[go: up one dir, main page]

CN119528803A - 一种脱氧吡啶酚人工半抗原及其制备方法和应用 - Google Patents

一种脱氧吡啶酚人工半抗原及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN119528803A
CN119528803A CN202411718555.XA CN202411718555A CN119528803A CN 119528803 A CN119528803 A CN 119528803A CN 202411718555 A CN202411718555 A CN 202411718555A CN 119528803 A CN119528803 A CN 119528803A
Authority
CN
China
Prior art keywords
deoxypyridinol
artificial
reagent
hapten
enzyme
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202411718555.XA
Other languages
English (en)
Inventor
朱飞剑
张尧锋
李因来
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hangzhou Boyue Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Hangzhou Boyue Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hangzhou Boyue Biotechnology Co ltd filed Critical Hangzhou Boyue Biotechnology Co ltd
Priority to CN202411718555.XA priority Critical patent/CN119528803A/zh
Publication of CN119528803A publication Critical patent/CN119528803A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D213/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/04—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D213/24—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with substituted hydrocarbon radicals attached to ring carbon atoms
    • C07D213/54—Radicals substituted by carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals
    • C07D213/55—Acids; Esters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/76—Albumins
    • C07K14/765—Serum albumin, e.g. HSA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/06—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/535—Production of labelled immunochemicals with enzyme label or co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or enzyme substrates
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/10—Musculoskeletal or connective tissue disorders
    • G01N2800/108—Osteoporosis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明属于免疫检测领域，具体涉及一种脱氧吡啶酚人工半抗原及其制备方法和应用。本发明提供的脱氧吡啶酚人工半抗原最大程度地保留了脱氧吡啶酚的特征结构，且具有可以与载体蛋白发生偶联的活性基团，得到的人工抗原可作为抗原决定簇，通过免疫实验动物的方式获得脱氧吡啶酚抗体，利用所制得的人工半抗原、人工抗原以及抗体制备检测脱氧吡啶酚的试剂实现对于脱氧吡啶酚的检测，所制得的检测脱氧吡啶酚的试剂灵敏度高、交叉少，为脱氧吡啶酚的检测提供方便快速准确的途径。

Description

一种脱氧吡啶酚人工半抗原及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于免疫检测领域，具体涉及一种脱氧吡啶酚人工半抗原及其制备方法与应用。
