CN119552810A - 用以分离外泌体的胎盘培养 - Google Patents

Abstract

提供了用以产生、分离和表征从培养的胎盘或其部分中回收的外泌体的若干方法。本文所述的替代方案有助于外泌体的所述产生、分离和表征，所述外泌体能够用作生物技术工具和治疗剂。本文还提供了源自胎盘器官培养物或所述胎盘的部分的培养物的外泌体群体。还提供了包含所述外泌体群体的组合物以及使用所述组合物以用于治疗受试者的方法。

Description

用以分离外泌体的胎盘培养

本申请是申请日为2018年11月16日，申请号为201880079103.8的专利申请的分案申请。

本申请要求2018年11月16日提交的美国临时专利申请号62/587,335的权益，所述临时专利申请的公开内容以引用的方式整体并入本文。

技术领域

提供了用以从培养的胎盘或其部分产生、分离外泌体以及表征所述外泌体的方法。本文所述的替代方案有助于外泌体的所述产生、分离和表征，所述外泌体能够用作生物技术工具和治疗剂。

背景技术

外泌体是从活细胞分泌的纳米级双脂质膜囊泡，所述外泌体在细胞间通讯中起重要作用。在人类怀孕期间，胎盘在调控生理稳态和支持胎儿发育中起着核心作用。已知由胎盘分泌的细胞外囊泡和外泌体有助于胎盘与母体组织之间的通讯，以维持母胎耐受性。外泌体含有活性生物制剂，包括可呈递在外泌体表面上的脂质、细胞因子、微小RNA、mRNA和DNA以及蛋白质。外泌体被认为可用于许多治疗方法，包括免疫调节、促进血管生成和用于递送药物。显然需要允许分离大量外泌体的更多方法。

发明内容

本发明的方面涉及用以从培养的胎盘或其部分产生、分离外泌体以及表征所述外泌体的方法。本文所述的方法有助于外泌体的所述产生、分离和表征，所述外泌体能够用作生物技术工具和治疗剂。优选的替代方案包括：

1.一种从胎盘或其部分中分离外泌体的方法，所述方法包括：

a)使胎盘或其部分，优选地是培养的胎盘或其部分与第一培养基接触；以及

b)从所述胎盘或其部分获得包含外泌体群体的第一级分；

c)任选地，使所述胎盘或其部分与第二培养基接触，并从所述胎盘或其部分获得包含外泌体群体的第二级分；

d)任选地，使所述胎盘或其部分与第三培养基接触，并从所述胎盘或其部分获得包含外泌体群体的第三级分；以及

e)任选地，优选地通过连续离心和/或亲和色谱法，使用对所需的外泌体群体上存在的标志物或肽具有特异性的抗体或其结合部分，从所述第一级分、所述第二级分和/或所述第三级分中分离所述外泌体群体，其中所述抗体或其结合部分被固定在诸如膜、树脂、珠粒或器皿的基底上。

2.如替代方案1所述的方法，其中所述胎盘或其部分还包括羊膜。

3.如替代方案2所述的方法，其中所述胎盘或其部分是人胎盘或其部分。

4.如前述替代方案中任一项所述的方法，其中所述第一培养基、所述第二培养基和/或所述第三培养基与所述胎盘或其部分接触至少45分钟，如45分钟或1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时或24小时或2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天或20天或在由前述时间点中的任何两者限定的范围内的任何时间量。

5.如前述替代方案中任一项所述的方法，其中所述第一培养基、所述第二培养基和/或所述第三培养基与所述胎盘或其部分接触至少7天、14天、28天、35天或42天或在由前述时间点中的任何两者限定的范围内的任何时间量。

6.如前述替代方案中任一项所述的方法，其中已将所述胎盘或其部分切碎、研磨或进行酶处理。

7.如替代方案1-5中任一项所述的方法，其中所述胎盘或其部分是基本上平坦的或片状的，并且已经脱细胞且基本上干燥，并且其中所述方法还包括使包含外源细胞的流体与所述脱细胞的胎盘或其部分接触，以便使所述脱细胞的胎盘或其部分接种所述外源细胞，并且其中所述细胞与所述脱细胞的胎盘或其部分的所述接触已在使所述脱细胞的胎盘或其部分与第一培养基接触之前进行。

8.如替代方案7所述的方法，其中所述外源细胞从与所述胎盘或其部分的供体受试者不同的受试者获得。

9.如替代方案7或8所述的方法，其中所述流体包括腹水、血液或血浆。

10.如替代方案7或8所述的方法，其中所述细胞来自器官。

11.如替代方案10所述的方法，其中所述细胞来自肝、肾、肺或胰腺。

12.如替代方案7或8所述的方法，其中所述细胞是免疫细胞。

13.如替代方案12所述的方法，其中所述细胞是T细胞或B细胞。

14.如前述替代方案中任一项所述的方法，其中所述第一培养基包含磷酸盐缓冲盐水(PBS)。

15.如替代方案9所述的方法，其中所述第一级分、所述第二级分或所述第三级分包含来自腹水、血液或血浆的外泌体。

16.如替代方案10所述的方法，其中所述第一级分、所述第二级分或所述第三级分包含来自器官细胞的外泌体。

17.如替代方案11所述的方法，其中所述细胞来自肝、肾、肺或胰腺。

18.如前述替代方案中任一项所述的方法，其中所述第二培养基包含生长因子。

19.如前述替代方案中任一项所述的方法，其中所述第三培养基包含螯合剂。

20.如替代方案19所述的方法，其中所述螯合剂是膦酸酯、BAPTA四钠盐、BAPTA/AM、二-Notrophen TM试剂四钠盐、EGTA/AM、吡哆醛异烟酰肼、N,N,N′,N′-四-(2吡啶基甲基)乙二胺、6-溴-N′-(2-羟基亚苄基)-2-甲基喹啉-4-碳酰肼、1,2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N′,N′-四乙酸四(乙酰氧基甲基酯)、(亚乙基二次氮基)四乙酸(EDTA)、Edathamil、亚乙基二次氮基四乙酸、乙二醇-双(2-氨基乙基醚)-N,N,N′,N′-四乙酸或乙二醇-双(β-氨基乙基醚)-N,N,N′,N′-四乙酸四钠盐(EGTA)或它们的任何组合。

21.如替代方案19或20中任一项所述的方法，其中所述螯合剂是EDTA或EGTA或它们的组合。

22.如替代方案19-21中任一项所述的方法，其中所述螯合剂以1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM或100mM的浓度或以在由前述浓度中的任何两者限定的范围内的浓度提供于所述第三培养基中。

23.如替代方案19-22中任一项所述的方法，其中所述第三培养基中的EDTA的浓度以1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM或100mM的浓度或以在由前述浓度中的任何两者限定的范围内的浓度提供。

24.如前述替代方案中任一项所述的方法，其中所述第三培养基包含蛋白酶。

25.如替代方案24所述的方法，其中所述蛋白酶是胰蛋白酶、胶原酶、胰凝乳蛋白酶或羧肽酶或它们的任何组合。

26.如替代方案25或25所述的方法，其中所述蛋白酶是胰蛋白酶。

27.如替代方案24所述的方法，其中所述蛋白酶以1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM或100mM的浓度或以在由前述浓度中的任何两者限定的范围内的浓度提供于所述第三培养基中。

28.如前述替代方案中任一项所述的方法，其中所述方法还包括使所述胎盘或其部分与另外的多种培养基接触，其中所述接触导致获得包含外泌体的多个级分。

29.如替代方案28所述的方法，其中所述第一培养基、所述第二培养基、所述第三培养基或所述另外的培养基包含葡萄糖。

30.如替代方案28或29所述的方法，其中所述第一培养基、所述第二培养基、所述第三培养基或所述另外的培养基包含GM-CSF。

31.如替代方案28-30中任一项所述的方法，其中所述第一培养基、所述第二培养基、所述第三培养基或所述另外的培养基包含血清。

32.如替代方案28-31中任一项所述的方法，其中所述第一培养基、所述第二培养基、所述第三培养基或所述另外的培养基包含DMEM。

33.如替代方案28-32中任一项所述的方法，其中所述第一培养基、所述第二培养基、所述第三培养基或所述另外的培养基包含AHR拮抗剂。

34.如替代方案33所述的方法，其中所述AHR拮抗剂是SR1。

35.如替代方案34所述的方法，其中所述SR1的浓度为1nM、10nM、100nM、200nM、300nM、400nM、500nM、600nM、700nM、800nM、900nM或1mM，或在由前述值中的任何两者限定的范围内的任何其他浓度。

36.如前述替代方案中任一项所述的方法，其中使所述第一培养基与所述胎盘或其部分接触，同时维持0℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃或40℃的温度或在由前述温度中的任何两者限定的范围内的温度。

37.如前述替代方案中任一项所述的方法，其中使所述第二培养基与所述胎盘或其部分接触，同时维持0℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃或40℃的温度或在由前述温度中的任何两者限定的范围内的温度。

38.如前述替代方案中任一项所述的方法，其中使所述第三培养基与所述胎盘或其部分接触，同时维持0℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃或40℃的温度或在由前述值中的任何两者限定的范围内的温度。

39.如替代方案28-38中任一项所述的方法，其中使所述另外的多种培养基与所述胎盘或其部分接触，同时维持0℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃或40℃的温度或在由前述值中的任何两者限定的范围内的温度。

40.如前述替代方案中任一项所述的方法，其中所述第一灌注、所述第二灌注或所述第三灌注或所述另外的多种培养基包含抗生素。

41.如前述替代方案中任一项所述的方法，其中通过包括以下步骤的方法从所述第一级分、所述第二级分和/或所述第三级分或所述多个级分中分离所述外泌体：

(a)使所述第一级分、所述第二级分和/或所述第三级分或所述多个级分通过组织过滤器；

(b)对(a)中收集的滤液进行第一次离心以产生细胞沉淀物和第一上清液；

(c)对第一上清液进行第二次离心以产生第二上清液；和

(d)对所述第二上清液进行第三次离心以产生外泌体沉淀物；以及任选地，

(e)将所述外泌体重悬于溶液中。

42.如前述替代方案中任一项所述的方法，其中所述外泌体包含CD63、CD63-A、穿孔素、Fas、TRAIL或颗粒酶B或它们的任何组合。

43.如替代方案42所述的方法，其中所述外泌体包含CD63A。

44.如前述替代方案中任一项所述的方法，其中所述外泌体包含信号传导分子。

45.如前述替代方案中任一项所述的方法，其中所述外泌体包含细胞因子、mRNA或miRNA。

46.如前述替代方案中任一项所述的方法，所述方法还包括通过亲和色谱法分离外泌体，其中亲和色谱法对除去包含病毒抗原、病毒蛋白、细菌抗原、细菌蛋白、真菌抗原或真菌蛋白的外泌体具有选择性。

47.如前述替代方案中任一项所述的方法，所述还包括通过一个或多个另外的亲和色谱法步骤分离外泌体，其中所述一个或多个另外的色谱法步骤对除去包含炎症标志物和/或肿瘤标志物的外泌体具有选择性。

还提供了一种组合物，所述组合物包含源自人胎盘的外泌体，其中所述外泌体对CD1c、CD20、CD24、CD25、CD29、CD2、CD3、CD8、CD9、CD11c、CD14、CD19、CD31、CD40、CD41b、CD42a、CD44、CD45、CD49e、CD4、CD56、CD62P、CD63、CD69、CD81、CD86、CD105、CD133-1、CD142、CD146、CD209、CD326、HLA-ABC、HLA-DRDPDQ、MCSP、ROR1、SSEA-4或它们的组合呈阳性。

本文所述的外泌体包含特定标志物。此类标志物可例如适用于鉴定所述外泌体并且用于将所述外泌体与其他外泌体(例如并非源自胎盘的外泌体)区分开来。在某些实施方案中，此类外泌体对于一种或多种标志物呈阳性，例如，如通过流式细胞术、例如通过荧光活化细胞分选(FACS)所确定的。此外，本文提供的外泌体可基于某些标志物的不存在而鉴定。可使用本领域已知的方法，例如荧光活化细胞分选(FACS)来完成此类标志物的存在或不存在的确定。

