CN119546706A - 具有间隔连接基基团的聚合物串联染料 - Google Patents

Abstract

公开了可用作荧光或着色染料的化合物。化合物具有以下结构(I)：或其立体异构体、互变异构体或盐，其中R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、L¹、L^1a、L^1b、L²、L³、L⁴、L⁵、L⁶、L⁷、M¹、M²、m、n、q和w如本文所定义。还提供了与制备和使用此类化合物相关的方法。

Description

具有间隔连接基基团的聚合物串联染料

背景

技术领域

本公开总体上涉及具有用于亮度增强的间隔基团的二聚和聚合物荧光或着色串联染料，以及用于其制备的方法和在各种分析方法中的用途。

相关技术说明

已知荧光和/或着色染料特别地适用于期望高度灵敏的检测试剂的应用中。能够优选地标记样品中特定成分或组分的染料使得研究人员能够确定该特定成分或组分的存在、量和/或位置。此外，可以在不同环境中在其空间和时间分布方面监测特定体系。

荧光和比色法在化学和生物学中极其普遍。这些方法给出了关于生物分子的存在、结构、距离、取向、复合和/或位置的可用信息。此外，时间分辨方法越来越多地被用于动力学(dynamics and kinetics)的测量中。因此，已经开发了用于生物分子诸如核酸和蛋白质的荧光或颜色标记的许多策略。由于生物分子的分析典型地发生在水性环境中，因此重点关注水溶性染料的开发和使用。

高度荧光或着色染料是期望的，因为使用此类染料增加信噪比并且提供其他相关益处。因此，已经尝试了增加来自已知荧光和/或着色部分的信号。具体地，荧光共振能量转移(resonance energy transfer)(“FRET”-有时也与荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer)可互换地使用)技术产生可靠地测量生物分子距离和相互作用的变化的信息。共振能量转移技术相对便宜并且可以快速地获得测量结果；然而，由于游离荧光团和不期望的pH敏感性，FRET受到与发色团的取向和定位以及能量转移掩蔽有关的若干限制。

因此，本领域需要具有增加的摩尔亮度和/或增加的FRET发射信号的水溶性染料、尤其是共振能量转移染料。理想地，此类染料和生物标志物应当是强烈地着色的或荧光的并且应当在多种颜色和荧光波长中可用。本发明满足了该需要并且提供了另外的相关优点。

概述

简而言之，本公开的实施方案总体上涉及可用作能够视觉检测分析物分子诸如生物分子以及用于其制备的试剂的水溶性、荧光和/或着色染料和/或探针的化合物。特别地，在一些实施方案中，本公开的化合物是可用的，因为它们能够实现与其相关的FRET荧光发射。还描述了用于使用染料视觉上检测分析物分子的方法。

本文所公开的染料的实施方案包括两个或更多个通过具有以下结构的连接基共价连接的荧光和/或着色部分(即，FRET受体M¹和相应的FRET供体M²)：

具体地，FRET受体M¹与相应的FRET供体M²的比率是1:1、1:2、1:3、或2:3。与二聚和/或聚合物染料的先前报道相反，本发明的染料比相应的单体染料化合物显著地更亮，并且由于分子内相互作用而使得实现FRET吸光度和发射。虽然不希望受理论的束缚，但认为FRET受体M¹与被连接基分离的相应FRET供体M²的特定比率在荧光和/或着色部分之间提供足够的接近度，使得分子内FRET被优化。本文所公开的染料的实施方案包括在两个FRET供体之间具有以下结构之一的连接基，其提供足够的接近度：

此外，本文所公开的染料的实施方案包括通过具有以下结构的连接基共价连接至‘5端‘3端的荧光和/或着色部分(即，FRET受体M¹和相应的FRET供体M²)：

本公开的实施方案的水溶性、荧光或着色染料是强烈着色的和/或荧光的，能够实现FRET过程(例如，吸光度、发射、斯托克斯位移)，并且可以通过视觉检查或其他手段容易地观察到。在一些实施方案中，可以在无事先照明或化学或酶活化的情况下观察化合物。如本文所描述的，通过染料的适当选择，可以获得多种颜色的视觉上可检测的分析物分子。

在一些实施方案中，提供了具有以下结构(I)的化合物：

或其立体异构体、互变异构体或盐，其中R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、L^1a、L^1b、L²、L³、L⁴、L⁵、L⁶、L⁷、M¹、M²、m、n、q和w如本文所定义。

结构(I)的化合物在许多应用中发现实用性，包括在各种分析方法中作为荧光和/或着色染料的用途。

在又其他实施方案中，提供了用于染色样品的方法，该方法包括向所述样品中添加结构(I)的化合物，其量足以在以适当波长照射所述样品时产生光学响应。

在还其他实施方案中，本公开提供了用于视觉上检测分析物分子的方法，其包括：

(a)提供如本文所公开的化合物；和

(b)通过其可见特性检测化合物。

其他公开的方法包括用于视觉上检测生物分子的方法，该方法包括：

(a)将如本文所公开的化合物与一种或多种生物分子掺合；和

(b)通过其可见特性检测化合物。

其他实施方案提供了用于视觉上检测分析物的方法，该方法包括：

(a)提供如本文所公开的化合物，其中R¹或R²包括包含与对分析物具有特异性的靶向部分的共价键的连接基；

(b)将化合物与分析物掺合，从而使靶向部分和分析物缔合；和

(c)通过其可见特性检测化合物。

在还其他实施方案中，本公开提供了用于增加染料的亮度的方法，其包括：

(a)提供包含如本文所公开的化合物的染料溶液；和

(b)使染料溶液陈化一定时间段。

其他实施方案涉及包含如本文所公开的化合物和一种或多种分析物分子(诸如一种或多种生物分子)的组合物。还提供了此类组合物在用于检测该一种或多种生物分子的分析方法中的用途。

本公开的这些和其他方面在参考以下详细描述时将是显而易见的。

附图的若干视图的简要说明

在图中，相同的附图标记标识类似的要素。图中要素的尺寸和相对位置不必按比例绘制并且这些要素中的一些被任意地放大和定位以提高图的易读性。此外，如所绘制的要素的特定形状不旨在传达关于特定要素的实际形状的任何信息，并且仅为了便于在图中识别而被选择。

图1示出FAM供体和Cy3受体染料分子FRET发射的光谱特征。

图2示出AF350供体和FAM受体染料分子FRET发射的光谱特征。

图3示出两个分子之间的距离与它们的-6平方值之间的图形关系。

图4示出供体与受体之间的FRET效应。

图5示出具有两个供体和一个受体的聚合物染料的结构取向。

图6示出具有三个供体和一个受体的聚合物染料的结构取向。

详述

在以下描述中，阐述了某些具体细节以便提供对本公开的各种实施方案的透彻理解。然而，本领域技术人员将理解，本公开可以在没有这些细节的情况下实践。

除非上下文另有要求，否则在整个本说明书和权利要求中，词语“包含/包括(comprise)”及其变体，诸如“包含/包括(comprises)”和“包含/包括(comprising)”应以开放性、包括端点的意义解释，即，解释为“包括，但不限于”。

贯穿本说明书对“一个实施方案(one embodiment)”或“实施方案(anembodiment)”的提及意味着结合该实施方案描述的特定特征、结构或特性包括在本公开的至少一个实施方案中。因此，贯穿本说明书在不同地方中出现短语“在一个实施方案中(inone embodiment)”或“在实施方案中(in an embodiment)”并不必定都是指同一实施方案。此外，在一个或多个实施方案中，可以将特定特征、结构、或特性以任何合适的方式组合。

“氨基”是指-NH₂基团。

“羧基”是指-CO₂H基团。

“氰基”是指-CN基团。

“甲酰基”是指-C(＝O)H基团。

“羟基(hydroxy)”或“羟基(hydroxyl)”是指-OH基团。

“亚氨基”是指＝NH基团。

“硝基”是指-NO₂基团。

“氧代”是指＝O取代基基团。

“硫氢基(sulfhydryl)”是指-SH基团。

“硫代(thioxo)”是指＝S基团。

“烷基”是指直链或支链烃链基团，其仅由碳和氢原子组成，不含有不饱和度，具有一至十二个碳原子(C₁-C₁₂烷基)、一至八个碳原子(C₁-C₈烷基)或一至六个碳原子(C₁-C₆烷基)，并且其通过单键附接至分子的其余部分，例如，甲基、乙基、正丙基、1-甲基乙基(异丙基)、正丁基、正戊基、1,1-二甲基乙基(叔丁基)、3-甲基己基、2-甲基己基等。除非说明书中另有具体说明，否则烷基是任选地取代的。

“亚烷基”或“亚烷基链”是指将分子的其余部分连接至基团的直链或支链二价烃链，其仅由碳和氢组成，不含有不饱和度，并且具有一至十二个碳原子，例如，亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚正丁基、亚乙烯基、亚丙烯基、亚正丁烯基、亚丙炔基、亚正丁炔基等。亚烷基链通过单键附接至分子的其余部分并且通过单键附接至基团。亚烷基链与分子的其余部分和与基团的附接点可以通过链内的一个碳或任何两个碳。除非说明书中另有具体说明，否则亚烷基是任选地取代的。

“亚烯基”或“亚烯基链”是指将分子的其余部分连接至基团的直链或支链二价烃链，其仅由碳和氢组成，含有至少一个碳碳双键并且具有二至十二个碳原子，例如，亚乙烯基、亚丙烯基、亚正丁烯基等。亚烯基链通过单键附接至分子的其余部分并且通过双键或单键附接至基团。亚烯基链与分子的其余部分和与基团的附接点可以通过链内的一个碳或任何两个碳。除非说明书中另有具体说明，否则亚烯基是任选地取代的。

“亚炔基”或“亚炔基链”是指将分子的其余部分连接至基团的直链或支链二价烃链，其仅由碳和氢组成，含有至少一个碳碳三键并且具有二至十二个碳原子，例如，亚乙烯基、亚丙烯基、亚正丁烯基等。亚炔基链通过单键附接至分子的其余部分并且通过双键或单键附接至基团。亚炔基链与分子的其余部分和与基团的附接点可以通过链内的一个碳或任何两个碳。除非说明书中另有具体说明，否则亚炔基是任选地取代的。

“烷基醚”是指如以上所定义的任何烷基，其中至少一个碳-碳键被碳-氧键替代。碳-氧键可以在末端上(如在烷氧基中)或碳氧键可以在内部(即，C-O-C)。烷基醚包括至少一个碳氧键，但可以包括多于一个。例如，聚乙二醇(PEG)包括在烷基醚的含义内。除非说明书中另有具体说明，否则烷基醚基团是任选地取代的。例如，在一些实施方案中，烷基醚被醇或-OP(＝R_a)(R_b)R_c取代，其中R_a、R_b和R_c中的每个如对于结构(I)的化合物所定义。

“烷氧基”是指式-OR_a的基团，其中R_a是如以上所定义的含有一至十二个碳原子的烷基。除非说明书中另有具体说明，否则烷氧基是任选地取代的。

“烷氧基烷基醚”是指式-OR_aR_b的基团，其中R_a是如以上所定义的含有一至十二个碳原子的亚烷基，并且Rb是如本文所定义的烷基醚基团。除非本说明书中另有具体说明，否则烷氧基烷基醚基团是任选地取代的，例如被醇或-OP(＝R_a)(R_b)R_c取代，其中R_a、R_b和R_c中的每个如对于结构(I)的化合物所定义。

“杂烷基”是指在烷基内或在烷基的末端处包含至少一个杂原子(例如，N、O、P或S)的如以上所定义的烷基。在一些实施方案中，杂原子在烷基内(即，杂烷基包含至少一个碳-[杂原子]_x-碳键，其中x是1、2或3)。在其他实施方案中，杂原子在烷基的末端处并且因此用于将烷基连接至分子的其余部分(例如，M1-H-A)，其中M1是分子的一部分，H是杂原子并且A是烷基)。除非说明书中另有具体说明，否则杂烷基是任选地取代的。示例性杂烷基包括亚乙基氧基(例如，聚亚乙基氧基)，任选地包括磷-氧键，诸如磷酸二酯键。

“杂烷氧基”是指式-OR_a的基团，其中R_a是如以上所定义的含有一至十二个碳原子的杂烷基。除非说明书中另有具体说明，否则杂烷氧基是任选地取代的。

“杂亚烷基”是指在亚烷基链内或在亚烷基链的末端处包含至少一个杂原子(例如，N、O、P或S)的如以上所定义的亚烷基。在一些实施方案中，杂原子在亚烷基链内(即，杂亚烷基包含至少一个碳-[杂原子]-碳键，其中x是1、2或3)。在其他实施方案中，杂原子在亚烷基的末端处并且因此用于将亚烷基连接至分子的其余部分(例如，M1-H-A-M2，其中M1和M2是分子的一部分，H是杂原子并且A是亚烷基)。除非说明书中另有具体说明，否则杂亚烷基是任选地取代的。示例性杂亚烷基包括亚乙基氧基(例如，聚亚乙基氧基)和“C”、“HEG”、“TEG”、“PEG 1K”及其变体，连接基团在以下示出：

以上C-连接基、HEG连接基和/或PEG 1K连接基的多聚体包括在杂亚烷基连接基的各种实施方案中。

在PEG 1K连接基的一些实施方案中，n是25。多聚体可以包含例如以下结构：

其中x是0或大于0的整数，例如，x范围从0-100(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10)。

“杂亚烯基”是包含至少一个碳碳双键的如以上所定义的杂亚烷基。除非说明书中另有具体说明，否则杂亚烯基是任选地取代的。

“杂亚炔基”是包含至少一个碳碳三键的杂亚烷基。除非说明书中另有具体说明，否则杂亚炔基是任选地取代的。

提及“杂原子连接基”的“杂原子”是指由一个或多个杂原子组成的连接基基团。示例性杂原子连接基包括选自由O、N、P和S组成的组的单个原子，以及多个杂原子，例如具有式-P(O^-)(＝O)O-或-OP(O^-)(＝O)O-的连接基及其多聚体和组合。

“磷酸酯基”是指-OP(＝O)(R_a)R_b基团，其中R_a是OH、O^-或OR_c；并且R_b是OH、O^-、OR_c、硫代磷酸酯基团或另外的磷酸酯基团，其中R_c是抗衡离子(例如，Na+等)。

“磷酸烷基”是指-OP(＝O)(R_a)R_b基团，其中R_a是OH、O-或OR_c；并且R_b是-O烷基，其中R_c是抗衡离子(例如，Na+等)。除非说明书中另有具体说明，否则磷酸烷基是任选地取代的。例如，在某些实施方案中，磷酸烷基中的-O烷基部分任选地被羟基、氨基、硫氢基、磷酸酯基、硫代磷酸酯基、磷酸烷基、硫代磷酸烷基、磷酸烷基醚、硫代磷酸烷基醚或-OP(＝R_a)(R_b)R_c中的一个或多个取代，其中R_a、R_b和R_c中的每个如对于结构(I)的化合物所定义。

“磷酸烷基醚”是指-OP(＝O)(R_a)R_b基团，其中R_a是OH、O-或OR_c；并且R_b是-O烷基醚，其中R_c是抗衡离子(例如，Na+等)。除非说明书中另有具体说明，否则磷酸烷基醚基团是任选地取代的。例如，在某些实施方案中，磷酸烷基醚基团中的-O烷基醚部分任选地被羟基、氨基、硫氢基、磷酸酯基、硫代磷酸酯基、磷酸烷基、硫代磷酸烷基、磷酸烷基醚、硫代磷酸烷基醚或-OP(＝R_a)(R_b)R_c中的一个或多个取代，其中R_a、R_b和R_c中的每个如对于结构(I)的化合物所定义。

“硫代磷酸酯基”是指-OP(＝R_a)(R_b)R_c基团，其中R_a是O或S，R_b是OH、O-、S-、OR_d或SR_d；并且R_c是OH、SH、O-、S-、OR_d、SR_d、磷酸酯基团或另外的硫代磷酸酯基团，其中R_d是抗衡离子(例如，Na+等)，并且前提是：i)R_a是S；ii)R_b是S-或SR_d；iii)R_c是SH、S-或SR_d；或iv)i)、ii)和/或iii)的组合。

“硫代磷酸烷基”是指-OP(＝R_a)(R_b)R_c基团，其中R_a是O或S，R_b是OH、O^-、S^-、OR_d或SR_d；并且R_c是-O烷基，其中R_d是抗衡离子(例如，Na+等)，并且前提是：i)R_a是S；ii)R_b是S-或SR_d；或iii)R_a是S并且R_b是S-或SR_d。除非说明书中另有具体说明，否则硫代磷酸烷基是任选地取代的。例如，在某些实施方案中，硫代磷酸烷基中的-O烷基部分任选地被羟基、氨基、硫氢基、磷酸酯基、硫代磷酸酯基、磷酸烷基、硫代磷酸烷基、磷酸烷基醚、硫代磷酸烷基醚或-OP(＝R_a)(R_b)R_c中的一个或多个取代，其中R_a、R_b和R_c中的每个如对于结构(I)的化合物所定义。

“硫代磷酸烷基醚”是指-OP(＝R_a)(R_b)R_c基团，其中R_a是O或S，R_b是OH、O-、S^-、OR_d或SR_d；并且R_c是-O烷基醚，其中R_d是抗衡离子(例如，Na+等)，并且前提是：i)R_a是S；ii)R_b是S-或SR_d；或iii)R_a是S并且R_b是S-或SR_d。除非说明书中另有具体说明，否则硫代磷酸烷基醚基团是任选地取代的。例如，在某些实施方案中，硫代磷酸烷基中的-O烷基醚部分任选地被羟基、氨基、硫氢基、磷酸酯基、硫代磷酸酯基、磷酸烷基、硫代磷酸烷基、磷酸烷基醚、硫代磷酸烷基醚或-OP(＝R_a)(R_b)R_c中的一个或多个取代，其中R_a、R_b和R_c中的每个如对于结构(I)的化合物所定义。

“碳环”是指包含3至18个碳原子的稳定的3元至18元芳族或非芳族环。除非说明书中另有具体说明，否则碳环可以是单环、双环、三环或四环环体系，其可以包括稠合环或桥环体系，并且可以是部分地或完全地饱和的。非芳族碳环基包括环烷基，而芳族碳环基包括芳基。除非说明书中另有具体说明，否则碳环基团是任选地取代的。

