CN119570979A

CN119570979A - 一种扩增与Argonaute酶切兼容的一管式基因编辑核酸检测方法及应用

Info

Publication number: CN119570979A
Application number: CN202311154393.7A
Authority: CN
Inventors: 冯雁; 李忠磊; 叶星宇; 刘倩; 鲍玲莉; 方正伟
Original assignee: Jiaohong Biotechnology Shanghai Co ltd; Shanghai Jiao Tong University
Current assignee: Jiaohong Biotechnology Shanghai Co ltd; Shanghai Jiao Tong University
Priority date: 2023-09-07
Filing date: 2023-09-07
Publication date: 2025-03-07

Abstract

本发明公开了一种扩增与Argonaute酶兼容的一管式基因编辑核酸检测方法及应用，包括固定化核酸酶的制备，扩增‑酶切兼容体系组分配方，扩增‑酶切一管式反应程序以及该方法在单重或多重核酸检测中的应用。本发明采用Argonaute级联剪切与酶固定化包埋结合的方法，结合Argonaute高温耐受特点，通过温控释放核酸酶活性，实现了扩增无核酸酶干扰，酶切热启动释放活性的一管式检测流程，避免了现有基因编辑核酸检测技术普遍存在的核酸污染、操作繁琐等问题，并且易于保存和运输，在现场及时检测和居家核酸自检中具有重要的应用潜力。

Description

一种扩增与Argonaute酶切兼容的一管式基因编辑核酸检测方法及应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种扩增与Argonaute酶切兼容的一管式基因编辑核酸检测方法及应用。

技术背景

最近几年，基因编辑工具酶的出现催生了新一代的核酸检测技术，其中以诺奖得主詹妮弗和华裔科学家张锋的基于CRISPR的基因编辑检测技术为代表。其解决了LAMP、重组酶聚合酶扩增等温扩增的非特异性产物造成的假阳性问题，还进一步放大了检测信号。不过CRISPR-Cas基因编辑酶能竞争性结合和剪切模板，目前CRISPR核酸检测一般分步进行扩增-酶切反应，操作较为繁琐，且开盖反应容易造成污染。虽然已有报道结合组分优化、光控核酸封闭、微流控设备等方法实现了一管式检测，但是仍然存在灵敏度低、需要专用设备问题。

与CRISPR基因编辑酶类似，Argonaute(Ago)蛋白是一种可编程性核酸内切酶，可在guide DNA介导下对互补配对核酸进行精准剪切，由于其无识别序列的限制及正交多重酶切活性，吸引了业界越来越多的关注，但是由于Ago有强烈的模板结合能力，目前基于Ago蛋白的核酸检测技术仍然需要扩增和酶切两步进行反应，同样存在操作繁琐、开盖污染的问题。

LAMP、重组酶聚合酶扩增具备快速简便、特异、敏感、重复性好等优点，相比于其他检测方法，在实际的应用中优势明显，但容易出现非特异性扩增造成的假阳性且难以实现多重检测。

发明内容

鉴于现有等温扩增的非特异性产物造成的假阳性问题，本发明提供一种扩增与Argonaute酶兼容的一管式基因编辑核酸检测方法及应用。

本发明第一方面提供一种一管式核酸检测反应体系，所述反应体系含有，扩增体系和包含固定化Argonaute核酸酶的酶切体系。

另一优选例中，所述扩增包括LAMP扩增。

另一优选例中，所述扩增包括重组酶聚合酶扩增。

另一优选例中，所述重组酶聚合酶扩增包括RPA、RAA、MIRA、ERA、或其组合。

另一优选例中，所述反应体系包括，LAMP扩增-酶切体系，或重组酶聚合酶扩增-酶切体系。

另一优选例中，所述LAMP扩增-酶切体系总体积为25-100μL。

另一优选例中，所述LAMP扩增-酶切体系含有，

(1)酶：4-50U Bst DNA聚合酶、0.5-2U反转录酶、0.5-4U热稳定无机焦磷酸酶、2-8mg固定化Argonaute核酸酶；

(2)缓冲液：0.5-2x Bst Buffer、1-10mM MgSO₄、1.0-3.0mM dNTP；

(3)引物和guide DNA：0.5-5μM上游gDNA、0.5-5μM下游gDNA、0.5-2x引物，其中1x引物组分为：1.6μM FIP/BIP内引物，0.2μM F3/B3外引物，0.4μM LF/LB环引物；和

(4)核酸报告分子和核酸模板：0.1-2μM核酸报告分子，5-40μL待测核酸模板。

另一优选例中，所述Bst DNA聚合酶和Bst缓冲液为常见的市售试剂。

另一优选例中，所述1x引物为LAMP扩增引物。

另一优选例中，所述反转录酶为耐受55-65℃的ThermoStable V RTase反转录酶或市售的其它耐受55-65℃的反转录酶。

另一优选例中，所述的核酸报告分子为25-35个碱基的探针分子。

另一优选例中，所述的gDNA为5’磷酸化和3’磷酸化的单链DNA分子。

另一优选例中，所述的gDNA可以只使用下游gDNA，检测效率不受显著影响。

另一优选例中，所述的gDNA的长度为15-20个碱基。

另一优选例中，所述LAMP扩增-酶切体系可检测两种靶标基因片段，且其包含：

(1)酶试剂：0.2-1U/μL Bst DNA聚合酶、0.5-1U/μL反转录酶、0.02-0.05U/μL热稳定无机焦磷酸酶、2-5mg/μL固定化核酸酶；

(2)缓冲液：1x Bst缓冲液、6-8mM MgSO₄、1.0-3.0mM dNTP；

(3)引物和guide DNA：0.5-2μM靶标1上游gDNA、0.5-2μM靶标1下游gDNA、0.5-1x靶标1引物，0.5-2μM靶标2上游gDNA、0.5-2μM靶标2下游gDNA、0.5-1x靶标2引物。

(4)核酸报告分子和核酸模板：0.5-1μM靶标核酸报告分子、0.5-1μM靶标2核酸报告分子、待测核酸模板为5-40μL。

另一优选例中，所述的0.5-1x引物组分为0.8-1.6μM FIP/BIP内引物，0.1-0.2μMF3/B3外引物和0.2-0.4μM LF/LB环引物。

另一优选例中，所述的LAMP扩增-酶切兼容体系程序为1)扩增阶段：控制温度62-65℃，维持30-45分钟。2)酶切阶段：控制温度92-97℃，维持20-30分钟。期间每15-60秒采集一次对应核酸报告分子荧光标记信号或终点采集荧光信号。

另一优选例中，所述重组酶聚合酶扩增-酶切体系总体积20-100μL。

另一优选例中，所述重组酶聚合酶扩增-酶切体系含有，120-125ng DNA重组酶、300-900ng单链结合蛋白或具有相似功能的突变体蛋白、25-50ng/μL重组调节蛋白、5-30mM乙酸镁、反转录酶0.5-2U、20-90mM Tris(pH 7.9-8.4)、80-100mM乙酸钾、1-10mM二硫苏糖醇、200μM dNTP、1-8mM ATP、20-50mM磷酸肌酸、20-120ng肌酸激酶、10-40ng枯草芽孢杆菌DNA聚合酶大片段Bsu、0.01-0.05U热稳定无机焦磷酸酶、0.1-10mg固定化Argonaute核酸酶、0.5-5μM上游gDNA、0.5-5μM下游gDNA、0.1-2μM核酸报告分子、0.2-1.0μM上游引物、0.2-1.0μM下游引物、5-40μL核酸模板

另一优选例中，所述DNA重组酶包括UvsX DNA重组酶或其类似物。

另一优选例中，所述单链结合蛋白包括单链结合蛋白gp32或其变体。

另一优选例中，所述重组调节蛋白包括UvsY重组调节蛋白或其变体。

另一优选例，所述重组酶聚合酶扩增-酶切体系含有：

(1)酶：120-125ng/μL重组酶、600-900ng/μL单链结合蛋白25-30ng/μL重组调节蛋白、0.5-1U/μL反转录酶、15-45ng/μL枯草芽孢杆菌DNA聚合酶大片段Bsu、0.01-0.05U/μL热稳定无机焦磷酸酶、2-5mg/μL固定化核酸酶；

(2)缓冲液和金属离子：5-30mM乙酸镁、50mM Tris(Ph7.9-8.4)、80-100mM乙酸钾、1-5mM二硫苏糖醇、5％-5.5％高分子量聚乙二醇、100-300μM dNTPs、1-8mM腺嘌呤核苷三磷酸ATP、20-50mM磷酸肌酸(phosphocreatine)、50-120ng/μL肌酸激酶(creatine kinease)；

(3)引物、gDNA：0.2-1.0μM上游引物、0.2-1.0μM下游引物、0.5-5μM上游gDNA、0.5-5μM下游gDNA；

(4)待测核酸模板和核酸报告分子：待测核酸模板为5-15μL、0.1-2μM核酸报告分子。

另一优选例，所述的重组酶聚合酶-酶切体系的酶可以是市售的常见RAA试剂组分。

另一优选例，所述的上游引物和下游引物为40-45个碱基的单链DNA分子。

另一优选例，所述的核酸报告分子为25-35个碱基的单链DNA分子探针。

另一优选例，所述的上游gDNA和下游gDNA为5’磷酸化和3’磷酸化的单链DNA分子。

另一优选例，所述的gDNA的长度为15-25个碱基。

另一优选例，所述的重组酶聚合酶扩增试剂若为常见的市售冻干试剂，可直接添加所述缓冲液、所述引物、所述gDNA、所述核酸报告分子、所述固定化Argonaute核酸酶、和所述核酸模板。

