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CN119409818A - 靶向钙粘蛋白17的纳米抗体及其应用 - Google Patents

靶向钙粘蛋白17的纳米抗体及其应用 Download PDF

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CN119409818A CN202411359048.1A CN202411359048A CN119409818A CN 119409818 A CN119409818 A CN 119409818A CN 202411359048 A CN202411359048 A CN 202411359048A CN 119409818 A CN119409818 A CN 119409818A
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Abstract

本发明涉及靶向钙粘蛋白17的纳米抗体及其应用，涉及免疫学和分子生物学技术领域，所述靶向钙粘蛋白17的纳米抗体的互补决定区的氨基酸序列包括如SEQ ID NO:21～32任一所示的CDR1、如SEQ ID NO:34～45任一所示的CDR2、氨基酸序列如SEQ ID NO:47～58任一所示的CDR3。本发明通过构建羊驼免疫噬菌体展示库，从中筛选出系列靶向钙粘蛋白17(CDH17)的纳米抗体分子，并在CDH17抗原蛋白、CDH17靶细胞和CDH17CAR‑T细胞等多种水平上验证了所述纳米抗体的功能和应用。

Description

靶向钙粘蛋白17的纳米抗体及其应用
技术领域
本发明涉及免疫学和分子生物学技术领域，具体涉及靶向钙粘蛋白17的纳米抗体及其应用。
背景技术
钙粘蛋白(Cadherins，钙粘素)是一类依赖于钙离子的细胞粘附分子的超家族，其通过胞外域与相邻细胞的钙粘蛋白分子形成连接，从而实现细胞间的粘附，在维持组织结构和形态中发挥着关键作用。钙粘蛋白-17(Cadherin17，CDH17)，又称为肝肠钙粘蛋白(Liver intestine-cadherin，LI-cadherin)或人肽转运蛋白-1(HPT-1)，是钙粘蛋白超家族中的非经典成员。与经典钙粘蛋白不同，CDH17的胞外结构域具有七个重复结构单元(EC1-EC7)(如图1所示)，CDH17的胞内域仅含24个氨基酸残基，与经典钙黏蛋白由150～160个氨基酸构成的胞内域缺乏同源性。
目前的研究已证明CDH17为消化系统肿瘤的靶向治疗的有效且安全的靶点，抗CDH17的候选抗体分子可用于开发消化系统肿瘤等疾病的诊断试剂、靶向性抗体药物和CAR-T/NK免疫细胞药物，但目前可利用的抗CDH17的候选抗体分子非常有限，而且主要为传统抗体，优势突出且成药性良好的纳米抗体仅有1例报道，来自宾夕法尼亚大学研究团队，并由Chimeric Therapeutics公司开发了世界首款CDH17 CAR-T，目前进入临床II期。为了促进CDH17靶点诊断试剂和靶向药物的研发，需要加快开发更多的抗CDH17的候选纳米抗体分子。鉴于此，本发明公开了靶向钙粘蛋白17的纳米抗体及其应用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供靶向钙粘蛋白17的纳米抗体及其应用。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
第一方面，靶向钙粘蛋白17的纳米抗体，所述靶向钙粘蛋白17的纳米抗体的互补决定区的氨基酸序列包括如SEQ ID NO:21～32任一所示的CDR1、如SEQ ID NO:34～45任一所示的CDR2、氨基酸序列如SEQ ID NO:47～58所示的CDR3。
进一步，靶向钙粘蛋白17的纳米抗体，所述靶向钙粘蛋白17的纳米抗体包括E001、E005、E042、E046、E101、E114、E116、E119、E121、E201、E242、E243中的任意一种；
所述E001的氨基酸序列的互补决定区包括如SEQ ID NO:21所示的CDR1、如SEQ IDNO:34所示的CDR2、如SEQ ID NO:47所示的CDR3；
所述E005的氨基酸序列的互补决定区包括如SEQ ID NO:22所示的CDR1、如SEQ IDNO:35所示的CDR2、如SEQ ID NO:48所示的CDR3；
所述E042的氨基酸序列的互补决定区包括如SEQ ID NO:23所示的CDR1、如SEQ IDNO:36所示的CDR2、如SEQ ID NO:49所示的CDR3；
所述E046的氨基酸序列的互补决定区包括如SEQ ID NO:24所示的CDR1、如SEQ IDNO:37所示的CDR2、如SEQ ID NO:50所示的CDR3；
所述E101的氨基酸序列的互补决定区包括如SEQ ID NO:25所示的CDR1、如SEQ IDNO:38所示的CDR2、如SEQ ID NO:51所示的CDR3；
所述E114的氨基酸序列的互补决定区包括如SEQ ID NO:26所示的CDR1、如SEQ IDNO:39所示的CDR2、如SEQ ID NO:52所示的CDR3；
所述E116的氨基酸序列的互补决定区包括如SEQ ID NO:27所示的CDR1、如SEQ IDNO:40所示的CDR2、如SEQ ID NO:53所示的CDR3；
所述E119的氨基酸序列的互补决定区包括如SEQ ID NO:28所示的CDR1、如SEQ IDNO:41所示的CDR2、如SEQ ID NO:54所示的CDR3；
所述E121的氨基酸序列的互补决定区包括如SEQ ID NO:29所示的CDR1、如SEQ IDNO:42所示的CDR2、如SEQ ID NO:55所示的CDR3；
所述E201的氨基酸序列的互补决定区包括如SEQ ID NO:30所示的CDR1、如SEQ IDNO:43所示的CDR2、如SEQ ID NO:56所示的CDR3；
所述E242的氨基酸序列的互补决定区包括如SEQ ID NO:31所示的CDR1、如SEQ IDNO:44所示的CDR2、如SEQ ID NO:57所示的CDR3；
所述E243的氨基酸序列的互补决定区包括如SEQ ID NO:32所示的CDR1、如SEQ IDNO:45所示的CDR2、如SEQ ID NO:58所示的CDR3。
进一步，述靶向钙粘蛋白17的纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:9～20任一所示。
