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CN119546759A - 改进的聚合物降解酶 - Google Patents

改进的聚合物降解酶 Download PDF

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CN119546759A
CN119546759A CN202380051070.7A CN202380051070A CN119546759A CN 119546759 A CN119546759 A CN 119546759A CN 202380051070 A CN202380051070 A CN 202380051070A CN 119546759 A CN119546759 A CN 119546759A
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CN
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plastic
gene
microfluidic
enzyme
droplets
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CN202380051070.7A
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弗洛里安·霍费德尔
马里亚纳·兰格尔·佩雷拉
约瑟芬·荷斯坦
托马斯·卡明斯基
菲利普·麦尔
法布里斯·吉伦
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Cambridge Enterprise Ltd
Original Assignee
Cambridge Enterprise Ltd
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Abstract

本发明涉及鉴定酶的方法和筛选用于降解聚合物如塑料的优化酶的方法。本发明还涉及聚合物降解酶和编码这些酶的核酸，以及包含这些核酸的表达盒和宿主细胞。本发明还涉及这些酶或者包含编码这些酶的核酸的宿主细胞用以降解聚合物如塑料的用途。最后，本发明还涉及塑料降解酶的晶体结构以及这些结构的用途。

Description

改进的聚合物降解酶
技术领域
本发明涉及一种用于鉴定和优化新的聚合物降解酶(例如塑料降解酶)的快速通量方法。本发明还涉及新的聚合物(例如塑料降解酶)、这些酶的晶体结构、以及使用这些晶体结构的方法。
背景技术
全世界每年生产4.6亿吨塑料，其中90％由化石燃料生产。约79％积聚在填埋场或自然环境中。
聚(对苯二甲酸乙二醇酯)(PET)是最丰富的聚酯塑料，全世界每年制造近7000万吨以用在纺织业和包装工作中。如果可以回收这种塑料，则将减少化石燃料的消耗和填埋场的使用。
目前，仅已知少量的PET酶(将PET降解成其组成单体的酶)。这些是通过低通量方法(如用可溶性酶进行的基于琼脂糖的筛选)发现的。尽管在近几十年中广泛使用这些筛选技术来获取由宏基因组文库提供的巨大多样性，但是筛选活动可能是费力的、成本和时间密集型的。
发明内容
重要的是找到更有效的PET酶和通常更有效的塑料降解酶以及降解在环境中积聚的聚合物的其他酶。
诸位发明人已经使用新的方法解决了本领域中的这个问题，以发现并改进降解聚合物(例如塑料，如PET)的酶。
因此，在第一方面，提供了用于鉴定塑料降解酶或优化塑料降解酶的方法，所述方法包括：
a)将基因文库包封到多个微流体液滴中，每个微流体液滴包含至少一个基因，并且每个微流体液滴另外包含：
i)用于表达所述基因的表达系统；和
ii)塑料粒子；
b)检测所述微流体液滴中所述塑料粒子的降解；以及
c)选择其中已经检测到塑料降解的微流体液滴。
检测降解可以任选地通过检测由塑料粒子引起的光散射的减少来进行。
任选地，所述基因文库是：
a)宏基因组文库；或者
b)定向进化文库。
如果所述基因文库是宏基因组文库，则任选地所述方法进一步包括：
a)鉴定所述塑料降解酶；以及任选地
b)由所述塑料降解酶制备定向进化文库，并且用所述定向进化文库重复第一方面的方法。
上述用于优化的方法可以任选地在筛选方法之前进行，其中所述筛选方法包括：
a)将基因文库包封到多个微流体液滴中，每个微流体液滴包含至少一个基因，并且每个微流体液滴另外包含：
i)用于表达所述基因的表达系统；和
ii)可溶性塑料模拟物；
b)检测所述微流体液滴中所述可溶性塑料模拟物的裂解；以及
c)选择其中已经检测到裂解的微流体液滴。
在另一方面，提供了酯酶，所述酯酶与以下项具有至少70％或更多的序列同一性：
a)SEQ ID NO.2；或者
b)SEQ ID NO.4；或者
c)SEQ ID NO.6。
在另一方面，提供了分离的和/或重组的核酸，其编码本文所述的任何塑料水解酶；包含所述分离的或重组的核酸的表达盒或载体；或包含所述分离的和/或重组的核酸或者所述表达盒或载体的宿主细胞。
在另一方面，提供了本文所述的任何酯酶用以降解塑料的用途。
在另一方面，提供了如本文所述并且根据权利要求书所述的酯酶的晶体。
在另一方面，提供了计算机可读数据存储介质，其编码有表2或3中残基的原子坐标，或图16或17中的原子坐标。
在另一方面，提供了与表2或表3中残基的主链原子的均方根偏差小于或者与图16中原子坐标的均方根偏差小于的原子坐标(任选地图16或图17的氨基酸12-325的坐标，任选地图17的氨基酸2-267的坐标)用以如下的用途：
a)通过计算设计来优化塑料降解活性；
b)通过计算设计来优化热稳定性；
c)设计塑料水解酶；或者
d)对从蛋白质获得的结构生物学数据进行定相。
在另一方面，还提供了：
用于筛选优化的塑料降解酶的方法，所述方法包括：
a)将具有所述塑料降解酶的变体基因序列的基因文库包封到多个微流体液滴中，每个微流体液滴包含所述塑料降解酶的至少一个变体基因序列，并且每个微流体液滴另外包含：
i)用于表达所述基因的表达系统；和
ii)塑料粒子；
b)检测所述微流体液滴中所述塑料粒子的降解；以及
c)选择其中已经检测到塑料降解的微流体液滴。
在另一方面，还提供了：
用于鉴定塑料降解酶的方法，所述方法包括：
a)将基因文库包封到多个微流体液滴中，每个微流体液滴包含至少一个基因，并且每个微流体液滴另外包含：
i)用于表达所述基因的表达系统；和
ii)塑料粒子；
b)检测所述微流体液滴中所述塑料粒子的降解；以及
c)选择其中已经检测到塑料降解的微流体液滴。
在另一方面，还提供了：
水解酶，任选地酯酶，其与以下项具有至少70％或更多的序列同一性：
a)SEQ ID NO.2，任选地其中所述酶包含SEQ ID NO.2的以下突变中的任一个或多个：
i)A9S；和/或
ii)A118E；和/或
iii)A19T；
或者
b)SEQ ID NO.4；
或者
c)SEQ ID NO.6。
在另一方面，还提供了：
多肽，除了以下突变之外，其与SEQ ID NO.2、4或6具有100％序列同一性，任选地与SEQ ID NO.2具有100％序列同一性：
a)A9S；和/或
b)A118E；和/或
c)A19T；或者
d)A118E和/或F221S和/或S235G；和/或
e)A118E和/或F221S；和/或
f)A19T和/或A118E和/或F221S；和/或
g)F221S。
在另一方面，还提供了与SEQ ID NO.8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30或32具有至少70％同一性的水解酶，或与SEQ ID NO.8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30或32具有100％同一性的多肽。
具体实施方式
方法
包封
包封在微流体液滴中可以用液滴生成模块来进行。
基因文库
基因文库意指2个或更多个基因，即两个或更多个不同的核酸序列。
基因文库可以呈宏基因组文库的形式。也就是说，包含来自环境样品的序列的文库。这种类型的基因文库可以包含在结构和功能上基本彼此不同的基因，因为这些是从环境样品收集的随机序列。
可替代地，基因文库可以呈定向进化文库的形式。在定向进化文库中，基因文库衍生自一个原始核酸序列，已使该原始核酸序列突变而形成该原始基因序列的变体，即它是变体文库或随机化DNA文库。来自该文库的两个或更多个基因可以包括例如原始基因以及具有对于原始序列而言的一个或多个核酸改变的突变变体。
每个微流体液滴中的一个或多个基因来自该基因文库。可以将基因克隆到文库中的载体中。也就是说，文库可以包含多个载体，每个载体包含一个或多个基因。文库中的每个基因还可以具有启动子。也就是说，所述基因是表达盒的一部分。
表达系统
表达系统意指将基因转录并将其翻译成酶所需的组分。
表达系统可以是体外翻译表达系统，或是细胞，其中所述细胞包含表达系统。例如，细菌细胞。
如果表达系统是细胞，则也可以包封用以裂解细胞的裂解缓冲液。
在使用细胞来表达基因的情况下，可以将基因克隆到载体中并转化到细胞中进行表达。也就是说，表达系统和基因是例如包含载体的细菌细胞，所述载体包含被克隆到载体中的基因。载体可以包含用于表达基因的启动子。
包封后，可以孵育液滴以允许基因表达(和/或塑料粒子降解)。例如，孵育范围为30秒至4周的一段时间。例如，1-5小时、24小时或48小时。如果使用短的孵育时间，则可以在芯片上进行孵育。可以在孵育时间后，将裂解缓冲液添加到液滴中，例如通过皮可注射(picoinjection)。可替代地，可以在将细胞掺入液滴中之前在细胞中表达基因。以这种方式，可以将裂解缓冲液与细胞一起掺入液滴中。
塑料粒子
塑料粒子是固体。粒子的尺寸可以是50-1000nm。例如，100-200nm，例如100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000nm，或者这些尺寸中的任何范围。可以使用动态光散射来验证粒子的均一尺寸。粒子的多分散性可低于1。也就是说，所述粒子是单分散的。粒子的结晶度可以在1％-40％之间(样品的一部分是结晶的，即，8％意指8％的样品是结晶的，并且其余是无定形的)。例如，1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、10％、15％、20％、25％、30％、35％或40％，或者这些值中任一个的范围。这可以通过差示扫描量热法(DSC)测量。通过这种技术，可以确定玻璃化转变温度(Tg)、解链温度(Tm)和解链热ΔHm和冷结晶热ΔHc。通过与100％结晶样品的解链热比较，可以计算结晶度百分比。微流体液滴可以含有一个或多个塑料粒子。
所述粒子可以通过塑料底物的沉淀和溶剂蒸发来制备。
在沉淀和溶剂蒸发之前，塑料底物可以呈无定形或结晶形式。
当塑料底物是例如PET或聚酰胺时，溶剂可以是1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇或者氯仿和三氟乙酸的混合物。在塑料底物是PCL、PES或PLA的情况下，溶剂可以是二氯甲烷(DCM)。在塑料底物是聚氯乙烯(PVC)的情况下，四氢呋喃(THF)可以用作溶剂。
当将纳米粒子悬浮在微流体液滴中时，纳米粒子可以悬浮在Tween(聚山梨醇酯，例如Tween-80)中。在散射前，液滴中所得浓度可以是0.1％-0.5％ Tween(Tween比液滴体积)或例如0.05％-1％。还可以使用其他表面活性剂，例如Triton、SDS或聚(乙烯醇)。
检测降解
降解的检测可以通过光散射来进行。如果液滴含有具有塑料降解活性的酶，则与不含有具有塑料降解活性的酶的液滴相比来自粒子的光散射将更小。降解意指将聚合物粒子分解成构成单体。
选择
选择意指选择含有具有塑性降解活性的酶的液滴并将它们与未表现出塑性降解的液滴分离。
鉴定酶
可以从液滴中的基因序列中鉴定出塑料降解酶。可以通过对包含液滴中基因的核酸进行测序来验证基因的身份。这可以通过从液滴中回收和纯化基因的DNA，随后对DNA进行测序来完成。
筛选方法
任选地，可以进行初筛法来检测可能具有塑性降解特性的酶。初筛法使用可溶性塑料模拟物。当被裂解时，可溶性塑料模拟物释放可被检测到的信号。例如，当筛选降解包含酯键的塑料的塑料降解酶时，可溶性塑料模拟物可以是共价键合至信号传导分子(例如荧光素)的酯(而不是聚合物)。例如，可溶性塑料模拟物可以是荧光素酯，例如荧光素二己酸酯。当这种可溶性塑料模拟物被裂解时，可以检测到荧光的增加。
可以从已经检测到裂解的微流体液滴中鉴定出塑料降解酶的基因序列。然后可以如下所述优化由此基因序列编码的酶。
进一步优化酶
筛选优化的酶意指搜索并任选地鉴定出具有聚合物(例如塑料)降解活性的序列变体(突变体)。所述方法可以进一步包括选择优化变体。可以以多种方式从原始塑料降解酶改进所述变体，例如与原始酶相比在功能上改进。改进的功能可以是更好的聚合物降解活性或热稳定性或其他功能改进。
定向进化意指编码酶的核苷酸序列的突变。然后可以筛选所得突变体以发现改进的功能突变体。
微流体装置
所使用的一个或多个微流体装置被设计成首先将文库(由单个基因或多个基因构成的插入物)、塑料粒子和基因的表达系统包封在微流体液滴(液滴生成模块)中；其次检测和分选液滴(散射分选仪模块)。
可以将这些功能在两个装置之间进行分割，从而允许进行液滴孵育和降解，或者它们可以是一个装置的一部分。
液滴生成模块可以包括与一个或多个通道处于流体连通的液滴生成接合部，这一个或多个通道被适配成使基因、表达系统、塑料粒子和分配流体(例如油)流入液滴生成接合部中。液滴生成接合部被适配成将基因、表达系统和塑料粒子包封在分配流体中。
在包封和一段时间孵育以使酶催化反应继续进行之后，分选微流体液滴。分选仪可以包括在液滴生成接合部下游的分叉的分选接合部，所述分叉的分选接合部与第一出口通道和第二出口通道处于流体连通，其中所述分叉的分选接合部被适配成将这些液滴分选到经由第一出口通道离开的第一液滴集和经由第二出口通道离开的第二液滴集。
机制可以是通过检测荧光或通过检测光散射。检测可以与其中不存在基因(或其中具有编码非活性酶的基因)的对照液滴进行比较。如果检测是光散射，如果塑料已经降解，则光散射将减少。如果通过荧光进行检测，荧光信号将随酶活性而增加。
光散射的光信号可以使用2根彼此成大约90°角的光纤来检测(参见图2A)。另外，引入检测点的液滴通道可以与检测光纤成大约90°角，与入射光成180°角。这使得光纤能够靠近微流体通道插入。
提供入射光的光纤的直径可以小于液滴和检测光纤。