优选的，所述的重组酶聚合酶扩增-酶切体系程序为：

1)扩增阶段：控制温度37-42℃，维持30-50分钟；

2)酶切阶段：控制温度90-99℃，维持20-40分钟；

期间每15-60秒采集一次对应核酸报告分子荧光标记信号或终点采集荧光信号。

另一优选例中，所述Argonaute核酸酶包括耐高温Argonaute核酸酶。

另一优选例中，所述耐高温Argonaute核酸酶包括，PfAgo、MfAgo、TtAgo、MpAgo、ThAgo、TpsAgo、或其组合。

另一优选例中，所述固定化Argonaute核酸酶包括所述Argonaute核酸酶的冻干剂型。

另一优选例中，所述固定化Argonaute核酸酶包括所述固定化Argonaute核酸酶的冻干剂型。

另一优选例中，所述固定化Argonaute核酸酶包括所述耐高温Argonaute核酸酶的冻干剂型。

另一优选例中，所述固定化Argonaute核酸酶包括所述PfAgo、MfAgo、TtAgo、MpAgo、ThAgo、TpsAgo、或其组合的冻干剂型。

另一优选例中，所述Argonaute核酸酶的冻干剂型为均匀地包埋于温变相且熔化后透明无色的惰性材料中。

另一优选例中，所述固定化Argonaute核酸酶的冻干剂型为均匀地包埋于温变相且熔化后透明无色的惰性材料中。

另一优选例中，所述耐高温Argonaute核酸酶的冻干剂型为均匀地包埋于温变相且熔化后透明无色的惰性材料中。

另一优选例中，所述PfAgo、MfAgo、TtAgo、MpAgo、ThAgo、TpsAgo、或其组合的冻干剂型为均匀地包埋于温变相且熔化后透明无色的惰性材料中。

另一优选例中，所述惰性材料外层还包含一层温变相且熔化后透明无色的外层惰性材料。

另一优选例中，所述Argonaute核酸酶来自宿主表达。

另一优选例中，所述宿主包括微生物。

另一优选例中，所述微生物包括，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、毕赤酵母(Pichia pastoris)、摩纳酵母(Saccharomyces monacensis)、贝酵母(Saccharomycesbayanus)、巴氏酵母(Saccharomyces pastorianus)、卡氏酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、粟酒裂殖酵母(Saccharomyces pombe)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxiamus)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)，树干毕赤酵母(Pichia stipites)、休哈塔假丝酵母(Candidashehatae)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、大肠杆菌(Escherichia coli)、或其组合。

另一优选例中，所述微生物包括，酿酒酵母、毕赤酵母、嗜热毁丝霉、或其组合。

另一优选例中，所述惰性材料和/或外层惰性材料包括，石蜡、聚乙烯蜡(PE蜡)、聚丙烯蜡(PP蜡)、乙酸乙烯共聚蜡(EVA蜡)、地蜡、明胶、琼脂糖、环氧树脂、或其组合。

另一优选例中，所述惰性材料和/或外层惰性材料包括为环氧树脂。

另一优选例中，所述反应体系由于冻干，可于30-60摄氏度常温时保存和/或运输。

另一优选例中，所述冻干包括保护剂。

另一优选例中，所述保护剂包括，：甘露醇2-3％(m/v)、海藻糖2-10％(m/v)、聚乙二醇-8000 1-3％(m/v)、甘氨酸2-3％(m/v)、或其组合。

另一优选例中，所述冻干的程序包括，(1)-60℃～-50℃维持10-15h；(2)-50℃～-40℃维持3-5h，抽真空并维持到程序结束；(3)-40℃～-30℃维持1-5h；(4)-35～-25℃维持2-5h；(5)-25～-20℃维持2-5h；(6)-20℃～-10℃维持1-3h；(7)-10℃～0℃维持1-3h；(8)0℃～10℃维持2-5h；(9)10℃～20℃维持3-4h；(10)20℃～30℃维持99h。

另一优选例中，所述反应体系还包括检测设备或体系。

另一优选例中，所述检测设备或体系包括荧光定量PCR仪、恒温荧光检测仪、便携式荧光检测仪、或其组合。

另一优选例中，当扩增为LAMP时，所述检测设备或体系的反应程序包括：

第一阶段：60-65℃，20-50分钟，不采集荧光信号；

第二阶段：87-99℃，10-40分钟，每15-60秒一个循环，每个循环采集一次对应核酸报告分子荧光标记信号，或终点采集荧光信号。

另一优选例中，当扩增为重组酶聚合酶扩增时，所述检测设备或体系的反应程序包括：

第一阶段：35-45℃，维持20-50分钟，不采集荧光信号；

第二阶段：87-99℃，维持10-40分钟，期间每15-60秒一个循环，每个循环采集一次对应核酸报告分子荧光标记信号或终点采集荧光信号。

另一优选例中，所述反应体系用于核酸检测。

另一优选例中，所述核酸检测包括单个和多重核酸检测。

另一优选例中，所述核酸包括核酸序列。

另一优选例中，所述核酸序列来自以下物种：

新型冠状病毒SARS-CoV-2、甲型流感病毒(IAV)、乙型流感病毒(IBV)、非洲猪瘟病毒(AFSV)、猪呼吸与繁殖综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猫疱疹病毒(FHV)、或其组合。

本发明第二方面提供一种用于核酸靶标检测的试剂盒，所述试剂盒含有，如本发明第一方面所述检测体系或用于配制所述检测体系的试剂、描述使用所述检测体系检测靶核酸的方法的使用说明书、或其组合。

本发明第三方面提供一种检测样本中是否存在靶标核酸分子的方法，包括以下步骤：

(a)提供本发明第一方面所述检测体系；和

(b)将所述检测体系与待检测的样本在一定温度下进行反应，从而形成第一反应溶液；

(c)对所述第一反应溶液进行荧光检测，从而获得荧光信号值；

其中，所述第一反应溶液中检测到荧光信号值，则表示所述样本中存在靶标核酸分子；而所述第一反应溶液中没有检测到荧光信号值，则表示所述样本中不存在靶标核酸分子。

在另一优选例中，所述的待检测的样本包括未经扩增的样本以及经过扩增(或核酸扩增)的样本。

在另一优选例中，所述的待检测的样本是经过扩增而获得的样本。

在另一优选例中，所述核酸扩增的方法选自下组：PCR扩增、LAMP扩增、RPA扩增、连接酶链式反应、分支DNA扩增、NASBA、SDA、转录介导扩增、MIRA、ERA、和滚环扩增。

在另一优选例中，所述的PCR包括高温PCR、常温PCR、低温PCR。

在另一优选例中，所述方法用于检测靶位点处的核酸是否在SNP、点突变、缺失、和/或插入。

在另一优选例中，在步骤(b)中所述荧光检测采用酶标仪或者荧光分光光度计进行检测。

在另一优选例中，所述的方法是体外方法。

在另一优选例中，所述的方法是非诊断性和非治疗性的。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了LAMP扩增-Argonaute固定化核酸酶剪切一管式冻干试剂形态以及反应完成后形态。

图2显示了以新型冠状病毒SARS-CoV-2的N基因为例，预分装LAMP扩增-Argonaute固定化核酸酶剪切一管式冻干试剂的灵敏度检测结果。

图3显示了新型冠状病毒SARS-CoV-2假病毒免提取N基因LAMP扩增-Argonaute核酸酶剪切一管式检测结果。

图4显示了非洲猪瘟病毒(ASFV)的LAMP扩增-Argonaute核酸酶剪切一管式检测结果。

图5显示了猪圆环病毒2型(PCV2)的LAMP扩增-Argonaute核酸酶剪切一管式检测结果。

图6显示了猪蓝耳病毒PRRSV的LAMP扩增-Argonaute核酸酶剪切一管式检测结果。

图7显示了猫疱疹(FHV)的LAMP扩增-Argonaute核酸酶剪切一管式检测结果。

图8显示了新型冠状病毒SARS-CoV-2的N基因和甲型流感病毒M基因的双靶标LAMP扩增-Argonaute核酸酶剪切检测结果。

图9显示了新型冠状病毒SARS-CoV-2的N基因和人类RNase P20基因LAMP扩增-Argonaute核酸酶剪切一管式检测结果。

图10显示了新型冠状病毒SARS-CoV-2的N基因RAA扩增-Argonaute固定化核酸酶剪切一管式检测结果。

图11显示了上游gDNA和下游gDNA同时使用(双gDNA)与只使用下游gDNA的一管式检测结果的比较。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次采用Ago级联剪切与LAMP、重组酶聚合酶扩增结合的方法，并利用Ago高温耐受特点，使用固定化包埋的冻干Ago酶，通过温控释放核酸酶活性，实现了扩增无核酸酶干扰，酶切热启动释放活性的一管式扩增-剪切检测流程，避免了现有基因编辑核酸检测技术普遍存在的核酸污染、操作繁琐等问题，同时实现了常温保存运输，在现场及时检测和居家核酸自检中具有重要的应用潜力。在此基础上完成了本发明。

术语

为了更好地理解本发明，定义了以下术语。

除非另有说明，所有单数术语也包括术语的复数、主动时态和过去式。因此，例如，提及“一种蛋白质”包括多于一种蛋白质，并且提及“一种化合物”是指多于一种化合物。

除非上下文另有明确说明，术语“约”包括在所述值的标准偏差范围内的值。

在提供数值范围的情况下，除非上下文另外清楚地指出，否则应当理解，该值的每个中间整数和该值的每个中间整数的每十分之一(除非上下文另外清楚地指出)、在该范围的上限与下限之间和在该规定范围中的任何其他规定或中间值都包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围内，并且也涵盖在本发明内，但须遵守规定范围内的任何明确排除的限制。当规定范围包括这些限值中的一个或两个时，不包括那些所包括的限制中的(i)任一个或(ii)两个的范围也包括在本发明中。例如，“1至50”包括“2至25”、“5至20”、“25至50”、“1至10”等。

除非另有定义，否则本文中所用的全部技术术语和科学术语均具有如本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。

如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。

如本文所用，术语“核酸”意指核苷酸单体的单链聚合物和双链聚合物，包括通过核苷酸间磷酸二酯键键合或核苷酸间类似物连接的2’-脱氧核糖核苷酸(DNA)和核糖核苷酸(RNA)，以及缔合的抗衡离子，例如H⁺、NH₄ ⁺、三烷基铵、四烷基铵、Mg²⁺、Na⁺等。核酸可以是多核苷酸或寡核苷酸。核酸可以完全由脱氧核糖核苷酸，完全由核糖核苷酸组成，或可以是其嵌合混合物。核苷酸单体单位可以包括本文描述的任何核苷酸，包括但不限于天然存在的核苷酸和核苷酸类似物。核酸的尺寸范围典型地从几个单体单元例如5个-40个至几千个单体核苷酸单元。核酸包括但不限于基因组DNA、cDNA、hnRNA、mRNA、rRNA、tRNA、片段化的核酸、从亚细胞细胞器例如线粒体或叶绿体获得的核酸、以及从可以存在于生物样品上或生物样品中的微生物或DNA或RNA病毒获得的核酸。