第二方面，一种靶向钙粘蛋白17的CAR-T细胞，所述CAR-T细胞表达靶向钙粘蛋白17的嵌合抗原受体(CAR)；所述靶向钙粘蛋白17的嵌合抗原受体包括CDH17抗原结合域、铰链区、跨膜区和胞内信号传导域；所述CDH17抗原结合域包括信号肽和如权利要求1或2所述的纳米抗体中的任意一种。
进一步，所述信号肽为来自CD8α的信号肽，所述铰链区为氨基酸突变优化的IgG4的铰链区、所述跨膜区为CD28的跨膜区、所述胞内信号传导域包括CD28胞内共刺激域、4-1BB共刺激域和CD3ζ信号传导域。
进一步，所述CD8α的信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:60所示；
所述氨基酸突变优化的IgG4的铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO:62所示；
所述CD28的跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO:64所示；
所述CD28胞内共刺激域的氨基酸序列如SEQ ID NO:66所示；
所述4-1BB共刺激域序列的氨基酸序列如SEQ ID NO:68所示；
所述CD3ζ信号传导域的氨基酸序列如SEQ ID NO:70所示。
第三方面，一种核酸，包括编码所述的靶向钙粘蛋白17的纳米抗体的核酸序列或其互补序列，或包括编码所述的靶向钙粘蛋白17的嵌合抗原受体的核酸序列或其互补序列。
进一步，所述CD8α的信号肽的编码核苷酸序列如SEQ ID NO:61所示；
所述抗CDH17的纳米抗体的编码核苷酸序列如SEQ ID NO:82～93或SEQ ID NO:74～81所示；
所述氨基酸突变优化的IgG4的铰链区的编码核苷酸序列如SEQ ID NO:63所示；
所述CD28的跨膜区的编码核苷酸序列如SEQ ID NO:65所示；
所述CD28胞内共刺激域的编码核苷酸序列如SEQ ID NO:67所示；
所述4-1BB共刺激域序列的编码核苷酸序列如SEQ ID NO:69所示；
所述CD3ζ信号传导域的编码核苷酸序列如SEQ ID NO:71所示。
第四方面，一种慢病毒载体，所述慢病毒载体包含所述的核酸分子。
第五方面，一种药物组合物，所述的药物组合物包括所述的靶向钙粘蛋白17的纳米抗体，或者所述的靶向钙粘蛋白17的CAR-T细胞，或者所述的核酸，或者所述的慢病毒载体。优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的辅料。
第六方面，一种所述的靶向钙粘蛋白17的纳米抗体，或者所述的靶向钙粘蛋白17的CAR-T细胞，或者所述的核酸，所述的慢病毒载体，或者所述的药物组合物在制备靶向钙粘蛋白17的检测试剂、活体成像探针、治疗产品中的应用。
本发明的核心创新点在于，提供了一组12条靶向CDH17的纳米抗体分子，现有技术中未发现与本发明的CDR1～3序列一致的抗体，解决了现有技术中缺少靶向CDH17的候选纳米抗体分子的问题。
本发明通过构建羊驼免疫噬菌体展示库，从中筛选出系列靶向钙粘蛋白17(CDH17)的12条纳米抗体分子，并在CDH17抗原蛋白、CDH17靶细胞和CDH17 CAR-T细胞等多种水平上验证了所述纳米抗体的功能和应用。12条纳米抗体与人IgG1的Fc段的融合抗体(VHH-Fc)，与人CDH17抗原蛋白及表达人CDH17抗原蛋白的胃癌细胞SNU-16和胰腺癌细胞ASPC1皆具有良好的结合活性，且与鼠CDH17抗原蛋白具有交叉结合活性。生物膜干涉(BLI)技术检测结果表明12条纳米抗体的VHH-Fc融合抗体与人CDH17蛋白的亲和力(KD值)达到100pM至nM级水平。其中，8种分别表达纳米抗体克隆E042、E046、E101、E116、E119、E121、E201和E243的氨基酸序列的CAR-T细胞对人CDH17抗原阳性的胃癌和胰腺癌细胞皆具有显著的杀伤能力。本发明的纳米抗体可用于肿瘤诊断试剂以及肿瘤靶向治疗的抗体药物和CAR-T/NK等免疫细胞药物的开发。
本发明的有益效果是：
(1)本发明选用的CDH17靶点是潜在的最安全且有效的消化系统肿瘤治疗靶点：CDH17主要表达在胃肠道系统的上皮组织细胞间紧密连接处，在胃癌、胆管癌、胰腺癌、食管癌、神经内分泌肿瘤以及结直肠癌细胞等消化系统肿瘤中高度表达；已有研究表明CDH17CAR-T或者双抗药物对正常表达组织无损伤，对CDH17表达肿瘤组织特异性杀伤。
(2)本发明为消化系统肿瘤的靶向治疗提供了候选纳米抗体分子：相比血液瘤，实体瘤的特异性免疫靶向治疗药物研发进展缓慢，制约因素之一为缺少有效且安全的靶点；目前的研究已表明CDH17为消化系统肿瘤的安全且有效的治疗靶点，但针对CDH17靶点的靶向药物研究起步较晚，目前在研药物仅有少量几款，制约瓶颈在抗体发现阶段，已开发的CDH17候选抗体分子仅有几例，而涉及的纳米抗体更是稀少。
(3)本发明的纳米抗体具有广泛的应用领域：(a)本发明通过羊驼免疫库筛选得到的针对CDH17的系列候选纳米抗体，将其C末端与人IgG1的Fc片段融合，在蛋白水平和细胞水平上检测其与CDH17抗原的结合活性，结果都表现出比对照抗体更好或至少相当的活性。(b)利用本发明的系列候选纳米抗体序列构建的CAR-T细胞，对消化系统多种肿瘤靶细胞具有娴熟的杀伤活性。(c)纳米抗体相对于其它抗体具有显著的优点，如其半衰期长短可通过化学修饰或者蛋白融合改造进行调节，渗透性强，可识别普通抗体不可及的隐蔽表位，耐胃蛋白酶，耐酸，耐热，易生产，而且因为是单链，易于和其它类型抗体组装为双价抗体和多价抗体。因此，本发明的纳米抗体，可开发成免疫检测试剂、CAR-T/NK免疫细胞药物和抗体药物。结合CDH17靶点的特性，本发明的候选抗体，若用于癌症的免疫诊断试剂，将具有更好的效果；若开发成细胞或抗体免疫治疗药物，则具有更低的毒副作用和更佳的临床药效，从而为患者提供更多的药物选择。
(4)可用于开发双靶点药物：研究发现密蛋白18.2(Claudin18.2)与CDH17一样为安全且有效的消化系统肿瘤治疗靶点，二者在食管癌、胃癌、胰腺癌、结直肠癌等消化系统肿瘤中共表达，且临床或临床前试验证明靶向这两个靶点皆可特异性杀伤肿瘤细胞，而对正常组织无伤害，故本发明的抗CDH17候选纳米抗体可与CLDN18.2抗体联用开发抗CLDN18.2/CDH17双抗药物和双靶点CAR-T药物，有望增强单抗或单靶点CAR-T/NK等免疫细胞药物的疗效。