酶
塑料降解
塑料降解意指将塑料聚合物分解成构成部分的能力。
酶可以是水解酶。例如，酶可以属于EC 3酶类。降解可以是通过催化将聚酯水解成酸和醇。也就是说，酶是例如酯酶或脂肪酶或角质酶。酶可属于分类为EC 3.1的水解酶类。
降解可以是通过催化将聚酰胺水解，从而释放胺和羧酸。也就是说，酶是尼龙水解酶或尼龙酶(nylonase)。它们可以属于分类为EC 3.5.1.117的水解酶类。
例如，SEQ ID NO.2、4和6是水解酶，例如酯酶，并且可以进一步分类为PET酶。例如，SEQ ID NO.8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30和32是水解酶，并且可以进一步分类为尼龙水解酶。
塑料
塑料意指包含聚合物的合成材料，其可以被模制、挤出、压制或以其他方式成形为刚性或略带弹性的形式。
塑料可以是聚酯、聚酰胺；聚乙烯、聚氨酯或聚烯烃。
塑料可以包括以下中的任一项：聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚对苯二甲酸丙二醇酯(PTT)、聚琥珀酸乙二醇酯(PES)、聚对苯二甲酸丁二醇酯(PBT)、聚对苯二甲酸乙二醇异山梨醇酯(PEIT)、聚乳酸(PLA)、聚羟基链烷酸酯(PHA)、聚琥珀酸丁二醇酯(PBS)、聚琥珀酸己二酸丁二醇酯(PBSA)、聚对苯二甲酸己二酸丁二醇酯(PBAT)、聚乙二醇呋喃酸酯(PEF)、聚己内酯(PCL)、聚(己二酸乙二醇酯)(PEA)、聚萘二甲酸乙二醇酯(PEN)、聚苯乙烯(PS)、聚丙烯(PP)、聚氯乙烯(PVC)、聚氨酯(PUR)(例如弹性纤维)、聚酰胺(PA)、聚碳酸酯(PC)以及本文所述的任何聚合物的共混物/混合物。粒子可以包含任一种上述塑料或共混物/混合物或由其组成。
塑料可以是聚酰胺，如尼龙。尼龙可以是尼龙6或尼龙12、或尼龙6,6。
重组
重组意指对于其中表达所述核酸的细胞而言不是天然的外源核酸序列。
序列表
表1.酶的SEQ ID号(用于序列表中)
序列同一性
可以使用任何合适的软件如BLAST(Altschul,S.F.,Gish,W.,Miller,W.,Myers,E.W.&Lipman,D.J.(1990)“Basic local alignment search tool[基本局部比对搜索工具].”J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]215:403-410.)来计算序列同一性。
要求保护的酶可以与表1中列出的任何酶具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或90％序列同一性。这些酶可以另外被截短为用以提供功能的核心二级结构元件，例如通过从构建体的N末端和/或C末端去除1至20个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个)氨基酸。
相对于全长序列计算序列同一性。
分离
蛋白质或核酸可以是分离的。“分离的”意指蛋白质或核苷酸分子不处于其天然状态，目前它已经被纯化到至少某一程度或已经通过例如重组方法合成产生。因此，术语“分离的”包括分子与其他生物或非生物材料(如细胞、细胞或细胞片段的悬液、蛋白质、肽、表达载体、有机或无机溶剂、或其他适当的材料)组合的可能性，但排除蛋白质处于自然界中发现的状态的情况。
突变体
突变体意指不同于野生型(例如全长野生型形式)的酶(即变体，并且这些术语在本申请中可互换使用)。突变体可以通过本领域熟知的各种技术获得。特别地，用于改变编码野生型蛋白质的DNA序列的技术的实例包括但不限于定点诱变、随机诱变和合成寡核苷酸构建。也就是说，变体或突变体可以具有改变的氨基酸序列。
对应意指该酶的任何序列中的等同氨基酸。
可以使用序列比对软件(如上述BLAST序列比对工具)发现对应或等同的氨基酸。
核酸
这些核酸可与表1中列出的那些具有70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％序列同一性。
表达盒
术语“表达盒”表示核酸构建体，其包含编码区(即本发明的核酸)和可操作地连接的调节区(即包含一个或多个控制序列)。
表达盒可以是表达载体的一部分。如本文所用，术语“表达载体”意指包含本发明的表达盒的DNA或RNA分子。优选地，表达载体是线性或环状双链DNA分子。
表达盒可以是体外转录和翻译系统的一部分，或者可以由宿主细胞表达。
宿主细胞
宿主细胞可以以瞬时或稳定的方式转化、转染或转导。将本发明的表达盒或载体引入到宿主细胞中，这样使得所述盒或载体被维持作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体。术语“宿主细胞”还涵盖由于复制期间发生突变而与亲本宿主细胞不同一的亲本宿主细胞的任何后代。宿主细胞可以是有用于产生本发明的变体的任何细胞，例如原核细胞或真核细胞。例如，原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。根据本发明的核酸、表达盒或表达载体可以通过技术人员已知的任何方法引入宿主细胞中，如电穿孔、缀合、转导、感受态细胞转化、原生质体转化、原生质体融合、生物弹道“基因枪”转化、PEG介导的转化、脂质辅助的转化或转染、化学介导的转染、乙酸锂介导的转化、脂质体介导的转化。
任选地，可以将本发明的核酸、盒或载体的多于一个的拷贝插入到一个宿主细胞中以增加变体的产生。
在特定实施例中，宿主细胞是重组微生物。本发明确实允许工程化具有改进的降解含聚酯材料的能力的微生物。例如，本发明的序列可以用于补给已知能够降解聚酯的真菌或细菌的野生型菌株，以便改进和/或增加菌株能力。
用途
以上对酶的描述适用于这些酶的用途。
酶的结构
RR1102(指定变体)的原子坐标已经保藏在登录号PDB ID:6ZZV下。
CI5En2-A9S(指定变体)的原子坐标已经保藏在登录号PDB ID:7NCQ下。
活性位点残基在下表2和3中给出。
RMSD
单均方根偏差(RMSD)是对叠加蛋白结构的主链原子之间的平均距离的测量。可以使用任何算法计算RMSD，例如如在Coutsias EA,Seok C,Dill KA(2004).“Usingquaternions to calculate RMSD[使用四元法计算RMSD]”.J Comput Chem.[计算化学杂志]25(15):1849-1857中描述的。
表2.活性位点残基
活性位点残基
RR11O2 S149/D311/E212/H308
表3.CI5En2的活性位点残基
活性位点残基
Cl5En2-wt S138/D184/H216
这些残基的原子坐标可以在图16和17中找到。
原子坐标可以在计算机可读介质上。
除了表3之外，活性位点残基可以包括以下中的任一项或多项：Asn 137、Tyr 72、Val 71、Thr 220、Phe 221、Leu 217、Leu 222、Phe 68、Ala 67、Ile 186、Met 139、Ala 187、Trp 163、Leu 66和Phe 65。例如，除了表3中的那些之外，活性位点残基还可以包括所有这些残基。
原子坐标的用途
可以使用原子坐标来通过计算设计(即，按计算机实施的方法)优化酶的塑性降解活性，可包括使活性位点内的氨基酸在计算上突变，以：i)改变塑料底物结合或ii)增加水解反应速率。这可以使用https://funclib.weizmann.ac.il/bin/steps来进行。也可以以相同的方式使用原子坐标来增加酶的热稳定性。这可以使用https://pross.weizmann.ac.il/step/pross-terms/来进行。
“优化热稳定性”意指增加酶的预测解链温度。
还可以使用原子坐标来设计塑料水解酶，例如使用由Richter F,Leaver-Fay A,Khare SD,Bjelic S,Baker D(2011)De Novo Enzyme Design Using Rosetta3[使用Rosetta3重新设计酶].PLoS ONE[公共科学图书馆·综合]6(5):e19230描述的方案。
所用的原子坐标可以是图16或17中的氨基酸坐标。图16列出了RR1102的氨基酸坐标。氨基酸残基12-325列于图16中。图17列出了CI5En2-A9S的氨基酸坐标。氨基酸残基2-267列于图17中。
这些坐标可以另外被截短为核心二级结构元件，例如通过从N末端和/或C末端去除1至20个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个)氨基酸。
贯穿本说明书，除非上下文另外需要，术语“包含(comprise)”或“包括(include)”或变化形式(如“包含(comprises或comprising)”、“包括(includes或including)”)应被理解为暗示所述方法或试剂盒包括所陈述完整事物或多个完整事物的群组，但不排除任何其他完整事物或多个完整事物的群组。
本发明的进一步特征
另外，塑料粒子可以替代性地是生物聚合物粒子。例如，包含生物聚合物(如几丁质、木质纤维素生物质、纤维素、淀粉、藻酸盐、天然橡胶、角质、胶膜(cutan)或黑色素)或由其组成的颗粒。生物聚合物意指由活生物体(如植物和微生物)产生或衍生自活生物体而非衍生自石油(聚合物的传统来源)的聚合物。
因此，所述方法可以是用于鉴定生物聚合物降解酶或优化生物聚合物降解酶的方法，所述方法包括：
a)将基因文库包封到多个微流体液滴中，每个微流体液滴包含至少一个基因，并且每个微流体液滴另外包含：
i)用于表达所述基因的表达系统；和
ii)生物聚合物粒子；
b)检测所述微流体液滴中所述生物聚合物粒子的降解；以及
c)选择其中已经检测到生物聚合物降解的微流体液滴。
以上关于塑料粒子描述的实施例同样适用于在此关于生物聚合物描述的。
本发明还通过以下编号条款来描述：
1.一种用于筛选优化的聚合物降解酶的方法，所述方法包括：
a)将具有所述聚合物降解酶的变体基因序列的基因文库包封到多个微流体液滴中，每个微流体液滴包含所述聚合物降解酶的至少一个变体基因序列，并且每个微流体液滴另外包含：
i)用于表达所述基因的表达系统；和
ii)聚合物粒子；
b)检测所述微流体液滴中所述聚合物粒子的降解；以及
c)选择其中已经检测到聚合物降解的微流体液滴。
2.一种用于鉴定聚合物降解酶的方法，所述方法包括：
a)将基因文库包封到多个微流体液滴中，每个微流体液滴包含至少一个基因，并且每个微流体液滴另外包含：
i)用于表达所述基因的表达系统；和
ii)聚合物粒子；
b)检测所述微流体液滴中所述聚合物粒子的降解；以及
c)选择其中已经检测到聚合物降解的微流体液滴。
3.a)如条款1所述的方法，其中
所述基因文库是定向进化文库；或者
b)如条款2所述的方法，其中所述基因文库是宏基因组文库；和/或
c)如条款2所述的方法，其中所述方法进一步包括制备具有所鉴定的聚合物降解酶的变体基因序列的基因文库，并进行如条款1所述的方法。
4.如条款1-3中任一项所述的方法，其中所述聚合物是生物聚合物，例如上文描述的任何生物聚合物。
5.如条款4所述的方法，其中检测降解是通过检测由所述生物聚合物粒子引起的光散射的减少来进行的。
6.如条款2所述的方法，其中所述方法是在用以鉴定聚合物降解酶(任选地生物聚合物降解酶)的基因序列的筛选方法之前进行，其中所述筛选方法包括：
a)将基因文库包封到多个微流体液滴中，每个微流体液滴包含至少一个基因，并且每个微流体液滴另外包含：
i)用于表达所述基因的表达系统；和
ii)可溶性聚合物模拟物(任选地可溶性生物聚合物模拟物)；
b)检测所述微流体液滴中所述可溶性聚合物模拟物的裂解；以及
c)选择其中已经检测到裂解的微流体液滴，任选地其中所述基因文库是宏基因组文库。
本文所引用的每篇文件、参考文献、专利申请或专利都以其全部内容通过引用清楚地结合在此，这意味着读者应当将上述文献作为本文的一部分来阅读和考虑。仅仅为了简洁，本文所引用的文件、参考文献、专利申请或专利都不再在本文中重复。提及本文所含的引用材料或信息不应被理解为承认所述材料或信息属于公知常识的一部分或在任何国家中已知。
附图说明
图1显示了微流体液滴中关于酯酶活性的功能宏基因组学。(a)来自八个不同来源的汇集的宏基因组文库含有1.25x 106个成员和从1至5kb的插入尺寸。(b)将汇集的宏基因组DNA转化到高效的大肠杆菌(E.coli)细胞中，并在泊松分布(λ＝0.35，24.6％的液滴被单独区室化)下与20μM的(1)荧光素二己酸酯底物和细胞裂解试剂一起区室化到油包水液滴中。(c)将液滴在芯片外在室温下孵育24至72小时，并且(d)通过FADS进行分选。将门控调整至高于反应背景的荧光，并且分选液滴进行去乳化和(e)DNA回收。(f)将回收的质粒转化到大肠杆菌BL21中，并将细胞铺板在含有1％(2)三丁酸甘油酯的LB琼脂板上，通过检测阳性命中菌落周围的透明晕圈，将其用于二次筛选。(g)对潜在候选物进行测序，并对预测的基因进行注释。(h)将编码酯酶/脂肪酶或α/β水解酶的基因与已知数据库进行比较，并克隆到表达载体中以得到动力学和混杂曲线，用于鉴定具有独特特征(i)的命中。
图2a.实验期间使用的微流体装置的设计。(a)用于生成单分散油包水液滴的流动聚焦装置。分别从入口2和3注入含有底物和细胞的两种水溶液。入口1用于油-表面活性剂混合物。从出口4收集液滴。液滴生成装置的深度为80μm。流动聚焦接合部处的通道为50μm宽，并且另外存在促进液滴形成的25μm宽的缩窄部。(c)用于液滴的散射激活筛选的分选装置。数字5指示液滴乳液的入口，数字6和7分别表示空间和偏压油(bias oil)的入口。用于生成高压信号的5M NaCl溶液的入口用8和9标记，分别用于接地[GND(-)]和信号[信号(+)]电极。阳性通道(ch+)和阴性通道(ch-)的出口分别用数字10和11标记。数字12和13表示FC/PC光纤的插入位点，分别为25μm，0.1NA和105μm，0.22NA(托尔实验室(Thorlabs)，英国)。除了再注射舱为50μm深之外，整个分选装置的深度是100μm。在分选接合部处的通道的宽度为50μm宽。比例尺为5mm。