如本文所用，术语“靶核酸”意图意指为分析或作用的目标物的核酸。分析或作用包括使核酸经历拷贝、扩增、测序和/或用于核酸询问(interrogation)的其他程序。靶核酸可以包括除了待分析的靶序列以外的核苷酸序列。例如，靶核酸可以包含一个或更多个衔接子，包括在待分析的靶核酸序列的侧翼作为引物结合位点发挥作用的衔接子。与捕获寡核苷酸或捕获引物杂交的靶核酸可以包含延伸超过捕获寡核苷酸的5'或3'末端的核苷酸，这样的方式并不是所有的靶核酸都适于延伸。

如本文所用，当提及指导RNA或DNA、crRNA或其衍生物、5’磷酸化单链核酸、或其他核苷酸使用时，术语“靶特异性”意图意指这样的多核苷酸，其包含对靶多核苷酸序列特异性的核苷酸序列，即能够选择性退火至靶多核苷酸(例如，靶DNA)的识别区域的核苷酸序列。靶特异性核苷酸可以具有单一种类的寡核苷酸，或者靶特异性核苷酸可以包括具有不同序列的两个或更多个种类的寡核苷酸。因此，靶特异性核苷酸可以是两种或更多种序列，包括3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种或10种或更多种不同的序列。在一个实施方案中，crRNA或其衍生物包含与靶DNA序列的一个区域互补的靶特异性核苷酸区域。在一个实施方案中，crRNA或其衍生物可以包含除靶特异性核苷酸区域以外的其他核苷酸序列。在一个实施方案中，其他核苷酸序列可以来自tracrRNA序列。在一个实施方案中，5’磷酸化单链核酸或其衍生物包含与靶DNA序列的一个区域互补的靶特异性核苷酸区域。在一个实施方案中，5’磷酸化单链核酸或其衍生物可以包含除靶特异性核苷酸区域以外的其他核苷酸序列。

如本文所用，当提及多核苷酸使用时，术语“互补”意图意指包括能够在某些条件下选择性退火至靶多核苷酸的鉴定区域的核苷酸序列的多核苷酸。如本文所用，术语“基本上互补”和语法等同物意图意指包括能够在某些条件下特异性退火至靶多核苷酸的鉴定区域的核苷酸序列的多核苷酸。退火指的是一种核酸与另一种核酸的核苷酸碱基配对相互作用，该相互作用导致形成双链体、三链体或其他更高等级的结构。通过沃森-克里克(Watson-Crick)和Hoogsteen型氢键键合，主要的相互作用典型地是核苷酸碱基特异性的，例如，A:T、A:U、和G:C。在某些实施方案中，碱基堆积和疏水相互作用还可以有助于双链体稳定性。多核苷酸与靶核酸的互补区域或基本上互补的区域退火的条件是本领域熟知的，例如，如在Nucleic Acid Hybridization,A Practical Approach,Hames和Higgins，编著，IRL Press,Washington,D.C.(1985)以及Wetmur和Davidson,Mol.Biol.31:349(1968)中描述的。退火条件将取决于特定应用，并且可以由本领域技术人员常规地确定，而无需过度的实验。

如本文所用，术语“聚合酶链式反应”或“PCR”指的是其中少量核酸例如，RNA和/或DNA被扩增的程序，如例如在属于Mullis的美国专利第4,683,195号中描述的。通常，来自感兴趣的区域末端或以外的序列信息需要是可获得的，使得可以设计寡核苷酸引物；这些引物在序列上将与待扩增的模板的相对链相同或类似。两种引物的5’末端核苷酸可以与扩增的材料的末端一致。PCR可以用于扩增特定RNA序列、来自总基因组DNA的特定DNA序列、以及从总细胞RNA转录的cDNA、噬菌体或质粒序列等等。通常参见Mullis等人，ColdSpringHarbor Symp.Quant.Biol.,51:263(1987)；Erlich,编著,PCRTechnology,(StocktonPress,NY,1989)。

如本文所用，术语“Argonaute系统”指的是包括指导核酸和Argonaute家族蛋白或其变体的酶系统，所述指导核酸包含与靶多核苷酸的一个区域互补或基本上互补的核苷酸序列，例如指导DNA。Argonaute系统包括源自天然存在的Argonaute系统的工程化的和/或编程的核酸酶系统。Argonaute系统可以包含工程化的和/或突变的Argonaute蛋白。Argonaute系统可以包含工程化的和/或编程的指导DNA。

如本文所用，术语“引导RNA”、“gDNA”、和“指导DNA”可互换使用，指的是包含与靶DNA序列的一个区域互补或基本上互补的序列的gDNA。gDNA可以包含除了与靶DNA序列的一个区域互补或基本上互补的区域以外的核苷酸序列。

如本文所用，术语“指导DNA”指的是包含与靶DNA序列的一个区域互补或基本上互补的序列的DNA。指导DNA可以包含除了与靶DNA序列的一个区域互补或基本上互补的区域以外的核苷酸序列。

如本文所用，术语“核酸酶”指的是能够切割核酸的核苷酸亚基之间的磷酸二酯键的酶。

如本文所用，术语“检测”核酸分子或其片段指的是典型地当核酸分子或其片段与样品或组合物的其他组分已经完全或部分分离时，确定核酸分子的存在，并且还可以包括确定核酸分子或其片段的荷质比(charge-to-mass ratio)、质量、量、吸光度、荧光或其他性质。

如本文所用，术语“引物”指的是当被置于引物延伸(不限于延伸碱基的数目)被启动的条件下时能够充当核酸合成的起始点的天然的或合成的寡核苷酸引物。引物可以是单链寡脱氧核糖核苷酸。引物的长度可以在从约10个至约50个核苷酸的范围内，例如10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个或约50个核苷酸。引物不需要反映模板的准确序列，但必须充分互补，以与模板杂交，用于引物延伸发生。如果期望，可以通过例如光谱学、光化学、生物化学、免疫化学或化学手段通过掺入可检测的标记物来标记引物。示例性标记物包括，但不限于生物素、胺、放射性标记物(例如，32P)、荧光染料、电子致密试剂、酶(通常用于ELISA)或生物素。

如本文所用，术语“线性扩增”指的是使用多个循环的引物延伸反应扩增靶核酸的扩增过程。随着线性扩增，转录物的丰度随循环数目成比例增加并且线性放大。线性扩增程序的实例是LCR、上文的Phillips和Eberwine的aRNA方法、以及本文描述的线性扩增方法。与指数扩增不同，扩增产物的量不呈指数增长。例如，在拷贝率是2000个拷贝/分钟的理想的4小时线性扩增反应中，2000个拷贝的模板DNA将产生960,000,000个拷贝。

如本文所用，术语“指数扩增”指的是其中产物(即，扩增子)随每个反应循环加倍的扩增程序。“指数扩增”是非线性扩增，其导致存在的核酸拷贝的数目呈指数增长。例如，当在一个扩增循环中引物延伸起始于扩增子的两端时，指数扩增可以发生。例如，PCR是指数扩增程序。例如，在具有30个循环的理想PCR反应中，2个拷贝的模板DNA将产生2^30或1,073,741,824个拷贝。

如本文所用，在富集靶多核苷酸的上下文中，术语“富集(enrich)”、“富集(enriching)”或“富集(enrichment)”指的是在多核苷酸群体中产生较高百分比的靶多核苷酸的过程。在一个实施方案中，百分比增加约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在一个实施方案中，百分比增加约2倍、5倍、10倍、50倍或100倍。在一个实施方案中，靶多核苷酸基本上从多核苷酸群体中分离。

如本文所用，术语“聚合酶”指的是能够催化核苷酸的特异性掺入以针对核酸靶序列延伸引物分子(诸如例如，模板寡核苷酸)的3’羟基末端的蛋白。聚合酶可以是例如嗜热的，使得其在升高的反应温度是有活性的。例如，它还可以具有链置换能力。

如本文所用，术语“单核苷酸多态性(SNP)”指的是当基因组(或其他共有序列)中的单个核苷酸—A、T、C或G在物种的成员之间(或在个体中的成对染色体之间)不同时，发生的DNA序列变异。

如本文所用，术语“单核苷酸变体(SNV)”指的是一种基因型或多核苷酸，其包括单核苷酸多态性(SNP)或点突变位点。

如本文所用，术语“受试者”和“患者”可互换地使用。如本文所用，受试者优选地是哺乳动物，例如非灵长类动物(例如牛、猪、马、猫、狗、大鼠等)或灵长类动物(例如猴子和人类)。在特定的实施方案中，受试者是人类。在一个实施方案中，受试者是具有癌症的哺乳动物(例如人类)。

Ago酶

在本发明和检测方法中，一个核心成分是基因编辑酶，例如Ago酶。

一些实施方案中，所述Ago源自Argonaute系统。Argonaute蛋白家族首先在遗传上被发现，并且在植物中被首次鉴定。成员由PAZ(Piwi-Argonaute-Zwille)和PIWI结构域的存在来定义。Argonaute蛋白在物种之间高度保守，并且许多生物体编码该家族的多个成员。Argonaute基因的数目在从裂殖酵母粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)中的1个至线虫蠕虫秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)中的27个的范围内。在哺乳动物中，存在八个Argonaute基因。Argonaute蛋白家族可以分为Ago亚家族和Piwi亚家族。在迄今为止调查的大多数生物体，包括果蝇、斑马鱼和小鼠中，Piwi蛋白的表达限于种系，在种系中，Piwi蛋白与Piwi相互作用蛋白(piRNA)结合。相比之下，Ago蛋白在许多生物体中普遍表达。人类Ago1、Ago3和Ago4基因簇集在第1号染色体上，而Ago2基因位于第8号染色体。人类Piwi亚家族包括HIWI1、HIWI2、HIWI3和HILI；它们分别由第12号染色体、第11号染色体、第22号染色体和第8号染色体上的基因编码。显示出了Argonaute蛋白家族的成员是由小RNA指导的基因沉默途径中的关键角色。小RNA，例如短干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)或Piwi相互作用RNA(piRNA)被锚定在特定的结合口袋中，并且指导Argonaute蛋白靶向mRNA分子以用于沉默或破坏。参见例如，Hock和Meister,Genome Biol,.2008,9(2):210。最近，还示出了，某些Argonaute蛋白由小DNA指导用于进行DNA切割。参见例如，Gao等人,naturebiotechnology,2016,doi:10.1038/nbt.3547。因此，Argonaute系统提供了用于靶向特定序列以及对该序列的某些酶活性的机制。