背景技术
骨质疏松症是一种致残的退行性骨疾病，影响老年人群，尤其是绝经后人群女性，导致150万人骨折骨骼每年在单位，这种代谢性疾病是由于骨更新过程，当骨再吸收超过骨形成。目前的方法骨质疏松症的诊断目前的方法骨质疏松症的诊断涉及组织形态计量学研究和密度测量，预防这种疾病的努力以及开发有效的抗骨吸收治疗增加了需求用于可靠和无创的骨生化标志物再吸收，骨吸收的传统标志物，即尿钙和羟脯氨酸,缺乏诊断的临床敏感性和特异性骨质疏松症。脱氧吡啶酚(DPD)作为反映骨代谢的一个敏感而特异的生化指标，既可早期诊断骨质疏松症，降低骨折发生率，又可用于评估骨质疏松症的预后，为监测和防治骨量提前流失提供了一项简便易行、特异性强、灵敏度高的临床指标。此外，DPD在反映妊娠期和哺乳期骨吸收增加方面具有重要意义。DPD在良性骨病变诊断中可以发挥巨大作用，与传统的生化指标相比特异性更强、灵敏度更高，因此，对DPD指标的快速检测具有重要的现实意义。
发明内容
针对现有技术中对于快速检测脱氧吡啶酚(DPD)指标的需求，本发明提供了一种脱氧吡啶酚人工半抗原及其制备方法和应用，具体技术方案如下：
第一方面，本发明提供了一种脱氧吡啶酚人工半抗原，所述脱氧吡啶酚人工半抗原的结构如式Ⅳ所示：
第二方面，本发明提供了上述的脱氧吡啶酚人工半抗原的制备方法，包括以下步骤：
S1：将N-Boc-D-谷氨酸-1-叔丁酯在三乙胺存在的情况下与氯甲酸异丁酯、重氮甲烷反应，分离提纯后得到如式Ⅰ所示的中间产物Ⅰ；
S2：将中间产物Ⅰ与氢溴酸反应，分离提纯后得到如式Ⅱ所示的中间产物Ⅱ；
S3：中间产物Ⅱ与N-Boc-L-赖氨酸甲酯在碱、催化剂存在的条件下反应，分离提纯后得到如式Ⅲ所示的中间产物Ⅲ；
S4：中间产物Ⅲ在碱性条件下发生水解，分离提纯后得到如式Ⅳ所示的脱氧吡啶酚人工半抗原。
进一步地，S1中，具体步骤为：
将N-Boc-D-谷氨酸-1-叔丁酯溶于二氯甲烷，加入三乙胺，冰水浴，加入氯甲酸异丁酯，冰水浴反应，加入重氮甲烷二氯甲烷溶液，继续冰水浴反应，加入乙酸乙酯、水进行分液萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩有机相，得到如式Ⅰ所示的中间产物Ⅰ。
更进一步地，所述N-Boc-D-谷氨酸-1-叔丁酯与氯甲酸异丁酯的质量比为5：2～3。
更进一步地，所述N-Boc-D-谷氨酸-1-叔丁酯与氯甲酸异丁酯的质量比为2：1。
更进一步地，S1中，在加入乙酸乙酯、水进行分液萃取之前，加入乙酸，淬灭剩余的重氮甲烷。
进一步地，S2中，具体步骤为：
将中间产物Ⅰ溶于四氢呋喃，加入百里酚蓝作指示剂，冰水浴搅拌，滴加氢溴酸水溶液，直至溶液变为紫红色，结束反应，加入乙酸乙酯、水进行分液萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩有机相，加适量乙腈溶解，加入硅胶，旋干，柱层析提纯：洗脱液PE/EA4/1得到中间产物Ⅱ。
更进一步地，S2中，加入乙酸乙酯、水进行分液萃取之前，加入碳酸氢钠，淬灭剩余的酸，中和反应混合物。
进一步地，S3中，所述碱为碳酸钾，所述催化剂为1，8-二氮杂双环(5，4，0)-7-十一碳烯(DBU)。
进一步地，S3中，具体步骤为：
将中间产物Ⅱ溶于乙腈，加入N-Boc-L-赖氨酸甲酯、碳酸钾，氮气保护，室温搅拌，过滤，滤液旋干，加入甲醇溶解，加入1，8-二氮杂双环(5，4，0)-7-十一碳烯(DBU)，室温搅拌，加入乙酸乙酯、水，分液萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩有机相，加适量乙腈溶解，加入硅胶，旋干，柱层析提纯：洗脱液PE/EA1/4得到中间产物Ⅲ。
更进一步地，所述中间产物Ⅱ与N-Boc-L-赖氨酸甲酯的质量比为10：4～5。
更进一步地，所述中间产物Ⅱ与N-Boc-L-赖氨酸甲酯的质量比为9：4。
更进一步地，S3中，加入DBU后，通入氧气。
进一步地，S4中，具体步骤为：
将中间产物Ⅲ溶于乙醇，加入10％氢氧化钠溶液，室温搅拌，加入乙酸乙酯、水进行分液萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩有机相，旋干得到脱氧吡啶酚人工半抗原。
更进一步地，S4中，加入乙酸乙酯、水进行分液萃取之前，用乙酸调pH值至5。
第三方面，本发明提供了一种脱氧吡啶酚人工抗原，所述脱氧吡啶酚人工抗原为上述脱氧吡啶酚人工半抗原与载体蛋白偶联得到。
进一步地，所述载体蛋白为牛血清蛋白。
第四方面，本发明提供了上述的脱氧吡啶酚人工抗原的制备方法，包括以下步骤：
S1：将如权利要求1所述的脱氧吡啶酚人工半抗原与N-羟基琥珀酰亚胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺在溶剂中反应，得到反应液Ⅰ；
S2：将载体蛋白溶解，得到反应液Ⅱ；
S3：将反应液Ⅰ与反应液Ⅱ混合，反应完成后过滤、离心、取上清液得到脱氧吡啶酚人工抗原。
进一步地，S1中，所述溶剂为N,N-二甲基甲酰胺(DMF)。
进一步地，S1中，具体步骤为：
取脱氧吡啶酚半抗原，加入N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，再加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)，室温搅拌反应，反应结束离心取上清液，得到反应液Ⅰ。
