CN119662655A - Rna分子及其组合物在肿瘤免疫治疗中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了RNA分子及其组合物在制备治疗肿瘤的药物中的应用。这些组合物包括编码用于治疗癌症的蛋白质的mRNA分子，如IL‑12、OX40激动剂，并可选择性地与FADD、MLKL或MLKL‑4HB一起联合使用。这些mRNA可以包含5’非翻译区(UTR)和3’UTR以及能改善这些mRNA分子稳定性和/或治疗效果的5’帽结构。

Description

RNA分子及其组合物在肿瘤免疫治疗中的应用

背景

肿瘤免疫疗法是通过调控免疫系统以识别和杀伤肿瘤细胞的治疗方法，包括免疫检查点抑制和过继性细胞疗法等。例如增强肿瘤特异性效应T细胞的效应功能，或者是削弱肿瘤特异性调节T细胞的抑制功能。

经典的肿瘤免疫疗法包括使用靶向检查点蛋白或肿瘤相关抗原的抗体，或构建表达靶向受体的免疫细胞。然而，抗体的使用具有一定的局限性，而细胞疗法的生产成本极高。

目前出现了一项新兴技术，将编码功能蛋白的mRNA递送进体内实现治疗。然而，mRNA分子往往不稳定且免疫原性强，因此这项技术需要进一步优化和发展。

摘要

本发明提出某些结构元件可以帮助提高mRNA分子的稳定性和/或治疗活性。例如，与其他非翻译区域(untranslated region,UTR)组合相比，由组合H(包含SEQ ID NO:19的5’UTR和SEQ ID NO:20的3’UTR的组合)构成的mRNA的表达水平更高。此外，在不同的5’帽结构中，Cap1显示出最佳的抗肿瘤效果。这些结构原件可以包含在编码治疗性蛋白质的mRNA分子中，例如IL-12和OX40激动剂，且可选择性地与FADD或MLKL(或四螺旋束结构MLKL-4HB)一起使用。

本发明提供了一种信使RNA(mRNA)，包括一个5’非翻译区(UTR)、一个3’UTR域和一个编码序列，其中5’UTR包括SEQ ID NO:19的核酸序列，3’UTR包括SEQ ID NO:20的核酸序列。

在某些实施例中，mRNA的5'端包含Cap-1结构。在某些实施例中，Cap-1结构由试剂共转录合成。

在某些实施例中，mRNA由T7 RNA聚合酶转录。在某些实施例中，mRNA还包含一个多聚腺嘌呤(polyA)尾，优选通过酶合成法或共转录法制备。在某些实施例中，多聚腺嘌呤(polyA)尾包含至少50个腺嘌呤碱基，优选为至少80个腺嘌呤碱基，更优选至少100个腺嘌呤碱基。

在某些实施例中，mRNA序列单独编码IL-12或OX40激动剂，或同时编码IL-12和OX40激动剂。在某些实施例中，OX40激动剂是OX40配体(OX40L)，包含OX40L的细胞外结构域的多肽，或激动剂抗OX40抗体或其抗原结合片段。在某些实施例中，编码序列还编码FADD(FAS相关死亡域蛋白)、MLKL(混合谱系激酶结构域样假激酶)或四螺旋束结构MLKL-4HB。

在某些实施例中，IL-12的编码序列选自一个包括从SEQ ID NO:21-26的核酸序列的组。在某些实施例中，OX40L的编码序列选自一个包括从SEQ ID NO:27-33的核酸序列的组，优先从SEQ ID NO:27、28、30、32和33的组中选择。

本发明提供了一种药物组合物，包括mRNA和可电离脂质、磷脂质、结构脂质、聚乙烯醇(PEG)脂质或其组合。在某些实施例中，可电离脂质为SM102或ALC0315。

本发明提供了一种在制备治疗肿瘤的药物中的应用，包括向患者施用本公开的mRNA或药物组合物。

本发明提供了一种在制备治疗肿瘤的药物中的应用，包括向患者施用第一种编码OX40激动剂的mRNA、第二种编码IL-12的mRNA和第三种编码FADD或MLKL(或四螺旋束结构MLKL-4HB)的mRNA。

在某些实施例中，第三种mRNA与第一种mRNA或第二种mRNA在同一RNA分子上。在某些实施例中，OX40激动剂是OX40配体(OX40L)，包含OX40L的细胞外结构域的多肽，或抗OX40激动型抗体或其抗原结合片段。

在某些实施例中，第一种mRNA和第二种mRNA的施用质量比为4:1到0.5:1，优选为3:1到0.75:1，更优选为2:1到0.9:1。

在某些实施例中，施用方式为皮下注射、肌肉注射、腹腔注射、胸腔注射、静脉注射、动脉注射或其组合。

在某些实施例中，肿瘤选择自以下组别：鳞状细胞癌、肺癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、尿道癌、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌、子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、软组织肉瘤、神经母细胞瘤、阴茎癌、黑色素瘤、浅表扩散性黑色素瘤、雀斑黑色素瘤、肢端黑色素瘤、结节性黑色素瘤、多发性骨髓肿瘤、B细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、急性淋巴母细胞白血病、毛细胞白血病、慢性髓系白血病、急性髓系白血病、移植后淋巴增殖性疾病、脑肿瘤、脑癌和头颈癌，优选结肠癌、乳腺癌和肺癌。

本发明进一步提供了一种药物组合物，包括第一种编码OX40激动剂和/或IL-12的mRNA和第二种编码FADD或MLKL(或四螺旋束结构MLKL-4HB)的mRNA。在某些实施例中，第一种mRNA编码OX40激动剂，第二种mRNA编码FADD或MLKL(或MLKL-4HB)，其中该组合物可选择性地进一步包含编码IL-12的第三种mRNA。在某些实施例中，第一种mRNA编码IL-12，第二种mRNA编码FADD或MLKL(或MLKL-4HB)，其中该组合物可选择性地进一步包含编码OX40激动剂的第三种mRNA。

本发明提供了一种mRNA，在某些实施例中，选自一个包括从SEQ ID NO:21-26的核酸序列的组。本发明还提供了一种mRNA，选自一个包括从SEQ ID NO:27-33的核酸序列的组，优先从SEQ ID NO:27、28、30、32和33的组中选择。

图示简述

图1显示了在结肠癌动物模型中筛选具有抗肿瘤效应的单一或组合mRNA分子的结果。

图2显示OX40L与IL-12mRNA组合的治疗效果从注射部位扩展到远端肿瘤部位。

图3显示在肿瘤内注射测试药物或药物组合的mRNA后，动物瘤重情况。

图4显示在肿瘤内注射测试药物或药物组合的mRNA后，动物的体重变化。

图5显示了不同处理组在肿瘤植入后第8、11、14和17天注射侧肿瘤体积的变化。

图6显示了不同处理组在肿瘤植入后第8、11、14和17天远端肿瘤体积的变化。

图7显示在肿瘤内注射测试药物或药物组合的mRNA后，动物瘤重情况。

图8显示在肿瘤内注射测试药物或药物组合的mRNA后，动物的体重变化。

图9显示了不同处理组在肿瘤植入后第9、12、15和18天注射侧肿瘤体积的变化。

图10显示了不同处理组在肿瘤植入后第9、12、15和18天远端肿瘤体积的变化。

图11显示了用不同可电离脂质递送的OX40L和IL-12mRNA的抗肿瘤效果。

图12显示了用不同可电离脂质递送的荧光素酶mRNA表达的分布情况。

图13显示了使用不同RNA聚合酶和加帽方法生产的OX40L和IL-12mRNA的抗肿瘤效果。

图14显示了由T7或VSW-3RNA聚合酶转录的EGFP mRNA的翻译情况。

图15显示了具有不同帽子结构的OX40L和IL-12mRNA的抗肿瘤效果。

图16显示了具有不同UTR组合的EGFP mRNA的翻译。

图17显示了经过密码子优化的OX40L和IL-12mRNA的翻译情况。

图18显示了具有不同poly(A)长度的EGFP mRNA的翻译情况。

详细描述

定义及一般术语

需要说明的是，术语“一个”或“一种”实体指的是一个或多个该实体；例如，“一种mRNA”被理解为表示一个或多个mRNA。因此，术语“一个”(或“一种”)、“一个或多个”以及“至少一个”在此处可以互换使用。

OX40，也称为CD134和肿瘤坏死因子受体超家族成员4(TNFRSF4)，是TNFR超家族受体的一个成员。与在静息状态下的初始T细胞上持续表达的CD28不同，OX40是一个次级免疫检查点共刺激分子，在激活后24至72小时内表达。

OX40L，也称为CD252，是OX40的配体，并在许多抗原呈递细胞上稳定表达，如DC2(树突细胞的一个亚型)、巨噬细胞和活化的B淋巴细胞。OX40L也存在于许多非免疫细胞的表面，如内皮细胞和平滑肌细胞。OX40L的表面表达可以被许多促炎因子诱导，如TNF-α、IFN-γ和PGE2。

人类OX40L(剪切异构体1)的代表性核酸序列见NCBI参考号NM_003326，相关的蛋白序列为NP_003317。人类OX40L(剪切异构体2)的另一个代表性核酸序列见NCBI参考号NM_001297562，相关的蛋白序列为NP_001284491。剪切异构体1的N末端比剪切异构体2长，但其他方面是相同的。

白介素12(IL-12)是一种白介素，由树突细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和人类B淋巴母细胞(NC-37)在抗原刺激下产生。IL-12是一种由两个不同基因编码的异二聚体细胞因子，分别为IL12A(p35)和IL12B(p40)。