因此，在一些实施方案中，所述Ago是Ago亚家族系统或其衍生物。在其他实施方案中，系统是Piwi亚家族系统或其衍生物。在一些特定的实施方案中，Argonaute蛋白是格氏嗜盐碱杆菌Argonaute(Ng Argonaute)或其变体。

Argonaute系统的关键元件包括指导核酸，例如5’磷酸化单链核酸。5’磷酸化单链核酸或其衍生物包含与靶核酸的一个区域互补或基本上互补的靶特异性核苷酸区域。在一些实施方案中，5’磷酸化单链核酸或其衍生物包含允许酶特异性靶向互补双链DNA的用户可选择的DNA序列。在一些实施方案中，用户可选择的DNA序列包含与靶DNA序列的一个区域互补或基本上互补的20个-50个核苷酸。在一些实施方案中，5’磷酸化单链核酸是小于100个核苷酸的用户可选择的单链DNA序列。在一些实施方案中，5’磷酸化单链核酸是小于50个核苷酸的单链DNA。在一些实施方案中，5’磷酸化单链核酸是小于25个核苷酸的单链DNA。单链DNA的示例性长度包括10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个和50个核苷酸。在一些实施方案中，用户可选择的DNA序列包含与靶DNA序列的一个区域互补或基本上互补的小于20个核苷酸。示例性用户可选择的DNA序列包含与靶DNA序列的一个区域互补或基本上互补的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、或19个核苷酸。

在一些实施方案中，5’磷酸化单链核酸的靶特异性核苷酸区域具有与靶核酸的一个区域100％碱基对匹配。在一些实施方案中，5’磷酸化单链核酸的靶特异性核苷酸区域具有与靶核酸的一个区域90％-100％、80％-100％、或70％-100％碱基对匹配。在一些实施方案中，在crRNA的靶特异性核苷酸区域和靶核酸的一个区域之间存在一个碱基对错配。在一些实施方案中，在5’磷酸化单链核酸的靶特异性核苷酸区域和靶核酸的一个区域之间存在两个碱基对错配。在一些实施方案中，在5’磷酸化单链核酸的靶特异性核苷酸区域和靶核酸的一个区域之间存在三个碱基对错配。在一些实施方案中，在5’磷酸化单链核酸的靶特异性核苷酸区域和靶核酸的一个区域之间存在四个碱基对错配。在一些实施方案中，在5’磷酸化单链核酸的靶特异性核苷酸区域和靶核酸的一个区域之间存在五个碱基对错配。

本申请使用的Argonaute包括源自天然存在的Argonaute系统的工程化的和/或编程的核酸酶系统。Argonaute系统可以包含工程化的和/或突变的Argonaute蛋白。Argonaute系统还可以包含工程化的和/或编程的指导核酸。在一些实施方案中，Argonaute蛋白或其变体被工程化以去除内切核酸酶活性，使得Argonaute系统不会产生双链DNA断裂或单链DNA断裂。在其他实施方案中，Argonaute蛋白或其变体被工程化以能够产生单链DNA断裂。

应该理解，可以在本方法中使用能够通过指导核酸结合核酸或破坏双链核酸并创建环结构的任何Argonaute系统。

在一些实施方案中，本申请使用的引物是单链寡脱氧核糖核苷酸。在一些实施方案中，引物长度在从约10个至约50个核苷酸的范围。本文提供的引物的示例性长度是10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、或50个核苷酸。

在一些实施方案中，本申请使用的引物具有与靶核酸的一个区域100％碱基对匹配。在一些实施方案中，本申请使用的引物具有与靶核酸的一个区域90％-100％、80％-100％、或70％-100％碱基对匹配。在一些实施方案中，在引物和靶核酸的一个区域之间存在一个碱基对错配。在一些实施方案中，在引物和靶核酸的一个区域之间存在两个碱基对错配。在一些实施方案中，在引物和靶核酸的一个区域之间存在三个碱基对错配。在一些实施方案中，在引物和靶核酸的一个区域之间存在四个碱基对错配。在一些实施方案中，在引物和靶核酸的一个区域之间存在五个碱基对错配。

在一些实施方案中，本申请使用的引物被标记，例如，用于扩增产物的富集或检测。在一些实施方案中，本申请使用的引物被标记用于通过光谱学、光化学、生物化学、免疫化学或化学手段检测。在一些实施方案中，引物用生物素、胺、放射性标记物(例如，32P)、荧光染料、电子致密试剂、酶(通常用于ELISA)或生物素来标记。

在本发明中，优选的Ago酶是PfAgo酶，其来自于古菌Pyrococcus furiosus，基因长度2313bp，氨基酸序列由770个氨基酸组成。

PfAgo酶的酶切特性为：该酶可利用5'磷酸化的寡聚核苷酸作为向导ssDNA指导该酶对目标核酸序列的精确剪切；剪切位点位于与向导ssDNA的第10与11位核苷酸对应的目标核酸(ssDNA)之间的磷酸二酯键。

通常，PfAgo酶的优选工作温度为95±2度。

引物、向导ssDNA对、和报告核酸分子

在本发明的检测体系和检测方法中，一个核心成分是向导ssDNA对。

在本发明中，优选的向导ssDNAs均为长度为14-24nt(如16nt)的寡聚核苷酸，其5’第一个核苷酸均为磷酸化修饰的胸腺嘧啶(T)。

本文所用的术语“引物”具有本领域技术人员常规理解的意义，即，一小段单链DNA或者RNA片段，用于检测与其互补的核酸序列。

鉴于本发明的教导和本领域的公知常识，本领域技术人员应该理解，在知晓引物对的前提下，本领域技术人员可以根据正向引物和反向引物结合位点之间的模板序列自主设计探针，并检测该探针与引物对的技术效果。在具体的实施方式中，本领域普通技术人员可根据需要具体设计探针，所述探针可以处于液相中，也可以固定于固相上；可以在扩增前结合，也可以在扩增后结合。因此，本发明的探针并不限于实施例中具体公开的探针。本发明的引物对也不限于与实施例中具体公开的探针配对使用。

在本发明的检测体系和检测方法中，一个核心成分是携带报告分子的报告核酸。

如本文所用，“探针”、“报告分子”、和“报告核酸分子”可互换使用。

一些实施方式中，本发明优选的报告分子是荧光分子或荧光基团。一种优选的报告核酸分子是分别携带荧光基团和淬灭基团的核酸分子。例如，在5’端标记荧光基团(F)，3’端标记淬灭基团(Q)。

检测体系、方法、和试剂盒

本发明提供了用于检测靶标核酸分子的一管式检测体系，它包括：扩增体系和包含固定化Argonaute核酸酶的酶切体系等，如向导ssDNA对、基因编辑酶Pyrococcusfuriosus Argonaute(PfAgo)、荧光报告核酸，所述荧光报告核酸带有荧光基团和淬灭基团；其中，所述的靶标核酸分子为靶标DNA。

在本发明还提供了基于固定化Argonaute核酸酶的核酸检测方法。

为了便于理解，本发明人提供了本发明检测方法的原理。应理解，本发明的保护范围并不受所述原理的限制。

在本发明方法中，基于固定化Argonaute核酸酶的剪切活性，可根据目标核酸序列的不同设计出一系列向导ssDNAs，这些向导ssDNAs靶向于待检测核酸并介导固定化Argonaute核酸酶对目的片段进行剪切。一些实施方案中，在所述剪切后，还形成新的次级向导ssDNA；次级向导ssDNA继续在固定化Argonaute核酸酶的作用下，引导固定化Argonaute核酸酶对与次级向导ssDNAs互补的荧光报告核酸进行剪切，从而达到对目标核酸的检测。

在本发明中，根据向导ssDNAs的设计要求，可通过特殊设计使固定化Argonaute核酸酶可以选择性地对存在部分位点存在差异的核酸序列进行选择性剪切，从而实现分型检测。

在优选例中，本发明中提供了用于核酸检测的优选的引物、向导ssDNAs及荧光报告核酸。

在本发明中，可以在固定化Argonaute核酸酶的剪切体系中同时加入多种目标待检核酸和向导ssDNAs，结合带有不同荧光基团的报告核酸，能达到对目的核酸的多重检测。

本发明方法非常适合用于检测痕量核酸。通过结合PCR以及具有特定序列的向导ssDNA对，本发明可以检测低至fM浓度的靶核酸。

在一个优选例中，本发明检测方法包括如下步骤：

步骤1：针对不同的目标待检核酸序列设计扩增引物、特异性的寡核苷酸向导ssDNAs和荧光报告核酸；

步骤2：采集待检样本，提取含目标序列的核酸复合物；

步骤3：将获取的待检样本作为模板加入本发明的一管式核酸检测反应体系，进行扩增反应；

步骤4：在本发明的一管式核酸检测反应体系在90-99摄氏度持续保温的条件下进行特异性剪切；

步骤5：对步骤4的体系进行荧光定量分析；

步骤6：分析图像后调节Baseline的Start值、End值和阈值线，判定结果。

在本发明中，所用于扩增反应的扩增引物，其Tm值通常60±3度左右，扩增片段大小约为90-120bp。优选地，扩增引物设计时应避开待检测区段。

本发明还提供了用于一种用于本发明检测方法的试剂盒。

典型地，所述的试剂盒包括：用于配制本发明检测体系的试剂和描述使用所述检测体系检测靶核酸的方法的使用说明书

应用

本发明利用了Argonaute核酸酶耐高温的特点，具有简化的操作，同时特别适合检测微量靶标核酸分子，以及多重检测，具有广泛的应用性。

在本发明中，靶标核酸分子可以是DNA，也可以是RNA。当靶标核酸分子是RNA时，可通过逆转录转变为DNA再进行检测。

在另一优选例中，所述靶标核酸分子包括来源于选自下组的靶标核酸分子：植物、动物、微生物、病毒、或其组合。

在另一优选例中，所述的靶标DNA是人工合成或天然存在的DNA。

在另一优选例中，所述的靶标DNA包括野生型或突变型的DNA。

本发明的检测反应体系适于检测多种病原体，例如病毒。在一些实施方案中，所述病毒可以选自而不限于：正义单链RNA病毒((+)-ss-envRNAV)、反义单链RNA病毒((-)-ss-envRNAV)、双链DNA病毒(ds-DNAV)或源于DNA病毒的正义RNA。在一些实施方案中，病毒感染由以下病毒科中的任一种引起：沙粒病毒(Arenaviridae)、动脉病毒(Arterviridae)、布尼亚病毒(Bunyaviridae)、丝状病毒(Filoviridae)、黄病毒(Flaviviridae)、正粘病毒(Orthomyxoviridae)、副粘病毒(Paramyxoviridae)、弹状病毒(Rhabdoviridae)、逆转录病毒科(Retroviridae)(特别是三角逆转录病毒(Deltaretroviridae)属)、冠状病毒(Coronaviridae)、披膜病毒(Togaviridae)、疱疹病毒(Herpesviridae)、痘病毒(Poxviridae)或肝炎病毒(Hepadnaviridae)。

