CN119409815B - 抗人补体c5 vhh抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种特异性结合补体C5的单域抗体或重链抗体。本发明也涉及编码所述抗体的多核苷酸、表达载体和宿主细胞，及其药物组合物，和治疗C5蛋白相关疾病的方法和用途。

Description

抗人补体C5 VHH抗体及其应用

技术领域

本发明涉及一种特异性结合补体C5的单域抗体或重链抗体。本发明也涉及编码所述抗体的多核苷酸、表达载体和宿主细胞，及其药物组合物或组合产品，和治疗C5蛋白相关疾病的方法和用途。

背景技术

补体系统由30余种可溶性蛋白分子组成，是天然免疫系统的一部分，其组成成分包括补体固有成分、多种调节因子和补体受体等30多种分子。补体系统可通过3条既相对独立又相互联系的途径被激活，从而发挥调节吞噬、裂解细胞、介导炎症、免疫调节和清除免疫复合物等多种生物学效应，包括增强吞噬作用、增强吞噬细胞的趋化性、增加血管的通透性、中和病毒、细胞溶解作用、免疫反应的调节作用等。虽然补体活化为抵抗潜在病原体提供了有价值的第一线防御力，但促进保护性炎症应答反应的补体激活也可能表现为对宿主的潜在威胁。补体激活和其在靶结构上的沉积也可以间接地引起细胞或组织破坏。在补体途径中的各个点产生介导组织损害的补体激活产物。宿主组织上不适当的补体激活在许多自身免疫病和炎性疾病的病理学中起重要作用。

补体蛋白质包括表示为C1至C9的蛋白质，并且这些蛋白质通过三种不同途径(经典途径、凝集素途径、替代途径)被连续激活，以引起免疫反应。补体C5是补体的第五种成分，在炎症和细胞杀伤过程中起重要作用。这种蛋白质由通过二硫键连接的α和β多肽链组成。 活化肽 C5a 是一种过敏毒素，经由C5aR(CD88)和C5L2(GPR77)诱导各种细胞的炎性反应，具有强效的致痉挛和趋化活性，通过用 C5 转化酶裂解从α多肽中衍生而来。 C5b大分子裂解产物可以与C6补体成分形成复合物，而这种复合物是形成膜攻击复合物（MAC）的基础，其中包括额外的补体成分。如果不能适当控制补体系统或该补体系统被过度激活，则补体系统可能会对宿主细胞产生强烈的细胞毒性。

众多研究显示补体C5与多种疾病有关，例如与人补体溶血活性相关的多种疾病。

抗C5单克隆抗体依库珠单抗(Eculizumab,Soliris(注册商标))展示出对补体C5的高亲和性，且通过抑制C5裂解为C5a/C5b及伴随膜攻击复合物的形成来遏制补体的激活。由此，依库珠单抗展现出对溶血的抑制作用，且因此作为阵发性睡眠性血红蛋白尿症和非典型溶血尿毒综合征的治疗剂。此外，依库珠单抗被称为全身性重症肌无力(gMG)的治疗剂。

在体外溶血抑制活性检测时，尽管依库珠单抗展现出了良好的经典途径溶血抑制效果，但其旁路途径的溶血抑制效果却较弱，这也可能是导致多达75%经Soliris治疗的病人，经历持续贫血和贫血相关症状的原因。

此外，依库珠单抗价格较为昂贵，其原因之一就是人体内补体C5蛋白含量较高，且更新速度快，这就需要单次治疗时注射大量的药物用于完全阻断补体活性，因此开发活性更好，稳定性更高、分子尺寸更小的单域抗体具有改善治疗效果和提高患者依从性的潜力。

因此希望可以开发适用于治疗和预防补体C5相关的疾病的替代性抗体，特别是稳定性更高的分子尺寸较小的单域抗体。

发明内容

本发明涉及一种能够高效结合人和猴补体C5蛋白的单域抗体，例如VHH抗体，以及包含其的重链抗体。在一些实施方案中，所述抗体能够有效阻断人补体溶血活性。

在一些实施方案中，本发明的抗体能够特异性结合人C5蛋白和/或猴（例如食蟹猴）C5蛋白。在一些实施方案中，本发明的抗体能够有效抑制人和/或猴（例如食蟹猴）补体经典途径溶血和人和/或猴（例如食蟹猴）补体旁路途径溶血，活性强于已知的抗C5抗体例如依库珠单抗。在一些实施方案中，本发明的抗体能够具有良好的人补体抑制活性和/或良好的猴（例如食蟹猴）补体抑制活性，例如活性强于已知的抗C5抗体例如依库珠单抗。在一些实施方案中，本发明的抗体具有更高的耐热稳定性，例如能够耐受70℃、75℃、76℃、77℃、78℃或79℃下热处理（例如热处理1小时）；优选地，能够耐受80℃、81℃、82℃、83℃、或84℃热处理（例如热处理1小时）。

在本发明的一些方面中，本发明提供了特异性结合补体C5的VHH抗体，其包含SEQID NO:34、33、11-14中任一项所示的VH中所含的三个互补决定区域（CDR）CDR1、CDR2和CDR3。

在一些实施方案中，本发明的VHH抗体包含CDR1、CDR2和CDR3，其中，

(i) CDR1包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列或由其组成， CDR2包含SEQ IDNO:19所示的氨基酸序列或由其组成，CDR3包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列或由其组成；

或(ii) CDR1包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列或由其组成， CDR2包含SEQIDNO:19所示的氨基酸序列或由其组成，CDR3包含SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列或由其组成；

或(iii) CDR1包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列或由其组成， CDR2包含SEQIDNO:19所示的氨基酸序列或由其组成， CDR3包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列或由其组成；

或(iv) CDR1包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列或由其组成， CDR2包含SEQIDNO:19所示的氨基酸序列或由其组成， CDR3包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列或由其组成。

在一些实施方案中，本发明的VHH抗体包含重链可变区或由其组成，所述重链可变区包含与SEQ ID NO: 34、33、11-14中任一项所示的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列或由其组成;或者包含SEQ ID NO:34、33和11-14中任一项所示的氨基酸序列或由其组成。

在本发明的一些方面中，本发明提供了特异性结合补体C5的重链抗体，其包含本发明所述的VHH抗体。

在一些实施方案中，本发明的重链抗体包含与抗体恒定区或Fc区连接的本发明所述的VHH抗体，优选地，所述抗体恒定区或Fc区来自人IgG1、人IgG2、人IgG3或人IgG4，任选地，所述VHH抗体与所述Fc区通过铰链区连接。在一些实施方案中，所述VHH抗体与Fc区经由铰链区连接，例如所述铰链区来自人IgG1，例如是天然人IgG1铰链区或包含C220S的人IgG1铰链区。在一些实施方案中，所述铰链区包含SEQ ID NO:38或39所示的氨基酸序列或由其组成。

在一些实施方案中，本发明的重链抗体包含与抗体Fc区连接的本发明所述的VHH抗体，其中所述Fc区为来自人IgG1的Fc区，优选地，所述Fc区包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列或与之具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或更高同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明的重链抗体：

(i)包含与选自SEQ ID NO:36、35和27-30中任一项所示的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列或由其组成;

或者(ii) 包含选自SEQ ID NO: 36、35和27-30中任一项所示的氨基酸序列或由其组成。

在一些实施方案中，本发明的VHH抗体或重链抗体是驼源抗体、嵌合抗体或人源化抗体。

在本发明的一些方面中，本发明提供了核酸分子，其编码本发明的VHH抗体，或本发明的重链抗体；或包含SEQ ID NO:32、31和7-10中任一项所述的核酸序列，或由所述核酸序列组成。

在本发明的一些方面中，本发明提供了表达载体，其包含本发明的核酸分子，优选地，所述表达载体为pCDNA3.1。

在本发明的一些方面中，本发明提供了宿主细胞，其包含本发明所述的核酸分子或本发明所述的表达载体，优选地，所述宿主细胞是原核的或真核的，例如293细胞，例如293FT细胞。

在本发明的一些方面中，本发明提供了制备本发明所述的VHH抗体，或本发明所述的重链抗体的方法，所述方法包括，在适合所述VHH抗体或重链抗体或其链表达的条件下，培养本发明所述的宿主细胞，和任选地从所述宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收所述VHH抗体或重链抗体。

在本发明的一些方面中，本发明提供了免疫缀合物，其包含本发明所述的VHH抗体，或本发明所述的重链抗体。

在本发明的一些方面中，本发明提供了药物组合物，其包含一种或多种本发明所述的VHH抗体，或本发明所述的重链抗体，或本发明所述的免疫缀合物，以及任选地药用辅料。

在本发明的一些方面中，本发明提供了药物组合物，其包含两种或三种本发明所述的VHH抗体；或两种或三种本发明所述的重链抗体，以及任选地药用辅料。

在本发明的一些方面中，本发明提供了药物组合产品，其包含本发明所述的VHH抗体或重链抗体，以及其它治疗剂。

在本发明的一些方面中，本发明提供了药物组合产品，其中所述药物组合产品包含两种或三种本发明所述的VHH抗体或重链抗体。

在本发明的一些方面中，本发明提供了在受试者中预防或治疗补体C5相关疾病或病症或用于阻断或抑制补体溶血的方法，包括向受试者施用有效量的一种或多种本发明所述的VHH抗体，或一种或多种本发明所述的重链抗体，本发明所述的免疫缀合物；或本发明所述的药物组合物；或本发明所述的药物组合产品。在本发明的一些方面中，本发明一种或多种本发明所述的VHH抗体，或一种或多种本发明所述的重链抗体，本发明所述的免疫缀合物；或本发明所述的药物组合物；或本发明所述的药物组合产品制备药物的用途，所述药物用于在受试者中预防或治疗补体C5相关疾病或病症或用于阻断或抑制补体溶血。在本发明的一些方面中，本发明一种或多种本发明所述的VHH抗体，或一种或多种本发明所述的重链抗体，本发明所述的免疫缀合物；或本发明所述的药物组合物；或本发明所述的药物组合产品，用于在受试者中预防或治疗补体C5相关疾病或病症或用于阻断或抑制补体溶血。在一些实施方案中，本发明所述疾病或病症包括由未调控的C5功能例如由于失调的C5激活，例如增加的C5激活而导致的疾病表型。在一些实施方案中，本发明所述受试者中具有（例如升高水平的，例如核酸或蛋白质水平的）补体C5蛋白或所述疾病治疗将受益于抑制核酸或蛋白质水平的补体C5蛋白。在一些实施方案中，所述补体溶血是补体经典途径溶血和/或补体旁路途径溶血。

附图说明

图1显示了羊驼免疫后血清中抗C5抗体效价。

图2显示了重组C5 VHH抗体对人补体CP途径溶血的抑制活性。

图3显示了重组C5 VHH抗体对人补体AP途径溶血的抑制活性。

图4显示了重组人源化C5 VHH抗体C5006d1-G1 SEC-HPLC纯度（波长=280nM）。

图5显示了重组人源化C5 VHH抗体C5006e3-G1 SEC-HPLC纯度（波长=280nM）。

图6显示了包被抗体检测梯度稀释的抗原人C5时，人源化C5 VHH抗体C5006d1-G1、C5006e3-G1对人CD5的结合。

图7显示了当包被抗原人C5蛋白检测梯度稀释的抗体时，人源化C5 VHH抗体C5006d1-G1、C5006e3-G1对人C5的结合。

图8显示了重组人源化C5 VHH抗体对人补体CP途径溶血的抑制活性。

图9显示了重组人源化C5 VHH抗体对人补体AP途径溶血的抑制活性。

图10 显示了重组人源化C5 VHH抗体对猴补体CP途径溶血的抑制活性。

图11 显示了重组人源化C5 VHH抗体对猴补体AP途径溶血的抑制活性。

图12显示了热处理后重组人源化C5 VHH抗体对补体CP途径溶血的抑制活性。

具体实施方式

除非另外限定，否则本文中所用的全部技术与科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。本文所提及的全部出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用的方式完整地并入。此外，本文中所述的材料、方法和例子仅是说明性的并且不意在是限制性的。本发明的其他特征、目的和优点将从本说明书及附图并且从后附的权利要求书中显而易见。

I. 定义

为了解释本说明书，将使用以下定义，并且只要适当，以单数形式使用的术语也可以包括复数，并且反之亦然。要理解，本文所用的术语仅是为了描述具体的实施方案，并且不意欲是限制性的。