在一些实施方案中，所述外泌体对CD1c、CD20、CD24、CD25、CD29、CD2、CD3、CD8、CD9、CD11c、CD14、CD19、CD31、CD40、CD41b、CD42a、CD44、CD45、CD49e、CD4、CD56、CD62P、CD63、CD69、CD81、CD86、CD105、CD133-1、CD142、CD146、CD209、CD326、HLA-ABC、HLA-DRDPDQ、MCSP、ROR1和SSEA-4呈阳性。在一些实施方案中，所述外泌体对选自由以下组成的组的2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种标志物呈阳性：CD1c、CD20、CD24、CD25、CD29、CD2、CD3、CD8、CD9、CD11c、CD14、CD19、CD31、CD40、CD41b、CD42a、CD44、CD45、CD49e、CD4、CD56、CD62P、CD63、CD69、CD81、CD86、CD105、CD133-1、CD142、CD146、CD209、CD326、HLA-ABC、HLA-DRDPDQ、MCSP、ROR1和SSEA-4。

在一些实施方案中，所述外泌体是CD3-、CD11b-、CD14-、CD19-、CD33-、CD192-、HLA-A-、HLA-B-、HLA-C-、HLA-DR-、CD11c-或CD34-。在一些实施方案中，所述外泌体是CD3-、CD11b-、CD14-、CD19-、CD33-、CD192-、HLA-A-、HLA-B-、HLA-C-、HLA-DR-、CD11c-和CD34-。

在一些实施方案中，所述外泌体包含非编码RNA分子。在一些实施方案中，所述RNA分子是微小RNA。在一些实施方案中，所述微小RNA选自由表7中的微小RNA以及它们的组合组成的组。在一些实施方案中，所述微小RNA选自由以下组成的组：hsa-mir-26b、hsa-miR-26b-5p、hsa-mir-26a-2、hsa-mir-26a-1、hsa-miR-26a-5p、hsa-mir-30d、hsa-miR-30d-5p、hsa-mir-100、hsa-miR-100-5p、hsa-mir-21、hsa-miR-21-5p、hsa-mir-22、hsa-miR-22-3p、hsa-mir-99b、hsa-miR-99b-5p、hsa-mir-181a-2、hsa-mir-181a-1、hsa-miR-181a-5p以及它们的组合。

在一些实施方案中，所述外泌体包含选自由表3中的细胞因子以及它们的组合组成的组的细胞因子。

在一些实施方案中，所述外泌体包含选自由表4中的细胞因子受体以及它们的组合组成的组的细胞因子受体。

在一些实施方案中，所述外泌体包含选自由表6中的蛋白质以及它们的组合组成的组的蛋白质。在一些实施方案中，所述外泌体包含选自由以下组成的组的蛋白质：细胞质乌头酸水合酶、细胞表面糖蛋白MUC18、蛋白质精氨酸N-甲基转移酶1、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G(s)亚基α、Cullin-5、钙结合蛋白39、葡糖苷酶2亚基β、细胞内氯离子通道蛋白5、脑信号蛋白-3B、60S核糖体蛋白L22、剪接体RNA解旋酶DDX39B、转录活化因子蛋白Pur-α、程序性细胞死亡蛋白10、含BRO1结构域的蛋白BROX、犬尿氨酸--酮戊二酸转氨酶3、层粘连蛋白亚基α-5、ATP结合盒亚家族E成员1、突触融合蛋白结合蛋白3、蛋白酶体亚基β-7型以及它们的组合。

在一些实施方案中，所述外泌体包含至少一种标志物分子，所述至少一种标志物分子的水平是源自间充质干细胞、脐带血或胎盘灌流液的外泌体的至少两倍水平。在一些实施方案中，所述外泌体包含至少一种标志物分子，所述至少一种标志物分子的水平是源自间充质干细胞、脐带血以及胎盘灌流液的外泌体的至少两倍。

在一些实施方案中，从整个胎盘培养物的培养基中分离所述外泌体。在一些实施方案中，从包含胎盘小叶或胎盘的部分的整个培养物的培养基中分离所述外泌体。

在一些实施方案中，通过本发明的方法产生所述外泌体。在一些实施方案中，所述组合物呈适于静脉内施用的形式。在一些实施方案中，所述组合物呈适于局部注射的形式。在一些实施方案中，所述组合物呈适于局部施用的形式。在一些实施方案中，所述组合物呈适于超声递送的形式。

还提供了增加免疫细胞的增殖的方法，所述方法包括使所述细胞与如权利要求48-65中任一项所述的组合物接触。

在一些实施方案中，所述免疫细胞是T细胞。

在一些实施方案中，所述免疫细胞是NK细胞。

在一些实施方案中，所述免疫细胞是CD34+细胞。

还提供了抑制癌细胞的增殖的方法，所述方法包括使所述细胞与本发明的组合物接触。

还提供了促进所述受试者的血管生成或血管形成的方法，所述方法包括向所述受试者施用本发明的组合物。

还提供了调节所述受试者的免疫系统的方法，所述方法包括向所述受试者施用本发明的组合物。

还提供了修复受试者的患病或受损组织的方法，所述方法包括向所述受试者施用本发明的组合物。

还提供了治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用本发明的组合物。

在以上方法的一些实施方案中，所述受试者是人。

本文还提供了包含外泌体的组合物。此类组合物通常不包含所述外泌体所来源的胎盘细胞。此外，此类组合物通常不包含来自所述外泌体所来源的细胞培养物的细胞培养物上清液。

在某些实施方案中，将纯化的外泌体配制成适于施用至有需要的受试者的药物组合物。在某些实施方案中，所述受试者是人。本文提供的含有胎盘来源的外泌体的药物组合物可被配制为局部(locally)、全身、皮下、肠胃外、静脉内、肌内、局部(topically)、口服、皮内、透皮或鼻内施用至有需要的受试者。在某一实施方案中，将本文提供的含有胎盘来源的外泌体的药物组合物配制用于局部施用。在某一实施方案中，将本文提供的含有胎盘来源的外泌体的药物组合物配制用于全身皮下施用。在某一实施方案中，将本文提供的含有胎盘来源的外泌体的药物组合物配制用于肠胃外施用。在某一实施方案中，将本文提供的含有胎盘来源的外泌体的药物组合物配制用于肌内施用。在某一实施方案中，将本文提供的含有胎盘来源的外泌体的药物组合物配制用于局部施用。在某一实施方案中，将本文提供的含有胎盘来源的外泌体的药物组合物配制用于口服施用。在某一实施方案中，将本文提供的含有胎盘来源的外泌体的药物组合物配制用于皮内施用。在某一实施方案中，将本文提供的含有胎盘来源的外泌体的药物组合物配制用于透皮施用。在某一实施方案中，将本文提供的含有胎盘来源的外泌体的药物组合物配制用于鼻内施用。在一个具体实施方案中，将本文提供的含有胎盘来源的外泌体的药物组合物配制用于静脉内施用。

在另一方面，本文提供了本文所述的外泌体和/或包含外泌体的药物组合物的用途。

在一个具体实施方案中，本文所述的外泌体和/或包含外泌体的药物组合物用于治疗和/或预防有需要的受试者的疾病和/或疾患。在一个具体实施方案中，本文所述的外泌体和/或包含外泌体的药物组合物用于促进有需要的受试者的血管生成和/或血管形成。在另一个具体实施方案中，本文所述的外泌体和/或包含外泌体的药物组合物用于调节有需要的受试者的免疫活性(例如，增加免疫应答或降低免疫应答)。在另一个具体实施方案中，本文所述的外泌体和/或包含外泌体的药物组合物用于修复有需要的受试者的组织损伤，例如由急性或慢性损伤引起的组织损伤。

在另一个具体实施方案中，本文所述的来源的外泌体和/或包含外泌体的药物组合物用于在用以治疗和/或预防有需要的受试者的疾病和/或疾患的方法中使用。在另一个实施方案中，本文所述的包含外泌体的药物组合物用于在用以治疗有需要的受试者的疾病和/或疾患的方法中使用。在另一个实施方案中，本文所述的包含外泌体的药物组合物用于在用以预防有需要的受试者的疾病和/或疾患的方法中使用。在一个具体实施方案中，本文所述的包含外泌体的药物组合物用于在用以促进有需要的受试者的血管生成和/或血管形成的方法中使用。在另一个具体实施方案中，本文所述的包含外泌体的药物组合物用于在用以调节有需要的受试者的免疫活性(例如，增加免疫应答或降低免疫应答)的方法中使用。在另一个具体实施方案中，本文所述的包含外泌体的药物组合物用于在用以修复有需要的受试者的组织损伤(例如，由急性或慢性损伤引起的组织损伤)的方法。

在另一个具体实施方案中，本文所述的外泌体和/或包含外泌体的药物组合物用作细胞保护剂。在另一方面，本文所述的外泌体和/或包含外泌体的药物组合物以适于药物用途的药盒的形式提供。

附图说明

图1示出用于培养用以外泌体分离的细胞的示意图。

图2A-图2C示出3种pExo分离物，通过NanoSight分析了所述pExo分离物的大小分布。这项工作由SBI Inc.(System Bioscience Inc.)使用合同服务(www.systembio.com/services/exosome-services/)来执行和报告。

图3A-3C示出使用MACSPlex试剂盒，与胎盘灌流液外泌体(图3B)和脐带血血清来源的外泌体(图3C)相比，pExo(N＝12)(图3A)上存在的蛋白质标志物。

图4示出在胎盘外泌体群体中鉴定的蛋白质的功能途径。

图5示出在三个胎盘外泌体样品中鉴定的共有和独特的蛋白质。

图6示出pExo促进人皮肤成纤维细胞在transwell系统中的迁移。

图7示出pExo促进人脐带血管内皮细胞的迁移。

图8示出pExo刺激HUVEC的增殖。

图9示出pExo刺激人CD34+细胞的增殖。

图10示出pExo刺激人CD34+细胞的集落形成。

图11示出pExo抑制SKOV3癌细胞的增殖。

图12示出pExo抑制A549癌细胞的增殖。

图13示出pExo抑制MDA321癌细胞的增殖。

图14示出pExo不影响培养物中的CD3+T细胞的增殖。

图15示出pExo增加UBC T CD3+细胞中的活化标志物CD69的表达。

图16示出pExo增加成人PBMC T CD3+细胞中的活化标志物CD69的表达。

图17示出pExo增加PBMC中的CD56+NK细胞。

具体实施方式

5.1.胎盘来源的外泌体

如下文所述，本文所述的胎盘来源的外泌体可通过它们的形态和/或分子标志物来选择和鉴定。,本文所述的胎盘来源的外泌体不同于本领域中已知的外泌体，例如绒毛膜间充质干细胞来源的外泌体，例如在Salomon等人,2013,PLOS ONE,8:7,e68451中描述的外泌体。因此，如本文所用的术语“胎盘来源的外泌体”并不意味着包括从绒毛膜间充质干细胞获得或得到的外泌体。

在某些实施方案中，本文所述的胎盘来源的外泌体群体不包含细胞，例如有核细胞，例如胎盘细胞。

5.1.1.胎盘来源的外泌体标志物

本文所述的胎盘来源的外泌体含有可用于鉴定和/或分离所述外泌体的标志物。这些标志物可以是例如蛋白质、核酸、糖分子、糖基化蛋白质、脂质分子，并且可以单体、寡聚体和/或多聚体形式存在。在某些实施方案中，所述标志物由外泌体所来源的细胞产生。在某些实施方案中，所述标志物由外泌体所来源的细胞提供，但是所述细胞不以更高的水平表达所述标志物。在一个具体实施方案中，当与对照标志物分子相比时，与起源细胞相比，本文所述的外泌体的标志物在外泌体中更高。在另一个具体的实施方案中，与从另一种细胞类型(例如，在Salomon等人,2013,PLOS ONE,8:7,e68451中描述的绒毛膜间充质干细胞和前脂肪细胞间充质干细胞)相比，本文所述的外泌体的标志物在所述外泌体中富集，其中所述外泌体通过相同的方法分离。

外泌体的三维结构允许标志物保留在外泌体的表面上和/或包含在外泌体内。类似地，标志物分子可部分存在于外泌体内，部分存在于外泌体的外表面上和/或跨过外泌体的磷脂双层。在一个具体实施方案中，与本文所述的外泌体相关的标志物是蛋白质。在某些实施方案中，所述标志物是跨膜蛋白，所述跨膜蛋白锚定在外泌体磷脂双层内，或锚定跨过外泌体磷脂双层，以使得所述蛋白质分子的部分在外泌体内，同时同一分子的部分暴露于外泌体的外表面。在某些实施方案中，所述标志物完全包含在外泌体内。在另一个具体实施方案中，与本文所述的外泌体相关的标志物是核酸。在某些实施方案中，所述核酸是非编码RNA分子，例如微小RNA(miRNA)。

