CN119569836B

CN119569836B - Rsv f蛋白突变体及其应用

Info

Publication number: CN119569836B
Application number: CN202510136318.0A
Authority: CN
Inventors: 张年; 张超; 陶璐; 黄放; 王倩; 黄倩; 何刚; 周冬梅; 张敬武; 韩振; 段梦奇
Original assignee: Fosun Antekin Chengdu Biopharmaceutical Co ltd
Current assignee: Fosun Antekin Chengdu Biopharmaceutical Co ltd
Priority date: 2025-02-07
Filing date: 2025-02-07
Publication date: 2025-07-15
Anticipated expiration: 2045-02-07
Also published as: CN120192386A; CN120192385B; CN119569836A; CN120192385A

Abstract

本发明涉及RSV F蛋白突变体及其应用，属于疫苗领域。基于野生型RSV F蛋白的氨基酸序列，本发明进行了多个方面、多种方式的改造，包括二硫键突变、脯氨酸突变、空腔填充突变、静电突变、p27序列改造和/或三聚化结构域改造，设计得到了多种RSV F蛋白突变体。然后，通过进行基因合成、表达和ELISA检测，本发明对RSV F蛋白突变体的融合前构象（pre‑F）比例、高温和低温条件下稳定性进行了测试，筛选出融合前构象比例较高且结构稳定的若干RSV F蛋白突变体。最后，选择候选抗原代表进行了免疫原性检测，证明了其具有较好的免疫原性，可用于开发RSV疫苗、制备RSV特异性抗体或RSV检测试剂。

Description

RSV F蛋白突变体及其应用

技术领域

本发明涉及RSV F蛋白突变体及其应用，属于疫苗领域。

背景技术

呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus, RSV）是一种单股负链RNA病毒，属副黏病毒科，有A、B两种亚型。RSV为直接接触传播，感染后可引起支气管炎、肺炎、哮喘及呼吸衰竭等症状。RSV是引起全球儿童呼吸道感染的首要病原体，也可引起婴幼儿、老年人及免疫功能受损人群呼吸道及肺部严重感染。目前有两款国外上市的人源化单克隆抗体（Palivizumab帕利珠单抗和Nirsevimab尼塞韦单抗）用于帮助预防RSV感染，但此种被动免疫形成的保护持续时间较短，需多次注射且单克隆抗体价格十分昂贵。预防性疫苗方面国外已有三款RSV疫苗获批上市，包括GSK公司的Arexvy，辉瑞公司的Abrysvo以及Modena公司的mRESVIA，但国内尚无上市的RSV预防性疫苗。因此，开发安全高效且经济实惠的疫苗对预防和控制RSV感染具有重要的意义。

RSV基因组长15.2kb，编码11个蛋白。其中黏附蛋白（Attachment protein, G)和融合蛋白（Fusion protein, F）是病毒膜表面主要的糖蛋白，也是病毒入侵人体的关键，因此是疫苗研究主要的抗原蛋白。G蛋白帮助病毒颗粒识别并附着到宿主细胞表面的受体上。F蛋白可以促使病毒颗粒和宿主细胞膜之间发生融合，从而使病毒核壳得以进入宿主细胞内。在与宿主细胞膜融合期间，F蛋白会由亚稳定的融合前构象（Pre-F）变为稳定的融合后构象（Post-F）。相比于G蛋白，F蛋白在RSV中更加的保守，是开发疫苗的良好抗原蛋白。F蛋白前体F0包含574个氨基酸，氨基酸残基110-136之间的27个氨基酸短肽（p27）会被弗林蛋白酶水解释放，并形成F1（137-574aa）和 F2（26-109aa）两个亚基。两个亚基通过二硫键连接，三个F1+F2亚基会形成成熟的F蛋白三聚体结构。F1亚基包含负责插入相邻宿主细胞膜的融合肽（Fusion peptide, FP）及七肽重复区Heptad repeat A（HRA）和Heptad repeat B（HRB)。HRA和HRB在Pre-F时是分离状态，膜融合时HRB对接HRA卷曲螺旋并形成稳定的六角形螺旋状结构，产生稳定的Post-F。在F1亚基C端还包含跨膜区（525-550aa）及胞内区（551-574aa)。

近年来，科学家们利用结构生物学等手段解析了F蛋白从Pre-F结构到Post-F的过程，并发现了与中和活性相关的抗原表位。其中Site Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ共同存在于Pre-F和Post-F构象中，并能被具有中和活性的抗体识别，如131-2a（Site Ⅰ)，Motavizumab（Site II)及101F/mAb19（Site IV)等抗体。同时，科学家们发现了Pre-F结构特有的中和抗体表位，包括Site Ø，Site V及横跨两个单体之间的抗原表位（Quaternary cleavage-dependentepitope)。这些表位能与强效的中和抗体结合，如D25（Site Ø), hRSV90（Site V)及AM14（Quaternary cleavage-dependent epitope)等。因此Pre-F结构相比于Post-F结构能诱导出更高滴度的强效中和抗体产生，是研发RSV疫苗的关键。目前国外已有基于Pre-F结构的RSV疫苗在临床上取得较高保护率并成功上市。美国国家过敏和传染病研究所（NIAID)团队设计了名为“DS-Cav1”的蛋白突变体，通过位点突变形成二硫键（S155C, S290C）及填充结构空腔（S190F, V207L）来稳定Pre-F结构（Jason S. McLellan, et al., Science,2013）。辉瑞公司设的“847”蛋白突变体通过位点突变形成二硫键（T103C，I148C），填充结构空腔（S190I）以及引入静电突变（D486S）来产生稳定的Pre-F结构（Ye Che, et al.,Science Translational Medicine, 2023)。此外杨森制药公司（Janssen）设计的“SC-TM”蛋白突变体通过刚性氨基酸突变（S215P)，空腔填充（N67I）及静电突变（E487Q）也得到了较稳定的Pre-F结构（Anders Krarup，et al., Nature communication, 2015)。目前在国内还未有基于Pre-F结构的RSV疫苗成功上市。同时，当前构建Pre-F结构的策略也存在蛋白表达量低，结构稳定性不足等问题。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了多种野生型RSV F蛋白的突变体。通过对野生型RSV F蛋白进行氨基酸序列突变，所述突变包括氨基酸的取代、缺失或添加，该突变体能提升Pre-F结构的蛋白表达量和稳定性，有助于RSV感染的预防、诊断和治疗。