术语“约”在与数字数值联合使用时意为涵盖具有比指定数字数值小5%(例如4%、3%、2%或1%)的下限和比指定数字数值大5%(例如4%、3%、2%或1%)的上限的范围内的数字数值。

如本文所用，术语“和/或”意指可选项中的任一项或可选项的两项或多项或全部。

如本文所用，术语“包含”或“包括”意指包括所述的要素、整数或步骤，但是不排除任意其他要素、整数或步骤。在本文中，当使用术语“包含”或“包括”时，除非另有指明，否则也涵盖由所述及的要素、整数或步骤组成的情形。例如，当提及“包含”某个具体序列的抗体可变区时，也旨在涵盖由该具体序列组成的抗体可变区。

术语“补体C5”或“C5蛋白”或“补体C5蛋白”或“C5补体蛋白”可互换使用，并且还是指不同物种中的补体C5蛋白。在本文中，除非另外说明，该术语也涵盖C补体C5的任何变体，尤其是天然存在的变体、等位基因变体，以及翻译后修饰变体和构象变体，并涵盖其物种同源物。此外，应理解，该术语不仅涵盖由细胞天然或重组表达的CDH17或在天然或重组细胞上表达的CDH17，也涵盖重组表达的包含CDH17或其片段的融合蛋白。

人补体C5（例如Uniprot条目P01031）是一种分泌的多结构域糖蛋白，由通过二硫桥连接的α链（999个氨基酸）和β链（655个氨基酸）组成。α链的Arg751与Leu752之间的肽键被C5转化酶裂解，产生小的74个氨基酸长的C5a片段和大的C5b片段（1580个氨基酸）。C5向C5b的转化涉及大的构象变化并导致随后的C6结合。例如，在一些实施方案中，人C5具有如SEQ ID NO：1中所示的序列并且食蟹猴（Macaca fascicularis）C5具有SEQ ID NO:6中所示的序列。

“单域抗体”（single domain antibody, sdAb）在本文中用于指，通过单个可变抗体结构域，例如单个VH或单个VL，来识别并结合目的抗原的抗体多肽。单域抗体的单个可变抗体结构域无需与另一抗体可变结构域配对，即能够识别和结合目的抗原。在本文中，包含重链可变结构域的单域抗体也称作VHH。

术语“VHH” ，通常指这样的抗体，其仅包含一个重链可变区或由其组成，具有与抗原结合的活性，即从C端到N端仅包含一条链：FR4-CDR3-FR3-CDR2-FR2-CDR1-FR1的抗体。VHH通常是从缺乏轻链的重链抗体衍生的重链可变结构域，也称作纳米抗体。本发明中使用的VHH优选来自骆驼科动物，例如羊驼，或是其人源化形式或序列优化形式(例如，以增加结合亲和力的亲和力成熟形式)。在一些实施方案中，本发明的VHH为由或基本上由单个重链可变区（例如重链抗体的重链可变区）组成的单价单特异性多肽分子。

本发明的单域抗体或VHH也可以包含在更大的多肽/蛋白中。包含本发明VHH的多肽/蛋白例子包括但不限于，重链抗体(HcAb)。本发明所述的“重链抗体”是指不具有轻链的抗体，例如其从N段到C段可以包含VH-Fc或VH-CH2-CH3或VH-铰链区-CH2-CH3，或可以包含VH-CH1-CH2-CH3；可以涵盖同型二聚体，例如不具有轻链的重链二聚体抗体。本发明的重链抗体中可以包含来自标准抗体的VH或者来自单域抗体的VH。例如，本发明的重链抗体中的VH可以就是VHH。在一些实施方案中，本发明的重链抗体可以是具有源自骆驼科动物（美洲驼、骆驼，尤其是羊驼）的构架区和/或重链恒定区的重链抗体，其人源化形式或其序列优化形式(亲和力成熟形式)、或其片段（例如包含至少部分恒定区的片段）。本发明的重链抗体还涵盖将重链可变区或VHH与Fc区（例如人IgG Fc区，例如人IgG1或IgG4Fc区）融合后形成的抗体。

术语抗体的“抗原结合片段”是比全抗体或全长抗体的氨基酸残基数要少的全长或全抗体的一部分或一段，但其能结合抗原或与全长抗体(即与抗原结合片段所来源的全长抗体)竞争结合抗原。可以通过重组DNA技术、或通过酶或化学切割完整的抗体制备抗原结合片段。抗原结合片段包括但不限于Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、单链Fv、双体抗体(diabody)、单域抗体(sdAb)、纳米抗体。例如，通过木瓜蛋白酶消化全长抗体能够获得Fab片段。此外，通过胃蛋白酶在铰链区的二硫键下面消化完全抗体产生F(ab')2，其为Fab’的二聚体，是二价的抗体片段。F(ab')2可以在中性条件下通过破坏铰链区中的二硫键而被还原，由此将F(ab')2二聚体转化为Fab'单体。Fab'单体基本上是具有铰链区的Fab片段。Fv片段由抗体单臂的VL和VH结构域组成。Fv片段的两个结构域VL和VH可以由独立的基因编码，但是也可以使用重组方法，使用合成性连接肽连接这两个结构域以使其作为单条蛋白链产生，并且在所述单条蛋白链中VL区和VH区配对以形成单链Fv (scFv)。

在本文中，术语“可变区”或“可变结构域”是指参与抗体与抗原结合的抗体重或轻链的结构域。在重链抗体例如来自骆驼科重链抗体的情况下，单个VH结构域(在本文中，也称作VHH结构域)可以足以给予抗原结合特异性。VHH结构域与常规IgG抗体的重链和轻链可变区一样，都包含四个保守的框架区(FR)和三个互补决定区(CDR)，并以FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的顺序排列。在根据本发明的一些方面，可以对抗体的可变区中的一个或多个残基进行修饰，例如，对一个或多个CDR区和/或对一个或多个构架区进行残基修改，尤其是保守残基取代，以获得仍基本上保持亲本抗体的至少一个生物学特性(例如，抗原结合能力) 的抗体变体。在再一些方面，可以通过CDR移植，修饰抗体可变区。由于CDR序列负责大多数抗体-抗原相互作用，故可以构建模拟已知抗体的性质的重组抗体变体。在此类抗体变体中，来自已知抗体的CDR序列被移植到具有不同性质的不同抗体的构架区上，并可以根据需要进行1至几个残基突变，例如回复突变以精细化抗体的期望性质。可以在体外或体内测定试验中评估突变和/修饰后的抗体的性质，例如靶抗原结合性质或其它期望的功能性质，例如补体途径中抑制溶血的活性。

抗体的“互补决定区”或“CDR区”或“CDR” 或“高变区”，是抗体可变结构域（VH或VHH）中在序列上高度可变并且形成在结构上确定的环（“超变环”）和/或含有抗原接触残基（“抗原接触点”）的区域。CDR主要负责与抗原表位结合。重链和轻链的CDR从N-端开始顺序编号，通常称作CDR1、CDR2和CDR3。位于抗体重链可变结构域内的CDR也称作HCDR1、HCDR2和HCDR3，而位于抗体轻链可变结构域内的CDR则称作LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一个给定的轻链可变区或重链可变区氨基酸序列中，可以采用本领域公知的多种方案确定其CDR序列，例如：基于抗体的三维结构和CDR环的拓扑学的Chothia，基于抗体序列可变性的Kabat(Kabat等人, Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest, 第4版, U.S.Department of Health and Human Services, National Institutes of Health(1987)), AbM (University of Bath)，Contact (University College London)，国际ImMunoGeneTics database (IMGT) (国际免疫遗传学信息系统,万维网imgt.cines.fr/)，以及基于利用大量晶体结构的近邻传播聚类(affinity propagation clustering)的North CDR定义（North等，“ANew Clustering of Antibody CDR Loop Con格式ions”，Journal of Molecular Biology，406，228-256（2011））。

以下为采用kabat、AbM、Chothia、Contact和IMGT方案定义的CDR的区域范围。

CDR	Kabat方案	AbM方案	Chothia方案	Contact方案	IMGT方案
						LCDR1（Kabat和Chothia编号系统）	L24-L34	L24-L34	L26-L32	L30-L36	L27-L32
LCDR2（Kabat和Chothia编号系统）	L50-L56	L50-L56	L50-L52	L46-L55	L50-L52
						LCDR3（Kabat和Chothia编号系统）	L89-L97	L89-L97	L91-L96	L89-L96	L89-L96
HCDR1（Kabat编号系统）	H31-H35B	H26-H35B	H26-H32	H30-H35B	H26-H33
						HCDR1（Chothia编号系统）	H31-H35	H26-H35	H26-H32	H30-H35	H26-H33
HCDR2（Kabat和Chothia编号系统）	H50-H65	H50-H58	H53-H55	H47-H58	H51-H57
						HCDR3（Kabat和Chothia编号系统）	H95-H102	H95-H102	H96-H101	H93-H101	H93-H102

除非另有说明，否则在本发明中，术语“CDR”或“CDR序列”涵盖以上述任一种方式确定的CDR序列。

CDR也可以基于与参考CDR序列具有相同的Kabat编号位置而确定。除非另有说明，否则在本发明中，当提及抗体可变区中的残基位置（包括重链可变区残基和轻链可变区残基）时，是指根据Kabat编号系统（Kabat等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest, 5^thEd. Public Health Service, National Institutes of Health,Bethesda, Md. (1991)）的编号位置。

在一个实施方案中，本发明的抗体分子中的CDR是通过IMGT规则确定的。

术语“Fc结构域”或“Fc区”在本文中用来定义免疫球蛋白重链的含有至少一部分恒定区的C端区域。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。天然的免疫球蛋白“Fc结构域”或“Fc区”包含两个或三个恒定结构域，即CH2结构域、CH3结构域和可选的CH4结构域。例如，在天然抗体中，免疫球蛋白Fc结构域包含源自IgG、IgA和IgD类抗体的重链的第二和第三恒定结构域(CH2结构域和CH3结构域)；或者包含源自IgM和IgE类抗体的两条重链的第二、第三和第四恒定结构域(CH2结构域、CH3结构域和CH4结构域)。除非本文中另外说明，否则Fc区或重链恒定区中的氨基酸残基编号根据EU编号体系（也称作EU索引）进行编号(Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interes, 第5版, Public Health Service,National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991)。在本文中，术语“Fc区”、“Fc部分”和“Fc片段”不包括免疫球蛋白的重链可变区VH和轻链可变区VL以及重链恒定区CH1和轻链恒定区CL，但在一些情况下可以包括在重链恒定区N端的铰链区。在一些实施方案中，人IgG重链Fc区具有自Cys226 或自Asn231延伸至重链羧基端的氨基酸序列。此外，Fc区的C端末端赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。在一些实施方案中，人IgG重链Fc区在N端带有天然免疫球蛋白的铰链序列或部分铰链序列，例如根据EU编号，E216到P230的序列或D221到P230的序列。

术语“嵌合抗体”是这样的抗体分子，其中(a)将恒定区或其部分进行改变、替换或交换，从而抗原结合位点与具有不同的或改变的类别、效应子功能和/或物种来源的恒定区连接、或与赋予嵌合抗体新性能的完全不同的分子(例如，酶、毒素、激素、生长因子、药物)等连接；或(b)将可变区或其部分用具有不同或改变的抗原特异性的可变区改变、替换或交换。例如，驼源重链抗体可以通过将其恒定区更换为来自人免疫球蛋白的恒定区进行修饰。由于更换为人类恒定区，该嵌合抗体可以保留其在识别抗原方面的特异性，同时与原始驼源抗体相比，具有在人类中降低的抗原性。

如本文所用，“人源化抗体”是一种保留非人类抗体(例如羊驼单克隆抗体)的抗原特异反应性，同时作为治疗药对人施用时免疫原性较低的抗体。这可以例如通过保留非人抗原结合位点并将抗体的剩余部分替换成它们的人类相应部分(即，将恒定区以及可变区中不参与结合的部分替换为人类抗体的相应部分)来实现。

如本文所用，术语“融合蛋白”与“嵌合多肽”可互换使用，是指由至少两个异源多肽序列，任选地通过接头，融合形成的更大多肽。融合蛋白可以通过重组表达产生。

如本文所用，术语“单特异性”指，具有一个或多个抗原结合位点的多肽/蛋白分子，所述位点中的每一个位点与相同抗原的相同表位结合。如本文所用，术语“多特异性”指，具有与不同表位(同一抗原上的不同表位或不同抗原上的不同表位)结合的至少两个抗原结合位点的多肽/蛋白分子。

