CN119505032A

CN119505032A - 一种双官能化吡喃环衍生物及其制备方法和应用

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Publication number: CN119505032A
Application number: CN202411649514.XA
Authority: CN
Inventors: 曹小晞; 刘茂群
Original assignee: Shanghai Qumu Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shanghai Qumu Biotechnology Co ltd
Priority date: 2024-11-19
Filing date: 2024-11-19
Publication date: 2025-02-25
Anticipated expiration: 2044-11-19

Abstract

本发明提供了一种双官能化吡喃环衍生物及其制备方法和应用，涉及生物医药领域。所述双官能化吡喃环衍生物的结构为：

Description

一种双官能化吡喃环衍生物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种双官能化吡喃环衍生物及其制备方法和应用。

背景技术

首次关于HYALURONIC ACID(HA)的研究可以追溯到1880年：法国科学家Portes观察到玻璃体中的粘蛋白不同于角膜和软骨中的其他粘多糖，并将其命名为“透明粘蛋白”。然而，直到1934年，Meyer和Palmer才从牛玻璃体中分离出一种含有氨基糖和糖醛酸的新多糖，并将其命名为HA，意为“透明体”(玻璃体)和“糖醛酸”。在1930年代和1950年代期间，HA也从人类脐带、鸡冠和链球菌中分离出来。

自1940年代以来，HA的物理化学性质得到了广泛研究，并且其化学结构在1954年由Meyer和Weissmann解析出来。20世纪下半叶，对HA生物学角色的逐步理解引起了对其生产和开发为医用产品的浓厚兴趣。因此，从动物组织中提取HA的工艺逐渐优化，但仍然存在一些去除不需要的污染物(如微生物、蛋白质)的问题。在1970年代之前，已经开展了通过细菌发酵和化学合成生产HA的初步研究。

1979年，Balazs首次生产出制药级HA，他开发了一种从鸡冠和人类脐带中提取和纯化聚合物的有效方法。Balazs的方法为HA的工业生产奠定了基础。自20世纪80年代初以来，HA作为开发植入用人工晶状体的原材料得到了广泛研究，因其对角膜内皮的安全性和保护作用，成为眼科领域的主要产品。此外，HA还被发现对关节和皮肤疾病的治疗、伤口愈合和软组织增容有益。

自20世纪80年代后期以来，HA还被用于配制药物递送系统，至今仍在继续努力开发基于HA的载体以提高治疗效果。在1990年代和2000年代，特别关注识别和表征参与HA代谢的酶，并开发细菌发酵技术以生产具有控制尺寸和多分散性的HA。如今，HA在各种医疗、制药、营养和化妆品应用中占据关键地位。因此，HA仍然是研究的热点，以阐明其生物合成途径和分子生物学，优化其生物技术生产，合成具有改良性质的衍生物，并优化和实施其治疗和美学用途。

功能化改性HA在医学和生物工程领域展示了许多独特的优点，使其成为一种理想的生物材料。

增强的稳定性和耐久性：通过化学修饰和交联，改性HA可以显著提高其在体内的稳定性，减少HA酶的降解作用。这种增强的稳定性使得HA在应用中能够维持更长时间的疗效。

刺激响应性：改性HA可以结合不同的刺激响应性基团，实现对特定外部刺激(如pH值、温度、光、电场或磁场)的响应。这种特性使得HA能够在特定条件下释放药物，提高药物的靶向性和有效性。例如，pH响应性HA可以在肿瘤微环境的酸性条件下触发药物释放，温度响应性HA则可以在体温变化时调节药物释放速率。

增强的生物相容性：改性HA能够与细胞和组织更好地相互作用，提供优异的生物相容性。这种特性使其在组织工程、伤口愈合和软组织填充等应用中表现出色。

多功能性和可调控性：通过不同的化学修饰，改性HA可以具备多种功能，如增加其机械强度、调节其降解速度和改进其药物载体性能。这种多功能性使得HA能够适应各种生物医学需求，提供个性化和定制化的治疗方案。

提高药物递送效率：改性HA作为药物递送系统的载体，能够提高药物的溶解度和生物利用度，并实现控制释放。这种智能药物递送系统在癌症治疗、炎症控制和慢性病管理中具有显著优势。