为解决上述技术问题，本发明具体的技术方案如下：

第一方面，本发明提供了一种野生型RSV F蛋白的突变体，所述突变体相对于所述野生型RSV F蛋白存在以下至少一种修饰：

（a）至少一个工程化改造的二硫键突变；

（b）至少一个空腔填充突变；

（c）至少一个静电突变；

（d）至少一个脯氨酸突变；

（e）p27序列的改造：删除包含p27的序列；

（f）三聚化结构域改造：删除跨膜区及胞内区并添加包含三聚化结构域的氨基酸序列。

下文关于氨基酸序列位置的描述，均为基于SEQ ID NO.1所示的野生型RSV F蛋白的氨基酸序列所确定。

工程改造的二硫键突变是指野生型RSV F蛋白中至少一对氨基酸残基突变为一对半胱氨酸残基（Cys，C）以在二者之间形成二硫键，所述突变为半胱氨酸的残基在RSV F蛋白融合前构型（pre F）中接近但在融合后构型（Post F）中远离，因此，引入的一对半胱氨酸残基之间形成二硫键可以稳定RSV F蛋白的的融合前构型（pre F）。在可选的实施方式中，所述至少一种修饰包含RSV F蛋白F1亚基和/或F2亚基中至少一对氨基酸残基被半胱氨酸（Cys，C）取代形成工程化改造的二硫键。在可选的实施方式中，所述工程化改造的二硫键突变包含野生型RSV F蛋白氨基酸序列位置106+144、486+487、104+146、104+147、104+148、105+145、105+146、105+147、34+471、171+191、60+196和105+370中至少一对。优选的，所述二硫键突变包含R106C+V144C、N104C+I148C、N105C+A147C、D486C+E487C、E60C+K196C和S/N105C+M370C中至少一对。

空腔填充的目标替代氨基酸包括小脂族氨基酸(例如Gly、Ala和Val)或小极性氨基酸(例如Ser和Thr)，通过将这些氨基酸替换为侧链较大的大脂族氨基酸(Ile、Leu和Met)或大芳族氨基酸(His、Phe、Tyr和Trp)，以填充结构空腔，稳定Pre-F构象。在可选的实施方式中，所述空腔填充突变是野生型RSV F蛋白氨基酸序列第190位氨基酸突变为异亮氨酸（Ile，I）、缬氨酸（Val，V)、亮氨酸（Leu，L)和色氨酸（Trp，W)。优选的，所述空腔填充突变包含位置190S突变为I、V、L、和W任意一种氨基酸。

静电突变是利用氨基酸突变减少蛋白折叠结构中彼此靠近残基之间的离子排斥。在可选的实施方式中，所述静电突变包含野生型RSV F蛋白氨基酸序列第486、487或489位氨基酸突变为天冬酰胺（Asn，N）、谷氨酰胺（Gln，Q）、苏氨酸（Thr，T）或脯氨酸（Pro，P）。优选的，所述静电突变包含位置486D突变为N或Q、位置487E突变为T、位置489D突变为P或Q。

脯氨酸突变的又称为刚性氨基酸突变，其目的是利用脯氨酸独特的环状结构和几何构象限制，在多肽主链的转角区域或特定关键位置稳定蛋白质的正确折叠构象，从而减少错误折叠或解折叠的可能性，提高蛋白的结构稳定性。在可选的实施方式中，所述脯氨酸突变包含位置210、211、212、213、214、215、216、217、218、490、210+212、211+213、212+214、214+216、216+218、213+214+216和211+212+214氨基酸突变为P和/或G。优选的，所述脯氨酸突变包含Q210P、S211P、C212P、S213P、I214P、S215P、N216P、I217P、E218P、Q210P+C212P、S211P+S213P、C212P+I214P、I214P+N216P、S215P+A490P、N216P+E218P、S213G+I214P+N216G或S211G+C212P+I214G。

p27序列改造是指在野生型RSV F基础上删除p27序列，其目的是删除弗林蛋白酶切割位点，采用共价键或连接肽将F1和F2亚基连接，以稳定Pre-F构象。弗林蛋白酶一般在蛋白质的R-X-K/R-R后方进行切割（其中R代表精氨酸，K代表赖氨酸，X代表任一氨基酸），结合野生型RSV F蛋白的序列（SEQ ID NO:1）可知，弗林蛋白酶切割位点位于RSV F第109位和第136位氨基酸残基后方，故p27序列是指RSV F蛋白第110~136位氨基酸残基片段（aa 110–136）。本发明中，p27序列改造是指在RSV F蛋白基础上删除包含p27在内的片段，所删除的片段可以比p27略长，例如，在可选的实施方式中，所述p27序列改造是指在野生型RSV F蛋白氨基酸序列基础上，第103~145、104~148或105~147位氨基酸之间的片段被删除或删除后被连接肽取代（前述“之间”不含所给出的数据范围的端值），所述连接肽氨基酸序列可以是GS、GSGS、GGGS等常见形式。优选的，所述p27序列改造选自：N104-I148、N104-GS-I148、S/N105-A147、S/N105-GS-A147或T103-GS-G145，表示保留该数据范围端值对应的氨基酸残基并删除其之间的片段，或进一步用GS代替所删除的片段。

三聚化结构域改造是指在野生型RSV F基础上删除包含跨膜区及胞内区的序列，并添加包含三聚化结构域的氨基酸序列，其目的是促进F蛋白形成三聚体构象，维持其天然构象。所述跨膜区及胞内区，是指位于野生型RSV F蛋白C端的跨膜区（aa 525-550）及胞内区（aa 551-574）；所述三聚化结构域可以选择异源三聚化结构域例如Foldon结构域，或者基于RSV F胞内区片段改造得到的半胱氨酸拉链三聚化结构域等。（1）所述Foldon三聚化结构域是指在噬菌体T4纤维蛋白的C-末端的残基，在本申请中，Foldon结构域可以是噬菌体T4纤维蛋白的C-末端的27个残基或其突变体，在可选的实施方式中，所述Foldon三聚化结构域氨基酸序列为GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL；作为可选的实施方式，所述删除跨膜区及胞内区并添加包含三聚化结构域的氨基酸序列是指，在野生型RSV F蛋白C端删除aa 514~574（涵盖跨膜区及胞内区），并添加接头序列（如SAIG）和前述的Foldon三聚化结构域。（2）所述半胱氨酸拉链三聚化结构域是指包含4对半胱氨酸突变的序列，其可以是ABCD-tag或ABCH-tag，在可选的实施方式中，所述ABCD-tag三聚化结构域氨基酸序列为CCHNVNACCSTTNICCTTTNICCTT，所述ABCH-tag三聚化结构域氨基酸序列为CCHNVNACCSTTNICCTTIIICCIV；作为可选的实施方式，所述删除跨膜区及胞内区并添加包含三聚化结构域的氨基酸序列是指，在野生型RSV F蛋白C端删除aa 512~574（涵盖跨膜区及胞内区），并添加前述的ABCD-tag或ABCH-tag

在可选的实施方式中，本发明所述的野生型RSV F蛋白突变体还包括接头序列（如GG、GS、SAIG)及8*His标签序列（HHHHHHHH）。所述序列不是RSV F蛋白的功能、诸如诱导免疫应答所必需。本领域技术人员将认识到此类序列，并且在适当时理解，本发明所公开的RSVF蛋白突变体中可以包含或不包含这类序列。

作为可选的实施方式，本发明共提供了三组RSV F突变体：

第一组RSV F突变体都具有静电突变E487T、D486N或D486Q；

第二组RSV F突变体都具有二硫键突变D486C+E487C；

第三组RSV F突变体都具有二硫键突变，其选自R106C+V144C、S/N105C+A147C、S/N105C+A146C、N104C+I148C或N104C+S146C；