接头可以是连接肽。在本文中，术语 “连接肽”是指由氨基酸组成的短氨基酸序列，例如单独或组合使用的甘氨酸(G)和/或丝氨酸(S)和/或苏氨酸残基(T)，或来自免疫球蛋白的铰链区。在一个实施方案中，连接肽具有5-50个氨基酸长度，例如，10,15,20,25,30个氨基酸长度。在一个实施方案中，连接肽包含氨基酸序列(G4S)n，其中n是等于或大于1的整数，例如，n是2,3,4,5,6或7的整数。在一个实施方案中，连接肽包含氨基酸序列TS(G4S)n,其中n是等于或大于1的整数，例如，n是2,3,4,5,6或7的整数。在一个实施方案中，连接肽包含氨基酸序列G(G4S)n,其中n是等于或大于1的整数，例如，n是2,3,4,5,6或7的整数。在再一实施方案中，连接肽为来自免疫球蛋白的铰链区，例如包含“CPPC”的铰链区氨基酸序列，例如，氨基酸序列“EPKSCDKTHTCPPCP（SEQ ID NO:38）”或“EPKSSDKTHTCPPCP(SEQ IDNO:39)”或“ESKYGPPCPPCP(SEQ ID NO:37)”。

如本文所用，术语“抗”、“结合”或“特异性结合”意指结合作用对抗原是选择性的并且可以与不想要的或非特异的相互作用区别。抗原结合位点与特定抗原结合的能力可以通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)或本领域已知的常规结合测定法如通过放射性免疫测定(RIA)或生物膜薄层干涉测定法或MSD测定法或表面等离子体共振法（SPR）测定。

“亲和力”或“结合亲和力”指反映结合对子的成员之间相互作用的固有结合亲和力。分子X对其配偶物Y的亲和力可以通常由解离常数(KD)代表，解离常数是解离速率常数和缔合速率常数(分别是kdis和kon)的比例。亲和力可以由本领域已知的常见方法测量。用于测量亲和力的一个具体方法是本文中的ForteBio动力学结合测定法。

氨基酸序列的“同一性百分数(%)”是指将候选序列与本说明书中所示的具体氨基酸序列进行比对并且如有必要的话为达到最大序列同一性百分数而引入空位后，并且不考虑任何保守置换作为序列同一性的一部分时，候选序列中与本说明书中所示的具体氨基酸序列的氨基酸残基相同的氨基酸残基百分数。在一些实施方案中，本发明考虑本发明抗体分子的变体，所述变体相对于在本文中具体公开的抗体分子及其序列而言具有相当程度的同一性，例如同一性为至少80%,85%,90%,95%, 97%, 98%或99%或更高。所述变体可以包含保守性改变。

对于多肽序列，“保守性改变”包括对多肽序列的置换、缺失或添加，但不实质性改变多肽序列的期望功能活性。例如，保守性置换常常导致某个氨基酸置换为化学上相似的氨基酸。提供功能上相似氨基酸的保守性置换表是本领域熟知的。以下列出了8组含有互为保守替换的氨基酸：1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)。在一些实施方案中，术语“保守序列改变”用于指不显著影响或改变含有氨基酸序列的本发明抗体分子或结合蛋白分子的目的抗原结合特征的氨基酸修饰。例如保守修改变体相对于亲本抗体或结合蛋白保持对目的抗原至少80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%或更高，例如100-110%或更高的结合亲和力。

术语“宿主细胞”指已经向其中引入外源多核苷酸的细胞，包括这类细胞的子代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，这包括原代转化的细胞和从其衍生的子代。宿主细胞是可以用来产生本发明抗体分子的任何类型的细胞系统，包括真核细胞，例如，哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞；和原核细胞，例如，大肠杆菌细胞。宿主细胞包括培养的细胞，也包括转基因动物、转基因植物或培养的植物组织或动物组织内部的细胞。

术语“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，其包含有效连接要表达的核苷酸序列的表达控制序列。表达载体包含足够的用于表达的顺式作用元件；用于表达的其它元件可以由宿主细胞提供或在体外表达系统中。表达载体包括本领域已知的所有那些，包括被掺入重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如，裸的或包含在脂质体中)和病毒(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)。

术语“个体”或“受试者”可互换地使用，是指哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯化动物(例如，奶牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类(例如，人和非人灵长类如猴)、兔和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。特别地，个体是人。

术语“治疗”包括给予组合物或抗体以预防或延迟疾病的症状、并发症、或生化指征的发作、缓解症状或阻止或抑制疾病、病状或病症的进一步发展。治疗可以是预防性的（以预防或延迟疾病的发作，或以防止其临床或亚临床症状的显现）或在疾病显现后对症状的治疗性抑制或缓解。术语“预防”包括对疾病或病症或特定疾病或病症的症状的发生或发展的抑制。

如本文所用，术语“补体C5相关疾病或病症”是指这样的疾病或病症，其中未调控的C5功能可能例如由于失调的C5激活，例如增加的C5激活而导致疾病或疾病表型。

术语“药用辅料”指与活性物质一起施用的稀释剂、佐剂(例如弗氏佐剂(完全和不完全的))、赋形剂、载体或稳定剂等。

术语“药物组合物”指这样的组合物，其以允许包含在其中的活性成分的生物学活性有效的形式存在，并且不包含对施用所述组合物的受试者具有不可接受的毒性的另外的成分。

术语“药物组合”、 “组合产品”、“药物联合”或“联合产品”是指非固定组合产品或固定组合产品，包括但不限于药盒、药物组合物。术语“非固定组合”意指活性成分（例如，(i)本发明的抗体分子、以及(ii)其他治疗剂；或两种或两种以上的本发明的抗体分子；或两种或两种以上的本发明的抗体分子以及其他治疗剂）以分开的实体被同时、无特定时间限制或以相同或不同的时间间隔、依次地施用于患者，其中这类施用在患者体内提供预防或治疗有效水平的两种或更多种活性剂。在一些实施方案中，药物组合中使用的本发明的抗体分子和其他治疗剂以不超过它们单独使用时的水平施用。术语“固定组合”意指两种或更多种活性剂以单个实体的形式被同时施用于患者。优选对两种或更多种活性剂的剂量和/或时间间隔进行选择，从而使各部分的联合使用能够在治疗疾病或病症时产生大于单独使用任何一种成分所能达到的效果。各成分可以各自呈单独的制剂形式，其制剂形式可以相同也可以不同。

术语“组合疗法”或“联合疗法”是指施用两种或更多种治疗剂或治疗方式以治疗本文所述疾病。这种施用包括以基本上同时的方式共同施用这些治疗剂，例如以具有固定比例的活性成分的单一胶囊。或者，这种施用包括对于各个活性成分在多种或在分开的容器(例如片剂、胶囊、粉末和液体)中的共同施用。粉末和/或液体可以在施用前重构或稀释至所需剂量。此外，这种施用还包括以大致相同的时间或在不同的时间以顺序的方式使用每种类型的治疗剂。在任一情况下，治疗方案将提供药物组合在治疗本文所述的病症或病状中的有益作用。

术语“有效量”指本发明的抗体或片段或组合物或组合的这样的量或剂量，其以单一或多次剂量施用患者后，在需要治疗或预防的患者中产生预期效果。

“治疗有效量”指以需要的剂量并持续需要的时间段，有效实现所需治疗结果的量。治疗有效量也是这样的一个量，其中抗体或抗体片段或组合物或组合的任何有毒或有害作用不及治疗有益作用。相对于未治疗的对象，“治疗有效量”优选地抑制可度量参数或改善可度量参数至少约40%、甚至更优选地至少约50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%甚至100%。

“预防有效量”指以需要的剂量并持续需要的时间段，有效实现所需预防结果的量。通常，由于预防性剂量在对象中在疾病较早阶段之前或在疾病较早阶段使用，故预防有效量将小于治疗有效量。

本文所使用的术语“标记”是指被直接或间接缀合或融合至试剂（诸如多核苷酸探针或抗体）并且促进其所缀合或融合的试剂的检测的化合物或组合物。标记本身可以是可检测的(例如，放射性同位素标记或荧光标记)或在酶促标记的情况下可以催化可检测的底物化合物或组合物的化学改变。术语旨在涵盖通过将可检测物质偶联(即，物理连接)至探针或抗体来直接标记探针或抗体以及通过与直接标记的另一种试剂反应来间接标记探针或抗体。在一些实施方案中，标记是His或生物素。

“受试者/患者/个体样品”指从患者或受试者得到的细胞或流体的集合。组织或细胞样品的来源可以是实体组织，像来自新鲜的、冷冻的和/或保存的器官或组织样品或活检样品或穿刺样品；血液或任何血液组分；体液，诸如泪液、玻璃体液、脑脊液、羊膜液(羊水)、腹膜液(腹水)、或间隙液；来自受试者的妊娠或发育任何时间的细胞。在一些实施方案中，样品是血液或血清。

II.单域抗体或VHH抗体

一方面，本发明涉及一种特异性结合人补体C5蛋白和/或特异性结合猴（例如食蟹猴）补体C5蛋白（优选地同时特异性结合人补体C5蛋白和猴（例如食蟹猴）补体C5蛋白）的单域抗体（single domain Antibody, sdAb），特别是VHH抗体。

单域抗体或VHH抗体具有人IgG分子大约十分之一的分子量，以及仅几纳米的物理直径。由于小的分子尺寸，单域抗体相比常规的四链抗体具有如下优势：高稳定性和溶解性，以及能够识别隐藏抗原性位点。此外，单域抗体在制备上也比常规的四链抗体更为便宜。除了作为单独分子应用外，单域抗体也是构建多特异性分子的适宜组件。

在一些实施方案中，本发明的单域抗体是包含重链可变区或由所述重链可变区组成的VHH抗体，所述重链可变区通常具有以下结构：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，其中FR1至FR4指构架区1至4；CDR1至CDR3指互补决定区1-3。VHH可变区中的CDR序列可以按照“定义”部分描述的任何CDR定义方案，例如，根据AbM、Chothia、Kabat、IMGT或其任意组合进行定义，优选可以通过IMGT来定义VHH序列中的三个CDR的边界。

在一些实施方案中，本发明的抗补体C5的VHH包含：

(i)SEQ ID NO:34、33和11-14中任一项所示的VH中所含的三个互补决定区域（CDR）CDR1、CDR2和CDR3，

或(ii)SEQ ID NO:32、31和7-10中任一项所述的核酸序列所编码的氨基酸序列中所含的三个互补决定区域（CDR）CDR1、CDR2和CDR3；

或(iii) 相对于(i)或(ii)的序列，在所述三个CDR区上共包含至少一个且不超过5、4、3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的序列；

优选地，CDR序列根据IMGT定义。

在一些实施方案中，本发明的抗补体C5的VHH抗体包含重链可变区或由其组成，所述重链可变区包含：

(i)SEQ ID NO:34、33和11-14中任一项所示的VH中所含的三个互补决定区域（CDR），

或(ii)SEQ ID NO:32、31和7-10中任一项所示的核酸序列所编码的氨基酸序列中所含的三个互补决定区域（CDR）CDR1、CDR2和CDR3；

或(ii)相对于(i)或(ii)的序列，在所述三个CDR区上共包含至少一个且不超过5、4、3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的序列，

优选地，CDR序列根据IMGT定义。

在一些实施方案中，本发明的抗补体C5的VHH抗体所含的CDR1包含选自SEQ IDNO:15-18中任一项所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成，或者CDR1包含与选自SEQID NO:15-18中任一项所示的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列或由所述序列组成。

在一些实施方案中，本发明的抗补体C5的VHH抗体所含的CDR2包含选自SEQ IDNO:19所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成，或者CDR2包含与选自SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列或由所述序列组成。

在一些实施方案中，本发明的抗补体C5的VHH抗体所含的CDR3包含选自SEQ IDNO:20或21所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成，或者CDR3包含与选自SEQ ID NO:20或21所示的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列或由所述序列组成。