附图说明
图1为CDH17蛋白结构示意图，Extracellular为胞外区，Cellular为胞质区；
图2为经3次和4次免疫后的羊驼血清效价ELISA检测结果，Serum dilution fold为血清稀释倍数；
图3为羊驼四免血清与CDH17抗原表达细胞ASPC-1、SNU-16结合活性的流式检测MF1值；
图4为CDH17羊驼免疫纳米抗体库构建流程图；
图5为在纳米抗体水平上所有富集后的输出集合与Human-CDH17-ECD-His、CDH17-EC1-2-His、Mus-CDH17-ECD-His三种抗原均有交叉结合的ELISA检测结果，横坐标VHH Con.为纳米抗体浓度(μg/mL)；
图6为在噬菌体水平上所有富集后的输出集合与Human-CDH17-ECD-His、CDH17-EC1-2-His、Mus-CDH17-ECD-His三种抗原均有交叉结合的ELISA检测结果,横坐标PhageTiter为噬菌体滴度(CFU)；
图7为12个候选纳米抗体克隆的氨基酸序列比较图(VHH1为阳性对照)；
图8为阳参抗体Anti-CDH17-VHH-Fc及12个候选纳米抗体克隆(E001、E005、E042、E046、E101、E114、E116、E119、E121、E201、E242和E243E)与人IgG1的Fc段融合的全长表达蛋白分别与抗原CDH17-EC1-2-His、Mus-CDH17-ECD-His和CDH17-EC1-2-His的结合活性的ELISA检测结果，横坐标Antibody conc.为全长表达抗体蛋白的浓度(μg/mL)；
图9为阳参抗体Anti-CDH17-VHH-Fc及12个候选纳米抗体克隆(E001、E005、E042、E046、E101、E114、E116、E119、E121、E201、E242和E243E)与人IgG1的Fc段融合的全长表达蛋白分别在ASPC-1和SNU-16细胞上的结合活性FACS检测结果，横坐标Antibody conc.为全长表达抗体蛋白的浓度(nM)；
图10为阳性对照CDH17 CAR及8个CDH17候选纳米抗体克隆(E042、E046、E101、E116、E119、E121、E201和E243)的通用CAR结构示意图；
图11为8种候选纳米抗体克隆(E042、E046、E101、E116、E119、E121、E201和E243)和对照抗体构建CDH17 CAR慢病毒表达质粒所采用的三代慢病毒表达载体pCDH-EF1-Kan的质粒图谱；
图12为8种候选纳米抗体克隆(E042、E046、E101、E116、E119、E121、E201和E243)的anti-CDH17 CAR-T和阳性对照CDH17 CAR-T的CAR阳性率流式检测图；
图13为CDH17抗原阳性的三种靶细胞(AGS、ASPC-1和SNU5)的CDH17抗原阳性率及导入GFP荧光标记基因后的GFP蛋白表达阳性率流式检测结果；
图14为8种候选纳米抗体克隆(E042、E046、E101、E116、E119、E121、E201和E243)的anti-CDH17 CAR-T和阳性对照CDH17 CAR-T分别对CDH17抗原阳性的GFP荧光标记的三种靶细胞(AGS、ASPC-1和SNU5)的杀伤效率分析图。
具体实施方式
以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购得的常规产品。
实施例
1、羊驼免疫及免疫库筛选所需抗原、抗体和细胞原材料
本发明采用CDH17抗原蛋白和CDH17抗原高表达细胞作为免疫原对羊驼(品系为Alpaca)进行多次免疫，构建羊驼免疫库，从中筛选特异性结合目标抗原CDH17的抗体分子。免疫及筛选所用的抗原、细胞株及阳性对照抗体等原材料皆由三优生物公司制备或提供，相关信息详见表1。其中CDH17-ECD指包含CDH17抗原的全部7个胞外结构域ECD1-7的抗原蛋白，CDH17-EC1-2指只包含CDH17抗原的前两个胞外结构域ECD1-2的抗原蛋白。
表1免疫及筛选用抗原及细胞系及阳性对照抗体原材料
上述抗原蛋白中的Fc标签的氨基酸序列来自hIgG1-CS，即人IgG1重链恒定区，其铰链区的一个氨基酸C(半胱氨酸)被突变为S(丝氨酸)，以减少游离C的存在。所述Fc的氨基酸序列及编码核苷酸序列分别如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示。上述氨基酸与编码核苷酸序列分别如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的与Fc融合的Anti-CDH17-VHH，来自专利US20210253728A1中的抗CDH17的VHH1(anti-CDH17 VHH1)。
2、羊驼免疫
2.1羊驼免疫方法
采用Human-CDH17-ECD-Fc抗原、ASPC-1细胞对羊驼(Alpaca)进行交叉免疫，共免疫4次，每两周免疫一次，每次使用0.5mg抗原或1E+07(科学计数方法，即1×107)个细胞/羊驼。抗原首免为弗氏完全佐剂；后续免疫为弗氏不完全佐剂，细胞免疫不添加佐剂(购自Sigma)。注射方式为皮下多点注射。羊驼免疫方案见表2。
表2羊驼免疫方案
2.2免疫血清效价检测
采集3次和4次免疫后的羊驼血清，分别采用ELISA和FACS检测抗体效价。
2.2.1血清效价ELISA检测
血清效价ELISA检测，包括如下步骤：(1)采用Human-CDH17-ECD-his抗原(2μg/mL,30μL)包板，4℃过夜孵育；(2)用PBST洗涤板3次，用PBS配制的5％脱脂奶粉(购自伊利)室温封闭2h；(3)用PBST洗涤板3次，加入30μL用PBS梯度稀释的血清，室温孵育1h；(4)用PBST洗涤板3次，加入二抗Goat anti-Llama IgG(H+L)Secondary Antibody,HRP(ThermoFisher，A16060)，室温孵育50分钟；(5)加入30μl TMB(购自SurModics)显色，室温15-30min；(6)加入50μl TMB显色终止液(购自碧云天，P0215)终止反应，读取酶标仪(Molecular Devices)OD450数值。
测试样品及对照为三免血清(CDH17-3rd)、四免血清(CDH17-4th)、阴性对照抗体NC(NC-CDH17)和阳性对照抗体PC。根据1.65倍NC标定血清效价，效价大于16K为合格。结果显示经3次和4次免疫后，针对Human-CDH17-ECD-his的羊驼免疫血清效价皆已达到256K，可以用于建库。血清效价ELISA检测结果详见表3和图2。