图2b.用于散射激活液滴分选的光学设置的方案。所述设置是对先前提出的用于荧光激活液滴分选的系统的改良(van Loo等人ACS Synth.Biol.[ACS合成生物学]2019,8,12,2690-2700)。由来自显微镜灯的红光穿过593nm长通滤光片F1(FF01-593/LP-25，Semrocks)和显微镜集光器的透镜(L1)照射微流体装置的大部分。接着，通过物镜(通常为10x或20x)收集透射的红光，所述红光通过摄影窗口离开显微镜，将它通过快速照相机(Miro eX4，幻影公司(Phantom)，美国)记录下来。来自488nm激光器(容错公司(Stratus))的光穿过中性密度滤光片OD＝1(NE10A，托尔实验室)，并且接下来通过经由C1准直器(可调节FC/PC准直器，CFC-11X-A，托尔实验室)耦合到入射光光纤(25μm，0.1NA，FC/PC，托尔实验室)将其递送到分选接合部。通常，激光的输入强度被设置为10mW，在穿过ND滤光片之后，在芯片上转换为1mW。从检测光纤(25μm，0.1NA，FC/PC托尔实验室)发出的光经由C2准直器(CFC-11X-A，托尔实验室)连接到容纳安装在光电倍增管PMT(PM002，托尔实验室)的检测器之前50mm的F2带通滤光片(FL488-10 nm，托尔实验室)的检测器管上。使用单球面透镜(L2，L3)来将光聚焦在照相机和PMT的检测器上。由耦合至FPGA NI卡的PMT记录散射光信号，并由定制的写入LabVIEW程序实时分析。黑色箭头指示系统中信号和触发器的方向。当散射光信号高于任意设置的阈值时，FPGA卡触发由一系列电子装置生成高压脉冲(1kV)：脉冲发生器PG(TGP110，Thurlby Thandar仪器公司)->函数发生器FG(TG200，Thurlby Thandar仪器公司)->高压放大器AMP(610E，崔克公司(Trek))。通过填充有5M NaCl溶液7的“盐电极”，以2.5ms的延迟将短的2ms长脉冲递送至微流体装置，结果高荧光液滴偏离至用于阳性“命中”(b)的收集通道。脉冲的持续时间和延迟可以根据流速和所希望的分选通量(高达350Hz)来改良，取决于输入乳液的质量。
图3显示了从荧光液滴分选到阳性命中鉴定。通过使用(1)荧光素二己酸酯作为诱饵底物，对超过1百万个成员的宏基因组文库进行针对酯酶活性的分选。将油包水液滴在室温下孵育长达3天并经由FADS分选高于阈值的，此处(A)显示了在将活动I孵育1天(筛选液滴1000万个，分选液滴126个-代表分选级分为0.0012％)和2天(筛选液滴570万个，分选液滴110个-代表分选级分为0.0019％)之后分选液滴的荧光直方图。在液滴分选和DNA回收之后，将回收的质粒转化到细胞中用于二次筛选(B和C)。(B)通过将1％(2)三丁酸甘油酯水解成甘油和丁酸，在酯酶活性的潜在阳性候选物的菌落周围形成透明晕圈。(C)经由与荧光素二己酸酯的反应进一步确认活性。当使用荧光酶标仪时，可以对通过阳性候选物将荧光素二己酸酯水解为荧光素单己酸酯和己酸进行监测。P35和Est30分别用作阴性和阳性对照，灰色虚线代表阴性对照的背景反应。反应一式三份进行，并且测量的标准误差显示为误差条。
图4显示了宏基因组命中：探索α/β水解酶超家族及其活性。研究宏基因组命中的序列的上下文，连同它们对p-NP酰基酯的功能活性、pH曲线和解链温度。(A)用从α/β水解酶氏族(来自Pfam分类的CL0028)检索的序列和在本工作中鉴定的13个宏基因组命中生成序列网络。创建的网络含有370,000个序列，这些序列聚类为20,000个节点，代表80％的CL0028。节点大小与所代表的序列的数量成比例(范围为1到2600，中位数为4)。连接线代表e值<10-20的比对，中位比对长度为312。(B、C和D)宏基因组命中的功能表征。将编码酯酶/脂肪酶活性的ORF单独克隆到表达载体中，并针对p-NP酰基酯(B)、pH(C)和解链温度(D)测试对应的重组蛋白。(B)针对不同的p-NP酰基酯[乙酸酯(C2)、丁酸酯(C4)、己酸酯(C6)、辛酸酯(C8)、癸酸酯(C10)、十二烷酸酯(C12)、肉豆蔻酸酯(C14)和棕榈酸酯(C16)]测量宏基因组命中的催化效率。在22℃下，在含有50mM Tris-HCl pH 8.0和0.3％(v/v)Triton X-100的缓冲液中进行反应。(C)在柠檬酸缓冲液(pH 4.0、5.0和6.0)、磷酸盐(pH 6.0、7.0和8.0)、Tris-HCl(pH 7.0、8.0和9.0)或CAPS(pH 9.5、10.0和11.0)中针对1mM p-NP C6执行pH曲线。(D)经由热迁移测定来确定解链温度(Tm)，其中它们的变性促进Sypro橙的释放，并且通过20℃至100℃的温度斜坡测量释放的荧光(λ激发＝410nm，λ发射＝610nm)。一式三份进行实验，并且在对Kaleidagraph进行分析之前将数据归一化。在含有100mM Tris-HCl pH 8.0和100mM NaCl的缓冲液中进行测定。
图5显示了探索序列空间以发现PET水解酶。(A)目前已知的PET酶和新的酯酶宏基因组衍生的RR11O2的序列网络。从MGnify和NCBI数据库中检索3408个序列，并且此处显示获得的序列网络(未展示20％至50％同一性的序列)。灰色节点代表从MGnify和NCBI提取的序列。红色节点代表RR11O2，蓝色节点代表已知的PET酶，绿色和橙色节点分别代表报告的显示PET活性的角质酶和酯酶，并且浅蓝色节点代表文献中描述的聚酯降解酶。为了推定地表征序列簇，对网络中PET酶、角质酶、酯酶和RR11O2进行鉴定有助于定义潜在簇。RR11O2、Cl5En2和PET酶的簇以灰色书写。(B)PET水解酶催化聚(对苯二甲酸乙二醇酯)(PET)解聚成对苯二甲酸双(2-羟乙基)酯(BHET)、单(2-羟乙基)-对苯二甲酸(MHET)或对苯二甲酸(TPA)和乙二醇(EG)。在经由高效液相色谱(HPLC)表征期间，MHET和TPA已经被鉴定为主要产物。(C)通过RR11O2、Cl5En2和对照LCC、LCC-ICCG以及IsPET酶对PET进行的酶促降解。使用6μM的酶在37℃下孵育三天后对从结晶PET膜释放的化合物进行HPLC分析。监测250nm下的吸光度。
图6显示了经由荧光激活液滴分选(FADS)对来自宏基因组文库的酶进行功能筛选，随后是基于微液滴的散射光激活分选(SADS)的定向进化循环。(A)如图1所述，为了针对酯酶活性筛选宏基因组文库，将分离的环境DNA(eDNA)克隆到质粒中。在转化细菌细胞后，将单个细胞与裂解剂和荧光素二己酸酯底物共包封在微液滴中。在芯片外孵育后，将液滴再注入FADS分选装置中，并选择阳性命中。在回收DNA后进行再筛选和测序，得到了对PET显示出混杂活性的新的酯酶。将此酶与已知的PET酶一起用于生成序列网络。在簇中将Cl5En2鉴定为新的PET水解酶。使此酶经受定向进化活动。将单个细菌细胞与裂解剂和用作测定底物的PET纳米粒子一起包封在微液滴中。将液滴在液滴舱中孵育并再注入分选模块中。SADS模块依赖于以90°角集成到芯片中的光纤。显示测定的主要原理的示意图。如果酶降解塑料纳米粒子，则散射光的强度降低。从阳性液滴中回收DNA，并进行再筛选和测序，产生改进的PET水解酶。为了进一步改进，进行了迭代轮次进化。(B)描绘一个分选事件的后续独立视频帧。当液滴在光纤前方流动时，微液滴分选装置测量光散射的强度。当测量值在用户定义的阈值内时，触发“阳性”液滴的介电泳分选。(C)针对共包封的Cl5En2(600nM)或缓冲液对照和PET纳米粒子检测的光散射的直方图。归因于PET的解聚，含有酶的液滴的信号随时间而降低。(D)柱状图，其显示了用表达Cl5En2的易错PCR文库的单细胞液滴裂解产物进行的分选实验的结果。在室温下孵育两周后进行分选。来自分选的阳性液滴的光散射的值用绿色标记并且代表群体的0.5％。
图7显示了功能未知蛋白(DUF3089)的成员RR11O2的结构特征。(A)RR11O2的蛋白质结构，其中链A(左侧)展示为B因子分析，链B(右侧)以卡通展示(α-螺旋为深鲑鱼色且β-链为黑色)。(B)RR11O2的腔(蓝色)以及催化三联体(青色)S149、D311和H308的细节。(C)针对p-NP酰基酯[乙酸酯(C2)、丁酸酯(C4)、己酸酯(C6)、辛酸酯(C8)、癸酸酯(C10)、十二烷酸酯(C12)、肉豆蔻酸酯(C14)和棕榈酸酯(C16)]测量RR11O2的催化效率。在22℃下，在含有50mM Tris-HCl pH8.0和0.3％(v/v)Triton X-100的缓冲液中进行反应。
图8显示了具有不同链长的对硝基苯酚酰基酯的预测结合模式。由PRANK服务器(18)预测的RR1102的最大结合位点(被认为是活性位点)被着色为红色(口袋A)和蓝色(口袋B)。(A)针对与RR1102的活性位点结合的每种底物生成的结合模式的所有10个姿态。预测具有烷基链C2至C8的底物以所有预测的结合模式结合在内活性位点口袋(口袋A)内。但是预测C10至C16不适合在活性位点口袋(口袋A)内。这种预测的结合模式通过对具有链长C10至C16的底物缺乏活性来验证。(B)建模研究中使用的底物的活性。(C)建模研究中使用的底物的结构。
图9a显示了改进的变体的筛选和表征。(A)在分选Cl5En2的ep-PCR文库后，富集与野生型相比具有更高活性的变体。在回收和转化DNA后，在8天、两周和五周后从未分选的原始文库和分选的样品中随机挑取菌落，随后针对p-NP C12底物进行平板测定。将数据相对于Cl5En2-wt的速率归一化。条形图给出了与wt相比显示更高活性(活性>wt)或更低活性(活性<wt)的变体的比较。(B)在Cl5En2的三轮进化之后富集具有比野生型更高的活性的变体。盒式图显示了均值()、中位数(-)、四分位数(方框)和范围(须线)。(C)与Cl5En2-wt和宏基因组衍生的命中RR11O2相比有改进的变体的活性。将PET纳米粒子用6μM酶在37℃下孵育一小时。通过HPLC以及TPA和MHET的对应标准曲线确定释放的单体TPA和MHET的量。(D)显示了在用600nM A10和Cl5En2-wt孵育无定形PET NP的微液滴中经22小时进行的时程实验的结果。
图9b显示了Bla-Cl5En2-wt、其变体和IsPET酶的热稳定性。经由热迁移测定来确定经纯化的酶的解链温度(Tm)，其中它们的变性促进Sypro橙的释放，并且通过25℃至95℃的温度斜坡测量释放的荧光(λ激发＝410nm，λ发射＝610nm)。一式三份进行实验，并且在对Kaleidagraph进行分析之前将数据归一化。在含有100mM Tris-HCl pH 8.0和100mM NaCl的缓冲液中进行测定。
图10显示了Cl5En2-A9S(PDB代码7NCQ)的结构特征。(A)在的高分辨率下获得的Cl5En2-A9S的蛋白质结构。Cl5En2-A9S展示了α/β折叠，并且在晶胞中观察到两个分子(链A和B)。(B)构成催化三联体的残基(S138、D184和H216)。
图11显示了RR11O2具有底物透明进口和内腔。(A和B)RR11O2展示为蓝色表面，并且进入催化三联体的进口用圆点以及灰色箭头(A)和黑色箭头(B和C)突出显示。B-蛋白质表面以60％的透明度示出，允许可视化蛋白质内部催化三联体(S149、D311和H308)的残基。(C)示出了在与(A)和(B)中相同的位置以及在向右侧90°翻转之后RR11O2的腔。进口位置用黑色箭头显示。
图12显示了RR11O2与来自α/β折叠家族的成员的二级和三级结构比较。(A)RR1102的二级结构图。RR1102与其他α/β折叠水解酶之间的结构上保守的二级结构的颜色是匹配的。(B)α/β水解酶的二级结构的一览图。RR1102与其他α/β折叠水解酶之间的结构上保守的二级结构的颜色是匹配的。灰色二级结构是非保守的；(C)在RR1102中保守的α/β水解酶折叠的β-片层和α-螺旋；对于(A)、(B)和(C)，结构上保守的结构的颜色是匹配的。(D)RR1102(PDB代码6ZZV)针对代表性α/β水解酶折叠(PDB代码1UFO)的结构比对。在Pymol中使用super函数进行比对；(E)RR1102的B片层与PDB代码1UFO的B-片层的结构比对；(F)RR1102和1UFO的保守α-螺旋的结构比对；RR1102和1UFO的保守α-螺旋和β-片层的结构比对；(G)RR1102(PDB 6ZZV)针对代表性α/β水解酶折叠(PDB代码1UFO)的全结构的全结构比对。
图13显示了RR11O2(PDB 6ZZV)的催化三联体。来自RR1102的保守α-螺旋α-F和来自PDB代码1UFO的α-C的结构比对。(A)亲核的位置(RR11O2的Ser149和PDB代码1UFO的Ser113)，(B)与RR1102中Asp311和Glu212的位置相比，来自PDB代码1UFO的催化三联体的Asp183的位置。在RR1102的此部分中二级结构几乎没有保守性；(C)来自RR1102的α-J和来自PDB代码1UFO的α-E的结构比对。显示了来自两种结构的催化三联体的碱性His的位置；(D)通过DALI服务器鉴定的具有最高结构相似性的10个结构中催化三联体的位置；(E)催化三联体的可能的第三成员在RR1102活性位点中的位置。
图14显示了对RR11O2结构(PDB 6ZZY)上环的柔性的研究。(A)RR11O2的3D结构的链A关于两个活性位点环(环1和环2)的归一化B因子。(B)RR1102的结构中柔性活性位点和环(环1)的位置。(C)RR1102的链A的结构，其中颜色和尺寸代表B因子；(D)柔性活性位点环的位置和底物的预测结合模式。
图15a显示了PET NP的流体动力学直径分布。从无定形膜或结晶粉末开始，通过动态光散射(DLS)确定粒度。显示了悬液的多分散性指数(PdI)。
图15b显示了无定形和结晶PET NP的酶促降解。对使用6μM pExp-bla-Cl5En2-WT在30℃下孵育一周后释放的产物进行HPLC分析。监测250nm下的吸光度，这检测出了释放的TPA和MHET。
图15c显示了对稳定的尼龙6和尼龙66纳米粒子(NP)进行动态光散射(DLS)测量以确定尺寸分布。(A)用0.1％ SDS稳定的尼龙6NP。(B)用0.1％ SDS稳定的尼龙66NP。d：直径；PdI：多分散性指数。
图16显示了RR1102的原子坐标。
图17显示了用BHET浸泡的CI5En2-A9S的原子坐标。
图18显示了用BHET浸泡的Cl5En2-A9S(PDB代码7ZJ9)的蛋白质结构。Cl5En2-A9S的晶体是在Proplex H2(0.1M MES pH 6.5，1M LiSO4)条件下获得的，并且将它们在含有3.5mM的母液储器中浸泡46min。获得在下的高分辨率数据集。与BHET水解产物TPA复合的Cl5En2-A9S的表面展示(A)和卡通展示(B)。(C)与TPA(蓝色)复合的Cl5En2的催化三联体(S138、D184和H216，绿色)。在所有图中示出了结晶条件中硫酸盐的存在。