更进一步地，所述脱氧吡啶酚半抗原与N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1：0.5～1。
更进一步地，所述脱氧吡啶酚半抗原与N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1：0.8。
进一步地，S2中，所述载体蛋白为牛血清蛋白。
进一步地，S2中，将载体蛋白溶解在PBS缓冲液中，得到反应液Ⅱ。
更进一步地，S3中，具体步骤为：
在快速搅拌下，将反应液Ⅰ缓慢滴加到反应液Ⅱ中，反应液Ⅰ与反应液Ⅱ的体积比为1:5，得到的混合液在4℃条件下静置保存，移入透析袋中，用pH＝2的盐酸溶液透析，完成后，移入透析袋中，用PBS缓冲液透析，透析结束后，离心取上清液即得到脱氧吡啶酚人工抗原。
进一步地，S3混合的过程中，使用的S1中的脱氧吡啶酚人工半抗原，与使用的S2中的载体蛋白，质量比为1：1～1.5。
更进一步地，S3混合的过程中，使用的S1中的脱氧吡啶酚人工半抗原，与使用的S2中的载体蛋白，质量比为1：1.25。
第五方面，本发明提供了一种脱氧吡啶酚抗体，由上述脱氧吡啶酚人工抗原免疫实验动物后制得。
第六方面，本发明提供了上述脱氧吡啶酚抗体的制备方法，包括以下步骤：
(1)将浓度为1mg/mL的脱氧吡啶酚人工抗原PBS溶液与弗氏完全佐剂混合得到混合液；
(2)将步骤(1)中得到的混合液注射到免疫动物中；
(3)对免疫动物进行采血，自血液中分离得到免疫血清，分离得到脱氧吡啶酚抗体。
进一步地，上述尼嗪类抗体的制备方法中，步骤(1)中，所述脱氧吡啶酚人工抗原PBS溶液与弗氏完全佐剂的体积比为1:1。
进一步地，上述脱氧吡啶酚抗体的制备方法中，步骤(2)中，使用步骤(1)制得的混合液对免疫动物进行注射，21天后，再次使用脱氧吡啶酚人工抗原PBS溶液与弗氏完全佐剂混合液对新西兰白兔进行注射，之后每隔14天进行注射，共注射5次。
第七方面，本发明提供了上述脱氧吡啶酚人工半抗原，脱氧吡啶酚人工抗原，或脱氧吡啶酚抗体在制备检测脱氧吡啶酚的试剂中的应用。
进一步地，所述检测脱氧吡啶酚的试剂为均相酶免疫测试试剂、酶联免疫吸附检测试剂、胶体金标记试剂、化学发光标记试剂、放射性标记试剂、荧光标记试剂、磁性颗粒标记试剂中的一种或多种。
进一步地，所述检测脱氧吡啶酚的试剂为均相酶免疫测试试剂。
第八方面，本发明提供了一种脱氧吡啶酚均相酶免疫检测试剂，所述均相酶免疫试剂包括抗脱氧吡啶酚特异性抗体以及酶试剂；
所述抗脱氧吡啶酚特异性抗体为权利要求6所述的脱氧吡啶酚抗体；
所述酶试剂由脱氧吡啶酚酶标偶联物与酶的底物组成，所述脱氧吡啶酚酶标偶联物为权利要求1所述的脱氧吡啶酚人工半抗原和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶偶联得到，所述酶的底物为葡萄糖-6-磷酸。
第九方面，本发明提供了上述脱氧吡啶酚均相酶免疫检测试剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)试剂A的制备：
将脱氧吡啶酚人工半抗原和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶偶联得到脱氧吡啶酚酶标偶联物；将制得的脱氧吡啶酚酶标偶联物分散于Tris缓冲液中；
(2)试剂B的制备：
将葡萄糖-6-磷酸、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、脱氧吡啶酚抗体分散在Tris缓冲液中；
所述试剂A与试剂B为脱氧吡啶酚均相酶免疫检测试剂。
进一步地，试剂A的制备中，所述Tris缓冲液浓度为100mM、pH＝8.1。
进一步地，试剂A的制备中，脱氧吡啶酚酶标偶联物浓度为0.01％～1％。
进一步地，试剂B的制备具体为：将5g、10mM烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和1.5g、10mM葡萄糖-6-磷酸用1L 50mM、pH＝8.0Tris缓冲液中，将实施例2制备得到的脱氧吡啶酚抗体分散在其中，脱氧吡啶酚抗体与酶的底物的比例为1:100～1:5000。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供了一种脱氧吡啶酚人工半抗原，该人工半抗原最大程度地保留了脱氧吡啶酚的特征结构，且具有可以与载体蛋白发生偶联的活性基团，偶联得到的人工抗原可作为抗原决定簇，通过免疫实验动物的方式获得脱氧吡啶酚抗体，利用所制得的人工半抗原、人工抗原或抗体实现对于脱氧吡啶酚的检测，灵敏度高、交叉少，为脱氧吡啶酚的检测提供方便快速准确的途径。
附图说明
图1为本发明脱氧吡啶酚人工抗原(Ⅳ)的制备反应式示意图。
其中，THF表示四氢呋喃，DCM表示二氯甲烷，DBU表示1，8-二氮杂双环(5，4，0)-7-十一碳烯，EDC表示1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，NHS表示N-羟基琥珀酰亚胺，DMF表示N,N-二甲基甲酰胺，BSA表示牛血清白蛋白。
图2为本发明实施例1半抗原中间体Ⅰ的质谱图；其中，Rel.Abundance(％)表示相对丰度，m/z表示荷质比。