表3免疫血清效价ELISA检测结果
样品稀释倍数 三免血清 四免血清 NC PC
1:2K 2.67 1.98 0.05 2.34
1:4K 2.58 1.64 0.06 1.92
1:8K 1.92 1.15 0.05 2.44
1:16K 1.39 0.58 0.06 2.53
1:32K 0.97 0.37 0.05 2.35
1:64k 0.73 0.24 0.05 1.47
1:128k 0.38 0.15 0.05 0.56
1:256K 0.27 0.11 0.06 0.13
2.2.2免疫血清与细胞结合的FACS检测
在板孔中加入1E5细胞/孔，离心并用FACS缓冲液[含体积百分比为2％FBS(购自Gibco)的1×PBS缓冲液)]洗涤细胞；向细胞中加入100μL血清稀释液，在4℃下孵育60分钟，离心并用FACS缓冲液洗涤细胞三次；向细胞中加入100μL Goat anti-Llama IgG(H+L)，Fluorescein(FITC)Conjugate(Thermo Fisher，A16061)，在4℃下孵育30分钟。用FACS缓冲液重新悬浮细胞；流式细胞术检测，分析平均荧光强度(MF1)。
测试样品为四免血清(CDH17-4th)、阴性对照非免疫羊驼血清(NC-CDH17)、同型对照对照抗体IgG(购自三优，P78791)和阳性对照抗体(Reference Ab，即Anti-CDH17-VHH-Fc，P76670，购自三优)。
结果表明，四免血清样品在20、80、320和1280倍的稀释浓度下，皆与SNU-16和ASPC-1细胞保持良好结合。结果见表4、表5和图3。
表4羊驼四免血清与ASPC-1结合的FACS检测MF1值
稀释倍数 四免血清 NC-CDH17 IgG(P78791) Reference Ab
1:20 88324 1672 442 2792
1:80 90931 1169 405 2510
1:320 65455 590 419 1704
1:1280 29190 415 436 914
表5羊驼四免血清与SNU-16结合的FACS检测MF1值
样品稀释倍数 四免血清 NC-CDH17 IgG(P78791) Reference Ab
1:20 164023 5965 567 45757
1:80 171792 4082 513 27913
1:320 129986 1750 526 8253
1:1280 63651 854 524 2539
3、羊驼免疫库构建
3.1免疫库构建
采集80mL经4次免疫后的1只羊驼血液，通过Ficoll-Paque密度梯度分离液(GE，17144003S)分离外周血单个核细胞(PBMC)。将分离的PBMC抽取其RNA，并通过反转录试剂盒(TaKaRa，6210A)反转录成cDNA。由于羊驼抗体的分子形式不同于普通抗体，其不含有轻链而且重链不含有CH1，因此在VH germline基因前端和CH2上通过设计引物，PCR得到两个不同大小的片段，通过割胶回收较小的目的片段；通过比对VHH抗体所有V基因和J基因的所有序列，设计含有NcoI和NotI酶切位点的简并引物，然后以回收的DNA片段产物为模板扩增所有的VHH基因，最后通过双酶切和连接将目的抗体基因片段插入至噬菌体展示用载体上，其中VHH在C端融合了GIII基因。连接产物通过回收试剂盒(Omega，D6492-02)回收，最后通过电转仪(Bio-Rad，MicroPulser)转化至感受态大肠杆菌SS320(Lucigen，MC1061F)中，并涂布于具有氨苄抗性的2-YT固体平板(由胰蛋白胨1.5％，酵母提取物1％，NaCl 0.5％，琼脂1.5％，按质量体积g/mL配制而成)。由此构建而成的羊驼免疫噬菌体展示文库，通过系列筛选过程获得候选抗体。以上过程如图4所示。
3.2单域抗体库库容测定
以1μL菌液稀释后在平板上形成的克隆来计算电转化形成的克隆数，即库容。库容测定结果如表6所示，表明单域抗体库满足库容大于或等于1.00×108CFU的质量标准。
表6单域抗体库电转体系及库容统计
电转数量(个) 单电转库容(CFU) 总库容(CFU)
2 3.69×108 7.38×108
3.3单域抗体库测序结果分析
通过单克隆测序分析验证抗体基因的正确插入率。共挑取80个克隆进行测序，对测序成功的结果进行进一步分析。有效库容计算方式：总库容×抗体正确表达率×Unique序列占比率＝有效库容。结果见表7。
表7单域抗体库测序信息统计表
结果显示，抗体基因序列正确插入率大于或等于80％、CDR区比对有较高的丰富度，空占比小于或等于10％，酶切位点正确率大于或等于90％，符合单域抗体库构建的质量标准。本发明单域抗体库建库质量合格，可用于后续筛选。
4、羊驼免疫库筛选
通过噬菌体展示技术将构建好的羊驼免疫库抗体序列展示在噬菌体表面，再以特定蛋白、细胞作为抗原材料，经过多轮海选将结合抗原的噬菌体展示抗体不断富集，进一步通过ELISA筛选特异结合抗原的阳性克隆，并通过测序获得阳性克隆抗体序列。
4.1免疫库筛选方法
免疫库筛选方法，包括如下步骤：(1)噬菌体制备：将羊驼免疫库库菌或获得的输出集合，通过接菌、辅助噬菌体侵染、噬菌体扩培、噬菌体沉淀与重悬等一系列步骤，制备富集后的噬菌体并投入下一步的海选。(2)固相海选:将抗原包被在具有高吸附力的免疫管表面，然后把制备的噬菌体加入免疫管进行孵育、洗涤和洗脱，经历3轮淘选后，将针对抗原的特异性单克隆抗体进行富集。(3)液相海选:将标记生物素的抗原与偶联链霉亲和素的磁珠结合，再与制备的噬菌体进行孵育、洗涤和洗脱，经历3轮的淘选后，将针对抗原的特异性单克隆抗体进行富集。(4)细胞海选:将制备的负筛后的噬菌体和抗原过表达细胞进行孵育、洗涤和洗脱，经过3轮淘选后，将针对抗原的特异性单克隆抗体进行富集。
海选方式及结果详见表8，结果显示：从第二轮开始均有不同程度的富集，具体数据见表8。方式为：a.固相，b.液相，c.细胞。
表8海选数据统计表
备注：N/A表示未检出或不适用。
(5)海选集合检测
对海选输出集合进行ELISA实验检测富集效果：
①在纳米抗体VHH水平的ELISA检测步骤为：在96孔板的孔中加入2μg/mL抗原(Human-CDH17-ECD-His、CDH17-EC1-2-His或Mus-CDH17-ECD-His)包板→5％ PBSM封闭→加入VHH Pool(VHH输出集合)稀释液孵育→加入二抗Anti-Flag-HRP孵育→加入TMB显色→加入TMB显色终止液→测定OD450值。