图19显示了与聚己内酯PCL(PDB代码7ZJA)共结晶的Cl5En2-A9S的蛋白质结构。在PCL纳米粒子存在下Cl5En2-A9S结晶，并且在“经典H8”[0.1M MES pH6.5，30％w/v，PEG MME5K，0.2M(NH4)2SO4]的条件下成功形成晶体。获得了与PCL共结晶的Cl5En2-A9S在下的高分辨率数据集。与PCL水解产物6-羟基己酸复合的Cl5En2-A9S的表面展示(A)和卡通展示(B)。(C)与6-羟基己酸(蓝色)复合的Cl5En2(S138、D184和H216，绿色)的催化三联体。
图20显示了a)对5mg/mL木质素纳米粒子(NP)进行动态光散射(DLS)测量以确定尺寸分布(d：直径；PdI：多分散性指数)和b)对含有木质素纳米粒子的液滴进行散射激活测量(将5mg/mL木质素纳米粒子包封在150pL液滴中)。
图21显示了探索序列空间以发现新的尼龙酶。(A)从MGnify数据库中提取NylC的同源物(NCBI登录代码：Q1EPR5.2)，并用于生成由1583个节点和69291个边缘序列构成的序列网络。(B)鉴定NylC的第一个相邻序列，并选择最接近的候选物(C)，其中包括Nyl2(MGnify代码：MGYP000645618208)。
图22显示了探索序列空间以发现新的尼龙酶。(A)从MGnify数据库中提取NylC的同源物(NCBI登录代码：Q1EPR5.2)，并用于生成由1583个节点和69291个边缘序列构成的序列网络。(B)鉴定MGYP000645618208的第一连接(在列出的代码下从MGnify检索出来的序列)，并且将序列空间划分成簇(从1到3)。从每个簇中选择潜在的尼龙酶候选物，包括：Nyl5(MGnify代码：MGYP000544655629，来自簇1)和Nyl9(MGnify代码：MGYP000403660814，来自簇3)。
图23显示了由尼龙6纳米粒子解聚释放的产物的高效液相色谱(HPLC)分析。使用10μM的酶Nyl-2、Nyl-3、Nyl-5、Nyl-9和缓冲液对照在37℃下孵育一周后监测反应。测定220nm下的吸光度，检测释放的6-氨基己酸。时间偏移量为2％。
图24a显示了由尼龙6纳米粒子解聚释放的产物的高效液相色谱(HPLC)分析。使用18μM的酶Bla-Nyl土壤和缓冲液对照在37℃下孵育3天后测量反应。测定220nm下的吸光度，检测释放的6-氨基己酸。图24b显示了由tights样品解聚释放的产物的高效液相色谱(HPLC)分析。在1周的时间段和在37℃下使用18μM的酶Nyl-2、Nyl-5、Nyl-9、Nyl-10、Nyl-11、Nyl-12、Nyl-14、Nyl-Mar-2、Nyl-18、Nyl-20、Nyl-24、Nyl-25以及阴性缓冲液对照和阳性Nyl-C对照进行孵育后测量反应。测量220nm下的吸光度，检测释放的6-氨基己酸(Ahx)。
图25显示了在Uniprot/SwissProt/NCBI数据库上探索序列空间以发现新的尼龙酶。从Uniprot/SwissProt/NCBI数据库中提取酰胺酶(NCBI代码WP_011209364.1)、NylA(NCBI登录代码：P13397和P13398)、NylB(NCBI登录代码P07061)和NylC(NCBI登录代码：Q1EPR5.2)的同源物，并用于生成由9,770个序列构成的序列网络。鉴定NylC的第一个相邻序列，并检索295个序列用于系统发育分析。检索的序列有Nyl-10(Uniprot代码A0A1C6V3K0)、Nyl-11(Uniprot代码A0A138ZXG5)、Nyl-12(Uniprot代码A0A1M7HAK8)和Nyl-14(Uniprot代码WP243569406.1)。
图26显示了在全长数据库MGnify上探索序列空间以发现新的尼龙酶。(A)从MGnify/全长数据库中提取酰胺酶(NCBI代码WP_011209364.1)、NylA(NCBI登录代码：P13397和P13398)、NylB(NCBI登录代码P07061)和NylC(NCBI登录代码：Q1EPR5.2)的同源物，并用于生成由10,233个序列构成的序列网络。(B)鉴定NylC的第一个相邻序列，并(C)检索497个序列用于系统发育分析。检索的序列有Nyl 18-FL(MGnify代码MGYP000370831902/2-317)、20-FL(MGnify代码MGYP000123679597/3-313)、24-FL(MGnify代码MGYP000614730541/11-353)和25-FL(MGYP000554001943/18-373)。
图27显示了在土壤数据库MGnify上探索序列空间以发现新的尼龙酶。从MGnify/土壤数据库中提取酰胺酶(NCBI代码WP_011209364.1)、NylA(NCBI登录代码：P13397和P13398)、NylB(NCBI登录代码P07061)和NylC(NCBI登录代码：Q1EPR5.2)的同源物，并用于生成由1,108个序列构成的序列网络。鉴定NylC的第一个相邻序列，并检索77个序列用于系统发育分析。检索的序列有土壤1(MGnify代码MGYP000120183263/1-286)。
图28显示了在海洋数据库MGnify上探索序列空间以发现新的尼龙酶。(A)从MGnify/海洋数据库中提取酰胺酶(NCBI代码WP_011209364.1)、NylA(NCBI登录代码：P13397和P13398)、NylB(NCBI登录代码P07061)和NylC(NCBI登录代码：Q1EPR5.2)的同源物，并用于生成由7,089个序列构成的序列网络。鉴定NylC的第一个相邻序列，并(C)检索344个序列用于系统发育分析。检索的序列有海洋2(MGnify代码MGYP000645432643/3-305)。
实例
现在将仅通过举例的方式并且参考以下实验来说明本发明的各个方面。
一般材料和方法：
用于散射激活液滴分选(SADS)的微流体芯片的制造
用于液滴生成和液滴分选的微流体装置是遵循经典软光刻程序通过使用高分辨率乙酸盐掩模和SU-8光致抗蚀剂图形化(patterning)制造的。为了制造单个PDMS[聚(二甲基硅氧烷)]微流体装置，将20-30克硅酮弹性体基料和固化剂(SylgardTM 184，道康宁公司(Dow Corning)，美国)以10:1(v:v)的比率在塑料杯中混合，并且接着在真空舱中脱气。接下来，将PDMS倾倒在SU-8主晶片上并且在烘箱中在65℃下固化至少4小时。然后在低压氧等离子体发生器(Femto，迪内电子公司(Diener Electronics)，德国)中将图形化的PDMS芯片等离子体键合到50mm x 75mm x 1mm(长度x宽度x厚度)的载玻片上。接下来，将装置用在HFE-7500(3M，美国)中的1％(v/v)三氯(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)-硅烷(西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich)，英国)冲洗并且在热板上在75℃下烘烤30分钟以便蒸发氟碳油和硅烷混合物。
制造分选芯片需要与入射光附加集成以及具有FC/PC型连接器的检测多模光纤。入射光纤(目录号M67L02，托尔实验室)具有125μm的包层直径和25μm的芯径，数值孔径(NA)为0.1。检测光纤(目录号M43L02，托尔实验室)具有125μm的包层直径和105μm的芯径，NA为0.22。将两种光纤在其端部切割以去除FC/PC连接器之一，接着使用三孔光纤剥皮器(目录号FTS4，托尔实验室)去除被夹住的外部保护性PVC，用解剖刀切割保护性螺纹并且最后使用光纤剥皮工具(目录号T06S13，托尔实验室)将丙烯酸酯涂层去除。在下一步骤中，使用陶瓷光纤刻划刀(目录号CSW12-5，托尔实验室)切割光纤尖头的尖头以获得平的尖端。通过使低功率(例如0.1mW)激光穿过光纤并目视检查从光纤尖端射出的光束的形状来检查裂解的质量。如果需要，则重复裂解直到观察到光束呈球形形状。在实验前至少1天将光纤末端固定到微流体芯片上。在显微镜载物台上进行光纤固定过程，并且使用显微照相机来验证光纤末端的位置。首先，用液体PDMS填充容纳光纤的微流体通道，并且然后将光纤尖头手动插入芯片中。另外通过用环氧胶(双组分环氧糊状胶粘剂)将光纤附接到芯片的载玻片上来稳定光纤。将整个芯片在显微镜载物台上放置过夜以使PDMS和胶在室温下固化。可将此种芯片用于几个分选实验，条件是将它们用纯HFE-7500小心地洗涤，并在每次使用后用压缩空气吹扫它们而进行干燥。
基因文库的表达
为了表达酶，可以使用以下方案：
·用基因文库转化大肠杆菌细胞并使细胞在培养瓶中生长。
·当细胞达到特定OD时，使用IPTG诱导蛋白质表达。例如，用0.4mM IPTG以0.5的OD诱导。
·将培养物在20℃下孵育过夜。
·将单个细胞与裂解剂一起包封到液滴中。
可以使用的另一种策略是将单细胞与培养物一起包封到液滴中。首先使细胞在液滴内生长，然后皮可注射IPTG以诱导蛋白质表达。之后皮可注射裂解剂和塑料纳米粒子。
PET膜的制备
通过将200mg PET颗粒分别溶解在10mL二氯甲烷中或者氯仿和三氟乙酸的4:1混合物中来制备用于酶促降解的PET膜。将500μL或1mL的溶解液分别在1.5mL开口管中在96℃下蒸发。使用差示扫描量热法(DSC)(1.5.)测定塑料膜的结晶度。
通过差示扫描量热法(DSC)表征塑料底物
将PET样品(颗粒、膜和纳米粒子)通过配备有自动进样器和中间冷却器系统的DSCQ2000仪器(TA仪器公司，纽卡斯尔，美国)进行分析。使大约1mg的干燥样品经受由在氮气氛下的第一加热、冷却和第二加热循环构成的温度程序。以5K/min的速率运行在-20℃与+300℃之间的第一加热循环。随后分别地以-10K/min恒定速率冷却至0℃且以10K/min的恒定速率进行第二加热循环至300℃。使用TA Universal Analysis 2000软件分析所得热分析图。从第一加热循环开始，计算玻璃化转变温度(Tg)、解链温度(Tm)和解链热ΔHm和冷结晶热ΔHc。通过以下等式计算结晶度K的百分比：
ΔHm是可通过对吸热解链峰进行积分确定的解链焓，ΔHc是冷结晶焓并且可通过对放热冷结晶峰进行积分确定。聚合物的实验融合热除以使100％结晶聚合物解链的焓的报告文献值(对于PET为140J/g)。
DNA测序、引物步移和ORF分析
选择在二次筛选期间显示透明晕圈的所有菌落进行Sanger DNA测序，使用M13-正向引物(5'-TGT AAAACG ACG GCC AGT-3')和M13-反向引物(5'-CAG GAA ACAGCT ATG AC-3')。使用Sequencher 5.4.5版(基因密码公司(Genes Codes Corporation))生成重叠群。如果需要，则进行引物步移测序方法。通过针对非冗余蛋白质(nr)和宏基因组学(env_nr)的局部比对BLAST工具以及Pfam数据库，将所有获得的重叠群与保藏在国家生物技术信息中心(NCBI)中的序列进行比较。使用ORFfinder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)通过使用任何替代的起始密码子进行ORF预测，并且将针对酯酶/脂肪酶活性预测的ORF与Pfam、ESTHER和UniProtKB数据库进行比较。
系统发育分析
从公共数据库检索代表着文献中描述的19个家族的48个成员的氨基酸序列。将这些序列与在本工作中鉴定的宏基因组衍生命中的13个序列一起用作使用ClustalW进行的序列比对的输入文件，并且将生成的输出文件提交给MEGA 7以建立合适的进化模型。系统发育树是通过使用根据基于JTT矩阵的模型的最大似然方法建立的，引导程序为1,000个重复。
对所选择物的克隆
选择酯酶活性的所有潜在ORF进行克隆用于进一步生化表征。使用设计的具有限制性内切酶位点的引物，用Phusion高保真DNA聚合酶(目录号F530L，赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific))通过PCR扩增所选择的基因。将扩增的片段克隆到pHAT或pHAT3载体中用于蛋白质表达，并使用重组质粒来转化大肠杆菌DH5ɑ细胞、大肠杆菌BL21细胞(DE3)(目录号C2527H，新英格兰生物实验室(New England BioLabs))或SHuffle T7表达细胞(目录号C3029H，新英格兰生物实验室)。
蛋白质过表达和纯化
使转化的细胞在含有100μg mL-1氨苄西林的5mL LB培养基中在37℃下生长16小时，并且使用获得的培养物来接种500mL LB(100μg mL-1氨苄西林)。使细胞在37℃下生长直到OD600nm达到0.5至0.6，并且通过在20℃下添加400μM的IPTG来持续20小时诱导蛋白质表达。表达后，通过在4℃下以4000g离心20分钟来收获细胞，并将其重悬于35mL的50mM Tris-HCl pH 8.0中用于经由Emulsiflex(奥威斯汀公司(Avestin))进行细胞裂解。将提取物带到50mM Tris-HCl pH 8.0、250mM NaCl、10mM咪唑、10mMβ-巯基乙醇和5％(v/v)甘油中，并在4℃下以8,000g离心45分钟，以去除细胞碎片。将上清液加载到用纯化缓冲液[50mMTris-HCl pH8.0，250mM NaCl，10mM咪唑和5％(v/v)甘油]预平衡的Super Nickel NTA亲和树脂(目录号Super-NiNTA25，蛋白质Ark)上，并且使用逐步咪唑梯度(10、50、100、200、500mM咪唑)洗脱重组蛋白。通过SDS-PAGE凝胶确认重组蛋白的可溶性表达，并通过用Amicon Ultra-15过滤器(默克密理博公司(Merck-Millipore))使用基于其分子量的适当截止值来离心而浓缩所选级分。为了消除污染物，使用柱HiLoad 16/60Superdex 75或200(GE医疗集团(GE Healthcare))在4℃下通过尺寸排阻色谱进行另外的蛋白质纯化步骤。对于不含污染物的样品，根据制造商的方案，通过Sephadex G-25PD10柱(目录号17085101，GE医疗集团)进行缓冲液交换。将所有重组蛋白储存在50mM Tris-HCl pH 8.0、100mM NaCl和2.5％(v/v)甘油中，并且通过使用Nanodrop ND-1000分光光度计(Nanodrop技术公司(Nanodrop Technologies))测量280nm下的吸光度来确定蛋白质浓度。