图3为本发明实施例1半抗原中间体Ⅱ的质谱图；其中，Rel.Abundance(％)表示相对丰度，m/z表示荷质比。
图4为本发明实施例1半抗原中间体Ⅲ的质谱图；其中，Rel.Abundance(％)表示相对丰度，m/z表示荷质比。
图5为本发明实施例1半抗原Ⅳ的液相色谱图；其中，Response(mAU)表示响应值，单位是mAU。
图6为本发明实施例1半抗原Ⅳ的质谱图；其中，Rel.Abundance(％)表示相对丰度，m/z表示荷质比。
图7为本发明对比例1人工抗原Ⅵ的制备反应过程示意图。
图8为本发明对比例2人工抗原Ⅶ的制备反应过程示意图。
图9为本发明实施例1半抗原Ⅳ的吸收光谱示意图；其中，Rel.Response(％)表示相对响应值，Wavelength表示波长，单位是nm。
图10为本发明均相免疫酶测试标准曲线。
具体实施方式
为了使本领域技术人员更好地理解本发明方案，下面结合具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述。应该指出，以下详细说明都是示例性的，且仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。
基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。本发明实施例中所用的实验材料均为本领域常规的实验材料，均可通过商业渠道购买得到。未注明详细条件的实验方法使按照常规实验方法或按照供应商所建议的操作说明书进行的。
本申请中所使用的主要材料、试剂：
N-Boc-D-谷氨酸-1-叔丁酯，CAS号为：73872-71-6；三乙胺，CAS号为：121-44-8；氯甲酸异丁酯，CAS号为：543-27-1；重氮甲烷二氯甲烷，CAS号为334-88-3：N-Boc-L-赖氨酸甲酯，CAS号为：3017-32-1；N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，CAS号为6066-82-6；1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)，CAS号为：25952-53-8；牛血清蛋白，CAS号为9048-46-8；牛丙种球蛋白，CAS号为9007-83-4；脱氧吡啶酚，CAS号为83462-55-9。
实施例1脱氧吡啶酚人工半抗原以及人工抗原的制备
反应式如图1所示，包括以下步骤：
(1)脱氧吡啶酚半抗原的制备
1)将5g N-Boc-D-谷氨酸-1-叔丁酯溶于50mL二氯甲烷，加入1.9g三乙胺，冰水浴半小时，加入2.5g氯甲酸异丁酯，冰水浴反应2小时，加入2M的30mL重氮甲烷二氯甲烷溶液，继续冰水浴反应12小时，加入20mL乙酸淬灭，加入200mL乙酸乙酯，200mL水，分液萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩有机相，得到3.9g浅黄色油状物，收率：75％，对该浅黄色油状物进行质谱分析检测，中间产物I的质谱图见图2，分子离子峰的质荷比(m/z)为328.3，与其理论分子量327.2吻合，确认得到中间产物Ⅰ；
2)将3.2g浅黄色油状物A溶于40mL四氢呋喃，加入1mg百里酚蓝作指示剂，冰水浴搅拌半小时，滴加氢溴酸水溶液，直至溶液变为紫红色，结束反应，加入1g碳酸氢钠淬灭，加入200mL乙酸乙酯，200mL水，分液萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩有机相，加适量乙腈溶解，加入15g硅胶，旋干，柱层析提纯：洗脱液PE/EA4/1得到2.2g浅黄色油状物，收率：60％，对该浅黄色油状物进行质谱分析检测，中间体Ⅱ的质谱图见图3，分子离子峰的质荷比(m/z)为380.1，与其理论分子量379.1吻合，确认得到中间产物Ⅱ；
3)将1.8g浅黄色油状物B溶于20mL乙腈，加入0.8g N-Boc-L-赖氨酸甲酯，1.3g碳酸钾，氮气保护，室温搅拌12小时，过滤，滤液旋干，加入30mL甲醇溶解，加入1.4g DBU，通入氧气，室温搅拌12小时，加入200mL乙酸乙酯，200mL水，分液萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩有机相，加适量乙腈溶解，加入10g硅胶，旋干，柱层析提纯：洗脱液PE/EA1/4得到目标产物，2.38g浅黄色油状物，收率：60％，对该浅黄色油状物进行质谱分析检测，中间体Ⅲ的质谱图见图4，分子离子峰的质荷比(m/z)为840.5，与其理论分子量839.4吻合，确认得到中间产物Ⅲ；
4)将1g浅黄色油状物C溶于10mL乙醇，加入0.5g 10％氢氧化钠溶液，室温搅拌12小时，用乙酸调pH值至5，加入100mL乙酸乙酯，100mL水，分液萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩有机相，旋干得到0.9g浅黄色油状物，收率：90％，对该浅黄色固体进行LC-MS检测，确定得到脱氧吡啶酚人工半抗原(Ⅳ)。
尼嗪类人工半抗原Ⅳ的液相色谱图见图5，质谱图见图6。从图5可以看出经过纯化得到的尼嗪类人工半抗原的纯度达到98％以上。从图6可以看出本实施例得到的人工半抗原的分子离子峰为826.5，与其理论分子量825.5吻合，初步确定得到的最终化合物是本发明所设计的尼嗪类人工半抗原Ⅳ。