在一些实施方案中，本发明的抗补体C5的VHH抗体包含CDR1、CDR2和CDR3，其中，

(i) CDR1包含选自SEQ ID NO:15-18中任一项所示的氨基酸序列，或者CDR1包含与选自SEQ ID NO:15-18中任一项所示的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；

(ii) CDR2包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列，或者CDR2包含与SEQ ID NO: 19所示的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；和

(iii) CDR3包含选自SEQ ID NO:20或21所示的氨基酸序列，或者CDR3包含与选自SEQ ID NO:20或21所示的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成。

在一些实施方案中，本发明的抗补体C5的VHH抗体包含CDR1、CDR2和CDR3，其中，

(i) CDR1包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列或由其组成， CDR2包含SEQ IDNO:19所示的氨基酸序列或由其组成， CDR3包含SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列或由其组成；

或(ii) CDR1包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列或由其组成， CDR2包含SEQIDNO:19所示的氨基酸序列或由其组成， CDR3包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列或由其组成；

或(iii) CDR1包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列或由其组成， CDR2包含SEQIDNO:19所示的氨基酸序列或由其组成， CDR3包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列或由其组成；

或(iv) CDR1包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列或由其组成， CDR2包含SEQIDNO:19所示的氨基酸序列或由其组成， CDR3包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列或由其组成。

在一些实施方案中，本发明的抗补体C5的VHH抗体：

(i)包含与选自SEQ ID NO:34、33和11-14中任一项所示的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列或由其组成；

(ii)包含选自SEQ ID NO:34、33和11-14中任一项所示的氨基酸序列或由其组成；

(iii)包含与选自SEQ ID NO:32、31和7-10中任一项所示的核酸序列所编码的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列或由其组成；

(iv)包含选自SEQ ID NO:32、31和7-10中任一项所示的核酸序列所编码的氨基酸序列或由其组成；

或者(v)包含与选自SEQ ID NO:34、33和11-14中任一项所示的氨基酸序列或与选自SEQ ID NO:32、31和7-10中任一项所示的核酸序列所编码的氨基酸序列相比具有1个或多个（优选不超过10个，更优选不超过5、4、3、2、1个）的氨基酸改变（优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换）的氨基酸序列，优选地，所述氨基酸改变不发生在CDR区中。

在一些实施方案中，本发明的抗补体C5的VHH抗体包含重链可变区或由其组成，所述重链可变区：

(i)包含与选自SEQ ID NO:34、33和11-14中任一项所示的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列或由其组成；

(ii)包含选自SEQ ID NO:34、33和11-14中任一项所示的氨基酸序列或由其组成；

(iii)包含与选自SEQ ID NO:32、31和7-10中任一项所示的核酸序列所编码的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列或由其组成；

(iv)包含选自SEQ ID NO:32、31和7-10中任一项所示的核酸序列所编码的氨基酸序列或由其组成；

或者(v)包含与选自SEQ ID NO:34、33和11-14中任一项所示的氨基酸序列或与选自SEQ ID NO:32、31和7-10中任一项所示的核酸序列所编码的氨基酸序列相比具有1个或多个（优选不超过10个，更优选不超过5、4、3、2、1个）的氨基酸改变（优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换）的氨基酸序列，优选地，所述氨基酸改变不发生在CDR区中。

优选地，本发明的抗补体C5的VHH抗体包含选自SEQ ID NO:34、33和11-14中任一项所述的氨基酸序列或选自SEQ ID NO:32、31和7-10中任一项所示的核酸序列所编码的氨基酸序列，或由所述序列组成。

在一些实施方案中，氨基酸改变包括氨基酸的置换、插入或缺失。优选的，本文所述的氨基酸改变为氨基酸置换，优选地保守置换。在优选的实施方案中，本发明所述的氨基酸改变发生在CDR外的区域（例如在FR中）。在一些实施方案中，置换为保守性置换。保守置换是指一个氨基酸经相同类别内的另一氨基酸置换，例如一个酸性氨基酸经另一酸性氨基酸置换，一个碱性氨基酸经另一碱性氨基酸置换，或一个中性氨基酸经另一中性氨基酸置换。

在一些实施方案中，本发明也提供本发明单域抗体或VHH抗体的功能性变体。所述功能性变体可以采用本发明熟知的方法，例如通过随机或定点诱变，将突变引入本发明的示例性单域抗体的编码核酸序列中，例如引入CDR序列和/或FR序列中，并随后筛选（例如通过噬菌体展示文库筛选）保持期望性质的变体，来获得功能性变体。典型地，功能性变体保持与亲本单域抗体(或VHH抗体)显著的序列的同一性。优选地，功能性变体保持亲本单域抗体(或VHH抗体)的期望生物学性质，例如，相对于亲本的生物活性，变体具有相当(例如，至少50%，60%，70%，80%，优选地90%以上)的生物活性，或改善的生物活性（例如110-150%或更高）的生物活性。所述的期望生物学性质包括例如，但不限于，目的抗原结合亲和力(如通过KD值量度), 阻断目的抗原与受体结合的活性(例如通过IC50值量度)、阻断人补体溶血活性(例如通过EC50值量度)等。

在一些实施方案中，本发明提供本发明单域抗体或VHH抗体的亲和力变体。优选地，所述亲和力变体表现出相对于其来源亲本单域抗体在氨基酸序列上的一个或多个氨基酸变化，其中亲和力变体相比亲本抗体具有改变的对目的抗原的结合亲和力。典型地，亲和力变体表现出优于亲本的改善的抗原结合亲和力。所述改善可以是，但不限于，较低的KD值，更快的解离速率，或增加(或降低)与目的抗原的非人物种同源蛋白的交叉反应性。亲和力变体相比亲本往往在CDR中具有一个或多个氨基酸残基取代。该取代可以是保守取代或非保守取代。在一个实施方案中，本发明的亲和力变体相对于亲本在CDR1-3中总共具有不超过10个，不超过6个，或1-5个，例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸取代。亲和力变体可以通过本领域已知的多种亲和力成熟方法获得，包括突变CDR，链改组，使用大肠杆菌增变株，DNA改组，噬菌体展示等。

在一些实施方案中，本发明的抗补体C5的VHH抗体包含源自通过免疫驼科动物(例如羊驼)产生的驼科重链抗体的CDR氨基酸序列和/或构架(FR)氨基酸序列。在一些实施方案中，源自驼科重链抗体的本发明VHH单抗可以进行工程化，例如，以包含源自人氨基酸序列(即，人抗体)或其他非驼科哺乳动物物种的构架区序列。因此，在一个实施方案中，本发明的VHH抗体是驼源抗体。

通常，人源化以保持单域抗体的有利结合性质的方式进行。本领域熟知用于确定人源化单域抗体的生物学性质，例如结合亲和力等的试验，以确定和选择适宜的人源化残基突变或突变组合。

在一个实施方案中，本发明的抗补体C5的VHH抗体是人源化抗体。例如，使用“最佳匹配法”将原始VHH序列进行人源化，其包括：

(i)利用人种系V基因数据库对VHH框架区的氨基酸序列进行比对分析，选出最佳种系序列，例如人germline IGHV3-23*01序列；

(ii)用VHH CDR序列代替最佳匹配的人类CDR序列，并可选地通过回复突变框架区的多个残基，任选地还进行翻译后修饰(Post-translational modification, PTM)去除，生成人源化VHH序列；

(iii)任选地测序VHH抗体。

III.重链抗体

在本发明的另一方面中，本发明提供了包含本发明的VHH抗体重链可变区的重链抗体。

在一些实施方案中，可以将本发明的单域抗体或VHH (例如驼源VHH或其人源化形式)，与人抗体的恒定区例如Fc区连接，以产生包含VHH-Fc的重链抗体。在一个实施方案中，所述重链抗体为包含本发明单域抗体和位于其C端的Fc区。在一些实施方案中，通过铰链区，例如IgG的铰链区（例如IgG1、2、3或4的铰链区）连接VHH与Fc。

在一些实施方案中，本发明的抗C5蛋白重链抗体包含如本文定义的VHH或其中的重链可变区，以及重链恒定区或重链恒定区的Fc区。在一些实施方案中，在VHH或重链可变区与重链恒定区或Fc区之间包含连接肽，例如抗体铰链区，例如IgG铰链区。在一些实施方案中，在VHH或重链可变区与重链恒定区或Fc区之间包含铰链区。在一些实施方案中，所述铰链区是源自人IgG1、2、3或4的铰链区。在一些实施方案中，所述铰链区是人IgG1的铰链区。在一些实施方案中，所述铰链区是天然人IgG1的铰链区，或其变体，例如其C220S的变体。在一些实施方案中，所述铰链区包含SEQ ID NO:38或SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成。

在一个实施方案中，所述重链抗体包含来自驼科动物（例如羊驼）的Fc部分。在一个实施方案中，通过免疫所述驼科动物例如羊驼产生并分离所述的重链抗体。本领域已知多种方式可用于免疫驼科动物和分离产生的针对目的抗原的VHH抗体或重链抗体。

在一些实施方案中，所述重链抗体包含来自人或非人灵长类动物（例如食蟹猴）抗体的恒定区，例如来自人IgG1 、人IgG2、人IgG3或人IgG4的恒定区。

在一些实施方案中，所述重链抗体包含来自人或非人灵长类动物（例如食蟹猴）的Fc部分。在再一实施方案中，所述重链抗体包含人IgG Fc区，例如人IgG1 、人IgG2、人IgG3或人IgG4 Fc区，优选地人IgG1Fc区。在一些实施方案中，当所述Fc区通过铰链区与VHH抗体连接时，所述Fc区本身不含铰链区。在一些实施方案中，与VHH抗体经由铰链区连接的Fc区来自IgG1，其包含与SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列或由其组成。

在一个实施方案中，根据本发明的重链抗体可以通过Fc区，与包含Fc区的另一多肽链（例如相同或不同的另一重链抗体）二聚化。因此，在一个实施方案中，本发明也提供了包含本发明重链抗体的同源或异源多聚体蛋白质。在一个优选的实施方案中，优选所述蛋白包括两条相同重链抗体链配对形成的重链抗体。

在一些实施方案中，所述重链抗体：

(i)包含与选自SEQ ID NO:36、35和27-30中任一项所示的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列或由其组成;或者

(ii)包含选自SEQ ID NO: 36、35和27-30中任一项所示的氨基酸序列或由其组成；或者

(iii)包含与选自SEQ ID NO: 36、35和27-30中任一项所示的氨基酸序列相比具有1个或多个（优选不超过10个，更优选不超过5、4、3、2、1个）的氨基酸改变（优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换）的氨基酸序列，优选地，所述氨基酸改变不发生在CDR区中。

除了上述单域抗体（特别是VHH抗体）及重链抗体，本发明也提供包含至少一个根据本发明的单域抗体或VHH或重链抗体的其他融合蛋白/嵌合多肽，例如双特异性或多特异性抗体。

在一些实施方案中，本发明的融合蛋白/嵌合多肽包含单个根据本发明的单域抗体或VHH或重链抗体。在另一实施方案中，本发明的融合蛋白/嵌合多肽包含多个根据本发明的单域抗体或VHH或重链抗体。根据本发明的融合蛋白可以是单特异性的；或可以是多特异性的。在一些实施方案中，本发明的融合蛋白/嵌合多肽仅包含针对补体C5的特异性。在再一实施方案中，本发明的融合蛋白/嵌合多肽，除了包含针对补体C5的本发明单域抗体或VHH或重链抗体（一个或多个），还包含针对另一抗原的特异性。

在一个方面中，本发明还提供了包含本发明的单域抗体或VHH抗体或重链抗体的免疫缀合物，其中本发明的单域抗体或VHH抗体或重链抗体与其他活性剂（例如抗溶血药物）或标记缀合形成免疫缀合物。

IV.本发明的VHH抗体和/或重链抗体的性质

本发明的特异性结合人或猴补体C5的单域抗体（特别是VHH抗体）或包含所述单域抗体的重链抗体具有选自如下的一个或多个生物学活性：

（i）以高亲和力结合人补体C5，和/或猴例如食蟹猴补体C5;