IL-12参与初始T细胞向Th1细胞的分化。它刺激T细胞和自然杀伤(NK)细胞产生γ干扰素(IFN-γ)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，并减弱IL-4对IFN-γ的抑制作用。IL-12在自然杀伤细胞和T淋巴细胞的活性中发挥重要作用。IL-12可以增强NK细胞和CD8+细胞毒性T淋巴细胞的细胞毒性的活性。

IL-12与IL-12受体结合，该受体是由IL-12Rβ1和IL-12Rβ2形成的异二聚体受体。结合后，IL-12Rβ2发生酪氨酸磷酸化，为激酶Tyk2和Jak2提供结合位点。

人源IL-12A(剪切异构体1)的代表性核酸序列见NCBI参考号NM_000882，相关的蛋白序列为NP_000873。人源IL-12A(剪切异构体2)的另一个代表性核酸序列见NCBI参考号NM_001354582，相关的蛋白序列为NP_001341511。人类IL-12A(剪切异构体3)的另一个代表性核酸序列见NCBI参考号NM_001354583，相关的蛋白序列为NP_001341512。人类IL-12A(剪切异构体4)的另一个代表性核酸序列见NCBI参考号NM_001397992，相关的蛋白序列为NP_001384921。

人源IL-12B的代表性核酸序列见NCBI参考号NM_002187，相关的蛋白序列为NP_002178。

FAS相关死亡域蛋白(FADD)，也称为MORT1，是一种接头蛋白，连接肿瘤坏死因子受体超家族的成员，如Fas受体，与半胱天冬酶8和10前体(Procaspases 8和Procaspases 10)形成死亡诱导信号复合体(DISC)，参与细胞凋亡。FADD还被观察到在增殖、细胞周期调节和发育等其他过程中的作用。

人类FADD的代表性核酸序列见NCBI参考号NM_003824，相关的蛋白序列为NP_003815。

混合谱系激酶结构域样假激酶(MLKL)通过与受体相互作用蛋白3(RIP3)的相互作用，在肿瘤坏死因子(TNF)诱导的坏死性凋亡过程中发挥作用，RIP3是坏死性凋亡途径中的关键信号分子。

人类MLKL的代表性核酸序列见NCBI参考号NM_152649，相关的蛋白序列为NP_689862。

改进的mRNA结构和配方

通过测试和比较研究，研究者发现某些结构元件可以提高mRNA分子的稳定性、翻译效率和/或整体抗肿瘤效力。例如，UTR组合H包含于mRNA分子中并位于编码序列两侧时，表现出最高的翻译水平(见图16)。如表1所示，UTR组合H包括SEQ ID NO:19的5'UTR和SEQID NO:20的3'UTR。

转录和加帽方法也对mRNA的稳定性和效力产生影响。如图15所示，Cap-1结构产生的抗肿瘤效果比Cap-0结构更持久。形成Cap-1结构的AG共转录系统与使用最佳IVT条件(参见Xia,H.等,(2022),《RNA Biol》19,1130-1142.10.1080/15476286.2022.2139113)的VSW-3RNA聚合酶不兼容。因此，T7 RNA聚合酶在AG共转录系统中是更优的选择。

另一个结构元件是多聚腺嘌呤尾(polyA)。如图18所示，较长的多聚腺嘌呤尾(例如，120A)相比于短的多聚腺嘌呤尾(例如，30A)具有更高的翻译效率。

针对本公开的mRNA分子测试了各种脂质纳米颗粒配方。测试的两种可电离阳离子脂质SM102和ALC0315均提供了高质量的配方。SM102递送的mRNA表现出更大暴露量，而ALC0315递送的mRNA表现出更高效的递送速度。

根据本公开的实施例，本发明提供了一种具有一个或多个类似结构元件的mRNA分子。在一个实施例中，本发明提供了一种具有5'非翻译区(UTR)、3'UTR和编码序列的信使RNA(mRNA)。在某些实施例中，5'UTR包括SEQ ID NO:19的核酸序列。在某些实施例中，3'UTR包括SEQ ID NO:20的核酸序列。在某些实施例中，5'UTR位于编码序列的5'侧。在某些实施例中，3'UTR位于编码序列的3'侧。

根据本公开的实施例，本发明提供了一种具有5'帽结构的信使RNA(mRNA)。在一个实施例中，5'帽为Cap-0。在另一个实施例中，5'帽为Cap-1。在另一个实施例中，5'帽为Cap-2。

Cap-0是一个N7-甲基鸟苷，通过5’到5’三磷酸连接到5’核苷酸，也被称为m7G帽或m7Gppp-。在起始核苷酸的2'O位点进行额外甲基化会生成Cap-1，或称为m7GpppNm-，其中Nm表示任何带有2'O甲基化的核苷酸。同样，Cap-2具有m7G-ppp-Nm-Nm结构，如下图公式I所示。

公式I

在某些实施例中，mRNA的Cap-1结构是通过共转录加帽试剂形成的，该试剂由TriLink Biotechnologies(位于加利福尼亚州圣地亚哥)提供。在某些实施例中，mRNA是使用T7 RNA聚合酶转录的，但不局限于此。

在某些实施例中，mRNA进一步包括多聚腺嘌呤尾。在某些实施例中，多聚腺嘌呤尾至少包含50个腺嘌呤碱基，或至少60、70、80、90、100、110或120个腺嘌呤碱基。

在一种实施例中，还提供了一种药物组合物，该组合物包括本公开的mRNA和一种可电离阳离子脂质、磷脂、结构脂质、聚乙烯醇(PEG)脂质或其组合。在某些实施例中，可离子化脂质为SM102(9-十七烷基8-{(2-羟基乙基)[6-氧代-6-(十一烷氧)己基]氨基}辛酸酯；CAS号：2089251-47-6)或ALC0315([(4-羟基丁基)亚氨基]二(己烯-6,1-二基)双(2-六基癸酸酯)；CAS号：2036272-55-4)。在某些实施例中，该组合物以脂质纳米颗粒的形式呈现。

“脂质纳米颗粒”一词指的是至少有一个维度在纳米级(例如，1-1000纳米)范围内的颗粒，其中包含一种或多种公式I的化合物，或其药学上可接受的盐、立体异构体或立体异构体的混合物(例如，SM102、ALC0315或其药学上可接受的盐、立体异构体或立体异构体的混合物)。纳米颗粒组合物包括，例如，脂质纳米颗粒(LNPs)、脂质体、脂质囊泡和脂质复合物。在某些实施例中，纳米颗粒组合物是包含一种或多种脂质双层的囊泡。在某些实施例中，纳米颗粒组合物包括两个或多个同心双层，中间用水相隔开。脂质双层可以是功能化的和/或彼此交联的。脂质双层可能包括一种或多种配体、蛋白质或通道。

在此使用的“磷脂”是指包含磷酸基团和一种或多种碳链(如不饱和脂肪酸链)的脂质。磷脂可以包含一个或多个多重(例如双键或三键)键。磷脂的非限制性例子包括1,2-二亚油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DLPC)、1,2-二月桂酰-sn-甘油磷酸胆碱(DMPC)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二十烷酰-sn-甘油磷酸胆碱(DUPC)、1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、1,2-二-O-十八烯基-OT-甘油-3-磷酸胆碱(18:0DietherPC)、1-油酰-2-胆固醇半琥珀酸酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(OChemsPC)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(C16 Lyso PC)、1,2-二亚麻油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二花生四烯酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二二十二碳六烯酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二菲烯酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(ME 16.0PE)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚麻油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二花生四烯酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二二十二碳六烯酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸-rac-(l-甘油)钠盐(DOPG)、鞘磷脂及其组合。在某些实施例中，磷脂为DOPE。在某些实施例中，磷脂为DSPC。

在某些实施例中，组合物包括结构脂质。结构脂质的非限制性例子包括胆固醇、粪甾醇、植物甾醇、麦角甾醇、坚果甾醇、甾醇、白菜甾醇、番茄甾醇、乌索酸、α-生育酚及其组合。在一种实施例中，结构脂质为胆固醇。

在某些实施例中，组合物包括PEG脂质。PEG脂质的非限制性例子包括PEG修饰的磷脂酰乙醇胺、PEG修饰的磷脂酸、PEG修饰的神经酰胺、PEG修饰的二烷基胺、PEG修饰的二酰甘油、PEG修饰的二烷基甘油及其组合。

抗肿瘤蛋白及蛋白组合物

肿瘤免疫疗法通过使用小分子、抗体或工程免疫细胞，靶向肿瘤免疫循环中参与的多个因子，显示出巨大的前景。一种典型策略是激活促进免疫的刺激因子，或抑制降低免疫活性和/或防止自身免疫的因子。一些突出的例子包括抗CTLA4抗体和抗PD-1或抗PD-L1抗体。

通过编码mRNA递送癌症治疗药物是一项新兴技术，已经显示出一些潜力。然而，仍然存在一些意想不到的障碍。例如，当通过肿瘤内注射递送编码可溶性PD1片段(sPD1，已知的PD-1/PD-L1抑制剂)的mRNA时，肿瘤生长完全没有被抑制(示例1，图1)。

此外，瘤内注射编码OX40L的mRNA时，仅表现出轻微的肿瘤生长抑制作用。相反，瘤内注射编码IL-12的mRNA显著抑制肿瘤生长，抑制率约为50％(图1)。当这两种mRNA同时递送到同一动物时，抑制率约达到90％。这种显著增强的治疗效果清楚地表明了这些分子之间的协同作用。

结果表明，添加其他看似具有治疗性的mRNA分子并没有进一步提高疗效。例如，尽管单一小分子药物R848(Toll样受体7/8的配体)作为天然免疫的激活剂具有一定的抗肿瘤效果，但实际上在联合使用时却降低了其他药物的抗肿瘤效果(图1)。