以下对上述三组RSV F突变体分别进行说明：

（一）第一组RSV F突变体（都具有E487T、D486N或D486Q）：

本发明提供了一种RSV F蛋白突变体，其存在相对于的野生型RSV F蛋白的多种修饰以使之稳定在融合前构象，所述修饰包含：

（a）脯氨酸突变：S215P；

（b）空腔填充突变：选自S190V、S190L或S190I（其中优选S190V或S190L，进一步优选S190L）；

（c）静电突变：选自E487T、D486N或D486Q（其中优选E487T）；

其中，位置编号是基于SEQ ID NO: 1所示的序列。

优选的，所述修饰不包含工程化改造的二硫键突变。

优选的，所述RSV F蛋白突变体存在的修饰包含：S215P，S190L，E487T。

可选的，所述修饰还包含p27序列改造，即删除p27序列。可选的，所述p27序列改造采取以下做法之一：（1）删除含p27片段，同时不引入连接子：将所删除片段前后的序列直接共价键合；（2）删除含p27片段，同时引入连接子序列：采用连接子（例如GG、GS、GSGS、GGGS等）将所删除片段前后的序列相连。优选的，所述p27序列改造选自以下之一：T103-GS-G145、N104-I148、N104-GS-I148、S/N105-A147、S/N105-GS-A147，其中进一步优选T103-GS-G145、N104-GS-I148或S/N105-A147，更进一步优选S/N105-A147。

可选的，所述修饰还包含三聚化结构域改造：删除跨膜区及胞内区并添加包含三聚化结构域的序列。优选的，所述三聚化结构域选自Foldon、ABCD-tag或ABCH-tag，其序列分别如SEQ ID NO: 2、3、4所示，其中优选Foldon。

优选的，所述修饰包含以下任意一组所列的改造，或由任意一组所列的改造组成：

组（1）：S215P，S190L，E487T，T103-GS-G145，Foldon；

组（2）：S215P，S190L，E487T，N104-GS-I148，Foldon；

组（3）：S215P，S190L，E487T，S/N105-A147，Foldon；

组（4）：S215P，S190L，E487T，S/N105-GS-A147，Foldon。

其中优选组（3）。

上述各组中，“Foldon”是指删除RSV F的跨膜区及胞内区并添加包含Foldon三聚化结构域的序列。

优选的，具有组（1）、组（2）、组（3）或组（4）所述修饰的RSV F蛋白突变体，分别包含或者是与SEQ ID NO: 51、53、54或55存在99%以上（优选100%）同一性的氨基酸序列。

（二）第二组RSV F突变体（都具有D486C+E487C二硫键突变）；

本发明还提供了一种RSV F蛋白突变体，其存在相对于的野生型RSV F蛋白的多种修饰以使之稳定在融合前构象，所述修饰包含：

（a）工程化改造的二硫键突变：D486C+E487C；

（b）脯氨酸突变：选自S215P、Q210P、S211P或S211P+S213P；

（c）空腔填充突变：选自S190V或S190L；

其中，位置编号是基于SEQ ID NO: 1所示的序列。

优选的，所述修饰不包含其他静电突变（二硫键突变D486C+E487C可在一定程度上起到静电突变的目的，因为原本带负电的D486、E487替换为了不带电的C，避免了相邻氨基酸的电荷排斥；故在使用D486C+E487C的情况下，可以不再引入其他静电突变）。

可选的，所述修饰还包含p27序列改造，即删除p27序列。可选的，所述p27序列改造采取以下做法之一：（1）删除含p27片段，同时不引入连接子：将所删除片段前后的序列直接共价键合；（2）删除含p27片段，同时引入连接子序列：采用连接子（例如GG、GS、GSGS、GGGS等）将所删除片段前后的序列相连。优选的，所述p27序列改造选自以下之一：T103-GS-G145、N104-I148、N104-GS-I148、S/N105-A147、S/N105-GS-A147，其中优选T103-GS-G145或S/N105-A147。

优选的，所述修饰包含以下任意一组或由任意一组组成：

组（1）：D486C+E487C，S215P，S190V，T103-GS-G145，Foldon；

组（2）：D486C+E487C，S215P，S190L，T103-GS-G145，Foldon；

组（3）：D486C+E487C，S215P，S190L，T103-GS-G145；

组（4）：D486C+E487C，S215P，S190L，S/N105-A147，Foldon；

组（5）：D486C+E487C，Q210P，S190L，S/N105-A147，Foldon；

组（6）：D486C+E487C，S211P，S190L，S/N105-A147，Foldon；

组（7）：D486C+E487C，S211P+S213P，S190L，S/N105-A147，Foldon。

其中优选组（2）、组（4）、组（5）或组（6）。

优选的，具有组（1）、组（2）、组（3）、组（4）、组（5）、组（6）或组（7）所述修饰的RSV F蛋白突变体，分别包含或者是与SEQ ID NO: 46、47、50、58、64、65、73存在99%以上（优选100%）同一性的氨基酸序列。

（三）第三组RSV F突变体（都具有R106C+V144C、S/N105C+A147C、S/N105C+A146C、N104C+I148C或N104C+S146C二硫键突变）；

（a）工程化改造的二硫键突变：选自R106C+V144C、N104C+S146C、N104C+I148C、S/N105C+A146C、S/N105C+A147C或S/N105C+M370C；

（b）脯氨酸突变：S215P；

（c）空腔填充突变：选自S190I、S190L、S190V或S190W；

（d）静电突变：选自D486N、D486Q、E487T、D489P或D489Q；

其中，位置编号是基于SEQ ID NO: 1所示的序列。

可选的一种方案是：所述修饰中，二硫键突变选择R106C+V144C，空腔填充突变选自S190I、S190L、S190V或S190W（其中优选S190L、S190V或S190W），静电突变选自D486N、D486Q、E487T、D489P或D489Q（其中优选D486N、D486Q、E487T或D489P）。

可选的另一种方案是：所述修饰中，二硫键突变选自N104C+S146C、N104C+I148C、S/N105C+A146C或S/N105C+A147C，空腔填充突变选自S190I、S190L或S190V（其中优选S190I），静电突变选自D486N、D486Q、E487T（其中优选D486N）。

可选的，所述修饰可以包含或不包含p27序列改造，所述p27序列改造是指删除p27序列。可选的，所述p27序列改造采取以下做法之一：（1）删除含p27片段，同时不引入连接子：将所删除片段前后的序列直接共价键合；（2）删除含p27片段，同时引入连接子序列：采用连接子（例如GG、GS、GSGS、GGGS等）将所删除片段前后的序列相连。优选的，所述p27序列改造选自以下之一：T103-GS-G145、N104-I148、N104-GS-I148、S/N105-A147、S/N105-GS-A147。

可选的，所述修饰还包含三聚化结构域改造：删除跨膜区及胞内区并添加包含三聚化结构域的序列。可选的，所述三聚化结构域选自Foldon、ABCD-tag或ABCH-tag，其序列分别如SEQ ID NO: 2、3、4所示，其中优选Foldon。