（ii）表现出对人和猴例如食蟹猴补体C5的交叉反应性；

（ii）抑制补体免疫经典途径中的溶血，例如抑制补体免疫经典途径中人血清和/或猴例如食蟹猴血清中的溶血，例如活性强于已知的抗C5抗体例如依库珠单抗；

（iii）抑制补体免疫旁路途径中的溶血，例如抑制补体免疫旁路途径中人血清和/或猴例如食蟹猴血清中的溶血，例如活性强于已知的抗C5抗体例如依库珠单抗；

（iv）阻断人补体溶血活性或阻断猴例如食蟹猴补体溶血活性，例如活性强于已知的抗C5抗体例如依库珠单抗；

（v）具有更高的耐热稳定性，例如能够耐受70℃、75℃、76℃、77℃、78℃或79℃下热处理（例如热处理1小时）；优选地，能够耐受80℃、81℃、82℃、83℃、或84℃热处理（例如热处理1小时）。

V.多核苷酸、载体和宿主

本发明提供编码以上任何本发明分子（单域抗体或重链抗体）的核酸。还提供包含所述核酸的载体。在一个实施方案中，载体是表达载体（例如pCDNA载体，例如pCDNA3.1）。还提供包含所述核酸或所述载体的宿主细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是真核的。在另一个实施方案中，宿主细胞选自酵母细胞、哺乳动物细胞(例如CHO细胞或293细胞，例如293FT细胞)。在另一个实施方案中，宿主细胞是原核的。

在一方面，本发明提供编码以上任何抗C5蛋白的单域抗体或VHH或重链抗体的核酸。当从适宜的表达载体表达时，由所述核酸编码的多肽能够显示针对人或猴（例如食蟹猴）C5蛋白的抗原结合能力。在一些实施方案中，所述核酸在读框中与编码另一肽/多肽的核酸可操作连接，从而当从适宜的表达载体表达时，产生包含所述单域抗体或VHH与另一肽/多肽的融合蛋白或嵌合多肽。例如，在一些实施方案中，所述核酸在读框中与编码Fc区（例如人Fc区）的核酸可操作连接，从而当从适宜的表达载体表达时，产生包含所述单域抗体或VHH与Fc区的重链抗体。

为了便于生产和纯化，单域抗体或VHH结构域或重链抗体可以在N端融合分泌性信号肽，和/或利于纯化的标签肽，如六组氨酸标签或生物素标记。在一些实施方案中，所述信号肽包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列或由其组成。

如本领域技术人员明了的，因为密码子简并性，每一个抗体或多肽氨基酸序列可以由多种核酸序列编码。

在一些实施方案中，本发明的核酸包含编码选自SEQ ID NO:33-36、27-30和11-14中任一项所示氨基酸序列的核酸，或编码与选自SEQ ID NO: SEQ ID NO:33-36、27-30和11-14中任一项所示的氨基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性的氨基酸序列的核酸。在一些实施方案中，本发明的核酸包含选自SEQ IDNO:32、31和7-10中任一项所示的核酸核酸序列，或包含与选自SEQ ID NO: 32、31和7-10中任一项所示的核酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性的核酸序列。

编码本发明分子的核酸序列可以采用本领域熟知的方法，例如通过从头固相DNA合成，或通过PCR扩增而产生。

在一个实施方案中，提供包含本发明核酸的一个或多个载体。在一个实施方案中，载体是表达载体，例如原核表达载体或真核表达载体。载体包括但不限于病毒、质粒、粘粒、λ噬菌体或酵母人工染色体(YAC)。在优选的实施方案，表达载体是pCDNA，例如pCDNA3.1。

在一个实施方案中，提供了包含一种或多种本发明多核苷酸的宿主细胞。在一些实施方案中，提供了包含本发明表达载体的宿主细胞。如本文所用，术语“宿主细胞”指可以工程化以产生本发明的抗体分子的任何种类的细胞系统。适于复制和支持本发明的抗体分子表达的宿主细胞是本领域熟知的。根据需要，这类细胞可以用特定表达载体转染或转导，并且可以培育大量含有载体的细胞用于接种大规模发酵器以获得足够量的本发明分子用于临床应用。合适的宿主细胞包括原核微生物，如大肠杆菌，真核微生物如丝状真菌或酵母，或各种真核细胞，如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、昆虫细胞等。可以使用适于悬浮培养的哺乳动物细胞系。有用的哺乳动物宿主细胞系的例子包括SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(HEK 293或293F细胞或293FT细胞)、幼仓鼠肾细胞(BHK)、猴肾细胞(CV1)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76)、人宫颈癌细胞(HELA)、犬肾细胞(MDCK)、布法罗大鼠肝脏细胞(BRL 3A)、人肺细胞(W138)、人肝脏细胞(Hep G2)、CHO细胞、NSO细胞、骨髓瘤细胞系如YO、NS0、P3X63和Sp2/0等。本领域已知适合产生抗体的哺乳动物宿主细胞系。在一个优选的实施方案中，所述宿主细胞是CHO或HEK293细胞或293FT细胞。

VI.本发明分子的生产和纯化

再一方面，本发明提供用于生产本发明分子(单域抗体、VHH抗体或重链抗体)的方法，所述方法包括：在适于表达所述分子的多肽链的条件下培养包含编码所述多肽链的宿主细胞；任选地还包括在适于所述多肽链装配为所述分子的条件下使多肽链装配产生所述分子。

为了重组生产，可以将编码本发明分子的多肽链的多核苷酸插入一个或多个载体中以便进一步在宿主细胞中克隆和/或表达。可以使用本领域技术人员熟知的方法来构建表达载体。表达载体包括但不限于病毒、质粒、粘粒、λ噬菌体或酵母人工染色体(YAC)。一旦已经制备了用于表达的包含本发明的一种或多种多核苷酸的表达载体，则可以将表达载体转染或引入适宜的宿主细胞中。多种技术可以用来实现这个目的，例如，原生质体融合、磷酸钙沉淀、电穿孔、逆转录病毒的转导、病毒转染、基因枪、基于脂质体的转染或其他常规技术。

如本文所述制备的抗体分子可以通过已知的现有技术如高效液相色谱、离子交换层析、凝胶电泳、亲和层析（例如Protein A亲和层析）、大小排阻层析等纯化。用来纯化特定蛋白质的实际条件还取决于如净电荷、疏水性、亲水性等因素，并且这些对本领域技术人员是显而易见的。

可以通过多种熟知分析方法中的任一种方法确定本发明的抗体分子的纯度，所述熟知分析方法包括大小排阻层析、凝胶电泳、高效液相色谱等。可以通过本领域已知的多种测定法，鉴定、筛选或表征本文提供的抗体分子的物理/化学特性和/或生物学活性。

VII.测定法

可以通过本领域中已知的多种测定法对本文中提供的分子（单域抗体、VHH抗体或重链抗体）进行鉴定，筛选，或表征其物理/化学特性和/或生物学活性。

对于本发明分子与人补体C5蛋白和/或猴（例如食蟹猴）补体C5蛋白的结合，可以通过本领域已知的方法，诸如ELISA，Western印迹等，或本文实施例公开的例示性方法来测定。例如，可以使用人或猴补体C5蛋白，在生物光干涉测定法中测定分子的结合动力学(例如K_D值)。在一些实施方案中，使用生物光干涉测定法（例如Fortebio Octet系统亲和测量），例如实施例3所示的方法，测定分子与人或猴补体C5蛋白的结合平衡解离常数。

对于本发明分子的抑制溶血的作用，可以通过本领域已知的方法，诸如体外试验和/或体内动物实验来测量。例如，可以使用溶血实验，例如实施例4所示的方法，并检测分子对补体免疫经典途径和/或补体免疫旁路途径的溶血抑制作用。

VIII.药物组合物、药物联合和试剂盒

在一个方面，本发明提供了组合物，例如，药物组合物，所述组合物包含一种或多种（例如两种或三种）本发明分子（例如单域抗体、VHH抗体或重链抗体，或免疫缀合物等）。在一些实施方案中，所述药物组合物是药物制剂。

在一个实施方案中，本发明的组合物包含两种或三种本发明分子，例如两种或三种本发明的抗补体C5的单域抗体、VHH抗体、重链抗体或免疫缀合物。

在一个实施方案中，所述组合物还包含药用辅料，如本领域中已知的药用载体、药用赋形剂，包括缓冲剂。

如本文所用，“药用载体”包括生理上相容的任何和全部溶剂、分散介质、等渗剂和吸收延迟剂等。对于药用辅料的使用及其用途，亦参见文献(“Handbook ofPharmaceutical Excipients”,第八版,R.C.Rowe,P.J.Seskey和S.C. Owen,Pharmaceutical Press, London, Chicago)。

本发明的组合物或药物或制剂还可以除了本发明的一种或多种分子外，包含其它的治疗剂，所述其它的治疗剂是被治疗的特定适应证所需的，优选不会彼此不利的影响活性。因此，在一个实施方案中，组合物或制剂或药物，例如，药物组合物，包含一种或多种本发明分子，以及任选地一种或多种其它治疗剂的组合。

本发明的组合物或药物或制剂可以处于多种形式。这些形式例如包括液体、半固体和固体剂型，如液态溶液剂(例如，注射液)、散剂或混悬剂、脂质体剂和栓剂。本发明的组合物或药物或制剂适于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、直肠、脊髓或表皮施用(例如，通过注射或输注)。优选的形式取决于预期的施用模式和治疗用途。

本发明还提供了药物组合或药物组合产品，其包含：

(1)本发明的分子例如单域抗体或VHH或重链抗体或免疫缀合物和一种或多种其他治疗剂；

(2)本发明的两种或两种以上的分子例如单域抗体或VHH或重链抗体或免疫缀合物；

(3)本发明的两种或两种以上的分子例如单域抗体或VHH或重链抗体或免疫缀合物和一种或多种其他治疗剂。

在一些实施方案中，本发明还提供了包含所述药物组合的成套药盒，例如所述成套药盒在同一包装内包含含有包含两种或多种本发明的分子，例如单域抗体或VHH或重链抗体，的药物组合物的一种或多种容器。在一些实施方案中，两种或多种本发明的分子处于相同的容器中，或分别处于不同的容器中。

在一些实施方案中，本发明还提供了包含所述药物组合的成套药盒，例如所述成套药盒在同一包装内包含：

(i) 含有包含一种或多种本发明的分子，例如单域抗体或VHH或重链抗体，的药物组合物的第一容器（在一些实施方案中，两种或多种本发明的分子处于相同的容器中，或分别处于不同的容器中）;

(ii) 含有包含一种或多种其它治疗剂的药物组合物的第二容器（在一些实施方案中，两种或多种其它治疗剂处于相同的容器中，或分别处于不同的容器中）。

IX.用途和方法

本发明一方面提供了在受试者中预防或治疗补体C5相关疾病或病症或用于阻断或抑制补体溶血的方法，包括向受试者施用有效量的本发明的分子（例如单域抗体、VHH抗体或重链抗体，或免疫缀合物等），或包含其的组合物或药物或制剂或包含其的药物组合。

在其他方面，本发明提供本发明的分子或包含其的组合物或药物组合在生产或制备药物中的用途，所述药物用于本文所述的用途，例如用于预防或治疗本文提及的补体C5相关疾病或病症或用于阻断或抑制补体溶血。

在其他方面，本发明提供了本发明的分子或包含其的组合物或药物组合，用于疗法，例如本文所述的用途，例如用于预防或治疗本文提及的补体C5相关疾病或病症或用于阻断或抑制补体溶血。

在一些实施方案中，所述受试者中具有（例如升高水平的，例如核酸或蛋白质水平的）补体C5蛋白。

在一些实施方案中，所述疾病治疗将受益于抑制核酸或蛋白质水平的补体C5蛋白。

在一些实施方案中，所述补体C5相关疾病或病症可以是需要溶血抑制的疾病，例如需要抑制补体免疫经典途径和/或补体免疫旁路途径的溶血的疾病。

在一些实施方案中，本发明的分子或包含其的组合物或药物或制剂会延迟病症和/或与病症相关的症状的发作。

在一些实施方案中，所述补体溶血是补体经典途径溶血和/或补体旁路途径溶血。

在一些实施方案中，本发明的分子或包含其的组合物或药物或制剂或药物组合（例如包含两种或两种以上的本发明分子的药物组合）还能与一种或多种其它疗法例如治疗方式和/或其它治疗剂组合施用，用于本文所述的用途，例如用于预防和/或治疗本文提及的相关疾病或病症或用于阻断或抑制补体溶血。