ELISA检测中的对照抗体：以不相关靶点的纳米抗体VHH作为阴性对照，即NC(VHH)。而阳性对照抗体有两种，在人抗原Human-CDH17-ECD-His和CDH17-EC1-2-His的结合检测中以抗人CDH17的Anti-CDH17-VHH-Fc作为阳性对照；在鼠抗原Mus-CDH17-ECD-His的结合检测中以抗鼠CDH17的VHH-Fc抗体即H_PR_A124(购自三优，P80612)作为阳性对照。
②在噬菌体Phage水平的ELISA检测步骤为：在96孔板的孔中加入2μg/mL抗原(Human-CDH17-ECD-His、CDH17-EC1-2-His或Mus-CDH17-ECD-His)包板→5％ PBSM封闭→加入Phage Pool稀释液孵育→加入二抗Anti-M13-HRP孵育→加入TMB显色→加入TMB显色终止液→测定OD450值；其中，以空白Phage作为阴性对照，及NC(Phage)。同时以1xPBS缓冲液替代抗原作为空白对照(BC)，进行平行ELISA检测。
海选集合检测结果显示：
在VHH水平：所有Pool(输出集合)与Human-CDH17-ECD-His、CDH17-EC1-2-His、Mus-CDH17-ECD-His抗原均有交叉富集。
在Phage水平：所有Pool与Human-CDH17-ECD-His、CDH17-EC1-2-His、Mus-CDH17-ECD-His抗原均有交叉富集；所有Pool与BC无非特异性结合。
对海选集合进行的ELISA检测结果见图5(VHH水平)和图6(Phage水平)
(6)单克隆初筛
针对有富集的Pool挑选单克隆进行初筛。采用靶标抗原包板的方式，经过包板，封闭，孵育，加入二抗，显色，终止，检测OD值等一系列步骤。按照一定的背景值划定阳性克隆，并对阳性克隆进行测序。
使用Human-CDH17-ECD-His、CDH17-EC1-2-His、Mus-CDH17-ECD-His分别包板的方式筛选，从19块单克隆板上共挑选1656个克隆。最终获得623个与Human-CDH17-ECD-His、CDH17-EC1-2-His、Mus-CDH17-ECD-His交叉结合的阳性克隆，序列分析后获得36个序列独特的单域抗体(也称纳米抗体)分子，其中12个抗体克隆E001、E005、E042、E046、E101、E114、E116、E119、E121、E201、E242和E243的核苷酸序列依次如SEQ ID NO:82～93所示，其所编码的氨基酸序列依次如SEQ ID NO:9～20所示；对其氨基酸序列进行比较分析，结果如图7所示。对该12个纳米抗体克隆的VHH氨基酸序列采用Kabat编号方案和定义方案分析其CDR1～3，结果如表9所示。其中，VHH1为阳性对照抗体，来自专利US20210253728A1中的anti-CDH17VHH1。
表9十二个纳米抗体的3个互补决定区(CDR1～3)的氨基酸序列
5、候选纳米抗体分子的全长表达制备及理化检测
5.1全长抗体蛋白的表达质粒构建：
将纳米抗体的编码核苷酸序列与hIgG1-CS(Fc，其氨基酸序列及编码核苷酸序列分别如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示)的编码核苷酸序列融合进行全基因合成，构建到pcDNA3.4载体(Invitrogen)上，得到VHH-Fc融合蛋白表达质粒。
5.2全长抗体蛋白的表达与纯化
将构建的抗体质粒转染至Expi CHO细胞(Gibco，A29133)，进行瞬转表达，抗体表达时间为7天，表达体积为2mL～10mL，表达结束后进行蛋白纯化、分装。
5.3全长抗体蛋白的SDS-PAGE鉴定全长抗体蛋白的SDS-PAGE鉴定的方法与步骤：
(1)纯化蛋白样品溶液制备：
非还原样品溶液制备：将纯化样品溶液、4×LDS上样缓冲液(泽叶生物，ZY6SL1197)和碘代乙酰胺(泽叶生物,ZY144)按照比例混合，保证碘代乙酰胺的终浓度为40mM、非还原样品上样量为1μg，混合后的样品置于75℃干浴仪上加热10min。
还原样品溶液制备：将纯化样品溶液、4×LDS上样缓冲液和二硫苏糖醇(DTT)(泽叶生物，ZY3483)按照比例混合，保证DTT的终浓度为5mM、还原样品上样量为2μg，混合后的样品置于100℃干浴仪上加热10min。
(2)电泳：140V，75min。
(3)染色、脱色、扫描：凝胶考马斯亮蓝染色，脱色后用EPSON V550彩色扫描仪扫描。(4)计算纯度：用ImageJ按照峰面积归一法计算还原条带纯度，或者还原重链加轻链和的纯度。
系统适应性：参照品IPI(Ipilimumab，伊匹木单抗)非还原条带分子量150kDa左右，纯度大于90％；还原重链分子量50kDa左右，轻链分子量25kDa左右，重链加轻链纯度大于90％。
5.4全长抗体蛋白的SEC鉴定
全长抗体蛋白的SEC鉴定的方法与步骤：(1)流动相配制：配制0.15M PB+NaCl，pH调至6.0。(2)样品处理：将样品浓度稀释至0.5mg/mL。(3)色谱柱条件：使用XBridge BEH(购自Waters)，SEC 3.5μm，7.8×300mm，柱温设置20℃，检测基线平稳。(4)参数设置：流速设置0.8mL/min；样品进样体积设置为20μL；检测波长280nm，带宽4nm，参比波长360nm，带宽100nm，峰宽(响应时间)＞0.1min(2s响应时间)；狭缝4nm；负吸光度基线100mAU。
系统适应性标准：参比品Herceptin(赫赛汀，曲妥珠单抗)单体纯度大于95％，BSA单体与二聚体的分离度大于1.5，基线平稳，则视为系统适应性通过。
上述全长构建、表达的12个候选抗体Fc融合蛋白的理化性质检测结果如表10所示：
表10十二个候选纳米抗体克隆的Fc融合蛋白的理化性质检测结果汇总
备注：1)“/”代表未检。2)SDS-PAGE检测参比品IPI条带大小正确，纯度大于95％，SEC检测参比品Herceptin单体纯度大于95％，BSA单体与二聚体的分离度大于1.5，基线平稳，均符合系统适应性。
5.5全长抗体蛋白的亲和动力学
(1)溶液配制
Q Buffer溶液:用1xPBS配制终浓度为0.025％ Tween 20和0.2％ BSA(IgG-FreeProtease-Free)的动力学缓冲溶液。
R Buffer溶液:用超纯水配制含10mM甘氨酸和150mM氯化钠的溶液，盐酸调整pH至2.0.