“环烷基”是指稳定的非芳族单环或多环碳环，其可以包括具有三至十五个碳原子、优选地具有三至十个碳原子的稠合环或桥环体系，并且其是饱和的或不饱和的并且通过单键附接至分子的其余部分。单环环烷基包括例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。多环环烷基包括例如金刚烷基、降冰片基、十氢化萘基、7,7-二甲基-双环-[2.2.1]庚烷基等。除非说明书中另有具体说明，否则环烷基是任选地取代的。

“芳基”是指包含至少一个碳环芳族环的环体系。在一些实施方案中，芳基包含6至18个碳原子。芳基环可以是单环、双环、三环或四环环体系，其可以包括稠合环或桥环体系。芳基包括但不限于衍生自以下的芳基：醋蒽烯、苊、醋菲烯、蒽、薁、苯、荧蒽、芴、不对称引达省(as-indacene)、对称引达省(s-indacene)、茚满、茚、萘、非那烯、菲、七曜烯(pleiadene)、芘和苯并菲。除非说明书中另有具体说明，否则芳基是任选地取代的。

“杂环”是指包含一至十二个碳原子和一至六个选自由氮、氧和硫组成的组的杂原子的稳定的3元至18元芳族或非芳族环。除非说明书中另有具体说明，否则杂环可以是单环、双环、三环或四环环体系，其可以包括稠合环或桥环体系；并且杂环中的氮、碳或硫原子可以任选地被氧化；氮原子可以任选地被季铵化；并且杂环可以是部分地或完全地饱和的。以下在杂芳基的定义中列出了芳族杂环的实例(即，杂芳基是杂环的子集)。非芳族杂环的实例包括但不限于二氧戊环基、噻吩基[1,3]二噻烷基、十氢异喹啉基、咪唑啉基、咪唑烷基、异噻唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、八氢吲哚基、八氢异吲哚基、2-氧代哌嗪基、2-氧代哌啶基、2-氧代吡咯烷基、噁唑烷基、哌啶基、哌嗪基、4-哌啶酮基、吡咯烷基、吡唑烷基、吡唑并嘧啶基、奎宁环基、噻唑烷基、四氢呋喃基、三噁烷基、三噻烷基、三嗪烷基、四氢吡喃基、硫代吗啉基、噻吗啉基、1-氧代-硫代吗啉基和1,1-二氧代-硫代吗啉基。除非说明书中另有具体说明，否则杂环基团是任选地取代的。

“杂芳基”是指包含一至十三个碳原子，一至六个选自由氮、氧和硫组成的组的杂原子和至少一个芳族环的5元至14元环体系。出于本公开的某些实施方案的目的，杂芳基可以是单环、双环、三环或四环环体系，其可以包括稠合环或桥环体系；并且杂芳基中的氮、碳或硫原子可以任选地被氧化；氮原子可以任选地被季铵化。实例包括但不限于氮杂基、吖啶基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、苯并吲哚基、苯并二氧杂环戊烯基、苯并呋喃基、苯并噁唑基、苯并噻唑基、苯并噻二唑基、苯并[b][1,4]二氧杂基、1,4-苯并二噁烷基、苯并萘并呋喃基、苯并噁唑基、苯并二氧杂环戊烯基、苯并二噁英基、苯并吡喃基、苯并吡喃酮基、苯并呋喃基、苯并呋喃酮基、苯并噻吩基(benzothienyl)(苯并噻吩基(benzothiophenyl))、苯并三唑基、苯并[4,6]咪唑并[1,2-a]吡啶基、苯并噁唑啉酮基、苯并咪唑硫酮基、咔唑基、噌啉基、二苯并呋喃基、二苯并噻吩基、呋喃基、呋喃酮基、异噻唑基、咪唑基、吲唑基、吲哚基、吲唑基、异吲哚基、吲哚啉基、异吲哚啉基、异喹啉基、吲哚嗪基、异噁唑基、萘啶基、噁二唑基、2-氧代氮杂基、噁唑基、环氧乙烷基、1-氧桥吡啶基、1-氧桥嘧啶基、1-氧桥吡嗪基、1-氧桥哒嗪基、1-苯基-1H-吡咯基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩噁嗪基、酞嗪基、蝶啶基、蝶啶酮基、嘌呤基、吡咯基、吡唑基、吡啶基、吡啶酮基、吡嗪基、嘧啶基、嘧啶酮基、哒嗪基、吡咯基、吡啶并[2,3-d]嘧啶酮基、喹唑啉基、喹唑啉酮基、喹喔啉基、喹喔啉酮基、喹啉基、异喹啉基、四氢喹啉基、噻唑基、噻二唑基、噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-酮基、噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-酮基、三唑基、四唑基、三嗪基和噻吩基(thiophenyl)(即噻吩基(thienyl))。除非说明书中另有具体说明，否则杂芳基是任选地取代的。

后缀“-亚基(-ene)”是指通过单键附接至分子的其余部分并且通过单键附接至基团的特定结构特征(例如，烷基、芳基、杂烷基、杂芳基)。换言之，后缀“-亚基(-ene)”是指具有其所附接的部分的结构特征的连接基。“-亚基(-ene)”链与分子的其余部分和与基团的附接点可以通过链内的一个原子或任何两个原子。例如，杂亚芳基是指包含如本文所定义的杂芳基部分的连接基。

“稠合”是指包含至少两个环的环体系，其中这两个环共享至少一个共同的环原子，例如两个共同的环原子。当稠合环是杂环基环或杂芳基环时，一个或多个共同的环原子可以是碳或氮。稠合环包括双环、三环、四环等。

本文所使用的术语“取代的”意指任何以上基团(例如，烷基、亚烷基、亚烯基、亚炔基、杂亚烷基、杂亚烯基、杂亚炔基、烷氧基、烷基醚、烷氧基烷基醚、杂烷基、杂烷氧基、磷酸烷基、磷酸烷基醚、硫代磷酸烷基、硫代磷酸烷基醚、碳环、环烷基、芳基、杂环和/或杂芳基)，其中至少一个氢原子(例如，1、2、3个或所有氢原子)被与非氢原子的键替代，该非氢原子诸如但不限于：卤素原子，诸F、Cl、Br和I；基团中的氧原子，诸如羟基、烷氧基和酯基团；基团中的硫原子，诸如硫醇基团、硫代烷基、砜基团、磺酰基和亚砜基团；基团中的氮原子，诸如胺、酰胺、烷基胺、二烷基胺、芳基胺、烷基芳基胺、二芳基胺、N-氧化物、酰亚胺和烯胺；基团中的硅原子，诸如三烷基甲硅烷基、二烷基芳基甲硅烷基、烷基二芳基甲硅烷基和三芳基甲硅烷基；和各种其他基团中的其他杂原子。“取代的”还意指其中一个或多个氢原子被与杂原子的高阶键(例如，双键或三键)替代的任何以上基团，该杂原子诸如氧代、羰基、羧基和酯基团中的氧；以及基团诸如亚胺、肟、腙和腈中的氮。例如，“取代的”包括其中一个或多个氢原子被-NR_gR_h、-NR_gC(＝O)R_h、-NR_gC(＝O)NR_gR_h、-NR_gC(＝O)OR_h、-NR_gSO₂R_h、-OC(＝O)NR_gR_h、-OR_g、-SR_g、-SOR_g、-SO₂R_g、-OSO₂R_g、-SO₂OR_g、＝NSO₂R_g和-SO₂NR_gR_h替代的以上基团中的任一种。“取代的”还意指其中一个或多个氢原子被-C(＝O)R_g、-C(＝O)OR_g、-C(＝O)NR_gR_h、-CH₂SO₂R_g、-CH₂SO₂NR_gR_h替代的以上基团中的任一种。在前述中，R_g和R_h是相同或不同的并且独立地是氢、烷基、烷氧基、烷基氨基、硫代烷基、芳基、芳烷基、环烷基、环烷基烷基、卤代烷基、杂环基、N-杂环基、杂环基烷基、杂芳基、N-杂芳基和/或杂芳基烷基。“取代的”进一步意指其中一个或多个氢原子被与氨基、氰基、羟基、亚氨基、硝基、氧代、硫代、卤代、烷基、烷氧基、烷基氨基、硫代烷基、芳基、芳烷基、环烷基、环烷基烷基、卤代烷基、杂环基、N-杂环基、杂环基烷基、杂芳基、N-杂芳基和/或杂芳基烷基的键替代的任何以上基团。在一些实施方案中，任选的取代基是-OP(＝R_a)(R_b)R_c，其中R_a、R_b和R_c中的每个如对于结构(I)的化合物所定义。此外，前述取代基中的每个也可以任选地被以上取代基中的一个或多个取代。

“吸电子基团”是指如果其在分子中占据相同位置的话其比氢原子更能向自身吸引电子的官能团。这些术语被本领域技术人员充分理解并且在J.March的AdvancedOrganic Chemistry,John Wiley&Sons,New York,N.Y.,第16-18页(1985)中讨论，并且其中的讨论通过引用并入本文。吸电子基团的实例包括但不限于卤代、卤代(例如，F、Cl、Br、I)、—NO₂、—CN、—SO₃H、—SO₂ R_a、—SO₃ R_a、—COOH、—CO R_a、—COOR_a、—CONH R_a、—CON(R_a)₂、卤代烷基和5-14元缺电子的杂芳基，其中R_a是烷基、烯基、或炔基。

“共轭”是指一个p-轨道与另一个p-轨道在居间σ键上的重叠。共轭可以发生在环状或非环状化合物中。“共轭度”是指至少一个p-轨道与另一个p-轨道在居间σ键上的重叠。例如，1,3-丁二烯(butadine)具有一个共轭度，而苯和其他芳族化合物典型地具有多个共轭度。荧光和着色化合物典型地包含至少一个共轭度。

“荧光”是指能够吸收特定频率的光并且发射不同频率的光的分子。荧光是本领域普通技术人员熟知的。

“着色”是指吸收着色光谱(即，红色、黄色、蓝色等)内的光的分子。

“FRET”是指荧光共振能量转移，是指物理相互作用，借此来自一个部分(例如，第一发色团或“供体”)的激发的能量被转移至相邻部分(例如，第二发色团或“受体”)。“FRET”有时也与荧光共振能量转移可互换地使用(即，当每个发色团是荧光部分时)。通常，FRET要求(1)受体发色团的激发或吸收光谱与供体发色团的发射光谱重叠；(2)受体和供体发色团的跃迁偶极矩是基本上平行的(即，在约0°或180°处)；和(3)受体和供体发色团共享空间接近度(即，彼此接近)。从供体至受体的能量转移通过非辐射偶极-偶极偶合发生，并且供体发色团与受体发色团之间的距离通常远小于光的一个或多个波长。

“供体”或“供体发色团”是指发色团(例如，荧光团)，其被诱导或可以被诱导成激发电子态，并且可以通过长程偶极-偶极相互作用以非辐射方式将其激发或吸收能量转移至附近的受体发色团。不希望受理论的束缚，认为能量转移发生是因为相应发色团的振荡偶极具有类似的共振频率。具有这些类似的共振频率的供体和受体被称为“一个或多个供体-受体对”，其与“FRET部分”、“FRET对”、“FRET染料”或类似物可互换地使用。

“受体”或“受体发色团”是指发色团(例如，荧光团)，来自供体发色团的激发或吸收能量通过长程偶极-偶极相互作用经由非辐射转移来转移至该发色团。

“斯托克斯位移”是指电子跃迁(例如，从激发态至非激发态，反之亦然)的激发或吸收带最大值和发射光谱的位置之间的差异。在一些实施方案中，化合物具有大于25nm、大于30nm、大于35nm、大于40nm、大于45nm、大于50nm、大于55nm、大于60nm、大于65nm、大于70nm、大于75nm、大于80nm、大于85nm、大于90nm、大于95nm、大于100nm、大于110nm、大于120nm、大于130nm、大于140nm、大于150nm、大于160nm、大于170nm、大于180nm、大于190nm、或大于200nm的斯托克斯位移。

“J-值”被计算为供体发色团的发射光谱与受体发色团的激发或吸收光谱之间的光谱重叠的积分值。供体发色团的发射光谱是在用优选的激发或吸收波长激发供体发色团时生成的。用于供体发色团的优选的激发或吸收波长等于或接近本领域普通技术人员熟知的相应的激发或吸收最大值(例如，Pacific Blue在约401nm下具有激发或吸收最大值，FITC在约495nm下具有激发或吸收最大值)。

“连接基”是指至少一个原子(诸如碳、氧、氮、硫、磷及其组合)的连续链，其将分子的一部分连接至同一分子的另一部分或连接至不同的分子、部分或固体载体(例如，微粒)。连接基可以经由共价键或其他手段(诸如离子或氢键相互作用)连接分子。

术语“生物分子”是指多种生物材料中的任一种，包括核酸、碳水化合物、氨基酸、多肽、糖蛋白、激素、适配体及其混合物。更具体地，术语旨在包括但不限于RNA、DNA、寡核苷酸、修饰或衍生的核苷酸、酶、受体、朊病毒、受体配体(包括激素)、抗体、抗原和毒素，以及细菌、病毒、血细胞和组织细胞。如本文进一步描述的，通过使生物分子与具有能够经由任何可用原子或官能团(诸如生物分子上的氨基、羟基、羧基、或硫氢基)将生物分子附接至化合物的反应性基团的化合物接触来制备本公开的视觉上可检测的生物分子(例如，具有与其连接的生物分子的结构(I)的化合物)。

“反应性基团”是能够与第二反应性基团(例如，“互补反应性基团”)反应以形成一个或多个共价键的部分，例如通过置换、氧化、还原、加成或环加成反应。示例性反应性基团提供于表1中，并且包括例如亲核体、亲电体、二烯、亲二烯体、醛、肟、腙、炔烃、胺、叠氮化物、酰基叠氮化物、酰卤、腈、硝酮、硫氢基、二硫化物、磺酰卤化物、异硫氰酸酯、亚氨酸酯、活化酯、酮、α,β-不饱和羰基、烯烃、马来酰亚胺、α-卤代酰亚胺、环氧化物、氮丙啶、四嗪、四唑、膦、生物素、硫杂丙环等。

术语“可见的”和“视觉上可检测的”在本文中用于指不经事先照明或化学或酶活化而通过视觉检查可观察到的物质。此类视觉上可检测的物质吸收和发射在范围从约300至约900nm的光谱区域中的光。优选地，此类物质被强烈地着色，优选地具有至少约40,000、更优选地至少约50,000、还更优选地至少约60,000、又还更优选地至少约70,000并且最优选地至少约80,000M^-1cm^-1的摩尔消光系数。本公开的化合物可以通过用肉眼观察或借助于基于光学的检测装置(包括但不限于吸收分光光度计、透射光学显微镜、数码相机和扫描仪)来检测。视觉上可检测的物质不限于发射和/或吸收可见光谱中的光的那些。发射和/或吸收紫外(UV)区域(约10nm至约400nm)、红外(IR)区域(约700nm至约1mm)中的光的物质以及在电磁波谱的其他区域中发射和/或吸收的物质也包括在“视觉上可检测的”物质的范围内。

出于本公开的实施方案的目的，术语“光稳定可见染料”是指如上文所定义的视觉上可检测的并且在暴露于光时不显著改变或分解的化学部分。优选地，光稳定可见染料在暴露于光至少一小时之后不展现出显著的漂白或分解。更优选地，可见染料在暴露于光至少12小时、还更优选地至少24小时、还又更优选地至少一周并且最优选地至少一个月之后是稳定的。适用于本公开的化合物和方法中的光稳定可见染料的非限制性实例包括偶氮染料、硫靛染料、喹吖啶酮颜料、二噁嗪、酞菁、芘酮(perinone)、吡咯并吡咯二酮、喹酞酮和truarycarbonium。

如本文所用，术语“苝衍生物”旨在包括视觉上可检测的任何取代的苝。然而，术语不旨在包括苝本身。类似地使用术语“蒽衍生物”、“萘衍生物”和“芘衍生物”。在一些优选实施方案中，衍生物(例如，苝、芘、蒽或萘衍生物)是苝、蒽、萘、或芘的酰亚胺、双酰亚胺或肼酰亚胺(hydrazamimide)衍生物。

本公开的各种实施方案的视觉上可检测的分子可用于多种分析应用，诸如生物化学和生物医学应用，其中需要确定特定分析物(例如，生物分子)的存在、位置、或量。因此，在另一方面，本公开提供了用于视觉上检测生物分子的方法，其包括：(a)提供具有视觉上可检测的生物分子的生物系统，该生物分子包含连接至生物分子的结构(I)的化合物；和(b)通过其可见特性检测生物分子。出于本公开的目的，短语“通过其可见特性检测生物分子”意指用肉眼或借助于基于光学的检测装置(包括但不限于吸收分光光度计、透射光学显微镜、数码相机和扫描仪)观察生物分子而无需照明或化学或酶活化。可以使用密度计来定量存在的视觉上可检测的生物分子的量。例如，可以通过测量相对光密度来确定两个样品中生物分子的相对量。如果每个生物分子的染料分子的化学计量学是已知的，并且染料分子的消光系数是已知的，则生物分子的绝对浓度也可以从光密度的测量来确定。如本文所用，术语“生物系统”用于指除了视觉上可检测的生物分子之外还包含一种或多种生物分子的任何溶液或混合物。此类生物系统的非限制性实例包括细胞、细胞提取物、组织样品、电泳凝胶、测定混合物和杂交反应混合物。

“固体载体”是指用于分子的固相载体的本领域中已知的任何固体基质，例如“微粒”是指可用于附接至本公开的化合物的许多小颗粒中的任一种，包括但不限于玻璃珠粒、磁性珠粒、聚合物珠粒、非聚合物珠粒等。在某些实施方案中，微粒包含聚苯乙烯珠粒。