本发明的分子或包含其的组合物或药物或制剂的施用途径是根据已知方法，例如，注射或输注。

X.诊断和检测

在某些实施方案中，本文中提供的分子（例如抗补体C5蛋白的单域抗体、VHH抗体、重链抗体或免疫缀合物等）可以用于检测补体C5在生物样品中的存在。

术语“检测”用于本文中时，包括定量或定性检测，示例性的检测方法可以涉及免疫组织化学、免疫细胞化学、流式细胞术(例如，FACS)、抗体分子复合的磁珠、ELISA测定法、PCR-技术(例如，RT-PCR)。在某些实施方案中，生物样品是体液。

在某些实施方案中，所述方法包括将生物样品与如本文所述的分子在允许其与补体C5结合的条件下接触，并检测在该分子和补体C5之间是否形成复合物。复合物的形成表示存在补体C5。该方法可以是体外或体内方法。在一个实施方案中，本发明的分子用于选择适合利用针对补体C5的抑制剂（例如针对补体C5的抗体，例如本发明的分子）治疗的受试者，例如其中补体C5是用于选择所述受试者的生物标记物。

在某些实施方案中，提供标记的本发明的分子（例如本发明的抗补体C5蛋白的单域抗体、VHH抗体、重链抗体或免疫缀合物等）。标记包括但不限于，被直接检测的标记或部分(如荧光标记、发色团标记、电子致密标记、化学发光标记和放射性标记)，以及被间接检测的部分，如酶或配体，例如，通过酶促反应或分子相互作用。

在一些实施方案中，所述标记例如生物素或His标签等标记物。

在本文中提供的一些实施方案中，样品是在用本发明的分子或包含其的组合物、药物或制剂治疗之前获得的。在一些实施方案中，样品是在用其他疗法之前获得的。在一些实施方案中，样品是在用其他疗法治疗过程中，或者用其他疗法治疗后获得的。

在一些实施方案中，在治疗之前，例如，在起始治疗之前或在治疗间隔后的某次治疗之前检测补体C5。

在一些实施方案中，提供了一种治疗本发明疾病的方法，所述方法包括：对受试者(例如，样品)(例如，受试者样品)检验补体C5的存在，因而确定补体C5值，将补体C5值与对照值（例如正常个体中的值）比较，并且如果补体C5值大于对照值，则向受试者施用治疗有效量的任选与一种或多种其他疗法组合的本发明的分子或包含其的组合物、药物或制剂，因而治疗所述疾病。

本发明的这些以及其它方面和实施方案在附图(附图简述紧随其后)和发明详述中得到描述并且示例于实施例中。整个本申请中所论述的任何或所有特征可以在本发明的各种实施方案中组合。以下实施例进一步说明本发明，然而，应理解实施例以说明而非限定的方式来描述，并且本领域技术人员可以进行多种修改。

实施例

实施例 1：抗原制备及羊驼免疫

实施例1.1 重组人补体C5蛋白的表达和纯化（以下简称hC5）

人全长补体C5蛋白包括α链和β链 (UniProt#P01031)，相对分子质量约188.3KDa，将编码hC5的DNA分子（金斯瑞生物，NM_001735.2）重组克隆到哺乳动物表达载体（pCDNA3.1）上，并在C端加上Avi-tag（GLNDIFEAQKIEWHE）和10xHistag（HHHHHHHHHH），使用PEI（Polysciences，货号：24765-1）转染试剂，转染悬浮293细胞（Expi293, Thermofisher）进行表达。在细胞摇床中，220rpm，37℃，8% CO2，培养7天后收获细胞培养上清，使用镍柱（His TrapTM excel货号：17-3712-05，GEHealthcare）纯化hC5蛋白，获得纯度大于85%的蛋白溶于PBS中。

人补体C5氨基酸序列：

QEQTYVISAPKIFRVGASENIVIQVYGYTEAFDATISIKSYPDKKFSYSSGHVHLSSENKFQNSAILTIQPKQLPGGQNPVSYVYLEVVSKHFSKSKRMPITYDNGFLFIHTDKPVYTPDQSVKVRVYSLNDDLKPAKRETVLTFIDPEGSEVDMVEEIDHIGIISFPDFKIPSNPRYGMWTIKAKYKEDFSTTGTAYFEVKEYVLPHFSVSIEPEYNFIGYKNFKNFEITIKARYFYNKVVTEADVYITFGIREDLKDDQKEMMQTAMQNTMLINGIAQVTFDSETAVKELSYYSLEDLNNKYLYIAVTVIESTGGFSEEAEIPGIKYVLSPYKLNLVATPLFLKPGIPYPIKVQVKDSLDQLVGGVPVTLNAQTIDVNQETSDLDPSKSVTRVDDGVASFVLNLPSGVTVLEFNVKTDAPDLPEENQAREGYRAIAYSSLSQSYLYIDWTDNHKALLVGEHLNIIVTPKSPYIDKITHYNYLILSKGKIIHFGTREKFSDASYQSINIPVTQNMVPSSRLLVYYIVTGEQTAELVSDSVWLNIEEKCGNQLQVHLSPDADAYSPGQTVSLNMATGMDSWVALAAVDSAVYGVQRGAKKPLERVFQFLEKSDLGCGAGGGLNNANVFHLAGLTFLTNANADDSQENDEPCKEILRPRRTLQKKIEEIAAKYKHSVVKKCCYDGACVNNDETCEQRAARISLGPRCIKAFTECCVVASQLRANISHKDMQLGRLHMKTLLPVSKPEIRSYFPESWLWEVHLVPRRKQLQFALPDSLTTWEIQGVGISNTGICVADTVKAKVFKDVFLEMNIPYSVVRGEQIQLKGTVYNYRTSGMQFCVKMSAVEGICTSESPVIDHQGTKSSKCVRQKVEGSSSHLVTFTVLPLEIGLHNINFSLETWFGKEILVKTLRVVPEGVKRESYSGVTLDPRGIYGTISRRKEFPYRIPLDLVPKTEIKRILSVKGLLVGEILSAVLSQEGINILTHLPKGSAEAELMSVVPVFYVFHYLETGNHWNIFHSDPLIEKQKLKKKLKEGMLSIMSYRNADYSYSVWKGGSASTWLTAFALRVLGQVNKYVEQNQNSICNSLLWLVENYQLDNGSFKENSQYQPIKLQGTLPVEARENSLYLTAFTVIGIRKAFDICPLVKIDTALIKADNFLLENTLPAQSTFTLAISAYALSLGDKTHPQFRSIVSALKREALVKGNPPIYRFWKDNLQHKDSSVPNTGTARMVETTAYALLTSLNLKDINYVNPVIKWLSEEQRYGGGFYSTQDTINAIEGLTEYSLLVKQLRLSMDIDVSYKHKGALHNYKMTDKNFLGRPVEVLLNDDLIVSTGFGSGLATVHVTTVVHKTSTSEEVCSFYLKIDTQDIEASHYRGYGNSDYKRIVACASYKPSREESSSGSSHAVMDISLPTGISANEEDLKALVEGVDQLFTDYQIKDGHVILQLNSIPSSDFLCVRFRIFELFEVGFLSPATFTVYEYHRPDKQCTMFYSTSNIKIQKVCEGAACKCVEADCGQMQEELDLTISAETRKQTACKPEIAYAYKVSITSITVENVFVKYKATLLDIYKTGEAVAEKDSEITFIKKVTCTNAELVKGRQYLIMGKEALQIKYNFSFRYIYPLDSLTWIEYWPRDTTCSSCQAFLANLDEFAEDIFLNGC（SEQ IDNO:1）。

实施例1.2 羊驼免疫

取1）中制备的hC5蛋白与弗氏佐剂乳化混合后，500μg/次皮下注射免疫羊驼（上海伯进生物），免疫间隔为每10天免疫一次，共免疫4次，第4次免疫后使用不含佐剂的蛋白500μg/次皮下注射进行冲击免疫，在第二次、第三次免疫结束后采集血清，离心后，取上清，用ELISA方法测血清中抗hC5的抗体效价(Titer)。

实施例1.3 ELISA法测定羊驼血清抗hC5抗体效价

包被100μL 1μg/mL的1.1中制备的hC5于酶标板上(货号：42592, Costar)，4℃过夜。第二天PBST洗板后，用含2.5%脱脂牛奶的PBS（以下简称PBSM）封闭1小时；取10uL驼血清，使用PBSM分别稀释103、104、105、106、107、108、109倍，获得不同稀释倍数的血清稀释液。取各浓度血清稀释液100uL每孔加入到封闭好的酶标板中，37℃，孵育1小时；用含0.1%Tween 20的PBS（PBST）洗每孔3遍；洗涤完毕后，每孔加入100μL HRP标记的抗羊驼抗体（Goat PAb to Llama IgG (HRP), abcam货号：ab112786，1：10000稀释），室温孵育30分钟；再次用PBST洗涤3遍，加入TMB底物（thermofisher,002023）显色5-10分钟，加入终止液（上海生工，E661006-0200）终止反应后OD450nm读板，检测结果如图1所示。

检测结果显示，经过免疫的羊驼血清中产生了大量抗hC5的抗体，未经免疫的对照羊驼血清则未检测到结合信号，并且经过第三次免疫后血清中针对hC5的抗体滴度较第二次免疫有了明显提升，进行100万倍稀释后仍能明显检测到，说明羊驼免疫成功，可以进行后续实验。

实施例 2：抗hC5 VHH抗体噬菌体文库构建及筛选

实施例2.1 羊驼PBMC分离和VHH菌单克隆库的制备

采集第4次免疫后的羊驼外周血，使用淋巴细胞分离管（达科为，货号: 7922021）分离得到羊驼外周单核淋巴细胞（PBMC），将PBMC裂解提取Total RNA (RNeasy plus Minikit,货号：74134 ,Qiagen)，再将Total RNA反转录成cDNA (SuperscriptTMIV First-strand synthwsissystem,货号：18091050 ,Invirogen)，以cDNA为模板，通过两轮聚合酶链式反应（PCR）将羊驼B 细胞中的重链抗体可变区扩增出来，两轮PCR所用引物分别为:

第一轮PCR正向引物：GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG（SEQ ID NO:2）；

第一轮PCR反向引物：GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC (SEQ ID NO:3)；

第二轮PCR正向引物：CTAGTGCGGCCGCTGAGGAGACGGTGACCTGGGT (SEQ ID NO:4)；

第二轮PCR反向引物：GATGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGRGGAGG (SEQ ID NO:5)。

扩增产物经胶回收纯化后连接到噬菌体展示载体pComb3XTT（淼灵生物，P0831）上，通过电转化将插入了VHH的噬菌体展示载体转入TG1细胞（Lucigen）中，构建成VHH菌克隆库。

将VHH菌克隆库接种到含氨苄抗生素和2%葡萄糖的2xYT培养基（上海生工）中37℃恒温摇床上培养，待菌浓度OD600达到0.4-0.8，加入M13K07（货号N0315S,NEB）辅助噬菌体，37℃静置孵育30分钟，离心收集菌体，将菌体用含卡那抗生素和1mM IPTG（上海生工）的2xYT培养基重悬菌体，30℃ 250rpm过夜培养。过夜培养物在4℃下，9000g离心15分钟，收集上清，过0.22μm滤膜（Millipore）除菌后加入1/5体积的PEG-NaCl沉淀噬菌体颗粒，冰上孵育1小时，将获得的噬菌体悬液在4℃下，9000g离心15分钟，尽量弃干净上清，用PBS缓冲液重悬噬菌体颗粒，并转移到新的灭菌tube 管中，得到的噬菌体展示文库可置于4℃短期存放或加入终浓度20%甘油，冻存于-80℃冰箱长期保存。

实施例2. 2 噬菌体展示筛选VHH结构的抗hC5抗体

用生物素标记的人补体C5蛋白（实施例1中制备的hC5蛋白）和生物素标记的食蟹猴补体C5蛋白（Cynomolgus Complement C5 Protein, His Tag，货号：C05-C52HX，ACRO），来筛选同时能够结合hC5和cynoC5的VHH抗体，生物素标记方法见试剂盒说明书，EZ-Link™Sulfo-NHS-LC-Biotinylation Kit，Thermofisher, 21435，生物素与蛋白标记比例为10:1。