实验中结果进一步说明了这些组合方法的治疗效果。如图2所示，瘤内注射不仅抑制了治疗侧的肿瘤生长，还抑制了远端未治疗测的肿瘤生长。

实验结果表明，当在组合中使用OX40L蛋白的可溶性同源物时，治疗效果出现进一步改善(示例3，图3-6)，尤其是在距离动物注射侧较远的另一侧(图3和6)。该可溶性同源物是OX40L蛋白的细胞外片段与IgG Fc片段的融合蛋白(Fc-OX40L)。

另外，当进一步将FADD或MLKL(或MLKL-4HB)添加到组合中时，抗肿瘤效果出现进一步改善。并且，FADD或MLKL(或MLKL-4HB)的改善效果超出了在癌症疗法中常用的两种免疫调节剂GSDMD和TNFR。

根据本公开的一种实施例，提供了一种在制备治疗肿瘤的药物中的应用，该应用涉及使用编码OX40激动剂的mRNA(例如，OX40L或激活OX40的蛋白/多肽/抗体或其组合，例如OX40L蛋白或抗OX40激动剂抗体)，以及编码IL-12的mRNA或能激活IL-12受体(例如IL-12或IL-23mRNA/蛋白/多肽/抗体)的类似IL-12的蛋白/多肽/抗体或其组合。在某些实施例中，mRNA分子直接注射到受试者体内。在某些实施例中，一个或多个或所有mRNA分子以DNA的形式递送到体内，然后在体内转录为mRNA。

在某些实施例中，OX40L是人源蛋白。在某些实施例中，OX40L是完整的OX40L蛋白，而不是其片段或域，如可溶部分。在某些实施例中，OX40L是不同剪切体的完整OX40L蛋白，而不是其片段或结构域，如可溶部分。

在某些实施例中，OX40激动剂是一段至少包含完整OX40L的细胞外结构域的多肽，该多肽可以与跨膜域融合，并可选择性地与另一种蛋白的细胞内片段融合。

在某些实施例中，OX40激动剂是包含细胞外结构域的多肽，该多肽单独存在或与可促进其同源二聚体、同源三聚体或同源寡聚体形成的连接片段(例如，寡聚化结构域)融合。如免疫球蛋白的Fc片段等蛋白结构域通常用于促进同源二聚体的形成。

在某些实施例中，寡聚化结构域能够形成同源三聚体(即“三聚化结构域”)。三聚化结构域在技术领域内是已知的，如三聚体蛋白中负责介导三聚体蛋白聚合的结构域。

示例性的三聚化结构域包括T4噬菌体纤维蛋白三聚化基序(T4F)、GCN4三聚体亮氨酸拉链基序(GCN4)，以及来源于人类XVIII型胶原蛋白的同源三聚体化结构域(TIE)。在某些实施例中，三聚化结构域的长度超过100个氨基酸，或不超过90、80、70、60或50个氨基酸。

在某些实施例中，融合蛋白还包括位于OX40L细胞外结构域与三聚体化结构域之间的肽连接链。在某些实施例中，肽连接链是柔性的。

在某些实施例中，OX40L细胞外结构域与三聚化结构域之间的距离不超过100个氨基酸，或不超过90、80、70、60、50、40、30、25、20、15或10个氨基酸。在某些实施例中，肽连接链的长度为5到50个氨基酸残基，优选为5到20个氨基酸残基。

在某些实施例中，OX40激动剂是抗OX40激动型抗体或其抗原结合片段。

在某些实施例中，OX40激动剂mRNA包括与NM_003326的编码序列对应的RNA序列(SEQ ID NO:3)。在某些实施例中，OX40L mRNA包括与

NM_001297562的编码序列对应的RNA序列(SEQ ID NO:4)。在某些实施例中，OX40激动剂mRNA编码NP_003317的蛋白序列(SEQ ID NO:1)。在某些实施例中，OX40L mRNA编码NP_001284491的蛋白序列(SEQ ID NO:2)。

在某些实施例中，OX40激动剂mRNA编码的蛋白序列与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:1的第52-183残基具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列相似性。在某些实施例中，OX40激动剂mRNA编码的蛋白序列与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:2的第2-133残基具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列相似性。在某些实施例中，蛋白序列保留人源OX40L的活性或激活OX40的能力。

在某些实施例中，OX40激动剂mRNA编码NP_003317的细胞外结构域(即SEQ ID NO:1的第52-183残基，或与SEQ ID NO:1的第52-183残基具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％序列相似性的多肽)。在某些实施例中，OX40激动剂mRNA编码NP_001284491的细胞外结构域(即SEQ ID NO:2的第2-133残基，或与SEQ ID NO:2的第2-133残基具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％序列相似性的多肽)。

在某些实施例中，OX40L的细胞外结构域可以与跨膜域和可选的其他蛋白的细胞内片段融合，从而使融合蛋白能够锚定在质膜上。跨膜域和细胞内片段可以来自任何蛋白，例如人源蛋白，特别是那些在希望能表达OX40L的组织上的细胞膜蛋白。

跨膜结构域可以来自任何膜结合或跨膜蛋白，例如T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD3δ、CD3γ、CD45、CD4、CD5、CD7、CD8、CD8α、CD8β、CD9、CD11a、CD11b、CD11c、CD11d、CD16、CD22、CD27、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、TNFSFR25、CD154、4-1BB/CD137、活化的NK细胞受体、免疫球蛋白、B7-H3、BAFFR、BLAME(SLAMF8)、BTLA、CD100(SEMA4D)、CD103、CD160(BY55)、CD18、CD19、CD19a、CD2、CD247、CD276(B7-H3)、CD29、CD30、CD40、CD49a、CD49D、CD49f、CD69、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、细胞因子受体、DAP-10、DNAM1(CD226)、Fcγ受体、GADS、GITR、HVEM(LIGHTR)、IA4、ICAM-1、Igα(CD79a)、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、诱导性T细胞共刺激因子(ICOS)、整合素、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB2、ITGB7、ITGB1、KIRDS2、LAT、LFA-1、与CD83结合的配体、LIGHT、LTBR、Ly9

(CD229)、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1；CD1-1a/CD18)、MHCI类分子、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80(KLRF1)、OX-40、PAG/Cbp、程序性死亡-1(PD-1)、PSGL1、SELPLG(CD162)、淋巴细胞活化信号分子(SLAM家族蛋白)、SLAM(SLAMF1；CD150；IPO-3)、SLAMF4(CD244；2B4)、SLAMF6(NTB-A；Ly108)、SLAMF7、SLP-76、TNF受体蛋白、TNFR2、TNFSF14、Toll样受体、TRANCE/RANKL、VLA1或VLA-6，或这些蛋白的片段、截短或组合。

在某些实施例中，IL-12为人源IL-12。在某些实施例中，IL-12包括IL-12A(p35)。在某些实施例中，IL-12包括IL-12B(p40)。在某些实施例中，IL-12mRNA包括编码IL-12A的mRNA和编码IL-12B的mRNA。在某些实施例中，IL-12mRNA包括同时编码IL-12A和IL-12B的mRNA。

在某些实施例中，IL-12AmRNA包括与NM_000882的编码序列相对应的mRNA序列(SEQ ID NO:9)。在某些实施例中，IL-12AmRNA编码

NP_000873的蛋白序列(SEQ ID NO:5)，或成熟蛋白(SEQ ID NO:5的第57-253位残基)。

在某些实施例中，IL-12A mRNA包括与NM_001354582的编码序列相对应的mRNA序列(SEQ ID NO:10)。在某些实施例中，IL-12AmRNA编码

NP_001341511的蛋白序列(SEQ ID NO:6)，或成熟蛋白(SEQ ID NO:6的第57-239位残基)。

在某些实施例中，IL-12A mRNA包括与NM_001354583的编码序列相对应的mRNA序列(SEQ ID NO:11)。在某些实施例中，IL-12A mRNA编码

NP_001341512的蛋白序列(SEQ ID NO:7)，或成熟蛋白(SEQ ID NO:7的第57-215位残基)。

在某些实施例中，IL-12A mRNA包括与NM_001397992的编码序列相对应的mRNA序列(SEQ ID NO:12)。在某些实施例中，IL-12AmRNA编码

NP_001384921的蛋白序列(SEQ ID NO:8)，或成熟蛋白(SEQ ID NO:8的第23-219位残基)。

在某些实施例中，IL-12B mRNA包括与NM_002187的编码序列相对应的mRNA序列(SEQ ID NO:14)。在某些实施例中，IL-12A mRNA编码

NP_002178的蛋白序列(SEQ ID NO:13)，或成熟蛋白(SEQ ID NO:13的第23-328位残基)。

表A.序列

在某些实施例中，OX40L mRNA(或编码激活OX40的蛋白/多肽/抗体或其组合的mRNA)和IL-12mRNA是独立的mRNA分子。在某些实施例中，OX40L(或编码激活OX40的蛋白/多肽/抗体或其组合的mRNA)编码序列和IL-12编码序列包含在同一mRNA分子中，该mRNA可翻译为融合蛋白/多肽或独立的蛋白/多肽。

在某些实施例中，其中一种mRNA编码OX40L，例如人源OX40L。在某些实施例中，编码的蛋白包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在某些实施例中，编码的蛋白与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％相似性。在某些实施例中，编码蛋白的片段与SEQ ID NO:1中某片段的氨基酸序列具有至少90％、95％、98％或99％相似性。在某些实施例中，编码的蛋白包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在某些实施例中，编码的蛋白与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％相似性。在某些实施例中，编码蛋白的片段与SEQ ID NO:2中某片段的氨基酸序列具有至少90％、95％、98％或99％相似性。(可能有人会构建一个包含OX40L细胞外结构域及其他蛋白的细胞内结构域和跨膜结构域的融合蛋白)。