“固体载体残基”是指当分子从固体载体裂解时仍然附接至分子的官能团。固体载体残基是本领域中已知的并且可以基于固体载体的结构和将分子连接至其上的基团容易地衍生。

“靶向部分”是与特定靶标(诸如分析物分子)选择性地结合或缔合的部分。“选择性地”结合或缔合意指相对于其他靶标优先缔合或结合期望靶标的靶向部分。在一些实施方案中，出于使化合物与目的分析物(即，靶向部分的靶标)选择性地结合或缔合的目的，本文所公开的化合物包括与靶向部分的键，从而允许检测分析物。示例性靶向部分包括但不限于抗体、抗原、核酸序列、酶、蛋白质、细胞表面受体拮抗剂等。在一些实施方案中，靶向部分是与细胞上或细胞中的靶标特征(例如细胞膜或其他细胞结构上的靶标特征)选择性地结合或缔合的部分，诸如抗体，从而允许检测目的细胞。在某些实施方案中，与期望的分析物选择性地结合或缔合的小分子也被设想到作为靶向部分。本领域技术人员将理解在各种实施方案中可用的其他分析物和相应的靶向部分。

“碱基配对部分”是指能够经由氢键与互补杂环部分杂交的杂环部分(例如，沃森-克里克(Watson-Crick)碱基配对)。碱基配对部分包括天然和非天然碱基。碱基配对部分的非限制性实例是RNA和DNA碱基，诸如腺苷、鸟苷、胸苷、胞嘧啶和尿苷及其类似物。

本文所公开的本公开的实施方案还意在涵盖通过使一个或多个原子被具有不同原子质量或质量数的原子替代而被同位素标记的所有结构(I)的化合物。可以结合到所公开的化合物中的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、磷、氟、氯和碘的同位素，分别诸如²H、³H、¹¹C、¹³C、¹⁴C、¹³N、¹⁵N、¹⁵O、¹⁷O、¹⁸O、³¹P、³²P、³⁵S、¹⁸F、³⁶Cl、¹²³I和¹²⁵I。

结构(I)的同位素标记的化合物通常可以通过本领域技术人员已知的常规技术或通过类似于以下所描述的那些的方法和在以下实施例中使用适当的同位素标记的试剂代替先前所采用的未标记的试剂来制备。

“稳定化合物”和“稳定结构”意在指示足够稳固以经受住从反应混合物中分离至可用的纯度并且配制成有效的治疗剂的化合物。

“任选的”或“任选地”意指随后描述的事件或情况可以发生或可以不发生，并且该描述包括其中所述事件或情况发生的情况和其中所述事件或情况不发生的情况。例如，“任选地取代的烷基”意指烷基可以被取代或可以不被取代，并且描述包括取代的烷基和没有取代的烷基两者。

“盐”包括酸加成盐和碱加成盐两者。

“酸加成盐”是指与无机酸和有机酸形成的那些盐，这些无机酸诸如但不限于盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等，这些有机酸诸如但不限于乙酸、2,2-二氯乙酸、己二酸、藻酸、抗坏血酸、天冬氨酸、苯磺酸、苯甲酸、4-乙酰胺基苯甲酸、樟脑酸、樟脑-10-磺酸、癸酸、己酸、辛酸、碳酸、肉桂酸、柠檬酸、环拉酸、十二烷基硫酸、乙烷-1,2-二磺酸、乙磺酸、2-羟基乙磺酸、甲酸、富马酸、半乳糖二酸、龙胆酸、葡庚糖酸、葡萄糖酸、葡糖醛酸、谷氨酸、戊二酸、2-氧代-戊二酸、甘油磷酸、乙醇酸、马尿酸、异丁酸、乳酸、乳糖酸、月桂酸、马来酸、苹果酸、丙二酸、扁桃酸、甲磺酸、粘酸、萘-1,5-二磺酸、萘-2-磺酸、1-羟基-2-萘甲酸、烟酸、油酸、乳清酸、草酸、棕榈酸、帕莫酸、丙酸、焦谷氨酸、丙酮酸、水杨酸、4-氨基水杨酸、癸二酸、硬脂酸、琥珀酸、酒石酸、硫氰酸、对甲苯磺酸、三氟乙酸、十一碳烯酸等。

“碱加成盐”是指由向游离酸中添加无机碱或有机碱制备的那些盐。衍生自无机碱的盐包括但不限于，钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐、镁盐、铁盐、锌盐、铜盐、锰盐、铝盐等。衍生自有机碱的盐包括但不限于以下项的盐：伯胺、仲胺和叔胺，取代胺包括天然存在的取代胺、环胺和碱性离子交换树脂，诸如氨、异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、二乙醇胺、乙醇胺、丹醇(deanol)、2-二甲基氨基乙醇、2-二乙基氨基乙醇、二环己胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡因、海巴明(hydrabamine)、胆碱、甜菜碱、苯乙苄胺(benethamine)、二苄乙二胺(benzathine)、乙二胺、葡萄糖胺、甲基葡糖胺、可可碱、三乙醇胺、氨丁三醇、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶、聚胺树脂等。特别优选的有机碱是异丙胺、二乙胺、乙醇胺、三甲胺、二环己胺、胆碱和咖啡因。

结晶可以产生本文所描述的化合物的溶剂化物。本公开的实施方案包括所描述的化合物的所有溶剂化物。如本文所用，术语“溶剂化物”是指包含本公开的化合物的一个或多个分子与溶剂的一个或多个分子的聚集体。溶剂可以是水，在该情况下，溶剂化物可以是水合物。可替代地，溶剂可以是有机溶剂。因此，本公开的化合物可以作为水合物(包括一水合物、二水合物、半水合物、倍半水合物、三水合物、四水合物等)以及相应的溶剂化形式存在。本公开的化合物可以是真溶剂化物，而在其他情况下，本公开的化合物可以仅保留外源性水或其他溶剂或是水加上一些外源性溶剂的混合物。

本公开的化合物(例如，结构I或II的化合物)或其盐、互变异构体或溶剂化物的实施方案可以含有一个或多个不对称中心，并且因此可以产生对映异构体、非对映异构体和其他立体异构形式，其可以根据绝对立体化学被定义为(R)-或(S)-，或对于氨基酸被定义为(D)-或(L)-。本公开的实施方案意在包括所有此类可能的异构体，以及它们的外消旋形式和光学纯形式。光学活性的(+)和(-)、(R)-和(S)-、或(D)-和(L)-异构体可以使用手性合成子或手性试剂制备，或使用常规技术拆分，例如，色谱法和分级结晶。用于制备/分离单个对映异构体的常规技术包括从合适的光学纯前体手性合成或使用例如手性高压液相色谱法(HPLC)拆分外消旋体(或盐或衍生物的外消旋体)。当本文所描述的化合物含有烯属双键或其他几何不对称中心时，并且除非另有说明，否则这些化合物旨在包括E和Z几何异构体两者。同样地，也旨在包括所有互变异构形式。

“立体异构体”是指由通过相同键键合的相同原子组成但具有不可互换的不同三维结构的化合物。本公开设想到了各种立体异构体及其混合物，并且包括“对映异构体”，其是指分子彼此为不可重叠的镜像的两种立体异构体。

“互变异构体”是指质子从分子的一个原子至同一分子的另一个原子转移。本公开包括任何所述化合物的互变异构体。化合物的各种互变异构形式是本领域普通技术人员容易地可获得的。

本文所使用的化学品命名协议和结构图是I.U.P.A.C.命名系统的修改形式，使用ACD/Name Version 9.07软件程序和/或ChemDraw Ultra Version 11.0软件命名程序(CambridgeSoft)。也使用本领域普通技术人员熟悉的通用名称。

如以上所指出的，在本公开的一个实施方案中，提供了在各种分析方法中可用作荧光和/或着色染料的化合物。在其他实施方案中，提供了可用作用于制备可用作荧光和/或着色染料的合成中间体的化合物。一般而言，本公开的实施方案涉及荧光和/或着色部分的二聚体和更高聚合物。荧光和或着色部分通过连接基连接。不希望受理论的束缚，认为连接基帮助在荧光和/或着色部分之间维持足够的空间距离，使得减少或消除分子内淬灭，从而产生具有高摩尔“亮度”(例如，高荧光发射)的染料化合物。

因此，在一些实施方案中，本公开的化合物具有以下结构(I)或(I')之一：

或其立体异构体、盐或互变异构体，其中：

M¹和M²在每次出现时独立地是发色团，前提是M¹是FRET受体并且M²是相应的FRET供体，并且M¹和M²形成FRET对；

L^1a在每次出现时独立地是杂亚烷基或杂亚芳基连接基；

L^1b、L²、L³、L⁵、L⁶和L⁷在每次出现时独立地是任选的亚烷基、亚烯基、亚炔基、杂亚烷基、杂亚烯基或杂亚炔基连接基；

L⁴在每次出现时具有以下结构之一：

其中：

z是1至100的整数；和

*指示与相邻磷原子的键；

R¹和R²各自独立地是H、OH、SH、烷基、烷氧基、烷基醚、杂烷基、-OP(＝R_a)(R_b)R_c、Q、或其受保护形式、或L'；

R³在每次出现时独立地是H、烷基或烷氧基；

R⁴在每次出现时独立地是OH、SH、O-、S-、OR_d或SR_d；

R⁵在每次出现时独立地是氧代、硫代或不存在；

R_a是O或S；

R_b是OH、SH、O^-、S^-、OR_d或SR_d；

R_c是OH、SH、O^-、S^-、OR_d、OL'、SR_d、烷基、烷氧基、杂烷基、杂烷氧基、烷基醚、烷氧基烷基醚、磷酸酯基、硫代磷酸酯基、磷酸烷基、硫代磷酸烷基、磷酸烷基醚或硫代磷酸烷基醚；

R_d是抗衡离子；

Q在每次出现时独立地是包含反应性基团、或其受保护形式，能够与分析物分子、靶向部分、固体载体或互补反应性基团Q′形成共价键的部分；

L'在每次出现时独立地是包含与Q的共价键的连接基、包含与靶向部分的共价键的连接基、包含与分析物分子的共价键的连接基、包含与固体载体的共价键的连接基、包含与固体载体残基的共价键的连接基、包含与核苷的共价键的连接基或包含与另外的结构(I)的化合物的共价键的连接基；

m在每次出现时是一或更大的整数；

q在每次出现时是一或更大的整数；

w在至少一次出现时是一或更大的整数，前提是当n是1的整数时，q是大于w的整数；和

n是一或更大的整数。

在一些实施方案中，L^1a的至少一次出现是任选地取代的5-7元杂亚芳基连接基。在一些更具体的实施方案中，L^1a在每次出现时独立地是任选地取代的5-7元杂亚芳基连接基。在一些实施方案中，L^1a是6元杂亚芳基。在一些实施方案中，L^1a包含两个N原子和两个O原子。在某些实施方案中，L^1a在每次出现时是取代的。在一些相关实施方案中，L^1a例如被氧代、烷基(例如，甲基、乙基等)或其组合取代。在更具体的实施方案中，L^1a在每次出现时被至少一个氧代取代。在一些实施方案中，L^1a具有以下结构之一：

在一些实施方案中，本公开的化合物具有以下结构(IA)或(IA’)之一：

或其立体异构体、盐或互变异构体。

在一些实施方案中，L⁴的z是1至30，例如3至8、15至30、或22至26的整数。在一些实施方案中，z是22、23、24、25、或26。在一些实施方案中，z是3、4、5、6、7、或8。在一些具体实施方案中，z是6。

在一些实施方案中，当q是整数2时，L⁴具有对于第一次出现的和对于第二次出现的在一些实施方案中，当q是整数3时，L⁴具有对于第一次出现的对于第二次出现的和对于第三次出现的

在一些实施方案中，本公开的化合物具有以下结构(IB)或(IB’)之一：

或其立体异构体、盐或互变异构体。

在一些实施方案中，L⁵或L⁶的至少一次出现是亚烷基。在一些实施方案中，L⁵和L⁶在每次出现时独立地是C₁-C₆亚烷基、C₂-C₆亚烯基、或C₂-C₆亚炔基。例如，在一些实施方案中，L⁵和L⁶在每次出现时独立地是C₁-C₆亚烷基。

在一些实施方案中，L³的至少一次出现是亚烷基。在一些实施方案中，L³在每次出现时独立地是C₁-C₆亚烷基、C₂-C₆亚烯基、或C₂-C₆亚炔基。例如，在一些实施方案中，L³在每次出现时独立地是C₁-C₆亚烷基。

在一些实施方案中，本公开的化合物具有以下结构(IC)或(IC’)之一：

或其立体异构体、盐或互变异构体，其中y¹、y²和y³在每次出现时独立地是1至6的整数。在一些实施方案中，y¹是整数1、2、3、4、5、或6。在一些实施方案中，y²是整数1、2、3、4、5、或6。在一些实施方案中，y³是整数1、2、3、4、5、或6。在一些更具体的实施方案中，y¹是整数1。在一些其他的具体实施方案中，y²是整数1。在一些其他的具体实施方案中，y³是整数1。

结构(I)的化合物中的各种连接基和取代基(例如，R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、L^1a、L^1b、L²、L³、L⁴、L⁵、L⁶、L⁷、M¹、M²、R_c和Q)任选地被再一个取代基取代。例如，在一些实施方案中，选择任选的取代基以使结构(I)的化合物的水溶性或其他特性优化。在某些实施方案中，结构(I)的化合物中每个烷基、烷氧基、烷基醚、烷氧基烷基醚、磷酸烷基、硫代磷酸烷基、磷酸烷基醚和硫代磷酸烷基醚任选地被一个或多个选自由羟基、烷氧基、烷基醚、烷氧基烷基醚、硫氢基、氨基、烷基氨基、羧基、磷酸酯基、硫代磷酸酯基、磷酸烷基、硫代磷酸烷基、磷酸烷基醚和硫代磷酸烷基醚组成的组的取代基取代。在某些实施方案中，任选的取代基是-OP(＝R_a)(R_b)R_c，其中R_a、R_b和R_c如对于结构(I)的化合物所定义。

任选的连接基L^1b可以用作M¹部分与化合物的其余部分的附接点。例如，在一些实施方案中，制备结构(I)的化合物的合成前体，并且使用本领域中已知的任何数量的简易方法，例如称为“点击化学”的方法将M¹部分附接至合成前体。出于该目的，快速且基本上不可逆的任何反应可以用于将M¹附接至合成前体以形成结构(I)的化合物。示例性反应包括叠氮化物和炔烃的铜催化反应以形成三唑(Huisgen 1,3-偶极环加成)，二烯和亲二烯体的反应(狄尔斯-阿尔德(Diels-Alder))，张力促进的炔烃-硝酮环加成，张力烯烃与叠氮化物、四嗪或四唑的反应，烯烃和叠氮化物[3+2]环加成，烯烃和四嗪逆需求狄尔斯-阿尔德反应(Diels-Alder)，烯烃和四唑光反应以及各种置换反应，诸如通过对亲电原子的亲核攻击进行的离去基团的置换。示例性置换反应包括胺与以下的反应：活化酯；N-羟基琥珀酰亚胺酯；异氰酸酯；异硫氰酸酯等。在一些实施方案中，形成L^1b的反应可以在水性环境中进行。

因此，在一些实施方案中，L^1b在每次出现时是包含能够通过两个互补反应性基团的反应形成的官能团(例如作为前述“点击”反应之一的产物的官能团)的连接基。在各种实施方案中，对于L^1b的至少一次出现，官能团可以通过醛、肟、腙、炔烃、胺、叠氮化物、酰基叠氮化物、酰卤、腈、硝酮、硫氢基、二硫化物、磺酰卤化物、异硫氰酸酯、亚氨酸酯、活化酯(例如，N-羟基琥珀酰亚胺酯)、酮、α,β-不饱和羰基、烯烃、马来酰亚胺、α-卤代酰亚胺、环氧化物、氮丙啶、四嗪、四唑、膦、生物素或硫杂丙环官能团与互补反应性基团的反应形成。例如，胺与N-羟基琥珀酰亚胺酯或异硫氰酸酯的反应。

在其他实施方案中，对于L^1b的至少一次出现，官能团可以通过炔烃和叠氮化物的反应形成。在其他实施方案中，对于L^1b的至少一次出现，官能团可以通过胺(例如，伯胺)和N-羟基琥珀酰亚胺酯或异硫氰酸酯的反应形成。

在更多实施方案中，对于L^1b的至少一次出现，官能团包含烯烃、酯、酰胺、硫酯、二硫化物、碳环、杂环或杂芳基。在更多实施方案中，对于L^1b的至少一次出现，官能团包含烯烃、酯、酰胺、硫酯、硫脲、二硫化物、碳环、杂环或杂芳基。在其他实施方案中，官能团包含酰胺或硫脲。在一些更具体的实施方案中，对于L^1b的至少一次出现，L^1b是包含三唑基官能团的连接基。而在其他实施方案中，对于L^1b的至少一次出现，L^1b是包含酰胺或硫脲官能团的连接基。

在结构(I)的还其他不同实施方案中，L^1b在每次出现时独立地是亚烷基或杂亚烷基连接基。在一些实施方案中，L^1b的至少一次出现是杂亚烷基。

在其他实施方案中，L^1b的至少一次出现包含通过醛、肟、腙、炔烃、胺、叠氮化物、酰基叠氮化物、酰卤、腈、硝酮、硫氢基、二硫化物、磺酰卤化物、异硫氰酸酯、亚氨酸酯、活化酯、酮、α,β-不饱和羰基、烯烃、马来酰亚胺、α-卤代酰亚胺、环氧化物、氮丙啶、四嗪、四唑、膦、生物素、或硫杂丙环与互补反应性基团的反应形成的官能团。

在其他实施方案中，L^1b的至少一次出现包含由炔烃和叠氮化物的反应形成的官能团。例如，L^1b的至少一次出现是包含三唑基官能团的连接基。

在还其他实施方案中，对于L^1b-M¹、或L⁷-M²的至少一次出现具有以下结构之一：

其中L^1c和L^1d各自独立地是任选的连接基。

在不同的实施方案中，对于L^1b-M¹、或L⁷-M²的至少一次出现具有以下结构之一：

其中L^1c和L^1d各自独立地是任选的连接基。

在前述的各种实施方案中，L^1c或L^1d、或两者不存在。在其他实施方案中，L^1c或L^1d、或两者存在。在一些实施方案中，当存在时，L^c和L^d各自独立地是亚烷基或杂亚烷基。例如，在一些实施方案中，L^c和L^d独立地具有以下结构之一：