在一些实施方案中，(+)-ss-envRNAV可以选自而不限于：冠状病毒科、黄病毒科、披膜病毒科和动脉病毒科。在一些实施方案中，(+)-ss-envRNAV是对人类具有致病性的冠状病毒。在一些实施方案中，冠状病毒选自下组：SARS-CoV、MERS-CoV、COVID-19(SARS-CoV-2)、CoV 229E、CoV NL63、CoV OC43、CoV HKU1、和CoV HKU20。

在一些实施方案中，(+)-ss-envRNAV可以选自而不限于：黄病毒、黄热病病毒、登革热病毒、日本脑炎病毒、西尼罗河病毒、寨卡病毒、蜱传脑炎(Tick-borne Encephalitis)病毒、科萨努尔森林病(Kyasanur Forest Disease)病毒、Alkhurma病病毒、鄂木斯克出血热(Omsk Hemorrhagic Fever)病毒、和波瓦桑(Powassan)病毒。

在一些实施方案中，(+)-ss-envRNAV的披膜病毒科病毒可以选自而不限于：木柏病毒(arborvirus)、东部马脑脊髓炎病毒(EEEV)、西部马脑脊髓炎病毒(WEEV)、委内瑞拉马脑脊髓炎病毒(VEEV)、基孔肯雅病毒(CHIKV)、阿尼昂-尼昂病毒(ONNV)、Pogosta病病毒、辛德毕斯病(Sindbis)病毒、罗斯河热病毒(RRV)和塞米利奇森林(Semliki Forest)病毒。

本发明包括实施方案，所述实施方案中病毒是对人类具有致病性的冠状病毒(CoV)，例如可以选自而不限于：SARS-CoV、MERS-CoV、COVID-19(SARS-CoV-2)、CoV 229E、CoV NL63、CoV OC43、CoV HKU1、和CoV HKU20。

在一些实施方案中，所述(-)-(ss)-envRNAV可以选自而不限于：沙粒病毒科、布尼亚病毒科(布尼亚病毒目)、丝状病毒科、正粘病毒科、副粘病毒科、或弹状病毒科的病毒。

在一些实施方案中，沙粒病毒科病毒可以选自而不限于：拉沙(Lassa)病毒、无菌性脑膜炎病毒(aseptic mengitis)、瓜纳瑞托(Guanarito)病毒、胡宁(Junin)病毒、卢霍(Lujo)病毒、马丘波(Machupo)病毒、沙比亚(Sabia)病毒和白水阿罗约(WhitewaterArroyo)病毒。

在一些实施方案中，布尼亚病毒科病毒可以选自而不限于：汉坦病毒(Hantavirus)和克里米亚-刚果出血热内罗病毒(Crimean-Congo hemorrhagic feverorthonairovirus)。

在一些实施方案中，副粘病毒科病毒可以选自而不限于：腮腺炎(Mumps)病毒、尼帕(Nipah)病毒、亨德拉(Hendra)病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、人副流感病毒(HPIV)和NDV。

在一些实施方案中，正粘病毒科病毒可以选自而不限于：流感病毒(甲型(A)至丙型(C))、伊萨病毒(Isavirus)、托戈托病毒(Thogotovirus)、夸兰贾病毒(Quaranjavirus)、H1N1病毒、H2N2病毒、H3N2病毒、H1N2病毒、西班牙流感病毒、亚洲流感病毒、和俄罗斯流感病毒。

在一些实施方案中，弹状病毒科病毒可以选自而不限于：狂犬病病毒、水泡病毒(vesiculovirus)、狂犬病病毒属(Lyssavirus)、和细胞棒状病毒(Cytorhabdovirus)等。

本发明在疾病监控方面，可对疾病做到预测、预防等积极主动管理，做到早期发现早期治疗，或提早预测提早预防。由于本发明的检测灵敏度非常高，适合进行早期诊断，对症下药，节省患者治疗时间，提高治疗成功率。本发明减少高额医疗成本浪费，和争取治疗黄金时机。

在环境监控方面，本发明可便捷、快速的对环境污染物中的核酸分子进行准确鉴定，提供有效的环境检测数据。

本发明优选方案之一如下所述。

条目1.一种扩增与Argonaute酶切兼容的一管式基因编辑核酸检测方法，其包括如下内容：

(1)扩增-酶切兼容的一管式基因编辑核酸检测体系组分。

(2)扩增-酶切一管式检测操作步骤。

条目2.根据条目1所述的扩增-酶切兼容的一管式基因编辑核酸检测冻干体系组分，含有两种体系，分别是LAMP扩增-酶切体系和重组酶聚合酶扩增-酶切体系。

条目3.根据条目2所述的LAMP扩增-酶切体系，所述体系总体积为25-100μL，组分包括(1)酶：4-40U Bst DNA聚合酶、0.5-2U耐高温反转录酶、0.5-4U热稳定无机焦磷酸酶、2-8mg固定化Argonaute核酸酶；(2)缓冲液：0.5-2x Bst Buffer、1-10mM MgCl₂、1.0-3.0mMdNTP；(3)引物和guide DNA(简称gDNA)：0.5-5μM上游gDNA、0.5-5μM下游gDNA、0.5-2x引物，其中1x引物组分为：1.6μM内引物FIP及BIP，0.2μM外引物F3及B3，0.4μM环引物LF及LB；(4)核酸报告分子和核酸模板：0.1-2μM核酸报告分子，5-40μL核酸模板。

条目4.根据条目2所述的重组酶聚合酶扩增-酶切体系，其包括但不限于RPA、RAA、MIRA、ERA四种基于相似功能DNA重组酶的重组酶聚合酶扩增方法，体系总体积20-100μL，组分包括120-250ng UvsX DNA重组酶或具有类似功能的重组酶、300-900ng单链结合蛋白gp32或具有相似功能的突变体蛋白、25-50ng UvsY重组调节蛋白或具有相应功能的突变体蛋白、5-30mM乙酸镁、0.5-2U反转录酶、20-90mM Tris(pH7.9-8.4)、80-100mM乙酸钾、1-10mM二硫苏糖醇、200μMdNTP、1-8mM ATP、20-50mM磷酸肌酸、20-120ng肌酸激酶、10-40ng枯草芽孢杆菌DNA聚合酶大片段Bsu、0.01-0.05U热稳定无机焦磷酸酶、0.5-10mg固定化Argonaute核酸酶、0.5-5μM上游gDNA、0.5-5μM下游gDNA、0.1-2μM核酸报告分子、0.2-1.0μM上游引物、0.2-1.0μM下游引物、5-40μL核酸模板。

条目5.根据条目3、4所述的固定化Argonaute核酸酶，首先，Argonaute核酸酶为已冻干的PfAgo、MfAgo、TtAgo、MpAgo、ThAgo、TpsAgo等耐高温Argonaute酶；其次，Argonaute核酸酶冻干粉末被均匀地包埋于温变相且熔化后透明无色的惰性材料中；最后，已包埋Argonaute核酸酶冻干粉末的惰性材料外层再包裹一层温变相且熔化后透明无色的惰性材料。

所述的PfAgo为来自大肠杆菌表达的耐高温Argonaute酶。

条目6.根据条目5所述的温变相且熔化后透明无色的惰性材料，其包括石蜡、聚乙烯蜡(PE蜡)、聚丙烯蜡(PP蜡)、乙酸乙烯共聚蜡(EVA蜡)、地蜡、明胶、琼脂糖、环氧树脂等。释放后形成膜，可以防止液体蒸发以及气溶胶污染。

条目7.根据条目2所述的LAMP扩增-酶切体系和重组酶聚合酶扩增-酶切体系，可进行冻干实现10-30度常温保存运输。

条目8.根据条目7所述的LAMP扩增-酶切体系和重组酶聚合酶扩增-酶切体系的冻干，其中，冻干保护剂为：2-3％(m/v)甘露醇、2-10％(m/v)海藻糖、1-3％(m/v)聚乙二醇-8000、2-3％(m/v)甘氨酸，冻干程序为：(1)-60℃～-50℃维持10-15h；(2)-50℃～-40℃维持3-5h，抽真空并维持到程序结束；(3)-40℃～-30℃维持1-5h；(4)-35～-25℃维持2-5h；(5)-25～-20℃维持2-5h；(6)-20℃～-10℃维持1-3h；(7)-10℃～0℃维持1-3h；(8)0℃～10℃维持2-5h；(9)10℃～20℃维持3-4h；(10)20℃～30℃维持99h。

条目9.根据条目1所述扩增-酶切一管式检测方法的操作步骤，包括将所述的LAMP扩增-酶切兼容体系放入荧光定量PCR仪、恒温荧光检测仪、便携式荧光检测仪等适应设备中，设置反应程序为：

第一阶段：60-70℃，20-50分钟，不采集荧光信号；

条目10.根据条目1所述扩增-酶切体系一管式检测反应，包括将所述的重组酶聚合酶扩增-剪切兼容体系放入荧光定量PCR仪、恒温荧光检测仪、便携式荧光检测仪等适应设备中，设置反应程序为：

第一阶段：35-45℃，维持20-50分钟，不采集荧光信号；

条目11.一种扩增与Argonaute酶兼容的一管式基因编辑核酸检测方法的应用，其包括但不限于以下类型靶标或同类型靶标的单重或多重核酸检测应用及相关核酸序列：

病原微生物：新型冠状病毒SARS-CoV-2、甲型流感病毒(IAV)、乙型流感病毒(IBV)、非洲猪瘟病毒(ASFV)、猪呼吸与繁殖综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猫疱疹病毒(FHV)；