5.1.1.1.表面标志物

本文所述的外泌体包含表面标志物，所述表面标志物允许它们的鉴定并且可用于分离/获得基本纯的细胞外泌体群体，而不含它们的起源细胞以及其他细胞和非细胞物质。用于确定外泌体表面标志物组成的方法是本领域已知的。例如，可通过荧光活化细胞分选(FACS)或蛋白质印迹法检测外泌体表面标志物。

在某些实施方案中，与本领域中已知的外泌体相比，本文所述的外泌体包含更大量的表面标志物，如通过例如FACS所测定的。

5.1.1.2.产量

可根据本文描述的方法分离本文描述的外泌体，并且可量化它们的产量。在一个具体实施方案中，以每升培养基(例如，有或无血清的培养基)约0.5-5.0mg的浓度分离本文所述的外泌体。在另一个具体实施方案中，以每升培养基(例如，含血清的培养基)约2-3mg的浓度分离本文所述的外泌体。在另一个具体实施方案中，以每升培养基(例如，缺乏血清的培养基)约0.5-1.5mg的浓度分离本文所述的外泌体。

5.1.2.储存和保存

可保存本文所述的外泌体，即，将所述外泌体置于允许长期储存的条件下或抑制外泌体降解的条件下。

在某些实施方案中，本文所述的外泌体可在根据以上所述的方法收集后在适当的温度下储存在包含缓冲剂的组合物中。在某些实施方案中，例如在约-20℃或约-80℃下冷冻储存本文所述的外泌体被。

在某些实施方案中，可将本文所述的外泌体冷冻保存在例如小容器中，例如安瓿(例如2mL小瓶)中。在某些实施方案中，以约0.1mg/mL至约10mg/mL的浓度冷冻保存本文所述的外泌体。

在某些实施方案中，在约-80℃至约-180℃的温度下冷冻保存本文所述的外泌体。冷冻保存的外泌体可在解冻用于使用之前转移至液氮中。在一些实施方案中，例如，一旦安瓿达到约-90℃，就将它们转移至液氮储存区域。也可使用受控速率的冷冻机进行冷冻保存。在使用前，可将冷冻保存的外泌体在约25℃至约40℃的温度下解冻。

在某些实施方案中，本文所述的外泌体在约4℃至约20℃的温度下储存短时间段(例如，少于两周)。

5.2.组合物

本文还提供了包含本文提供的外泌体的组合物，例如药物组合物。本文所述的组合物可用于治疗受试者(例如人受试者)的某些疾病和病症，其中用外泌体治疗是有益的。

在某些实施方案中，除了包含本文提供的外泌体之外，本文描述的组合物(例如药物组合物)还包含药学上可接受的载体。如本文所用，术语“药学上可接受的”意指由联邦监管机构或州政府批准的或者在美国药典或其他通常认可的药典中列出，以用于动物并且更具体地用于人。如本文在药学上可接受的载体的上下文中所用，术语“载体”是指与药物组合物一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。盐水溶液以及水性右旋糖和甘油溶液也可用作液体载体，特别是用于可注射溶液。适合的赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂乳粉、甘油、丙烯、乙二醇、水，乙醇等。适合的药物载体的实例描述于“Remington's PharmaceuticalSciences”JP Remington和AR Gennaro,1990,第18版中。

在某些实施方案中，本文所述的组合物另外包含一种或多种缓冲剂，例如盐水、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、杜氏(Dulbecco’s)PBS(DPBS)和/或蔗糖磷酸盐谷氨酸盐缓冲剂。在其他实施方案中，本文所述的组合物不包含缓冲剂。在某些实施方案中，本文所述的组合物另外包含勃脉力(plasmalyte)。

在某些实施方案中，本文所述的组合物另外包含一种或多种盐，例如氯化钠、氯化钙、磷酸钠、谷氨酸一钠和铝盐(例如，氢氧化铝、磷酸铝、明矾(硫酸铝钾)或此类铝盐的混合物)。在其他实施方案中，本文所述的组合物不包含盐。

本文所述的组合物可与用于施用的说明书一起包括在容器、包装或分配器中。

本文所述的组合物可在使用之前储存，例如，所述组合物可冷冻储存(例如，在约-20℃或在约-80℃)；储存在冷藏条件下(例如，在约4℃)；或储存在室温下。

5.2.1.制剂和施用途径

对于治疗和/或预防疾病或疾患的治疗性用途将有效的本文所述的外泌体或组合物的量将取决于疾病的性质，并且可通过标准临床技术来确定。待施用至受试者的外泌体或其组合物的精确剂量还将取决于施用途径和待治疗的疾病或疾患的严重性，并且应根据执业医师的判断和每个受试者的情况来确定。例如，有效剂量可根据施用方式、靶部位、患者的生理状态(包括年龄、体重和健康状况)、患者是人还是动物、所施用的其他药物以及治疗是预防性还是治疗性而变化。最佳地滴定治疗剂量以优化安全性和功效。

本文所述的外泌体或其组合物的施用可经由本领域中已知的各种途径进行。在某些实施方案中，通过局部(local)、全身、皮下、肠胃外、静脉内、肌内、局部(topical)、口服、皮内、透皮或鼻内施用来施用本文所述的外泌体或其组合物。在一个具体实施方案中，所述施用是经由静脉内注射。在一个具体实施方案中，所述施用是经由皮下注射。在一个具体实施方案中，所述施用是局部施用。在另一个具体的实施方案中，以包含细胞外基质的制剂施用所述外泌体或其组合物。在另一个具体实施方案中，外泌体或其组合物与一个或多个另外的递送装置(例如支架)组合施用。在另一个具体实施方案中，局部施用所述外泌体或其组合物，例如在待用所述外泌体或组合物治疗的区域的部位处或周围，如缺氧组织(例如，用于治疗缺血性疾病)或引流淋巴结。

5.3.使用方法

5.3.1.受益于血管生成的疾病的治疗

本文所述的外泌体及其组合物促进血管生成，并且因此可用于治疗受益于血管生成的疾病和病症。因此，本文提供了使用本文所述的外泌体或其组合物促进有需要的受试者的血管生成的方法。如本文所用，术语“治疗”涵盖受试者的疾病、病症或疾患或其任何参数或症状的治愈、补救、改善、严重程度减轻或时间过程减少。在一个具体实施方案中，根据本文提供的方法治疗的受试者是哺乳动物，例如人。

在一个实施方案中，本文提供了诱导受试者的血管形成或血管生成的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文提供的外泌体或其组合物。因此，本文提供的方法可用于治疗受试者的受益于血管生成/血管形成增加的疾病和病症。受益于血管生成增加且因此可用本文所述的外泌体和组合物治疗的此类疾病/疾患的实例包括但不限于心肌梗塞、充血性心力衰竭、外周动脉疾病、严重肢体缺血、周围性血管疾病、左心发育不全综合征、糖尿病足部溃疡、静脉性溃疡或动脉性溃疡。

在一个实施方案中，本文提供可治疗例如在外周脉管系统中具有血流中断的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文提供的外泌体或其组合物。在一个具体实施方案中，本文提供的方法包括用本文提供的外泌体或其组合物治疗患有局部缺血的受试者。在某些实施方案中，局部缺血是外周动脉疾病(PAD)，例如是严重肢体缺血(CLI)。在某些其他实施方案中，局部缺血是周围性血管疾病(PVD)、外周动脉疾病、缺血性血管疾病、缺血性心脏病或缺血性肾病。

5.3.2.患者群体

在某些实施方案中，将本文所述的外泌体施用至需要治疗本文所述的任何疾病或疾患的受试者。在另一个实施方案中，将本文所述的组合物施用至需要治疗本文所述的任何疾病或疾患的受试者。在某些实施方案中，所述受试者是人。

在一个具体实施方案中，将本文所述的外泌体或组合物施用至需要治疗以增加血管生成和/或血管形成的受试者(例如人)。

5.4.药盒

本文提供了一种药物包或药盒，所述药物包或药盒包括填充有本文所述的药物组合物(即包含本文所述的外泌体的组合物)的一种或多种成分的一个或多个容器。任选地，与这样一个或多个容器相关联的可以是由管理药物或生物制品的制造、使用或销售的政府机构规定的形式的公告，所述公告反映所述机构针对人施用，对制造、使用或销售的许可。

本文所述的药盒可用于以上方法中。本文所述的组合物可以易于向个体施用的形式制备。例如，所述组合物可容纳在适合于医疗用途的容器内。这样的容器可以是例如无菌塑料袋、烧瓶、广口瓶或可容易地从其分配组合物的其他容器。例如，所述容器可以是血袋或适于向接受者静脉内施用液体的其他塑料的、医学上可接受的袋。

示例性胎盘培养

胎盘是细胞的储库，所述细胞包括干细胞，如造血干细胞(HSC)和非造血干细胞。本文描述了从胎盘或其部分中分离外泌体的方法，所述胎盘或其部分在生物反应器中进行培养。外泌体在培养过程中由细胞分泌，并且外泌体被分泌到培养基中，这有助于外泌体的进一步加工和分离。还可在不同的培养阶段(例如，在不同的时间点，并且在每个回收步骤可使用不同的灌注液)从胎盘或其部分中分离外泌体。一旦在培养基中，就可使用例如离心、可商购的外泌体分离试剂盒、凝集素亲和力和/或亲和色谱法(例如，利用固定化的结合剂，如附着至基底的结合剂，所述结合剂对小Rab家族GTP酶、膜联蛋白、浮舰蛋白(flotillin)、Alix、Tsg101、ESCRT复合物、CD9、CD37、CD53、CD63、CD63A、CD81、CD82)、Hsp70、Hsp90、上皮细胞粘附分子(EpCam)、穿孔素、TRAIL、颗粒酶B、Fas、一种或多种癌症标志物(如：Fas配体、CD24、EpCAM、EDIL3、纤连蛋白、存活素、PCA3、TMPRSS2:ERG、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1、TGF-β1、MAGE 3/6、EGFR、EGFRvIII、CD9、CD147、CA-125、EpCam和/或CD24)或一种或多种炎症或病原性标志物(如：病毒、真菌或细菌蛋白或肽，包括但不限于α-突触核蛋白、HIV或HCV蛋白、tau、β-淀粉样蛋白、TGF-β、TNF-α、胎球蛋白-A和/或CD133)具有特异性)进一步分离外泌体。所述分离的外泌体可用于治疗剂、诊断剂和用作生物技术工具。

如本文所述的“外泌体”是存在于许多且可能所有真核生物流体中的囊泡，包括腹水、血液、尿液、血清和母乳。它们也可称为细胞外囊泡。外泌体是从活细胞分泌的双脂质膜囊泡，所述外泌体在细胞间通讯中起重要作用。外泌体由细胞(如干细胞、上皮细胞)产生，并且外泌体的一种亚型(定义为基质结合的纳米囊泡(MBV))存在于细胞外基质(ECM)生物支架(非流体)中。所报告的外泌体的直径介于30与100nm之间，所述直径比低密度脂蛋白(LDL)大、但比例如红细胞小得多。当多囊泡体与质膜融合时，外泌体可从细胞释放，或者直接从质膜释放。

已显示外泌体具有专门的功能，并且在诸如凝血、细胞间信号传导和废物管理的过程中起关键作用。已知由胎盘分泌的细胞外囊泡和外泌体有助于胎盘与母体组织之间的通讯，以维持母胎耐受性。从人胎盘外植体中分离的外泌体显示具有免疫调节活性。还显示干细胞来源的外泌体通过抑制星形胶质细胞和小胶质细胞的活化来减轻神经炎症，并且可能通过靶向神经源性生态位来促进神经发生，两者都有助于TBI后的神经组织修复和功能恢复。(回顾Yang等人2017,Frontiers in Cellular Neuroscience)。源自人胚胎间充质干细胞的外泌体也促进骨软骨再生(Zhang等人2016,Osteoarthritis and Cartilage)。由人胎盘分泌的携带功能性Fas配体和Trail分子的外泌体显示在活化的免疫细胞中传递细胞凋亡，从而表明胎儿的外泌体介导免疫豁免。(Ann-Christin Stenqvist等人,Journal ofImmunology,2013,191:doi:10.4049).