在其他实施方案中，L^1b包含以下结构之一：

其中

a、b、c、d和e各自独立地是范围从1至6的整数。在一些实施方案中，a、b、c、d、或e是整数1。在一些实施方案中，a、b、c、d、或e是整数2。在一些实施方案中，a、b、c、d、或e是整数3。在一些实施方案中，a、b、c、d、或e是整数4。在一些实施方案中，a、b、c、d、或e是整数5。在一些实施方案中，a、b、c、d、或e是整数6。在一些具体实施方案中，a是整数6并且d是整数4。

在一些实施方案中，结构(I)的M¹-L^1b的至少一次出现具有以下结构之一：

在一些实施方案中，结构(I)的M¹-L^1b的每次出现具有以下结构之一：

在一些实施方案中，L⁷的至少一次出现是任选地取代的杂亚烷基连接基。在其他实施方案中，L⁷在每次出现时独立地是任选地取代的杂亚烷基。在一些实施方案中，L⁷包含酰胺官能团。例如，在一些实施方案中，L⁷的至少一次出现具有以下结构之一：

在其他实施方案中，L⁷的每次出现具有以下结构之一：

在一些具体实施方案中，L⁷的至少一次出现具有以下结构之一：

在一些其他具体实施方案中，L⁷的每次出现具有以下结构之一：

在一些实施方案中，R³的至少一次出现是H。

在结构(I)、(I')、(IA)、(IA’)、(IB)、(IB’)、(IC)、或(IC’)的化合物的还其他实施方案中，R⁵在每次出现时独立地是OH、O^-或OR_d。应理解，“OR_d”和“SR_d”旨在是指与阳离子缔合的O^-和S^-。例如，磷酸酯基团的二钠盐可以被表示为：

其中R_d是钠(Na⁺)。

在结构(I)、(I')、(IA)、(IA’)、(IB)、(IB’)、(IC)、或(IC’)的化合物的其他实施方案中，R⁴的至少一次出现是氧代。在结构(I)、(I')、(IA)、(IA’)、(IB)、(IB’)、(IC)、或(IC’)的任何化合物的其他实施方案中，R⁴在每次出现时是氧代。

在其他各种实施方案中，R¹和R²各自独立地是OH或-OP(＝R_a)(R_b)R_c。在一些不同的实施方案中，R¹或R²是OH或-OP(＝R_a)(R_b)R_c，并且R¹或R²中的另一个是Q或包含与Q的共价键的连接基。

在结构(I)、(I')、(IA)、(IA’)、(IB)、(IB’)、(IC)、或(IC’)的前述化合物中任一项的还更不同的实施方案中，R¹和R²各自独立地是-OP(＝R_a)(R_b)R_c。在这些实施方案的一些中，R_c是OL'。

在其他实施方案中，R¹和R²各自独立地是-OP(＝R_a)(R_b)OL'，并且L'是与以下项的亚烷基或杂亚烷基连接基：Q、靶向部分、分析物(例如，分析物分子)、固体载体、固体载体残基、核苷或另外的结构(I)、(I')、(IA)、(IA’)、(IB)、(IB’)、(IC)、或(IC’)的化合物。

在一些实施方案中，分析物分子是核酸、氨基酸或其聚合物。在一些其他实施方案中，分析物分子是酶、受体、受体配体、抗体、糖蛋白、适配体或朊病毒。

在一些实施方案中，靶向部分是抗体或细胞表面受体拮抗剂。在一些其他实施方案中，固体载体是聚合物珠粒或非聚合物珠粒。

连接基L'可以是适用于将Q、靶向部分、分析物(例如，分析物分子)、固体载体、固体载体残基、核苷或另外的结构(I)、(I')、(IA)、(IA’)、(IB)、(IB’)、(IC)、或(IC’)的化合物附接至结构(I)、(I')、(IA)、(IA’)、(IB)、(IB’)、(IC)、或(IC’)的化合物的任何连接基。有利地，某些实施方案包括使用所选择的L'部分来增加或优化化合物的水溶性。在某些实施方案中，L'是杂亚烷基部分。在一些其他某些实施方案中，L'包含亚烷基氧基或磷酸二酯部分、或其组合。

在某些实施方案中，L'具有以下结构：

其中：

m”和n”独立地是1至10的整数；

R^e是H、电子对或抗衡离子；

L”是R^e或直接键或与以下项的键：Q、靶向部分、分析物(例如，分析物分子)、固体载体、固体载体残基、核苷或另外的结构(I)、(I')、(IA)、(IA’)、(IB)、(IB’)、(IC)、或(IC’)的化合物。

在一些实施方案中，m”是4至10的整数，例如4、6或10。在其他实施方案中，n”是3至6的整数，例如3、4、5或6。在一些实施方案中，n”是18-28的整数，例如，21-23。

在一些其他实施方案中，L”是亚烷基、亚烷基杂亚环基、亚烷基杂亚环基亚烷基、亚烷基亚环基、亚烷基亚环基亚烷基、杂亚烷基、杂亚烷基杂亚环基、杂亚烷基杂亚环基杂亚烷基、杂亚烷基亚环基、或杂亚烷基亚环基杂亚烷基部分。在一些其他某些实施方案中，L”包含亚烷基氧基、磷酸二酯部分、硫氢基、二硫化物或马来酰亚胺部分或其组合。

在前述实施方案的某些中，靶向部分是抗体或细胞表面受体拮抗剂。

在一些实施方案中，抗体包括CD3、CD4、FoxP3、TNF-α、IFN-γ、clone 4S.B3、clone206D、CD8α(D8A8Y)Rabbit mAb、Vimentin(D21H3)Rabbit mAb、phospho-RB-Ser608、phospho-RB-Ser612、phospho-RB-Ser780、phospho-RB-Ser795、phospho-RB-Ser807、或phospho-RB-Ser811、anti-human IL17A、整合素αE/CD103、CCR9、或MOPC-21。

在结构(I)、(I')、(IA)、(IA’)、(IB)、(IB’)、(IC)、或(IC’)的前述化合物中任一项的其他更具体的实施方案中，R¹或R²具有以下结构之一：

在结构(I)、(I')、(IA)、(IA’)、(IB)、(IB’)、(IC)、或(IC’)的前述化合物中任一项的其他更具体的实施方案中，R¹或R²具有以下结构之一：

结构(I)、(I')、(IA)、(IA’)、(IB)、(IB’)、(IC)、或(IC’)的化合物的某些实施方案可以根据类似于本领域中已知的用于制备寡核苷酸的那些的固相合成方法来制备。因此，在一些实施方案中，L'是与固体载体、固体载体残基或核苷的键。包含活化的脱氧胸苷(dT)基团的固体载体是容易地可得的，并且在一些实施方案中可以被用作用于制备结构(I)、(I')、(IA)、(IA’)、(IB)、(IB’)、(IC)、或(IC’)的化合物的起始材料。因此，在一些实施方案中，R¹或R²具有以下结构：

本领域技术人员将理解，仅为了易于合成和经济效率，以上所描绘的dT基团被包括并且不是必需的。可以使用其他固体载体并且将导致不同的核苷或固体载体残基存在于L'上，或核苷或固体载体残基可以在合成后去除或修饰。

在还其他实施方案中，Q在每次出现时独立地是包含能够与分析物分子或固体载体形成共价键的反应性基团的部分。在其他实施方案中，Q在每次出现时独立地是包含能够与互补反应性基团Q′形成共价键的反应性基团的部分。例如，在一些实施方案中，Q′存在于另外的结构(I)、(I')、(IA)、(IA’)、(IB)、(IB’)、(IC)、或(IC’)的化合物上(例如，在R²或R³位置)，并且Q和Q′包含互补反应性基团，使得结构(I)的化合物和另外的结构(I)、(I')、(IA)、(IA’)、(IB)、(IB’)、(IC)、或(IC’)的化合物的反应产生结构(I)、(I')、(IA)、(IA’)、(IB)、(IB’)、(IC)、或(IC’)的化合物的共价结合的二聚体。结构(I)、(I')、(IA)、(IA’)、(IB)、(IB’)、(IC)、或(IC’)的多聚体化合物也可以以类似的方式制备并且包括在本公开的实施方案的范围内。

Q基团的类型和Q基团与结构(I)、(I')、(IA)、(IA’)、(IB)、(IB’)、(IC)、或(IC’)的化合物的其余部分的连接性不受限制，前提是Q包含具有用于形成期望键的适当反应性的部分。

在某些实施方案中，Q是在水性条件下不易水解，但具有足够的反应性以与分析物分子或固体载体(例如，胺、叠氮化物或炔烃)上的相应基团形成键的部分。

结构(I)、(I')、(IA)、(IA’)、(IB)、(IB’)、(IC)、或(IC’)的化合物的某些实施方案包含生物缀合领域中通常采用的Q基团。例如，在一些实施方案中，Q包含亲核反应性基团、亲电反应性基团或环加成反应性基团。在一些更具体的实施方案中，Q包含硫氢基、二硫化物、活化酯、异硫氰酸酯、叠氮化物、炔烃、烯烃、二烯、亲二烯体、酸卤化物、磺酰基卤化物、膦、α-卤代酰胺、生物素、氨基或马来酰亚胺官能团。在一些实施方案中，活化酯是N-琥珀酰亚胺酯、亚氨酸酯或多氟苯基酯。在其他实施方案中，炔烃是烷基叠氮化物或酰基叠氮化物。

Q基团可以以受保护形式方便地提供以增加储存稳定性或其他期望特性，并且然后在适当时间去除保护基团用于与例如靶向部分或分析物缀合。因此，Q基团包括反应性基团的“受保护形式”，包括以上和以下表1中所描述的反应性基团中的任一种。Q的“受保护形式”是指在相对于Q的预定反应条件下具有更低反应性的部分，但是其可以在优选地不降解或不与结构(I)、(I')、(IA)、(IA’)、(IB)、(IB’)、(IC)、或(IC’)的化合物的其他部分反应的条件下转化为Q。本领域技术人员可以基于特定的Q和期望的最终用途和储存条件得出Q的适当的受保护形式。例如，当Q是SH时，Q的受保护形式包括二硫化物，其可以使用通常已知的技术和试剂被还原以示出SH部分。

示例性Q部分在以下表I中提供。

表1.示例性Q部分

应当注意的是，在一些实施方案中，其中Q是SH，SH部分将倾向于与例如另一种结构(I)、(I')、(IA)、(IA’)、(IB)、(IB’)、(IC)、或(IC’)的化合物上的另一个硫氢基形成二硫键。因此，一些实施方案包括结构(I)、(I')、(IA)、(IA’)、(IB)、(IB’)、(IC)、或(IC’)的化合物，其呈二硫化物二聚体的形式，二硫键衍生自SH Q基团。

在某些实施方案的范围内还包括结构(I)的化合物，其中R¹和R²中的一者或两者包含与另外的结构(I)的化合物的键。例如，其中R¹和R²中的一者或两者是-OP(＝R_a)(R_b)R_c，并且Rc是OL'，并且L'是包含与另外的结构(I)的化合物的共价键的连接基。此类化合物可以通过制备具有例如约10个“M”部分(即，n＝9)并且具有用于与结构(I)的第二化合物上的互补Q'基团反应的适当“Q”的结构(I)的第一化合物来制备。以该方式，可以制备具有任何数量的“M”部分(例如100个或更多个)的结构(I)的化合物而无需使每个单体顺序地偶联。

m的值是可以基于期望的荧光和/或颜色强度来选择的另一个变量。在一些实施方案中，m在每次出现时是一或更大的整数。在一些实施方案中，m在每次出现时独立地是1至10的整数。在其他实施方案中，m在每次出现时独立地是1至6的整数，例如1、2、3、4、5、或6。在一些具体实施方案中，m是1的整数。在一些实施方案中，m是2的整数。在一些实施方案中，m是3的整数。在一些实施方案中，m是4的整数。在一些实施方案中，m是5的整数。在一些实施方案中，m是6的整数。

荧光强度也可以通过选择不同的n值来调整。在一些实施方案中，n在每次出现时是一或更大的整数。在某些实施方案中，n是1至100的整数。在其他实施方案中，n是1至10的整数。在一些实施方案中，n是1。在一些实施方案中，n是2。在一些实施方案中，n是3。在一些实施方案中，n是4。在一些实施方案中，n是5。在一些实施方案中，n是6。在一些实施方案中，n是7。在一些实施方案中，n是8。在一些实施方案中，n是9。在一些实施方案中，n是10。

q的值是可以基于期望的荧光和/或颜色强度来选择的另一个变量。在一些实施方案中，q在每次出现时是一或更大的整数。在一些实施方案中，q在每次出现时独立地是1至5的整数。例如，在一些实施方案中，q是1。在一些实施方案中，q是2。在一些实施方案中，q是3。在一些实施方案中，q是4。在一些实施方案中，q是5。

w的值是可以基于期望的荧光和/或颜色强度来选择的另一个变量。在一些实施方案中，w在每次出现时是一或更大的整数，前提是当n是1的整数时，q是大于w的整数。在一些实施方案中，w是1至10的整数。在一些实施方案中，w是1至5的整数。在一些实施方案中，w是1的整数。在一些实施方案中，w是2的整数。在一些实施方案中，w是3的整数。在一些实施方案中，w是4的整数。在一些实施方案中，w是5的整数。

q、w、n和m的值是可以基于期望的荧光和/或颜色强度来选择的变量。在一些更具体的实施方案中，q是2的整数，w是1的整数，n是1的整数，并且m是整数1。在一些其他的更具体的实施方案中，q是3的整数，w是1的整数，n是1的整数，并且m是整数1。在一些其他的更具体的实施方案中，q是1的整数，w是1的整数，n是2的整数，并且m在每次出现时是整数1。在一些其他更具体的实施方案中，q对于第一次出现是1的整数并且对于第二次出现是2的整数，w在每次出现时是1的整数，n是2的整数，并且m在每次出现时是整数1。在一些其他的更具体的实施方案中，q在每次出现时是2的整数，w在每次出现时是1的整数，n是2的整数，并且m在每次出现时是整数1。在一些其他更具体的实施方案中，q对于第一次出现是1的整数并且对于第二次出现是2的整数，w在每次出现时是1的整数，n是2的整数，并且m在每次出现时是整数1。

M¹和M²基于期望的光学特性，例如基于期望的颜色和/或荧光发射波长来选择。在一些实施方案中，M¹和M²在每次出现时是不同的。例如，在一些实施方案中，每个M¹和M²是不同的，并且选择不同的M¹和M²部分以具有用于荧光共振能量转移(FRET)方法中的吸收和/或发射。例如，在此类实施方案中，选择不同的M部分以形成FRET供体-受体对，使得在一个波长下的辐射吸收通过FRET机制导致在不同波长下的辐射发射。在该方面，M¹和M²部分形成FRET对。示例性M¹和M²部分可以由本领域普通技术人员基于期望的最终用途适当地选择。用于FRET方法的示例性M¹和M²部分包括荧光素和Alexa594染料。在一些其他实施方案中，用于FRET方法的M¹和M²部分包括荧光素和Alexa555染料。在一些其他实施方案中，用于FRET方法的M¹和M²部分包括荧光素和Alexa568染料。在一些其他实施方案中，用于FRET方法的M¹和M²部分包括荧光素和Alexa532染料。在一些其他实施方案中，用于FRET方法的M¹和M²部分包括荧光素和Alexa546染料。在一些其他实施方案中，用于FRET方法的M¹和M²部分包括Cy3和Alexa680染料。

M¹和M²可以从M¹和M²上的任何位置(即，原子)附接至分子的其余部分。本领域技术人员将认识到用于将M¹和M²附接至分子的其余部分的手段。

在一些实施方案中，M¹和M²是荧光或着色部分。可以使用任何荧光和/或着色部分，可以使用例如本领域中已知的并且典型地用于比色、UV、和/或荧光测定中的那些。可用于本公开的各种实施方案中的M部分的实例包括但不限于：呫吨衍生物(例如，荧光素、罗丹明、俄勒冈绿(Oregon green)、伊红或得克萨斯红(Texas red))；菁衍生物(例如，菁、吲哚碳菁、氧杂碳菁(oxacarboL1cyanine)、噻碳菁或部花菁)；方酸菁(squaraine)衍生物和环取代的方酸菁，包括Seta、SeTau和Square染料；萘衍生物(例如，丹磺酰基和2-丙酰基-6-二甲基氨基萘(prodan)衍生物)；香豆素衍生物；噁二唑衍生物(例如，吡啶基噁唑、硝基苯并噁二唑或苯并噁二唑)；蒽衍生物(例如，蒽醌，包括DRAQ5、DRAQ7和CyTRAK Orange)；芘衍生物诸如cascade蓝；噁嗪衍生物(例如，尼罗红、尼罗蓝、甲酚紫、噁嗪170)；吖啶衍生物(例如，原黄素、吖啶橙、吖啶黄)；芳基甲川衍生物：金胺、结晶紫、孔雀石绿；和四吡咯衍生物(例如，卟吩、酞菁或胆红素)。其他示例性M部分包括：菁染料、黄原酸酯染料(例如，Hex、Vic、Nedd、Joe或Tet)；Yakima黄；Redmond红；tamra；得克萨斯红和Alexa染料，诸如Alexa350、Alexa430、Alexa488、Alexa532、Alexa546、Alexa555、Alexa568、Alexa594、Alexa633、Alexa647、Alexa660、Alexa680、或Alexa750。