(2)全长抗体蛋白的亲和动力学检测
方法和步骤:①选模式：打开Gator非标记生物分子分析仪(购自Probe Life)及相关软件，选择Kinetics实验模式。②上机：亲和检测过程包括平衡、捕获、平衡、结合、解离和再生。首先平衡基线后使用Protein A探针(购自Probe Life)捕获待测抗体，再次平衡后待测抗体与梯度稀释的抗原结合、解离，最后进行探针再生。详见表11。
表11亲和动力学检测过程(Gator)
(2)亲和动力学检测结果
以人CDH17-EC1-2-His(P67889)为抗原进行的各抗体样品与抗原的亲和力检测结果表12所示。
Gator非标记生物分子分析仪所检测的KD限值为1E-06M。实验结果显示所有抗体在Global拟合模式下的相关系数R2都大于0.95，符合系统适应性要求，结果可靠。12个候选抗体全长蛋白样品与抗原的亲和力水平皆达到nM级或100pM级，阳性对照抗体Anti-CDH17-VHH-Fc与抗原的亲和力水平为100pM级。
表12亲和力动力学检测结果(Gator)
备注：R2：线性拟合常数；Rmax：曲线拟合最高响应值。
以鼠抗原蛋白Mus-CDH17-ECD-His(P98752)为抗原进行的候选抗体样品与抗原的亲和力检测结果如表13所示。实验结果显示所有抗体在Global拟合模式下的相关系数R2都大于0.95，符合系统适应性要求，结果可靠。结果显示待测样品P210390(E042)、P210434(E243)与抗原在180sec的解离时间内拟合不到解离趋势数据，其余10个待测样品与鼠抗原的亲和力水平分别达10nM-10pM级别。阳性对照抗体Anti-CDH17-VHH-Fc与抗原的亲和力水平为10nM级。
表13亲和力动力学检测结果(Gator)
备注：1)R2：线性拟合常数；Rmax：曲线拟合最高响应值。
5.6全长抗体蛋白的ELISA检测
全长抗体蛋白的ELISA检测的方法与步骤：(1)包板：用1×PBS稀释抗原至浓度为2μg/mL，按30μL/孔加入到96孔ELISA板中，4℃包被过夜。(2)封闭：用PBST洗板3次，加入封闭液(5％PBSM)室温封闭2h。(3)孵育：洗板，按30μL/孔加入1％ PBSM稀释的样品，室温孵育60min。(4)二抗孵育：用PBST洗板3次，加入二抗，室温孵育50min。(5)显色：用PBST洗板3次，每孔加入30μL TMB(购自SurModics)。(6)终止：加入50μl TMB显色终止液终止反应，同时检测OD450。
上述检测中，阴性对照抗体NC为IPI(Ipilimumab)，空白对照BC为1％ PBSM。
以CDH17-EC1-2-His、Mus-CDH17-ECD-His和CDH17-EC1-2-His为抗原进行的各抗体样品与抗原的ELISA检测结果如图8和表14所示。12个全长抗体皆与CDH17-EC1-2-His和CDH17-EC1-2-His有较强的结合活性，也皆与Mus-CDH17-ECD-His有不同程度的结合活性。
表14纯化后的候选抗体克隆全长表达蛋白的ELISA检测EC50(μg/mL)汇总
备注：/代表未测，N代表无结合，W代表弱结合，Y代表有结合，但无法计算EC50值。
5.7全长抗体蛋白的FACS检测
对12个全长抗体蛋白分别与两种抗原表达细胞ASPC-1和SNU-16的结合活性进行FACS检测，其方法与步骤如下：
(1)细胞铺板：将培养瓶中的细胞转移至离心管中，离心去上清，用培养基重悬计数后，将细胞密度调整为1×106cells/mL。取96孔圆底板，用100μL的移液排枪将细胞加入孔板中，每孔加入100μL。离心机300g/min，离心5min。甩去上清。
(2)蛋白上清稀释液的加入：将全长抗体蛋白样品用FACS缓冲液(含体积百分比为2％FBS的1×PBS缓冲液)稀释成150.000、37.500、9.375、2.3438、0.5859、0.1465、0.0366、0.0092nM 8个浓度梯度的稀释液。采用100μL的12道移液器将抗体稀释液加到96孔细胞板，每孔100μL。混匀后置于4℃冰箱中孵育1h。
(3)二抗的加入：将二抗PE labelled anti-Human Fc(购自Jackson)用FACS缓冲液进行1：200稀释，将细胞培养板离心去上清，采用100μL的12道移液器在细胞培养板加入100μL的二抗稀释液。将细胞培养板置于4℃冰箱中培养30min。离心去上清，FACS缓冲液洗板2次，每孔用120μL的FACS缓冲液重悬细胞。
上述检测中，阳性对照抗体为Anti-CDH17-VHH-Fc(P76673)，同型对照抗体为IgG1(P93950-1，购自三优)，只加二抗的对照标为“cell sec”，不加任何抗体的空白细胞对照标为“cell only”。
(4)数据采集：打开流式细胞仪(购自Beckman)，待仪器清洗结束后，进行FACS结合的检测。
抗体样品与抗原表达细胞的FACS检测结果如图9和表15所示。结果表明，12个全长抗体皆与ASPC-1和SNU-16有较强的结合活性。
表15纯化后的候选抗体克隆全长表达蛋白的FACS检测EC50结果汇总(nM)
6、Anti-CDH17 CARs的结构设计
设计了9个靶向CDH17的嵌合抗原受体(Anti-CDH17 CARs)，其通用的CAR结构示意图如图10所示。Anti-CDH17 CARs包括CD8α的信号肽(SP)，抗CDH17的纳米抗体(anti-CDH17VHH)、氨基酸突变优化的IgG4的铰链区(IgG4mH)、CD28的跨膜区(CD28TM)、CD28胞内共刺激域、4-1BB共刺激域序列和CD3ζ信号传导域。其中8个CAR表达的纳米抗体VHH氨基酸序列分别来自本发明的8个纳米抗体克隆E042、E046、E101、E116、E119、E121、E201和E243，其对应的CAR名称分别简写为E042 CAR、E046 CAR、E101 CAR、E116 CAR、E119 CAR、E121CAR、E201 CAR、和E243 CAR。其中阳性对照CAR(简写为CDH17 CAR)表达的纳米抗体的氨基酸及编码核苷酸序列为专利US20210253728A1中的anti-CDH17 VHH1序列。