外泌体含有活性生物制剂，包括脂质、细胞因子、微小RNA、mRNA和DNA。它们还可经由遗传物质和/或蛋白质转移充当细胞间通讯的介质。外泌体还可含有细胞类型特异性信息，所述信息可反映细胞的功能或生理状态。因此，关于外泌体的临床和生物学应用的发展越来越感兴趣。

因此，使用本文所述的方法(任选地包括表征所述外泌体(例如，通过鉴定外泌体上的一种或多种蛋白质或标志物的存在或不存在))从人胎盘或其部分中分离的外泌体可用于刺激免疫调节、抗纤维化环境和/或促再生作用。因此，可(例如，根据所述外泌体上存在或不存在的标志物)选择使用本文所述的方法从人胎盘或其部分中分离的外泌体，纯化、冷冻、冻干、包装和/或作为治疗性产品和/或生物技术工具分配。

在一些替代方案中，鉴定具有肿瘤标志物或肽、病原性标志物或肽(如病毒、真菌或细菌标志物或肽)和/或炎症标志物(如炎性肽)的外泌体可能是有益的，以使得此类外泌体可从外泌体群体中除去(例如，用对此类肿瘤标志物或肽、病原性标志物或肽和/或炎症标志物或肽具有特异性的结合分子如抗体或其结合部分通过亲和色谱法除去)。因此，在一些替代方案中，例如，通过本文所述的方法从人胎盘或其部分中分离第一外泌体群体，并且一旦分离了所述第一外泌体群体，就使用具有固定化的抗体或其结合部分的基底(例如，具有所述固定化的抗体或其结合部分的膜、树脂、珠粒或器皿)对这一外泌体群体进行进一步加工以除去一个或多个外泌体亚群，其中所述固定的抗体或其结合部分对所述外泌体亚群上存在的标志物或肽具有特异性，所述外泌体被选择用于进一步分离，如一种或多种肿瘤标志物或肽、病原性标志物或肽(例如病毒、真菌或细菌标志物或肽)和/或炎症标志物或炎性肽。在一些替代方案中，使通过本文所述的方法从人胎盘或其部分中分离的第一外泌体群体与具有固定化的抗体或其结合部分的基底(例如具有所述固定化的抗体或其结合部分的膜、树脂、珠粒或器皿)接触，其中所述固定化的抗体或其结合部分对一种或多种癌症标志物如：Fas配体、CD24、EpCAM、EDIL3、纤连蛋白、存活素、PCA3、TMPRSS2:ERG、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1、TGF-β1、MAGE 3/6、EGFR、EGFRvIII、CD9、CD147、CA-125、EpCam和/或CD24具有特异性，以便基于对所述固定化的抗体或其结合部分的亲和力从所述第一外泌体群体中分离第二外泌体群体。在一些替代方案中，使通过本文所述的方法从人胎盘或其部分中分离的第一外泌体群体与具有固定化的抗体或其结合部分的基底(例如具有所述固定化的抗体或其结合部分的膜、树脂、珠粒或器皿)接触，其中所述固定化的抗体或其结合部分对一种或多种炎症标志物或病原性标志物如：病毒、真菌或细菌蛋白或肽，包括但不限于α-突触核蛋白、HIV或HCV蛋白、tau、β-淀粉样蛋白、TGF-β、TNF-α、胎球蛋白-A和/或CD133或其部分具有特异性，以便基于对所述固定化的抗体或其结合部分的亲和力从所述第一外泌体群体中分离第二外泌体群体。

在一些替代方案中，通过本文所述的方法分离和/或选择的外泌体群体具有可用于治疗剂的标志物或肽，如穿孔素和/或颗粒酶B，其已被证明在体外和体外介导抗肿瘤活性(J Cancer 2016；7(9):1081-1087)；或Fas，其已在针对靶癌细胞发挥细胞毒活性的外泌体中发现。(Theranostics 2017；7(10):2732-2745)。因此，在一些替代方案中，使通过本文所述的方法从人胎盘或其部分中分离的第一外泌体群体与具有固定化的抗体或其结合部分的基底(例如，具有所述固定化的抗体或其结合部分的膜、树脂、珠粒或器皿)接触，其中所述固定化的抗体或其结合部分对穿孔素、TRAIL和/或颗粒酶B和/或Fas具有特异性，并且基于所述固定化的抗体或其结合部分对穿孔素、TRAIL和/或颗粒酶B和/或Fas的亲和力从所述第一外泌体群体中分离第二外泌体群体。在一些替代方案中，分离外泌体群体，所述外泌体群体包含CD63 RNA和/或所需的微小RNA。在一些替代方案中，使用亲和色谱法或免疫技术分离外泌体群体和/或在分离后表征外泌体群体，其中所述外泌体群体包含标志物或肽，如小Rab家族GTP酶、膜联蛋白、浮舰蛋白、Alix、Tsg101、ESCRT复合物、CD9、CD37、CD53、CD63、CD63A、CD81、CD82)、Hsp70、Hsp90)和/或上皮细胞粘附分子(EpCam)。如上文所详述，在一些替代方案中，使通过本文所述的方法从人胎盘或其部分中分离的第一外泌体群体与具有固定化的抗体或其结合部分的基底(例如，具有所述固定化的抗体或其结合部分的膜、树脂、珠粒或器皿)接触，其中所述固定化的抗体或其结合部分对小Rab家族GTP酶、膜联蛋白、浮舰蛋白、Alix、Tsg101、ESCRT复合物、CD9、CD37、CD53、CD63、CD63A、CD81、CD82)、Hsp70、Hsp90)和/或上皮细胞粘附分子(EpCam)具有特异性，并且基于所述固定化的抗体或其结合部分对小Rab家族GTP酶、膜联蛋白、浮舰蛋白、Alix、Tsg101、ESCRT复合物、CD9、CD37、CD53、CD63、CD63A、CD81、CD82)、Hsp70、Hsp90)和/或上皮细胞粘附分子(EpCam)的亲和力从所述第一外泌体群体中分离第二外泌体群体。在其他替代方案中，使通过本文所述的方法从人胎盘或其部分中分离的外泌体群体与对小Rab家族GTP酶、膜联蛋白、浮舰蛋白、Alix、Tsg101、ESCRT复合物、CD9、CD37、CD53、CD63、CD63A、CD81、CD82、Hsp70、Hsp90和/或上皮细胞粘附分子(EpCam)中的一种或多种具有特异性的抗体或其结合部分接触，并且用具有可检测试剂的第二结合剂检测所述抗体或其结合部分的结合，所述第二结合剂结合至所述抗体或其结合部分(例如，利用ELISA或印迹程序)，以确认所述分离的外泌体群体中小Rab家族GTP酶、膜联蛋白、浮舰蛋白、Alix、Tsg101、ESCRT复合物、CD9、CD37、CD53、CD63、CD63A、CD81、CD82)、Hsp70、Hsp90和/或上皮细胞粘附分子(EpCam)的存在。

如本文所述，“分离”是用于使外泌体与其他材料分离的方法。外泌体的分离可通过离心机中的高离心力，利用可商购的试剂盒(例如SeraMir外泌体RNA纯化试剂盒(SBIsystem biosciences)、完整外泌体纯化和RNA分离(组合试剂盒)Norgen BioTek Corp.)以及使用凝集素亲和力或亲和色谱法，用对外泌体上的标志物或肽如以上提及的标志物或肽具有特异性的结合剂(例如，抗体或其结合部分)(例如，对小Rab家族GTP酶、膜联蛋白、浮舰蛋白、Alix、Tsg101、ESCRT复合物、CD9、CD37、CD53、CD63、CD63A、CD81、CD82)、Hsp70、Hsp90、上皮细胞粘附分子(EpCam)、穿孔素、TRAIL、颗粒酶B、Fas、一种或多种癌症标志物(如：Fas配体、CD24、EpCAM、EDIL3、纤连蛋白、存活素、PCA3、TMPRSS2:ERG、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1、TGF-β1、MAGE 3/6、EGFR、EGFRvIII、CD9、CD147、CA-125、EpCam和/或CD24)或一种或多种炎症或病原性标志物(如：病毒、真菌或细菌蛋白或肽，包括但不限于α-突触核蛋白、HIV或HCV蛋白、tau、β-淀粉样蛋白、TGF-β、TNF-α、胎球蛋白-A和/或CD133))具有特异性的结合剂进行。

如本文所述，“胎盘”是怀孕的真哺乳亚纲哺乳动物的子宫中的器官，其通过脐带养育和维持胎儿。如本文所述，胎盘可用作获得外泌体的生物反应器。在一些替代方案中，脱细胞的胎盘可用作支架和生物反应器，其具有外源性细胞群体(例如，已经接种到脱细胞的胎盘上并与脱细胞的胎盘一起培养的细胞群体)，以便从所述细胞获得外泌体群体，所述外泌体群体是细胞特异性的。因此，在一些替代方案中，将脱细胞的胎盘接种再生细胞群体(例如，包含干细胞和/或内皮细胞和/或祖细胞的细胞群体)，并且在生物反应器中在所述脱细胞的胎盘上培养所述再生细胞群体，并且使用离心、可商购的外泌体分离试剂盒、凝集素亲和力和/或亲和色谱法，施用对所述外泌体上的标志物或肽如以上提及的标志物或肽具有特异性的结合剂(例如，抗体或其结合部分)(例如，对小Rab家族GTP酶、膜联蛋白、浮舰蛋白、Alix、Tsg101、ESCRT复合物、CD9、CD37、CD53、CD63、CD63A、CD81、CD82)、Hsp70、Hsp90、上皮细胞粘附分子(EpCam)、穿孔素、TRAIL、颗粒酶B、Fas、一种或多种癌症标志物(如：Fas配体、CD24、EpCAM、EDIL3、纤连蛋白、存活素、PCA3、TMPRSS2:ERG、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1、TGF-β1、MAGE 3/6、EGFR、EGFRvIII、CD9、CD147、CA-125、EpCam和/或CD24)或一种或多种炎症或病原性标志物(如：病毒、真菌或细菌蛋白或肽，包括但不限于α-突触核蛋白、HIV或HCV蛋白、tau、β-淀粉样蛋白、TGF-β、TNF-α、胎球蛋白-A和/或CD133))具有特异性的结合剂从所述培养的细胞中分离细胞特异性外泌体。

如本文所述，“腹水”是内衬腹部和腹部器官(腹膜腔)的膜之间的空间中的过量液体。腹水可以是外泌体的来源。

如本文所述，“血浆”是血液和淋巴液的液体部分，其占血液体积的约一半。血浆不含细胞，并且与血清不同，血浆没有凝结。血浆含有抗体和其他蛋白质。血浆可以是外泌体的来源。

本文提供了培养细胞以产生大量外泌体的若干方法。用于回收或分离外泌体的培养基可提供有一种或多种营养物、酶或螯合剂。螯合剂可用于促进外泌体从培养的细胞中释放。在不限制的情况下，在所述方法的一些中使用的螯合剂可包括膦酸酯、BAPTA四钠盐、BAPTA/AM、二-Notrophen TM试剂四钠盐、EGTA/AM、吡哆醛异烟酰肼、N,N,N′,N′-四-(2吡啶基甲基)乙二胺、6-溴-N′-(2-羟基亚苄基)-2-甲基喹啉-4-碳酰肼、1,2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N′,N′-四乙酸四(乙酰氧基甲基酯)、(亚乙基二次氮基)四乙酸(EDTA)、Edathamil、亚乙基二次氮基四乙酸、乙二醇-双(2-氨基乙基醚)-N,N,N′,N′-四乙酸或乙二醇-双(β-氨基乙基醚)-N,N,N′,N′-四乙酸(EGTA)或它们的任何组合。所述螯合剂可以1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM或100mM的浓度或以在由前述浓度中的任何两者限定的范围内的浓度提供于用于培养或分离外泌体的培养基中。如本文所示，培养基中一种或多种螯合剂的存在出人意料地增强了从生物反应器中培养的胎盘回收外泌体。用于培养和/或回收外泌体的培养基也可具有蛋白酶，所述蛋白酶可进一步增强外泌体的释放。在一些替代方案中，培养基中提供的蛋白酶是胰蛋白酶、胶原酶、胰凝乳蛋白酶或羧肽酶。在替代方案中，所述蛋白酶以1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM或100mM的浓度或以在由前述浓度中的任何两者限定的范围内的浓度提供于所述培养基中。也可将一种或多种糖添加至用于培养和/或回收外泌体的培养基中。在一些替代方案中，添加至培养基中的糖是葡萄糖。考虑培养基中葡萄糖的存在增强外泌体的释放。在替代方案中，葡萄糖以1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM或100mM的浓度或以在由前述浓度中的任何两者限定的范围内的浓度提供于所述培养基中。所述培养基还可包含生长因子、细胞因子或一种或多种药物，例如GM-CSF、血清和/或AHR拮抗剂。