本公开的化合物发现作为具有高量子效率的荧光和/或着色染料的实用性。这部分地是由于供体部分(例如，M¹)的发射光谱与受体部分(例如，M²)的吸收或激发光谱的重叠。因此，一些实施方案提供了具有300至900nm的激发最大值和350至900nm的发射最大值的FRET供体。例如，在一些实施方案中，FRET供体包括具有311nm激发最大值和375nm发射最大值的2,5-二苯基噁唑。在另一个实例中，在一些实施方案中，FRET供体包括具有333nm激发最大值和518nm发射最大值的丹磺酰基荧光团。在又另一个实例中，在一些实施方案中，FRET供体Alexa350具有346nm激发最大值和442nm发射最大值。在又另外的实例中，在一些实施方案中，FRET供体包括具有340nm激发最大值和376nm发射最大值的芘。在又另外的实例中，在一些实施方案中，FRET供体包括具有437nm激发最大值和477nm发射最大值的香豆素343。在又另一个实例中，在一些实施方案中，FRET供体Alexa430具有430nm激发最大值和539nm发射最大值。在又另一个实例中，在一些实施方案中，FRET供体5-羧基荧光素(FAM)具有495nm激发最大值和519nm发射最大值。在又另一个实例中，在一些实施方案中，FRET供体包括具有550nm激发最大值和615nm发射最大值的氰化物染料(CY3)。在又另一个实例中，在一些实施方案中，FRET供体Alexa555具有555nm激发最大值和572nm发射最大值。在又另一个实例中，在一些实施方案中，FRET供体Alexa568具有578nm激发最大值和603nm发射最大值。在又另一个实例中，在一些实施方案中，FRET供体Alexa633具有630nm激发最大值和650nm发射最大值。在又另一个实例中，在一些实施方案中，FRET供体Alexa647具有650nm激发最大值和668nm发射最大值。在又另一个实例中，在一些实施方案中，FRET供体MB800具有774nm激发最大值和798nm发射最大值。在又另一个实例中，在一些实施方案中，FRET供体Alexa800具有801nm激发最大值和814nm发射最大值。在又另一个实例中，在一些实施方案中，FRET供体Alexa810具有812nm激发最大值和826nm发射最大值。在又另一个实例中，在一些实施方案中，FRET供体CF820具有820nm激发最大值和830nm发射最大值。在又另一个实例中，在一些实施方案中，FRET供体820具有820nm激发最大值和849nm发射最大值。在又另一个实例中，在一些实施方案中，FRET供体PromoFluor 840/840具有838nm激发最大值和880nm发射最大值。在又另一个实例中，在一些实施方案中，FRET供体860具有852nm激发最大值和877nm发射最大值。

在一些实施方案中，提供了具有400至800nm的激发最大值和500至500nm的发射最大值的FRET受体。例如，在一些实施方案中，FRET受体5-羧基荧光素(FAM)具有495nm激发最大值和519nm发射最大值。在另一个实例中，在一些实施方案中，FRET受体包括具有548nm激发最大值和566nm发射最大值的Alexa543。在又另一个实例中，在一些实施方案中，FRET受体包括具有532nm激发最大值和554nm发射最大值的Alexa532。在又另一个实例中，在一些实施方案中，FRET受体包括具有554nm激发最大值和570nm发射最大值的Alexa546。在又另一个实例中，在一些实施方案中，FRET受体包括具有555nm激发最大值和572nm发射最大值的Alexa555。在又另一个实例中，在一些实施方案中，FRET受体包括具有578nm激发最大值和603nm发射最大值的Alexa568。在又另一个实例中，在一些实施方案中，FRET受体包括具有590nm激发最大值和617nm发射最大值的Alexa594。在又另一个实例中，在一些实施方案中，FRET受体包括具有630nm激发最大值和650nm发射最大值的Alexa633。在又另一个实例中，在一些实施方案中，FRET受体包括具有663nm激发最大值和690nm发射最大值的Alexa660。在又另一个实例中，在一些实施方案中，FRET受体包括具有650nm激发最大值和668nm发射最大值的Alexa647。在又另一个实例中，在一些实施方案中，FRET受体包括具有679nm激发最大值和702nm发射最大值的Alexa680。在又另一个实例中，在一些实施方案中，FRET受体包括具有756nm激发最大值和776nm发射最大值的Alexa750。

本公开的实施方案允许FRET供体/受体对的各种组合以增强作为传感器的亮度。例如，在一些实施方案中，FRET供体/受体对是作为FRET供体的2,5-二苯基噁唑和作为FRET受体的Alexa430。在另一个实例中，在一些实施方案中，FRET供体/受体对是作为FRET供体的丹磺酰基荧光团和作为FRET受体的Alexa543或Alexa532。在又另一个实例中，在一些实施方案中，FRET供体/受体对是作为FRET供体的Alexa350和作为FRET受体的Alexa430。在又另一个实例中，在一些实施方案中，FRET供体/受体对是作为FRET供体的芘和作为FRET受体的Alexa430。在又另一个实例中，在一些实施方案中，FRET供体/受体对是作为FRET供体的香豆素343和作为FRET受体的FAM。在又另一个实例中，在一些实施方案中，FRET供体/受体对是作为FRET供体的Alexa430和作为FRET受体的Alexa543、Alexa532、Alexa546、Alexa555、Alexa568、或Alexa594。在又另一个实例中，在一些实施方案中，FRET供体/受体对是作为FRET供体的FAM和作为FRET受体的Alexa532、Alexa555、Alexa546、Alexa568、或Alexa594。在又另一个实例中，在一些实施方案中，FRET供体/受体对是作为FRET供体的CY3和作为FRET受体的Alexa532、Alexa633。在又另一个实例中，在一些实施方案中，FRET供体/受体对是作为FRET供体的Alexa555和作为FRET受体的Alexa633或Alexa660。在又另一个实例中，在一些实施方案中，FRET供体/受体对是作为FRET供体的Alexa568和作为FRET受体的Alexa633、Alexa647、Alexa660、或Alexa680。在又另一个实例中，在一些实施方案中，FRET供体/受体对是作为FRET供体的Alexa633和作为FRET受体的Alexa680。在又另一个实例中，在一些实施方案中，FRET供体/受体对是作为FRET供体的Alexa647和作为FRET受体的Alexa680或Alexa750。

在前述中任一项的还其他实施方案中，M¹和M²包含三个或更多个芳基或杂芳基环、或其组合，例如四个或更多个芳基或杂芳基环、或其组合，或甚至五个或更多个芳基或杂芳基环、或其组合。在一些实施方案中，M¹和M²包含六个芳基或杂芳基环、或其组合。在另外的实施方案中，这些环是稠合的。例如，在一些实施方案中，M¹和M²包含三个或更多个稠合环、四个或更多个稠合环、五个或更多个稠合环、或甚至六个或更多个稠合环。

在一些实施方案中，M¹或M²是环状的。例如，在一些实施方案中，M¹或M²是碳环的。在其他实施方案中，M¹或M²是杂环的。在前述的还其他实施方案中，M¹或M²在每次出现时独立地包含芳基部分。在这些实施方案的一些中，芳基部分是多环的。在其他更具体的实例中，芳基部分是稠合多环芳基部分，例如其可以包含至少3个、至少4个、或甚至多于4个芳基环。

在结构(I)、(I')、(IA)、(IA’)、(IB)、(IB’)、(IC)、或(IC’)的前述化合物中任一项的其他实施方案中，M¹或M²在每次出现时独立地包含至少一个杂原子。例如，在一些实施方案中，杂原子是氮、氧或硫。

在前述中任一项的还更多实施方案中，M¹或M²在每次出现时独立地包含至少一个取代基。例如，在一些实施方案中，取代基是氟、氯、溴、碘、氨基、烷基氨基、芳基氨基、羟基、硫氢基、烷氧基、芳氧基、苯基、芳基、甲基、乙基、丙基、丁基、异丙基、叔丁基、羧基、磺酸酯、酰胺、或甲酰基。

在前述的一些甚至更具体的实施方案中，M¹或M²在每次出现时独立地是二甲基氨基茋、喹吖啶酮、氟苯基-二甲基-BODIPY、双-氟苯基-BODIPY、吖啶、苐(terrylene)、联六苯、卟啉、苯并芘、(氟苯基-二甲基-二氟硼-二氮杂-引达省)苯基、(双-氟苯基-二氟硼-二氮杂-引达省)苯基、联四苯、联苯并噻唑、三苯并噻唑、联萘、联蒽、方酸菁、方酸菁鎓(squarylium)、9,10-乙炔基蒽或三萘基部分。在其他实施方案中，M¹或M²在每次出现时独立地是对三联苯、苝、偶氮苯、吩嗪、菲咯啉、吖啶、噻吨(thioxanthrene)、红荧烯、蔻、菁、苝酰亚胺、或苝酰胺或其衍生物。在还更多实施方案中，M¹或M²在每次出现时独立地是香豆素染料、试卤灵染料、二吡咯亚甲基二氟化硼染料、钌联吡啶染料、能量转移染料、噻唑橙染料、聚甲炔、或N-芳基-1,8-萘二甲酰亚胺染料。

在前述中任一项的还更多实施方案中，每个M¹或M²是不同的。在还更多实施方案中，一个或多个M¹或M²是相同的并且一个或多个M¹或M²是不同的。

在一些实施方案中，M¹或M²是芘、苝、苝单酰亚胺、5-羧基荧光素(FAM)、6-FAM、6-FITC、5-FITC、或其衍生物。

在一些实施方案中，M¹和M²在一次或多次出现时独立地包括包含至少四个稠合环的稠合多环芳基或杂芳基部分。在一些实施方案中，M¹或M¹-L^1b在每次出现时独立地具有以下结构之一：

在一些实施方案中，M²在每次出现时独立地具有以下结构之一：

尽管包含羧酸基团的M¹或M²部分呈以上述阴离子形式(CO₂ ^-)描绘，但本领域技术人员将理解，这将取决于pH而变化，并且质子化形式(CO₂H)包括在各种实施方案中。

在一些具体实施方案中，结构(I)、(I')、(IA)、(IA’)、(IB)、(IB’)、(IC)、或(IC’)的化合物是选自表2的化合物。表2中的化合物根据实施例中阐述的程序来制备并且通过质谱法确认它们的身份。

如表2和整个本公开中所用，除非另有说明，否则R¹、R²、z和n具有对于结构(I)、(I')、(IA)、(IA’)、(IB)、(IB’)、(IC)、或(IC’)的化合物所提供的定义。

如以上表2和整个本公开中所用，M¹和M²在每次出现时独立地是如以上所描述的荧光或着色部分。M¹和M²之一是FRET供体，并且M¹和M²中的另一个是FRET受体。在一些实施方案中，M¹是Alexa594(AF594)并且M²是FAM。在一些实施方案中，M¹是Alexa555(AF555)并且M²是FAM。在一些实施方案中，M¹是Alexa568(AF568)并且M²是FAM。在一些实施方案中，M¹是Alexa680(AF680)并且M²是Cy3。

FAM是指具有以下结构之一的部分：

AF594是指具有以下结构的部分：

AF555是指具有以下结构的部分：

AF568是指具有以下结构的部分：

AF680是指具有以下结构之一的部分：

Cy3是指具有以下结构的部分：

如以上表2和整个本公开中所用，dT是指以下结构：

其中：

R是H或直接键。

FRET供体-受体的比率是可以基于期望的荧光和/或颜色强度来选择的另一个变量。在一些实施方案中，FRET受体M¹与相应的FRET供体M²的比率是1:1。换言之，对于每一个FRET供体M²，聚合物染料包含一个FRET受体M¹。在一些实施方案中，FRET受体M¹与相应的FRET供体M²的比率是1:2。换言之，对于每两个FRET供体M²，聚合物染料包含一个FRET受体M¹。在一些实施方案中，FRET受体M¹与相应的FRET供体M²的比率是1:3。换言之，对于每三个FRET供体M²，聚合物染料包含一个FRET受体M¹。在一些实施方案中，FRET受体M¹与相应的FRET供体M²的比率是2:3。换言之，对于每三个FRET供体M²，聚合物染料包含两个FRET受体M¹。

一些实施方案包括前述化合物中任一项，包括缀合至靶向部分(诸如抗体)的表2中所提供的特定化合物。在一些实施方案中，抗体包括CD3、CD4、FoxP3、TNF-α、IFN-γ、clone4S.B3、clone 206D、CD8α(D8A8Y)Rabbit mAb、Vimentin(D21H3)Rabbit mAb、phospho-RB-Ser608、phospho-RB-Ser612、phospho-RB-Ser780、phospho-RB-Ser795、phospho-RB-Ser807、或phospho-RB-Ser811、anti-human IL17A、整合素αE/CD103、CCR9、或MOPC-21。

本公开通常提供相对于早期已知化合物具有增加的荧光发射的化合物。因此，某些实施方案涉及包含Y个荧光部分M的荧光化合物，其中荧光化合物具有在用预定波长的紫外光激发时比单个M部分在用相同波长的紫外光激发时的峰值荧光发射大Y倍的至少85％的峰值荧光发射，并且其中Y是2或更大的整数。荧光化合物包括用光(诸如紫外光)激发时发射荧光信号的化合物。

还提供了包含结构(I)、(I')、(IA)、(IA’)、(IB)、(IB’)、(IC)、或(IC’)中任一种的荧光化合物和分析物的组合物。

本文所公开的化合物是“可调的”，意味着通过适当地选择前述化合物中任一项中的变量，本领域技术人员可以得到具有期望和/或预定摩尔荧光(摩尔亮度)的化合物。化合物的可调性允许使用者容易地得到具有期望的荧光和/或颜色的化合物用于特定测定中或用于识别特定目的分析物。尽管所有变量都可能对化合物的摩尔荧光具有影响，但M¹、M²、L⁴、L⁵、L⁶、m、n、q、w和z的适当选择被认为在化合物的摩尔荧光中起重要作用。因此，在一个实施方案中，提供了用于获得具有期望的摩尔荧光的化合物的方法，该方法包括选择具有已知荧光的M部分，制备包含M部分的结构(I)、(I')、(IA)、(IA’)、(IB)、(IB’)、(IC)、或(IC’)的化合物，和选择对于L⁴、L⁵、L⁶、m、n、q、w和z的适当变量以得到期望的摩尔荧光。

在某些实施方案中，摩尔荧光可以相对于母体荧光团(例如，单体)的荧光发射以倍数增加或减少来表示。在一些实施方案中，相对于母体荧光团，本发明化合物的摩尔荧光是1.1x、1.5x、2x、3x、4x、5x、6x、7x、8x、9x、10x或甚至更高。各种实施方案包括通过适当地选择L⁴、L⁵、L⁶、m、n、q、w和z来制备相对于母体荧光团具有荧光的期望倍数增加的化合物。

为了易于说明，描绘了处于阴离子状态(例如，-OPO(OH)O^-、-OPO₃ ^2-)的包含磷部分(例如，磷酸酯基等)的各种化合物。本领域技术人员将容易地理解，电荷依赖于pH，并且不带电荷(例如，质子化或盐，诸如钠或其他阳离子)形式也包括在本公开的实施方案的范围内。

在各种其他实施方案中提供了包含前述化合物中任一种和一种或多种分析物分子(例如，生物分子)的组合物。在一些实施方案中，还提供了此类组合物在用于检测该一种或多种分析物分子的分析方法中的用途。

在还其他实施方案中，化合物可用于各种分析方法中。例如，在某些实施方案中，本公开提供了染色样品的方法，该方法包括向所述样品中添加结构(I)、(I')、(IA)、(IA’)、(IB)、(IB’)、(IC)、或(IC’)的化合物，例如其中R¹或R²之一是包含与分析物分子(例如，生物分子)或微粒的共价键的连接基，并且R¹或R²中的另一个是H、OH、烷基、烷氧基、烷基醚或-OP(＝R_a)(R_b)R_c，其量足以在所述样品在适当波长下被照射时产生光学响应。

在前述方法的一些实施方案中，R¹或R²是包含与分析物分子(诸如生物分子)的共价键的连接基。例如，核酸、氨基酸或其聚合物(例如，多核苷酸或多肽)。在还更多实施方案中，生物分子是酶、受体、受体配体、抗体、糖蛋白、适配体或朊病毒。

在前述方法的又其他实施方案中，R¹或R²是包含与固体载体(诸如微粒)的共价键的连接基。例如，在一些实施方案中，微粒是聚合物珠粒或非聚合物珠粒。

在甚至更多实施方案中，所述光学响应是荧光响应。

在其他实施方案中，所述样品包括细胞，并且一些实施方案进一步包括通过流式细胞术观察所述细胞。

在还更多实施方案中，该方法进一步包括将荧光响应与具有可检测地不同光学特性的第二荧光团的荧光响应区分开来。

在其他实施方案中，本公开提供了用于视觉上检测分析物分子(诸如生物分子)的方法，其包括：

(a)提供例如结构(I)、(I')、(IA)、(IA’)、(IB)、(IB’)、(IC)、或(IC’)的化合物，其中R¹或R²之一是包含与分析物分子的共价键的连接基，并且R¹或R²中的另一个是H、OH、烷基、烷氧基、烷基醚或-OP(＝R_a)(R_b)R_c；和

(b)通过其可见特性检测化合物。

在一些实施方案中，分析物分子是核酸、氨基酸或其聚合物(例如，多核苷酸或多肽)。在还更多实施方案中，分析物分子是酶、受体、受体配体、抗体、糖蛋白、适配体或朊病毒。

在其他实施方案中，提供了用于视觉上检测分析物分子(诸如生物分子)的方法，该方法包括：

(a)将前述化合物中任一种与一种或多种分析物分子掺合；和

(b)通过其可见特性检测化合物。

在其他实施方案中，提供了用于视觉上检测分析物分子的方法，该方法包括：

(a)将结构(I)、(I')、(IA)、(IA’)、(IB)、(IB’)、(IC)、或(IC’)的化合物(其中R¹或R²是Q或包含与Q的共价键的连接基)与分析物分子掺合；

(b)形成化合物和分析物分子的缀合物；和

(c)通过其可见特性检测缀合物。

其他示例性方法包括用于检测分析物的方法，该方法包括：

(a)提供结构(I)、(I')、(IA)、(IA’)、(IB)、(IB’)、(IC)、或(IC’)的化合物，其中R¹或R²包括包含与对分析物具有特异性的靶向部分的共价键的连接基；