在某些实施例中，mRNA包括SEQ ID NO:3的核酸序列。在某些实施例中，mRNA包含与SEQ ID NO:3具有至少70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％序列相似性的核酸序列。在某些实施例中，mRNA包含SEQ ID NO:4的核酸序列。在某些实施例中，mRNA包含与SEQ IDNO:4具有至少70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％序列相似性的核酸序列。

在某些实施例中，其中一种mRNA编码IL-12A，例如人源IL-12A。在某些实施例中，编码的蛋白包括SEQ ID NO:5的氨基酸序列。在某些实施例中，编码的蛋白与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％相似性。在某些实施例中，编码的蛋白包括SEQ ID NO:6的氨基酸序列。在某些实施例中，编码的蛋白与SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％相似性。在某些实施例中，编码的蛋白包括SEQ ID NO:7的氨基酸序列。在某些实施例中，编码的蛋白与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％相似性。在某些实施例中，编码的蛋白包括SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在某些实施例中，编码的蛋白与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％相似性。

在某些实施例中，mRNA包含SEQ ID NO:9的核酸序列。在某些实施例中，mRNA包含与SEQ ID NO:9具有至少70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％序列相似性的核酸序列。在某些实施例中，mRNA包含SEQ ID NO:10的核酸序列。在某些实施例中，mRNA包含与SEQ IDNO:10具有至少70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％序列相似性的核酸序列。在某些实施例中，mRNA包含SEQ ID NO:11的核酸序列。在某些实施例中，mRNA包含与SEQ ID NO:11具有至少70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％序列相似性的核酸序列。在某些实施例中，mRNA包含SEQ ID NO:12的核酸序列。在某些实施例中，mRNA包含与SEQ ID NO:12具有至少70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％序列相似性的核酸序列。

在某些实施例中，其中一种mRNA编码IL-12B，例如人源IL-12B。在某些实施例中，编码的蛋白包括SEQ ID NO:13的氨基酸序列。在某些实施例中，编码的蛋白与SEQ ID NO:13的氨基酸序列具有至少70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％相似性。

在某些实施例中，mRNA包含SEQ ID NO:14的核酸序列。在某些实施例中，mRNA包含与SEQ ID NO:14具有至少70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％序列相似性的核酸序列。

在某些实施例中，一种或多种mRNA共同编码OX40L(或激活OX40的蛋白/多肽/抗体或其组合)和IL-12A。在某些实施例中，一种或多种mRNA共同编码OX40L(或激活OX40的蛋白/多肽/抗体或其组合)和IL-12B。在某些实施例中，一种或多种mRNA共同编码OX40L(或激活OX40的蛋白/多肽/抗体或其组合)、IL-12A和IL-12B。

当编码IL-12和OX40L(或其可溶性对应物)的mRNA分子以单独分子存在时，可以根据需要调整它们的比例。在某一实施例中，IL-12mRNA与OX40L mRNA之间的质量比的范围为1:0.5至1:6，不受限制。在某一实施例中，该质量比为1:0.5至1:5。在某一实施例中，该质量比为1:0.5至1:4。在某一实施例中，该质量比为1:0.75至1:6。在某一实施例中，该质量比为1:0.75至1:5。在某一实施例中，该质量比为1:0.75至1:4。在某一实施例中，该质量比为1:0.8至1:5。在某一实施例中，该质量比为1:0.8至1:4。在某一实施例中，该质量比为1:0.8至1:3。

在某一实施例中，IL-12mRNA与OX40L mRNA之间的质量比为1:0.9至1:5。在一个实施例中，该质量比为1:0.9至1:4。在一个实施例中，该质量比为1:0.9至1:3.5。在一个实施例中，该质量比为1:0.9至1:3。在一个实施例中，该质量比为1:0.9至1:2.5。

在某一实施例中，IL-12mRNA与OX40L mRNA之间的质量比为1:0.9至1:2。在一个实施例中，该质量比为1:1至1:4。在一个实施例中，该质量比为1:1至1:3。在一个实施例中，该质量比为1:1至1:2.5。在一个实施例中，该质量比为1:1至1:2。

在一些实施例中，OX40L是全长OX40L蛋白。在一些实施例中，

OX40L是Fc-OX40L(可溶性片段)。

本发明还提供了IL-12和OX40L的密码子优化后的编码序列，并对其进行了测试。在一些实施例中，IL-12的mRNA序列选自SEQ ID NO:21-26组。在一些实施例中，mRNA序列选自SEQ ID NO:27-33组。在一些实施例中，mRNA序列选自SEQ ID NO:27、28、30、32和33组。

如实施例所示，添加其他潜在治疗剂可能不会增加本组合mRNA的治疗效果。因此，在某一实施例中，治疗方法、用途或组合物不包括其他类型的mRNA。

在某一实施例中，不包括编码免疫检查点抑制剂的mRNA，例如PD-L1、PD-1和CTLA-4。在某一实施例中，不包括编码干扰素的mRNA，例如IFN-α、IFN-β或IFN-γ。在某一实施例中，不包括编码IL-12家族其他成员的mRNA，例如IL-23、IL-27和IL-35。在某一实施例中，不包括编码其他细胞因子的mRNA，例如IL-18。

在某些情况下，这些分子中的一个或多个仍可能被包含进来。在一些实施例中，包含这些分子中的一个或多个，或其他分子中的一个或多个。例如，在某一实施例中，该方法、用途或组合物进一步包括编码免疫调节因子的部分或全长的mRNA，例如FADD、MLKL、CD27、CD28、CD40、CD122、CD137、GITR、GSDMD、A2AR、CD276、VTCN1、BTLA、CTLA-4、IDO、LAG3、KIR、NOX2、PD-1、TIM-3、VISTA、SIGLEC7、SIGLEC9、IL-2、IL-15、IL-6、IL-18、IL-23、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、GM-CSF、M-CSF、RIG-I、MDA5、cGAS、Toll样受体、MAVS/VISA、STING/MITA、TRIF、TBK1、IRF3、IRF7、IRF1、JAK1、JAK2、Tyk2、STAT1、STAT2、STAT3、TNFR及其任意组合。

在特定实施例中，使用的试剂是FADD或编码FADD的mRNA。在特定实施例中，使用的试剂是MLKL(或MLKL-4HB)或编码MLKL(或MLKL-4HB)的mRNA。例如，在某一实施例中，该方法、用途或组合物进一步包括小分子试剂、重组蛋白、抗体。

在一些实施例中，FADD包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:15具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的序列相似性。在一些实施例中，编码FADD的mRNA包括SEQ ID NO:16，或与SEQ ID NO:16具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的序列相似性。

在一些实施例中，MLKL包括SEQ ID NO:17的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:17(或SEQ ID NO:17的1-125残基)具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的序列相似性。在一些实施例中，编码MLKL的mRNA包括SEQ ID NO:18，或与SEQ ID NO:18具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的序列相似性。

在一些实施例中，使用的试剂同时包括FADD和MLKL，二者可以编码在同一mRNA中或分别编码在不同的mRNA分子中。

mRNA可以采用多种已知方法合成。例如，可以通过体外转录(IVT)合成mRNA。简而言之，IVT通常使用包含启动子的线性或环状DNA模板、一组核糖核苷三磷酸、含有DTT和镁离子的缓冲系统以及适当的RNA聚合酶(例如，T3、T7、SP6或其他RNA聚合酶)、DNA酶I、焦磷酸酶和/或RNA酶抑制剂进行。具体条件会根据特定应用而有所不同。

在一些实施例中，为了制备mRNA，会在体外转录DNA模板。DNA模板通常具有启动子，例如用于体外转录的T3、T7、SP6或其他RNA聚合酶启动子，后面接着所需的核苷酸序列和终止信号。

所需的mRNA序列可以通过常规方法确定并整合至DNA模板中。例如，从所需的氨基酸序列出发，基于简并遗传密码进行虚拟反向翻译。通过优化算法选择合适的密码子。通常情况下，可以优化G/C含量，一方面尽量提高G/C含量，另一方面，结合密码子使用情况，尽可能考虑tRNA的频率。可以借助合适的显示设备建立和展示优化后的RNA序列，并与原始(野生型)序列进行比较。同时可以对二级结构进行分析，以确定RNA的稳定性和不稳定性的属性或其相应的区域。

mRNA包括线性RNA、环状RNA以及任何其他形式的RNA。mRNA可以合成未修饰或修饰的形式。在一些实施例中，mRNA经过修饰以增强稳定性。在一些实施例中，mRNA经过修饰以降低免疫原性。在一些实施例中，mRNA经过修饰以提高翻译效率。

在某些实施例中，鉴于现有技术的特殊应用，使用的mRNA未经过用于降低免疫原性的修饰，这对治疗效果有利。在一些实施例中，每个mRNA不包含减少免疫原性的化学修饰。在一些实施例中，每个mRNA不包括对骨架的化学修饰。在一些实施例中，每个mRNA仅包括天然核苷。

mRNA的修饰包括RNA核苷酸的修饰。因此，修饰后的mRNA可以包括例如骨架修饰、糖基化修饰或碱基修饰。在一些实施例中，mRNA可以由天然存在的核苷酸和/或核苷酸类似物(修饰核苷酸)合成，包括但不限于嘌呤(腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G))或嘧啶(胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U))，以及嘌呤和嘧啶的修饰核苷酸类似物或衍生物，例如1-甲基腺嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基硫-N-6-异戊烯基腺嘌呤、N6-甲基腺嘌呤、N6-异戊烯基腺嘌呤、2-硫胞嘧啶、3-甲基胞嘧啶、4-乙酰胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、2,6-二氨基嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、2,2-二甲基鸟嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、次黄嘌呤、1-甲基次黄嘌呤、伪尿嘧啶(5-尿嘧啶)、二氢尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基-2-硫尿嘧啶、5-(羧基羟甲基)-尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基尿嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、N-尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、5-甲基氨甲基尿嘧啶、5-甲氧氨甲基-2-硫尿嘧啶、5'-甲氧羰基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧基乙酸(v)、1-甲基伪尿嘧啶、奎苷、13-D-甘露糖基奎苷、wybutoxosine、磷酰胺酸、磷硫酰胺酸、肽核苷酸、甲基膦酸、7-去氮鸟苷、5-甲基胞嘧啶和次黄嘌呤。在一些实施例中，mRNA中至少有一个尿苷核苷经过化学修饰。在一些实施例中，化学修饰的尿苷核苷是N1-甲基伪尿苷。