(2)脱氧吡啶酚人工抗原的制备
1)取120mg脱氧吡啶酚半抗原放入50mL圆底烧瓶中，加入5mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，再加入75mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和135mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)，室温搅拌反应过夜，反应结束离心取上清液，备用。
2)称取14.5g十二水磷酸氢二钠，43.8g氯化钠，1.5g二水磷酸二氢钠，用蒸馏水溶解定容至5.0L，得到0.01M、pH＝7.4的PBS缓冲液。
3)称取0.125g牛血清蛋白溶于25mL步骤2)的PBS缓冲液中，得到浓度为5mg/mL的牛血清蛋白溶液。
4)在快速搅拌下，将步骤1)的上清液缓慢滴加到牛血清蛋白溶液中，上清液与牛血清蛋白溶液的体积比为1:5，得到的混合液在4℃条件下静置保存过夜，得到人工抗原混合液。
5)将人工抗原混合液移入透析袋中，用pH＝2盐酸溶液透析12小时。
6)将5)人工抗原混合液移入透析袋中，用PBS缓冲液透析4次，透析结束后，离心取上清液即得到脱氧吡啶酚人工抗原(Ⅴ)。
实施例2脱氧吡啶酚抗体的制备
将制备的脱氧吡啶酚人工抗原免疫新西兰白兔，具体步骤如下：
(1)用PBS将上述合成的脱氧吡啶酚人工抗原稀释至1mg/mL，得到抗原溶液，然后用0.5mL抗原溶液与0.5mL弗氏完全佐剂混合，对新西兰白兔进行注射；
(2)21天后，再用0.5mL抗原溶液与0.5mL弗氏完全佐剂的混合液对新西兰白兔进行注射，之后每隔14天进行注射，共注射5次；
(3)对新西兰白兔进行采血，分离得到免疫血清，纯化得到脱氧吡啶酚抗体。
实施例3脱氧吡啶酚均相酶免疫检测试剂的制备
制备脱氧吡啶酚均相酶免疫检测试剂，具体步骤如下：
(1)脱氧吡啶酚酶标偶联物的制备
脱氧吡啶酚人工半抗原Ⅴ～Ⅶ和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶偶联得到：
1)取100mg脱氧吡啶酚半抗原放入50mL圆底烧瓶中，加入5mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，再加入75mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和135mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)，室温搅拌反应过夜，反应结束离心取上清液，备用。
2)葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液的制备：称取10mg规格为100KU的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，室温溶解于10mL含有50mg 0.05M Tris、100mg NaCl的溶液中，pH＝9.0；在溶液中加入200mg还原态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、100mg葡萄糖-6-磷酸以及0.5mL卡必醇；再逐滴加入2mL DMF中，备用。
3)将步骤1)的活化物缓慢滴入步骤2)的酶溶液中，2-8℃搅拌过夜。
4)将步骤3)偶联物混合液移入透析袋中，用pH＝2盐酸溶液透析12小时。
5)偶联物混合液移入透析袋中，用PBS缓冲液透析4次，透析结束后，离心取上清液即得到脱氧吡啶酚酶标偶联物。
(2)试剂A的制备
将步骤(1)制得的脱氧吡啶酚酶标偶联物分散于100mM、pH＝8.1的Tris缓冲液中，脱氧吡啶酚酶标偶联物浓度为0.01％～1％。
(3)试剂B的制备
将5g、10mM烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和1.5g、10mM葡萄糖-6-磷酸用1L 50mM、pH＝8.0Tris缓冲液中，将实施例2制备得到的脱氧吡啶酚抗体分散在其中，脱氧吡啶酚抗体与酶的底物的比例为1:100～1:5000。
上述试剂A与试剂B为脱氧吡啶酚均相酶免疫检测试剂。
对比例1采用不同活化方式制备脱氧吡啶酚人工抗原
脱氧吡啶酚人工抗原(Ⅵ)的制备方法(反应式如图7)，包括以下步骤：
(1)脱氧吡啶酚人工半抗原(Ⅳ)的制备：
操作步骤和实施例1脱氧吡啶酚人工半抗原半抗原的制备相同。
(2)脱氧吡啶酚人工抗原的(Ⅵ)制备：
1)取100mg脱氧吡啶酚半抗原(I)于50mL圆底烧瓶中，加入5mL N,N二甲基甲酰胺(DMF)，再加入90mg三乙胺和120mg氯甲酸异丁酯，室温搅拌反应过夜，反应结束离心取上清液，备用；
2)-6)和实施例1抗原制备相同，得到脱氧吡啶酚人工抗原(Ⅵ)。
对比例2采用不同载体蛋白制备人工抗原
脱氧吡啶酚人工抗原(Ⅶ)的制备方法(反应式如图8)，包括以下步骤：
(1)脱氧吡啶酚人工半抗原(Ⅳ)的制备：
操作步骤和实施例1脱氧吡啶酚人工半抗原半抗原的制备相同。
(2)脱氧吡啶酚人工抗原的制备：
采用牛丙种蛋白(BGG)作为载体蛋白和半抗原偶联，偶联步骤1)-2)和实施例1步骤相同。