在本工作中使用的底物包括：
(1)荧光素二己酸酯，(2)三丁酸甘油酯，(3c)pNP-己酸酯；(3e)pNP-癸酸酯；(3f)pNP-十二烷酸酯。
生化表征
通过监测对硝基苯酚的释放，经由对硝基苯酚(p-NP)羧酸酯酶的水解来确定所有酯酶命中的活性。使用Spectramax 190酶标仪(分子装置公司(Molecular Devices))，通过在405nm(εpNP＝17000M-1.cm-1)下的吸光度定量释放的对硝基苯酚的量。除非另有指示，使用96孔板在22℃下在50mM Tris-HCl pH 8.0和0.3％(v/v)Triton X-100中一式三份进行测量，最终测定体积为100μL。通过测量以下p-NP-脂肪酰基酯的水解来研究底物特异性：丁酸酯(C4)、己酸酯(C6，来自TCI化学品公司，H0484)、辛酸酯(C8)、癸酸酯(C10)、十二烷酸酯(C12)、肉豆蔻酸酯(C14)和棕榈酸酯(C16)。使用Michaelis-Menten等式通过数据的非线性回归来获得每种底物的动力学参数：V＝Vmax*[S]/(Km+[S])，其中V是速率，Vmax是通过反应实现的最大速率，S是底物浓度，并且Km是Michaelis-Menten常数。
通过测量在pH 4.0至11.0下在50mM含有0.3％(v/v)Triton X-100的以下缓冲液中的酶活性来评估pH的影响：pH 4.0、pH 5.0和6.0的柠檬酸钠；pH 6.0、7.0、8.0的磷酸盐；pH 7.0、8.0和9.0的Tris-HCl；pH 9.5、10.0、11.0的N-环己基-3-氨基丙磺酸(CAPS)。
热稳定性的测定
在Rotor-Gene 6000实时PCR仪(Corbett)上记录解链温度曲线，其中荧光在470nm下激发，并且在25℃与95℃之间以0.5℃的步长在610nm下测量。样品一式三份制备，并且含有在50mM Tris-HCl pH 8.0、100mM NaCl、2.5％甘油和5x Sypro橙蛋白质凝胶染色剂(赛默飞世尔公司(Thermo Fisher))中的8μM酶。制备样品，得到20μL的最终测定体积，将其用含有100mM Tris-HCl pH 8.0和100mM NaCl的缓冲液调节。在KaleidaGraph(Synergy软件公司)上分析解链曲线，并通过使用等式m1+((m1-m2)/(1+exp((m3-M0)/m4)))来进行拟合。
圆二色性(CD)
用JASCO J-810分光光度计进行CD测量，所述分光光度计装备有Peltier型温度控制器和与恒温浴接合的恒温池支架。为了验证pH在RR11O2和RR11O2 M1_L9del折叠中的影响，将酶在以下缓冲液中稀释：pH 6.0、7.0和8.0的100mM磷酸钠，以及pH 8.8的50mM硼酸盐。编译每个实验的从190至250nm的三次连续扫描，并且平均光谱减去对应缓冲液基线的贡献。分别在浓度为5.2μmol的RR11O2和浓度为5.39μmol的RR11O2 M1_L9del下进行测量。
克隆、表达和纯化IsPET酶
通过Gibson-Assembly-PCR6将IsPET酶基因(GenBank登录号GAP38373.1)插入pCri18-a(Addgene，#61326)质粒中，生成质粒pCri18-a-IsPET酶。用该质粒转化枯草芽孢杆菌(B.subtilis)168。重组蛋白含有C末端6×His标签以用于纯化。使重组枯草芽孢杆菌菌株在37℃下在补充有5μg/mL氯霉素的2YT培养基中生长。通过添加0.5mM IPTG进行诱导后，将培养物在20℃下进一步孵育18小时。将培养物进行离心(13,000xg，10min，4℃)，并且将上清液施加到用含有50mM Tris-HCl、150mM NaCl和50％甘油(pH 8)的缓冲液A平衡的Ni-NTA柱上。用20个柱体积的含有20mM咪唑的缓冲液A洗涤后，将结合的蛋白质用在缓冲液A中的500mM咪唑洗脱。通过Amicon ultra-4离心过滤装置(密理博公司(Millipore)，美国)将洗脱缓冲液中的酶进一步交换到缓冲液A，并且然后在4℃下储存。通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳确认蛋白质纯度的程度，并且通过Nanodrop 2000(赛默飞世尔科技公司，美国)使用Mw 30.2kDa和消光系数ε＝39,400M-1cm-1确定浓度。
实例1：初始预筛选方法
为了以高灵敏度和高通量筛选酯酶活性，我们开发了使用微流体的筛选平台。为了探索宏基因组学提供的多样性，先前生成的DNA宏基因组文库衍生自八种不同来源(海洋污泥、鹅塘、沙土、香草荚、半熟堆肥(medium compost)、嗜热成熟堆肥和牛瘤胃)并由1,250,000个成员构成，将其包封在油包水液滴中，这考虑了从底物和缓冲液筛选中获得的见解以及针对活性酯酶Est30实现的富集。
如图1所示，将汇集的宏基因组DNA转化到大肠杆菌中，并且在λ＝0.35的泊松分布下将细胞连同裂解缓冲液和(1)荧光素二己酸酯底物一起包封到约2pL液滴中(约70.4％的液滴是空的，约24.6％的液滴含有1个细胞并且约4.3％的液滴含有2个细胞)。将生成的液滴在室温下在芯片外孵育，并且在孵育之后，将乳液再注入分选芯片中，并且用荧光激活液滴分选进行长达三天的分选(图2B)。从分选液滴中回收质粒，转化到大肠杆菌BL21中，并将细胞分配在含有三丁酸甘油酯的LB琼脂板上进行二次筛选。选择展示透明晕圈的菌落进行质粒分离和DNA测序，随后在其他的情况下进行基因注释和生物化学表征，以鉴定展示独特特征的候选物。
另外的实验细节如下：
用于液滴包封的宏基因组文库制备。在含有50μg/mL卡那霉素(50倍的文库大小)的Luria Bertani(LB)琼脂板上，将来自被称为“SCV”的宏基因组文库的20ng DNA转化到大肠杆菌10G Elite(目录号60051-2，卢西根公司(Luria))中，产生约5x 107个变体。将板在37℃下孵育过夜，然后移至室温(约22℃)下持续48小时。使用含有50μg/mL卡那霉素的3×3mL液体LB将菌落从板上刮下，在冰上冷却，并且通过以5,000g离心5分钟而洗涤三次，并且重悬于缓冲液(50mM TrisHCl pH8.0、100mM NaCl、50μg/mL卡那霉素以及一片完全无EDTA的蛋白酶抑制剂(罗氏公司(Roche))，最终体积为50mL)中。将洗涤的细胞悬液在具有25％v/v Percoll(西格玛奥德里奇公司)的缓冲液中稀释至OD600nm 0.8。
液滴生成和孵育。在双流动聚焦接合部中生成液滴(图1)。第一水流在OD600nm0.8下含有细胞悬浮液；第二水流由以下构成：20μM的荧光素二己酸酯、0.4x BugBuster(BugBuster 10X蛋白质提取试剂，目录号70921-4，默克密理博公司)以及在含有100mMNaCl和100mM Tris-HCl pH 8.0的缓冲液中的27至33U/μL rLysozyme(目录号71110，默克密理博公司)。对于油相，使用含有1％w/w含氟表面活性剂(fluorosurfactant)-008(RAN生物技术公司)的HFE-7500(3M)。每个水流的流速为50μL/h，并且油相的流速为500μL/h，得到约2pL的液滴体积以及λ＝0.35的预期液滴占用率。将液滴收集到倒置的500μL微量离心管(在顶部和底部通过进入孔插入管而对其进行了改良)中，然后用粘合胶(Scotch-WeldPR1500，3M)密封。将液滴在室温(约22℃)下及在黑暗中在静态条件下孵育长达72小时。
荧光激活液滴分选(FADS)。将液滴由改良的微量离心管以5μL/h注入分选芯片中(图1)并且与100μL/h的含氟油HFE7500间隔开，得到约300Hz的分选频率。将液滴注入速率增加到15μL/h(至2,000Hz的速率)，并且调节油流以产生足够离析，以分选单个液滴。使用具有长通滤光片(593nm，BrightLine Semrock)和高速照相机(Miro eX4，幻影研究公司(Phantom Research))的显微镜(IX73，奥林巴斯公司(Olympus))光源监测芯片。为了测量液滴荧光，将激光束(488nm，30mW，85BCD30Melles-Griot，用ND 1.0衰减)扩大10倍并通过二向色镜(495nm，奥林巴斯公司)聚焦到分选接合部上游的微流体通道上。诱导的荧光通过空气物镜(LUCPlanFLN 40x/0.6，奥林巴斯公司)进行收集，穿过长通滤光片(488nm，RazorEdge Semrock)、二向色镜(555nm，托尔实验室)和最终的带通滤光片(525/28nm，BrightLine Semrock)，之后到达光电倍增管(PM002，托尔实验室)的检测器。将信号馈送到Virtex-5 LX30 FPGA(PCIe-7841R，NI)的模拟输入引脚(anaolog-in pin)。FPGA量化了每个液滴信号的信号阈值处的宽度、半最大值处的宽度、面积和振幅。使液滴数据流向定制LabView程序以可视化和设置分选阈值。如果液滴满足分选标准，则将触发器发送至脉冲发生器，产生具有500μs宽度的5V脉冲(TGP110，Thurlby Thandar仪器公司)。此脉冲控制在外部门控模式下工作的函数发生器(20MHz DDS函数发生器TG 2000，TTi)，在可调振幅(7至9V)下生成10kHz的方波信号，然后用电压放大器(TREK 601c)放大100倍以启动分选仪。通过用盐溶液(5M NaCl)填充通道来制备电极，并通过注射筒(19)连接到放大器。
质粒回收和高效转化。向收集到低结合DNA管(目录号183225J，艾本德公司(Eppendorf))的分选液滴中添加100μL的2ng/μL鲑鱼精子DNA(目录号15632-011，英杰公司(Invitrogen))和100μL的1H,1H,2H,2H-全氟辛醇(97％，目录号B20156.30，阿法埃莎公司(Alfa Aesar))。将管涡旋30秒并且以1,000g离心1min。使用低滞留移液管尖头(maxymumrecovery，爱思进公司(Axygen))将水解酶转移到新的低结合DNA管中，并且相同的程序用100μL的鲑鱼精子溶液和100μL的1H,1H,2H,2H-全氟辛醇再重复两次。根据制造商的方案，使用Zymo Clean and Concentrate-5试剂盒(目录号D4004，酶原研究公司(ZymoResearch))纯化所得300μL回收的DNA溶液。在5分钟的孵育时间后，用12μL超纯蒸馏水(目录号10977-035，英杰公司)洗脱DNA。
用三丁酸甘油酯进行二次筛选。在回收的溶液中，将2μL回收的质粒电转化到大肠杆菌10G Elite(目录号60051-2，卢西根公司)中，并且用1mL的回收培养基(目录号80026-1，卢西根公司)在37℃和450rpm下回收细胞持续1小时。将转化的细胞铺板在含有50μg/mL卡那霉素和1％三丁酸甘油酯(97％，目录号W222305，西格玛奥德里奇公司)的LB琼脂板上，并且将这些板在37℃下孵育一天，随后在室温下孵育。每天在板中检查菌落周围透明晕圈的存在，并选择阳性菌落用Genejet质粒小量制备试剂盒(目录号K0503，赛默飞世尔公司)进行小量制备用于DNA测序。
结果：已经从序列空间的不同区域发现了新酯酶
总共进行两次筛选活动并且筛选约3060万个液滴，分别地在活动I中两天筛选1570万个液滴，并且在活动II中三天筛选14.9个液滴。考虑到所应用的λ＝0.35的泊松分布，28.9％的液滴含有1或2个细胞，因此约880万个液滴将含有宏基因组质粒。在这两个筛选活动中，宏基因组文库被七倍覆盖，允许鉴定在活动I中展示透明晕圈的34个菌落。活动I示于图3中。
对来自活动I的候选物的DNA测序分析显示27个候选物被鉴定为潜在的阳性命中，归因于低质量读数，有4个候选物不能被测序出来，2个候选物是没有插入物的载体，并且1个候选物显示为假阳性。关于活动II，尽管18个候选物被鉴定为潜在的阳性命中，但仅一个被确认为新命中(RR11)，因为先前在活动I中鉴定出了其他候选物。测试了潜在阳性候选物对荧光素二己酸酯的活性，并且用酶标仪随时间监测反应。如所示的，与阴性对照P35相比，候选物展示出更高的活性，P35的活性被示为灰色条，并且灰色虚线代表此阴性对照与鉴定的宏基因组命中的比较。
为了获得来自每个宏基因组命中的eDNA插入物的全长重叠群，应用引物步移策略，并且以以下方式设计引物：在长达四轮DNA测序之后，获得每个宏基因组插入物的全长序列。全长重叠群的分析显示，在28个潜在命中(来自活动I的27个候选物和来自活动II的1个候选物)中，10个命中在活动I中是独特的，并且1个在活动II中是独特的，从而给出11个独特的宏基因组衍生命中的总和。
对候选物N20的重叠群分析允许鉴定ORF n20o1，其寻址到功能未知蛋白的家族DUF3089(Pfam代码PF11288)，即在Pfam数据库上具有630个成员的小家族。
来自所鉴定的11个独特宏基因组命中的13个ORF被分配到酯酶/脂肪酶功能。这13个ORF针对NCBI(宏基因组蛋白，env_nr)和UniprotKB数据库的序列比较显示，分别有69％和30.7％的ORF与之共享低于或高于50％的序列相似性。在ORF中具有最低序列同一性的是rr11o2，其显示与来自碳氢化合物宏基因组(NCBI登录代码KUG22667.1)的假定蛋白有38％序列相似性，并且与来自颤杆菌克属物种(Oribacterium sp.)(UniprotKB登录号A0A1H3Y0C3)的未表征蛋白有64％序列相似性。
13个ORF与Pfam和ESTHER数据库的比较显示，可以分别地根据Pfam来分配8个家族且根据ESTHER来分配9个家族。这显示，在筛选过程中可以探索不同的家族。此外，根据目前提出的脂解酶分类，本筛选平台允许通向6个不同家族(II、III、V、VII、X、XIX)。4个候选物不能精确地寻址到任何家族。
为了寻址宏基因组命中的活性，将每个ORF单独克隆到表达载体中，并针对具有不同链长的p-NP酰基酯测试对应的重组蛋白。如所预期的，对于具有中等链长的酯(例如丁酸酯、己酸酯和辛酸酯)观察到最高的催化效率，这与在液滴筛选期间用(1)施加的链长一致。对pH进行了相似的观察，pH 8.0是关于所有候选物观察到的最佳pH。另外，还研究了解链温度，显示出所有测试的宏基因组命中的嗜常温曲线。结果示于图4中。
还使用一系列底物(其中对硝基苯酚作为离去基团)，研究了宏基因组命中的催化混杂性，如下所述：
表4.