优选的，所述修饰包含以下任意一组或由任意一组组成：

（1）R106C+V144C，S215P，S190I，D486N，Foldon；

（2）R106C+V144C，S215P，S190V，D486N，Foldon；

（3）R106C+V144C，S215P，S190L，D486N，Foldon；

（4）R106C+V144C，S215P，S190W，D486N，Foldon；

（5）R106C+V144C，S215P，S190V，D486Q，Foldon；

（6）R106C+V144C，S215P，S190V，E487T，Foldon；

（7）R106C+V144C，S215P，S190L，D486Q，Foldon；

（8）R106C+V144C，S215P，S190L，E487T，Foldon；

（9）R106C+V144C，S215P，S190L，D489P，Foldon；

（10）R106C+V144C，S215P，S190W，D486Q，Foldon；

（11）R106C+V144C，S215P，S190W，E487T，Foldon；

（12）N104C+S146C，S215P，S190I，D486N，Foldon；

（13）N104C+I148C，S215P，S190I，D486N，Foldon；

（14）S/N105C+S146C，S215P，S190I，D486N，Foldon；

（15）S/N105C+A147C，S215P，S190I，D486N，Foldon；

（16）S/N105C+M370C，S190L，E487T，S/N105-A147，Foldon。

进一步优选的，具有组（1）~组（16）任一所述修饰的RSV F蛋白突变体，分别具有如下氨基酸序列特征：包含或者是与SEQ ID NO: 5、6、7、8、9、10、14、15、16、19、20、24、26、28、29或83存在99%以上（优选100%）同一性的氨基酸序列。

作为可选的实施方式，本发明提供了79种具体的RSV F突变体，其相对于野生型RSV F蛋白所存在的修饰具体如表1、表3、表5和表7中所示。

第二方面，本发明提供生物材料，所述生物材料包括以下任意一项：

（a）编码所述RSV F蛋白突变体的核酸分子。

（b）含有（a）所述核酸分子的重组载体，优选的，所述重组载体的原始质粒为pOET1.1。

（c）含有（a）所述核酸分子或（b）所述重组载体的重组病毒，优选的，所述重组病毒包括昆虫细胞杆状病毒、腺病毒、腺相关病毒、牛痘病毒、疱疹病毒或逆转录病毒。

（d）含有（a）所述核酸分子、（b）所述重组载体或（c）所述重组病毒的转化细胞，所述转化细胞的宿主细胞选自哺乳动物细胞、细菌、酵母、真菌或昆虫细胞；优选的，所述昆虫细胞为Sf9细胞、Sf21细胞或High-Five细胞。

第三方面，本发明还提供一种制备上述RSV F蛋白突变体的方法，步骤包括：重组载体的构建、重组载体的提取、重组载体转染至宿主细胞并表达蛋白及对表达产物的纯化。

第四方面，本发明还提供包含上述的RSV F蛋白突变体、核酸分子、重组载体、重组病毒或转化细胞的免疫原性组合物。

第五方面，本发明还提供任一种上述的RSV F蛋白突变体、核酸分子、重组载体、重组病毒、转化细胞、免疫原性组合物在以下任意一方面的应用：

（a）制备RSV特异性抗体的应用。

（b）制备用于预防和/或治疗RSV感染的药物；优选的，所述药物包括重组蛋白疫苗、载体类疫苗或核酸疫苗。

（c）制备RSV的诊断试剂。

术语定义：

在本申请中，术语“呼吸道合胞病毒”或“RSV”属于副黏病毒科的肺病毒属的单股负链RNA病毒。该病毒可引起婴幼儿，老年人及免疫力低下成人下呼吸道疾病症状（Lowerrespiratory tract disease，LRTD），包括间质性肺炎及毛细支气管炎。

在本申请中，术语“突变体”是指与野生型蛋白在氨基酸序列或蛋白质结构上有一种或多种变化的蛋白质。这些变化可能包括但不限于一个或多个氨基酸的删除、插入、更换、缩短和/或丢失，以及蛋白质结构的修饰或切割。在本申请中，"突变体"特指呼吸道合胞病毒（RSV）F蛋白突变体。

在本申请中，术语“二硫键突变”是指野生型RSV F蛋白中的氨基酸被半胱氨酸所取代，两个半胱氨酸残基中的硫原子之间形成二硫键以稳定RSV Pre-F结构。

在本申请中，术语“空腔填充突变”是指野生型RSV F蛋白中的氨基酸残基被预期填充成熟F蛋白结构空腔的氨基酸所取代以稳定RSV Pre-F结构。这些填充结构空腔的氨基酸往往是侧链基团较大的氨基酸，如大脂族氨基酸（Ile、Leu和Met)或大芳族氨基酸（His、Phe、Tyr和Trp)。

在本申请中，术语“静电突变”是指野生型RSV F蛋白中的氨基酸残基被预期氨基酸替代后能减少蛋白折叠结构中彼此靠近残基之间的离子排斥以稳定RSV Pre-F结构。所述静电突变包含野生型RSV F蛋白氨基酸序列第486、487或489位氨基酸突变为天冬酰胺（Asn）、谷氨酰胺（Gln）或苏氨酸（Thr）。

在本申请中，术语“脯氨酸突变”是指野生型RSV F蛋白中的氨基酸残基被脯氨酸所替代以稳定RSV Pre-F结构。脯氨酸中的氨基酸和羧基通过一个氨基连结，形成一个刚性的五元环结构，这种环状结构限制了脯氨酸在蛋白质中的旋转自由度，使得脯氨酸能形成固定的折叠和转角，增加蛋白质的稳定性。

在本申请中，术语“p27”是指野生型RSV F蛋白中氨基酸残基110-136之间的27个氨基酸短肽。该氨基酸短肽会被弗林蛋白酶水解释放，并形成F1（137-574aa）和F2（26-109aa）两个亚基。

在本申请中，术语“p27序列改造”是指在野生型RSV F蛋白基础上删除包含p27在内的片段，即，所删除的片段应覆盖p27且可以比p27略长（向p27的上游和/或下游延长1~15个氨基酸残基左右），例如，可以删除RSV F蛋白第104~144、105~147、或106~146位氨基酸残基之间的片段（前述“之间”不包含数值范围端值，例如，第104~144位氨基酸残基之间的片段是指105~143位氨基酸构成的片段），并且，在删除前述片段后，可以将前后片段直接共价连接或者采用连接肽（例如GG、GS、GSGS、GGGS等）连接，其中优选GS。

在本申请中，术语“三聚化结构域”是指通过引入异源氨基酸序列（例如Foldon）或半胱氨酸拉链氨基酸序列（例如ABCD-tag、ABCH-tag）在野生型RSV F蛋白C端形成三聚体的氨基酸序列。在本申请中的三聚体是指由三个RSV F蛋白F1+F2亚基形成的复合体。

在本申请中，术语“ABCD-tag”是指在删除跨膜区及胞内区的野生型RSV F蛋白C端添加半胱氨酸拉链（含4对半胱氨酸突变的氨基酸序列），所述ABCD-tag氨基酸序列为CCHNVNACCSTTNICCTTTNICCTT。