在一些实施例中，mRNA可能包含RNA骨架修饰。通常，骨架修饰是指RNA中核苷酸的骨架磷酸经过化学修饰的情况。典型的骨架修饰包括但不限于以下组中的修饰，如甲基磷酸酯、甲基磷酰胺、磷酰胺、磷硫酸酯(例如，胞苷5'-O-(1-硫酸酯))、硼酸磷酸酯、正电荷的胍基等，这意味着通过用其他阴离子、阳离子或中性基团替代磷酸二酯链接。

在一些实施例中，mRNA可能包含糖基化修饰。典型的糖基化修饰是对其包含的核苷酸糖的化学修饰，包括但不限于选择自以下组的糖基化修饰，如2'-去氧-2'-氟-寡核糖核苷酸(2'-氟-2'-去氧胞苷5'-三磷酸、2'-氟-2'-去氧尿苷5'-三磷酸)、2'-去氧-2'-氨基-寡核糖核苷酸(2'-氨基-2'-去氧胞苷5'-三磷酸、2'-氨基-2'-去氧尿苷5'-三磷酸)、2'-O-烷基-寡核糖核苷酸、2'-去氧-2'-C-烷基-寡核糖核苷酸(2'-O-甲基胞苷5'-三磷酸、2'-甲基尿苷5'-三磷酸)、2'-C-烷基-寡核糖核苷酸及其异构体(2'-阿拉胞苷5'-三磷酸、2'-阿拉尿苷5'-三磷酸)，或叠氮三磷酸盐(2'-叠氮-2'-去氧胞苷5'-三磷酸、2'-叠氮-2'-去氧尿苷5'-三磷酸)。

在一些实施例中，mRNA可能包含核苷酸碱基的修饰(碱基修饰)。含有碱基修饰的修饰核苷酸也称为碱基修饰核苷酸。这类碱基修饰核苷酸的示例包括但不限于：2-氨基-6-氯嘌呤核苷5'-三磷酸、2-氨基腺苷5'-三磷酸、2-硫胞苷5'-三磷酸、2-硫尿苷5'-三磷酸、4-硫尿苷5'-三磷酸、5-氨基烯丙基胞苷5'-三磷酸、5-氨基烯丙基尿苷5'-三磷酸、5-溴胞苷5'-三磷酸、5-溴尿苷5'-三磷酸、5-碘胞苷5'-三磷酸、5-碘尿苷5'-三磷酸、5-甲基胞苷5'-三磷酸、5-甲基尿苷5'-三磷酸、6-氮杂胞苷5'-三磷酸、6-氮杂尿苷5'-三磷酸、6-氯嘌呤核苷5'-三磷酸、7-去氮腺苷5'-三磷酸、7-去氮鸟苷5'-三磷酸、8-氮杂腺苷5'-三磷酸、8-叠氮腺苷5'-三磷酸、苯并咪唑核苷5'-三磷酸、N1-甲基腺苷5'-三磷酸、N1-甲基鸟苷5'-三磷酸、N6-甲基腺苷5'-三磷酸、O6-甲基鸟苷5'-三磷酸、假尿苷5'-三磷酸、嘌呤霉素5'-三磷酸或黄嘌呤5'-三磷酸。

根据不同的实施例，递送的mRNA的表达时间可以根据特定的医疗需求进行调整。在一些实施例中，在提供的脂质体或组合物单次给药1、2、3、6、12、18、24、30、36、42、48、54、60、66和/或72小时后，在血清或靶组织中可检测到所递送的mRNA编码的OX40L蛋白的表达。在一些实施例中，在提供的脂质体或组合物单次给药1天、2天、3天、4天、5天、6天和/或7天后，在血清或靶组织中可检测到所递送的mRNA编码的OX40L蛋白的表达。在一些实施例中，在提供的脂质体或组合物单次给药1周、2周、3周和/或4周后，在血清或靶组织中可检测到所递送的mRNA编码的蛋白的表达。在一些实施例中，在提供的脂质体或组合物单次给药一个月或更长时间后，在血清或靶组织中可检测到所递送的mRNA编码的蛋白的表达。

在一些实施例中，在提供的脂质体或组合物单次给药1、2、3、6、12、18、24、30、36、42、48、54、60、66和/或72小时后，在血清或靶组织中可检测到所递送的mRNA编码的IL-12A蛋白的表达。在一些实施例中，在提供的脂质体或组合物单次给药1天、2天、3天、4天、5天、6天和/或7天后，在血清或靶组织中可检测到所递送的mRNA编码的IL-12A蛋白的表达。在一些实施例中，在提供的脂质体或组合物单次给药1周、2周、3周和/或4周后，在血清或靶组织中可检测到所递送的mRNA编码的IL-12A蛋白的表达。在一些实施例中，在提供的脂质体或组合物单次给药一个月或更长时间后，可检测到所递送的mRNA编码的蛋白的表达。在一些实施例中，在提供的脂质体或组合物单次给药1、2、3、6、12、18、24、30、36、42、48、54、60、66和/或72小时后，在血清或靶组织中可检测到所递送的mRNA编码的IL-12B蛋白的表达。在一些实施例中，在提供的脂质体或组合物单次给药1天、2天、3天、4天、5天、6天和/或7天后，在血清或靶组织中可检测到所递送的mRNA编码的IL-12B蛋白的表达。在一些实施例中，在提供的脂质体或组合物单次给药1周、2周、3周和/或4周后，在血清或靶组织中可检测到所递送的mRNA编码的IL-12B蛋白的表达。在一些实施例中，在提供的脂质体或组合物单次给药后，一个月或更长时间后可检测到所递送的mRNA编码的蛋白的表达。

针对任何特定患者的具体剂量和治疗方案将取决于多种因素，包括所使用的特定mRNA及其变体或衍生物、患者的年龄、体重、整体健康状况、性别和饮食、给药时间、排泄速率、药物组合以及所治疗疾病的严重程度。医疗护理人员对这些因素的判断属于本领域的常规技能。剂量还将取决于待治疗的个体患者、给药途径、制剂类型、所使用的mRNA的特性、疾病的严重程度以及所期望的效果。该剂量可以根据已知的药理学和药代动力学原则进行确定。

mRNA的给药方法包括但不限于皮内、肌肉内、腹腔内、静脉内、皮下、鼻内和硬膜外给药。此处所用的“非肠道”一词指的是包括静脉注射、肌肉注射、腹腔注射、胸骨内注射、皮下注射和关节内注射及输注的给药方式。在某些实施例中，给药方式为肿瘤内注射。在某些实施例中，给药方式为皮下注射。在某些实施例中，给药方式为肌肉内或静脉内注射。在某些实施例中，给药方式为皮下注射、肌肉注射、腹腔注射、胸部注射、静脉注射、动脉注射或其组合。

在某些实施例中，药物注射进入肿瘤组织。在某些实施例中，药物注射进入肿瘤组织的一侧，例如肿瘤组织的一个端部或一部分。在某些实施例中，药物注射不进入肿瘤组织。

在某些实施例中，给药的频率为每周3次、每周2次、每周1次、每两周1次、每3周1次、每4周1次、每月1次或每3-6个月1次。

本发明提供了一种在制备治疗肿瘤的药物中的应用，所述治疗的肿瘤包括实体肿瘤、白血病和淋巴瘤。在某些实施例中，癌症为鳞状细胞癌、肺癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、尿道癌、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌、子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、软组织肉瘤、神经母细胞瘤、阴茎癌、黑色素瘤、表浅扩散型黑色素瘤、雀斑型黑色素瘤、肢端型黑色素瘤、结节型黑色素瘤、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、急性淋巴母细胞白血病、毛细胞白血病、慢性髓性白血病、移植后淋巴增生性疾病、脑肿瘤、脑癌和头颈癌。

在某一实施例中，癌症为实体肿瘤。在某一实施例中，癌症为转移性癌症。在某一实施例中，癌症为结肠癌。在某一实施例中，癌症为乳腺癌，包括三阴性乳腺癌。在某一实施例中，癌症为肺癌。

组成成分与组合物

本文还提供了可用于实施本发明方法的组合、包装、试剂盒和组成成分。

一种实施例提供了一种组合、包装、试剂盒或组成成分，包含编码OX40激动剂的mRNA(例如，OX40L或激活OX40的蛋白/多肽/抗体或其组合(例如，OX40L蛋白或抗OX40激动剂抗体))和编码IL-12的mRNA或类似于IL-12的可以用于刺激IL-12受体的蛋白/多肽/抗体(例如，IL-12或IL-23的mRNA/蛋白/多肽/抗体)或其组合。在某些实施例中，mRNA分子直接注射到受试者中。在某些实施例中，一个或多个或全部的mRNA分子作为DNA递送，随后在体内转录为mRNA。

另一种实施例提供了一种组合、包装、试剂盒或组成成分，包含编码OX40激动剂的mRNA(例如，OX40L或激活OX40的蛋白/多肽/抗体或其组合(例如，OX40L蛋白或抗OX40激动剂抗体))，以及IL-12或者类似于IL-12的可以用于刺激IL-12受体的蛋白/多肽/抗体(例如，IL-12或IL-23的mRNA/蛋白/多肽/抗体)或其组合。