3)称取0.125g牛丙种蛋白溶于25mL步骤2)的PBS缓冲液中，得到浓度为5mg/mL的牛丙种蛋白溶液；
4)在快速搅拌下，将步骤1)得到的上清液缓慢滴加到牛丙种蛋白溶液中，上清液与牛丙种蛋白溶液的体积比为1:5，得到的混合液在4℃条件下静置保存过夜，得到人工抗原混合液；
5)将人工抗原混合液移入透析袋中，用PBS缓冲液透析4次，透析结束后，离心取上清液即得到脱氧吡啶酚人工抗原(Ⅶ)。
测试例1脱氧吡啶酚人工抗原的性能检测
(1)摩尔吸收系数的测定
用PBS缓冲液配制配制浓度为0μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL的脱氧吡啶酚人工半抗原溶液，通过如图9所示的紫外吸收光谱图，可以看出脱氧吡啶酚半抗原的最大吸收波长为244nm，在244nm处测吸光值，每个浓度做平行样。摩尔吸光系数的计算公式为：ε＝吸光值/摩尔浓度。
(2)脱氧吡啶酚人工抗原蛋白浓度的测定
用lowry法测抗原浓度，用PBS缓冲液配制浓度为0μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、100μg/mL的牛血清蛋白液各1mL，每个浓度做平行样，在650nm处使用紫外分光光度计检测吸光值，绘制蛋白浓度与吸光值的关系曲线。将实施例1和对比例1-2制得的脱氧吡啶酚人工抗原溶解于PBS缓冲液中，按1/8比例稀释，在650nm处测得脱氧吡啶酚人工抗原的吸光值，从曲线上读取脱氧吡啶酚人工抗原溶液的相应蛋白浓度值，计算得到脱氧吡啶酚人工抗原的蛋白浓度。
(3)脱氧吡啶酚人工抗原的偶联比测定
配制100μg/mL的牛血清蛋白PBS溶液，将脱氧吡啶酚人工抗原用PBS稀释到100μg/mL，在240nm处测得吸光值A1，以PBS溶液为空白测得吸光值A2，偶联比率γ计算方法为：γ＝[(A1－A2)/ε]/(100×10-3/66000)；
其中，ε为本实施例中测定的摩尔吸光系数(L/mol)，66000为牛血清蛋白的分子量，100×10-3为牛血清蛋白浓度(g/L)；
采用牛丙种蛋白(BGG)作载体时，γ＝[(A1－A2)/ε]/(100×10-3/150000)，牛丙种蛋白分子量为1500000，100×10-3为牛血清蛋白浓度(g/L)。
各脱氧吡啶酚人工抗原的偶联比和对应的半抗原的摩尔吸收系数结果见表1所示
表1脱氧吡啶酚人工抗原Ⅴ～Ⅶ的性能检测
编号 人工抗原 抗原浓度 摩尔吸收系数 偶联比
实施例1 Ⅴ 3.42mg/mL 4856.1 27
对比例1 Ⅵ 3.21mg/mL 4759.6 16
对比例2 Ⅶ 3.19mg/mL 4812.3 20
由表1可见，人工半抗原的活化方法和载体蛋白的结构，半抗原和载体蛋白结合时的偶联比有一定的影响。
测试例2脱氧吡啶酚人工抗原的活性检测
将实施例2制备得到的免疫血清经ELISA方法检测其效价，检测结果见表2。
表2免疫血清效价
脱氧吡啶酚人工抗原 免疫血清效价
Ⅴ 1:80000
Ⅵ 1:19000
Ⅶ 1:26000
由表2可以看出，与实施例1制备的脱氧吡啶酚人工抗原相比，对比例1～2制得的脱氧吡啶酚人工抗原进行动物免疫获得的免疫血清，其效价均偏低。而利用脱氧吡啶酚人工抗原Ⅴ进行动物免疫获得的免疫血清，其效价达1:80000，可用于免疫分析中，能为脱氧吡啶酚的检测提供方便快速准确的途径。
测试例3脱氧吡啶酚用均相酶免疫性能测定
(1)标准样制备：将脱氧吡啶酚粉末溶解于乙腈溶液制成1mg/mL的母液，并将此母液稀释于空白尿液中，配置成最终浓度分别为0.0，10.0，25.0，50.0，100.0，200.0，300.0ng/mL的标准尿液样本。
(2)标准曲线：使用全自动生化分析仪，先加实施例3中制得的试剂B，再加入标准品，最后加入实施例3中制得的试剂A。加入试剂A后，测定不同时间点的吸光值，算出不同标准品浓度时的反应速率，得出较理想的反应标准曲线，具体如图10所示。
(3)样本检测：重复测定10ng/mL、50ng/mL、200ng/mL浓度质控样本5次，测定吸光值，通过如图10所示的标准曲线得出测试值，检测数据如表3所示。
表3脱氧吡啶酚标准样用均相酶免疫测试结果
从表3可以看出，本发明的均相酶免疫检测试剂测定的准确度高，可用于脱氧吡啶酚的检测应用。
测试例4药物交叉干扰实验
配制30种常见药物，浓度为50ng/mL，采用均相酶免疫方法进行检测，测试结果见表4。
表4脱氧吡啶酚药物交叉干扰试验结果
由表4可以看出，本发明的抗原免疫的抗体是脱氧吡啶酚的特异性抗体，与其它药物无交叉反应。

Claims (10)

1.一种脱氧吡啶酚人工半抗原，其特征在于，所述脱氧吡啶酚人工半抗原的结构如式Ⅳ所示：
2.如权利要求1所述的脱氧吡啶酚人工半抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：将N-Boc-D-谷氨酸-1-叔丁酯在三乙胺存在的情况下与氯甲酸异丁酯、重氮甲烷反应，分离提纯后得到如式Ⅰ所示的中间产物Ⅰ；
S2：将中间产物Ⅰ与氢溴酸反应，分离提纯后得到如式Ⅱ所示的中间产物Ⅱ；
S3：中间产物Ⅱ与N-Boc-L-赖氨酸甲酯在碱、催化剂存在的条件下反应，分离提纯后得到如式Ⅲ所示的中间产物Ⅲ；
S4：中间产物Ⅲ在碱性条件下发生水解，分离提纯后得到如式Ⅳ所示的脱氧吡啶酚人工半抗原。