SP的氨基酸和编码核苷酸序列分别如SEQ ID NO:60～61所示；IgG4mH的氨基酸和编码核苷酸序列分别如SEQ ID NO:62～63所示；CD28TM的氨基酸和编码核苷酸序列分别如SEQ ID NO:64～65所示；CD28胞内共刺激域的氨基酸和编码核苷酸序列分别如SEQ ID NO:66～67所示；4-1BB共刺激域的氨基酸和编码核苷酸序列分别如SEQ ID NO:68～69所示；CD3ζ信号传导域的氨基酸序列和编码核苷酸序列分别如SEQ ID NO:70～71所示，做为阳性对照的CDH17 CAR的全长氨基酸序列和编码核苷酸序列分别如SEQ ID NO:72～73所示。
7、Anti-CDH17 CARs的慢病毒表达质粒构建
(1)Anti-CDH17 VHH的编码核苷酸的密码子优化与合成：对8个纳米抗体克隆的VHH编码核苷酸序列，首先进行人类密码子优化，然后进行DNA合成。优化后的8个候选抗体克隆E042、E046、E101、E116、E119、E121、E201和E243的编码核苷酸序列分别如SEQ ID NO:74～81所示。
(2)载体酶切线性化：以三代慢病毒表达质粒pCDH-EF1-Kan(购自丰晖生物，其质粒图谱如图11所示为载体骨架，在XbaI和EcoRI两酶切位点进行双酶切使载体线性化。
(3)无缝克隆：利用常规无缝克隆技术，将PCR扩增的CAR结构中的所有DNA片段克隆进线性化的pCDH-EF1-Kan载体骨架中，构建成8个纳米抗体和1个阳性对照的Anti-CDH17CAR表达质粒，称作pCDH17 CAR。
8、慢病毒包装与滴度测定
慢病毒包装采用本领域的常规四质粒体系，四种质粒皆为卡那霉素抗性。采用293T细胞(ThermoFisher)作为慢病毒包装细胞。慢病毒表达质粒pCDH17 CAR与三种辅助质粒pMDLg/pRRE、pRSV-Rev和pMD2.G(三种质粒皆购自丰晖生物)共转染293T细胞的质粒用量比例为4:2:2:1；对于T75细胞培养瓶，质粒总量为20ug，则四种质粒用量分别为8.8ug、4.4ug、4.4ug、2.2ug。转染试剂PEI的用量为四种质粒总量的3倍；对于T75培养瓶，PEI用量为60ug(1ug/ul，60ul)。将上述质粒与PEI转染试剂分别加入无血清培养基中混匀，再将二者混匀后放置15分钟，然后将混合液加入至铺有293T细胞的T75培养瓶中，轻轻混匀，于37℃、5％CO2细胞培养箱培养6h。6h后更换含2％ FBS的新鲜培养基，继续培养，在转染48h后收集慢病毒的培养上清，离心(2000rpm，15min)后取上清，经0.45um滤器过滤后，采用超速离心(25000rpm，3h)浓缩上清，然后根据稀释倍数用相应体积的培养基重悬病毒沉淀，分装，置于-80℃冻存。
对于CDH17 CAR慢病毒的滴度测定，将慢病毒原液或浓缩液进行系列梯度稀释后转染293T细胞，72h后流式检测转染效率，计算出慢病毒的活性滴度。
9、CDH17 CAR-T制备与培养
取冻存的PBMC复苏培养过夜，取悬浮的PBMC离心并用含300IU/mL的IL-2的X-VIVO15培养基(购自LONZA)重悬并调整细胞密度为1.5×106/ml，按17.5：1(PBMC体积：激活剂体积)加入激活剂MACS GMP T Cell TransAct(Milteny Biotec)进行激活，30小时后离心更换培养基(含300IU/mL的IL-2的X-VIVO 15)、计数，按MOI＝5加入CDH17 CAR慢病毒，吸打混匀，于37℃、5％CO2的细胞培养箱培养16h，补加等体积培养基，继续培养。之后每两天进行一次计数并通过补充或更换培养基的方式，将细胞密度维持在0.5～2×106/ml，继续培养至8-14天(从细胞激活起算)，其间采用流式细胞仪检测CDH17 CAR-T细胞的CAR表达阳性率，方法如下：
取含1E6个细胞的CAR-T细胞液，300g离心5min，弃上清，加入50μL PBS重悬；加入1-3ul CDH17抗原CDH17 Protein-His Tag(Acro)，室温避光孵育20min；加入500μL PBS，混匀，300g离心5min；弃上清，加入50μL PBS重悬；加入CD3抗体Anti-CD3-APC(Biolegend)和二抗PE anti-His Tag(Biolegend)，混匀，室温避光孵育20min；加入500μL PBS，混匀，300g离心5min；弃上清，加200μL PBS重悬细胞，上机检测。分析CD3阳性细胞群的CAR阳性的T细胞比例，即为CAR-T细胞的CAR阳性率。在其中一次具体实施例中，9种CAR-T细胞在激活后9天(D9)的CAR阳性率流式检测结果如图12和表16所示。
表16anti-CDH17 CAR-T细胞的CAR阳性率(D9)
10、CDH17 CAR-T体外杀伤功能检测
采用的靶细胞有三种，分别为导入了绿色荧光蛋白(GFP)标记基因的CDH17抗原天然表达细胞系胃腺癌AGS(购自上海科学院细胞库)、胰腺癌ASPC-1(购自中国科学院细胞库)和胃癌SNU-5(购自中国科学院细胞库)。三种靶细胞的CDH17抗原和GFP标记蛋白的表达阳性率的流式检测结果如图13表示。