另一种实施例提供了一种组合、包装、试剂盒或组成成分，包含OX40激动剂(例如，OX40L或激活OX40的蛋白/多肽/抗体或其组合(例如，OX40L蛋白或抗OX40激动剂抗体))，以及编码IL-12的mRNA或类似于IL-12的可以用于刺激IL-12受体的蛋白/多肽/抗体(例如，IL-12或IL-23的mRNA/蛋白/多肽/抗体)或其组合。

另一种实施例提供了一种组合、包装、试剂盒或组成成分，包含OX40激动剂(例如，OX40L或激活OX40的蛋白/多肽/抗体或其组合(例如，OX40L蛋白或抗OX40激动剂抗体))，以及IL-12或类似于IL-12的可以用于刺激IL-12受体的蛋白/多肽/抗体(例如，IL-12或IL-23的蛋白/多肽/抗体)或其组合。

在上述任何一种实施例中，组合、包装、试剂盒或组成成分进一步包括FADD蛋白、编码FADD的mRNA或编码FADD的DNA载体。在上述任何一种实施例中，组合、包装、试剂盒或组成成分进一步包括MLKL蛋白、编码MLKL的mRNA或编码MLKL的DNA构建体。

在上述任何一种实施例中，组合、包装、试剂盒或组成成分进一步包括TNFR蛋白、编码TNFR的mRNA或编码TNFR的DNA载体。在上述任何一种实施例中，组合、包装、试剂盒或组成成分进一步包括GSDMD蛋白、编码GSDMD的mRNA或编码GSDMD的DNA载体。

在某些实施例中，OX40L为人源蛋白。在某些实施例中，OX40L为全长的OX40L蛋白，而非其片段或域，例如可溶部分。在某些实施例中，OX40L是具有不同异构体的全长OX40L蛋白，而非其片段或域，例如可溶性部分。

在某些实施例中，OX40激动剂为一种多肽，该多肽至少包含OX40L的细胞外结构域，该结构域可能与另一种蛋白的跨膜结构域和胞内片段融合。

在某些实施例中，OX40激动剂为一种包含细胞外结构域的多肽，该细胞外结构域可能单独存在，或者与能够促进其形成同源二聚体、同源三聚体或同源寡聚体的连接片段(例如，聚合域)融合。像免疫球蛋白的Fc片段的蛋白结构域通常用于促进同源二聚体的形成。

示例性的三聚化结构域包括T4噬菌体纤维蛋白三聚化基序(T4F)、GCN4三聚性亮氨酸拉链基序(GCN4)以及源自人类胶原XVIII的同源三聚化结构域(TIE)。在一些实施方式中，三聚化结构域的长度不超过100个氨基酸，或不超过90、80、70、60或50个氨基酸。

在某些实施例中，融合蛋白进一步包括OX40L细胞外结构域与三聚化结构域之间的肽连接链。在某些实施例中，该肽连接链是柔性结构。

在某些实施例中，OX40L细胞外结构域与三聚化结构域之间的距离不超过100个氨基酸，或不超过90、80、70、60、50、40、30、25、20、15或10个氨基酸。在某些实施例中，肽链接链的长度为5至50个氨基酸残基，优选为5至20个氨基酸残基。

在某些实施例中，OX40激动剂为抗OX40激动剂抗体或其抗原结合片段。

在某些实施例中，OX40激动剂mRNA包含与NM_003326的编码序列对应的RNA序列(SEQ ID NO:3)。在某些实施例中，OX40L mRNA包含与

NM_001297562的编码序列对应的RNA序列(SEQ ID NO:4)。在某些实施例中，OX40激动剂mRNA编码的蛋白序列为NP_003317(SEQ ID NO:1)。在某些实施例中，OX40L mRNA编码的蛋白序列为NP_001284491(SEQ ID NO:2)。

在某些实施例中，OX40激动剂mRNA编码的蛋白序列与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:1的52-183残基具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列相似性。在某些实施例中，OX40激动剂mRNA编码的蛋白序列与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:2的2-133残基具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列相似性。在某些实施例中，蛋白序列具有人源OX40L的活性或激活OX40的能力。

在某些实施例中，OX40激动剂mRNA编码NP_003317的细胞外结构域(即，SEQ IDNO:1的52-183残基，或与SEQ ID NO:1的52-183残基具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％序列相似性的肽段)。在某些实施例中，OX40激动剂mRNA编码NP_001284491的细胞外结构域(即，SEQ ID NO:2的2-133残基，或与SEQ ID NO:2的2-133残基具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％序列相似性的肽段)。

在某些实施例中，OX40L的细胞外结构域可以与跨膜结构域融合，并可选地与另一蛋白的细胞内片段融合，从而使融合蛋白可以锚定在质膜上。跨膜结构域和细胞内片段可以来自任何蛋白质，例如某个人源蛋白，尤其是那些期望能表达OX40L的组织上的细胞膜蛋白。

在某些实施例中，IL-12为人源IL-12。在某些实施例中，IL-12包含IL-12A(p35)。在某些实施例中，IL-12包含IL-12B(p40)。在某些实施例中，IL-12mRNA包含编码IL-12A的mRNA和编码IL-12B的mRNA。在某些实施例中，IL-12mRNA包含同时编码IL-12A和IL-12B的mRNA。

在某些实施例中，IL-12A mRNA包含与NM_000882的编码序列对应的mRNA序列(SEQID NO:9)。在某些实施例中，IL-12A mRNA编码的蛋白序列为NP_000873(SEQ ID NO:5)，或编码一个成熟蛋白(SEQ ID NO:5的57-253残基)。

在某些实施例中，IL-12A mRNA包含与NM_001354582的编码序列对应的mRNA序列(SEQ ID NO:10)。在某些实施例中，IL-12A mRNA编码的蛋白序列为NP_001341511(SEQ IDNO:6)，或编码一个成熟蛋白(SEQ ID NO:6的57-239残基)。

在某些实施例中，IL-12A mRNA包含与NM_001354583的编码序列对应的mRNA序列(SEQ ID NO:11)。在某些实施例中，IL-12A mRNA编码的蛋白序列为NP_001341512(SEQ IDNO:7)，或编码一个成熟蛋白(SEQ ID NO:7的57-215残基)。

在某些实施例中，IL-12A mRNA包含与NM_001397992的编码序列对应的mRNA序列(SEQ ID NO:12)。在某些实施例中，IL-12A mRNA编码的蛋白序列为NP_001384921(SEQ IDNO:8)，或编码一个成熟蛋白(SEQ ID NO:8的23-219残基)。

在某些实施例中，IL-12B mRNA包含与NM_002187的编码序列对应的mRNA序列(SEQID NO:14)。在某些实施例中，IL-12A mRNA编码的蛋白序列为NP_002178(SEQ ID NO:13)，或编码一个成熟蛋白(SEQ ID NO:13的23-328残基)。

在某些实施例中，OX40L mRNA(或编码激活OX40的蛋白/多肽/抗体或其组合的mRNA)与IL-12mRNA为单独的mRNA分子。在某些实施例中，OX40L(或编码激活OX40的蛋白/多肽/抗体或其组合的mRNA)编码序列与IL-12编码序列包含在同一mRNA分子中，该分子可以翻译为融合蛋白/多肽或独立的蛋白/多肽。

在某些实施例中，其中一个mRNA编码OX40L，例如人源OX40L。在某些实施例中，编码的蛋白含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在某些实施例中，编码的蛋白与SEQ ID NO:1的氨基酸序列至少具有70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列相似性。在某些实施例中，编码蛋白的某一片段与SEQ ID NO:1中的某一片段的氨基酸序列至少具有90％、95％、98％或99％的的序列相似性。在某些实施例中，编码的蛋白含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在某些实施例中，编码的蛋白与SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少具有70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列相似性。在某些实施例中，编码蛋白的某一片段与SEQID NO:2中的某一片段的氨基酸序列至少具有90％、95％、98％或99％的序列相似性。(可能有人会制作包含OX40L细胞外结构域和来自其他蛋白的细胞内及跨膜域的融合蛋白)。

在某些实施例中，mRNA包括SEQ ID NO:3的核酸序列。在某些实施例中，mRNA包括与SEQ ID NO:3具有至少70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％序列相似性的核酸序列。在某些实施例中，mRNA包括SEQ ID NO:4的核酸序列。在某些实施例中，mRNA包括与SEQ IDNO:4具有至少70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％序列相似性的核酸序列。

在某些实施例中，其中一个mRNA编码IL-12A，例如人类IL-12A。在某些实施例中，编码的蛋白含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列。在某些实施例中，编码的蛋白与SEQ ID NO:5的氨基酸序列至少具有70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％序列相似性。在某些实施例中，编码的蛋白含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列。在某些实施例中，编码的蛋白与SEQ IDNO:6的氨基酸序列至少具有70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％序列相似性。在某些实施例中，编码的蛋白含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列。在某些实施例中，编码的蛋白具有与SEQ ID NO:7具有至少70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％序列相似性的氨基酸序列。在某些实施例中，编码的蛋白含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在某些实施例中，编码的蛋白具有与SEQ ID NO:8具有至少70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％序列相似性的氨基酸序列。

在某些实施例中，mRNA包括SEQ ID NO:9的核酸序列。在某些实施例中，mRNA包括与SEQ ID NO:9具有至少70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％序列相似性的核酸序列。在某些实施例中，mRNA包括SEQ ID NO:10的核酸序列。在某些实施例中，mRNA包括与SEQ IDNO:10具有至少70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％序列相似性的核酸序列。在某些实施例中，mRNA包括SEQ ID NO:11的核酸序列。在某些实施例中，mRNA包括与SEQ ID NO:11具有至少70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％序列相似性的核酸序列。在某些实施例中，mRNA包括SEQ ID NO:12的核酸序列。在某些实施例中，mRNA包括与SEQ ID NO:12具有至少70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％序列相似性的核酸序列。