3.一种脱氧吡啶酚人工抗原，其特征在于，所述脱氧吡啶酚人工抗原由如权利要求1所述的脱氧吡啶酚人工半抗原与载体蛋白偶联得到。
4.根据权利要求3所述的脱氧吡啶酚人工抗原，其特征在于，所述载体蛋白为牛血清蛋白。
5.如权利要求3所述的脱氧吡啶酚人工抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：将如权利要求1所述的脱氧吡啶酚人工半抗原与N-羟基琥珀酰亚胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺在溶剂中分散，得到反应液Ⅰ；
S2：将载体蛋白溶解，得到反应液Ⅱ；
S3：将反应液Ⅰ与反应液Ⅱ混合，反应完成后过滤、离心、取上清液得到脱氧吡啶酚人工抗原。
6.一种脱氧吡啶酚抗体，其特征在于，由权利要求3或4任一项所述的脱氧吡啶酚人工抗原免疫实验动物后制得。
7.如权利要求6所述的脱氧吡啶酚抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将浓度为1mg/mL的脱氧吡啶酚人工抗原PBS溶液与弗氏完全佐剂混合得到混合液；
(2)将步骤(1)中得到的混合液注射到免疫动物中；
(3)对免疫动物进行采血，自血液中分离得到免疫血清，分离得到脱氧吡啶酚抗体。
8.如权利要求1所述的脱氧吡啶酚人工半抗原，如权利要求3或4任一项所述的脱氧吡啶酚人工抗原，或权利要求6所述的脱氧吡啶酚抗体在制备检测脱氧吡啶酚的试剂中的应用。
9.一种脱氧吡啶酚均相酶免疫检测试剂，其特征在于，所述均相酶免疫试剂包括抗脱氧吡啶酚特异性抗体以及酶试剂；
所述抗脱氧吡啶酚特异性抗体为权利要求6所述的脱氧吡啶酚抗体；
所述酶试剂由脱氧吡啶酚酶标偶联物与酶的底物组成，所述脱氧吡啶酚酶标偶联物为权利要求1所述的脱氧吡啶酚人工半抗原和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶偶联得到，所述酶的底物为葡萄糖-6-磷酸。
10.一种如权利要求9所述的脱氧吡啶酚均相酶免疫检测试剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)试剂A的制备：
将脱氧吡啶酚人工半抗原和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶偶联得到脱氧吡啶酚酶标偶联物；将制得的脱氧吡啶酚酶标偶联物分散于Tris缓冲液中；
(2)试剂B的制备：
将葡萄糖-6-磷酸、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、脱氧吡啶酚抗体分散在Tris缓冲液中；
所述试剂A与试剂B为脱氧吡啶酚均相酶免疫检测试剂。
CN202411718555.XA 2024-11-28 2024-11-28 一种脱氧吡啶酚人工半抗原及其制备方法和应用 Pending CN119528803A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202411718555.XA CN119528803A (zh) 2024-11-28 2024-11-28 一种脱氧吡啶酚人工半抗原及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202411718555.XA CN119528803A (zh) 2024-11-28 2024-11-28 一种脱氧吡啶酚人工半抗原及其制备方法和应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN119528803A true CN119528803A (zh) 2025-02-28

Family

ID=94707909

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202411718555.XA Pending CN119528803A (zh) 2024-11-28 2024-11-28 一种脱氧吡啶酚人工半抗原及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN119528803A (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1994003814A2 (en) * 1992-07-31 1994-02-17 Metra Biosystems, Inc. Method and kit for pyridinium crosslink assay
CN105801688A (zh) * 2016-04-14 2016-07-27 苏州博源医疗科技有限公司 脱氧吡啶酚免疫原、抗体和检测试剂及制备方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1994003814A2 (en) * 1992-07-31 1994-02-17 Metra Biosystems, Inc. Method and kit for pyridinium crosslink assay