(b)将化合物与分析物掺合，从而使靶向部分和分析物缔合；和

(c)例如通过其可见或荧光特性检测化合物。

在前述方法的某些实施方案中，分析物是颗粒，诸如细胞，并且该方法包括使用流式细胞术。例如，化合物可以提供有靶向部分，诸如抗体，用于选择性地与期望细胞缔合，从而使细胞通过任何数量的技术可检测，诸如可见或荧光检测。在一些实施方案中，抗体是多克隆抗体。在其他实施方案中，抗体是单克隆抗体。适当的抗体可以由本领域普通技术人员取决于期望的最终用途来选择。用于某些实施方案中的示例性抗体包括CD3(cloneUCHT1)、CD4(clone OKT4)、FoxP3、TNF-α、IFN-γ、clone 4S.B3、clone 206D、CD8α(D8A8Y)Rabbit mAb、Vimentin(D21H3)Rabbit mAb、phospho-RB抗体诸如phospho-RB-Ser608、phospho-RB-Ser612、phospho-RB-Ser780、phospho-RB-Ser795、phospho-RB-Ser807、或phospho-RB-Ser811、anti-human IL17A、整合素αE/CD103、CCR9和MOPC-21。

在某些实施方案中，形成包含结构(I)、(I')、(IA)、(IA’)、(IB)、(IB’)、(IC)、或(IC’)的化合物和分析物的缀合物的缀合效率大于约80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、98.5％、或99％。

在还其他实施方案中，本公开提供了用于增加染料的亮度的方法，该方法包括：

(a)提供包含结构(I)、(I')、(IA)、(IA’)、(IB)、(IB’)、(IC)、或(IC’)的化合物的染料溶液；和

(b)使染料溶液陈化一定时间段。

在一些实施方案中，使染料溶液陈化至少一周。例如，在一些实施方案中，在使用之前使染料溶液陈化约三周。

染料溶液可以包括各种缓冲液。在一些实施方案中，染料包含ETOH。在一些实施方案中，染料溶液包含BD亮剂(brilliant)。在一些实施方案中，染料溶液包含氯化钠或氯化钾。

因此，本发明化合物的实施方案在任何数量的方法中发现实用性，包括但不限于：细胞计数；细胞分选；生物标志物检测；定量凋亡；确定细胞活力；识别细胞表面抗原；确定总DNA和/或RNA含量；识别特异性核酸序列(例如，作为核酸探针)；和诊断疾病，诸如血癌。

除了以上方法之外，结构(I)、(I')、(IA)、(IA’)、(IB)、(IB’)、(IC)、或(IC’)的化合物的实施方案在各种学科和方法中发现实用性，包括但不限于：用于识别癌组织和其他组织的内窥镜检查手术中的成像；单细胞和/或单分子分析方法，例如具有很少或无扩增的多核苷酸的检测；癌症成像，例如通过在结构(I)、(I')、(IA)、(IA’)、(IB)、(IB’)、(IC)、或(IC’)的化合物中包括靶向部分，诸如抗体或糖或优先结合癌细胞的其他部分；外科手术中的成像；用于识别各种疾病的组蛋白的结合；药物递送，例如通过用活性药物部分替换结构(I)、(I')、(IA)、(IA’)、(IB)、(IB’)、(IC)、或(IC’)的化合物中的M部分；和/或牙科工作和其他手术中的造影剂，例如通过优先将结构(I)的化合物与各种菌群(flora)和/或器官结合。

应理解，如以上所阐述的结构(I)的化合物的任何实施方案以及对于如以上所阐述的结构(I)的化合物中R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、L'、L^1a、L^1b、L²、L³、L⁴、L⁵、L⁶、L⁷、M¹、M²、m、n、q和w变量的本文所阐述的任何特定选择可以独立地与结构(I)的化合物的其他实施方案和/或变量组合以形成以上未具体阐述的本公开的实施方案。此外，在针对具体实施方案和/或权利要求中的任何特定R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、L'、L^1a、L^1b、L²、L³、L⁴、L⁵、L⁶、L⁷、M¹、M²、m、n、q和w变量列出了选择的列表的情况下，应理解，可以从具体实施方案和/或权利要求中删除每个单独的选择，并且剩余的选择列表将被认为在本公开的范围内。

应理解，在本描述中，所描绘的式的取代基和/或变量的组合仅当此类贡献产生稳定的化合物时才允许。

本领域技术人员还应理解，在本文所描述的方法中，中间体化合物的官能团可能需要通过合适的保护基团保护。此类官能团包括羟基、氨基、巯基和羧酸。用于羟基的合适的保护基团包括三烷基甲硅烷基或二芳基烷基甲硅烷基(例如，叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基或三甲基甲硅烷基)、四氢吡喃基、苄基等。用于氨基、脒基和胍基的合适的保护基团包括叔丁氧基羰基、苄氧基羰基等。用于巯基的合适的保护基团包括-C(O)-R”(其中R”是烷基、芳基或芳基烷基)、对甲氧基苄基、三苯甲基等。用于羧酸的合适保护基团包括烷基、芳基或芳基烷基酯。保护基团可以根据标准技术添加或去除，这些标准技术是本领域技术人员已知的并且如本文所描述。保护基团的使用详细描述于Green,T.W.和P.G.M.Wutz,Protective Groups in Organic Synthesis(1999),第3版,Wiley中。如本领域技术人员将理解的，保护基团也可以是聚合物树脂，诸如王树脂(Wang resin)、Rink树脂或2-氯三苯甲基-氯化物树脂。

此外，呈游离碱或酸形式存在的本公开的所有化合物可以通过本领域技术人员已知的方法通过用适当的无机或有机碱或酸处理而转化为其盐。本公开的化合物的盐可以通过标准技术转化为其游离碱或酸形式。

以下反应方案说明了制备本公开的结构(I)、(I')、(IA)、(IA’)、(IB)、(IB’)、(IC)、或(IC’)的化合物的示例性方法。应理解，本领域技术人员能够通过类似方法或通过组合本领域技术人员已知的其他方法制备这些化合物。还应理解，本领域技术人员将能够以如以下所描述的类似方式，通过使用适当的起始组分并且根据需要修改合成的参数，制备以下未具体说明的结构(I)、(I')、(IA)、(IA’)、(IB)、(IB’)、(IC)、或(IC’)的其他化合物。通常，起始组分可以获得自诸如Sigma Aldrich、Lancaster Synthesis,Inc.、Maybridge、Matrix Scientific、TCI和Fluorochem USA等，或根据本领域技术人员已知的来源合成(参见例如，Advanced Organic Chemistry:Reactions,Mechanisms,andStructure,第5版(Wiley,December 2000))或如本公开所描述的制备。

反应方案I

反应方案I示出用于制备可用于制备结构(I)的化合物的中间体的示例性方法，其中R¹、L²、L³和M如以上所定义，R²和R³如以上所定义或是其受保护变体并且L是任选的连接基。参考反应方案1，结构a的化合物可以购买或通过本领域普通技术人员熟知的方法制备。在本领域中已知的铃木(Suzuki)偶联条件下，a与M-X(其中x是卤素，诸如溴)的反应得到结构b的化合物。结构b的化合物可以用于制备如以下所描述的结构(I)的化合物。

反应方案II

反应方案II示出用于制备可用于制备结构(I)的化合物的中间体的替代性方法。参考反应方案II，其中R¹、L¹、L²、L³、G和M如以上所定义，并且R²和R³如以上所定义，或是其受保护变体，使结构c的化合物(其可以购买或通过熟知技术制备)与M-G'反应以得到结构d的化合物。此处，G和G'表示具有互补反应性的官能团(即，反应以形成共价键的官能团)。G’可以是M的侧链或M的结构主链的一部分。G和G'可以是本文所描述的任何数量的官能团，分别诸如炔烃和叠氮化物，分别为胺和活化酯或分别为胺和异硫氰酸酯等。

结构(I)的化合物可以由结构b或d之一通过在熟知的自动DNA合成条件下与具有以下结构(e)的亚磷酰胺化合物的反应制备：

其中L是任选的连接基。

DNA合成方法在本领域中是众所周知的。简言之，使两个醇基团(例如以上中间体b或d中的R²和R³)分别用二甲氧基三苯甲基(DMT)和2-氰基乙基-N,N-二异丙基氨基亚磷酰胺基团官能化。典型地在活化剂诸如四唑的存在下，使亚磷酰胺基团偶联至醇基团，随后用碘氧化磷原子。二甲氧基三苯甲基可以用酸(例如，氯乙酸)去除以使游离醇暴露，可以使该游离醇与亚磷酰胺基团反应。通过用氨水处理，可以在低聚之后去除2-氰基乙基。

低聚方法中所使用的亚磷酰胺的制备在本领域中也是熟知的。例如，伯醇(例如，R³)可以通过与DMT-Cl的反应被保护为DMT基团。然后通过与适当的试剂诸如2-氰基乙基N,N-二异丙基氯亚磷酰胺反应，使仲醇(例如，R²)官能化为亚磷酰胺。用于制备亚磷酰胺及其低聚的方法是本领域中熟知的并且在实施例中更详细地描述。

结构(I)的化合物根据以上所描述的熟知的亚磷酰胺化学通过中间体b或d和e的低聚来制备。通过将亚磷酰胺偶联重复期望的次数，将期望数量的m和n个重复单元结合到分子中。

此外，本公开的化合物可以根据PCT公开号WO 2016/183185；WO 2017/173355；和WO 2017/177065(其中的每者特此通过引用并入)中所描述的方法制备。

FRET过程的效率部分地取决于发色团的特性。具体地，高效率FRET要求供体发色团的吸收光谱与受体发色团的发射光谱之间的较大重叠。此外，发色团的距离和取向起着重要作用。FRET效率与发色团之间的距离的6次幂成反比，并且跃迁偶极矩的角度应当基本上对齐成平行(即，接近0°或180°)。因此，在某些实施方案中，选择第一和第二发色团与聚合物主链的共价附接，使得第一与第二发色团之间的距离最小化并且跃迁偶极矩基本上对齐。FRET的效率可以根据以下等式表示：

其中E_FRET是FRET效率，R是发色团之间的距离，并且Ro根据以下等式表示：

Ro＝(8.8×10²³JK²Q_on^-4)^1/6

其中J是受体的吸收光谱与供体的发射光谱的光谱重叠，Q_o是供体量子效率，n^-4是供体与受体之间的介质指数(常数)，并且K²是偶极方向匹配。

因此，一个实施方案提供了聚合物化合物，其包含具有受体跃迁偶极矩并且与聚合物主链共价连接的受体发色团和具有供体跃迁偶极矩并且与聚合物主链共价连接的供体发色团，其中聚合物化合物在生理条件下在溶液中被确认，其中受体发色团与供体发色团之间的有效距离小于约50.0nm并且受体跃迁偶极和供体跃迁偶极基本上平行。

在一些实施方案中，受体发色团与供体发色团之间的有效距离小于约25.0nm。在一些实施方案中，受体发色团与供体发色团之间的有效距离小于约10.0nm。在一些实施方案中，受体发色团与供体发色团之间的有效距离小于约30.0nm、小于约27.0nm、小于约22.0nm、小于约20.0nm、小于约17.0nm、小于约15.0nm、小于约12.0nm、小于约11.0nm、小于约9.0nm、小于约8.0nm、小于约7.0nm、小于约6.0nm、小于约5.0nm、小于约4.0nm、小于约3.0nm、小于约2.0nm、或小于约1.0nm。

在一些实施方案中，受体发色团是荧光染料部分。在某些实施方案中，供体发色团是荧光染料部分。在某些相关实施方案中，受体发色团和供体发色团均是荧光染料部分。

在一些实施方案中，受体跃迁偶极矩与供体跃迁偶极矩之间的角度范围从120°至180°。例如，在一些实施方案中，受体跃迁偶极矩与供体跃迁偶极矩之间的角度范围从125°至180°、130°至180°、140°至180°、150°至180°、160°至180°、170°至180°、172°至180°、175°至180°、或177°至180°。

在某些实施方案中，受体跃迁偶极矩与供体跃迁偶极矩之间的角度范围从0°至60°。例如，在一些实施方案中，受体跃迁偶极矩与供体跃迁偶极矩之间的角度范围从0°至50°、0°至40°、0°至30°、0°至20°、0°至10°、0°至8°、0°至5°、0°至3°、或0°至2°。

在一些更具体的实施方案中，聚合物化合物进一步包含在聚合物主链的近端处共价连接的第一受体发色团、在聚合物主链的远端处共价连接的第二受体发色团以及在聚合物主链的近端与远端之间共价连接的供体发色团。

在某些实施方案中，聚合物主链包含磷酸酯连接基。在一些实施方案中，聚合物主链包含多个磷酸酯连接基。

在一些相关实施方案中，聚合物主链包含亚烷基氧基(alkylene oxide)连接基。在一些更具体的实施方案中，亚烷基氧基是亚乙基氧基。在一些具体实施方案中，聚合物主链包含HEG连接基、C连接基或其组合。

在一些实施方案中，聚合物化合物具有小于20,000g/mol的分子量。在一些实施方案中，聚合物化合物具有小于19,000g/mol、18,500g/mol、18,000g/mol、17,500g/mol、17,000g/mol、16,500g/mol、16,000g/mol、15,500g/mol、15,000g/mol、14,500g/mol、14,000g/mol、13,500g/mol、13,000g/mol、12,500g/mol、11,500g/mol、11,000g/mol、10,500g/mol、10,000g/mol、9,500g/mol、9,000g/mol、8,500g/mol、8,000g/mol、7,500g/mol、7,000g/mol、6,500g/mol、6,000g/mol、5,500g/mol、5,000g/mol、4,500g/mol、4,000g/mol、3,500g/mol、3,000g/mol、2,500g/mol、2,000g/mol、1,500g/mol、或1,000g/mol的分子量。

在一些实施方案中，聚合物化合物不是肽或蛋白质。在一些其他实施方案中，聚合物主链不具有酰胺键。

分子模拟

在一些实施方案中，本公开涉及设计如以上所描述的结构(I)、(I')、(IA)、(IA’)、(IB)、(IB’)、(IC)、或(IC’)的荧光染料的方法，该荧光染料具有控制各种波长和亮度以实现多种荧光发射的多个荧光发色团(即，FRET供体和受体)的空间布置。特别地，本公开涉及荧光染料，其具有多个荧光发色团(即，FRET供体和受体)，使得荧光染料内存在的空间位阻使FRET原理最大化。本公开的实施方案允许荧光染料具有更高的FRET效率以及待使用的FRET供体和受体的更宽选择，这导致具有各种波长和亮度的荧光染料。

根据荧光共振能量转移原理，从供体至受体的能量转移发生越多，荧光染料就越好。因此，荧光染料内存在的与受体分子等距离定位的供体分子越多(即，从受体分子至每个供体分子的距离相同)，荧光染料就越好。在该方面，受体分子可以充当球体的中心点，并且供体分子可以被视为球体的圆周或表面上的点。球体的半径由中心点受体分子和供体分子(即，FRET供体与FRET受体之间的距离)界定。这在以下图中描述：

本公开的荧光染料具有各自被位于FRET供体分子之间的连接基分隔4nm或更大的FRET供体分子，其提供空间位阻以防止碰撞淬灭。

在一些实施方案中，荧光染料具有三个或更多个荧光发色团(一个或多个FRET供体和一个或多个受体)。串联型染料使用两个或更多个荧光发色团，其中在更低波长侧(更高能量侧)激发和发射的发色团被称为供体并且在更高波长侧(更低能量侧)激发和发射的发色团被称为受体。外部激发光使供体激发，这使能量转移至受体，这转而使受体分子激发，导致其发射光。在外部，供体激发能量被观察到，就如同受体在发射光。在多色荧光检测实验中，预期串联染料具有容易地被检测器检测到的(高)亮度并且展现出受体的固有发射波长分布，其不应当与供体的发射波长分布混合。在多色化中，低亮度难以分离和检测。如果供体发射波长保持不变，则类似于供体分子的荧光发色团的荧光发色团不能用于该多色实验中。实验已经发现，两个或更多个荧光发色团的分子的数量对于实现串联染料预期的强发光强度很重要。

图1和2表明，1或更高的供体/受体(D/A)比率示出更高的强度。将供体/受体(D/A)比率绘制在横坐标(x)轴上，并且将来自供体激发光的受体发射的强度绘制在纵坐标(y)轴上。水平轴上低于1的值是受体数量高的情况，但随着负责发光本身的受体数量的增加，FRET光不会变得更强。图1和2表明，由于强度的增加，具有比受体分子更多的供体分子的荧光染料是更好的染料。

此外，为了使发光强度更强，供体与受体之间的距离越近，荧光染料越好。荧光共振能量转移原理描述了此种关系。

K_T(r)：分隔距离r的供体和受体的转移速率

Q_D：在不存在受体的情况下供体的量子收率

τ_D：在不存在受体的情况下供体的寿命

n：介质的折射率

N：阿佛加德罗数

r：供体与受体之间的距离

F_D：在波长范围λ至λ+Δλ中供体的校正荧光强度，以总强度(曲线下面积)统一归一化

ε_A：在λ下受体的消光系数，其典型地以M-

¹cm^-1为单位

κ²：描述供体和受体的跃迁偶极的空间中的相对取向的因子

本公开使用FRET型能量转移。已知Dexter跃迁(其中共轭分子轨道重叠和电子态是不同的)发生在小于1nm的距离处，因此在此避免了跃迁。如果供体-受体距离是2nm，则能量转移效率在3nm距离(1nm远)处是2nm的9％，在4nm距离(2nm远)处是2nm的2％，并且在5nm距离(3nm远)处是2nm的0.4％，与距离的六次幂成反比。实际的供体-受体FRET距离实际上被认为是小于4nm、优选地小于3nm。

根据图3，可以得出结论，当该系统(其包括多于一个)的供体分子和供体分子之间的距离接近时，能量不是从供体转移至受体，而是从供体传递至相邻的供体。即使设置了大量供体分子，来自供体的能量也无法在不浪费能量的情况下传递至受体。这可以通过将供体与供体分子分离超过一定距离来解决。

在一些实施方案中，荧光发色团之间的相互作用不限于供体与受体荧光发色团之间的能量转移FRET，但如果存在两个或更多个π-共轭基团，则多种类型的能量转移是可能的，包括：

I)π-共轭基团1与π-共轭基团2之间的基团间能量转移(FRET；本发明中供体-受体分子之间的预期能量转移)；

II)络合物形成：形成相同π-共轭基团1和1'的同源络合物和不同π-共轭基团1和2的异源络合物，通过激发的络合物产生具有不同光学特性的不同物质；

III)碰撞淬灭：同一物种的多个π-共轭基团的聚集或接近度导致它们在激发之后在发射光之前相互转移能量，导致热释放等，并且从而无发射。这是可以在本发明中的供体分子之间发生的可避免的转移；和