在本申请中，术语“ABCH-tag”是指在删除跨膜区及胞内区的野生型RSV F蛋白C端添加半胱氨酸拉链（含4对半胱氨酸突变的氨基酸序列），所述ABCH-tag氨基酸序列为CCHNVNACCSTTNICCTTTNICCTT。

在本申请中，术语“Mota”或“ motavizumab”是指Herren等人（Herren Wu, etal., Journal of Molecular Biology, 2007)论文中所述的抗体。

在本申请中，术语“D25”是指Jason等人（Jason S McLellan, et al., Science,2013)论文中所述的抗体。

在本申请中，术语“hRSV90”是指Jarrod等人Nature Microbiology 2, 16271（2017)论文中所述的抗体。

在本申请中，术语“AM14”是指Morgan等人（Morgan S A Gilman, et al., PLoSPathog, 2015)论文中所述的抗体。

在本申请中，术语“构象改变”通常是指蛋白质分子的空间结构发生变化；例如，所述构象改变可以包括蛋白质分子中化学键的改变、多肽的折叠方式改变。

在本申请中，术语“包含”通常是指包括明确指定的特征，但不排除其他要素。

本发明的有益效果：

本发明所述的RSV F蛋白突变体相对于野生型RSV F蛋白能显著提升融合前构象（pre-F）的稳定性及与中和抗体的结合活性，表明它具有极高的潜力成为RSV疫苗的有效组成部分。相比于现有技术（例如847蛋白），本发明提供的部分RSV蛋白突变体，具有更高的pre-F比例，或者在高温或低温条件下具有更好的稳定性。

附图说明

图1：本发明实施例1中使用的pOET1.1杆状病毒转移质粒图谱。

图2：各突变体细胞上清液与不同单克隆抗体结合的情况（双抗夹心ELISA）。

图3：各突变体纯化后的还原性及非还原性凝胶电泳分析图。

图4：各突变体纯化后的Western Blot分析图。

图5：免疫不同剂量BR47抗原蛋白后的小鼠结合抗体测定结果。

图6：免疫不同抗原蛋白后的小鼠结合抗体测定结果。

具体实施方式

为了更为准确、明了地理解和掌握本发明的目的、技术方案和优越性，以下将基于本发明实施例中的相关附图，对本发明的实施例进行深度解读与详实描述。请注意，这里阐述的实施例仅代表了本发明部分应用实例，并不囊括所有的实施例。

实施例1：RSV F突变体的设计和筛选

RSVF突变体设计和筛选包括如下步骤：

（1）突变体的设计及基因合成：首先，获得野生型RSV F的序列：根据NCBI数据库已公开的A型RSV毒株的F蛋白序列，计算出每个位点出现次数最多的氨基酸（共有氨基酸），构建得到RSV F共有氨基酸序列（如SEQ ID NO.1所示），以其代表A型野生株RSV F的序列。然后，在SEQ ID NO: 1所示的野生型RSV F蛋白的氨基酸序列基础上，进行改造以设计重组RSV F蛋白（突变体）：根据现有资料并结合结构生物学分析，本发明设计了多种RSV F突变体（重组蛋白），其分别包含以下改造中的一种或多种：二硫键突变、脯氨酸突变、空腔填充突变、静电突变、p27序列改造、引入三聚化结构域。然后，按照宿主Sf9昆虫细胞进行密码子优化确定核酸序列并进行全基因合成。

（2）重组质粒的构建及抗原蛋白的表达：将合成的目的基因插入杆状病毒转移载体pOET1.1（图1）中，并利用flashBAC^TM杆状病毒表达系统试剂盒将重组质粒和杆状病毒基因组共转染进Sf9昆虫细胞。转染的具体操作按试剂盒说明书进行。Sf9细胞在转染7天后将细胞上清收集，此时上清中含重组外源基因的P0代病毒。将P0代病毒转入新的Sf9细胞孔板中，获得P1代病毒。P1代病毒感染细胞6-7天后收集细胞上清进行ELISA检测各抗原的构象及稳定性。

（3）抗原蛋白的ELISA检测：利用ELISA方法检测各抗原蛋白的构象及稳定性。

ELISA检测的具体操作如下：将100μl Motavizumab（简称Mota，Pre-F和Post-F均可结合）、AM14（只结合Pre-F）、D25（只结合Pre-F）或hRSV90（只结合Pre-F）等抗体4℃过夜包被至96孔板中。第二天用PBST洗涤3次后拍干，再用PBST配制的5%脱脂牛奶进行封闭（200μl/孔，室温封闭1小时）。将（2）中收集到的细胞上清液平均分为3份，分别进行高温处理（50℃以上处理1h）、低温处理（4℃长时间存储或反复冻融）及不处理。封闭后的96孔板用PBST洗涤3次后拍干，每孔加入100 μl未处理和各种压力条件处理后的细胞上清液样品，室温孵育1-2小时。PBST洗涤3次后加入100 μl Rabbit His-tag Antibody，室温孵育1小时。PBST洗涤3次后加入100μl 抗兔IgG抗体（HRP），室温孵育1小时。PBST洗涤5次后拍干，每孔加入100 μl新鲜配制的TMB显色液。显色10-15分钟后加入终止液终止显色，并用酶标仪读取波长450nm/570nm的吸光值。最终吸光值读数为A450nm-A570nm。

稳定性评估的方法如下：根据ELISA检测结果，1）一方面，计算本发明设计的RSV F蛋白（简称候选抗原蛋白）相比于阳性对照847蛋白（辉瑞公司已在美国上市的RSV疫苗Abrysvo中采用的抗原蛋白，本申请中SEQ ID NO: 84所示）获得的Pre-F比例，如果该比例大于1，则说明候选抗原蛋白取得的pre-F构象占比（%Pre-F，即Pre-F相比于Pre-F+Post-F总和所占比例）相比847蛋白更加优秀，如果与847相比Pre-F比例不低于0.8（至少不低于0.75），则表明候选抗原蛋白较好。2）另一方面，计算候选抗原蛋白在高温和低温压力条件下的稳定性，其中分别以Mota蛋白、AM14蛋白作为抗体结合候选抗原蛋白，以评估候选抗原蛋白整体上的稳定性以及Pre-F部分的稳定性。综合各轮筛选结果，本发明定义压力条件处理后蛋白稳定性相应数值不低于0.6（至少不低于0.55），则表示蛋白稳定性较优秀。

（4）方案调整和改进：根据上步ELISA检测结果，基于表现优异的抗原，选择较好的突变类型进行下一轮的筛选。

按照上述研究思路，开展了四轮RSV F突变体设计和筛选，具体如以下实施例2~5所述。

实施例2：第一轮RSV F突变体设计和筛选

根据实施例1所述的操作步骤，进行了第一轮突变体的设计和ELISA检测。本轮试验的主要目的在于对二硫键突变、空腔填充突变、静电突变的的方式进行多种尝试，通过正交实验测验其联用效果。