食蟹猴补体C5氨基酸序列：

QEQTYVISAPKIFRVGASENIVIQVYGYTEAFDATISIKSYPDKKFSYSSGHVHLSSENKFQNSAVLTIQPKQLPGGQNQVSYVYLEVVSKHFSKSKKIPITYDNGFLFIHTDKPVYTPDQSVKVRVYSLNDDLKPAKRETVLTFIDPEGSEIDMVEEIDHIGIISFPDFKIPSNPRYGMWTIQAKYKEDFSTTGTAFFEVKEYVLPHFSVSVEPESNFIGYKNFKNFEITIKARYFYNKVVTEADVYITFGIREDLKDDQKEMMQTAMQNTMLINGIAEVTFDSETAVKELSYYSLEDLNNKYLYIAVTVIESTGGFSEEAEIPGIKYVLSPYKLNLVATPLFLKPGIPYSIKVQVKDALDQLVGGVPVTLNAQTIDVNQETSDLEPRKSVTRVDDGVASFVVNLPSGVTVLEFNVKTDAPDLPDENQAREGYRAIAYSSLSQSYLYIDWTDNHKALLVGEYLNIIVTPKSPYIDKITHYNYLILSKGKIIHFGTREKLSDASYQSINIPVTQNMVPSSRLLVYYIVTGEQTAELVSDSVWLNIEEKCGNQLQVHLSPDADTYSPGQTVSLNMVTGMDSWVALTAVDSAVYGVQRRAKKPLERVFQFLEKSDLGCGAGGGLNNANVFHLAGLTFLTNANADDSQENDEPCKEIIRPRRMLQEKIEEIAAKYKHLVVKKCCYDGVRINHDETCEQRAARISVGPRCVKAFTECCVVASQLRANNSHKDLQLGRLHMKTLLPVSKPEIRSYFPESWLWEVHLVPRRKQLQFALPDSVTTWEIQGVGISNSGICVADTIKAKVFKDVFLEMNIPYSVVRGEQVQLKGTVYNYRTSGMQFCVKMSAVEGICTSESPVIDHQGTKSSKCVRQKVEGSSNHLVTFTVLPLEIGLQNINFSLETSFGKEILVKSLRVVPEGVKRESYSGITLDPRGIYGTISRRKEFPYRIPLDLVPKTEIKRILSVKGLLVGEILSAVLSREGINILTHLPKGSAEAELMSVVPVFYVFHYLETGNHWNIFHSDPLIEKRNLEKKLKEGMVSIMSYRNADYSYSVWKGGSASTWLTAFALRVLGQVHKYVEQNQNSICNSLLWLVENYQLDNGSFKENSQYQPIKLQGTLPVEARENSLYLTAFTVIGIRKAFDICPLVKINTALIKADTFLLENTLPAQSTFTLAISAYALSLGDKTHPQFRSIVSALKREALVKGNPPIYRFWKDSLQHKDSSVPNTGTARMVETTAYALLTSLNLKDINYVNPIIKWLSEEQRYGGGFYSTQDTINAIEGLTEYSLLVKQLRLNMDIDVAYKHKGPLHNYKMTDKNFLGRPVEVLLNDDLVVSTGFGSGLATVHVTTVVHKTSTSEEVCSFYLKIDTQDIEASHYRGYGNSDYKRIVACASYKPSKEESSSGSSHAVMDISLPTGINANEEDLKALVEGVDQLFTDYQIKDGHVILQLNSIPSSDFLCVRFRIFELFEVGFLSPATFTVYEYHRPDKQCTMFYSTSNIKIQKVCEGATCKCIEADCGQMQKELDLTISAETRKQTACNPEIAYAYKVIITSITTENVFVKYKATLLDIYKTGEAVAEKDSEITFIKKVTCTNAELVKGRQYLIMGKEALQIKYNFTFRYIYPLDSLTWIEYWPRDTTCSSCQAFLANLDEFAEDIFLNGC（SEQ IDNO:6）

第一轮筛选用50nM 生物素标记的食蟹猴补体C5蛋白（下文称为“cynoC5”或“生物素标记的cynoC5”）与2.1中制备的噬菌体展示文库在含2.5%牛奶的PBS中室温共孵育2小时，然后加入M-270磁珠（货号：65305, Invitrogen）捕获生物素标记的cynoC5和能与cynoC5结合的噬菌体展示VHH抗体，室温共孵育30分钟。用磁力架吸附M-270磁珠，用PBST洗涤10遍，再用PBS洗涤10遍，使用0.25mg/mL Trypsin溶液（Trypsin，货号25200-072，Gibco）室温震荡孵育30分钟洗脱噬菌体。随后以20:1的比例加入4mg/mL的AEBSF溶液（AEBSF 蛋白酶抑制剂,货号：78431，Sigma）终止酶活性。

洗脱下的噬菌体文库为第一轮噬菌体展示文库，将其感染OD=0.4-0.5的新鲜TG1菌（Lucigen），静置30分钟。将其加入到50mL含氨苄抗生素和2%葡萄糖的2xYT培养基中37℃225rpm摇菌1-2小时，9000g离心15分钟，用含卡那抗生素和1mM IPTG的2xYT培养基重悬菌体，并取10-100uL悬液用于稀释计数，加入辅助噬菌体M13K07（NEB），30℃ 250rpm过夜培养。

第二轮筛选使用20nM 生物素标记的hC5，方法同第一轮筛选，获得第二轮噬菌体展示文库，再依次进行第三轮筛选获得第三轮噬菌体展示文库。

第三轮噬菌体文库侵染TG1混匀后，稀释和涂布到含氨苄抗生素的琼脂平板上，次日挑取菌单克隆接种到含氨苄抗生素和2%葡萄糖的2xYT培养基无菌的96孔深孔板中，37℃225rpm。待菌生长到对数期，取100uL加入到新的96孔板并加入M13K07辅助噬菌体，30分钟孵育，补充100uL新鲜含氨苄和卡那抗生素的2xYT培养基，30℃摇菌过夜。

次日，将得到的含有噬菌体的培养上清，利用噬菌体ELISA（Phage ELISA）的方法进行验证，检验是否能特异性的结合hC5和cynoC5。

实施例2.3噬菌体ELISA（Phage ELISA）筛选阳性克隆

用hC5和cynoC5 1μg/mL包被StripwellTMMicroplate (货号：42592,Costar)，4℃过夜。次日洗板后用含2.5% milk的PBS室温封闭1小时。用PBST洗板后每孔加入100uL 上一步获得的含有噬菌体的培养上清，室温孵育1小时。再次洗板加入抗M13HRP检测抗体（M13Bacteriophage antibody (HRP)货号：11973MM05T-HH013JA1501, Sino Bio），室温孵育30分钟。

用PBST洗5次板，然后加入1-step Ultra TMB-ELISA reagent （ThermoScientific,货号：#34029），观察每孔颜色变化。待颜色合适时，用2M硫酸终止反应，在OD450nm下读值。根据ELISA反应的结果，挑出表达阳性噬菌体的阳性克隆菌C5006、C5006-12、C5006-13、C5006-14、C5006-15和C5006-16，送桑尼生物测序，获得编码VHH抗体可变区的基因序列和基于基因序列推导的氨基酸序列如下所示（C5006-15和C5006-16序列未显示）。

VHH抗体可变区核苷酸序列

C5006：

GACGTTCAGCTGCAAGAGTCTGGCGGAGGACTGGTTCAAGCTGGCGGAAGCCTGACACTGTCTTGTGCCGCCTCTGGCAGAACCTTCAGCACCAATGCCATGGGCTGGTTCAGACAGACCCCTGGCAAAGAACGCGAGTTTGTGGCCGCTGTGTCTTGGGGCAATGGCATCCCTTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACTACGCCAAGAACACCGTGTCTCTGCAGATGAACAGCCTGAAGCCTGAGGACACCGCCGTGTATTACTGCGCCGCCTACAGCGAGTTCGCCAGAATCAGCGACAGCAGCAGCTACAGATATTGGGGCCAGGGCACCCACGTGACCGTTTCTTCT（SEQ ID NO:7）

C5006-12：

CAGGTGCAGGTTGTGGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAGGCTGGCGGATCTCTGACACTGAGCTGTGCTGCCTCTCCTGGCACCTTCAGCACAAATGCCATGGGCTGGTTCAGACAGACCCCTGGCAAAGAACGCGAGTTTGTGGCCGCTGTGTCTTGGGGCAATGGCATCCCTTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGATTACGCCGAGAACACCGTGTCTCTGCAGATGAGCAGCCTGAAGCCTGAGGACACCGCCGTGTATTACTGTGCCGCCACAAGCGAGTTCGCCCGGATCAGCGATAGCAGCAGCTACAGATATTGGGGCCAGGGCACCCAAGTGACCGTGTCATCT（SEQ ID NO:8）

C5006-13：

CAGGTGCAGCTGGTTGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAGGCTGGCGGATCTCTGACACTGAGCTGTGCCGCCTCTCCTAGAACCTTCAGCACCAATGCCATGGGCTGGTTCAGACAGACCCCTGGCAAAGAACGCGAGTTTGTGGCCGCTGTGTCTTGGGGCAATGGCATCCCTTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGATTACGCCGAGAACACCGTGTCTCTGCAGATGAGCAGCCTGAAGCCTGAGGACACCGCCGTGTATTATTGTGCCGCCACCAGCGAGTTCGCCCGGATCAGCGATAGCAGCAGCTACAGATATTGGGGCCAGGGCACCCTCGTGACCGTTTCTTCT（SEQ ID NO:9）

C5006-14：

CAGGTGCAGGTTGTGGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAGGCTGGCGGATCTCTGACACTGAGCTGTGCCGCCTCTCCTAGAACACTGAGCACCAATGCCATGGGCTGGTTCAGACAGACCCCTGGCAAAGAACGCGAGTTTGTGGCCGCTGTGTCTTGGGGCAATGGCATCCCTTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGATTACGCCGAGAACACCGTGTCTCTGCAGATGAGCAGCCTGAAGCCTGAGGACACCGCCGTGTATTATTGTGCCGCCACCAGCGAGTTCGCCCGGATCAGCGATAGCAGCAGCTACAGATATTGGGGCCAGGGCACCCTCGTGACCGTTTCTTCT（SEQ ID NO:10）

VHH抗体可变区氨基酸序列

C5006：

DVQLQESGGGLVQAGGSLTLSCAASGRTFSTNAMGWFRQTPGKEREFVAAVSWGNGIPYYADSVKGRFTISRDYAKNTVSLQMNSLKPEDTAVYYCAAYSEFARISDSSSYRYWGQGTHVTVSS（SEQ ID NO:11）

C5006-12：

QVQVVESGGGLVQAGGSLTLSCAASPGTFSTNAMGWFRQTPGKEREFVAAVSWGNGIPYYADSVKGRFTISRDYAENTVSLQMSSLKPEDTAVYYCAATSEFARISDSSSYRYWGQGTQVTVSS（SEQ ID NO:12）

C5006-13：

QVQLVESGGGLVQAGGSLTLSCAASPRTFSTNAMGWFRQTPGKEREFVAAVSWGNGIPYYADSVKGRFTISRDYAENTVSLQMSSLKPEDTAVYYCAATSEFARISDSSSYRYWGQGTLVTVSS（SEQ ID NO:13）

C5006-14：

QVQVVESGGGLVQAGGSLTLSCAASPRTLSTNAMGWFRQTPGKEREFVAAVSWGNGIPYYADSVKGRFTISRDYAENTVSLQMSSLKPEDTAVYYCAATSEFARISDSSSYRYWGQGTLVTVSS （SEQ ID NO:14）

表1：VHH抗体CDR氨基酸序列 (IMGT)

编号

SEQ ID NO

CDR1

SEQ ID NO

CDR2

SEQ ID NO

CDR3

C5006

15

GRTFSTNA

19

VSWGNGIP

20

AAYSEFARISDSSSYRY

C5006-12

16

PGTFSTNA

19

VSWGNGIP

21

AATSEFARISDSSSYRY

C5006-13

17

PRTFSTNA

19

VSWGNGIP

21

AATSEFARISDSSSYRY

C5006-14

18

PRTLSTNA

19

VSWGNGIP

21

AATSEFARISDSSSYRY

实施例3：重组C5 VHH抗体的表达和纯化

实施例3.1 抗体表达

合成编码C5006、C5006-12、C5006-13、C5006-14的VHH抗体的核酸（擎科生物），将其构建到包含有信号肽（SEQ ID NO: 22）和包含铰链区的人IgG1 Fc（SEQ ID NO: 23）的哺乳动物细胞表达载体（pCDNA3.1）上，所得质粒DNA，使用Lipofectamine2000（Thermofisher，货号：11668030）转染试剂，瞬转到293FT细胞中，培养96小时。同时表达依库珠单抗抗体（IMGT/mAb-DB ID: 37, INN number: 8231）做为hC5抗体阳性对照。