人类基因组：例如RNase P20。

本发明一方面提供了一种扩增与固定化Argonaute核酸酶兼容的多靶标的一管式基因编辑核酸检测体系组分。

优选的，所述的固定化Argonaute核酸酶为包埋在惰性材料中的冻干酶制剂。

优选的，所述的惰性材料为石蜡、聚乙烯蜡(PE蜡)、聚丙烯蜡(PP蜡)、乙酸乙烯共聚蜡(EVA蜡)、地蜡、明胶、琼脂糖、环氧树脂等。

更优选的，所述的惰性材料为环氧树脂。

优选的，所述的Argonaute核酸酶为已冻干的PfAgo、MfAgo、TtAgo、MpAgo、ThAgo、TpsAgo等耐高温Argonaute酶。

更优选的，所述的Argonaute核酸酶为PfAgo酶。

优选的，所述的单靶标的LAMP扩增-酶切兼容体系试剂的组分为：

(1)酶试剂：4-40U Bst DNA聚合酶、0.5-2U反转录酶、0.5-4U热稳定无机焦磷酸酶、2-8mg固定化Argonaute核酸酶；

(2)缓冲液：1x Bst缓冲液、6-8mM MgCl₂、1-3mM dNTP；

(3)引物和guide DNA：0.5-2μM上游gDNA、0.5-2μM下游gDNA、1x-1.5x引物；其中1x引物组分为：1.6μM内引物FIP及BIP，0.2μM外引物F3及B3，0.4μM环引物LF及LB。

(4)核酸报告分子和核酸模板：0.5-1μM核酸报告分子、5-40μL核酸模板。

优选的，所述的LAMP扩增-酶切兼容体系可以兼容DNA或RNA核酸分子的检测。

优选的，所述的1x引物为LAMP扩增引物。

更优选的，所述的1x引物组分为1.6μM内引物FIP及BIP，外引物0.2μM F3及B3，环引物0.4μM LF及LB。

优选的，所述的反转录酶为耐受55-65℃的ThermoStable V RTase反转录酶。

优选的，所述的核酸报告分子为25-35个碱基的探针分子。

优选的，所述的上游gDNA和下游为5’磷酸化修饰的和3’磷酸化修饰的单链DNA分子。

更优选的，所述的上游gDNA和下游gDNA可以仅使用下游gDNA，检测效率不受显著影响。

优选的，所述的gDNA的长度为15-20个碱基。

更优选的，所述的兼容两种靶标基因片段的LAMP扩增和固定化核酸酶兼容体系试剂的组成为：

(1)酶试剂：8-40U Bst DNA聚合酶、0.5-2U反转录酶、0.5-4U热稳定无机焦磷酸酶、2-8mg固定化核酸酶；

(2)缓冲液：1x Bst缓冲液、6-8mM MgCl₂、1.0-3.0mM dNTP；

(3)引物和guide DNA：0.5-2μM靶标1上游gDNA、0.5-2μM靶标1下游gDNA、0.5-1x靶标1引物，0.5-2μM靶标2上游gDNA、0.5-2μM靶标2下游gDNA、0.5x-1x靶标2引物。

(4)核酸报告分子和核酸模板：0.5-1μM靶标1核酸报告分子、0.5-1μM靶标2核酸报告分子、待测核酸模板为5-40μL。

优选的，所述的0.5-1x引物组分为0.8-1.6μM内引物FIP及BIP，0.1-0.2μM外引物F3及B3和0.2-0.4μM环引物LF及LB。

优选的，所述的LAMP扩增-酶切兼容体系程序为：(1)扩增阶段：控制温度62-65℃，维持30-45分钟，不采集荧光信号；(2)酶切阶段：控制温度92-97℃，维持20-40分钟，期间每15-60秒采集一次对应核酸报告分子荧光标记信号或终点采集荧光信号。

此配方为通过大量实验优选得到，是筛选得到的适合LAMP反应扩增和固定化核酸酶兼容的配方。

优选的，所述的重组酶聚合酶扩增-Argonaute酶切兼容体系试剂的组成为：

(1)酶：120-125ng UvsX或具有类似功能的重组酶、300-900ng单链结合蛋白gp32或具有相似功能的突变体蛋白、25-50ng UvsY重组调节蛋白或具有相应功能的突变体蛋白、0.5-2U反转录酶、15-40ng枯草芽孢杆菌DNA聚合酶大片段Bsu、0.01-0.05U热稳定无机焦磷酸酶、2-8mg固定化核酸酶。

(2)缓冲液和金属离子：5-30mM乙酸镁、50mM Tris(pH7.9-8.4)、80-100mM乙酸钾、1-5mM二硫苏糖醇、5％-5.5％高分子量聚乙二醇、100-300μMdNTPs、1-8mM腺嘌呤核苷三磷酸、20-50mM磷酸肌酸、50-120ng肌酸激酶。

(3)引物、gDNA、核酸模板和核酸报告分子：0.2-1.0μM上游引物、0.2-1.0μM下游引物、0.5-5μM上游gDNA、0.5-5μM下游gDNA、核酸模板为5-40μL、0.1-2μM核酸报告分子。

优选的，所述的上游引物和下游引物为40-45个碱基的单链DNA分子。

优选的，所述的核酸报告分子为25-35个碱基的单链DNA分子探针。

优选的，所述的上游gDNA和下游gDNA为5’磷酸化修饰的和3’磷酸化修饰的单链DNA分子。

优选的，所述的gDNA的长度为10-25个碱基。

优选的，所述的重组酶聚合酶扩增-酶切兼容体系程序为：(1)扩增阶段：控制温度37-42℃，维持30-50分钟，不采集荧光信号；(2)酶切阶段：控制温度90-99℃，维持20-40分钟，期间每15-60秒一个循环，每个循环采集一次对应核酸报告分子荧光标记信号或终点采集荧光信号。

以上组分体系和检测步骤为通过大量实验优选得到，是筛选得到的适合重组酶聚合酶反应扩增和固定化Argonaute核酸酶兼容的配方。

本发明还提供了一种扩增与固定化Argonaute核酸酶兼容的一管式基因编辑核酸检测体系的冻干保护剂。

优选的，所述的冻干保护剂组分配方终浓度为：2.5％(m/v)甘露醇、2％(m/v)海藻糖、2％(m/v)聚乙二醇-8000、2.5％(m/v)甘氨酸。

优选的，所述的一管式形态的冻干程序为：(1)-50℃12h；(2)-40℃3h，这一步抽真空直到结束；(3)-30℃3h；(4)-25℃4h；(5)-20℃2h；(6)-10℃1h；(7)0℃2h；(8)10℃4h；(9)20℃4h；(10)25℃99h。

优选的，所述的冻干组分可以加入离心管、西林瓶或直接分装于PCR管中进行冻干。

优选的，所述的冻干保护剂组分与LAMP扩增-酶切兼容体系同时进行冻干后的冻干产品形态良好，可以在25℃下储存180天。

本发明相对于现有技术的有益效果包括：

1.本发明所述的检测方法实现了一管式的基因编辑检测，且灵敏度和检测速度与中途开盖两步法基本一致，解决了基因编辑检测开盖污染、操作繁琐以及液体蒸发造成的荧光曲线波动及组分体系不稳定的问题。

2.本发明所述的检测试剂可以25℃保存半年，37℃保存4周或2-8℃保存1年甚至更长，可以常温运输。

3.本发明所述的单重或多重基因编辑检测系统可以满足多种病原微生物或人类动物基因组单重或多重的检测。

4.本技术的多重体系的满足依赖于不同探针分子上添加的不同波长的荧光分子，特异性较常规等温扩增大幅提升。

5.本技术所用的gDNA可以是只添加一种下游gDNA，效果可以满足检测需求，设计更为简单，成本更低。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

序列列表：

1.新型冠状病毒SARS-CoV-2(简称新冠)

SEQ ID NO.1N-F3：5'-AACACAAGCTTTCGGCAG-3'

SEQ ID NO.2N-B3：5'-GAAATTTGGATCTTTGTCATCC-3'

SEQ ID NO.3N-FIP：5'-TGCGGCCAATGTTTGTAATCAGCCAAGGAAATTTTGGGGAC-3'

SEQ ID NO.4N-BIP：5'-CGCATTGGCATGGAAGTCACTTTGATGGCACCTGTGTAG-3'

SEQ ID NO.5N-LF：5'-TTCCTTGTCTGATTAGTTC-3'

SEQ ID NO.6N-LB：5'-ACCTTCGGGAACGTGGTT-3'

SEQ ID NO.7N-gDNA1：5'-Phosphate-TCCAGCGCTTCAGCGT-3'-Phosphate

SEQ ID NO.8N-gDNA2：5'-Phosphate-TCTTCGGAATGTCGCG-3'-Phosphate

SEQ ID NO.9N-reporter：5'-ROX-TCTTCAGCGTTCTTCGGAATGTCGCGCA-3'-BHQ2

2.甲型流感(IAV)

SEQ ID NO.10IAV-F3：5'-TTTCTATCATCCCRTCAGGC-3'

SEQ ID NO.11IAV-B3：5'-TCGGGTCCCCATTCCCATT-3'

SEQ ID NO.12IAV-FIP：5'-TTAGCCATTCCATGAGAGCCTCRAGCCCCTCAAAGCCGAGATC-3'

SEQ ID NO.13IAV-BIP：5'-TTGTGTTCACGCTCACCGTGCTTTTGGACAAAGCGYCTACG-3'

SEQ ID NO.14IAV-LF1：5'-CTGTGTTCTTTCCTGCAAARACA-3'

SEQ ID NO.15IAV-LB1：5'-CAGTGAGCGAGGACTGCA-3'

SEQ ID NO.16IAV-gDNA1：5'-phosphate-TAGACAAGACCAATCT-3'-phosphate

SEQ ID NO.17IAV-gDNA2：5'-phosphate-TGTCACCTCTGACTAA-3'-phosphate

SEQ ID NO.18IAV-Reporter：5'-FAM-TACCAGTCAATCTTGTCACCTCTTACCAGT-3'-BHQ2

3.乙型流感(IBV)

SEQ ID NO.19IBV-F3：5'-CAAATCAAACAGAAGACGGA-3'

SEQ ID NO.20IBV-B3：5'-GCTTTTGTTTAATCCACCGT-3'

SEQ ID NO.21IBV-FIP：5'-ACCTCTTTGATAGRYAATTGTTCCAAAGTGGCAGAATTGTTGTTGA-3'

SEQ ID NO.22IBV-BIP：5'-CAAGTGGCAGGAGCAARGTAATTTTTCATGGAGGCAATC-3'

SEQ ID NO.23IBV-LF：5'-GTTTTTCCAGATTTYTGCACCATG-3'