如所预期的，所有候选物都显示出对具有短链长度的p-NP酯的活性并且还显示出对具有长链长度的p-NP酯的活性。此外，几乎所有候选物都显示出硫酯酶活性。
针对所选择的酶描述了对表4中化合物的活性：
表5a
表5b
实例2：探索含有RR1102和N2001的新酶簇周围的序列空间揭示了另外的酶簇
针对每个氏族的最大家族，从Pfam(Pfam 32.0，https://pfam.xfam.org/，2019年4月)下载全长fasta序列。为了减少网络中的序列(节点)数，使用cd-命中和psi-cd-命中将各个家族逐步聚类至90％、60％和30％序列同一性。将每个簇的代表性序列与酯酶命中序列组合到单个数据库中，将其用于多对多(all-versus-all)比对(蛋白质-蛋白质BLAST2.6.0+)。输出文件中的每一条线定义了连接所述网络的两个节点(代表性序列)的边缘(比对)。使用定制python脚本去除重复边缘、自环和高于某个e值的边缘。然后将简化的网络导入CytoScape 3.7.1进行可视化。
参加图5。酶CI5En2被鉴定为已知PET酶与新鉴定的RR1102之间的簇的一部分。
使用正向5’-GAAAACCTGTACTTCCAGGGTATGGCGGATTATGCGAAAG-3’和反向5’-TGACACTATAGAATACTCAAGCTTACACCACAAAACGGCTAAATTC-3’引物，通过PCR用Phusion高保真DNA聚合酶(赛默飞世尔科技公司，F530L)扩增cl5en2基因。经由slic克隆将扩增的片段克隆到先前用BsaI和HindIII消化的pExp载体系列中。通过DNA测序确认克隆，并使用对应的质粒进行大肠杆菌BL21(DE3)的转化。使转化的细胞在含有100μg mL-1氨苄西林的5mL LB培养基中在37℃下生长16小时，并且使用获得的培养物来接种250或500mL LB(100μg mL-1氨苄西林)。使细胞在37℃下生长直到OD600 nm达到0.5-0.6，并且通过在20℃下添加400μM IPTG来诱导蛋白质表达持续20小时。表达后，通过离心(4000xg，持续20分钟，在10℃下)来收获细胞，并将其重悬于Tris-HCl(35mL，50mM，pH 8.0)中。在Emulsiflex(奥威斯汀公司)中进行细胞裂解。将提取物带到50mM Tris-HCl pH 8.0、250mM NaCl、10mM咪唑、10mMβ-巯基乙醇和5％(v/v)甘油中，并在4℃下以8,000xg离心45分钟，以去除细胞碎片。将上清液加载到3mL的用纯化缓冲液[50mM Tris-HCl pH 8.0，250mM NaCl，10mM咪唑和5％(v/v)甘油]预平衡的Ni-NTA树脂(凯杰公司(Qiagen))上，并且使用逐步咪唑梯度洗脱重组蛋白。通过SDS-PAGE凝胶分析重组蛋白的可溶性表达，并通过用Amicon Ultra-15过滤器(默克密理博公司)使用基于其分子量的适当截止值来离心而合并和浓缩来自柱纯化的所选洗脱级分。为了消除可能的污染物，使用柱HiLoad 16/60Superdex 75或200(GE医疗集团)在4℃下通过尺寸排阻色谱进行另外的蛋白质纯化步骤。对于不含明显污染物的样品，遵循制造商的方案，使用Sephadex G-25PD10柱(安玛西亚生物科学公司(Amersham Biosciences))进行缓冲液交换。将所有重组蛋白储存在50mM Tris-HCl pH 8.0、100mM NaCl和2.5％(v/v)甘油中，并且通过使用Nanodrop ND-1000分光光度计(Nanodrop技术公司)测量280nm下的吸光度来确定经纯化的蛋白质的浓度。
结果：
CL5En2在30℃下表现出与IsPET酶相当并且高于LCC的活性。Cl5En2还显示出对具有不同结晶度的PET纳米粒子的活性。
实例3：塑料纳米粒子的制造
用上述实例1的筛选方法鉴定出了假阳性，是因为一些鉴定的酯酶尽管具有酯酶活性但对塑料没有高活性。因此，诸位发明人开发了一种高通量方法，其可以更选择性地挑选出具有塑性降解活性的酯酶并且还可以用于经由定向进化来选择优化的突变酶。
所述方法使用如下制备的塑料纳米粒子：
将50mg冷冻研磨的结晶PET颗粒或无定形PET膜(产品代码ES303015，古德费洛公司(Goodfellow GmbH)，伦敦，英国)溶解在1,1,3,3,3,-六氟-2-丙醇(5mL)中持续至少一小时。将此溶液滴加(1mL/min)到双蒸H2O(50mL，在冰浴中冷却)中，直到观察到聚集粒子在水表面上积聚。同时，将水使用Ultra 搅拌器(IKA公司，德国)以8000rpm剧烈搅拌。然后使用Whatman滤纸(8μm直径)过滤悬液。之后，蒸发剩余的溶剂。
使用以下的分析方法来表征合成的纳米粒子：
(i)通过在Zetasizer NanoZS(马尔文公司(Malvern)，英国)上进行动态光散射来测量流体动力学直径以评估粒度分布。
(ii)为了直接测量纳米粒子尺寸，使用颗粒尺寸、尺寸分布和形态透射电子显微术(TEM)。
(ii)用差示扫描量热法(DSC)(1.5.)确定结晶度。
(iii)通过称量从4mL的塑料纳米粒子悬液等分试样获得的沉淀物来确定最终悬液的粒子浓度，所述沉淀物是通过离心并在95℃下干燥至少1小时而生成的。
为了生成更高浓度的纳米粒子溶液，将悬液在37℃下在开口管中孵育直至达到所需的密度。
为了稳定液滴中的PET，使用浓度为0.1％-0.5％的Tween-80。即使存在缓冲液和酶或细胞裂解产物，还是提供了稳定的粒子。
已由尼龙形成了另外的塑料纳米粒子。这些是如下制备的：将50mg尼龙6或尼龙66溶解在1,1,3,3,3,-六氟-2-丙醇(5mL)中持续至少一小时。将此溶液滴加(1mL/min)到补充有0.05％或0.1％ SDS的双蒸H2O(50mL，在冰浴中冷却)中，直到观察到聚集粒子在水表面上积聚。同时，将水使用Ultra 搅拌器(IKA公司，德国)以8000rpm剧烈搅拌。然后使用Whatman滤纸(8μm直径)过滤悬液。之后，蒸发剩余的溶剂。
结果：
结果示于图15中。当使用纳米粒子时，在微流体液滴中没有观察到沉降，甚至在几周后进行的液滴测量中也是如此。发现Tween-80是可用的稳定剂(防止液滴中纳米粒子和生物分子之间的聚集)。
尼龙纳米粒子示于图18中。
实例4：用于使用对来自塑料纳米粒子的光散射的检测来选择和/或优化PET酶活性的方法
易错PCR文库的生成
使用GeneMorph II随机诱变试剂盒(安捷伦公司(Agilent)，目录N 200550)生成Cl5En2的两个ep-PCR文库，分别命名为文库1和2，用于第一轮定向进化。遵循制造商的说明，通过易错PCR对cl5en2基因进行扩增和随机突变。ePCR反应混合物由以下组成：正向5’GGTACCGAAAACCTGTACTTCCAG 3’引物和反向5’CTGGGATTTAGGTGACACTATAGAATACTC 3’引物(各0.5μM)、dNTP(各0.2mM)、mutzyme IIDNA聚合酶(1μL，2.5U/μl)、5μL 10×Mutazyme II反应缓冲液、以及3.5μg和699ng的DNA模板(分别用于第一和第二文库)。通过使用PCR程序[60s95℃，25x(30s 95℃，30s 59℃，60s 72℃)，600s 72℃，最终保持在4℃]进行扩增。将所得PCR产物使用Clean&Concentrator试剂盒-5(酶原公司(Zymogen)，目录号D4003)纯化，经由Nanodrop定量，并且然后经由如前所述的slic克隆在BamHI和HindIII位点处连接到pExp-bla载体中。使用Clean&Concentrator试剂盒-5再次纯化连接产物，将获得的纯化产物转化到电感受态大肠杆菌10G Elite细胞(卢西根公司)中。经由DNA测序确认克隆并计算突变频率。将来自每个ep-PCR文库的50ng转化到大肠杆菌中产生了187和119个变体，分别用于在LB琼脂板(含有100mg/mL氨苄西林)上进行文库1和文库2的10-3系列稀释，分别覆盖文库1和文库2的文库大小的89和93.25倍。
用于液滴包封的细菌悬浮液的制备
使转化的细菌在37℃下生长过夜，然后在室温下孵育1天。随后将菌落从琼脂板上刮下，并且遵循制造商的说明，使用DNA提取试剂盒(GeneJet质粒迷你试剂盒)分离质粒。将30ng提取的质粒DNA转化到大肠杆菌BL21(DE3)细胞中并铺板在LB琼脂(含有100mg/mL氨苄西林)上，然后在37℃下孵育过夜并在室温下孵育1天。使用含有100mg/mL氨苄西林的LB培养基将菌落轻轻地从板上刮下，并且将获得的培养物在37℃下孵育三小时，用IPTG诱导以得到0.4μM的终浓度并在20℃下孵育过夜。将培养物在4000xg下离心6分钟并用缓冲液(100mM Tris-HCl，100mM NaCl缓冲液，pH 8)洗涤3次。通过稀释调节细胞密度，以在区室化后获得所需的细胞/液滴比率。假设细菌包封为泊松分布(Huebner Chem Commun[胡埃布纳化学通讯]2007)，对于150pL液滴，细胞密度OD600nm 0.01应导致20％液滴具有单个细胞。
油包水皮升液滴的生成
使用80μm深且50μm宽的流动聚焦装置生成油包水液滴(体积150pL)，所述流动聚焦装置具有带三个入口的25μm喷嘴。两个入口运送在GF缓冲液(50mM Tris-HCl，100mMNaCl，2.5％甘油，pH 8.0)中制备的水溶液。从这些入口进来的液流供应(i)细胞悬液(OD600nm取决于细胞占用率)以及(ii)细胞裂解试剂BugBuster(0.2％v/v，瓦根公司(Novagen))、Tween-80(0.2％v/v，默克公司(Merck))、rlysozyme(96U/mL；默克公司)和塑料纳米粒子(约1mg/mL)的混合物。通过第三入口注入含有008-含氟表面活性剂(2％，w/w，RAN生物技术公司，美国)的氟化油HFE-7500(3M)。使用气密注射筒(汉密尔顿公司(Hamilton)；0.5、1或2.5ml)分别以4、4和32μl min-1的速率用neMesys注射泵(科托尼公司(Cetoni)，德国)注入水溶液和油相。将液滴收集在由倒置的0.5mL艾本德管制成的储存舱中。
液滴分选和电子器件
基于先前使用的荧光激活液滴分选仪的系统，使用定制的散射激活液滴分选仪(SADS)根据散射光的强度对液滴进行分选。取决于长期孵育后乳液的质量，将液滴以1-4μLmin-1注入分选芯片中，并与20-50μL min-1的油(在HFE7500中的2％w/w 008-含氟表面活性剂)间隔开。结果，以100-350Hz的频率分选液滴。重要的是注意到，空间油(spacing oil)和乳液中油的化学组成应该是相同的，否则信号的水平可能随着乳液的各式填装而波动。我们假设油中存在的表面活性剂胶束有助于散射光的水平，因此在分选过程中保持表面活性剂浓度稳定是有用的。通过提供λ＝488nm的入射光(容错公司激光器，488nm，25mW，沃特兰(Vortran)，美国)并且使用光电倍增管(PMT，PM002，托尔实验室)检测相同波长(nm)的散射光，来测量散射光的强度。使用现场可编程门阵列(FPGA，PCIe-7841R，美国国家仪器公司(National Instruments))进行分选，其中使用定制LabVIEW软件监测并记录信号。在倒置显微镜(IX73，奥林巴斯公司)上监测整个过程。
DNA回收