改性HA的这些优点使其在现代生物医学中占据重要地位，并推动了其在治疗和美容领域的广泛应用。随着研究的深入和技术的进步，改性HA的应用前景将更加广阔。

发明内容

本发明通过一锅两步法工艺成功制备了一种具有新颖结构的双官能化改性吡喃环衍生物，所述双官能化基团为醛基与胺基或醛基与酰肼基团。双官能化吡喃环衍生物可在水溶液中通过席夫碱缩合反应形成原位自交联水凝胶，并且由于席夫碱缩合反应可逆，该凝胶具备自愈合性能，是一种良好的新型生物相容性高分子生物材料，可以作为水凝胶原料并开发成伤口敷料、愈合粉、凝胶药物载体、凝胶细胞载体等生物医用产品。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明提供了一种双官能化吡喃环衍生物，其结构如下式I所示：

式I中，x、y、z分别为三种结构单元所占的百分比，x+y+z＝100％；

R为胺基或酰肼基团。

进一步地，R为以下基团中的任一种：

进一步地，所述双官能化吡喃环衍生物的分子量为10-2500kDa，优选200-1000kDa，更优选400-600kDa。

进一步地，所述式I化合物中醛基的取代度为10-90％，优选30-60％，更优选40-50％；胺基或酰肼基团的取代度为20-80％，优选30-60％，更优选45-55％。

在本发明中，取代度表示被取代的吡喃环单元占全部吡喃环单元的百分比。

本发明还提供了上述双官能化吡喃环衍生物的制备方法，包括如下步骤：

(1)将透明质酸溶解，加入高碘酸钠，搅拌一定时间；

(2)加入乙二醇，搅拌一定时间；

(3)将溶液pH值调整为4.7-4.8，加入EDCI(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐)搅拌一定时间；

(4)加入胺类化合物或酰肼类化合物，搅拌一定时间；

(5)将反应物进行透析纯化，所得纯化液冷冻干燥后即得所述双官能化吡喃环衍生物。

上述反应的具体反应路线如下：

进一步地，步骤(1)中所述透明质酸的分子量为10-2500kDa，优选200-1000kDa，更优选400-600kDa。

进一步地，步骤(1)中溶解透明质酸的溶剂为水、生理盐水或PBS缓冲液。

进一步地，步骤(1)中所述透明质酸溶解后的质量浓度为0.1-20％，优选0.5-4％。

进一步地，步骤(1)中所述高碘酸钠与透明质酸的摩尔比为0.1-100：1，优选1-10：1。

进一步地，步骤(1)中所述搅拌的时间为1-24小时。

进一步地，所述高碘酸钠与乙二醇的摩尔比为1：10-1000，优选1：20-200。

进一步地，步骤(2)中所述搅拌的时间为1-24小时。

进一步地，步骤(3)中所述EDCI与透明质酸的摩尔比为0.1-100：1，优选1-10：1。

进一步地，步骤(3)中所述搅拌的时间为1-24小时。

进一步地，步骤(4)中所述胺类化合物为含有两个或两个以上胺基的有机化合物。

进一步地，步骤(4)中所述胺类化合物为乙二胺、丙二胺、丁二胺、对苯二胺或间苯三胺。

进一步地，步骤(4)中所述酰肼类化合物为含有两个或两个以上肼类的有机化合物。

进一步地，步骤(4)中所述酰肼类化合物为乙二酸二酰肼、丙二酸二酰肼、丁二酸二酰肼、对苯二酸二酰肼、间苯二酸二酰肼或间苯三酸三酰肼。

进一步地，步骤(4)中所述胺类化合物或酰肼类化合物与透明质酸的摩尔比为2-1000：1，优选5-40：1。

进一步地，步骤(4)中所述搅拌的时间为1-24小时。

本发明还提供了一种由上述双官能化吡喃环衍生物制备的水凝胶。

进一步地，所述水凝胶的制备方法包括：将本发明的双官能化吡喃环衍生物粉碎后溶解于水中，搅拌即得所述水凝胶。

本发明还提供了上述双官能化吡喃环衍生物或上述水凝胶在生物医药或医学美容等领域中的用途，具体可用于制备伤口敷料、愈合粉、凝胶药物载体、凝胶细胞载体、肿瘤放射性隔离凝胶、血管栓塞凝胶、动脉瘤封堵剂、眼科粘弹剂、膝关节注射凝胶等。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