在某些实施例中，其中一个mRNA编码IL-12B，例如人类IL-12B。在某些实施例中，编码的蛋白含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列。在某些实施例中，编码的蛋白与SEQ ID NO:13的氨基酸序列至少具有70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％序列相似性。

在某些实施例中，mRNA包括SEQ ID NO:14的核酸序列。在某些实施例中，mRNA包括与SEQ ID NO:14具有至少70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％序列相似性的核酸序列。

在某些实施例中，一个或多个mRNA共同编码OX40L(或激活OX40的蛋白/多肽/抗体或其组合)和IL-12A。在某些实施例中，一个或多个mRNA共同编码OX40L(或激活OX40的蛋白/多肽/抗体或其组合)和IL-12B。在某些实施例中，一个或多个mRNA共同编码OX40L(或激活OX40的蛋白/多肽/抗体或其组合)、IL-12A和IL-12B。

当编码IL-12和OX40L(或其可溶性对应物)的mRNA分子分别提供时，可以根据需要调整它们的比例。在某一实施例中，IL-12mRNA与OX40LmRNA的质量比的范围在1:0.5到1:6之间，且不受限制。在某一实施例中，IL-12mRNA与OX40L mRNA的质量比在1:0.5到1:5之间。在某一实施例中，IL-12mRNA与OX40L mRNA的质量比在1:0.5到1:4之间。在某一实施例中，IL-12mRNA与OX40L mRNA的质量比在1:0.75到1:6之间。在某一实施例中，IL-12mRNA与OX40L mRNA的质量比在1:0.75到1:5之间。在某一实施例中，IL-12mRNA与OX40L mRNA的质量比在1:0.75到1:4之间。在某一实施例中，IL-12mRNA与OX40L mRNA的质量比在1:0.8到1:5之间。在某一实施例中，IL-12mRNA与OX40L mRNA的质量比在1:0.8到1:4之间。在某一实施例中，IL-12mRNA与OX40L mRNA的质量比在1:0.8到1:3之间。

在某一实施例中，IL-12mRNA与OX40L mRNA的质量比在1:0.9到1:5之间。在某一实施例中，IL-12mRNA与OX40L mRNA的质量比在1:0.9到1:4之间。在某一实施例中，IL-12mRNA与OX40L mRNA的质量比在1:0.9到1:3.5之间。在某一实施例中，IL-12mRNA与OX40L mRNA的质量比在1:0.9到1:3之间。在某一实施例中，IL-12mRNA与OX40L mRNA的质量比在1:0.9到1:2.5之间。

在某一实施例中，IL-12mRNA与OX40L mRNA的质量比在1:0.9到1:2之间。在某一实施例中，IL-12mRNA与OX40L mRNA的质量比在1:1到1:4之间。在某一实施例中，IL-12mRNA与OX40L mRNA的质量比在1:1到1:3之间。在某一实施例中，IL-12mRNA与OX40L mRNA的质量比在1:1到1:2.5之间。在某一实施例中，IL-12mRNA与OX40L mRNA的质量比在1:1到1:2之间。

在一些实施例中，OX40L是全长的OX40L蛋白。在一些实施例中，

OX40L是Fc-OX40L(可溶性片段)。

如实施例所示，添加其他潜在治疗剂可能不会增加当前mRNA组合的治疗效果。因此，在一种实施例中，治疗方法、用途或组合不包括其他类型的mRNA。

在某一实施例中，不包括编码免疫检查点抑制剂的mRNA，如PD-L1、PD-1和CTLA-4。在某一实施例中，不包括编码干扰素的mRNA，如IFN-α、IFN-β或IFN-γ。在某一实施例中，不包括编码IL-12家族其他成员的mRNA，如IL-23、IL-27和IL-35。在某一实施例中，不包括编码其他细胞因子的mRNA，如IL-18。

在一些实施例中，每个mRNA是线性mRNA或环状mRNA。在一些实施例中，每个mRNA还包括一个miRNA结合位点。在一些实施例中，每个mRNA不包含减少免疫原性的化学修饰。在一些实施例中，mRNA的主链没有化学修饰。在一些实施例中，每个mRNA仅包含天然核苷酸。

在一些实施例中，mRNA中的至少一种尿苷核苷经过化学修饰。在一些实施例中，经过化学修饰的尿苷核苷是N1-甲基伪尿苷。在一些实施例中，第一个mRNA和第二个mRNA与药物学上可接受的载体配制在一起。

实施例

实施例1：IL-12与OX40L mRNA的组合协同抑制肿瘤

本实施例评估了mRNA递送的各种因子在抑制肿瘤生长中的效果。

这些因子包括可溶性PD1(sPD1，作为PD-1/PD-L1抑制剂)、OX40配体(OX40L，剪切异构体1)、IL-12(IL12B-IL12A融合蛋白)、干扰素β(IFN-β)、雷西莫特(R-848，Toll样受体7/8的配体)以及GFP作为对照。

本实施例使用小鼠结肠癌模型。CT-26是一种小鼠结肠癌细胞系。在小鼠中植入CT-26细胞八天后，将单个因子、单个因子的mRNA、多个因子的mRNA混合物(每只小鼠10μgmRNA)(表1)分别包装在脂质纳米颗粒(LNP)中，将这些mRNA样品注射到肿瘤中。在第18天，安乐处死动物，分离肿瘤，并测量肿瘤体积。结果如图1所示。

表1.mRNA样本

有趣的是，单独使用sPD1并没有表现出抗肿瘤效果。虽然OX40L显示出一些抗肿瘤效果，但R848和IFN-β的抗肿瘤效果更强，而IL-12作为单一剂量显示出最强的抗肿瘤效果。

在所有组合治疗中，OX40L与IL-12的组合(治疗编号10)效果显著，肿瘤大小减少了约10倍。与各自的单一药物(治疗编号4和5)相比，该组合实现了协同效果。

尽管R848作为单一药物的抗肿瘤效果适中，但在组合使用时却降低了其他药物的抗肿瘤效果。例如，治疗编号18(R848+OX40L+IL-12)的效果不如治疗编号10(OX40L+IL-12)，而治疗编号20(R848+sPD1+OX40L+IL-12)的效果则不如治疗编号16(sPD1+OX40L+IL-12)。

实施例2：肿瘤远端侧的抗肿瘤效果

基于实施例1的结果，本示例进一步探讨了组合mRNA治疗在远端肿瘤区域的抗肿瘤功效。

本实施例中使用的动物模型与实施例1相同。在注射LNP包装的OX40L和IL-12mRNA后的第10天(第18天)，测量了注射侧和远端侧的肿瘤体积。如图2所示，即便mRNA仅注射到肿瘤块的一侧，双方的抗肿瘤效果仍然相似。

因此，本实施例表明，注射的mRNA和/或其表达的蛋白产物能够在肿瘤组织中扩散，从而有效抑制整个肿瘤。

实施例3：全长OX40L与可溶性OX40L片段的比较

本实施例比较了全长OX40L及其可溶性部分在肿瘤动物模型中的疗效。

肿瘤内注射mRNA制剂。这些制剂包括GFP(对照)、IL-12、全长OX40L和与IgG Fc片段融合的可溶性OX40L片段(Fc-OX40L)的mRNA制剂。

将CT26肿瘤细胞(1×10^6)植入小鼠体内，并在第8天和第11天分别向动物肿瘤内注射测试药物(每只动物总共1.5μg mRNA)。在首次给药时，CT26肿瘤块直径约为4毫米。动物在植入后第8、11、14和17天进行检查。如图3所示，总体而言，IL-12与OX40L(无论是全长还是可溶性)组合的肿瘤缩小效果优于单独使用任一剂，对局部肿瘤(“注射侧”)和远端区域(“远端侧”)均表现出更好的效果。有趣的是，含有可溶性OX40L(Fc-OX40L)的组合优于全长OX40L的组合。

这些测试剂的安全性和抗肿瘤功效的详细测量数据见图4-6，涵盖植入后第8、11、14和17天(图5为注射侧；图6为远端侧)。所有测试剂在动物中均表现出良好的安全性，且与对照相当(图4)。

这些结果证实了IL-12与可溶性Fc-OX40L联用是最有效的组合。

实施例4：IL-12、OX40L与MLKL或FADD

本实施例测试了添加额外药物是否能进一步增强IL-12/OX40L组合的抗肿瘤效果。

测试了四种额外药物，包括FADD(FAS相关死亡域蛋白)、MLKL(混合谱系激酶样伪激酶)、GSDMD(Gasdermin D)和TNFR(肿瘤坏死因子受体)。FADD是一种接头蛋白，连接肿瘤坏死因子受体超家族成员(如Fas受体)与前半胱天冬酶8和10，形成在细胞凋亡过程中的死亡诱导信号复合体(DISC)。MLKL通过与受体相互作用蛋白3(RIP3)的相互作用，在肿瘤坏死因子(TNF)诱导的坏死性凋亡中发挥作用。GSDMD是炎症性半胱天冬酶(半胱天冬酶-1、-4、-5和-11)的特定底物，并作为细胞程序性死亡的效应分子，参与溶解性和高度炎症性的焦亡。

所有这些药物以不同组合的形式通过mRNA(总计1.5μg)在肿瘤细胞植入后的第9和12天注入上述相同的动物模型中。虽然IL-12和OX40L通过不同载体编码表达，但增加的药物(例如FADD)通过IRES元件与OX40L融合在同一条mRNA中。