RSV F突变体设计策略如下：（1）二硫键突变方面，进行了8种设计（R106C+V144C、N104C+S146C、N104C+A147C、N104C+I148C、S/N105C+G145C、S/N105C+S146C、S/N105C+A147C、Q34C+G471C）；（2）脯氨酸突变方面，采用S215P或者在其基础上进一步增加A490P；（3）空腔填充突变方面，进行了4种设计（S190V、S190L、S190W、S190I）；（4）静电突变方面，进行了5种设计（D486N、D486Q、E487T、D489P、D489Q）；（5）p27序列方面，不进行p27序列改造，或采取T103-GS-G145（删除103~145位氨基酸之间的片段并额外引入连接子GS）；（6）三聚化结构域方面：采用Foldon。

基于上述各种类型的修饰方式，在进行联用以构建RSV F突变体时，（1）一方面，固定二硫键突变（R106C+V144C）、脯氨酸突变（包含S215P）、p27序列改造（不进行改造）和三聚化结构域（Foldon）的选择，进行空腔填充突变（S190I、S190V、S190L、S190W）、静电突变（D486N、D486Q、E487T、D489P、D489Q）的正交设计和筛选（BR01、BR06~BR23）；（2）另一方面，固定脯氨酸突变（包含S215P）、空腔填充突变（S190I）、静电突变（D486N）、p27序列改造（不进行改造）和三聚化结构域（Foldon）的选择，进行二硫键突变（N104C+S146C、N104C+A147C、N104C+I148C、S/N105C+G145C、S/N105C+S146C、S/N105C+A147C、Q34C+G471C）的变化和比较（BR24~BR30）；（3）此外，在BR30基础上进行p27序列改造（T103-GS-G145）得到BR31，二者对比以分析p27序列改造对技术效果的影响。

本轮本轮所设计的具体RSV F突变体见表1，该表中，左列为突变体的名称，同一行中列出了该突变体相比于野生型RSV F进行的改造及其相应的序列编号。各突变体相应的ELISA检测结果见表2。

表1：第一轮RSV F突变体设计

备注：

（1）“/”表示此项目未进行改造（下同）。

（2）“p27序列改造”一列：“/”表示未对野生型RSV F蛋白中的p27序列进行改造；“T103-GS-G145”表示删除野生型RSV F蛋白第103~145位氨基酸之间的片段（不含端值即第103、145位氨基酸，即：仅删除第104~144位氨基酸片段）并以GS替代，其中GS作为连接子。

（3）关于S/N105C+G145C：其中“S/N105”是指，野生型RSV F蛋白中第105号氨基酸位点可以是S或N（以S最为常见，其次为N），“S/N105C”表示该位点由野生型的S/N突变为C。

表2：第一轮RSV F突变体的ELISA检测结果

备注：

¹ “Pre-F比例”的计算公式为：%Pre-F=OD_AM14/OD_Mota，下同；

² “与847相比Pre-F比例”表示各突变体Pre-F蛋白比例与阳性对照847的比值，例如BR06与847相比Pre-F比例的计算公式为：（%Pre-F_BR06）/（%Pre-F₈₄₇），下同；

³ “蛋白稳定性（Mota）”表示压力条件处理前后样品Mota抗体的OD值变化，具体计算公式为：（Mota OD_处理后）/（Mota OD_处理前），下同；

⁴ “蛋白稳定性（AM14）”表示压力条件处理前后样品AM14抗体的OD值变化，具体计算公式为：（AM14 OD_处理后）/（AM14 OD_处理前），下同。

根据第一轮筛选结果，各抗原蛋白均能正常表达并能利用ELISA方法进行抗原蛋白的筛选。第一轮筛选主要是为了初步探索各设计策略的组合效果：

二硫键突变方面，R106C+V144C（对应BR01、BR06~BR23）、N104C+S146C（对应BR24）、N104C+I148C（对应BR26）、S/N105C+S146C（对应BR28）及S/N105C+A147C（对应BR29）均能帮助稳定Pre-F蛋白构象，而N104C+A147C（对应BR25）、S/N105C+G145C（对应BR27）和Q34C+G471C（对应BR30、BR31）表现一般。由于N104C+I148C和S/N105C+A147C为未报道的全新二硫键且表现优异，选择其进入下一轮筛选。

空腔填充方面，添加S190V和S190L突变后Pre-F构象比例普遍高于S190W突变，选择其进入下一轮筛选。

静电突变方面，添加D486N、D486Q及E487T等突变相较于其他突变更能稳定Pre-F构象，选择它们进行下一轮抗原筛选。

实施例3：第二轮RSV F突变体设计和筛选

本轮试验的主要目的在于对选出的二硫键突变、空腔填充突变、静电突变的联用效果进行测试；同时，本轮试验中提高了压力条件（高温从50℃提高到60℃）以测试所构建的RSV F突变体的热稳定性，同时也将上轮筛选中表现较好的BR26、BR29纳入本轮压力条件测试。

RSV F突变体设计策略如下：根据上一实施例的结果，在本轮RSV F突变体设计中，（1）二硫键突变方面，选择N104C+I148C和S/N105C+A147C进入本轮筛选，此外引入D486C+E487C；（2）脯氨酸突变方面仍采用S215P；（3）空腔填充突变方面，选择S190V或S190L；（4）静电突变方面，选择D486N、D486Q或E487T；（5）p27序列改造方面，仍采取T103-GS-G145，或不进行p27序列改造；（6）三聚化结构域方面仍采用Foldon。

本轮所设计的具体RSV F突变体见表3，该表中，左列为突变体的名称，同一行中列出了该突变体相比于野生型RSV F进行的改造及其相应的序列编号。各突变体相应的ELISA检测结果见表4。

表3：第二轮RSV F突变体设计

表4：第二轮RSV F突变体的ELISA检测结果

在第二轮筛选中我们提高了高温处理压力（从50℃提高到60℃），期望筛选到更优异的抗原设计。结果显示：

（一）经60℃高温处理后，大多数突变体的蛋白稳定性（AM14）显著下降，而添加了D486C+E487C二硫键突变的RSV F突变体（BR44~BR46）Pre-F构象无显著变化，尤其是BR46及BR47表现突出，故在后续筛选中考虑保留二硫键突变D486C+E487C。

（二）相对而言，二硫键突变N104C+I148C或S/N105C+A147C对RSV F突变体稳定性的贡献不如D486C+E487C，不过，考虑到RSV F突变体的提取、纯化和保存过程中一般不会涉及50℃以上的高温，故在非极端温度条件下，N104C+I148C或S/N105C+A147C也是可用的二硫键突变方式。（1）针对N104C+I148C，对比BR26、BR32~BR37可知，当N104C+I148C与S190I、D486N联用时，该突变组合与S/N105C+A147C和其他空腔填充突变（如S190L/V）、静电突变（D486Q/E487T）类型联用的技术效果相差不大，不过在蛋白稳定性（AM14)略高。（2）与之相似，针对S/N105C+A147C，对比BR29、BR38~BR43可知,当S/N105C+A147C与S190I、D486N联用时，该突变组合相比于S/N105C+A147C和其他空腔填充突变（如S190L/V）、静电突变（D486Q/E487T）类型联用的技术效果相差不大，不过在蛋白稳定性（AM14)略高。