从胎盘或其部分收集外泌体的方法

用于从胎盘回收外泌体的示例性方法在图1中示出。用于外泌体分离的来源可来自脐带血浆；当胎盘用作外泌体生成的生物反应器时，可置于胎盘或其部分中的PRP、胎盘灌流液(PS)、胎盘组织培养物(PTS)、胎盘器官培养物(PO)或外源细胞。通过一种方法，收集胎盘或其部分(#200010323，9/25/2017收集)。将胎盘与培养基接触或用标准PSC-100收集方法灌注，收集为PS-1(9/26/2017)。将所述胎盘或其部分在通风橱中孵育至少4小时。将所述胎盘或其部分与培养基(RPMI培养基)接触或用500mL RPMI基础培养基(1％抗生素)灌注，收集为PS-2。然后将所述胎盘或其部分在通风橱中孵育过夜并盖上。将所述胎盘或其部分与750mL盐水溶液接触或用750mL盐水溶液灌注，并且收集为PS-3。然后将样品运送至实验室进行分析(Warren)。在RBC溶解后的同一天通过FACS分析PS1、PS2和PS3。

对于所述分析，将胎盘组织切割成1x1x1 cm的大小，置于T75烧瓶中的100mL溶液(均含1％ P&S)中(各自约1/8胎盘)。测定了四种溶液：A：DMEM培养基；B：PBS；C：PBS+5mMEDTA；D：PBS+0.025％胰蛋白酶-EDTA。然后将其在37℃孵育箱中孵育过夜(O/N)。

然后收获上清液，通过组织过滤器并以400g离心分离以收获细胞(沉淀物)。然后将第一次离心后的上清液离心分离用于外泌体分离(3000g离心汤>10,000离心汤：100,000g沉淀物)

所收集的细胞也用于FACS分析。细胞样品在若干缓冲液中(A＝PTS1；B＝PTS2；C＝PTS-3，D＝PTS4)。回收外泌体，且然后进行测定以鉴定外泌体标志物的存在，从而确认通过所述程序获得并分离了外泌体。

使用ELISA和蛋白质测定鉴定从胎盘生物反应器中分离的外泌体群体

通过上述方法收集来自胎盘生物反应器的上清液的级分，并过滤所述级分。然后使所述上清液以400g x 10分钟离心以收集细胞。在第一次离心后，以3000g x 30分钟进行第二次离心以使细胞碎片沉淀。以10,000g x 1小时进行第三次离心以使微囊泡沉淀。然后以100,000gx 1.5小时进行第四次离心以使外泌体沉淀。然后将含有沉淀的外泌体的离心管倒置放在纸上以排出残留的液体。然后将外泌体沉淀物溶解在适当体积的无菌PBS(例如2.0mL)中以溶解沉淀物，且然后将含有外泌体的溶液在无菌Eppendorf管中等分，并在-20℃/-80℃冷冻机中冷冻。然后使用ELISA-63A和蛋白质定量试剂盒测定外泌体中外泌体特异性标志物CD63A的存在。

如所示，PRP、胎盘灌流液和胎盘组织含有为CD63+的外泌体群体，并且可通过超速离心有效分离。为了分离外泌体，首先将培养上清液通过组织过滤器过滤，并如上所述进行若干次离心以获得外泌体，然后将所述外泌体冷冻。对于外泌体的ELISA检测，使用了抗CD63抗体。在所述测定中，用外泌体结合缓冲液(60uL+60uL)1:1稀释样品。通过这种程序有效地分离了CD63+外泌体。

外泌体的表征

外泌体可含有蛋白质、肽、RNA、DNA和细胞因子。可进行诸如miRNA测序、表面蛋白分析(MACSPlex外泌体试剂盒，Miltenyi)、蛋白质组学、功能研究(酶测定，体外伤口愈合测定(划痕测定)、外泌体诱导的细胞增殖(人角质形成细胞或成纤维细胞)(与5种已知的刺激物比较)、外泌体诱导的胶原蛋白产生(人角质形成细胞或成纤维细胞)：与TGFb相比，包括血清和非血清对照，用于前胶原1C肽的ELISA，外泌体诱导的炎性细胞因子抑制：反应细胞类型包括人角质形成细胞或人成纤维细胞，以及与冻干的热杀灭细菌或LPS的比较)的方法。

在一些替代方案中，将分离的外泌体用100Kda Vivaspin过滤器(Sartorius)浓缩，用PBS洗涤一次，并回收大约40uL。将浓缩的外泌体群体与10uL的含有1x蛋白酶抑制剂混合物(Roche)的5XRIPA溶解缓冲液混合并涡旋，然后在水超声发生器(UltrasonicCleaner，JSP)在20℃下超声处理5分钟。在超声处理后，将管在冰上孵育20分钟，伴随间歇混合。接下来，在4℃下将混合物以10,000g离心10分钟。将分离的澄清溶解产物转移至新鲜管中。用BCA试剂盒测量蛋白质量，并且每泳道负载10ug蛋白质以进行蛋白质印迹，并使用抗体确定目标蛋白质。

在另一个替代方案中，检查了外泌体标记和细胞摄取(例如HEK293T)。将冷冻洗脱的外泌体的等分部分重悬于1mL PBS中，并使用PKH26荧光细胞接头试剂盒(Sigma-Aldrich)进行标记。制备了2x PNK26染料溶液(在1mL稀释剂C中的4uL染料)，并与1mL外泌体溶液混合，最终染料浓度为2x10e-6M。将立即样品混合5分钟，并通过添加1％ BSA捕获Excel PKH26染料来终止染色。将标记的外泌体转移到100-Kda Vivaspin过滤器中，并以4000g离心，然后用PBS洗涤两次，且回收大约50uL样品用于使用NTA分析外泌体浓度，然后储存在-80C。PBS用作标记反应的阴性对照。为了进行摄取研究，使用常规培养基将HEK293T细胞接种于8孔室载玻片(1x10e4/孔)中。在24小时后，将载玻片用PBS洗涤两次，并与DMEM-不含exo的FBS(10％)一起孵育24小时。此后，将各自标记对应于2x10e9外泌体的外泌体样品的新鲜DMEM培养基(含10％不含exo的PBS(200uL))添加至每个孔，并在细胞孵育箱中孵育1.5小时。在孵育后，将载玻片用PBS(500ul)洗涤两次，并在室温下用4％多聚甲醛溶液固定20分钟。将载玻片用PBS(500uL)洗涤两次，干燥，并使用带有DAPI的ProLong Gold 4抗褪色剂安装。使用Axioskop显微镜(Zeiss)将细胞可视化

来自培养的产后人胎盘的外泌体的高产量分离

灌注获得完全供体同意的产后人胎盘。用大量无菌盐水冲洗掉胎盘上的残留血液，且然后在5-L生物反应器中用补充有抗生素的无血清培养基进行培养，且在在37℃孵育箱(5％CO2)中培养，并在冷藏条件下交替旋转延长的时间段直至4天。通过经由3000g和10,000g连续离心将培养基的上清液加工以使组织、细胞和微囊泡沉淀。通过从10,000g离心的上清液进行100,000g超离心来沉淀外泌体，并用无菌PBS溶解。通过BCA蛋白测定来定量外泌体的产量。

如用于分离外泌体的方法中所述加工来自胎盘器官培养物的上清液。使用抗CD63A抗体的ELISA测定表明，分离的外泌体含有CD63A蛋白，所述蛋白是外泌体的特异性蛋白质标志物。据估计，在1升培养基中培养的一个胎盘在24小时内产生大约40mg外泌体，或大约1x10¹³ CD63A阳性外泌体颗粒。对这些胎盘器官来源的外泌体进行进一步表征，包括CD9、CD81的表达、大小和功能活性。

在另一组实验中，在获得完全供体同意的情况下，对产后人胎盘进行灌注，以分离具有不同浓度的EDTA的外泌体。经由蠕动泵以恒定的速率通过脐带静脉将补充有抗生素和不同浓度的EDTA(例如5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100mM或在前述浓度中的任何两者限定的范围内)的无血清培养基灌注到胎盘中，并且在受控条件下再培养24-48小时。在培养后，以受控的速率灌注750mL含有所用EDTA量的生理培养基。然后通过连续离心和超速离心分离外泌体，通过CD63A ELISA测定确认，并且通过BCA蛋白质测定进行定量，全部如上所述。将表明，用于回收外泌体的培养基中EDTA的浓度影响从生物反应器中培养的胎盘回收的外泌体的量。

另外的替代方案

在一些替代方案中，提供了一种从胎盘或其部分中分离外泌体的方法。所述方法包括：a)使胎盘或其部分与第一培养基接触；b)从所述胎盘或其部分获得包含外泌体的第一级分；c)使所述胎盘或其部分与第二培养基接触；d)从所述胎盘或其部分获得包含外泌体的第二级分；e)使所述胎盘或其部分与第三培养基接触；f)从所述胎盘或其部分获得包含外泌体的第三级分；并且任选地，从所述第一级分、所述第二级分和/或所述第三级分中分离所述外泌体。在一些替代方案中，所述方法还包括使所述胎盘或其部分与另外的培养基接触；并且从所述胎盘或其部分获得包含外泌体的另外级分的多个步骤。这两个步骤可重复多次。优选地，在生物反应器中培养和/或维持所述胎盘或其部分。在一些替代方案中，所述胎盘或其部分包括羊膜。在一些替代方案中，所述胎盘或其部分是人胎盘或其部分。在一些替代方案中，所述第一培养基、第二培养基和/或第三培养基与所述胎盘或其部分接触至少45分钟，如45分钟或1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时或12小时或在由前述时间点中的任何两者限定的范围内的任何时间量。在一些替代方案中，所述第一培养基、第二培养基和/或第三培养基与所述胎盘或其部分接触至少7天、14天、28天、35天或42天或在由前述时间点中的任何两者限定的范围内的任何时间量。在一些替代方案中，已将所述胎盘或其部分切碎、研磨或用酶(如胶原酶和/或蛋白酶)进行处理。

在一些替代方案中，以基本上平坦或片状的支架材料的形式提供胎盘或其部分，所述胎盘或其部分已经脱细胞且任选地基本上干燥。所述脱细胞的胎盘或其部分用作支架以容纳外源细胞，如从细胞培养或初级分离程序获得的均质细胞群体(例如，包括干细胞、内皮细胞和/或祖细胞的再生细胞)。所述方法还包括使流体或包含待接种至脱细胞的胎盘或其部分中的细胞的流体通过。一旦建立细胞，就使用上述程序回收并分离由所述细胞产生的外泌体。在一些替代方案中，包含待接种在脱细胞胎盘或其部分上的细胞的流体是腹水、血液或血浆。在一些替代方案中，所述细胞来自器官。在一些替代方案中，所述细胞来自肝、肾、肺或胰腺。在一些替代方案中，所述细胞是免疫细胞。在一些替代方案中，所述细胞是T细胞或B细胞。

在一些替代方案中，所述第一培养基包含磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在一些替代方案中，所述第二培养基包含生长因子。在一些替代方案中，所述第三培养基包含螯合剂。在一些替代方案中，所述螯合剂是EDTA、EGTA、膦酸酯、BAPTA四钠盐、BAPTA/AM、二-NotrophenTM试剂四钠盐、EGTA/AM、吡哆醛异烟酰肼、N,N,N′,N′-四-(2吡啶基甲基)乙二胺、6-溴-N′-(2-羟基亚苄基)-2-甲基喹啉-4-碳酰肼、1,2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N′,N′-四乙酸四(乙酰氧基甲基酯)、(亚乙基二次氮基)四乙酸、EDTA、Edathamil、亚乙基二次氮基四乙酸、乙二醇-双(2-氨基乙基醚)-N,N,N′,N′-四乙酸或乙二醇-双(β-氨基乙基醚)-N,N,N′,N′-四乙酸四钠盐或它们的任何组合。在一些替代方案中，所述螯合剂是EDTA或EGTA或它们的组合。在替代方案中，螯合剂以1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM或100mM的浓度或以在由前述浓度中的任何两者限定的范围内的浓度提供于第三培养基中。在一些替代方按照，所述第三培养基中的EDTA的浓度以1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM或100mM的浓度或以在由前述浓度中的任何两者限定的范围内的浓度提供。