杀伤实验设置：9种CAR-T与对照T(MOCK-T)作为效应细胞分别与3种靶细胞共孵育，效：靶比设为2:1(注：效应细胞为总细胞数)，每种效靶共孵育设3个复孔，同时设置只有靶细胞的空白对照。(1)铺靶：在96孔板中，各孔加入细胞密度为2E5/ml的靶细胞100ul，放入S3实时活细胞成像仪(购自赛多利斯)，设置好靶细胞绿色荧光拍摄参数，于37℃、5％CO2条件下培养过夜；(2)第二天，在对应孔加入细胞密度为4E5/ml的效应细胞100ul，对于只有靶细胞的空白对照补加100ul培养基。将96孔板放入S3实时活细胞成像仪(购自赛多利斯)，于37℃、5％CO2条件下继续孵育48h。
结果分析：根据IncuCyte实时拍摄的靶细胞绿色荧光图片进行分析，以加入效应细胞与靶细胞开始共孵育之前最近的一个拍摄时间点作为靶细胞荧光面积归一化的时间点，以共孵育结束时点为终点，绘制靶细胞生长曲线，即效应细胞对靶细胞的杀伤曲线。根据杀伤曲线上共孵育终点对应的靶细胞绿色荧光值，计算效应细胞的杀伤效率。计算公式为：杀伤效率＝[(空白靶细胞终点荧光值-效靶共孵育细胞组终点荧光值)/空白靶细胞终点荧光值]×100％。根据杀伤效率计算结果绘制杀伤效率柱状图(见图4)。可以看出，9种CAR-T对三种CDH17靶细胞均具有明显的杀伤作用，与MOCK-T相比，杀伤差异显著性在1个*(P<0.05)和4个*(P<0.0001)之间。其中，E119CAR-T和E121 CAR-T的杀伤效率相对偏低，与其CAR阳性率偏低有关。除了E119 CAR-T和E121CAR-T，另6种候选抗体的CAR-T杀伤效率均与对照CAR-T相当或高于。另外，9种CAR-T对AGS和SNU-5两种胃癌细胞的杀伤效果均好于胰腺癌细胞ASPC-1。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.靶向钙粘蛋白17的纳米抗体，其特征在于，所述靶向钙粘蛋白17的纳米抗体的互补决定区的氨基酸序列包括如SEQ ID NO:21～32任一所示的CDR1、如SEQ ID NO:34～45任一所示的CDR2、氨基酸序列如SEQ ID NO:47～58任一所示的CDR3。
2.根据权利要求1所述靶向钙粘蛋白17的纳米抗体，其特征在于，所述靶向钙粘蛋白17的纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:9～20任一所示。
3.一种靶向钙粘蛋白17的CAR-T细胞，其特征在于，所述CAR-T细胞表达靶向钙粘蛋白17的嵌合抗原受体；所述靶向钙粘蛋白17的嵌合抗原受体包括CDH17抗原结合域、铰链区、跨膜区和胞内信号传导域；所述CDH17抗原结合域包括信号肽和如权利要求1或2所述的纳米抗体中的任意一种。
4.根据权利要求3所述一种靶向钙粘蛋白17的CAR-T细胞，其特征在于，所述信号肽为CD8α的信号肽，所述铰链区为氨基酸突变优化的IgG4的铰链区、所述跨膜区为CD28的跨膜区、所述胞内信号传导域包括CD28胞内共刺激域、4-1BB共刺激域和CD3ζ信号传导域。
5.根据权利要求4所述一种靶向钙粘蛋白17的CAR-T细胞，其特征在于，所述CD8α的信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:60所示；
所述氨基酸突变优化的IgG4的铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO:62所示；
所述CD28的跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO:64所示；
所述CD28胞内共刺激域的氨基酸序列如SEQ ID NO:66所示；
所述4-1BB共刺激域序列的氨基酸序列如SEQ ID NO:68所示；
所述CD3ζ信号传导域的氨基酸序列如SEQ ID NO:70所示。
6.一种核酸，其特征在于，包括编码如权利要求1至2任一项所述的靶向钙粘蛋白17的纳米抗体的核酸序列或其互补序列，或包括编码如权利要求3至5任一项所述的靶向钙粘蛋白17的嵌合抗原受体的核酸序列或其互补序列。
7.根据权利要求6所述一种核酸，其特征在于，所述CD8α的信号肽的编码核苷酸序列如SEQ ID NO:61所示；
所述抗CDH17的纳米抗体的编码核苷酸序列如SEQ ID NO:82～93或SEQ ID NO:74～81任一所示；
所述氨基酸突变优化的IgG4的铰链区的编码核苷酸序列如SEQ ID NO:63所示；
所述CD28的跨膜区的编码核苷酸序列如SEQ ID NO:65所示；
所述CD28胞内共刺激域的编码核苷酸序列如SEQ ID NO:67所示；
所述4-1BB共刺激域序列的编码核苷酸序列如SEQ ID NO:69所示；
所述CD3ζ信号传导域的编码核苷酸序列如SEQ ID NO:71所示。
8.一种慢病毒载体，其特征在于，所述慢病毒载体包含权利要求6或7所述的核酸分子。
9.一种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物包括权利要求1至2任一项所述的靶向钙粘蛋白17的纳米抗体，或者权利要求3至5中任一项所述的靶向钙粘蛋白17的CAR-T细胞，或者权利要求6至7任一项所述的核酸，或者权利要求8所述的慢病毒载体。
10.一种权利要求1至2任一项所述的靶向钙粘蛋白17的纳米抗体，或者权利要求3至5任一项所述的靶向钙粘蛋白17的CAR-T细胞，或者权利要求6至7任一项所述的核酸，或者权利要求8所述的慢病毒载体，或者权利要求9所述的药物组合物在制备靶向钙粘蛋白17的检测试剂、活体成像探针或治疗产品中的应用。
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