（三）同时，此轮筛选结果显示，进行p27序列改造（BR46及BR47）与不改造（BR44及BR45）相比能显著提升Pre-F稳定性，故在后续筛选中考虑都进行p27序列改造。空腔填充突变中，S190L及S190V都能帮助稳定Pre-F构象，选择在进行p27序列改造后效果稍好的S190L进行下一轮筛选。静电突变中D486N、D486Q及E487T表现均较好，选择效果稍好的E487T进入下一轮的抗原筛选。

实施例4：第三轮RSV F突变体设计和筛选

本轮试验的主要目的在于拓展p27序列、三聚化结构域的改造方式，并测试其与基于前轮结果筛选出的二硫键突变、空腔填充突变、静电突变的联用效果；同时，在本轮测试中，我们进一步提高了压力条件（高温从60℃提高到65℃，低温从4℃储存改为反复冻融处理），期望筛选到更能耐受极端条件的抗原设计，同时也将上轮筛选中表现较为突出的BR47纳入本轮压力条件测试。

RSV F突变体设计策略如下：根据上一实施例的结果，在本轮RSV F突变体设计中，（1）二硫键突变方面，选择D486C+E487C进入本轮筛选，或不引入二硫键突变；（2）脯氨酸突变方面仍采用S215P，或不引入脯氨酸突变；（3）空腔填充突变方面，选择S190L；（4）静电突变方面，选择E487T，或不引入静电突变；（5）p27序列改造方面，除了第一、二轮中测试过的T103-GS-G145，增加了另外四种改造方式（N104-I148、N104-GS-I148、S/N105-A147和S/N105-GS-A147）；（6）三聚化结构域方面，除了此前测试过的Foldon，增加了ABCD-tag（CCHNVNACCSTTNICCTTTNICCTT）、ABCH-tag（CCHNVNACCSTTNICCTTIIICCIV）两种选择，或者不引入三聚化结构域。

本轮所设计的具体RSV F突变体见表5，该表中，左列为突变体的名称，同一行中列出了该突变体相比于野生型RSV F进行的改造及其相应的序列编号。各突变体相应的ELISA检测结果见表6。

表5：第三轮RSV F突变体设计

备注：

p27序列改造一列，1）“S/N105-A147”表示删除野生型RSV F蛋白第105~147位氨基酸之间的片段（不含端值即第105、147位氨基酸，即：仅删除第106~146位氨基酸片段），同理，“N104-I148”表示删除其第104~148位氨基酸之间的片段（不含端值）；2）“T103-GS-G145”表示删除野生型RSV F蛋白第103~145位氨基酸之间的片段（不含端值）并以GS替代，同理，“N104-GS-I148”表示删除野生型RSV F蛋白第104~148位氨基酸之间的片段（不含端值）并以GS替代、“S/N105-GS-A147”表示删除野生型RSV F蛋白第105~147位氨基酸之间的片段（不含端值）并以GS替代。

表6：第三轮RSV F突变体的ELISA检测结果

第三轮筛选结果显示：

p27序列改造方面，不同改造方式对Pre-F构象稳定性有显著的影响：五种改造方式中，S/N105-A147表现的效果最好。如表6显示，在不加入二硫键突变时：比较不同的p27序列改造方案（即抗原设计BR49，BR52，BR53，BR54及BR55），当中BR54（p27序列改造为S/N105-A147）在高温压力处理后均优于其他设计，低温压力处理后与其他设计无显著差异；同样的，在加入二硫键突变时：比较不同的p27序列改造方案（即抗原设计BR47，BR56，BR57，BR58及BR59），当中BR58（p27序列改造为S/N105-A147）在高温压力处理中均优于其他设计，低温压力处理后与其他设计无显著差异。因此，选择S/N105-A147进入下一轮筛选。

此外，值得一提的是，BR50（D486C+E487C，S215P，S190L，T103-GS-G145）虽然没有进行三聚化结构域改造，其在pre-F比例、结构稳定性方面虽略弱于BR47（D486C+E487C，S215P，S190L，T103-GS-G145，Foldon）仍表现较好，推测原因在于靠近RSV F蛋白C端的D486C+E487C二硫键在一定程度上起到帮助蛋白三聚化的效果。因此，在采用D486C+E487C二硫键突变的情况下，进行三聚化结构域改造并非必须。

实施例5：第四轮RSV F突变体设计和筛选

本轮试验的主要目的在于拓展脯氨酸突变的改造方式，次要目的在于在二硫键突变方面做更多的尝试，并测试其与基于前轮结果筛选出空腔填充突变、静电突变、p27序列改造改造的联用效果。

RSV F突变体设计策略如下：根据上一实施例的结果，在本轮RSV F突变体设计中，（1）二硫键突变方面，仍以D486C+E487C为主，此外引入了L171C+K191C、E60C+K196C、S/N105C+M370C单独或与D486C+E487C联用，引入这些新二硫键的目的是期望代替脯氨酸突变，获得更稳定的Pre-F构象；（2）脯氨酸突变方面，在此前的S215P之外测试了多种可能性（Q210P、S211P、C212P、S213P、I214P、N216P、I217P、E218P、Q210P+C212P、S211P+S213P、C212P+I214P、I214P+N216P、N216P+E218P、S213G+I214P+N216G、S211G+C212P+I214G），以对比其效果；（3）空腔填充突变方面，仍采用S190L或不引入空腔填充突变；（4）静电突变方面，仍采用E487T或不引入静电突变；（5）p27序列改造方面，统一采用S/N105-A147；（6）三聚化结构域方面，统一采用Foldon。

本轮所设计的具体RSV F突变体见表7，该表中，左列为突变体的名称，同一行中列出了该突变体相比于野生型RSV F进行的改造及其相应的序列编号。各突变体相应的ELISA检测结果见表8。

表7：第四轮RSV F突变体设计

表8：第四轮RSV F突变体的ELISA检测结果

第四轮筛选结果显示：

脯氨酸突变方面，Q210P、S211P及S211P+S213P均能显著提升Pre-F蛋白的构象稳定性。

二硫键突变方面，对比BR79、BR80、BR81、BR82和BR83的ELISA检测结果可知：（1）BR83表现相对较好，可见S/N105C+M370C能在无刚性氨基酸突变（脯氨酸突变）存在时帮助稳定Pre-F构象。（2）与之相比，尽管BR80各项数据表面上较好（例如与847蛋白相比Pre-F比例故高达2.18），但实际上该突变体蛋白表达水平极低（例如，65℃ 1h处理后，OD_Mota=0.111，OD_AM14=0.136，可见检测抗体OD值很低，尽管求得%Pre-F=OD_AM14/OD_Mota=1.22以及“与847相比Pre-F比例”高达2.18），故E60C+K196C这对二硫键并非优选。（3）此外，BR79、BR81的与847蛋白相比Pre-F比例较低，故L171C+K191C这对二硫键也非优选。