将分选液滴收集到1.5mL低DNA滞留反应管(DNA LoBind，艾本德公司)中，并通过添加100μL 1H,1H,2H,2H-全氟辛醇(97％，阿法埃莎公司)进行去乳化。将100μL的2ng/μL鲑鱼精子DNA溶液(目录号15632-011，英杰公司)添加到所收集的液滴中。将管短暂涡旋并在1,000xg下离心1min。将水层转移到新的反应管中，并重复萃取两次。遵循制造商的说明，使用Clean&Concentrator试剂盒-5(酶原公司)将水相浓缩。用12μL去离子水进行洗脱。使用pExp-F/R(for:)引物对，使用5μL水相进行PCR扩增[30s 98℃，25x(10s 98℃，30s 55℃，30s 72℃)，300s 72℃，最终保持在4℃]。将PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行纯化，并通过使用Clean&Concentrator试剂盒-5进行回收。通过SLIC技术将分离的DNA亚克隆到pExp-bla质粒中，并通过Clean&Concentrator试剂盒-5再次纯化连接产物。将纯化的产物转化到电感受态大肠杆菌10G细胞中。
二次筛选
细胞裂解
挑取转化到大肠杆菌菌株BL21(DE3)中的Cl5En2变体的各个菌落，并接种在96深孔板中，所述板含有1mL具有100μg mL-1氨苄西林的LB培养基。使细胞在37℃、200rpm下生长3小时，并且然后添加400μM的IPTG以提供蛋白质表达，使之在20℃、200rpm下进行20小时。表达后，通过在10℃下以4000xg离心45分钟来收获细胞，并丢弃上清液。向细胞中添加100μL的裂解缓冲液[(100mM Tris-HCl pH 8.0，100mM NaCl，1x BugBuster和裂解酶(默克密理博公司，目录号71230-4)]，并且将板涡旋直到细胞完全重悬，然后在37℃下孵育30分钟，以更好地提供细胞裂解。
通过水解p-NP酰基酯进行验证
我们还通过测量p-NP酰基酯水解后对硝基苯酚的形成来验证Cl5En2变体的动力学参数。测量无酶空白往后的反应以减去自水解，并且通过M3酶标仪(分子装置公司)中的分光光度法定量在405nm(εpNP＝18.300M-1.cm-1)下监测释放的对硝基苯酚。我们使用p-NP酰基十二烷酸酯(C12)和p-NP酰基十二烷酸酯(C16)作为底物，并且通过使用10μL的细胞裂解产物和90μL的p-NP酰基酯(1.11mM)进行反应。所有测定均在96孔微板(赛默飞世尔公司，目录号260836)中在含有50mM Tris-HCl pH 8.0和0.3％triton X-100(v/v)的缓冲液(最终体积为100μL)中在22℃下进行。
使用PET NP进行命中的验证
通过监测微量滴定板中600nm下悬液的浊度变化来分析使用细胞裂解产物对PETNP的酶水解。在每个孔中，将由冷冻研磨的粉末制成的0.29mg/mL PET纳米粒子用0.5％Tween-80和10μL如上所述制备的细胞裂解产物进行孵育。所述测定在含有50mM Tris-HCl、100mM NaCl和2.5％甘油(pH 8.0)的缓冲液(最终体积为100μL)中在室温下进行。在几天的孵育期内监测浊度的变化。
生化表征
为了计算Cl5En2野生型、Cl5En2变体和IsPET酶的热稳定性，将2M的纯化酶与Sypro橙蛋白质凝胶染色剂(英杰公司，目录号S6650)混合。在50mM Tris-HCl pH8.0中进行所述测定，并且在CFX Connect实时PCR检测系统(伯乐公司(Bio-Rad))中通过将温度从25℃增加至95℃(0.5℃/30s)来监测酶的变性。测量SYPRO橙的荧光(λ激发＝410nm，λ发射＝610nm)，使用KaleidaGraph 4.1.3(Synergy公司)计算解链温度(Tm)。将解链温度定义为一半酶变性的温度，并计算为每个温度-荧光曲线的一阶导数。
结果：
结果显示于图9中。
其中＝表示沉默突变。
实例5：由实例1鉴定的酶：RR1102
在本工作中在此鉴定的宏基因组命中是RR11O2。尽管RR1102在功能测定中被鉴定为酯酶，但它与其他已知的酯酶具有极低序列保守性。与来自碳氢化合物宏基因组(NCBI登录号KUG22667.1)的假定蛋白最接近的序列相似性是38％。
RR11O2的核酸序列和氨基酸序列。将RR11O2克隆到pHAT和pHAT3载体中进行表达，此处代表了RR11O2 pHAT的完整构建物。突出显示了pHAT的核酸序列和氨基酸序列(前13个氨基酸为灰色)以及RR11O2的核酸，根据其密码子使用(红色)针对大肠杆菌对其进行了优化。还突出显示了RR11O2的催化三联体(S149、D311和H308)。
针对不同的p-NP酰基酯[乙酸酯(C2)、丁酸酯(C4)、己酸酯(C6)、辛酸酯(C8)、癸酸酯(C10)、十二烷酸酯(C12)和肉豆蔻酸酯(C14)]测试纯化的RR11O2、Bla-Cl5En2和IsPET酶的酶活性。反应中酶的最终酶浓度取决于用作底物的p-NP酰基酯。分别地在31.25μM至23.2μM之间的酶浓度的RR11O2、2.5nM至50nM之间的酶浓度的Bla-Cl5En2以及50nM至4.8μM之间的酶浓度的IsPET酶下测量动力学。以0与4mM之间的浓度范围使用p-NP酰基酯底物。使用Kaleidagraph，通过初始速率与Michaelis–Menten等式的非线性最小二乘拟合来计算动力学参数Vmax和KM。根据等式kcat＝Vmax/[E]，从初始稳态速度计算催化速率常数kcat(mM-1)，并且所有酶测定均在含有50mM Tris-HCl pH 8.0和0.3％ Triton-X 100的缓冲液中(最终体积为100μL)在22℃下进行。通过以20秒间隔取时间点，在M3酶标仪(分子装置公司)中在405nm(εpNP＝18.300M-1.cm-1)下用分光光度法监测释放的对硝基苯酚。
结果：
结果示于图8中。
RR1102还表现出对PET的混杂活性。
实例7：酶的酶表征
为了检测在各种酶存在下TPA、MHET和BHET的释放，从反应混合物中取出等分试样，通过添加等体积的含有0.5％甲酸的甲醇来终止周转，进行离心(16,100xg，15分钟)并通过HPLC(1260Infinity II，安捷伦公司；Nucleodur C18分析型EC标准柱(5μm，4x 125mm，马歇雷-纳高公司(Macherey-Nagel)，德国)进行分析。使用缓冲液A(在蒸馏水中的0.1％甲酸)和缓冲液C(蒸馏水)以及缓冲液D(乙腈)的混合物作为流动相，流速为1mL/min。在整个运行中，缓冲液A保持在20％。5分钟后流动相从72％ C和8％ D逐渐变为50％ C和30％ D直至13分钟，然后变为30％ C和50％ D直至17分钟，之后在18分钟时变为10％ C和70％ D。保持后一条件直至25分钟，且变回72％ C和8％ D的起始条件直至30分钟，以起始另一次运行(参见以下图表)。通过与可信样品比较，在250nm下检测TPA、MHET和BHET，并通过与校准曲线比较进行定量。
扫描电子显微术(SEM)分析PET膜形态
使用SE检测器，用Tescan MIRA3 FEG-SEM(布尔诺，捷克共和国)观察到关于经处理的PET膜的表面结构变化的SEM。工作电压和距离分别为5kV和6mm。用在100mM Tris-HCl和100mM NaCl缓冲液(pH 8.0)中的18μM酶孵育长达一个月后，将PET样品用1％ SDS溶液、去离子水、乙醇洗涤并风干。使用溅射涂覆有10nm铂的碳带将PET样品安装在铝短轴上。通过SEM以所希望的放大率记录PET膜的电子显微照片。
PCL膜和PET膜的重量损失
将PCL膜(大约24mg)和PET膜(大约15mg)用在500μL 100mM Tris-HCl、100mM NaCl缓冲液(pH 8.0)中的1或2μM酶进行孵育。在37℃和300rpm下进行长达一周的水解。还通过使用不存在酶的仅缓冲溶液进行对照。处理后，将PCL膜用去离子水彻底洗涤三次，干燥直至获得恒重。分别通过测量PCL膜和PET膜的重量损失来评估塑料降解活性。通过以下等式(1)计算塑料膜的重量损失(％)：
重量损失(％)＝100×(W_(降解前的膜)-W_(降解后的膜))/W_(降解前的膜)，其中W是PCL膜或PET膜的重量。
PET纳米粒子和膜的酶测定
将无定形或结晶PET纳米粒子(大约0.3mg的干燥粉末)或自制结晶PET膜(大约10-20mg)用在Tris-HCl和100mM NaCl缓冲液(pH 8)中的6μM纯化的和TEV裂解的蛋白质在37℃下进行孵育。通过添加等体积的含有0.5％甲酸的甲醇，在不同时间点(无定形粒子为t0、t2h和t12h且结晶粒子为t0、t1d和t3d)终止反应。通过HPLC来分析由离心(16,100×g，15min)获得的上清液。
微板和微液滴中聚酯纳米粒子的酶水解
通过监测聚酯纳米粒子悬液在600nm下的浊度变化来分析聚酯的酶水解。在微量滴定板(Nunc，赛默飞世尔公司，美国)中，在每个孔中用由冷冻研磨的粉末制备的0.23mg/mL的PCL纳米粒子和0.29mg/mL的PET纳米粒子在室温下进行酶水解。在几天的孵育期内监测浊度的变化。
我们还使用微液滴和散射光测量来测试纯酶的活性。在包封之前，通过将纳米粒子与酶溶液混合来制备样品。在缓冲液(50mM Tris-HCl，100mM NaCl，2.5％甘油，pH 8)中使用0.1％-0.5％(v/v)Tween-80来稳定0.5至2mg/mL的所希望密度范围的塑料纳米粒子，之后添加纯化的和TEV裂解的酶(500nM至2μM)。之后，将溶液分成两个相等体积，使用两个水性入口将其注入液滴生成芯片中。流速与生成具有单个细胞的液滴的流速相同。
结果
结果示于图5C中。
实例8：RR1102的结构表征
然而，所述酶清楚地显示出酯酶活性，因此从晶体结构理解在序列不保守的情况下功能如何保守是重要的。
最初，设计RR11O2的截短构建物，以便具有不同的长度和N末端柔性用于蛋白质结晶。
在Diamond光源(Diamond lightsource)的光束线IO3上收集数据，并且使用来自具有仪表盘的Diamond自动数据处理流水线的数据进行结构确定。使用来自CCP4包的软件和Phenix进行结构确定和修正。数据收集和修正统计示于表6中。已将坐标以登录号PDB6ZZV保藏于蛋白质数据库(PDB)。
设计了四种截短的构建物(M1_L9del、M1_N16del、M1_F27del和M1_Y33del)。B-克隆到pHAT3中的全长RR11O2和克隆到pHAT中的四种截短的构建物(M1_L9del、M1_N16del、M1_F27del和M1_Y33del)的溶解度测试的SDS-PAGE。使所有构建物在37℃下生长并且在20℃或37℃下用0.4mM IPTG诱导。缩写是指M：蛋白梯(赛默飞世尔科技公司，目录号26619)，T0：无诱导，TON：诱导过夜后，S：可溶性级分，I：不溶性级分。C-在以下中Δ10D的解链温度：100mM柠檬酸盐pH 4.0，200mM NaCl和10％甘油(-)；100mM Tris pH 8.0和100mM NaCl(x)；和100mM hepes pH 7.0和100mM甲酸钠(·)。D-在18℃下孵育8天和21天后在JCSG孔F2[0.1M柠檬酸钠pH 5.0，3.2M(NH4)2SO4]条件下M1_L9del的结晶，缩写：明视野(BF)和紫外光(UV)。将获得的晶体(D的上部)提交到所述光束线并且进一步处理在(D的下部)的衍射图案。
表6.