IV)激发态反应：通过π-共轭基团1和2的相互作用通过内部转换发生无跃迁辐射。

制备本公开的荧光染料，使得在供体分子之间不发生III)碰撞淬灭。这可以通过保持供体分子之间的距离足够远来解决。

如以上所描述的，如果供体分子之间的距离是2nm作为标准，则能量转移效率与距离的六次幂成反比地降低：在3nm距离处是2nm的9％，在4nm距离处是2nm，并且在5nm距离处是2nm的0.4％，其分别是1nm远和3nm远。供体分子之间的距离应当分隔4nm或更大、优选地5nm或更大。

此外，更好的是在供体与供体之间设置连接基以提供空间位阻以防止碰撞淬灭。还有必要防止残留的供体发射波长分布，例如，除了受体发射波长分布之外，其对于串联染料是预期的。图4表明，这可以通过使多个所包括的供体与受体之间的距离尽可能相当地近来解决。如果一个供体设置得不足够近以无法将能量传递至受体，则供体将被激发并且发射光，留下出乎意料的供体发射波长分布。

在一些实施方案中，聚合物染料包含：i)两个或更多个FRET供体；ii)至少一个FRET受体，前提是FRET供体的数量大于FRET受体的数量；和iii)至少一个带负电荷的基团，其中：A)这两个或更多个FRET供体中的每个之间的距离在空间上是4.0nm或更大；B)这两个或更多个FRET供体与该至少一个FRET受体之间的距离在空间上是至多3.0nm；C)这两个或更多个FRET供体中的每个经由包含该至少一个带负电荷的基团的连接基连接；和D)这两个或更多个FRET供体和该至少一个FRET受体经由包含该至少一个带负电荷的基团的连接基连接。

在一些实施方案中，这两个或更多个FRET供体中的每个独立地是包含四个或更多个芳基或杂芳基环、或其组合的部分。在一些实施方案中，这两个或更多个FRET供体中的每个独立地是荧光的或着色的。在一些更具体的实施方案中，这两个或更多个FRET供体中的每个独立地包括包含至少四个稠合环的稠合多环芳基或杂芳基部分。在一些特定实施方案中，这两个或更多个FRET供体中的每个独立地具有以下结构之一：

在一些实施方案中，该至少一个FRET受体独立地是包含四个或更多个芳基或杂芳基环、或其组合的部分。在一些实施方案中，该至少一个FRET受体独立地是荧光的或着色的。在一些更具体的实施方案中，该至少一个FRET受体独立地包括包含至少四个稠合环的稠合多环芳基或杂芳基部分。在一些特定实施方案中，该至少一个FRET受体独立地具有以下结构之一：

在一些实施方案中，聚合物染料包含多个带负电荷的基团。在一些更具体的实施方案中，带负电荷的基团是磷酸根。

在一些实施方案中，连接基进一步包含一个或多个亚烷基或亚烷基氧基部分。在一些更具体的实施方案中，亚烷基氧基部分包含聚亚乙基氧基部分。

在一些实施方案中，聚合物染料包含2至100个FRET供体。在一些实施方案中，聚合物染料包含2至10个FRET供体。在一些实施方案中，聚合物染料包含2至5个FRET供体。在一些实施方案中，聚合物染料包含2至3个FRET供体。在一些具体实施方案中，聚合物染料包含2个FRET供体。在一些具体实施方案中，聚合物染料包含3个FRET供体。在一些具体实施方案中，聚合物染料包含4个FRET供体。在一些具体实施方案中，聚合物染料包含5个FRET供体。

在一些实施方案中，聚合物染料包含1至10个FRET受体。在一些实施方案中，聚合物染料包含1至5个FRET受体。在一些实施方案中，聚合物染料包含1至3个FRET受体。在一些实施方案中，聚合物染料包含2至5个FRET受体。在一些实施方案中，聚合物染料包含2至3个FRET受体。在一些具体实施方案中，聚合物染料包含1个FRET受体。在一些具体实施方案中，聚合物染料包含2个FRET受体。在一些具体实施方案中，聚合物染料包含3个FRET受体。在一些具体实施方案中，聚合物染料包含4个FRET受体。在一些具体实施方案中，聚合物染料包含5个FRET受体。

在一些实施方案中，聚合物染料包含2至6个FRET供体和1至3个FRET受体。在一些实施方案中，聚合物染料包含2个FRET供体和1个FRET受体。在一些实施方案中，聚合物染料包含3个FRET供体和1个FRET受体。在一些实施方案中，聚合物染料包含4个FRET供体和1个FRET受体。在一些实施方案中，聚合物染料包含5个FRET供体和1个FRET受体。在一些实施方案中，聚合物染料包含3个FRET供体和2个FRET受体。在一些实施方案中，聚合物染料包含4个FRET供体和2个FRET受体。在一些实施方案中，聚合物染料包含5个FRET供体和2个FRET受体。在一些实施方案中，聚合物染料包含6个FRET供体和2个FRET受体。

在一些实施方案中，聚合物染料具有以下结构取向之一：

其中：A表示FRET受体，其中A位于球体的中心处；D表示FRET供体，其中每个D位于球体的表面上，与另一个D分隔开第一距离，并且与A分隔开第二距离；第一距离在空间上是4.0nm或更大；第二距离在空间上是至多3.0nm；球体由A与D之间的半径界定；每个FRET供体经由包含至少一个带负电荷的基团的连接基连接；并且每个FRET供体和FRET受体经由包含该至少一个带负电荷的基团的连接基连接。

在一些实施方案中，球体的半径是1nm至4nm。在一些实施方案中，球体的半径是2nm至3nm。在一些更具体的实施方案中，球体的半径是1nm。在一些更具体的实施方案中，球体的半径是2nm。在一些更具体的实施方案中，球体的半径是3nm。在一些更具体的实施方案中，球体的半径是4nm。

在一些实施方案中，第一距离在空间上是4.0nm至5.0nm。在一些更具体的实施方案中，第一距离在空间上是4.0nm。在一些更具体的实施方案中，第一距离在空间上是5.0nm。在一些更具体的实施方案中，第一距离在空间上是4.0nm至4.8nm。在一些更具体的实施方案中，第一距离在空间上是4.0nm至4.6nm。在一些更具体的实施方案中，第一距离在空间上是4.0nm至4.4nm。

在一些实施方案中，第二距离在空间上是1.0nm至3.0nm。在一些实施方案中，第二距离在空间上是1.5nm至2.5nm。在一些实施方案中，第二距离在空间上是1.7nm至2.3nm。在一些更具体的实施方案中，第二距离在空间上是1.9nm。在一些更具体的实施方案中，第二距离在空间上是2.0nm。在一些更具体的实施方案中，第二距离在空间上是2.1nm。

第一和第二距离是在空间中两个相邻的FRET供体或FRET供体与FRET受体之间的距离。第一和第二距离在3D建模软件中计算或通过晶体结构获得。第一和第二距离可以取决于溶剂的存在或不存在而变化。例如，溶剂中的第一和第二距离可以不同于真空中的第一和第二距离。在另一个实例中，由于聚合物染料与特定溶剂之间的相互作用，一种溶剂中的第一和第二距离可以不同于另一种溶剂中的第一和第二距离。

在一些实施方案中，FRET供体D位于球体的表面上的任何点上。球体由中心FRET受体A和球体的半径界定，该球体的半径由第二距离(FRET供体与FRET受体之间的距离)界定。尽管在本公开中具体示出了这些结构取向中的两种，但其他结构取向是可能的，因为FRET供体D可以位于球体的表面上的任何点上。

以下实施例仅出于说明目的而非限制提供。

实施例

一般方法

质谱分析在Waters/Micromass Quattro micro MS/MS系统(仅在MS模式下)上使用MassLynx 4.1采集软件进行。用于染料上的LC/MS的流动相是100mM 1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇(HFIP)、8.6mM三乙胺(TEA)，pH 8。还使用Waters Acquity UHPLC系统用2.1mmx50mm Acquity BEH-C18柱保持在45℃下，采用乙腈/水流动相梯度，分析了亚磷酰胺和前体分子。单体中间体的分子量在Waters/Micromass Quattro micro MS/MS系统(仅在MS模式下)上使用鎓阳离子输注增强电离获得。激发和发射曲线实验在Cary Eclipse分光光度计上记录。

除非另有说明，否则所有反应均在氮气气氛下在烘箱干燥玻璃器皿中进行。可商购的DNA合成试剂购自Glen Research(Sterling,VA)。无水吡啶、甲苯、二氯甲烷、二异丙基乙胺、三乙胺、乙酸、吡啶和THF购自Aldrich。所有其他化学品均购自Aldrich或TCI并且按原样使用，无需额外纯化。

实施例1

具有亚烷基-聚乙二醇-亚烷基间隔基的染料的合成

具有亚烷基-聚亚乙基氧基-亚烷基连接基的化合物如下制备：

低聚氟苷(oligofluoroside)构建体(即，结构(I)的化合物)在AppliedBiosystems 394DNA/RNA合成仪上以1μmol规模合成并且具有3’-磷酸酯基团或3’-S₂-(CH₂)₆-OH基团或本文所描述的任何其他基团。合成直接在CPG珠粒上或在聚苯乙烯固体载体上使用标准亚磷酰胺化学进行。低聚氟苷使用标准固相DNA方法在3’至5’方向上合成，并且偶联采用标准β-氰基乙基亚磷酰胺化学。将氟苷亚磷酰胺和间隔基(例如，聚乙二醇亚磷酰胺、丙烷-二醇亚磷酰胺、丁烷-二醇亚磷酰胺和己烷-二醇亚磷酰胺)和连接基(例如，5’-氨基-改性剂亚磷酰胺和硫醇-改性剂S2亚磷酰胺)溶解于乙腈中以制备0.1M溶液，并且使用以下合成循环以连续顺序添加：1)用在二氯甲烷中的二氯乙酸去除5’-二甲氧基三苯甲基保护基团，2)将下一个亚磷酰胺与在乙腈中的活化剂试剂偶联，3)用碘/吡啶/水氧化P(III)以形成稳定的P(v)，和4)用乙酸酐/1-甲基咪唑/乙腈对任何未反应的5’-羟基封端。将合成循环重复，直到组装全长低聚氟苷构建体。在链组装结束时，用在二氯甲烷中的二氯乙酸去除单甲氧基三苯甲基(MMT)或二甲氧基三苯甲基(DMT)。

在标记的Eppendorf管中以0.2umol规模在可控孔玻璃(CPG)载体上提供化合物。添加400μL的20％-30％ NH₄OH并且缓慢地混合。将开口管置于55℃下持续～5分钟或直到已经释放出过量的气体，并且然后紧密封闭并且温育2小时(+/-15min.)。将管从加热块取出并且允许其达到室温，随后以13,400RPM离心30秒以使上清液和固体巩固。将上清液小心地取出并且置于标记的管中，并且然后添加150μL乙腈以洗涤载体。将洗涤液添加至管中之后，将其在40℃下置于CentriVap装置中直至干燥。

将产物通过ESI-MS、UV-吸收和荧光光谱表征。

实施例2

一般流式细胞术方法

除非另有说明，否则在整个以下实施例中使用以下一般程序：

全血的裂解：

缓冲氯化铵方法。对于活细胞的染色，将乙二胺四乙酸酯(EDTA)抗凝正常人血液在室温(RT)下用氯化铵溶液(ACK)、15mL血液至35mL溶血剂超大量(bulk)裂解15min。将细胞用50％汉克(Hank's)平衡盐溶液(HBSS)和具有0.02％叠氮化钠的50％1％胎牛血清(FBS)1x Dulbecco's磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)洗涤两次。然后将细胞在供体血浆中重新悬浮至100μL/供试品/0.1-1x10e6。将在血浆中的细胞添加至在聚丙烯96孔HTS板中用于100μL 1％牛血清白蛋白(BSA)和具有0.02％叠氮化钠的1x DPBS的V_f的预稀释抗体中。在室温下温育45min.之后，将细胞用50％ HBSS和具有0.02％叠氮化钠的50％-1％ FBS 1xDPBS洗涤两次。

裂解/固定方法。将血液在室温下用1.0mL RBC裂解液(氯化铵)、100-15mL血液至35mL溶血剂裂解15min。然后将细胞用50％HBSS和具有0.02％叠氮化钠的50％-1％ FBS 1xDPBS洗涤两次。然后将细胞在供体血浆中重新悬浮至100μL/供试品/1x10e6。将预稀释的抗体添加在100μL 1％ BSA和具有0.02％叠氮化钠的1x DPBS中。将100μL细胞添加至96孔聚丙烯HTS板中(总计200μL供试品大小)。在室温下温育45min.之后，将细胞用50％ HBSS和具有0.02％叠氮化钠的50％1％ FBS1x DPBS洗涤两次。

抗体缀合物的制备：

抗体缀合物通过使包含具有以下结构的Q部分的结构(I)的化合物与期望的抗体反应来制备：

因此，通过抗体上的S与Q部分的反应使化合物和抗体缀合以形成以下连接结构：

抗体缀合物由抗体名称后跟化合物编号指示。例如，UCHT1-I-1指示在UCHT1抗体与结构(I)I-1的化合物之间形成的缀合物。如果参考化合物编号不包括表1中的以上Q部分，则应理解Q部分已设置并且缀合物由具有Q部分的所得化合物制备。

缀合物的稀释：

使抗体达到室温。将抗体缀合物在细胞染色缓冲液(1X DPBS，1％BSA，0.02％叠氮化钠)中稀释至0.1-540nM(8.0微克或更少/供试品)的范围内的浓度。在一些实施例中，每个样品的连续稀释液以在细胞染色缓冲液中269nM抗体起始，并且将抗体稀释液保持避光直至使用。在其他实验中，稀释液以4.0μg抗体/供试品大小起始，其中供试品大小范围从100-200μL。滴度以两倍或四倍稀释进行以生成结合曲线。在一些情况下，在稀释系列中第一个孔中使用8.0或2.0μg/供试品大小。

用缀合物进行的流式细胞术：

在物理表征之后，测试缀合物的活性和官能度(抗体结合亲和力和染料的亮度)并且与参考抗体染色进行比较。然后通过与自动荧光阴性对照相比的亮度以及使用流式细胞仪的其他非特异性结合来确定分辨率的品质。全血筛查是用于测试缀合物的最常规方法。随着新构建体形成，实施了衔接性研究。

进行游离染料流式细胞术：

在分子和物理表征之后，还测试了与参考染料染色相比染料对细胞的潜在亲和力。由于染料也具有充当细胞探针并且与细胞材料结合的潜力，因此通常可以在高浓度(>100nM-至-10,000nM)下针对血液筛选染料以确定特定特性。然后通过使用流式细胞仪评价稀释后与自动荧光阴性对照和其他染料对照相比的亮度和线性，对预期或未预期的脱靶结合进行鉴定。

流式细胞术工作流程：培养细胞并且观察代谢应激的视觉信号用于染料筛选或脱靶结合(数据未示出)，或使用新鲜健康细胞用于缀合物筛选。将细胞定期计数以检查细胞密度(1x10e5和1x10e6活细胞/mL)。将抗体缀合物在收获细胞之前在染色缓冲液(DPBS，0.1％BSA，0.02％叠氮化钠)中稀释(优选地在板或管中)。使用具有80％-85％的活力范围的细胞。通过离心和用缓冲液洗涤细胞将细胞洗涤两次以去除pH指示剂，并且用包含在FBS中的Ig和其他蛋白质阻断细胞。将细胞密度调节至染色缓冲液中的供试品大小。将细胞平板接种，一种供试品/孔，或将染料(预稀释的)施涂至板中的细胞。然后，将细胞在23℃下温育45min。通过离心和用洗涤缓冲液洗涤细胞将细胞洗涤两次，然后将板抽吸。将细胞重新悬浮在采集缓冲液中。通过流式细胞术采集5000个完整的细胞。

通过488nM蓝色激光线通过流式细胞术检测染料的荧光，使用525/50带通滤波器检测峰值发射(521nM)。通过流式细胞术采集至少1500个完整的细胞，靶标采集3000-5000个完整的细胞，并且进行分析以识别细胞配制剂中存在的活细胞。

数据分析方法：

描述性统计。EC-800软件允许使用者为每个样品采集收集大量统计数据。使用FL1-A通道中的平均或中值荧光强度(MFI)来测量抗体-染料试剂在其通过流式细胞术进行查询时和在检查噪声时的亮度。评价其他统计数据以确定试剂的染料特性和总体品质，包括中值信噪比和绝对荧光(中值或几何平均值)。

直方图。流式细胞术事件相对于侧向散射前向按尺寸门控(细胞体积相对于细胞颗粒度)。然后通过平均荧光强度(MFI)在515nm下的荧光发射对那些细胞进行门控。所收集的数据呈现为绘制为y轴上的事件数量相对于荧光强度(其在x轴上以对数刻度表示)的双参数直方图。数据可以通过亲和力曲线、或相对荧光强度的直方图来总结。

结合曲线。选择MFI，因为当抗体-染料试剂被FCM查询时，其是测量抗体-染料试剂的亮度的最佳参数，这可以表示为几何平均值、中值、或平均值，并且表示绝对荧光测量值。为了比较，在噪声可以被高度表征的情况下，信噪比被报告为MFI，S/N。

双变量、双参数直方图。在一些情况下，为了检查定性输出，未对FCM事件进行门控，并且数据以细胞颗粒度(SSC)相对于染料荧光来表示。该方法允许对全血中回收的所有群体进行总体评价。

实施例3

将化合物I-1和I-2的流式细胞术分析与CD4(clone OKT4)抗体缀合，并且在1x d-PBS(磷酸盐缓冲生理盐水)中洗脱。所使用的染料包括FAM和Alexa594(AF594)。使用0.5ug的抗体缀合物对全血进行染色并且在光谱仪器上进行筛选。