1、本发明的制备工艺简单，采用一锅两步法即可得到双官能化吡喃环衍生物，无需对中间产物进行纯化，且醛基、胺基或酰肼基团的取代度可以进行调节。

2、避免了有机溶剂的使用，从根本上排除了产品中有机溶剂的残留问题，生物相容性更好，植入人体的排异反应及炎症反应发生概率可以大大降低。

3、开创性地将两种互相反应的官能团同时接枝在透明质酸主链上，使所得吡喃环衍生物在溶解后可自发形成交联水凝胶结构。

附图说明

图1为本发明实施例1制备的HA-CHO-EDA的¹H-NMR谱图。

图2为本发明实施例2制备的HA-CHO-SDH的¹H-NMR谱图。

图3为本发明实施例5中双官能度吡喃环衍生物MTT细胞相容性实验结果。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。另外，值得说明的是，本发明所涉及的原料如无特殊说明均为普通市售产品。

实施例1、醛基-胺基-双官能化吡喃环衍生物(HA-CHO-EDA)的合成

将10克500kDa分子量的透明质酸溶解于1L纯净水中，加入1倍当量高碘酸钠，室温搅拌24小时，加入50倍当量乙二醇，室温搅拌2小时。使用1M盐酸将溶液pH调整至4.7-4.8，加入2倍当量缩合剂EDCI搅拌15分钟，加入5倍当量乙二胺(EDA)搅拌4小时，将反应体系转移至截留分子量为1kDa的透析袋中进行透析纯化，所得纯化溶液经过冷冻干燥得到白色纤维状HA-CHO-EDA产物8.2克，产物¹H-NMR谱图如附图1所示。

经测，产物中醛基的取代度为16％，胺基的取代度为47.5％。

HA-CHO-EDA的结构式如下：

实施例2、醛基-酰肼-双官能化吡喃环衍生物(HA-CHO-SDH)的合成

将10克1000kDa分子量透明质酸溶解于1L纯净水中，加入2倍当量高碘酸钠，室温搅拌24小时，加入100倍当量乙二醇，室温搅拌2小时。使用1M盐酸将溶液pH调整至4.7-4.8，加入2倍当量缩合剂EDCI搅拌15分钟，加入8倍当量丁二酸二酰肼(SDH)搅拌4小时，将反应体系转移至截留分子量为1kDa的透析袋中进行透析纯化，所得纯化溶液经过冷冻干燥得到白色纤维状HA-CHO-SDH产物8.6克，产物¹H-NMR谱图如附图2所示。

经测，产物中醛基的取代度为20％，酰肼的取代度为48％。

HA-CHO-SDH的结构式如下：

实施例3、HA-CHO-EDA凝胶合成

将实施例1中制备的HA-CHO-EDA粉碎后分别取0.1克、0.2克、0.4克、0.6克、0.8克溶解于10毫升纯净水中，粉末溶解过程中溶液粘稠度逐渐增大，持续搅拌直至形成均一凝胶，即得到Hydrogel_CHO-EDA1％、Hydrogel_CHO-EDA2％、Hydrogel_CHO-EDA4％、Hydrogel_CHO-EDA6％、Hydrogel_CHO-EDA8％。

实施例4、HA-CHO-SDH凝胶合成

将实施例2中制备的HA-CHO-SDH粉碎后分别取0.1克、0.2克、0.4克、0.6克、0.8克溶解于10毫升纯净水中，粉末溶解过程中溶液粘稠度逐渐增大，持续搅拌直至形成均一凝胶，即得到Hydrogel_CHO-SDH1％、Hydrogel_CHO-SDH2％、Hydrogel_CHO-SDH4％、Hydrogel_CHO-SDH6％、Hydrogel_CHO-SDH8％。

实施例5、细胞相容性试验

将实施例1-2中制备的吡喃环衍生物分别用DMEM细胞配样液配制成一系列浓度的样品(0，500，1000，2500g/mL)，并进行过滤除菌。采用MTT法对L929成纤维细胞进行样品细胞毒性测试。浓度为0的一组为空白对照组，其他为实验组。将对数期生长的L929细胞接种到96孔细胞培养板中(细胞浓度8.0×10³个/孔)，隔夜培养待细胞贴壁后，分别加入上述空白对照组和实验组溶液，每孔100μL，设置3个复孔。培养24h后，MTT法测定570nm处吸光值并计算细胞相对存活率。