SEQ ID NO.24IBV-LB：5'-GGATCCTTGCCCTTAATTGGWGAAG-3'

SEQ ID NO.25IBV-gDNA1：5'-phosphate-TATTTTATTGCCTCAA-3'-phosphate

SEQ ID NO.26IBV-gDNA2：5'-phosphate-TAGGTGTGGTGCGCAA-3'-phosphate

SEQ ID NO.27IBV-Reporter：5'-VIC-TTTATTGCCTCAAAAGGTGTGGTGCGCA-3'-BHQ2

5.非洲猪瘟病毒(ASFV)

SEQ ID NO.28ASFV-F3：5'-TTCCAGGTAGGTTTTAATCCT-3'

SEQ ID NO.29ASFV-B3：5'-GTAGACGCAATATACGCTTTA-3'

SEQ ID NO.30ASFV-FIP：5'-GGTGACCCACACCAACAATAACTGGGCCATTTAAGAGCAG-3'

SEQ ID NO.31ASFV-BIP：5'-CAAAAAGGTTGTGTATTTCAGGGGTGGTTTATCCCAGGAGTCATT-3'

SEQ ID NO.32ASFV-LF：5'-CACCACGATGAAAAACTAATGT-3'

SEQ ID NO.33ASFV-LB：5'-TTCATTATTCGTGAGCGAGAT-3'

SEQ ID NO.34ASFV-gDNA1：5'-phosphate-TGCGTTTTATGGACAC-3'-phosphate

SEQ ID NO.35ASFV-gDNA2：5'-phosphate-TTATCAGGGAAAATCG-3'-phosphate

SEQ ID NO.36ASFV-Reporter：5'-FAM-TTATGGACACGTATCAGGGAAAATCGAACG-3'-BHQ1

6.人核糖核酸酶P基因(RNase P20)

SEQ ID NO.37RNaseP20-FIP：5'-GTGTGACCCTGAAGACTCGGTTTTAGCCACTGACTCGGATC-3'

SEQ ID NO.38RNaseP20-BIP：5'-CCTCCGTGATATGGCTCTTCGTTTTTTTCTTACATGGCTCTGGTC-3'

SEQ ID NO.39RNaseP20-LF：5'-ATGTGGATGGCTGAGTTGTT-3'

SEQ ID NO.40RNaseP20-LB：5'-CATGCTGAGTACTGGACCTC-3'

SEQ ID NO.41RNaseP20-F3：5'-TTGATGAGCTGGAGCCA-3'

SEQ ID NO.42RNaseP20-B3：5'-CACCCTCAATGCAGAGTC-3'

SEQ ID NO.43RNaseP20-gDNA1：5'-phosphate-TATCACGGAGGGGATA-3'-phosphate

SEQ ID NO.44RNaseP20-gDNA2：5'-phosphate-TGTGGAGGAGTGTCTT-3'-phosphate

SEQ ID NO.45RNaseP20-Reporter：5'-VIC-TCACGGAGGGGATAAGTGGAGGAGTGTCTT-3'-BHQ2

8.猪圆环病毒2型(PCV2)

SEQ ID NO.46PCV2-FIP：5'-GTTACAGGGTGCTGCTCTGCGACCTGTCTACTGCTGTG-3'

SEQ ID NO.47PCV2-BIP：5'-CGTGATTGGAAGACGAATGTACACCCAGTATGTGGTTTCCGG-3'

SEQ ID NO.48PCV2-LF：5'-CCGCTCTCCAACAAGGTACT-3'

SEQ ID NO.49PCV2-LB：5'-ATTGTGGGGCCACCTGG-3'

SEQ ID NO.50PCV2-F3：5'-GATCTCAAGGACAACGGA-3'

SEQ ID NO.51PCV2-B3：5'-CCACTTGTTTCTAGGTGGTT-3'

SEQ ID NO.52PCV2-gDNA1：5'-phosphate-TCTGAACTTTTGAAAG-3'

SEQ ID NO.53PC2-gDNA2：5'-phosphate-TGAGCGGGAAAATGCA-3'

SEQ ID NO.54PCV2-Reporter：5'-FAM-CTGAACTTTTGAAAGTGAGCGGGAAAATGC-3-BHQ1'

9.猫疱疹病毒(FHV)

SEQ ID NO.55FHV-FIP：5'-AGCCTATTCCGTTCATAGTGGGAAAAAAATACTAGTTGGCGTGAT-3'

SEQ ID NO.56FHV-BIP：5'-TTCAGTGTTTTCAAAGCCCGG-CCCATGCATGCATGTCAA-3'

SEQ ID NO.57FHV-LF：5'-GTTAAAAATTTCTTAGTA-3'

SEQ ID NO.58FHV-LB：5'-GAGCTCTCCGACCAAAATGG-3'

SEQ ID NO.59FHV-F3：5'-GCAATGTATATATGATGTTGGTACA-3'

SEQ ID NO.60FHV-B3：5'-TCCATAAGTCCATCGAGGA-3'

SEQ ID NO.61FHV-gDNA1：5'-phosphate-TACAATAGTTTCCGAT-3'

SEQ ID NO.62FHV-gDNA2：5'-phosphate-TCGACGGAGTCAGATT-3'

SEQ ID NO.63FHV-Reporter：5'-FAM-ACAATAGTTTCCGATTCGACGGAGTCAGAT-3'-BHQ1

10.猪繁殖与呼吸综合征

SEQ ID NO.64PRRSV-FIP：5'-GTGCAGAAGCCCTAGCAGTCGTTTTCTATTACCTACACGCC-3'

SEQ ID NO.65PRRSV-BIP：5'-TTCAGAGTACAAATAAGGTCGCGCGGTTTCTATGGCTGAGTACAC-3'

SEQ ID NO.66PRRSV-LF：5'-CGACTCACCTTTAGGGCATATATC-3'

SEQ ID NO.67PRRSV-LB：5'-CACTATGGGAGCAGTAGTTGC-3'

SEQ ID NO.68PRRSV-F3：5'-ACAAAAGGTGCTTTTGGC-3'

SEQ ID NO.69PRRSV-B3：5'-TCTGGAGGTGATGAATTTCC-3'

SEQ ID NO.70PRRSV-gDNA1：5'-phosphate-TCTGCACCTTTTGATC-3'

SEQ ID NO.71PRRSV-gDNA2：5'-phosphate-TTCCTGAATTGTGCTT-3'

SEQ ID NO.72PRRSV-Reporter：5'-FAM-CTGCACCTTTTGATCTTCCTGAATTGTGCT-3'-BHQ1

11.猪流行性腹泻病毒

SEQ ID NO.73PEDV-FIP：5'-TGGGTCCGAAGCAAGCTGAGACATCCCAGAGTGGAGG-3'

SEQ ID NO.74PEDV-BIP：5'-TTGGAGATGCGGAATTTGTCGAACTGGCGATCTGAGCATAG-3'

SEQ ID NO.75PEDV-LF：5'-GCTATTTTCGCCCTTGGGA-3'

SEQ ID NO.76PEDV-LB：5'-AGGTGTTGATGCCTCAGG-3'

SEQ ID NO.77PEDV-F3：5'-CTTCGAAGGAACGTGACCT-3'

SEQ ID NO.78PEDV-B3：5'-CAATGCTGCAACATTTGGT-3'

SEQ ID NO.79PEDV-gDNA1：5'-phosphate-GACCCAGGGGAGGCTT-phosphate-3'

SEQ ID NO.80PEDV-gDNA2：5'-phosphate-CAAAAATTTTGGAGAT-phosphate-3'

SEQ ID NO.81PEDV-Reporter；5'-FAM-CCAGGGGAGGCTTCAAAAATTTTGGAGA-3'-BHQ1

12.新型冠状病毒的重组酶聚合酶扩增-剪切反应

SEQ ID NO.82RAA-N-F1：5'-CTCTTCTCGTTCCTCATCACGTAGTCGCAAC-3

SEQ ID NO.83RAA-N-R1：5'-ACATTTTGCTCTCAAGCTGGTTCAATCTGTCA-3

SEQ ID NO.84RAA-N-gDNA1：5'-phosphate-TTCAAGAAATTCAACT-3'-phosphate-

SEQ ID NO.85RAA-N-gDNA2：5'-phosphate-TCAGGCAGCAGTAGGG-3'-phosphate-

SEQ ID NO.86RAA-N-Reporter：5'-FAM-CAAGAAATTCAACTCCAGGCAGCAGTAGGG-3'-BHQ1

实施例

下面结合实施例和附图对本发明做进一步详细的描述，但发明点实施方式不限于此。

实施例1LAMP扩增-Argonaute固定化核酸酶剪切一管式冻干试剂制备

以新型冠状病毒SARS-CoV-2的N基因为例，冻干形态的预分装LAMP扩增-Argonaute核酸酶剪切一管式检测的配置步骤如下：

单个反应的反应体系具体成分如下：

上表中除了固定化Argonaute核酸酶外所有组分按照反应的数量进行配置后，分装到8联管中，进行冻干处理。

程序设置为(1)-50℃12h；(2)-40℃3h，这一步抽真空直到结束；(3)-30℃3h；(4)-25℃4h；(5)-20℃2h；(6)-10℃1h；(7)0℃2h；(8)10℃4h；(9)20℃4h；(10)25℃99h。

处理后添加1粒高活性的固定化Argonaute核酸酶颗粒，如图1所示。8联管的每个反应孔包含冻干后的反应组分和1粒固定化Argonaute核酸酶颗粒。颗粒数根据酶活力和颗粒大小决定，保证酶的终浓度在2-5mg/μL。此冻干试剂可以常温储存30天，运输时采用常温或冰袋运输。使用时，在冻干组分中添加20μL无酶水复融后，添加待测核酸分子，或者5μL阴性对照。程序选择65摄氏度40min；后95℃40min，每1min采集一次ROX通道的荧光信号。质粒浓度设置的梯度依次是3000拷贝每微升、300拷贝每微升、30拷贝每微升、3拷贝每微升、0.3拷贝每微升。结果如图2所示，预分装LAMP扩增-Argonaute固定化核酸酶剪切一管式冻干试剂的灵敏度为3拷贝每微升。

实施例2单靶标LAMP扩增-Argonaute核酸酶剪切一管式检测结果

一、新型冠状病毒SARS-CoV-2假病毒免提取N基因LAMP扩增-Argonaute核酸酶剪切一管式检测

新型冠状病毒SARS-CoV-2假病毒含有N基因和ORF1ab基因片段。

检测试剂的组分如下表所示：

上表中组分配置后，添加模板，放置在荧光定量仪器上进行扩增-酶切反应，程序设置为65℃保持40分钟；95℃保持40分钟，期间每30秒采集一次ROX通道的荧光信号。模板为阴性对照、待测的假病毒样本，其中假病毒的拷贝数为600拷贝每微升、60拷贝每微升、6拷贝每微升、0.6拷贝每微升。

结果如图3所示，新型冠状病毒SARS-CoV-2假病毒免提取N基因LAMP扩增-Argonaute核酸酶剪切一管式检测的灵敏度为6拷贝每微升。

二、非洲猪瘟病毒(ASFV)的LAMP扩增-Argonaute核酸酶剪切一管式检测

非洲猪瘟的一管式检测试剂的组分如下表所示：

组分	用量
		Bst酶(8U/μL)	0.8μL
20U/μL耐高温反转录酶	0.2μL
		dNTPs(10mM)	3.5μL
MgCl₂(100mM)	1.5μL
		10x Bst缓冲液	2.5μL
2U/μL热稳定无机焦磷酸酶	0.5μL
		固定化Argonaute核酸酶	1粒
20x ASFV引物	1.25μL
		ASFV-gDNA1(100μM)	0.5μL
ASFV-gDNA2(100μM)	0.5μL
		ASFV-Reporter(10μM)	2μL
无酶水	0.25μL

上表中组分配置后，添加模板，放置在荧光定量仪器上进行扩增-酶切反应，程序设置为65℃保持40分钟；95℃保持40分钟，期间每60秒采集一次FAM通道的荧光信号。模板为阴性对照、含有非洲猪瘟的P72基因的质粒。

ASFV质粒浓度设置的梯度依次是3000拷贝每微升、300拷贝每微升、30拷贝每微升、3拷贝每微升、0.3拷贝每微升。结果如图4所示，非洲猪瘟病毒的LAMP扩增-Argonaute固定化核酸酶剪切一管式检测的灵敏度为3拷贝每微升。

三、猪圆环病毒2型PCV2的LAMP扩增-Argonaute核酸酶剪切一管式检测

猪圆环病毒2型的一管式检测试剂的组分如下表所示：

上表中组分配置后，添加模板，放置在荧光定量仪器上进行扩增-酶切反应，程序设置为65℃保持40分钟；95℃保持20分钟，期间每60秒采集一次FAM通道的荧光信号。模板为阴性对照、含有猪圆环病毒序列的质粒。

猪圆环病毒质粒浓度设置的梯度依次是3000拷贝每微升、300拷贝每微升、30拷贝每微升、3拷贝每微升、0.3拷贝每微升。结果如图5所示，PCV2的LAMP扩增-Argonaute固定化核酸酶剪切一管式检测的灵敏度为0.3拷贝每微升。

四、猪蓝耳病毒(PRRSV)的LAMP扩增-Argonaute核酸酶剪切一管式检测

猪蓝耳病毒的一管式检测试剂的组分如下表所示：

组分	用量
		8U/μL Bst酶	0.8μL
20U/μL耐高温反转录酶	0.2μL
		dNTPs(10mM)	3.5μL
MgCl₂(100mM)	1.5μL
		10x Bst缓冲液	2.5μL
2U/μL热稳定无机焦磷酸酶	0.5μL
		固定化Argonaute核酸酶	1粒
20xPRRSV引物	1.25μL
		PRRSV-gDNA1(100μM)	0.5μL
PRRSV-gDNA2(100μM)	0.5μL
		PRRSV-Reporter(10μM)	2μL
无酶水	0.25μL

上表中组分配置后，添加模板，放置在荧光定量仪器上进行扩增-酶切反应，程序设置为65℃保持30分钟；95℃保持40分钟，期间每60秒采集一次ROX通道的荧光信号。模板为阴性对照、含有猪蓝耳病毒的质粒。

猪蓝耳病毒质粒浓度设置的梯度依次是3000拷贝每微升、300拷贝每微升、30拷贝每微升、3拷贝每微升、0.3拷贝每微升。结果如图6所示，PRRSV的LAMP扩增-Argonaute固定化核酸酶剪切一管式检测的灵敏度为0.3拷贝每微升。

五、猫疱疹病毒(FHV)的LAMP扩增-Argonaute核酸酶剪切一管式检测

猫疱疹病毒的一管式检测试剂的组分如下表所示：

上表中组分配置后，添加模板，放置在荧光定量仪器上进行扩增-酶切反应，程序设置为65℃保持30分钟；95℃保持20分钟，期间每60秒采集一次FAM通道的荧光信号。模板为阴性对照、含有猫疱疹病毒的质粒。

猫疱疹病毒片段的质粒浓度设置的梯度依次是3000拷贝每微升、300拷贝每微升、30拷贝每微升、3拷贝每微升、0.3拷贝每微升。结果如图7所示，FHV的LAMP扩增-Argonaute固定化核酸酶剪切一管式检测的灵敏度为0.3拷贝每微升。

实施例3LAMP扩增-酶切双重靶标的一管式检测反应

一、新型冠状病毒和甲流双靶标的LAMP扩增-酶切一管式检测的反应成分如下表所示：

上表中组分配置后，添加5μL待测模板，放置在荧光定量仪器上进行扩增-酶切反应，并在酶切步骤实时采集FAM和ROX双通道的荧光信号。模板为阴性对照、含有新型冠状病毒N基因的质粒和含有甲流病毒的质粒。

新型冠状病毒N基因和甲流病毒的质粒浓度设置的梯度依次是3000拷贝每微升、300拷贝每微升、30拷贝每微升、3拷贝每微升、0.3拷贝每微升。结果如图8所示，新型冠状病毒和甲流病毒双重靶标的LAMP扩增-Argonaute固定化核酸酶剪切一管式检测的灵敏度新型冠状病毒的N基因质粒为30拷贝每微升、甲流质粒的为30拷贝每微升。

二、新型冠状病毒SARS-CoV-2的N基因和人类RNase P20基因双靶标的LAMP扩增-酶切一管式检测的反应成分如下表所示：

上表中组分配置后，添加5μL待测模板，放置在荧光定量仪器上进行扩增-酶切反应，并在酶切步骤实时采集FAM和ROX双通道的荧光信号。模板为阴性对照、含有新型冠状病毒的质粒和含有人内参基因的质粒。

新型冠状病毒N基因和人类RNase P20基因的质粒浓度设置的梯度依次是3000拷贝每微升、300拷贝每微升、30拷贝每微升、3拷贝每微升、0.3拷贝每微升。结果如图9所示，新型冠状病毒N基因和人类RNase P20基因双重靶标的LAMP扩增-Argonaute固定化核酸酶剪切一管式检测条件下，新型冠状病毒的N基因质粒的灵敏度为30拷贝每微升、人类RNaseP20基因的灵敏度为30拷贝每微升。

实施例4RAA扩增-酶切一管式检测试剂制备

重组酶聚合酶扩增-酶切一管式检测的反应成分如下表所示：

上表中组分配置后，添加10μL待测模板，放置在荧光定量仪器上进行扩增-酶切反应，程序设置为37℃保持30分钟；95℃30s，40个循环，此步收集一次FAM通道的荧光信号。模板为阴性对照、含有新型冠状病毒的质粒。

新型冠状病毒N基因片段的质粒浓度设置的梯度依次是3000拷贝每微升、300拷贝每微升、30拷贝每微升、3拷贝每微升、0.3拷贝每微升。结果如图10所示，N基因质粒的RAA扩增-Argonaute固定化核酸酶剪切一管式检测的灵敏度为0.3拷贝每微升。

实施例5非洲猪瘟双gDNA与下游gDNA检测

非洲猪瘟双gDNA和单个gDNA一管式检测结果的比较，配置反应体系：

(1)双gDNA体系

(2)单gDNA体系

配置完成后添加5μL模板，进行LAMP扩增-酶切反应。程序设置为65℃保持40分钟；95℃保持30分钟，每60秒收集一次FAM荧光通道的信号，结果如图11所示。

模板为包含非洲猪瘟的质粒分子，拷贝数分别为3000拷贝每微升、300拷贝每微升、30拷贝每微升、3拷贝每微升、0.3拷贝每微升。结果如图11所示，双gDNA和下游gDNA非洲猪瘟质粒的LAMP扩增-Argonaute固定化核酸酶剪切一管式检测的灵敏度均为3拷贝每微升，且曲线较为一致。

结果显示此反应条件下，双gDNA的灵敏度和单gDNA的灵敏度一致。

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，是一种优选的实施例，其目的在于本专业领域技术人员能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限定本发明的保护范围。凡根据本发明的原理所作的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种一管式核酸检测反应体系，其特征在于，所述反应体系含有，扩增体系和包含固定化Argonaute核酸酶的酶切体系。

2.如权利要求1所述的反应体系，其特征在于，所述扩增包括LAMP扩增、重组酶聚合酶扩增。

3.如权利要求2所述的反应体系，其特征在于，所述重组酶聚合酶扩增包括RPA、RAA、MIRA、ERA、或其组合。

4.如权利要求1所述的反应体系，其特征在于，所述Argonaute核酸酶包括耐高温Argonaute核酸酶。

5.如权利要求4所述的反应体系，其特征在于，所述耐高温Argonaute核酸酶包括PfAgo、MfAgo、TtAgo、MpAgo、ThAgo、TpsAgo、或其组合。

6.如权利要求4所述的反应体系，其特征在于，所述固定化Argonaute核酸酶包括所述耐高温Argonaute核酸酶的冻干剂型。

7.如权利要求1所述的反应体系，其特征在于，所述核酸检测包括单个和多重核酸检测。

8.如权利要求1所述的反应体系，其特征在于，所述核酸来自以下物种：

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)、甲型流感病毒(IAV)、乙型流感病毒(IBV)、非洲猪瘟病毒(AFSV)、猪呼吸与繁殖综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猫疱疹病毒(FHV)、或其组合。

9.一种用于核酸靶标检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有，如权利要求1所述的检测体系或用于配制所述检测体系的试剂、描述使用所述检测体系检测靶核酸的方法的使用说明书、或其组合。

10.一种检测样本中是否存在靶标核酸分子的方法，包括以下步骤：

(a)提供如权利要求1所述的检测体系；和