使用GOLD软件包(CCDC)，使用保藏在PDB(PDB代码6ZZV)中的结构作为靶标，进行底物与RR1102的预测结合模式的建模。使用Grade网络服务器生成底物结构。目的位点被定义为Ser149周围的球形。用grade(环球菲兹公司(Global Phasing))生成配体文件。对p-NP己酸酯(C6)的初始研究指示，为了与所产生物的生产性结合模式，芳族环将必须结合在口袋A中(生产性结合模式＝酯结合在Ser149的内)。因此，引入药效团约束以将底物的芳族环放置在口袋A中，以便研究生产性结合模式。
结果
RR1102的结构示于图7、8a和11-14中。原子坐标列于图16中。
在的高分辨率下用空间群P1 21 1和晶胞中的两个分子确定RR11O2的晶体结构。RR11O2的结构展示了具有由S149、D311和H308构成的催化三联体的α/β折叠(图6B)，其被内腔包围，口袋体积＝275.101体积SA(图11)，靠近两个柔性环(图14)，这似乎与RR11O2对长度不同的p-NP酯展示的催化效率相关联。对RR11O2的表面分析显示了为底物提供了通向活性位点的通路的大中空部以及位于中空部底部的催化三联体(图11A和14C)。
为了研究与其他α/β水解酶的结构相似性程度，使用Dali服务器进行结构比对。尽管RR1102与α/β家族的其他成员具有非常低的序列相似性，但有可能观察到RR1102中的经典α/β折叠以及α/β水解酶的其他保守特征(图12)。
虽然RR1102的外环中存在显著差异，但是RR1102的核心与RR1102的β-片层与展示传统的α/β水解酶折叠的蛋白质(PDB代码4VFO)的β-片层之间以的RMSD重叠。简言之，RR1102的β-链形成与α/β水解酶折叠的中心β-片层对齐的较小的β-片层(图12)。与α/β水解酶折叠一样，RR11O2的中心β-片层被许多α-螺旋包围，但是只有9个β-链中的5个和9个α-螺旋中的4个是RR11O2和其他水解酶共有的。
由于核心结构的关键部分的保守性，催化三联体中残基的定位在RR1102和α/β水解酶折叠之间是保守的(图13)。催化性丝氨酸(Ser149)和碱性His308与在DALI比对中鉴定的展示α/β折叠的水解酶的催化三联体对齐。实际上，来自RR1102的Ser149和His308与来自DALI服务器的前20个命中的等同残基之间的平均RMSD是RR1102的Ser149在保守基序GXSXG中。催化三联体的第三组分通常是酸(例如PDB代码1UFO中的Asp183)。然而，RR1102与来自DALI比对的结构的催化三联体的比较显示，尽管在正确位置存在保守的酸性残基(Glu212)，但该残基没有被正确定向。很可能该残基可以旋转以参与催化机制。然而，为了做到这一点，它必须打破其与Arg278的相互作用。
对催化性丝氨酸和结合位点的鉴定允许RR1102水解酯的令人感兴趣的选择性曲线得以合理化。结合口袋由催化三联体的任一侧上的2个不同口袋(A和B)组成。首先，存在被覆盖的疏水口袋(口袋A)，被保守的疏水夹W108终止。在这里呈现的结构中，口袋A被1个甘油分子占用。这指示该位点很可能将结合小分子。第二口袋(口袋B)是深但开口的口袋。这由柔性环终止。口袋A的口可以被认为太狭窄而不允许小分子进入。然而，对来自所述结构(PDB代码6ZZV)的归一化B因子的审查指示覆盖口袋A的环极具柔性。因此，可能有大量送气，这将允许打开口袋A，使得配体可以进入。
为了更好地理解这些底物如何结合以及RR1102的选择性如何发生，进行建模研究以允许分析结合模式。使用GOLD将图8b中测试的线性酯对接到RR1102的结合位点。从这些结果中选取被判断为在反应机制中具有生产性的结合姿态。这些生产性结合模式被定义为如下的结合模式，借此底物的羰基碳被预测为接近Ser149(在内)，并且相对于亲核Ser149的取向使得它将允许对底物羰基进行的亲核攻击。对于较短的底物，GOLD可以生成许多生产性结合模式，其中对硝基苯酚基团位于口袋A或口袋B中。然而，对于较长的底物(例如p-NP己酸酯，C6)，为了生成生产性结合模式，对硝基苯酚必须结合在口袋A中。由于所有底物的结合模式可能相似，因此决定正确的结合模式是对硝基苯酚结合在口袋A中的模式(参见图8A)。所生成的选择性数据显示对在烷氧基链中含有2至8个碳的底物的高水平水解。其中，对于具有比八个碳更长的链的对硝基苯酚酯，活性显著下降。对预测的结合模式的分析指示，烷氧基链长度长于八个碳的酯到达由PRANK鉴定的口袋之外。
实例9：C15En2-A9S的结构表征
Cl5En2的结晶
向纯化的重组蛋白pExp-bla Cl5En2-A9S(9.3mg蛋白)中添加600单位的TEV蛋白酶(西格玛奥德里奇公司，目录号T4455-1KU)，以裂解β-内酰胺酶融合标签。在4℃下进行16小时裂解并且经由SDS-Page凝胶确认裂解，其中经由镍纯化去除融合标签。
纯化后，提交在含有100mM hepes pH 7.0、100mM甲酸钠的缓冲液中最终浓度为6.7mg/mL的裂解的且纯的Cl5En2-A9S蛋白进行初始结晶试验，通过使用以下商业试剂盒：JCSG套件(凯杰公司，希尔登，德国)、Wizard I和II(埃默拉德生物系统公司(EmeraldBioSystems)，班布里奇岛，华盛顿，美国)和Classics(耶拿生物科学公司(JenaBioscience)，德国)。第一晶体是在0.8M琥珀酸二钠(商业试剂盒JCSG，孔F7)中获得的，并且通过改变盐和蛋白质浓度来进一步优化它们。
我们还在PCL纳米粒子存在下共结晶Cl5En2-A9S。为此，使用1μL:1μL和1μL:0.5μL比率的蛋白质和母液，通过蒸汽扩散技术手工制备各板。将所有结晶板在18℃下孵育。
Apo-Cl5En2-A9S的数据收集和结构测定
将晶体提交到来自英国牛津郡的Diamond光源(Diamond Light Source)的光束线I03处进行衍射，并且使用Pilatus 6M检测器记录图像。使用XDS索引并整合Apo形式Cl5En2-A9S以及与PCL共结晶的数据集(KABSCH，2010)。在CCP4包中使用Phaser程序通过分子置换来解析所有结构。将与Cl5En2共享36.39％氨基酸序列同一性的褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)角质酶(PDB代码5ZOA)的结构坐标用作模型。使用COOT手动进行结构的修正，并且然后使用程序REFMAC5进行刚体修正和限制性修正循环。根据拉式(Ramachandran)图评估蛋白质验证参数。用Pymol进行对结构和图的分析。由数据收集和修正得到的所有统计数据示于下表中：
在下表中提供了CI5En2与PCL和BHET的复合结构的数据：
PDB保藏
Apo-Cl5En2-A9S、PCL-Cl5En2-A9S和BHET-Cl5En2-A9S的结构已经被保藏在PDB上，并且可以分别使用PDB代码7NCQ、7ZJA和7ZJ9登录。
结果：
CI5En2-A9S的结构示于图10中。原子坐标列于图17中。
得出本申请的项目已从欧洲研究理事会(ERC)根据第695669号和第685474号拨款协议在欧盟地平线2020研究和创新程序(European Union’s Horizon 2020research andinnovation programme)下获得资金。
实例10：木质素纳米粒子的制造
遵循如先前针对PET所描述的沉淀和溶剂蒸发技术制备木质素纳米粒子1。简言之，将250mg木质素粉末溶解在1,1,3,3,3,-六氟-2-丙醇(5mL)中持续至少一小时。将此溶液滴加(1mL/min)到双蒸H2O(50mL，在冰浴中冷却)中，直到观察到聚集粒子在水表面上积聚。同时，将水使用Ultra 搅拌器(IKA公司，德国)以8000rpm剧烈搅拌。然后使用Whatman滤纸(8μm直径)过滤悬液。之后，蒸发剩余的溶剂。不需要表面活性剂来防止沉降。
结果：结果示于图20中。A)通过在Zetasizer NanoZS(马尔文公司，英国)上进行动态光散射来测量流体动力学直径以评估粒度分布。DLS测量表明木质素纳米粒子在138nm附近的窄尺寸分布以及单分散性(PdI：0.3)。B)当使用纳米粒子时，在微流体液滴中没有观察到沉降，甚至在几天后进行的液滴测量中也是如此。不需要表面活性剂来获得稳定。
实例11：用于尼龙解聚的新酶
将序列空间探索用于新的尼龙酶的初始发现。从MGnify数据库中提取NylC的同源物(NCBI登录代码：Q1EPR5.2)，并用于生成由1583个节点和69291个边缘序列构成的序列网络。鉴定MGYP000645618208的第一连接(在列出的代码下从MGnify检索出来的序列)，并且将序列空间划分成簇(从1到3)。从每个簇中选择潜在的尼龙酶候选物，包括：Nyl5(MGnify代码：MGYP000544655629，来自簇1)和Nyl9(MGnify代码：MGYP000403660814，来自簇3)。
尼龙纳米粒子的酶测定
将尼龙纳米粒子(大约0.3mg的干燥粉末)用在Tris-HCl和100mM NaCl缓冲液(pH8)中的10μM纯化的和TEV裂解的蛋白质在37℃下进行孵育。通过热变性在不同时间点(t0、t3d和t7d)终止反应。将由离心(16,100×g，10min)获得的上清液通过HPLC(1260InfinityII，安捷伦公司；Nucleodur C18分析型EC标准柱(5μm，4x 125mm，马歇雷-纳高公司，德国))进行分析，以检测单体6-氨基己酸(Ahx)。使用流速为1mL/min的缓冲液A(蒸馏水)和缓冲液B(乙腈)作为流动相。在开始时，缓冲液A保持在100％。5分钟后，流动相逐渐变为100％ B直至10分钟，然后回到100％ A直至15分钟。通过与可信样品比较，在220nm下检测Ahx，并通过与校准曲线比较进行定量。
结果：结果示于图21-28中。
发现了以下新尼龙酶：
图24显示了在PA6纳米粒子(NP)(a)或含有85％尼龙的消耗后tights样品(b)上测试的各种上述酶。HPLC测量确认尼龙单体6-氨基己酸(Ahx)的生成。
图25显示上表列出的一些新尼龙酶的发现。特别地，这些新尼龙酶有Nyl-10(Uniprot代码A0A1C6V3K0)、Nyl-11(Uniprot代码A0A138ZXG5)、Nyl-12(Uniprot代码A0A1M7HAK8)和Nyl-14(Uniprot代码WP243569406.1)。Nyl-10、Nyl-11、Nyl-12和Nyl14在序列空间中远离已知的尼龙酶，分别与NylC共享49％、33％、30％和56％序列同一性。
图26显示了上述一些其他新尼龙酶的发现。特别地，新尼龙酶有Nyl 18-FL(MGnify代码MGYP000370831902/2-317)、20-FL(MGnify代码MGYP000123679597/3-313)、24-FL(MGnify代码MGYP000614730541/11-353)和25-FL(MGYP000554001943/18-373)，分别与NylC共享38％、41％、30％和33％序列同一性。
图27显示了上述列表中描述的新尼龙酶土壤1的发现。土壤1(MGnify代码MGYP000120183263/1-286)与NylC共享20％序列同一性。
图28显示了上述列表中描述的新尼龙酶海洋2的发现。海洋2(MGnify代码MGYP000645432643/3-305)与NylC共享19％序列同一性。

Claims (17)

1.一种用于筛选优化的塑料降解酶的方法，所述方法包括：
a)将具有所述塑料降解酶的变体基因序列的基因文库包封到多个微流体液滴中，每个微流体液滴包含所述塑料降解酶的至少一个变体基因序列，并且每个微流体液滴另外包含：
i)用于表达所述基因的表达系统；和
ii)塑料粒子；
b)检测所述微流体液滴中所述塑料粒子的降解；以及
c)选择其中已经检测到塑料降解的微流体液滴。
2.一种用于鉴定塑料降解酶的方法，所述方法包括：
a)将基因文库包封到多个微流体液滴中，每个微流体液滴包含至少一个基因，并且每个微流体液滴另外包含：
i)用于表达所述基因的表达系统；和
ii)塑料粒子；
b)检测所述微流体液滴中所述塑料粒子的降解；以及
c)选择其中已经检测到塑料降解的微流体液滴。
3.a)如权利要求1所述的方法，其中
所述基因文库是定向进化文库；或者
b)如权利要求2所述的方法，其中所述基因文库是宏基因组文库；和/或
c)如权利要求2所述的方法，其中所述方法进一步包括制备具有所鉴定的塑料降解酶的变体基因序列的基因文库，并进行如权利要求1所述的方法。
4.如权利要求1-3所述的方法，其中检测降解是通过检测由所述塑料粒子引起的光散射的减少来进行的。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述塑料粒子包含聚酯、聚酰胺、聚氨酯或聚烯烃，任选地其中所述塑料粒子包含以下中的任一种或多种：聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚对苯二甲酸丙二醇酯(PTT)、聚对苯二甲酸丁二醇酯(PBT)、聚对苯二甲酸乙二醇异山梨醇酯(PEIT)、聚乳酸(PLA)、聚羟基链烷酸酯(PHA)、聚琥珀酸丁二醇酯(PBS)、聚琥珀酸己二酸丁二醇酯(PBSA)、聚对苯二甲酸己二酸丁二醇酯(PBAT)、聚乙二醇呋喃酸酯(PEF)、聚己内酯(PCL)、聚(己二酸乙二醇酯)(PEA)、聚萘二甲酸乙二醇酯(PEN)、聚乙烯(PE)、聚苯乙烯(PS)、聚丙烯(PP)、聚氯乙烯(PVC)、聚氨酯(PUR)、聚酰胺(PA)、聚碳酸酯(PC)。
6.如权利要求1中任一项所述的方法，其中所述方法是在用以鉴定塑料降解酶的基因序列的筛选方法之前进行，其中所述筛选方法包括：
a)将基因文库包封到多个微流体液滴中，每个微流体液滴包含至少一个基因，并且每个微流体液滴另外包含：
i)用于表达所述基因的表达系统；和
ii)可溶性塑料模拟物；
b)检测所述微流体液滴中所述可溶性塑料模拟物的裂解；以及
c)选择其中已经检测到裂解的微流体液滴，任选地其中所述基因文库是宏基因组文库。
7.一种水解酶，任选地酯酶，其与以下项具有至少70％或更多的序列同一性：
a)SEQ ID NO.2，任选地其中所述酶包含SEQ ID NO.2的以下突变中的任一个或多个：
i)A9S；和/或
ii)A118E；和/或
iii)A19T；
或者
b)SEQ ID NO.4；
或者
c)SEQ ID NO.6。
8.如权利要求7a)所述的水解酶，任选地酯酶，其中所述酶包含SEQ ID NO.2的以下突变中的任一个或多个：
a)A118E和/或F221S和/或S235G；和/或
b)A118E和/或F221S；和/或
c)A19T和/或A118E和/或F221S；和/或
c)F221S。
9.一种多肽，除了以下突变之外，其与SEQ ID NO.2、4或6具有100％序列同一性，任选地与SEQ ID NO.2具有100％序列同一性：
a)A9S；和/或
b)A118E；和/或
c)A19T；或者
d)A118E和/或F221S和/或S235G；和/或
e)A118E和/或F221S；和/或
f)A19T和/或A118E和/或F221S；和/或
g)F221S。
10.一种水解酶，所述水解酶与SEQ ID NO.8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30或32具有至少70％同一性，或一种多肽，所述多肽与SEQ ID NO.8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30或32具有100％同一性。
11.一种分离的和/或重组的核酸，其编码如权利要求7-10中任一项所述的水解酶或多肽。
12.一种表达盒或载体，其包含如权利要求11所述的核酸。
13.一种宿主细胞，其包含如权利要求11所述的核酸或者如权利要求12所述的表达盒或载体。
14.如权利要求7至10所述的水解酶或多肽中的任一种或者如权利要求13所述的宿主细胞用以降解塑料的用途。
15.一种酯酶的晶体，所述酯酶具有：
a)与SEQ ID NO.2具有至少70％序列同一性，或是其生物活性片段，任选地：
i)其中所述晶体衍射X射线，达到至少的分辨率；和/或
ii)其中所述晶体具有P6222的空间群；和/或
iii)其中晶胞参数是a＝122b＝122c＝218α＝90β＝90γ＝120；和/或
iv)其中所述晶体是能够在以下结晶条件下获得的：琥珀酸钠；LiSO4；或PEG MME 5K和(NH4)2SO4，
或者
b)与SEQ ID NO.4具有至少70％序列同一性，或是其生物活性片段，任选地：
i)其中所述晶体衍射X射线，达到至少的分辨率；和/或
ii)其中所述晶体具有P1211的空间群；和/或
iii)其中晶胞参数是a＝60.6b＝53.3c＝100.6α＝90β＝100.3γ＝90；和/或
iv)其中所述晶体是能够在以下结晶条件下获得的：柠檬酸钠和(NH4)2SO4。
16.一种计算机可读数据存储介质，其编码有表2或3中残基的原子坐标，或图16或17中的原子坐标。
17.与表2或表3中残基的主链原子的均方根偏差小于或者与图16中原子坐标的均方根偏差小于的原子坐标、任选地图16或图17的氨基酸12-325的坐标、任选地图17的氨基酸2-267的坐标用以如下的用途：
a)通过计算设计来优化蛋白质的塑料降解活性；
b)通过计算设计来优化蛋白质的热稳定性；
c)设计塑料水解酶；或者
d)对从蛋白质获得的结构生物学数据进行定相。
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