实施例4

亚磷酰胺和化合物的制备

使用标准固相寡核苷酸合成方案和具有以下结构的含荧光素的亚磷酰胺制备示例性化合物：

其购自ChemGenes(Cat.#CLP-9780)。

通过与具有以下结构的亚磷酰胺偶联将示例性连接基(L⁶)包括在化合物中：

其也是可商购的。

通过与具有以下结构之一的亚磷酰胺偶联将示例性连接基(L⁷/L^1b)包括在化合物中：

其也是可商购的。

使用根据以下方案制备的亚磷酰胺来制备其他示例性化合物：

最终脱保护产生期望的Fx部分。视情况而定采用其他可商购的亚磷酰胺试剂来设置化合物的各个部分。具有以下结构的Q部分：

通过以下项与游离硫氢基的反应设置：

根据本领域普通技术人员的知识以类似的方式设置其他Q部分。

可以将以上所描述的各种实施方案组合以提供另外的实施方案。本说明书中提及和/或在申请数据表中列出的所有美国专利、美国专利申请公开、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利出版物，包括2022年6月15日提交的美国临时专利申请号63/352,570，均通过引用以其整体并入本文。如果必要，可以修改实施方案的方面以采用各种专利、申请和出版物的构思来提供又另外的实施方案。可以根据以上详细描述对实施方案作出这些和其他更改。通常，在以下权利要求中，所使用的术语不应当被解释为将权利要求限定于本说明书和权利要求中所公开的具体实施方案，而应当被解释为包括所有可能的实施方案以及此类权利要求被授权的全部等效范围。因此，权利要求不受本公开的限制。

Claims (99)

1.聚合物染料，其包含：

i)两个或更多个FRET供体；

ii)至少一个FRET受体，前提是所述FRET供体的数量大于FRET受体的数量；和

iii)至少一个带负电荷的基团，

其中：

A)所述两个或更多个FRET供体中的每个之间的距离在空间上是4.0nm或更大；

B)所述两个或更多个FRET供体与所述至少一个FRET受体之间的距离在空间上是至多3.0nm；

C)所述两个或更多个FRET供体中的每个经由包含所述至少一个带负电荷的基团的连接基连接；和

D)所述两个或更多个FRET供体和所述至少一个FRET受体经由包含所述至少一个带负电荷的基团的连接基连接。

2.如权利要求1所述的聚合物染料，其中，所述两个或更多个FRET供体中的每个独立地是包含四个或更多个芳基或杂芳基环、或其组合的部分。

3.如权利要求1所述的聚合物染料，其中，所述两个或更多个FRET供体中的每个独立地是荧光的或着色的。

4.如权利要求1所述的聚合物染料，其中，所述两个或更多个FRET供体中的每个独立地包括包含至少四个稠合环的稠合多环芳基或杂芳基部分。

5.如权利要求1所述的聚合物染料，其中，所述两个或更多个FRET供体中的每个独立地具有以下结构之一：

6.如权利要求1所述的聚合物染料，其中，所述至少一个FRET受体独立地是包含四个或更多个芳基或杂芳基环、或其组合的部分。

7.如权利要求1所述的聚合物染料，其中，所述至少一个FRET受体独立地是荧光的或着色的。

8.如权利要求1所述的聚合物染料，其中，所述至少一个FRET受体独立地包括包含至少四个稠合环的稠合多环芳基或杂芳基部分。

9.如权利要求1所述的聚合物染料，其中，所述至少一个FRET受体独立地具有以下结构之一：

10.如权利要求1所述的聚合物染料，其中，所述聚合物染料包含多个带负电荷的基团。

11.如权利要求10所述的聚合物染料，其中，所述连接基进一步包含一个或多个亚烷基或亚烷基氧基部分。

12.如权利要求11所述的聚合物染料，其中，所述亚烷基氧基部分包含聚亚乙基氧基部分。

13.如权利要求1-12中任一项所述的聚合物染料，其中，所述带负电荷的基团是磷酸根。

14.如权利要求1-13中任一项所述的聚合物染料，其中，所述聚合物染料包含2至100个FRET供体。

15.如权利要求1-14中任一项所述的聚合物染料，其中，所述聚合物染料包含2至10个FRET供体。

16.如权利要求1-15中任一项所述的聚合物染料，其中，所述聚合物染料包含1至10个FRET受体。

17.如权利要求1-16中任一项所述的聚合物染料，其中，所述聚合物染料包含1至5个FRET受体。

18.如权利要求1-17中任一项所述的聚合物染料，其中，所述聚合物染料包含2至6个FRET供体和1至3个FRET受体。

19.如权利要求1-18中任一项所述的聚合物染料，其中，所述聚合物染料包含2个FRET供体和1个FRET受体。

20.如权利要求1-19中任一项所述的聚合物染料，其中，所述聚合物染料包含3个FRET供体和1个FRET受体。

21.一种聚合物染料，其具有以下结构取向之一：

其中：

A表示FRET受体，其中所述A位于球体的中心处；

D表示FRET供体，其中每个D位于所述球体的表面上，与另一个D分隔开第一距离，并且与所述A分隔开第二距离；

所述第一距离在空间上是4.0nm或更大；

所述第二距离在空间上是至多3.0nm；

所述球体由所述A与所述D之间的半径界定；

每个FRET供体经由包含至少一个带负电荷的基团的连接基连接；和

每个FRET供体和所述FRET受体经由包含所述至少一个带负电荷的基团的连接基连接。

22.如权利要求21所述的聚合物染料，其中，所述球体的半径是1nm至4nm。

23.如权利要求21所述的聚合物染料，其中，所述球体的半径是2nm至3nm。

24.如权利要求21所述的聚合物染料，其中，所述球体的半径是2nm。

25.如权利要求21所述的聚合物染料，其中，所述第一距离在空间上是4.0nm至5.0nm。

26.如权利要求21所述的聚合物染料，其中，所述第二距离在空间上是1.0nm至3.0nm或在空间上是1.5nm至2.5nm。

27.如权利要求21所述的聚合物染料，其中，所述D位于所述球体的表面上的任何点上。

28.如权利要求1-27中任一项所述的聚合物染料，所述聚合物染料具有以下结构(I)或(I')之一：

或其立体异构体、盐或互变异构体，其中：

M¹和M²在每次出现时独立地是发色团，前提是M¹是所述FRET受体并且M²是所述FRET供体，并且M¹和M²形成FRET对；

L^1a在每次出现时独立地是杂亚烷基或杂亚芳基连接基；

L^1b、L²、L³、L⁵、L⁶和L⁷在每次出现时独立地是任选的亚烷基、亚烯基、亚炔基、杂亚烷基、杂亚烯基或杂亚炔基连接基；

L⁴在每次出现时具有以下结构之一：

其中：

z是1至100的整数；和

*指示与相邻磷原子的键；

R¹和R²各自独立地是H、OH、SH、烷基、烷氧基、烷基醚、杂烷基、-OP(＝R_a)(R_b)R_c、Q、或其受保护形式、或L'；

R³在每次出现时独立地是H、烷基或烷氧基；

R⁴在每次出现时独立地是OH、SH、O^-、S^-、OR_d或SR_d；

R⁵在每次出现时独立地是氧代、硫代或不存在；

R_a是O或S；

R_b是OH、SH、O^-、S^-、OR_d或SR_d；

R_c是OH、SH、O^-、S^-、OR_d、OL'、SR_d、烷基、烷氧基、杂烷基、杂烷氧基、烷基醚、烷氧基烷基醚、磷酸酯基、硫代磷酸酯基、磷酸烷基、硫代磷酸烷基、磷酸烷基醚或硫代磷酸烷基醚；

R_d是抗衡离子；

Q在每次出现时独立地是包含反应性基团、或其受保护形式的部分，能够与分析物分子、靶向部分、固体载体或互补反应性基团Q′形成共价键；

L'在每次出现时独立地是包含与Q的共价键的连接基、包含与靶向部分的共价键的连接基、包含与分析物分子的共价键的连接基、包含与固体载体的共价键的连接基、包含与固体载体残基的共价键的连接基、包含与核苷的共价键的连接基或包含与另外的结构(I)的化合物的共价键的连接基；

m在每次出现时是一或更大的整数；

q在每次出现时是一或更大的整数；

w在至少一次出现时是一或更大的整数，前提是当n是1的整数时，q是大于w的整数；和

n是一或更大的整数。

29.如权利要求1-28中任一项所述的聚合物染料，其中，L^1a在每次出现时独立地是任选地取代的5-7元杂亚芳基连接基。

30.如权利要求1-29中任一项所述的聚合物染料，其中，L^1a具有以下结构之一：

31.如权利要求1-30中任一项所述的聚合物染料，其具有以下结构(IA)或(IA’)之一：

或其立体异构体、盐或互变异构体。

32.如权利要求1-31中任一项所述的聚合物染料，其中，z是3至8的整数、15至30的整数、或22至26的整数。

33.如权利要求1-32中任一项所述的聚合物染料，其具有以下结构(IB)或(IB’)之一：

或其立体异构体、盐或互变异构体。

34.如权利要求1-33中任一项所述的聚合物染料，其中，L⁵或L⁶的至少一次出现是亚烷基。

35.如权利要求1-34中任一项所述的聚合物染料，其中，L⁵或L⁶的每次出现是亚烷基。

36.如权利要求1-35中任一项所述的聚合物染料，其中，L³的至少一次出现是亚烷基。

37.如权利要求1-36中任一项所述的聚合物染料，其中，L³的每次出现是亚烷基。

38.如权利要求1-37中任一项所述的聚合物染料，其具有以下结构(IC)或(IC’)之一：

或其立体异构体、盐或互变异构体，其中y¹、y²和y³在每次出现时独立地是1至6的整数。

39.如权利要求1-38中任一项所述的聚合物染料，其中，L^1b的至少一次出现包含通过醛、肟、腙、炔烃、胺、叠氮化物、酰基叠氮化物、酰卤、腈、硝酮、硫氢基、二硫化物、磺酰卤化物、异硫氰酸酯、亚氨酸酯、活化酯、酮、α,β-不饱和羰基、烯烃、马来酰亚胺、α-卤代酰亚胺、环氧化物、氮丙啶、四嗪、四唑、膦、生物素、或硫杂丙环与互补反应性基团的反应形成的官能团。

40.如权利要求1-39中任一项所述的聚合物染料，其中，L^1b的至少一次出现包含由炔烃和叠氮化物的反应形成的官能团。

41.如权利要求1-40中任一项所述的聚合物染料，其中，L^1b的至少一次出现是包含三唑基官能团的连接基。

42.如权利要求1-41中任一项所述的聚合物染料，其中，L^1b-M¹的至少一次出现包含以下结构：

其中L^c和L^d各自独立地是任选的连接基。

43.如权利要求42所述的聚合物染料，其中，L^c或L^d、或两者不存在。

44.如权利要求43所述的聚合物染料，其中，L^c或L^d、或两者存在。

45.如权利要求44所述的聚合物染料，其中，当存在时，L^c和L^d各自独立地是亚烷基或杂亚烷基。

46.如权利要求44所述的聚合物染料，其中，L^c和L^d独立地具有以下结构之一：

47.如权利要求1-46中任一项所述的聚合物染料，其中，L^1b包含以下结构之一：

其中

a、b、c、d和e各自独立地是范围1-6的整数。

48.如权利要求1-47中任一项所述的聚合物染料，其中，M¹-L^1b的至少一次出现具有以下结构之一：

49.如权利要求1-48中任一项所述的聚合物染料，其中，M¹-L^1b的每次出现具有以下结构之一：

50.如权利要求1-49中任一项所述的聚合物染料，其中，L⁷的至少一次出现是任选地取代的杂亚烷基连接基。

51.如权利要求1-50中任一项所述的聚合物染料，其中，L⁷在每次出现时独立地是任选地取代的杂亚烷基。

52.如权利要求1-51中任一项所述的聚合物染料，其中，L⁷包含酰胺官能团。

53.如权利要求1-52中任一项所述的聚合物染料，其中，L⁷的至少一次出现具有以下结构之一：

54.如权利要求1-53中任一项所述的聚合物染料，其中，L⁷的每次出现具有以下结构之一：

55.如权利要求1-54中任一项所述的聚合物染料，其中，L⁷的至少一次出现具有以下结构之一：

56.如权利要求1-55中任一项所述的聚合物染料，其中，L⁷的每次出现具有以下结构之一：

57.如权利要求1-56中任一项所述的聚合物染料，其中，R³的至少一次出现是H。

58.如权利要求1-57中任一项所述的聚合物染料，其中，R⁵在每次出现时独立地是OH、O^-或OR_d。

59.如权利要求1-58中任一项所述的聚合物染料，其中，R⁴在每次出现时是氧代。

60.如权利要求1-59中任一项所述的聚合物染料，其中，R¹和R²各自独立地是OH或-OP(＝R_a)(R_b)R_c。

61.如权利要求1-60中任一项所述的聚合物染料，其中，R¹或R²之一是OH或-OP(＝R_a)(R_b)R_c，并且R¹或R²中的另一个是Q或包含与Q的共价键的连接基。

62.如权利要求1-61中任一项所述的聚合物染料，其中，R¹和R²各自独立地是-OP(＝R_a)(R_b)R_c。

63.如权利要求1-62中任一项所述的聚合物染料，其中，R_c是OL'。

64.如权利要求1-63中任一项所述的聚合物染料，其中，L'是与以下项的杂亚烷基连接基：Q、靶向部分、分析物分子、固体载体、固体载体残基、核苷或另外的结构(I)的化合物。

65.如权利要求1-64中任一项所述的聚合物染料，其中，所述分析物分子是核酸、氨基酸或其聚合物。

66.如权利要求1-65中任一项所述的聚合物染料，其中，所述分析物分子是酶、受体、受体配体、抗体、糖蛋白、适配体或朊病毒。

67.如权利要求1-66中任一项所述的聚合物染料，其中，所述靶向部分是抗体或细胞表面受体拮抗剂。

68.如权利要求1-67中任一项所述的聚合物染料，其中，所述固体载体是聚合物珠粒或非聚合物珠粒。

69.如权利要求1-68中任一项所述的聚合物染料，其中，L'包含亚烷基氧基或磷酸二酯部分、或其组合。

70.如权利要求1-69中任一项所述的聚合物染料，其中，L'具有以下结构：

其中：

m”和n”独立地是1至10的整数；

R^e是H、电子对或抗衡离子；

L”是R^e或直接键或与以下项的键：Q、靶向部分、分析物分子、固体载体、固体载体残基、核苷或另外的结构(I)的化合物。

71.如权利要求1-70中任一项所述的聚合物染料，其中，R¹或R²具有以下结构之一：

72.如权利要求1-70中任一项所述的聚合物染料，其中，R¹或R²具有以下结构：

73.如权利要求1-72中任一项所述的聚合物染料，其中，Q包含亲核反应性基团、亲电反应性基团或环加成反应性基团。

74.如权利要求73所述的聚合物染料，其中，Q包含硫氢基、二硫化物、活化酯、异硫氰酸酯、叠氮化物、炔烃、烯烃、二烯、亲二烯体、酸卤化物、磺酰基卤化物、膦、α-卤代酰胺、生物素、氨基或马来酰亚胺官能团。

75.如权利要求74所述的聚合物染料，其中，所述活化酯是N-琥珀酰亚胺酯、亚氨酸酯或多氟苯基酯。

76.如权利要求74所述的聚合物染料，其中，所述叠氮化物是烷基叠氮化物或酰基叠氮化物。

77.如权利要求1-76中任一项所述的聚合物染料，其中，Q是选自表1的部分。

78.如权利要求1-77中任一项所述的聚合物染料，其中，M¹和M²在一次或多次出现时独立地是包含四个或更多个芳基或杂芳基环、或其组合的部分。

79.如权利要求1-78中任一项所述的聚合物染料，其中，M¹和M²在一次或多次出现时独立地是荧光的或着色的。

80.如权利要求1-79中任一项所述的聚合物染料，其中，M¹和M²是荧光的。

81.如权利要求1-80中任一项所述的聚合物染料，其中，M¹和M²在一次或多次出现时独立地包括包含至少四个稠合环的稠合多环芳基或杂芳基部分。

82.如权利要求1-81中任一项所述的聚合物染料，其中，M¹或M¹-L^1b在每次出现时独立地具有以下结构之一：

83.如权利要求1-82中任一项所述的聚合物染料，其中，M²在每次出现时独立地具有以下结构之一：

84.如权利要求1-83中任一项所述的聚合物染料，其中，对于每一个FRET供体M²，所述聚合物染料包含一个FRET受体M¹。

85.如权利要求1-84中任一项所述的聚合物染料，其中，对于每两个FRET供体M²，所述聚合物染料包含一个FRET受体M¹。

86.如权利要求1-85中任一项所述的聚合物染料，其中，对于每三个FRET供体M²，所述聚合物染料包含一个FRET受体M¹。

87.如权利要求1-86中任一项所述的聚合物染料，其中，对于每三个FRET供体M²，所述聚合物染料包含两个FRET受体M¹。

88.如权利要求1-28中任一项所述的聚合物染料，其中，n是1至100的整数。

89.如权利要求1-88中任一项所述的聚合物染料，其中，n是1至10的整数。

90.如权利要求1-89中任一项所述的聚合物染料，其中，q是1至10的整数。

91.如权利要求1-90中任一项所述的聚合物染料，其中，q是1至5的整数。

92.如权利要求1-91中任一项所述的聚合物染料，其中，q是1的整数，w是1的整数，并且n是2的整数。

93.如权利要求1-92中任一项所述的聚合物染料，其中，q是2的整数，w是1的整数，并且n是1的整数。

94.如权利要求1-93中任一项所述的聚合物染料，其中，q是3的整数，w是1的整数，并且n是1的整数。

95.如权利要求1-94中任一项所述的聚合物染料，其中，q是2的整数，w是1的整数，并且n是2的整数。

96.如权利要求1-95中任一项所述的聚合物染料，其中，m是1至6的整数。

97.如权利要求1-96中任一项所述的聚合物染料，其中，m是1的整数。

98.如权利要求1-97中任一项所述的聚合物染料，其中，y¹、y²和y³在每次出现时各自是1。

99.如权利要求1-28中任一项所述的聚合物染料，其中，所述聚合物染料具有选自表2的结构。