在一些替代方案中，所述第三培养基包含蛋白酶。在一些替代方案中，所述蛋白酶是胰蛋白酶、胶原酶、胰凝乳蛋白酶或羧肽酶或其混合物。在一些替代方案中，所述蛋白酶是胰蛋白酶。在替代方案中，所述蛋白酶以1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM或100mM的浓度或以在由前述浓度中的任何两者限定的范围内的浓度提供于第三培养基中。

在一些替代方按照，所述方法还包括使所述胎盘或其部分与另外的多种培养基接触，其中所述接触使得获得包含外泌体的多个级分。在一些替代方案中，所述第一培养基、第二培养基、第三培养基或另外的培养基包含葡萄糖。在一些替代方案中，所述第一培养基、第二培养基、第三培养基或另外的培养基包含GM-CSF。在一些替代方案中，所述第一培养基、第二培养基、第三培养基或另外的培养基包含血清。在一些替代方案中，所述第一培养基、第二培养基、第三培养基或另外的培养基包含DMEM。在一些替代方案中，所述第一培养基、第二培养基、第三培养基或另外的培养基包含AHR拮抗剂。在一些替代方案中，所述AHR拮抗剂是SR1。在一些替代方案中，所述SR1的浓度为1nM、10nM、100nM、200nM、300nM、400nM、500nM、600nM、700nM、800nM、900nM或1mM，或在由前述值中的任何两者限定的范围内的任何其他浓度。

在一些替代方案中，使所述第一培养基与所述胎盘或其部分接触，同时维持0℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃或40℃的温度或在由前述温度中的任何两者限定的范围内的温度。在一些替代方案中，使所述第二培养基与所述胎盘或其部分接触，同时维持0℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃或40℃的温度或在由前述温度中的任何两者限定的范围内的温度。在一些替代方案中，使所述第三培养基与所述胎盘或其部分接触，同时维持0℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃或40℃的温度或在由前述值中的任何两者限定的范围内的温度。在一些替代方案中，使所述另外的多种培养基与所述胎盘或其部分接触，同时维持0℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃或40℃的温度或在由前述值中的任何两者限定的范围内的温度。

在一些替代方案中，所述第一培养基、第二培养基、第三培养基或另外的多种培养基包含抗生素。

在一些替代方案中，通过包括以下步骤的方法从所述第一级分、所述第二级分和/或所述第三级分或所述多个级分中分离所述外泌体：

(a)使所述第一级分、所述第二级分和/或所述第三级分或所述多个级分通过组织过滤器；

(b)对(a)中收集的滤液进行第一次离心以产生细胞沉淀物和第一上清液；

(c)对所述第一上清液进行第二次离心以产生第二上清液；以及

(d)对所述第二上清液进行第三次离心以产生外泌体沉淀物；以及任选地，

(e)将外泌体重悬于溶液中。

在一些替代方案中，所述分离的外泌体群体包含具有CD63、CD63-A、穿孔素、Fas、TRAIL或颗粒酶B或它们的组合的外泌体。在一些替代方案中，所述分离的外泌体群体包含含有信号传导分子的外泌体。在一些替代方案中，所述分离的外泌体群体包含外泌体，所述外泌体包含细胞因子、mRNA或miRNA。

在一些替代方案中，所述方法还包括通过亲和色谱法分离外泌体，其中亲和色谱法对除去包含病毒抗原、病毒蛋白、细菌抗原或细菌蛋白、真菌抗原或真菌蛋白的外泌体具有选择性。

在一些替代方案中，所述方法还包括通过替代或另外的亲和色谱法步骤分离外泌体，其中所述替代或另外的亲和色谱法步骤对除去包含炎症蛋白的外泌体具有选择性。在一些替代方案中，所述方法还包括富集包含抗炎生物分子的外泌体群体。

在一些替代方案中，提供了由本文的任一个实施方案产生的外泌体。在一些替代方案中，所述外泌体来自腹水、血液或血浆。在一些替代方案中，所述外泌体来自器官的细胞。在一些替代方案中，所述外泌体来自免疫细胞。在一些替代方案中，所述外泌体来自T细胞或B细胞。

本领域技术人员应了解，一般来说，在本文并且尤其在随附权利要求(例如，随附权利要求的主体)中使用的术语通常意图为“开放”术语(例如，术语“包括(including)”应解释为“包括但不限于”，术语“具有”应解释为“至少具有”，术语“包括(includes)”应解释为“包括但不限于”等)。本领域技术人员将进一步理解，如果意图引用权利要求陈述的具体数量，则这样的意图将在权利要求中明确地陈述，并且在没有这种陈述的情况下，不存在这样的意图。例如，为了有助于理解，以下随附权利要求书可含有介绍性短语“至少一个”和“一个或多个”的使用，用来介绍权利要求陈述。然而，此类短语的使用不应解释为暗指由不定冠词“一个/种(a/an)”引入权利要求叙述将含有这种引入权利要求叙述的任何特定权利要求局限于含有仅一个这种叙述的实施方案，即使当相同权利要求包括引入性短语“一个/种或多个/种”或“至少一个/种”以及如“一个/种(a/an)”(例如，一个/种(a/an)应解释为意指“至少一个/种”或“一个/种或多个/种”)的不定冠词时；对于用于引入权利要求叙述的定冠词的使用，也是这样。此外，即使明确地叙述了所引入权利要求叙述的特定数目，本领域技术人员仍然将意识到，这种叙述应解释为意指至少一个所叙述的数目(例如，在没有其他修饰语的情况下，直接叙述“两个叙述”意指至少两个叙述，或意指两个或更多个叙述)。此外，在其中使用类似于“A、B和C等中的至少一者”的惯例的情况下，通常这样的句法结构意指在本领域技术人员意义上的惯例(例如，“具有A、B和C中的至少一者的系统”将包括但不局限于仅具有A、仅具有B、仅具有C、同时具有A和B、同时具有A和C、同时具有B和C、和/或同时具有A、B和C等的系统)。在使用类似于“A、B或C等中的至少一者”的惯例的情况下，通常这样的句法结构意指在本领域技术人员意义上的惯例(例如，“具有A、B或C中的至少之一的系统”将包括但不局限于仅具有A、仅具有B、仅具有C、同时具有A和B、同时具有A和C、同时具有B和C、和/或同时具有A、B以及C等的系统)。本领域技术人员将进一步理解，无论是在说明书、权利要求书或附图中，实际上任何呈现两个或更多个替代术语的分离性词语和/或短语应被理解为设想包括所述术语中的一个、所述术语中的任一个或两个术语的可能性。例如，短语“A或B”将通常理解为包括“A”或“B”或“A和B”的可能性。

实施例

6.1.实施例1：人胎盘的培养

接收人胎盘并用无菌PBS或盐水溶液洗涤以除去血液。然后将胎盘作为全器官在大容器中的器皿中培养，所述容器具有500mL或1000mL体积的补充有抗生素和2mM EDTA的DMEM培养基。在不同的替代方案中，可将胎盘切割成不同的大小并置于培养容器中。在含5％ CO2的细胞培养孵育箱中在37℃下培养。培养时间是4小时至8小时，并且将培养物的上清液用于分离外泌体。在每个收获时间点(例如，每8小时或每12小时)添加新的培养基，并将胎盘器官和组织培养达至少5天。

6.2.实施例2：胎盘外泌体的分离和纯化

将培养物的上清液以3,000g离心30分钟以使细胞和组织碎片沉淀。然后将上清液以10,000g离心1小时，并丢弃沉淀物(小细胞碎片和细胞器)。然后将上清液以100,000g离心2小时。所得的沉淀物是外泌体。可通过以下方法进一步纯化外泌体沉淀物：用不同体积的无菌PBS重悬，并再次以100,000离心2小时，且然后用无菌PBS重悬最终的沉淀物。将重悬的外泌体通过注射器过滤器(0.2um)过滤，在-80℃下以300uL至1mL的不同体积等分。

通过大小表征胎盘外泌体。通过纳米颗粒追踪测定分析大小分布。使用NanoSight测量pExo的三个代表性样品的大小。每种分离物分别具有117、101和96的平均大小，与报告的外泌体大小一致。结果示于图2A–图2C中。

6.3.实施例3：通过FACS分析，pExo的标志物

使用MACSPlex外泌体试剂盒(Miltenyi Biotec，目录号130-108-813)，按照试剂盒所提供的方案分析pExo的蛋白质标志物。简言之，将120uL的pExo分离物与15uL的外泌体捕获珠粒一起在室温下孵育过夜。用用1mL洗涤溶液洗涤一次后，将外泌体与外泌体检测试剂CD9、CD63和CD81混合物一起孵育，并且再孵育1小时。在两次洗涤后，用FACS(BD Canto10)分析样品。此试剂盒中包括总计37种蛋白质标志物(表1)，不包括mIgG1和REA对照。

表1：MACSPlex外泌体试剂盒中用于检测pExo的蛋白质标志物的列表

pExo样品被鉴定为对以下蛋白质标志物呈高度阳性，所述蛋白质标志物包括CD1c、CD9、CD20、CD24、CD25、CD29、CD2、CD3、CD8、CD9、CD11c、CD14、CD19、CD31、CD10、CD41b、CD42a、CD44、CD45、CD19c、CD4、CD15、CD19c、CD4、CD56、CD62P、CD83、CD69、CD81、CD86、CD105、CD133-1、CD142、CD148、HLA-ABC、HLA-DRDPDQ、MSCP、ROR1、SSEA-4。pExo具有非常低的CD209水平(2.6％)。在不用培养基和细胞培养孵育箱培养的情况下通过用盐水溶液灌注胎盘的血管系统而获得的人胎盘灌流液也用于分离外泌体，并且通过相同的方法分析标记蛋白表达。灌流液来源的外泌体也表达高水平的在pExo中发现的大多数标志物，但与pExo相比，其具有显著较低CD11c(2.0％)、MCSP(3.4％)和SSEA-4(3.5％)。与胎盘灌流液外泌体相比，pExo还具有显著更高的CD142和CD81水平。脐带血血清也用于分离外泌体，并且通过相同的方法分析蛋白质表达。脐带血血清来源的外泌体在大多数蛋白质标志物中也呈阳性，但通常显示每种这些标志物蛋白质表达的水平较低。具体而言，与pExo相比，脐带血血清外泌体具有较低的CD56(1.4％)、CD3(0.3％)和CD25(3.9％)水平。脐血清中的SSEA-4和MSCP蛋白表达显著低于pExo，但高于胎盘灌流液外泌体。与pExo相比，脐血清外泌体还具有更高的MSCP蛋白水平。这些数据表明，与未培养的胎盘和脐血清相比，培养的胎盘组织可产生独特的外泌体群体。与脐血清来源的外泌体和胎盘灌流液外泌体相比的pExo样品的结果示于图3A–图3C和表2中。

表2

6.4实施例4：pExo样品的细胞因子和生长因子

使用包含41种不同细胞因子的MiltiPlex Luminex试剂盒分析pExo样品的细胞因子的含量。下表示出在15种不同的pExo制备物上检测到的细胞因子的数据。所述数据表明，pExo含有显著水平的细胞因子(平均>50pg/mL)，包括FGF2、G-CSF、分形趋化因子(fractalkine)、GDGF-AA/BB、GRO、IL-1RA、IL-8、VEGF以及RANTES。pExo还含有可检测水平的其他细胞因子(5pg/mL至49pg/mL)，包括EGF、Flt-3L、IFNa3、MCP-3、PDGF-AA、IL-15、sCD40L、IL6、IP-10、MCP-1、MIP-α、MIP-1β和TNF-α。

表3：在pExo制备物中检测到的细胞因子

还通过多重Luminex分析分析了pExo(11个样品)中可溶性细胞因子受体的存在。数据在下表中示出。数据表明pExo含有高水平(>100pg/mL)的sEFGR、sgp-130、sIL-1R1、sTNFR1、sTNFRII、sVEGRR1、sVEGFR1、sVEGFR3和sCD30，在一些样品中也检测到sIL-2Ra、sIL-6R、sRAGE(>10ng/mL)。显示为<的数据未检测到，并且被视为阴性。