如图7所示，添加MLKL、FADD、GSDMD和TNFR中的任意一种均进一步增强了IL-12/OX40L组合的疗效，即使它们单独使用时并未观察到抗肿瘤效果。其中，含有MLKL或FADD四螺旋束结构的三联组合表现出最显著的疗效(图7、9)。特别是IL-12/OX40L/FADD组合在动物的注射侧和远端侧均表现出最显著的疗效(图7、10)。所有测试药物在动物中均表现出良好的安全性(图8)。

实施例5：脂质纳米颗粒制剂

本实施例测试了使用不同配方脂质纳米颗粒制剂递送IL-12和OX40LmRNA的抗肿瘤效果。

制剂配方包括SM102-1和SM102-2(50％ SM102、38.5％胆固醇、10％磷脂和1.5％脂质-PEG)，以及ALC0315制剂。使用上述方法对它们的抗肿瘤效果进行评估。如图11所示，这三种制剂具有相当的抗肿瘤疗效。

通过递送荧光素酶mRNA检测不同制剂配方表达产物的组织分布情况。将等量的荧光素酶mRNA通过SM102-1、SM102-2和ALC0315进行肿瘤内递送。在注射后6小时、24小时和48小时分析不同组织中荧光素酶的活性。

ALC0315在注射48小时后的荧光素酶活性较低，但在注射6小时后的活性却很高。这表明ALC0315介导的mRNA递送速度快，但持续时间短，这解释了图11中相当的抗肿瘤效果。对于所有制剂，大部分mRNA在肝脏中被检测到，同时也有较大部分仍滞留在肿瘤组织中(图12)。

实施例6：RNA聚合酶、帽结构和多腺苷酸化方法

本实施例测试了由不同RNA聚合酶、不同帽结构和不同多腺嘌呤尾及不同制备方法制备的mRNA的肿瘤治疗效率。

在第一个实验中，OX40L和IL-12的mRNA由VSW-3RNA聚合酶转录，使用VCE(痘苗病毒加帽酶)进行加帽，并由酵母多腺苷酸聚合酶催化的poly(A)(酶促法加帽加尾)。在第二个实验中，mRNA由T7 RNA聚合酶转录，使用AG加帽，并通过转录模板添加多聚腺嘌呤尾(共转录加帽加尾)。两种方法合成的mRNA通过瘤内注射进测试动物一侧肿瘤内。如图13所示，使用不同RNA聚合酶、加帽方法和多腺苷酸化方法生产的OX40L和IL-12mRNA均显示出显著的抗肿瘤效果。

有报道指出，由VSW-3RNA聚合酶合成的RNA产物所含双链RNA副产物(dsRNA)的量远低于T7 RNAP IVT产品中的量。本实施例进一步测试了VSW-3和AG的兼容性。使用EGFP作为标记蛋白指示通过不同RNA聚合酶转录的mRNA的表达。将T7或VSW-3与AG转录产生的等量的EGFP mRNA转染到HEK293T细胞中。转染经VSW-3转录的EGFP mRNA的HEK293T细胞中的荧光信号远低于由T7转录的EGFP mRNA(图14)，这表明VSW-3在最佳IVT条件下与AG的兼容性较差。

本实施例随后进一步检测了具有不同帽结构的OX40L和IL-12mRNA的抗肿瘤效果。在肿瘤植入后第8天和第11天注射带有cap-0或cap-1的OX40L和IL-12mRNA。第14天时，cap0和cap1 mRNA均表现出相当的抗肿瘤效果，但第17天时cap1 mRNA的抗肿瘤效果比cap0mRNA更为稳定(图15)。

实施例7：具有不同UTR序列和密码子优化的mRNA

本实施例评估了不同UTR组合对mRNA翻译的影响。

使用EGFP mRNA作为研究工具。如图16所示，通过检测带有不同UTR的EGFP mRNA的翻译来测试UTR组合H或组合R。组合R序列采用自PCT申请号WO2023142283A1，组合H的5'UTR和3'UTR序列分别显示在

SEQ ID NO:19和20(表A)中。UTR组合H表现出略高于组合R的平均荧光强度(MFI)。

此外，对OX40L和IL-12mRNA的序列进行了密码子优化。如图17所示，除了OX40L的#8(SEQ ID NO:29)和#10mRNA(SEQ ID NO:31)表现出相对较低的翻译水平，大多数经过密码子优化的mRNA表现出优秀的翻译水平。

实施例8：具有不同poly(A)长度的mRNA

本实施例检测了不同长度poly(A)对EGFP mRNA翻译的影响。分别将带有30个腺嘌呤或120个腺嘌呤poly(A)尾的EGFP mRNA等量转染到HEK293T细胞中，转染18小时后检测荧光。与30A相比，120A的EGFP mRNA具有更高的翻译水平(图18)。

本公开的范围不应局限于所描述的具体实施例，这些实施例仅作为本公开各个方面的单一示例，任何在功能上等效的组合物或方法均在本公开的范围内。对本领域的技术人员而言，很容易在不偏离本公开的精神或范围的前提下，对本公开的方法和组合物进行各种修改和变动。因此，只要它们在所附权利要求及其等同物的范围内，本公开旨在涵盖这些修改和变动。

本说明书中提到的所有出版物和专利申请，均通过引用整体纳入，效力等同于每个单独出版物或专利申请被单独明确列明为引用内容。

Claims (25)

1.一种信使RNA(mRNA)，包括5’非翻译区(UTR)、3’UTR和编码序列，其中5’UTR包括SEQID NO:19的核酸序列，3’UTR包括SEQ ID NO:20的核酸序列。

2.根据权利要求1的mRNA，其中mRNA的5’端包含Cap-1结构。

3.根据权利要求2的mRNA，其中Cap-1结构由AG共转录加帽试剂或酶促加帽形成。

4.根据权利要求3的mRNA，其中mRNA由T7 RNA聚合酶转录。

5.根据任何前述权利要求的mRNA，其中mRNA进一步包含一个poly(A)尾，优选由酶法或共转录法制备。

6.根据权利要求5的mRNA，其中poly(A)包含至少50个腺嘌呤碱基，优选为至少80个腺嘌呤碱基，更优选为至少100个腺嘌呤碱基。

7.根据任何前述权利要求的mRNA，其中编码序列编码IL-12或OX40激动剂，或同时编码IL-12和OX40激动剂。

8.根据权利要求7的mRNA，其中OX40激动剂为OX40配体(OX40L)、包含OX40L的细胞外结构域的多肽，或抗OX40激动型抗体或其抗原结合片段。

9.根据权利要求7或8的mRNA，其中编码序列进一步编码FADD(FAS相关死亡结构域蛋白)、MLKL(混合谱系激酶结构域类样假激酶)或MLKL的四螺旋束结构域(MLKL-4HB)。

10.根据权利要求7或8的mRNA，其中IL-12的编码序列选自一个包括从SEQ ID NO:21-26的核酸序列的组。

11.根据权利要求7或8的mRNA，其中OX40L的编码序列选自一个包括从SEQ ID NO:27-33的核酸序列的组，优先从SEQ ID NO:27、28、30、32和33的组中选择。

12.一种药物组合物，包括权利要求1-11中任一项的mRNA，以及一种可电离脂质、磷脂、结构脂质、聚乙烯醇(PEG)脂质或它们的组合。

13.根据权利要求12的药物组合物，其中可电离脂质为SM102或ALC0315。

14.一种在制备治疗肿瘤的药物中的应用，包括向患者施用权利要求1-11中任一项的mRNA或权利要求12或13的药物组合物。

15.一种在制备治疗肿瘤的药物中的应用，包括向患者施用第一种mRNA(编码OX40激动剂)、第二种mRNA(编码IL-12)和第三种mRNA(编码FADD、MLKL或MLKL-4HB)。

16.根据权利要求15的应用，其中第三种mRNA与第一种mRNA或第二种mRNA在同一RNA分子上。

17.根据权利要求15或16的应用，其中OX40激动剂为OX40配体

(OX40L)、包含OX40L的细胞外结构域的多肽，或抗OX40激动型抗体或其抗原结合片段。

18.根据权利要求15-17中任一项的应用，其中第一种mRNA和第二种mRNA以质量比4:1到0.5:1施用，优选为3:1到0.75:1，更优选为2:1到0.9:1。

19.根据权利要求14-18中任一项的应用，其中施用方式为皮下注射、肌肉注射、腹腔注射、胸腔注射、静脉注射、动脉注射或它们的组合。

20.根据权利要求14-20中任一项的应用，其中肿瘤选择自以下组：鳞状细胞癌、肺癌、腹膜癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、尿道癌、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌、子宫癌、唾液腺肿瘤、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、软组织肉瘤、神经母细胞瘤、阴茎癌、黑色素瘤、表浅扩展型黑色素瘤、雀斑型黑色素瘤、肢端型黑色素瘤、结节型黑色素瘤、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、急性淋巴母细胞白血病、毛细胞白血病、慢性髓性白血病、急性髓性白血病、移植后淋巴增殖性疾病、脑肿瘤、脑癌和头颈癌，优选结肠癌、乳腺癌和肺癌。

21.一种药物组合物，包括第一种mRNA(编码OX40激动剂和/或IL-12)和第二种mRNA(编码FADD、MLKL或MLKL-4HB)。

22.根据权利要求21的药物组合物，其中第一种mRNA编码OX40激动剂，第二种mRNA编码FADD、MLKL或MLKL-4HB，其中该组合物进一步可选择性地包括第三种mRNA(编码IL-12)。

23.根据权利要求21的药物组合物，其中第一种mRNA编码IL-12，第二种mRNA编码FADD、MLKL或MLKL-4HB，其中该组合物进一步可选择性地包括第三种mRNA(编码OX40激动剂)。

24.一种mRNA，选自一个包括从SEQ ID NO:21-26的核酸序列的组。

25.一种mRNA，选自一个包括从SEQ ID NO:27-33的核酸序列的组，优先从SEQ ID NO:27、28、30、32和33的组中选择。