计算公式为：细胞存活率(％)＝(实验组OD平均值/空白对照组OD平均值)×100％。

结果如附图3所示，各实验组的细胞存活率均在90％以上，说明实施例1-2中制备的吡喃环衍生物均无明显毒性。

实施例6、水凝胶粘弹性检测

使用TA-RH-2型流变仪与8mm探头检测实施例3与实施例4所得水凝胶流变力学性能，另设20万分子量透明质酸作为对照组溶解于同样浓度的水中进行粘弹性检测。

结果如表1所示：

表1：

如表1所示，双官能度HA衍生物在溶解后除Hydrogel_CHO-EDA1％样品组未形成水凝胶外，其余样品组均形成均一交联结构水凝胶(弹性模量大于粘性模量)，并且水凝胶强度范围随着衍生物浓度增加而增大。20万分子量透明质酸作为对照组溶解于同样浓度水中，如表1所示，在1％、2％、4％浓度下得到粘稠溶液，均未发生交联反应(粘性模量大于弹性模量)，6％与8％浓度样品未溶解至均一状态。

实施例7、双官能度吡喃环衍生物止血效果实验

7.1准备物品

戊巴比妥麻药，1ml无菌注射器，纱布，天平，盒托，镊子，剪刀，手术刀，酒精消毒剂，纸巾。

7.2实验步骤

1.8只SD大鼠，称重，腹腔麻醉，标记；

2.使用外科切割工具切割40％的鼠尾长度，近端鼠尾置于预先称重的10层5cm*5cm的纱布上，让尾巴在空气中停留15秒，以确保正常失血，再进行后续实验；

3.治疗组：鼠截尾并正常出血后，将透明质酸原料及吡喃环衍生物粉末施加于出血部位，每组粉末用量0.2克，用量需覆盖伤口部位。观察并记录停止出血时间，停止出血后称重纱布，记录出血量；

4.空白组：鼠截尾并正常出血后，观察并记录停止出血时间，停止出血后称重纱布，记录出血量；

5.止血后，给伤口处施加抗生素药膏保护(红霉素眼药膏)。

6.大鼠苏醒后观察动物状态，并记爬行动作行为。

7.3结果记录于表2中。

表2：

最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims

1.一种双官能化吡喃环衍生物，其结构如下式I所示：

R为胺基或酰肼基团；优选地，R为以下基团中的任一种：

2.根据权利要求1所述的双官能化吡喃环衍生物，其特征在于，所述双官能化吡喃环衍生物的分子量为10-2500kDa，优选200-1000kDa，更优选400-600kDa。

3.根据权利要求1所述的双官能化吡喃环衍生物，其特征在于，所述式I化合物中醛基的取代度为10-90％，优选30-60％，更优选40-50％；所述胺基或酰肼基团的取代度为20-80％，优选30-60％，更优选45-55％。

4.权利要求1-3任一项所述的双官能化吡喃环衍生物的制备方法，包括如下步骤：

(1)将透明质酸溶解，加入高碘酸钠，搅拌一定时间；

(2)加入乙二醇，搅拌一定时间；

(3)将溶液pH值调整为4.7-4.8，加入EDCI搅拌一定时间；

(4)加入胺类化合物或酰肼类化合物，搅拌一定时间；

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述透明质酸的分子量为10-2500kDa，优选200-1000kDa，更优选400-600kDa；

优选地，步骤(1)中溶解透明质酸的溶剂为水、生理盐水或PBS缓冲液；

优选地，步骤(1)中所述透明质酸溶解后的质量浓度为0.1-20％，优选0.5-4％；

优选地，步骤(1)中所述高碘酸钠与透明质酸的摩尔比为0.1-100：1，优选1-10：1。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述高碘酸钠与乙二醇的摩尔比为1：10-1000，优选1：20-200；优选地，所述EDCI与透明质酸的摩尔比为0.1-100：1，优选1-10：1；优选地，所述胺类化合物或酰肼类化合物与透明质酸的摩尔比为2-1000：1，优选5-40：1。

7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述胺类化合物为含有两个或两个以上胺基的有机化合物，所述酰肼类化合物为含有两个或两个以上肼类的有机化合物；

优选地，所述胺类化合物为乙二胺、丙二胺、丁二胺、对苯二胺或间苯三胺，所述酰肼类化合物为乙二酸二酰肼、丙二酸二酰肼、丁二酸二酰肼、对苯二酸二酰肼、间苯二酸二酰肼或间苯三酸三酰肼。

8.一种由权利要求1-3任一项所述的双官能化吡喃环衍生物制备的水凝胶。

9.权利要求8所述的水凝胶的制备方法，所述方法包括：将权利要求1-3任一项所述的双官能化吡喃环衍生物粉碎后溶解于水中，搅拌即得所述水凝胶。

10.权利要求1-3任一项所述的双官能化吡喃环衍生物或权利要求8或9所述的水凝胶在生物医药或医学美容等领域中的用途。