表4

6.5实施例5：胎盘外泌体的蛋白质组学分析

三个pExo样品进行了蛋白质组学分析。使用具有以下设置的声波探头(QSonica)溶解提交的样品：振幅40％，脉冲10x开启1秒、关闭1秒。通过Qubit荧光测定法测定蛋白质浓度。通过SDS page加工10ug的每个样品，并且纯化的蛋白质进行胰蛋白酶消化。表5示出从每个样品鉴定的总蛋白质。在这些样品中，总共鉴定了1814种蛋白质。表6示出pExo样品中最高鉴定的蛋白质的鉴定和基因ID。另外的数据在图4和图5中示出。

表5

表6

6.6.实施例6：胎盘外泌体的RNA分析

通过测序分析了三个pExo样品的RNA谱。简言之，从pExo样品中提取RNA，并转化成cDNA且测序。然后将测序数据与数据库进行比较，以鉴定每个测序数据的类型和特性。表7示出RNA测序结果的总体概况。pExo中的RNA含有tRNA、微小RNA和其他类别的非编码RNA。微小RNA是pEXO样品的组成中第二最丰富的RNA。在这三个pExo样品中鉴定了总计1500种不同的微小RNA。一些通常存在于所有三个样品中，并且一些独特地存在于所述样品中的一者或两者中。示出了最丰富的微小RNA的基因ID以及相对频率和丰度。已知微小RNA在细胞间通讯功能中起重要作用。

表7

6.7.实施例7：胎盘外泌体促进人皮肤成纤维细胞(HDF)的迁移

细胞因子谱显示pExo包括趋化生长因子，从而表明pExo应该具有促进细胞迁移的功能。为了检查这一点，将transwell迁移测定设置为如下：将750uL的DMEM基础培养基(无血清)置于transwell(24孔)板的底部室上，添加50uL的pExo。添加与对照相同体积的PBS。将1x10e5个HDF接种在transwell的顶部室(8um孔)上。在6至24小时后，用棉签除去transwell顶部室上的细胞。然后将transwell固定在含有PBS中的1％乙醇的溶液，然后用溶解于1％乙醇-PBS中的1％结晶紫染色。用显微镜可视化迁移的细胞。数据显示迁移至Transwell低侧的HDF的结果的实例，而在PBS对照Transwell中迁移通过所述孔的细胞显著较少。所述研究表明，pExo可促进人皮肤成纤维细胞的迁移。参见图6。

6.8.实施例8：胎盘外泌体促进人脐带血内皮细胞(HUVEC)的迁移

也将transwell迁移测定设置为如下：将750uL的DMEM基础培养基(无血清)置于transwell(24孔)板的底部室上，添加50uL的pExo。添加与对照相同体积的PBS。将2x10e5个HUVEC表达GFP蛋白接种在transwell的顶部室(8um孔)上。在6至24小时后，直接用倒置荧光显微镜(AMG)可视化迁移的孔。所述研究证明，所测试的所有三个pExo样品均可促进HUVEC在所有三个重复孔中的迁移。与完全培养基或pExo测试孔相比，用于HUVEC的完全培养基用作阳性对照，具有显著细胞迁移；并且PBS用作另外的对照，具有显著较少的细胞迁移。参见图7。

6.9.实施例9：胎盘外泌体刺激HUVEC的增殖

pExo的细胞因子谱表明，它具有已知参与HUVEC的生长的若干生长因子(PGDF-AA、BB、VEGF)。为了检查pExo对HUVEC的生长和增殖的影响。将HUVEC表达GFP在96孔板(透明底部和非透明壁)中以1x10e4个细胞接种于100uL完全HUVEC生长培养基中。在接种2小时后，将细胞附着至所述孔的底部。然后向所述孔中添加25uL不同的pExo样品(每个样品N＝6)。然后在接种后的第0天和第2天使用酶标仪(Synergy H4，激发395nm/发射509nm)评价板的荧光强度。如图13所示，完全培养基显示从第0天到第2天更高的GFP信号(细胞数量的指标)。与完全培养基相比，在完全培养基中稀释50％的PBS对照中显示出轻微的生长。所有八个不同的pExo样品在第2天都显示出较高的GFP生长。参见图8。

6.10.实施例10：胎盘外泌体刺激人CD34+细胞的增殖和集落形成

为了测试pExo对造血干细胞的增殖的影响，将人脐带血CD34+细胞(由内部制备)解冻并以1x10e4/细胞/mL(N＝4)在含有10％ SCF、Flt-3、KL(培养基A)与10％ FCS-IMDM的混合物的扩增培养基中培养。向培养孔中添加25uL的PBS或25uL的pExo样品(测试了两个pExo样品)。在培养一周后，计数每个孔的总细胞数，并使用抗CD34抗体通过流式细胞术(FACS)评价培养物中CD34+细胞的百分比。将总CD34+细胞数量计算为孔中的总细胞数量与培养物中CD34+细胞的％。结果表明，与PBS对照培养物相比，两种pExo处理的培养物均具有显著更高的CD34+细胞数量。在集落形成单位培养物(CFU)中还测试了pExo对CD34+细胞的影响。用MethoCult H4434培养基(Stem Cell Technologies)建立CFU培养物，并以50uL/mL添加pExo或PBS。在培养两周后，计数每个35-mm培养皿中的总CFU数量(N＝3)。数据显示，在存在pExo的情况下，与PBS对照培养物相比，CFU的数量显著更高。参见图图9和图10。

6.11.实施例11：癌细胞增殖的抑制

微小RNA数据和细胞因子数据表明，pExo具有抑制癌细胞增殖的活性。使用pExo样品来检查其对96孔板中SKOV3(人卵巢癌细胞系)的生长的影响。将这种SKOV3细胞工程改造以表达荧光素酶，因此，测量荧光素酶活性是细胞生长的指标。使用了总计8个不同的pExo样品。将2000个SKOV3细胞添加至100uL生长培养基(DMEM-10％ FCS)中的96孔板。2小时后，将40uL的pExo添加至孔(N＝6)并补充60uL的生长培养基。40uL的PBS用作对照。完全培养基条件是向孔中添加100uL培养基。在孵育箱中培养2天后，通过溶解细胞用荧光素酶测定试剂盒(Promega)测量荧光素酶的活性，并通过酶标仪(Synergy H4)用发光发射法测量荧光素酶活性。数据表明，在每种细胞浓度下，与PBS对照相比，经pExo处理的培养物具有显著更低的Luminex指数。此数据表明pExo抑制了SKOV3细胞的生长。参见图11。

将A549癌细胞系(人肺癌癌细胞系)以1500个细胞/孔接种在96孔板(Xiceligence)中。在接种24小时后，将pExo以三种不同剂量(5uL、25和50uL)添加在生长培养基(100uL)中。添加相同量的PBS作为对照。在接种后的第一天至第三天，可通过反映细胞在孔上的粘附的软件来监测细胞的生长。数据表明，在存在pExo的情况下细胞的生长(如示出为标准化的细胞指数，与PBS对照相比在存在pExo的情况下显著更低。生长曲线各自是来自三个独立孔的平均细胞指数。参见图12。

使用pExo样品来检查其对96孔板中不同细胞剂量的MDA231(人乳腺癌细胞系)的生长的影响。将这种MDA231细胞工程改造以表达荧光素酶，因此，测量荧光素酶活性是细胞生长的指标。将不同细胞数的MDA231-荧光素酶接种至96孔板(一式三份)中，并添加25uL的pExo#789。在孵育箱中培养2天后，通过溶解细胞用荧光素酶测定试剂盒(Promega)测量荧光素酶的活性，并通过酶标仪(Synergy H4)用发光发射法测量荧光素酶活性。数据表明，在每种细胞浓度下，与PBS对照相比，经pExo处理的培养物具有显著更低的Luminex指数。此数据表明pExo抑制了MDA231细胞的生长。参见图13。

6.12.实施例12：胎盘外泌体调节免疫细胞的活化和分化

为了检查pExo对免疫细胞的作用，用PKH荧光染料标记人脐带血T细胞，且然后与pExo或PHA一起孵育作为刺激。在RPMI+10％FCS中培养5天后，使用可区分总T细胞以及不同类型的T细胞的亚型，包括CD4、CD8、CD69、CD27的抗体用FACS分析细胞。数据表明在存在pExo的情况下，CD3+细胞的MFI与对照培养物相似，从而表明单独pExo不会影响T细胞的增殖活性。在PHA刺激下，MFI显著降低，从而表明在PHA和pExo两者存在的情况下，细胞增殖，MFI与单独PHA相似，从而表明细胞增殖不受pExo的存在影响。据发现用pExo处理的细胞中CD69+细胞显著更高，在CD3+细胞(T细胞)中CD69+细胞显著增加，从而表明通过pExo增加了T细胞活化。在脐血T细胞和PBMC细胞中均发现了这种观察结果。此外，发现pExo增加PBMC中CD56+细胞(NK)细胞的百分比。参见图14、图15、图16和图17。

6.13.实施例13：来自培养的胎盘、胎盘灌流液和PRP(脐血清)的外泌体的产量

通过培养的人胎盘组织的相同方法分离胎盘灌流液和PRP(脐血清)。下表显示来自胎盘灌流液和PRP的外泌体的产量显著低于培养的胎盘。

表8

讨论：

主题方法能够产生大量具有独特且有利性质的外泌体。显示所述外泌体含有许多蛋白质和RNA，所述蛋白质和RNA由于外泌体的证实的功能而被认为具有生物活性。外泌体表达许多细胞表面标志物，所述细胞表面标志物可充当结合配偶体，例如，作为受体或配体，并且由此允许这种生物学活性靶向所需的细胞类型。

本文呈现的数据显示所述外泌体用于各种各样的适应症(如表9中所述的那些)的效用。

表9

等效方案：

本公开的范围不受本文描述的具体实施方案的限制。实际上，除所描述的那些以外，本文提供的主题的多种修改对于本领域技术人员来说将由前述描述和附图变得显而易见。此类修改意图落在所附权利要求书的范围之内。

本文引用了多篇公布、专利专利申请，其公开内容以引用的方式整体并入。

Claims (79)

1.一种从胎盘或其部分中分离外泌体的方法，所述方法包括：

a)使胎盘或其部分，优选地是培养的胎盘或其部分与第一培养基接触；以及

b)从所述胎盘或其部分获得包含外泌体群体的第一级分；

c)任选地，使所述胎盘或其部分与第二培养基接触，并从所述胎盘或其部分获得包含外泌体群体的第二级分；

d)任选地，使所述胎盘或其部分与第三培养基接触，并从所述胎盘或其部分获得包含外泌体群体的第三级分；以及

e)任选地，优选地通过连续离心和/或亲和色谱法，使用对所需的外泌体群体上存在的标志物或肽具有特异性的抗体或其结合部分，从所述第一级分、所述第二级分和/或所述第三级分中分离所述外泌体群体，其中所述抗体或其结合部分被固定在诸如膜、树脂、珠粒或器皿的基底上。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述胎盘或其部分还包括羊膜。

3.如权利要求2所述的方法，其中所述胎盘或其部分是人胎盘或其部分。

4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一培养基、所述第二培养基和/或所述第三培养基与所述胎盘或其部分接触至少45分钟，如45分钟或1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时或24小时或2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天或20天或在由前述时间点中的任何两者限定的范围内的任何时间量。

5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一培养基、所述第二培养基和/或所述第三培养基与所述胎盘或其部分接触至少7天、14天、28天、35天或42天或在由前述时间点中的任何两者限定的范围内的任何时间量。

6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中已将所述胎盘或其部分切碎、研磨或进行酶处理。

7.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述胎盘或其部分是基本上平坦的或片状的，并且已经脱细胞且基本上干燥，并且其中所述方法还包括使包含外源细胞的流体与所述脱细胞的胎盘或其部分接触，以便使所述脱细胞的胎盘或其部分接种所述外源细胞，并且其中所述细胞与所述脱细胞的胎盘或其部分的所述接触已在使所述脱细胞的胎盘或其部分与第一培养基接触之前进行。