CN105801688A (zh) * 2016-04-14 2016-07-27 苏州博源医疗科技有限公司 脱氧吡啶酚免疫原、抗体和检测试剂及制备方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MACIEJ ADAMCZYK，等: "Collagen Cross-Links. Synthesis of Immunoreagents for Development of Assays for Deoxypyridinoline, a Marker for Diagnosis of Osteoporosis", BIOCONJUGATE CHEM., vol. 11, no. 1, 16 December 1999 (1999-12-16), pages 124 - 130 *
MACIEJ ADAMCZYK，等: "Collagen Cross-links: Synthesis of Pyridinoline, Deoxypyridinoline and Their Analogues", TETRAHEDRON, vol. 55, 31 December 1999 (1999-12-31), pages 63 - 88, XP004150854, DOI: 10.1016/S0040-4020(98)01023-0 *
PIETRO ALLEVI，等: "Total synthesis of deoxypyridinoline, a biochemical marker of collagen turnover", CHEM. COMMUN., 31 December 1999 (1999-12-31), pages 559 - 560, XP001079160, DOI: 10.1039/a900298g *
PIETRO ALLEVI，等: "Total synthesis of the collagen glycosylated cross-link b-Dgalactopyranosyl- O-pyridinoline and of its unnatural epimer b-Dgalactopyranosyl- O-epipyridinoline", TETRAHEDRON: ASYMMETRY, vol. 18, 7 August 2008 (2008-08-07), pages 1750 - 1757 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109824599B (zh) 一种阿苯达唑半抗原及其制备方法和应用
CN104447984B (zh) 多西紫杉醇免疫原、抗多西紫杉醇特异性抗体和多西紫杉醇检测试剂
CN104530222A (zh) 紫杉醇免疫原、抗紫杉醇特异性抗体和紫杉醇检测试剂
CN110967481B (zh) 一种拉莫三嗪衍生物、其制备方法及其在均相酶免疫检测试剂中的应用
CN110003300B (zh) 一种17-羟类固醇的衍生物、检测试剂及制备方法
KR20210143785A (ko) 미트라기닌에 대한 면역분석
CN104478813A (zh) 5-氟尿嘧啶衍生物、5-氟尿嘧啶免疫原及其抗体与5-氟尿嘧啶检测试剂盒
CN119118954B (zh) 一种苯海索人工半抗原、人工抗原及其制备方法和应用
CN107973836B (zh) 醛固酮衍生物及其制备方法、醛固酮均相酶免疫检测试剂
CN109239368A (zh) 测定孕酮的方法及试剂盒
CN119528803A (zh) 一种脱氧吡啶酚人工半抗原及其制备方法和应用
CN114920696B (zh) 奥卡西平代谢物的半抗原衍生物、人工抗原和单克隆抗体及其应用、杂交瘤细胞株
CN112225795A (zh) 6-羟基硫酸褪黑素衍生物及其免疫原、特异性抗体的制备方法和应用
CN110683965B (zh) 硝呋地腙半抗原和人工抗原及其制备方法与应用
CN114436927B (zh) 一种氨磺必利衍生物、均相酶免疫检测试剂及制备方法
CN111620931B (zh) 万古霉素衍生物及其制备方法和应用
CN102295698B (zh) 环孢霉素a免疫原、特异性抗体、检测试剂及检测试剂盒
CN115073465B (zh) 美罗培南半抗原衍生物、美罗培南人工抗原、杂交瘤细胞株、美罗培南单克隆抗体及应用
CN103145566B (zh) 一种莱克多巴胺人工抗原及其制备方法与应用
CN113968865A (zh) 倒千里光碱的半抗原、人工抗原及其制备方法与应用
CN114436987B (zh) 一种唑尼沙胺衍生物、均相酶免疫检测试剂及制备方法
CN121164619A (zh) 一种苯妥英免疫检测试剂及其制备方法和检测方法
CN121164624A (zh) 一种甲氨蝶呤免疫检测试剂及其制备方法和检测方法
Cernoch et al. Production and analytical characterization of neopterin immunoreagents for biosensor developments
CN119285554A (zh) 一种尼嗪类人工半抗原及其制备方法与应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination