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CN119499379B - Elane基因作为心力衰竭靶点的制药用途和西维来司他的新用途 - Google Patents

Elane基因作为心力衰竭靶点的制药用途和西维来司他的新用途

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CN119499379B
CN119499379B CN202411324037.XA CN202411324037A CN119499379B CN 119499379 B CN119499379 B CN 119499379B CN 202411324037 A CN202411324037 A CN 202411324037A CN 119499379 B CN119499379 B CN 119499379B
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heart failure
tac
heart
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Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及ELANE基因作为心力衰竭靶点的制药用途和西维来司他的新用途。本发明通过在压力负荷性心力衰竭的心肌细胞中过表达ELANE基因，能够增加心衰阶段射血分数，减缓心肌细胞凋亡，有效恢复心脏功能。明确了ELANE可作为药物或基因治疗中的靶基因，应用于压力负荷性心力衰竭的预防、缓解或/和治疗，为压力负荷性心力衰竭的防治提供新的策略。本发明还提供了西维来司他的新用途，西维来司他能够显著改善压力负荷诱导的心力衰竭小鼠心心脏功能、心肌纤维化情况，为治疗心力衰竭的有效药物，可以用于制备治疗抗心力衰竭的药物。

Description

ELANE基因作为心力衰竭靶点的制药用途和西维来司他的新 用途
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及ELANE基因作为心力衰竭靶点的制药用途和西维来司他的新用途。
背景技术
心力衰竭是指由于多种原因导致的心脏结构和(或)功能的异常改变，致使心室的收缩泵血和(或)舒张充盈功能障碍而引起的心脏输出血量无法满足机体正常生理功能所需的一种复杂的慢性临床综合征。心力衰竭的致病因素多种多样，包括缺血性心肌病，高血压性心脏病，遗传性心肌病以及心脏瓣膜病等，其中导致原发性心肌损害的缺血性心肌病和引起左心室后负荷增加的高血压性心脏病为最主要的两项致病因素。在高血压性心脏病中，由于外周循环阻力增高，左心室所面临的压力也相应增加。为了克服后负荷升高保证正常的心脏泵血，左室心肌将进行代偿性生长，从而导致心脏病理性重构的发生。然而，随着疾病不断进展，心脏病理性重构不断加剧，心脏功能也逐渐由代偿状态转变为失代偿状态，最终导致心力衰竭。虽然心力衰竭的病理过程有了更深的理解并在治疗方面取得了一定的进展。然而，心脏的病理性重构和心力衰竭发生的更为精确的深层病理机制仍有待进一步研究。
中性粒细胞弹性酶(Neutrophil elastase,ELANE,NE)是一种由ELANE基因编码的丝氨酸蛋白酶，主要在细胞内和细胞外病原体破坏中发挥作用。它对多种细胞外基质蛋白以及多种非基质蛋白(如细胞因子/趋化因子、细胞表面蛋白/受体和其他功能性可溶性蛋白)具有有效的蛋白水解活性。NE与多种破坏性和炎症性疾病有关，包括慢性和急性肺部疾病以及动脉粥样硬化。具体而言，在人类动脉粥样硬化斑块中均可检测到NE mRNA和蛋白，并且在动脉粥样硬化发展过程中观察到血浆NE活性增加。有研究也已经证实了NE在动脉粥样硬化和损伤诱导的新内膜平滑肌细胞增生中的作用。然而，NE是否参与了心脏压力负荷过载情况下心肌的适应性重构和心肌功能调节，尚未可知。
西维来司他(sivelestat)是一种已经上市的选择性中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂，是全球首个被批准用于治疗伴有全身性炎症反应综合症的急性肺损伤的药物，用于治疗该疾病日给药剂量为4.8mg/kg/天(0.2mg/kg/h持续24小时静脉给药)。基于其对NE的高度选择性抑制作用，西维来司他被期望用于治疗多种类型的疾病。
现有技术中所公开的关于西维来司他的心脏疾病治疗用途，主要与脓毒症诱导的心肌损伤相关。未见报道西维来司他能够用于治疗或缓解其他类型的心脏疾病，特别是压力负荷诱导的心力衰竭。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了ELANE基因或其编码的蛋白NE在压力负荷性心力衰竭中的病理生理意义及在治疗压力负荷性心力衰竭治疗中的应用，以期为开发心力衰竭治疗药物提供候选靶点。并且提供了西维来司他或其药学上可接受的盐在制备治疗或缓解心力衰竭的药物中的用途。
一方面，本发明提供了抑制或沉默中性粒细胞弹性酶活性的物质在心脏疾病中的制药用途。
具体地，所述的物质包括但不限于：西维来司他或其药学上可接受的盐或其可药用衍生物；
和/或，乌司他丁或其药学上可接受的盐或其可药用衍生物；
和/或，黄酮苷元及其糖苷和甲基化、乙酰化和羟基化衍生物。
优选地，所述的物质为西维来司他或其药学上可接受的盐或其可药用衍生物。
进一步优选地，所述的物质为西维来司他。
具体地，所述的心脏疾病包括但不限于：冠状动脉疾病、心律失常、心肌病、心力衰竭、心包疾病、高血压性心脏病或肺源性心脏病。
进一步具体地，所述的心脏疾病为心力衰竭。
更进一步具体地，所述的心脏疾病为压力负荷诱导的心力衰竭。
又一方面，本发明提供了抑制或沉默中性粒细胞弹性酶基因表达的物质在心脏疾病中的制药用途。
具体地，所述的物质包括但不限于：西维来司他或其药学上可接受的盐或其可药用衍生物；
和/或，乌司他丁或其药学上可接受的盐或其可药用衍生物；
和/或，黄酮苷元及其糖苷和甲基化、乙酰化和羟基化衍生物。
优选地，所述的物质为西维来司他或其药学上可接受的盐或其可药用衍生物。
进一步优选地，所述的物质为西维来司他。
具体地，所述的心脏疾病为冠状动脉疾病、心律失常、心肌病、心力衰竭、心包疾病、高血压性心脏病或肺源性心脏病。
进一步具体地，所述的心脏疾病为心力衰竭。
更进一步具体地，所述的心脏疾病为压力负荷诱导的心力衰竭。
又一方面，本发明提供了西维来司他或其药学上可接受的盐或其可药用衍生物在制备治疗心脏疾病的药物中的应用。
具体地，所述的心脏疾病为冠状动脉疾病、心律失常、心肌病、心力衰竭、心包疾病、高血压性心脏病或肺源性心脏病。
进一步具体地，所述的心脏疾病为心力衰竭。
更进一步具体地，所述的心脏疾病为压力负荷诱导的心力衰竭。
具体地，所述的药物还包括药学上可接受的辅料。
进一步具体地，所述的药学上可接受的辅料选自润湿剂、乳化剂、防腐剂、抗氧化剂、缓冲剂、赋形剂、稀释剂、润滑剂、抑菌剂、悬浮剂、助悬剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂、甜味剂以及香料中的一种或两种以上的组合。
优选地，所述药学上可接受的辅料为选自乳糖、甘露糖、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、硬脂酸镁和矿物油中的至少一种。
具体地，所述的药物的剂型包括但不限于：溶液剂型、乳剂型或粉末型。
又一方面，本发明提供了一种治疗心脏疾病的药物组合物，包含抑制或沉默ELANE基因表达的物质。
具体地，所述的物质包括但不限于：西维来司他或其药学上可接受的盐或其可药用衍生物；
或，乌司他丁或其药学上可接受的盐或其可药用衍生物；
或，黄酮苷元及其糖苷和甲基化、乙酰化和羟基化衍生物。
具体地，所述的物质为西维来司他或其药学上可接受的盐或其可药用衍生物。
优选地，所述的物质为西维来司他。
具体地药物组合物还包括药学上可接受的辅料。
进一步具体地，所述的药学上可接受的辅料选自润湿剂、乳化剂、防腐剂、抗氧化剂、缓冲剂、赋形剂、稀释剂、润滑剂、抑菌剂、悬浮剂、助悬剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂、甜味剂以及香料中的一种或两种以上的组合。
优选地，所述药学上可接受的辅料为选自乳糖、甘露糖、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、硬脂酸镁和矿物油中的至少一种。
具体地，所述的药物组合物的剂型为溶液剂型、乳剂型或粉末型。
本发明所取得的技术效果：
(1)NE在压力负荷性心力衰竭血清及心脏组织中高表达。
(2)NE敲除能够显著缓解压力负荷性心力衰竭小鼠心功能、心肌纤维化、心肌肥大及心肌炎症。
(3)AAV9介导的NE过表达能够加剧压力负荷性心力衰竭小鼠心功能、心肌纤维化、心肌肥大及心肌炎症。
(4)西维来司他能够缓解压力负荷诱导小鼠心脏功能。
(5)西维来司他能够缓解压力负荷诱导心力衰竭小鼠心肌纤维化及心肌肥大。
附图说明
图1为主动脉弓部缩窄诱导(TAC)的心力衰竭引起小鼠血清和心脏浸润的中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)增加，其中，A为蛋白质印迹(Western blotting)检测各组小鼠心肌组织中NE蛋白表达水平；B为TAC14天后不同组小鼠血液中NE含量；C为TAC 14天后不同组小鼠心脏中NE含量；D为免疫荧光检测假手术组及TAC 14天小鼠心脏中NE表达；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。
图2为NE敲除小鼠血清中NE水平检测；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。
图3为NE敲除改善TAC诱导心力衰竭小鼠心功能、心脏肥大，其中，A为各组超声心动图、心脏大小及WGA染色；B为各组小鼠心肌存活率统计；C为各组小鼠心脏体重比；D为各组小鼠心脏胫骨长度比；E为各组小鼠射血分数；F为各组小鼠左室短轴缩短率；G为各组小鼠心肌细胞横截面积统计；(H-J)为各组小鼠心肌组织中ANP、BNP及β-MHC的mRNA表达水平；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。
图4为NE敲除改善TAC诱导心力衰竭小鼠心肌纤维化，其中A为马松(Masson)染色、天狼猩红染色(Picrosirius red)和HE染色；B为蛋白质印迹(Western blotting)检测各组小鼠心肌组织中CollagenⅠ、TGF-β蛋白表达水平；C为CollagenⅠ蛋白的半定量分析(差异倍数)；D为TGF-β蛋白的半定量分析(差异倍数)；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。
图5为NE敲除改善TAC诱导心力衰竭小鼠心脏炎症，其中A为各组小鼠心肌组织中IL-1β的mRNA表达水平；B为各组小鼠心肌组织中IL-6的mRNA表达水平；C为各组小鼠心肌组织中TNF-α的mRNA表达水平；D为各组小鼠心肌组织中MCP1的mRNA表达水平；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。
图6为过表达NE小鼠血清中NE表达水平显著增加；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。
图7为NE过表达加剧TAC诱导心力衰竭小鼠心功能降低及心脏肥大，其中，A为各组超声心动图、心脏大小及WGA染色；B为各组小鼠心肌存活率统计；C为各组小鼠心脏体重比；D为各组小鼠心脏胫骨长度比；E为各组小鼠射血分数；F为各组小鼠左室短轴缩短率；G为各组小鼠心肌细胞横截面积统计；(H-J)为各组小鼠心肌组织中ANP、BNP及β-MHC的mRNA表达水平；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。
图8为NE过表达加剧TAC诱导心力衰竭小鼠心脏心肌纤维化，其中A为马松(Masson)染色、天狼猩红染色(Picrosirius red)和HE染色；B为Western blotting检测各组小鼠心肌组织中CollagenⅠ、TGF-β蛋白表达水平；C为B为CollagenⅠ蛋白的半定量分析(差异倍数)；D为TGF-β蛋白的半定量分析(差异倍数)；；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。
图9为NE过表达加剧TAC诱导心力衰竭小鼠心脏慢性炎症，其中A为各组小鼠心肌组织中IL-1β的mRNA表达水平；B为各组小鼠心肌组织中IL-6的mRNA表达水平；C为各组小鼠心肌组织中TNF-α的mRNA表达水平；D为各组小鼠心肌组织中MCP1的mRNA表达水平；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。
图10为不同浓度西维来司他钠对TAC诱导心力衰竭小鼠心功能的影响，其中，A为各组超声心动图；B为各组小鼠左心室射血分数；C为各组小鼠左室缩短分数；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。
图11为不同浓度西维来司他钠对各组小鼠心脏大小的影响，其中，A各组小鼠心脏大小；B为各组小鼠心脏体重比；C为各组小鼠心脏胫骨长度比；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。
图12为不同浓度西维来司他钠对各组小鼠心脏心肌细胞大小的影响，其中，A为WGA染色；B为各组小鼠心肌细胞横截面积统计；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。
图13为不同浓度西维来司他钠对各组小鼠心脏心肌纤维化的影响，包括马松(Masson)染色，天狼猩红染色(Picrosirius red)和HE染色。
图14为不同浓度西维来司他钠对各组小鼠心肌组织纤维化相关蛋白的影响，其中，A为Western blotting检测各组小鼠心肌组织中CollagenⅠ、TGF-β蛋白表达水平；B为CollagenⅠ蛋白的半定量分析(差异倍数)；C为TGF-β蛋白的半定量分析(差异倍数)；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。
图15为不同浓度西维来司他钠对各组小鼠肝肾功能相关指标的影响，其中，A为各组小鼠血清AST水平；B为各组小鼠血清SER水平；C为各组小鼠血清ALT水平；D为各组小鼠血清BUN水平；E为各组小鼠血清UA水平；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1NE在TAC诱导的心力衰竭小鼠模型心肌中的表达情况研究
采用Western B1ot、Elisa、免疫荧光检测TAC诱导的心力衰竭小鼠心肌中NE的表达水平。
1.1实验小鼠选取及分组
8-10周龄SPF级C57BL/6J背景小鼠以及同背景WT小鼠购自赛业生物科技有限公司(Suzhou,Jiangsu,China)。并在研究开始前接受适应性喂养1周。所有小鼠于SPF级实验动物中心进行饲养，房间温度保持在22±1℃，湿度维持在50±10％，采用人工循环照明，每天12小时的光照和12小时的黑暗，自由摄食饮水。
将实验小鼠随机分为假手术组、TAC诱导心力衰竭组，其中TAC诱导心力衰竭组又分为术后3天、14天、28天和56天四组，每组6只。TAC诱导心力衰竭组小鼠进行TAC手术处理，假手术组小鼠行相同的手术，但没有进行结扎处理。
1.2TAC诱导心力衰竭小鼠模型的构建
对TAC诱导心力衰竭组小鼠进行TAC手术处理，构建TAC诱导心力衰竭的小鼠模型。具体的操作步骤为：通过腹腔注射三溴乙醇使小鼠麻醉。当小鼠被深度麻醉时，切开气管前部的皮肤，钝性分离肌肉组织。轻轻抬起并切开第二根肋骨,拉到两侧，充分暴露主动脉弓。采用6-0尼龙缝合线收紧并结扎26号针，以完成右无名、左颈总动脉之间的横主动脉收缩，然后缝合胸骨和皮肤。多普勒超声心动图显示经主动脉横切速度大于4m/s，证实了TAC手术成功。将小鼠转移到加热垫上，并进行密切监测。所有操作人员和分析人员均采用盲法随机化，以避免小鼠基因型偏好。假手术组小鼠行相同的手术步骤，但没有进行结扎处理。
1.3TAC诱导心力衰竭小鼠血清中NE表达的蛋白质印迹(Western blotting)、酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测
(1)蛋白质印迹(Western blotting)检测
采用western Blot检测各组小鼠血清中NE表达的具体步骤如下：
1)蛋白提取及定量
将蛋白裂解液与蛋白酶抑制剂及磷酸酶抑制剂按100：1的比例加入配置成蛋白提取液，混匀置于冰上待用；
动物蛋白提取：取下一小块组织放入离心管中，按每0.1g组织加入1mL的蛋白提取液，然后使用匀浆器进行匀浆，直至组织碎块微小化，随后将管子放在冰上，让其在冰上裂解20分钟。将离心管置于4℃的离心机中，12000g离心15分钟，随后将上清液转移到新的离心管中；取适量上清液用于蛋白浓度的测定，余量分装放入-80℃冰箱保存。
将试剂盒中的标准蛋白稀释至浓度为0.5mg/μL；计算标准品和样品数量，配制适量BCA工作液用于蛋白浓度测定；将稀释后的标准蛋白按0、2、4、8、16、20μL加入到96孔板中，随后每孔加入不同体积的纯水补齐至20μL；将待测蛋白样品加到96孔板中，加纯水补齐至20μL；每孔加入200μL BCA工作液，37℃孵育30分钟；在酶标仪562nm波长下测量吸光度；使用标准蛋白的浓度和对应的吸光度制作标准曲线，根据标准曲线计算检测样品中的蛋白浓度；据样品检测的浓度，按照每一份样品含20μg蛋白配置成20μL体系(5×Loadingbuffer4μL，剩余体积用蛋白裂解液补足)；100℃加热10分钟使蛋白变性；变性后的蛋白放在冰上冷却后直接上样进行电泳，或者储存在-20℃冰箱备用。
2)SDS-PAGE
(1)用清洁的玻璃板安装制胶装置，调配10％的分离胶溶液并将其加入制胶槽中，室温下静置。等待分离胶凝固后，调配5％的浓缩胶溶液并快速加入制胶槽中，加满后立即垂直插入梳子，注意避免气泡产生，再次让其在室温下静置等待凝固。分离胶和浓缩胶配比如下表：
上样：将凝胶从制胶槽中取出，放入电泳槽中。倒入1×电泳缓冲液直至覆盖凝胶表面。缓慢地拔出梳子，在每个加样孔中按照顺序依次加入分子量标记Maker和蛋白样品；
电泳：打开发射器装置开关，首先以60V的电压进行初始浓缩胶电泳。待样品进入分离胶层并且看到分子量标记物Marker分散后，将电压调至120V，继续进行恒压电泳，待溴酚蓝至胶底部时停止电泳；
转膜：准备一块大小合适的PVDF膜(聚偏二氟乙烯膜)，转膜前将其置于甲醇中活化。在黑白夹中依次放置海绵垫、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸、海绵垫，固定好之后将转膜夹放入到电转槽中。在低温条件下，设置恒定电流为300mA，持续转膜时间为60-90分钟(转膜时间长短根据目的蛋白分子量大小而定)；
膜封闭：转膜完成后，将PVDF膜放入含有10％脱脂牛奶的TBST溶液中，置于摇床上摇晃60分钟进行封闭。之后将PVDF膜在TBST缓冲液中洗涤3次，每次10分钟；
孵一抗：根据目标蛋白分子量剪切出相应的条带。加入稀释好的一抗(NeutrophilElastase，Abcam，ab310335；Anti-LY6G，Servicebio,GB11229；Collagen I，Abcam，ab260043；TGF-β，Abcam，ab215715；Anti-GAPDH，Proteintech,，HRP-60004)，放置在摇床上，在4℃下孵育过夜。次日，把一抗吸出回收，加入TBST缓冲液洗涤3次，每次10分钟；
孵二抗：将条带置于稀释好的二抗(Invitrogen,31444,31460)中，在室温摇床上孵育1小时，随后再次使用TBST缓冲液洗涤3次；
成像曝光：用配置好的曝光液孵育条带，然后使用凝胶成像系统进行图像采集；
图像分析：采用ImagJ软件分析目的蛋白和内参蛋白的灰度值用于蛋白水平表达分析。
(2)ELISA检测
小鼠尾静脉采血置于血清分离管，待凝块形成后，以5000rpm离心血样，10min后收集血清。将血清和样本稀释液以1:9的比例稀释并用于检测。剪取小鼠心脏，加入适量组织匀浆液，高速匀浆后置于冰上静置20min。4℃/18000g离心20min，弃沉淀，上清液检测蛋白浓度，待用。
取出预先包被NE的酶标板及所需的试剂(Abcam，ab79962)，平衡至室温。先将50uL稀释后的血清或组织样本、标准品和ddH2O(空白)加入孔中，再加入50uL抗体混合液，封住孔板，平板振荡器上400rpm室温孵育1h。用350uL洗涤缓冲液(ddH2O稀释10×Wash Buffer)洗涤孔板3次，每次洗涤将板倒置轻轻敲击干净的纸巾以去除多余的液体。向每个孔中加入100μL TMB溶液，并在设置为400rpm的平板振荡器上在黑暗中孵育15min。向每个孔中加入100μL终止液。在平板振荡器上摇动板1min以混合，记录450nm处的吸光度值，绘制标准曲线图并计算样本中NE的浓度。
(3)免疫荧光检测
1)石蜡包埋及切片
固定：将收集的心脏样本置于4％多聚甲醛溶液中室温固定24小时以上；
脱水：将固定好的样本放入标记好的石蜡包埋盒进行脱水。脱水流程如下：70％乙醇60分钟→80％乙醇30分钟→95％乙醇30分钟→无水乙醇I 30分钟→无水乙醇II 30分钟；
透明：脱水后的样本按以下流程进行透明化：二甲苯I 60分钟→二甲苯II 60分钟；
浸蜡：将样本置于融化好的软蜡(熔点为52-54℃)里浸泡90分钟，然后放入硬蜡(熔点为58-60℃)里浸泡90分钟；
包埋：在包埋模具盒底部注入少量石蜡，然后取出组织包埋盒中的样本放入模具盒中，待模具中的石蜡稍微冷却固定后，将预先标记的包埋盒放在模具上方。接着加入液体石蜡，直至样本完全被石蜡所浸没。随后把装有样本的包埋模具盒转移到冷却台上，待石蜡块完全冷却凝固后，从模具盒中取出固化的蜡块；
切片：将蜡块置于切片机的置物台上，调整蜡块与刀片之间的角度，确保石蜡块稳固且平整。设置切片机的切片厚度为20μm进行修片，修片至能清晰看到暴露的样本后设置切片机的切片厚度为5μm，进行切片；
展片：用镊子将切割下来的石蜡薄片移到移至43℃的水浴槽中，使其充分展开；
烤片：待切片充分展开后，用干燥的载玻片捞片并做好标记，置于65℃的烤片机上预烘烤1小时，然后放置于切片盒待用。
2)脱蜡完成后，将切片浸没于抗原修复液中，使用微波炉进行抗原修复处理加热条件95℃，持续时间12分钟。
3)待修复液自然冷却至室温后，将切片放入到1×PBS中清洗三次，每次5分钟；
4)吸水纸擦干切片残留的PBS，用油性笔在每个心脏组织周围画圈，每个组织滴加适量的3％ BSA，37℃封闭30分钟；
5)甩去BSA，将切片放置于湿盒中，加入NE一抗(Abcam，ab310335)4℃孵育过夜；
6)次日将切片放入到1×PBS中清洗三次，每次5分钟，继续加入Ly6G一抗(武汉塞维尔生物科技有限公司，GB11229)4℃孵育8小时；
7)PBS清洗3次，每次5分钟；
8)室温孵育荧光二抗(abcam,ab150080,ab150077)2小时，期间注意避光；
9)二抗孵育完毕，PBS清洗3次，每次5分钟，期间注意避光；
10)滴加DAPI封片剂，盖玻片封片，置于4℃冰箱避光保存；
11)显微镜下观察，采集图像。
1.4NE基因敲除小鼠鉴定
(1)Direct PCR溶液和蛋白酶K以100：1的比例配制成鼠尾裂解液；
(2)剪取需要进行基因鉴定的小鼠尾巴1-2毫米，放入配置好的鼠尾裂解液中，先在55℃的水浴锅中过夜，然后在85℃的水浴锅中进行1小时的裂解；
(3)建立20μL PCR反应体系进行PCR，PCR反应体系如下：
(4)正向引物SEQ ID NO.1
(F1):5’-GGATGTCTGCTGAGTTTTCATTGG-3’；
反向引物SEQ ID NO.2
(R1):5’-GAACATGGGATTTAGGAACAGAAACC-3’；
内控PCR引物SEQ ID NO.3
F:5’-GCAGAAGAGGACAGATACATTCAT-3’；
内控PCR引物SEQ ID NO.4
R:5’-CCTACTGAAGAATCTATCCCACAG-3’。
(5)将3mg琼脂糖和150mL的0.5×TBE溶液混合后放入微波炉中，高火加热至溶解。室温冷却5分钟后加入10μL绿色荧光核酸染料，轻轻摇匀后倒入插有梳子的制胶模具中，室温静置30分钟；
(6)安装电泳装置，倒入0.5×TBE电泳液，缓慢地拔出梳子，在每个加样孔中按照顺序依次加入分子量标记Maeker和样品；
(7)140V电压进行电泳，时间约为25分钟；
(8)核酸曝光仪曝光显色；
(9)条带判读：位于413bp的单条带为NE KO小鼠，位于455bp的单条带为WT小鼠，位于413bp和455bp的双条带为杂合子小鼠。
1.5实验动物分组及模型构建
选取8周龄的雄性NE KO小鼠以及同背景WT小鼠各20只，按随机数字表法随机分成4组，每组10只，分组如下：
(1)WT假手术组(WT-假手术)
(2)WT TAC模型组(WT-TAC)
(3)NE KO对照组(NE KO-假手术)
(4)NE4 KO TAC模型组(NE KO-TAC)
选取6周龄C57BL/6J雄性WT小鼠30只，按随机数字表法随机分成3组，每组12只，分组如下：
(1)AAV-GFP假手术组(AAV-GFP-假手术)
(2)AAF-GFP模型组(AAV-GFP-TAC)
(3)AAF-NE模型组(AAV-NE-TAC)
其中AAV-GFP-假手术和AAV-GFP-TAC在TAC前2周尾静脉注射AAV-GFP对照质粒，AAV-NE-TAC组小鼠在TAC前2周尾静脉注射AAV9载体包裹NE过表达质粒。两周后通过ELISA检测小鼠血清NE水平，验证病毒转染的效果。
1.6小鼠心脏超声检测
小鼠TAC术后心脏功能通过Vevo2100小动物超声影像系统进行评估。为减少对小鼠的刺激，于超声检测前一天，用脱毛膏脱去小鼠胸前毛发，充分暴露胸前心脏部位皮肤。TAC手术后一周，在小鼠清醒状态下，通过MS400C超敏探头分别获得小鼠左室短轴B型和M型超声心动图用以后续分析。小鼠心脏超声的检测指标包括：心率，左心室收缩期和舒张期前后壁厚度，左心室收缩末期和舒张末期容积，射血分数和缩短分数。选取连续5个心动周期的各平均值用于最终的数据统计。
1.7苏木素-伊红(H&E)染色
(1)石蜡切片脱蜡至水，步骤如下：二甲苯I 30分钟→二甲苯II 30分钟→无水乙醇I 5分钟→无水乙醇II 5分钟→95％乙醇5分钟→80％乙醇5分钟→蒸馏水5分钟；
(2)苏木素染色5分钟，蒸馏水冲洗1分钟；
(3)1％盐酸酒精分化液分化5秒，蒸馏水冲洗1分钟，自来水浸泡10分钟；
(4)伊红染色5分钟(确切时间取决于组织的上色程度)；
(5)将染完色的切片进行酒精脱水和透明化处理，步骤如下：95％乙醇30秒→无水乙醇I分钟→无水乙醇II 1分钟→二甲苯I15分钟→二甲苯II 30分钟；
(6)中性树胶封片，将封好的切片放在通风橱中晾干；
(7)显微镜下观察，采集图像。
1.8天狼星红(Sirius red)染色
(1)石蜡切片脱蜡至水；
(2)擦干组织周围水，天狼星红染色1小时；
(3)将染完色的切片放入无水乙醇I和无水乙醇II中各浸泡1分钟；
(4)将切片进行透明化处理，步骤如下：二甲苯I15分钟→二甲苯II 30分钟；
(5)中性树胶封片，将封好的切片放在通风橱中晾干；
(6)显微镜下观察，采集图像。
小麦胚芽凝集素(WGA)荧光染色
(1)石蜡切片脱蜡至水；
(2)将切片放入到1×Tris-EDTA抗原修复液中，微波炉中高火5分钟煮沸，进行抗原修复；
(3)待修复液自然冷却至室温后，将切片放入到1×PBS中清洗三次，每次5分钟；
(4)吸水纸擦干切片残留的PBS，用油性笔在每个心脏组织周围画圈，每个组织滴加适量的3％ BSA，37℃封闭30分钟；
(5)甩去BSA后使用WGA工作液进行滴染，37℃避光孵育1小时；
(6)PBS清洗3次，每次5分钟；
(7)滴加DAPI封片剂，盖玻片封片，置于4℃冰箱避光保存；
(8)显微镜下观察，采集图像。
1.9实时定量荧光PCR
总RNA的提取
(1)样品准备：从-80℃冰箱中取出小鼠心脏组织样品，剪成米粒大小放入1.5mL的EP管中；
(2)组织裂解：每管加入1mL的Trizol，使用电动匀浆器对组织进行高速匀浆，破坏细胞膜和核膜，释放核酸；
(3)RNA分离：将匀浆后的裂解液放在冰上，加入200μL的三氯甲烷，盖紧管盖后上下剧烈震荡混匀，冰上静置15分钟，然后在4℃下12000g离心15分钟；
(4)DNA和蛋白质去除：取出EP管，将上层液相转移到一个新的1.5mL EP管中，每个EP管中加入500μL的异丙醇，上下颠倒混匀，冰上静置10分钟，然后在4℃下12000g离心15分钟。离心后，管底部可见少量白色沉淀，小心弃去上清；
(5)RNA洗涤：每管加入1mL的75％乙醇对RNA进行清洗，在4℃下12000g离心15分钟；
(6)RNA干燥：小心弃去上清，用移液枪尽量吸去残留的乙醇溶液，然后将EP管倒扣，室温放置，干燥沉淀20分钟；
(7)RNA溶解：加入适量的DEPC水溶解；
(8)测量RNA浓度：使用Nanodrop分光光度计测定RNA浓度及纯度，放置-80℃长期保存。
RNA反转录合成cDNA
(1)冰上融化RNA及所有试剂；
(2)根据上述体系加样后混匀。设置反应条件：42℃60分钟，70℃5分钟，进行逆转录得到cDNA。
实时定量荧光PCR(qRT-PCR)
(1)根据样品个数取适量200μL的八联排离心管，每个样品设置两个复孔，每孔中加入如下试剂配置10μL反应体系，混匀后将液体离心至管底。反应程序：95℃30秒；95℃5秒，60℃34秒，40个循环；95℃15秒，60℃1分钟；
PCR反应体系见下表：
试剂 剂量
SYBR Green预混液(Takara,RR820A) 5μL
引物(F+R) 0.5μL
cDNA 1μL
ddH2O 3.3μL
ROX II 0.2μL
总计 10μL
引物信息如下表：
(2)数据分析：以GAPDH作为内参基因，目的基因表达量以2﹣△△Ct公式计算。
1.10结果及分析
1.10.1主动脉弓部缩窄(TAC)诱导的心力衰竭引起血清和心脏浸润的中性粒细胞弹性蛋白酶NE增加
TAC手术在小鼠体内建立心衰模型。该手术是在小鼠体内建立心肌肥厚和心衰模型的经典手段，具有手术操作简单，死亡率低，可重复性高等特点。在本发明中，为了尽可能的减少体重，性别，年龄等相关因素的干扰，采用的所有小鼠均为雄性，并且年龄和体重都非常相近。蛋白质印迹(Western Blotting)检测TAC后不同时间点血清中NE表达变化，结果如图1中的A，TAC术后14天，NE蛋白表达水平显著增加。因此，后续实验均采用TAC术后14天这一时间点。Elisa法检测TAC后小鼠血清中NE含量变化，结果显示，与假手术组相比，TAC14天后能够显著增加血清中NE的含量(图1中的B)。Elisa法检测TAC后小鼠心脏组织中NE含量，也得到类似的结论(图1中的C)。此外，运用免疫荧光检测假手术组及TAC后心脏组织中中性粒细胞及NE的变化，结果表明，与假手术组相比，TAC后14天，心脏组织中中性粒细胞浸润明显增加，NE荧光强度显著增加。以上结果表明，TAC术后14天，血清、心脏组织中NE表达水平显著上调，心脏有显著的中性粒细胞浸润。
1.10.2NE敲除显著改善TAC诱导心力衰竭小鼠心功能及心肌肥大
在观察到TAC术后14天，NE蛋白表达水平显著增加后，这提示NE可能参与TAC诱导的心力衰竭的发生发展。因此，本发明采用NE基因敲除小鼠(NE KO)进一步探究NE增加在TAC诱导心力衰竭中的具体作用。在TAC手术前，先检测了血清中NE含量，以确定NE KO小鼠是否构建成功，结果如图2，NE KO小鼠血清中NE表达几乎完全确实，表明NE KO小鼠构建成功。
TAC术后14天，记录WT-假手术、NE KO-假手术、WT-TAC、NE KO-TAC各组小鼠死亡情况，结果如图3中的A，与野生型TAC(WT-TAC)相比，NE KO小鼠TAC后存活率显著增加。同时记录心脏体重比及心脏胫骨长度比，结果如图3中的B、C所示，与WT小鼠相比，NE KO小鼠能够显著降低TAC诱导的心脏体重比及心脏胫骨长度比的增加。
采用带有MS400C探头的Vevo3100系统对TAC诱导处理后的小鼠进行超声心动检测。通过测量乳头肌水平的二维肌模式来确定收缩期和舒张期心室直径和壁厚，计算射血分数(EF)、短轴收缩率(FS)。结果如图3中的D-F所示，与WT小鼠相比，NE KO小鼠能够显著增加TAC后的EF及FS，表明NE KO能够改善TAC术后小鼠心脏功能。对各组小鼠心脏切片进行WGA染色，结果表明，TAC术后14天，NE KO小鼠心肌细胞横截面积显著低于WT小鼠(图3中的D、G)。此外，TAC术后14天，NE KO小鼠心肌组织心肌肥厚相关maker ANP、BNP、β-MHC基因mRNA水平显著低于WT对照组(图3中的H-J)。
1.10.3NE敲除显著改善TAC诱导心力衰竭小鼠心肌纤维化及炎症
TAC术后14天，对WT-假手术组、NE KO-假手术组、WT-TAC组、NE KO-TAC组四组小鼠心脏进行马松(Masson)、天狼星红(PSR)及HE染色。小鼠心脏马松(Masson)、天狼星红(PSR)及HE染色结果如图4中的A所示，WT小鼠在TAC术后14天，心肌纤维化显著增加，而NE KO小鼠则能够显著缓解TAC介导的心肌纤维化。此外，在TAC14天后，NE KO小鼠心肌组织纤维化相关蛋白CollagenⅠ、TGF-β蛋白表达水平显著低于WT组小鼠(图4中的B-C)，表明NE KO能够显著缓解TAC诱导的心肌纤维化。采用q-PCR方法检测各组小鼠心肌细胞炎症因子mRNA表达水平，结果如图5所示，WT小鼠TAC术后14天，心肌细胞IL-1β、IL-6、TNF-α及MCP1基因mRNA表达水平显著增加，而NE KO小鼠则能够显著降低TAC引起的心肌细胞IL-1β、IL-6、TNF-α及MCP1基因mRNA表达水平的增加。以上结果表明，NE敲除显著改善TAC诱导心力衰竭小鼠心功能、心脏肥大、心脏炎症及心肌纤维化情况。
1.10.4NE过表达加重TAC诱导心力衰竭小鼠心功能障碍及心肌肥大
为了进一步探索NE在TAC诱导的心力衰竭中的作用，对WT小鼠尾静脉注射腺相关病毒(AAV)介导NE(AAV9-NE)过表达，AAV介导绿色荧光蛋白(GFP)为对照。如预期，与AAV-GFP相比，AAV9-NE能够显著增加血清中NE水平(图6)。进一步研究AAV9-NE对TAC诱导的心力衰竭小鼠心功能及心肌肥大的影响。与AAV-GFP-TAC相比，AAV介导的NE过表达进一步增加了TAC诱导的心力衰竭小鼠的死亡率、心脏体重比、心脏胫骨长度比(图7中的A-C)。同时，与AAV-GFP-TAC心力衰竭小鼠相比，AAV9-NE加重TAC诱导的心功能障碍，表现为EF、FS的进一步降低(图7中的D-F)。WGA染色结果表明，AAV-NE处理进一步加重TAC诱导的心肌肥大(图7中的D、G)，这个结果也被心肌细胞肥大maker如ANP、BNP、β-MHC基因mRNA表达水平进一步升高所证明(图7中的H-J)。
1.10.5NE过表达加剧TAC诱导心力衰竭小鼠心肌纤维化及炎症
由图8中的A可知，马松(Masson)染色、PSR染色及HE染色表明，TAC术后14天，与AAV-GFP-TAC组相比，AAV-NE-TAC组心肌纤维化进一步加重。Western blotting检测心肌纤维化标志物CollagenⅠ、TGF-β蛋白表达水平，结果如图8中的B所示，与AAV-GFP-TAC组相比，AAV-NE-TAC组CollagenⅠ、TGF-β蛋白表达水平进一步升高，表明纤维化加重。图8中的C为图8中的B的半定量结果。
图9结果表明，与AAV-GFP-TAC组相比，AAV-NE-TAC组心肌细胞IL-1β、IL-6、TNF-α及MCP1基因mRNA表达水平进一步增加，心肌细胞炎症加重。
实施例2西维来司他的新用途
2.1实验小鼠选取
8-10周龄SPF级C57BL/6J背景小鼠以及同背景WT小鼠购自赛业生物科技有限公司(Suzhou,Jiangsu,China)。并在研究开始前接受适应性喂养1周。所有小鼠于SPF级实验动物中心进行饲养，房间温度保持在22±1℃，湿度维持在50±10％，采用人工循环照明，每天12小时的光照和12小时的黑暗，自由摄食饮水。
2.2TAC诱导心力衰竭小鼠模型的构建
对TAC诱导心力衰竭组小鼠进行TAC手术处理，构建TAC诱导心力衰竭的小鼠模型。具体的操作步骤为：通过腹腔注射三溴乙醇使小鼠麻醉。当小鼠被深度麻醉时，切开气管前部的皮肤，钝性分离肌肉组织。轻轻抬起并切开第二根肋骨，拉到两侧，充分暴露主动脉弓。采用6-0尼龙缝合线收紧并结扎26号针，以完成右无名、左颈总动脉之间的横主动脉收缩，然后缝合胸骨和皮肤。多普勒超声心动图显示经主动脉横切速度大于4m/s，证实了TAC手术成功。将小鼠转移到加热垫上，并进行密切监测。所有操作人员和分析人员均采用盲法随机化，以避免小鼠基因型偏好。假手术组小鼠行相同的手术步骤，但没有进行结扎处理。
2.3西维来司他钠(以下简称Sive)以二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)为溶剂配制成母液，按照西维来司他钠：PEG300:Tween-20:0.9％NaCl为1:8:1:10的比例和顺序加入，每次混匀保证液体澄清方可进行下一步。TAC术后1周后，对小鼠进行小动物超声评估弓部血流，对构建成功的小鼠进行随机分组，小鼠分组为假手术+溶剂(a组)，TAC+溶剂(b组)，TAC+Sive12.5mg/kg(c组)，TAC+Sive25mg/kg(d组)，TAC+Sive50mg/kg(e组)共五组，溶剂处理(即DMSO:PEG300:Tween-20:0.9％NaCl为1:8:1:10，200μL/只小鼠)，随即通过腹腔注射的方式给药，每日1次，连续7周。在第8周，通过小动物超声评估小鼠心功能。评估完毕，各组小鼠实施安乐死，收集样本，称重并进行后续实验。
2.4小鼠心脏超声检测
小鼠TAC术后心脏功能通过Vevo2100小动物超声影像系统进行评估。为减少对小鼠的刺激，于超声检测前一天，用脱毛膏脱去小鼠胸前毛发，充分暴露胸前心脏部位皮肤。TAC手术后一周，在小鼠清醒状态下，通过MS400C超敏探头分别获得小鼠左室短轴B型和M型超声心动图用以后续分析。小鼠心脏超声的检测指标包括：心率，左心室收缩期和舒张期前后壁厚度，左心室收缩末期和舒张末期容积，射血分数和缩短分数。选取连续5个心动周期的各平均值用于最终的数据统计。
2.5小麦胚芽凝集素(WGA)荧光染色
方法同实施例1。
2.6天狼星红(Sirius red)染色
方法同实施例1。
2.7苏木素-伊红(H&E)染色
方法同实施例1。
2.8Western Blot检测
方法同实施例1。
2.9结果及分析
2.9.1西维来司他钠显著缓解主动脉弓部缩窄(TAC)诱导的心力衰竭小鼠心功能
AC手术采用的所有小鼠均为雄性，并且年龄和体重都非常相近。采用带有MS400C探头的Vevo3100系统对TAC诱导处理后的小鼠进行超声心动检测。通过测量乳头肌水平的二维肌模式来确定收缩期和舒张期心室直径和壁厚，计算射血分数(EF)、短轴收缩率(FS)。结果如图10所示，与假手术组相比，TAC后小鼠心功能明显变差，表现为EF和FS的显著降低，而不同浓度西维来司他钠处理后能够显著增加TAC后的EF及FS，表明西维来司他钠能够改善TAC术后小鼠心脏功能。
2.9.2西维来司他钠显著改善TAC诱导的心力衰竭小鼠心脏肥大
与假手术组相比，TAC后小鼠心脏显著变大(图11中的A)，心脏体重比及心脏胫骨长度比显著增加(图11中的B，C)，而不同浓度西维来司他钠处理后，显著降低了TAC诱导的心脏大小和心脏体重比及心脏胫骨长度。WGA染色结果也同样表明，与TAC组相比，不同浓度西维来司他钠处理后心脏横截面积显著降低(图12中的A，B)。
2.9.3西维来司他钠显著改善TAC诱导的心力衰竭小鼠心脏组织病理改变
与假手术组相比，TAC后小鼠心脏心肌排列紊乱，心肌纤维化显著增加(图13中的A-C)，而不同浓度西维来司他钠处理后，显著降低了TAC诱导的心脏纤维化等(图13中的A-C)。
2.9.4西维来司他钠显著改善TAC诱导的心力衰竭小鼠心脏组织心肌纤维化相关蛋白表达水平
与假手术组相比，TAC后小鼠心脏组织心肌纤维化相关蛋白CollagenⅠ、TGF-β表达水平显著增加，表明TAC后小鼠心肌组织出现纤维化，而不同浓度西维来司他钠处理后，显著降低了TAC诱导的心肌纤维化相关蛋白CollagenⅠ、TGF-β表达水平的升高(图14)。
2.9.5西维来司他钠补充剂量下各组小鼠肝肾功能未发生不良反应
由图15中的A-E可知，西维来司他钠补充剂量下并未影响各组小鼠肝肾功能。

Claims (6)

1.抑制或沉默中性粒细胞弹性酶活性的物质在制备治疗压力负荷诱导的心力衰竭的药物中的用途，其特征在于，所述的物质为西维来司他钠。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的药物还包括药学上可接受的辅料。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的药物的剂型为溶液剂型、乳剂型或粉末型。
4.抑制或沉默中性粒细胞弹性酶基因表达的物质在制备治疗压力负荷诱导的心力衰竭的药物中的用途，其特征在于，所述的物质为西维来司他钠。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的药物还包括药学上可接受的辅料。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的药物的剂型为溶液剂型、乳剂型或粉末型。
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