8.如权利要求7所述的方法，其中所述外源细胞从与所述胎盘或其部分的供体受试者不同的受试者获得。

9.如权利要求7或8所述的方法，其中所述流体包括腹水、血液或血浆。

10.如权利要求7或8所述的方法，其中所述细胞来自器官。

11.如权利要求10所述的方法，其中所述细胞来自肝、肾、肺或胰腺。

12.如权利要求7或8所述的方法，其中所述细胞是免疫细胞。

13.如权利要求12所述的方法，其中所述细胞是T细胞或B细胞。

14.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一培养基包含磷酸盐缓冲盐水(PBS)。

15.如权利要求9所述的方法，其中所述第一级分、所述第二级分或所述第三级分包含来自腹水、血液或血浆的外泌体。

16.如权利要求10所述的方法，其中所述第一级分、所述第二级分或所述第三级分包含来自器官细胞的外泌体。

17.如权利要求11所述的方法，其中所述细胞来自肝、肾、肺或胰腺。

18.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第二培养基包含生长因子。

19.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第三培养基包含螯合剂。

20.如权利要求19所述的方法，其中所述螯合剂是膦酸酯、BAPTA四钠盐、BAPTA/AM、二-Notrophen TM试剂四钠盐、EGTA/AM、吡哆醛异烟酰肼、N,N,N′,N′-四-(2吡啶基甲基)乙二胺、6-溴-N′-(2-羟基亚苄基)-2-甲基喹啉-4-碳酰肼、1,2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N′,N′-四乙酸四(乙酰氧基甲基酯)、(亚乙基二次氮基)四乙酸(EDTA)、Edathamil、亚乙基二次氮基四乙酸、乙二醇-双(2-氨基乙基醚)-N,N,N′,N′-四乙酸或乙二醇-双(β-氨基乙基醚)-N,N,N′,N′-四乙酸四钠盐(EGTA)或它们的任何组合。

21.如权利要求19或20中任一项所述的方法，其中所述螯合剂是EDTA或EGTA或它们的组合。

22.如权利要求19-21中任一项所述的方法，其中所述螯合剂以1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM或100mM的浓度或以在由前述浓度中的任何两者限定的范围内的浓度提供于所述第三培养基中。

23.如权利要求19-22中任一项所述的方法，其中所述第三培养基中的EDTA的浓度以1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM或100mM的浓度或以在由前述浓度中的任何两者限定的范围内的浓度提供。

24.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第三培养基包含蛋白酶。

25.如权利要求24所述的方法，其中所述蛋白酶是胰蛋白酶、胶原酶、胰凝乳蛋白酶或羧肽酶或它们的任何组合。

26.如权利要求25或25所述的方法，其中所述蛋白酶是胰蛋白酶。

27.如权利要求24所述的方法，其中所述蛋白酶以1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM或100mM的浓度或以在由前述浓度中的任何两者限定的范围内的浓度提供于所述第三培养基中。

28.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括使所述胎盘或其部分与另外的多种培养基接触，其中所述接触导致获得包含外泌体的多个级分。

29.如权利要求28所述的方法，其中所述第一培养基、所述第二培养基、所述第三培养基或所述另外的培养基包含葡萄糖。

30.如权利要求28或29所述的方法，其中所述第一培养基、所述第二培养基、所述第三培养基或所述另外的培养基包含GM-CSF。

31.如权利要求28-30中任一项所述的方法，其中所述第一培养基、所述第二培养基、所述第三培养基或所述另外的培养基包含血清。

32.如权利要求28-31中任一项所述的方法，其中所述第一培养基、所述第二培养基、所述第三培养基或所述另外的培养基包含DMEM。

33.如权利要求28-32中任一项所述的方法，其中所述第一培养基、所述第二培养基、所述第三培养基或所述另外的培养基包含AHR拮抗剂。

34.如权利要求33所述的方法，其中所述AHR拮抗剂是SR1。

35.如权利要求34所述的方法，其中所述SR1的浓度为1nM、10nM、100nM、200nM、300nM、400nM、500nM、600nM、700nM、800nM、900nM或1mM，或在由前述值中的任何两者限定的范围内的任何其他浓度。

36.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中使所述第一培养基与所述胎盘或其部分接触，同时维持0℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃或40℃的温度或在由前述温度中的任何两者限定的范围内的温度。

37.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中使所述第二培养基与所述胎盘或其部分接触，同时维持0℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃或40℃的温度或在由前述温度中的任何两者限定的范围内的温度。

38.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中使所述第三培养基与所述胎盘或其部分接触，同时维持0℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃或40℃的温度或在由前述值中的任何两者限定的范围内的温度。

39.如权利要求28-38中任一项所述的方法，其中使所述另外的多种培养基与所述胎盘或其部分接触，同时维持0℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃或40℃的温度或在由前述值中的任何两者限定的范围内的温度。

40.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一灌注、所述第二灌注或所述第三灌注或所述另外的多种培养基包含抗生素。

41.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过包括以下步骤的方法从所述第一级分、所述第二级分和/或所述第三级分或所述多个级分中分离所述外泌体：

(a)使所述第一级分、所述第二级分和/或所述第三级分或所述多个级分通过组织过滤器；

(b)对(a)中收集的滤液进行第一次离心以产生细胞沉淀物和第一上清液；

(c)对所述第一上清液进行第二次离心以产生第二上清液；以及

(d)对所述第二上清液进行第三次离心以产生外泌体沉淀物；以及任选地，

(e)将所述外泌体重悬于溶液中。

42.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述外泌体包含CD63、CD63-A、穿孔素、Fas、TRAIL或颗粒酶B或它们的任何组合。

43.如权利要求42所述的方法，其中所述外泌体包含CD63A。

44.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述外泌体包含信号传导分子。

45.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述外泌体包含细胞因子、mRNA或miRNA。

46.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括通过亲和色谱法分离外泌体，其中亲和色谱法对除去包含病毒抗原、病毒蛋白、细菌抗原、细菌蛋白、真菌抗原或真菌蛋白的外泌体具有选择性。

47.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述还包括通过一个或多个另外的亲和色谱法步骤分离外泌体，其中所述一个或多个另外的色谱法步骤对除去包含炎症标志物和/或肿瘤标志物的外泌体具有选择性。

48.一种组合物，所述组合物包含源自人胎盘的外泌体，其中所述外泌体对CD1c、CD20、CD24、CD25、CD29、CD2、CD3、CD8、CD9、CD11c、CD14、CD19、CD31、CD40、CD41b、CD42a、CD44、CD45、CD49e、CD4、CD56、CD62P、CD63、CD69、CD81、CD86、CD105、CD133-1、CD142、CD146、CD209、CD326、HLA-ABC、HLA-DRDPDQ、MCSP、ROR1、SSEA-4或它们的组合呈阳性。

49.如权利要求48所述的组合物，其中所述外泌体对CD1c、CD20、CD24、CD25、CD29、CD2、CD3、CD8、CD9、CD11c、CD14、CD19、CD31、CD40、CD41b、CD42a、CD44、CD45、CD49e、CD4、CD56、CD62P、CD63、CD69、CD81、CD86、CD105、CD133-1、CD142、CD146、CD209、CD326、HLA-ABC、HLA-DRDPDQ、MCSP、ROR1和SSEA-4呈阳性。

50.如权利要求48所述的组合物，其中所述外泌体对选自由以下组成的组的2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种标志物呈阳性：CD1c、CD20、CD24、CD25、CD29、CD2、CD3、CD8、CD9、CD11c、CD14、CD19、CD31、CD40、CD41b、CD42a、CD44、CD45、CD49e、CD4、CD56、CD62P、CD63、CD69、CD81、CD86、CD105、CD133-1、CD142、CD146、CD209、CD326、HLA-ABC、HLA-DRDPDQ、MCSP、ROR1和SSEA-4。

51.如权利要求48-50中任一项所述的组合物，其中所述外泌体是CD3-、CD11b-、CD14-、CD19-、CD33-、CD192-、HLA-A-、HLA-B-、HLA-C-、HLA-DR-、CD11c-或CD34-。

52.如权利要求48-50中任一项所述的组合物，其中所述外泌体是CD3-、CD11b-、CD14-、CD19-、CD33-、CD192-、HLA-A-、HLA-B-、HLA-C-、HLA-DR-、CD11c-和CD34-。

53.如权利要求48-52中任一项所述的组合物，其中所述外泌体包含非编码RNA分子。

54.如权利要求53所述的组合物，其中所述RNA分子是微小RNA。

55.如权利要求54所述的组合物，其中所述微小RNA选自由表7中的微小RNA以及它们的组合组成的组。

56.如权利要求54所述的组合物，其中所述微小RNA选自由以下组成的组：hsa-mir-26b、hsa-miR-26b-5p、hsa-mir-26a-2、hsa-mir-26a-1、hsa-miR-26a-5p、hsa-mir-30d、hsa-miR-30d-5p、hsa-mir-100、hsa-miR-100-5p、hsa-mir-21、hsa-miR-21-5p、hsa-mir-22、hsa-miR-22-3p、hsa-mir-99b、hsa-miR-99b-5p、hsa-mir-181a-2、hsa-mir-181a-1、hsa-miR-181a-5p以及它们的组合。

57.如权利要求48-56中任一项所述的组合物，其中所述外泌体包含选自由表3中的细胞因子以及它们的组合组成的组的细胞因子。

58.如权利要求48-57中任一项所述的组合物，其中所述外泌体包含选自由表4中的细胞因子受体以及它们的组合组成的组的细胞因子受体。

59.如权利要求48-58中任一项所述的组合物，其中所述外泌体包含选自由表6中的蛋白质以及它们的组合组成的组的蛋白质。

60.如权利要求48-58中任一项所述的组合物，其中所述外泌体包含选自由以下组成的组的蛋白质：细胞质乌头酸水合酶、细胞表面糖蛋白MUC18、蛋白质精氨酸N-甲基转移酶1、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G(s)亚基α、Cullin-5、钙结合蛋白39、葡糖苷酶2亚基β、细胞内氯离子通道蛋白5、脑信号蛋白-3B、60S核糖体蛋白L22、剪接体RNA解旋酶DDX39B、转录活化因子蛋白Pur-α、程序性细胞死亡蛋白10、含BRO1结构域的蛋白BROX、犬尿氨酸--酮戊二酸转氨酶3、层粘连蛋白亚基α-5、ATP结合盒亚家族E成员1、突触融合蛋白结合蛋白3、蛋白酶体亚基β7型以及它们的组合。

61.如权利要求48-60中任一项所述的组合物，其中所述外泌体包含至少一种标志物分子，所述至少一种标志物分子的水平是源自间充质干细胞、脐带血或胎盘灌流液的外泌体的至少两倍。

62.如权利要求48-60中任一项所述的组合物，其中所述外泌体至少一种标志物分子，所述至少一种标志物分子的水平是源自间充质干细胞、脐带血和胎盘灌流液的外泌体的至少两倍。

63.如权利要求48-62中任一项所述的组合物，其中所述外泌体是从整个胎盘培养物的培养基中分离的。

64.如权利要求48-62中任一项所述的组合物，其中所述外泌体是从包含胎盘小叶或胎盘的部分的整个培养物的培养基中分离的。

65.如权利要求48-64中任一项所述的组合物，其中所述外泌体是通过如权利要求1-47中任一项所述的方法产生的。

66.如权利要求48-65中任一项所述的组合物，所述组合物呈适于静脉内施用的形式。

67.如权利要求48-65中任一项所述的组合物，所述组合物呈适于局部注射的形式。

68.如权利要求48-65中任一项所述的组合物，所述组合物呈适于局部施用的形式。

69.如权利要求48-65中任一项所述的组合物，所述组合物呈适于超声递送的形式。

70.一种增加免疫细胞的增殖的方法，所述方法包括使所述细胞与如权利要求48-65中任一项所述的组合物接触。

71.如权利要求70所述的方法，其中所述免疫细胞是T细胞。

72.如权利要求70所述的方法，其中所述免疫细胞是NK细胞。

73.如权利要求70所述的方法，其中所述免疫细胞是CD34+细胞。

74.一种抑制癌细胞的增殖的方法，所述方法包括使所述细胞与如权利要求48-65中任一项所述的组合物接触。

75.一种促进所述受试者的血管生成或血管形成的方法，所述方法包括向所述受试者施用如权利要求48-65中任一项所述的组合物。

76.一种调节所述受试者的免疫系统的方法，所述方法包括向所述受试者施用如权利要求48-65中任一项所述的组合物。

77.一种修复受试者的患病或受损组织的方法，所述方法包括向所述受试者施用如权利要求48-65中任一项所述的组合物。

78.一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用如权利要求48-65中任一项所述的组合物。

79.如权利要求75-78中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。