完成四轮筛选后，选择总体表现较优异的突变体（BR47、BR54、BR58、BR64、BR65、BR73）作为代表，再与其他中和抗体进行ELISA检测，进一步确认所设计抗原的构象稳定性及诱导多种中和抗体的潜力。结果如图2所示，多个突变体能与不同的强中和抗体结合，且其Pre-F构象较为稳定。

实施例6：抗原蛋白的大量表达及纯化

将表达抗原蛋白的重组杆状病毒按1:100比例感染1L处于对数生长期的HighFive细胞（活细胞密度约2×10⁶cells/ml，活率大于95%)。将接毒细胞置于27℃，120 rpm振荡培养3-4天。当细胞直径显著变大，活细胞密度和细胞活率显著下降时4000 rpm离心20分钟收集细胞上清液。收集的上清液经0.22 μm滤膜过滤后进行镍柱纯化。纯化的具体步骤为：

平衡：使用结合缓冲液（50mM NaH₂PO₄，300 mM NaCl，10 mM咪唑，pH 8.0）平衡镍柱（UniNTA-80Ni）。用10倍柱体积的结合缓冲液洗涤镍柱。

上样：将过滤后的样品缓慢加入平衡后的镍柱中，流穿样品3次，使目的蛋白与镍柱充分结合。

洗杂：使用10-20柱体积的洗杂缓冲液（50mM NaH₂PO₄，300 mM NaCl，20-50 mM咪唑，pH 8.0）洗去非特异性结合蛋白。

洗脱：使用洗脱缓冲液（50mM NaH₂PO₄，300 mM NaCl，250-500 mM咪唑，pH 8.0）洗脱结合的目的蛋白。收集洗脱液，分为1 mL的组分收集。

收集到的洗脱液装入SnakeSkin 透析袋（Thermo Scientific™），通过PBS透析液置换洗脱液中的盐离子。透析完成后收集透析袋中的溶液并进行分装存储于-80℃冰箱。同时取少量样品进行还原性和非还原性电泳，以及Western blot分析（一抗：D25抗体，二抗：Goat Anti-Human IgG-Fc Secondary Antibody HRP）。

结果如图3及图4所示，利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统表达的各抗原蛋白单体及三聚体分子量符合预期，利用特异性抗体D25进行Western blot检测确认蛋白条带为RSVF蛋白。各突变抗原纯度符合预期，可以用于后续实验。

实施例7：动物实验

选择6-8周龄雌性Balb/C小鼠进行随机分组，每组5只。分别在第0天及21天通过肌肉注射免疫不同剂量经昆虫细胞表达纯化的抗原蛋白原液或抗原蛋白加铝佐剂混合配制的疫苗，左右腿各50 μl，共100 μl。阴性对照组免疫生理盐水100 μl。分别在第14天及第35天采集小鼠血液，并分离血清进行结合抗体检测，方法如下：

将100 μl纯化后的抗原蛋白包被至96孔板中，第二天用PBST洗涤3次后拍干，再用PBST配制的5%脱脂牛奶进行封闭（200μl/孔，室温封闭1小时）。PBST洗涤3次后拍干。血清样品使用含1%脱脂牛奶的PBST溶液进行2倍连续稀释，以1:100为检测首点，每孔加入100μl，室温孵育1小时。PBST洗涤3次后加入100 μl Goat Anti-Mouse IgG-HRP antibody，室温孵育1小时。PBST洗涤5次后拍干，每孔加入100 μl新鲜配制的TMB显色液。显色10-15分钟后加入终止液，并用酶标仪读取波长450nm的吸光值。以阴性对照吸光值2.1倍为Cut-off值，样品吸光值≥Cut-off值的最大稀释倍数为样品的结合抗体滴度。

结果如图5及图6所示：在剂量及佐剂探索实验中（图5），免疫不同剂量的抗原蛋白BR47原液或联合铝佐剂的疫苗，均可诱导小鼠产生高滴度的结合抗体，表现出高水平的免疫原性。在比较不同抗原设计的实验中（图6），经体外筛选得到的多个抗原蛋白均能诱导小鼠产生高滴度的结合抗体，证明建立的体外筛选方法可用于RSV F抗原蛋白的筛选，且所筛选到的抗原具备开发优异RSV疫苗的潜力。

本发明实施例的深入解析与详述，并非用于限定本发明应享有保护的适用范围，而只是以选取的实施例为代表来说明本发明的过程、结果及其应用。根据此次阐述的发明实施例，对于同一领域的特定技术人员而言，在未经创造性努力的情况下，其能够推导出的或者通过等同替换得到的所有其他实施方式，一律纳入本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种RSV F蛋白突变体，其特征在于，所述RSV F蛋白突变体的氨基酸序列是SEQ IDNO:51、53、54或55所示序列。

2.核酸分子，其编码权利要求1所述的RSV F蛋白突变体。

3.重组载体，其包含权利要求2所述的核酸分子。

4.权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体的原始质粒为pOET1.1。

5.重组病毒，其包含权利要求2所述的核酸分子或权利要求3-4任一项所述的重组载体。

6.权利要求5所述的重组病毒，其特征在于，所述重组病毒选自昆虫细胞杆状病毒、腺病毒、腺相关病毒、牛痘病毒、疱疹病毒或逆转录病毒。

7.转化细胞，其包含以下之一：

（1）权利要求2所述的核酸分子；

（2）权利要求3-4任一项所述的重组载体；

（3）权利要求5-6任一项所述的重组病毒。

8.权利要求7所述的转化细胞，其特征在于，所述转化细胞的宿主细胞选自哺乳动物细胞、细菌、真菌或昆虫细胞。

9.权利要求8所述的转化细胞，其特征在于，所述昆虫细胞为Sf9细胞、Sf21细胞或High-Five细胞。

10.免疫原性组合物，其包含以下之一：

（1）权利要求1所述的RSV F蛋白突变体；

（2）权利要求2所述的核酸分子；

（3）权利要求3-4任一项所述的重组载体；

（4）权利要求5-6任一项所述的重组病毒；

（5）权利要求7-9任一项所述的转化细胞。

11.权利要求1所述的RSV F蛋白突变体的制备方法，包括以下步骤：重组载体的构建、重组载体的提取、重组载体转染至宿主细胞并表达蛋白及对表达产物的纯化。

12.以下（1）~（6）任一项的应用：

（1）权利要求1所述的RSV F蛋白突变体；

（2）权利要求2所述的核酸分子；

（3）权利要求3-4任一项所述的重组载体；

（4）权利要求5-6任一项所述的重组病毒；

（5）权利要求7-9任一项所述的转化细胞；

（6）权利要求10所述的免疫原性组合物；

所述应用选自以下（a）~（b）任一项：

（a）制备用于预防和/或治疗RSV感染的药物；

（b）制备RSV的诊断试剂。

13.权利要求12所述的应用，其特征在于，所述药物是用于预防和/或治疗RSV的重组蛋白疫苗、载体类疫苗或核酸疫苗。