的+/-1百分之、规定的值(或值的范围)的+/-2％、规定的值(或值的范围)的+/-5％、规定的值(或值的范围)的+/-10％等。本文给出的任何数值均应也可以理解为包括大约或大约该值，除非上下文另有说明。例如，如果公开值“10”，则还公开“约10”。本文中所叙述的任何数值范围旨在包含所有其中纳入的子范围。还应当理解，如本领域的技术人员适当理解的，当公开的值“小于或等于”所述值时，还公开了“大于或等于所述值”以及所述值之间的可能范围。例如，如果公开了值“X”，则还公开了“小于或等于X”以及“大于或等于X”(例如，其中X是数值)。还应当理解，在整个申请中，数据以多种不同的格式提供，并且该数据代表端点和起始点，以及数据点的任何组合的范围。例如，如果公开了特定的数据点“10”和特定的数据点“15”，则应当理解，大于、大于或等于、小于、小于或等于、和等于10和15以及在10和15之间被认为是公开的。还应当理解，还公开了两个特定单位之间的每个单位。例如，如果公开了10和15，那么还公开了11、12、13和14。

尽管上面描述了各种说明性实施例，但是在不脱离权利要求所描述的本发明的范围的情况下，可以对各种实施例进行多种改变中的任一种改变。例如，在替代实施例中，执行各种所描述的方法步骤的顺序常常可以改变，并且在其他替代实施例中，可以一起跳过一个或多个方法步骤。各种设备和系统实施例的可选特征可以包括在一些实施例中而不包括在其他实施例中。因此，前面的描述主要是出于示例性目的而提供的，并且不应被解释为限制权利要求中阐述的本发明的范围。

本文包括的示例和图示通过图示而非限制的方式示出了可以实践本主题的特定实施例。如上所述，可以利用其他实施例并从中派生出其他实施例，使得可以在不脱离本公开的范围的情况下进行结构和逻辑上的替换和改变。本发明主题的这些实施例在本文中可以单独或统称为术语“发明”，这仅是为了方便，如果实际上公开了一个以上的发明或发明概念，这并不旨在自愿将本申请的范围限制于任何单个发明或发明概念。因此，尽管本文已经示出和描述了特定实施例，但是意图实现相同目的任何实施例都可以替代示出的特定实施例。本公开旨在覆盖各种实施例的任何和所有修改或实施例。通过阅读以上描述，上述实施例的组合以及本文没有具体描述的其他实施例对于本领域技术人员来说将是显而易见的。

Claims

1.一种用于从肝细胞生成微有机球(MOS)的方法。

2.根据权利要求1所述的方法，其中细胞密度为80个至160个细胞/MOS液滴并且其中所述液滴的直径为200uM至300uM。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述细胞密度为100个细胞/MOS液滴。

4.一种通过权利要求1所述的方法获得的MOS。

5.从肝细胞生成的MOS。

6.一种使用根据权利要求4或5所述的MOS的药物筛选的方法。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述方法评定药物药效学概况的一个或多个方面。

8.根据权利要求6所述的方法，其中所述方法应用于高通量药物筛选。

9.根据权利要求6所述的方法，其中所述方法评定药物毒性。

10.根据权利要求6所述的方法，其中所述方法评定药物诱导的肝损伤(DILI)。

11.根据权利要求6所述的方法，其中所述方法评定药物的长期施用的效应。

12.根据权利要求4或5所述的MOS在药物筛选的方法中的用途。

13.根据前述权利要求中任一项所述的MOS或方法，其中所述肝细胞是原代人肝细胞(PHH)。

14.根据前述权利要求中任一项所述的MOS、方法或用途，其中所述肝细胞是成体肝细胞。

15.根据前述权利要求中任一项所述的MOS、方法或用途，其中所述肝细胞分离自供体。

16.根据权利要求15所述的MOS、方法或用途，其中所述供体是需要治疗的患者。

17.根据前述权利要求中任一项所述的MOS、方法或用途，其中所述MOS内的细胞在培养中保持活力超过3周。

18.根据前述权利要求中任一项所述的MOS、方法或用途，其中所述MOS内的细胞保持肝特异性功能。

19.根据前述权利要求中任一项所述的MOS、方法或用途，其中所述MOS模拟肝再生。