信号肽氨基酸序列：SEQ ID NO:22

MGWSCIILFLVATATGVHS

包含突变铰链区的人IgG1 Fc区氨基酸序列：SEQ ID NO:23

EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(其中黑体为铰链区，且具有C220S突变)

人IgG1 Fc区氨基酸序列（野生型，无铰链区）：SEQ ID NO:24

APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

对照抗体序列：

>依库珠单抗重链：

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFSNYWIQWVRQAPGQGLEWMGEILPGSGSTEYTENFKDRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARYFFGSSPNWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK（SEQ ID NO:25）

>依库珠单抗轻链：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCGASENIYGALNWYQQKPGKAPKLLIYGATNLADGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQNVLNTPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（SEQ IDNO:26）

与人Fc片段连接的VHH抗体氨基酸序列

C5006-G1：

DVQLQESGGGLVQAGGSLTLSCAASGRTFSTNAMGWFRQTPGKEREFVAAVSWGNGIPYYADSVKGRFTISRDYAKNTVSLQMNSLKPEDTAVYYCAAYSEFARISDSSSYRYWGQGTHVTVSSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（SEQ ID NO:27）

C5006-12-G1：

QVQVVESGGGLVQAGGSLTLSCAASPGTFSTNAMGWFRQTPGKEREFVAAVSWGNGIPYYADSVKGRFTISRDYAENTVSLQMSSLKPEDTAVYYCAATSEFARISDSSSYRYWGQGTQVTVSSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:28)

C5006-13-G1：

QVQLVESGGGLVQAGGSLTLSCAASPRTFSTNAMGWFRQTPGKEREFVAAVSWGNGIPYYADSVKGRFTISRDYAENTVSLQMSSLKPEDTAVYYCAATSEFARISDSSSYRYWGQGTLVTVSSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:29)

C5006-14-G1：

QVQVVESGGGLVQAGGSLTLSCAASPRTLSTNAMGWFRQTPGKEREFVAAVSWGNGIPYYADSVKGRFTISRDYAENTVSLQMSSLKPEDTAVYYCAATSEFARISDSSSYRYWGQGTLVTVSSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:30)

实施例3.2 抗体纯化

使用Protein A纯化获得的与人Fc片段连接的VHH抗体（序列见SEQ ID NO:27-30），溶于PBS缓冲液中。

实施例4：C5 VHH抗体溶血抑制活性检测

实施例4.1 补体经典途径（CP）溶血的抑制活性检测

本实验通过检测不同浓度待测抗体，对在5%正常人血清中由补体介导的绵羊红细胞溶血的抑制程度，分析并比较各抗体对补体经典途径介导的溶血的抑制活性。实验过程简述如下：

(1) 抗体梯度稀释：确定待测抗体的质量浓度及分子量，用CP缓冲液(10mMHEPES, 150mM NaCl, 3mM CaCl2, 3mM MgCl2, 0.1% Gelatin, pH7.4) 将抗体配制成1200nM的溶液，然后从1200nM开始，用CP缓冲液3倍往下梯度稀释，一共6个浓度梯度；

(2) 血清的稀释：将正常人血清（NHS，上海儒百生物）从-70℃冰箱中取出，在室温下自然解冻后用CP缓冲液将血清原液稀释成20%的NHS溶液；

(3) 绵羊红细胞的激活：取2%绵羊红细胞（sheep Red Blood Cell, 货号：SBJ-RBC-S002，Sbjbio）用CP缓冲液洗涤至上清透明，然后用CP缓冲液重悬红细胞，并向悬液中加入效价比为1:4000的兔抗绵羊红细胞抗体(溶血素，Rabbitanti-sheep RBC, 货号：S25861，源叶生物)，37℃孵育30分钟激活绵羊红细胞，激活后的绵羊红细胞用CP缓冲液洗涤3次，用CP缓冲液重悬红细胞；

(4) 抗体反应液与红细胞孵育：于96孔V底板中加入50 ul步骤（3）激活后的绵羊红细胞,随后加入步骤（1）中稀释好的抗体25 ul，向混合液中加入25 μL步骤（2）中稀释好的血清，设置两个对照组，阴性对照组不含抗体并使用经56℃处理失活的血清，阳性对照组不含抗体使用正常血清，37℃孵育1小时；

(5) 反应终止：孵育结束后，每孔加入100 μL stop缓冲液（10mM HEPES, 150mMNaCl,10mM EDTA, 0.1%Gelatin）终止反应，将96孔V底板放在4℃离心机中3000rpm离心5分钟，取100μl上清液转移到96孔平底板中，在多功能读板机（Molecular Devices）中检测上清液在OD415nm时的吸光值，并保存数据；

(6) 数据处理：将（5）中所得的OD415nm读值代入以下公式计算红细胞溶血抑制率，计算公式为：溶血抑制率（%）=(阳性对照OD415-实验组OD415)/ (阳性对照OD415-阴性对照OD415)。然后以抗体终浓度为横坐标，溶血抑制率为纵坐标，使用Graph Pad Prism8软件进行四参数拟合作图，并计算IC50值。

检测结果显示，C5 VHH抗体C5006、C5006-12、C5006-13和C5006-14均能有效抑制经典途径（CP）介导的绵羊红细胞溶血，且随着抗体浓度升高抑制能力逐渐增强，相比之下C5006、C5006-13和C5006-12的抑制活性较好，C5006-14的抑制活性稍弱，C5006-15和C5006-16则无抑制活性，实验结果参见图2。

实施例4.2 补体旁路途径（AP）溶血的抑制活性检测

本实验通过测定不同浓度待测抗体，对在10%正常人血清中由补体介导的兔红细胞溶血的抑制程度，分析并比较各抗体对补体旁路途径介导的溶血的抑制活性。实验过程简述如下：

(1)抗体梯度稀释：确定待测抗体的质量浓度及分子量，用AP缓冲液(10mM HEPES,150mM NaCl, 3mM MgCl2, 0.1% Gelatin, 5mM EGTA, pH7.4) 将抗体浓度配制成1200nM的溶液，然后从1200nM开始，用AP缓冲液3倍往下梯度稀释，一共6个浓度梯度；

(2)血清的稀释：将正常人血清（NHS，上海儒百生物）从-70℃冰箱中取出，在室温下自然解冻后用AP缓冲液将血清原液稀释成40%的NHS溶液；

(3)兔红细胞的准备：取2%兔红细胞（rabbit Red Blood Cell, 货号：SBJ-RBC-RAB002，Sbjbio）用AP缓冲液洗涤至上清透明，然后用AP缓冲液重悬红细胞；

(4)抗体反应液与红细胞孵育：于96孔V底板中加入50ul步骤（3）中的兔红细胞，随后加入25 ul步骤（1）稀释好的抗体，向混合液中加入25 ul步骤（2）中稀释好的血清，设置两个对照组，阴性对照组不含抗体并使用经56℃处理失活的血清，阳性对照组不含抗体使用正常血清，37℃孵育1小时；

(5)反应终止：孵育结束后，每孔加入100 μL终止缓冲液（10mM HEPES, 150mMNaCl,10mM EDTA, 0.1% Gelatin）终止反应，将96孔V底板放在4℃离心机中3000rpm离心5分钟，取100μl上清液转移到96孔平底板中，在多功能读板机（Molecular Devices）中检测上清液在OD415nm时的吸光值，并保存数据；

(6) 数据处理：将（5）中所得的OD415nm读值代入以下公式计算红细胞溶血抑制率，计算公式为：溶血抑制率（%）=(阳性对照OD415-实验组OD415)/ (阳性对照OD415-阴性对照OD415)。然后以抗体终浓度为横坐标，溶血抑制率为纵坐标，使用Graph Pad Prism8软件进行四参数拟合作图，并计算IC50值。

检测结果显示，C5 VHH抗体C5006、C5006-12、C5006-13和C5006-14均能有效抑制旁路途径（AP）介导的兔红细胞溶血，且随着抗体浓度升高抑制能力逐渐增强，相比之下C5006、C5006-13和C5006-12的抑制活性较好，C5006-14的抑制活性稍弱，实验结果参见图3。

实施例5：C5 VHH抗体人源化

经序列比对分析发现，C5 VHH抗体的可变区与人germline IGHV3-23*01序列同源性较高，采用CDR移植的方法以IGHV3-23*01序列为骨架进行抗体人源化，抗体的CDR区以IMGT的规则进行界定，经过几轮回复突变筛选后，最终获得C5006d1和C5006e3两条人源化序列，人源化抗体的核苷酸和氨基酸序列如下所示。

VHH抗体可变区核苷酸序列

C5006d1：

GAAGTGCAGCTGCTGGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAACCTGGCGGCTCTCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCTCTGGCAGAACCTTCAGCACCAATGCCATGGGCTGGTTCAGACAGGCCCCTGGCAAAGAAAGGGAATTCGTGGCCGCTGTGTCCTGGGGCAATGGCATCCCTTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACTACGCCAAGAACACCGTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGGCCTGAGGATACCGCCGTGTACTACTGTGCCGCTTACAGCGAGTTCGCCCGGATCAGCGATAGCAGCAGCTACAGATATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTTTCTTCT（SEQ ID NO:31）

C5006e3：

GAAGTGCAGCTGCTGGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAACCTGGCGGCTCTCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCTCTCCCAGAACCTTCAGCACCAATGCCATGGGCTGGTTCAGACAGGCCCCTGGCAAAGAAAGGGAATTCGTGGCCGCTGTGTCCTGGGGCAATGGCATCCCTTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACTACGCCAAGAACACCGTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGGCCTGAGGATACCGCCGTGTACTACTGTGCCGCTACCAGCGAGTTCGCCCGGATCAGCGATAGCAGCAGCTACAGATATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTTTCTTCT（SEQ ID NO:32）

VHH抗体可变区氨基酸序列

C5006d1：

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSTNAMGWFRQAPGKEREFVAAVSWGNGIPYYADSVKGRFTISRDYAKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAAYSEFARISDSSSYRYWGQGTLVTVSS（SEQ ID NO:33）

C5006e3：

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASPRTFSTNAMGWFRQAPGKEREFVAAVSWGNGIPYYADSVKGRFTISRDYAKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAATSEFARISDSSSYRYWGQGTLVTVSS（SEQ ID NO:34）

表2：VHH抗体CDR氨基酸序列 (IMGT)

编号

SEQ ID NO

CDR1

SEQ ID NO

CDR2

SEQ ID NO

CDR3

C5006d1

15

GRTFSTNA

19

VSWGNGIP

20

AAYSEFARISDSSSYRY

C5006e3

17

PRTFSTNA

19

VSWGNGIP

21

AATSEFARISDSSSYRY

实施例6：重组人源化C5 VHH抗体的表达、纯化及纯度检测

实施例6.1 人源化C5 VHH抗体基因合成、抗体表达及纯化

人源化C5 VHH抗体基因合成、表达及纯化同实施例3所述，其完整的抗体序列信息如下所示。

与人Fc片段连接的人源化VHH抗体氨基酸序列

C5006d1-G1：

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSTNAMGWFRQAPGKEREFVAAVSWGNGIPYYADSVKGRFTISRDYAKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAAYSEFARISDSSSYRYWGQGTLVTVSSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（SEQ ID NO:35）

C5006e3-G1：

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASPRTFSTNAMGWFRQAPGKEREFVAAVSWGNGIPYYADSVKGRFTISRDYAKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAATSEFARISDSSSYRYWGQGTLVTVSSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:36)

实施例6.2 人源化C5 VHH抗体纯度检测（SEC-HPLC）

蛋白纯度分析使用尺寸排阻色谱法（SEC），将在PBS中的纯化蛋白样品施加于TSKgel Super SW3000的300×4.6mm，5μm柱 (TOSOH) 上，使用U3000型HPLC仪器(DIONEX)进行SEC，洗脱是以0.25mL/min流速进行的等度洗脱。所有蛋白质都使用UV检测，在280nm和214nm下测定。使用仪器自带软件进行组分分析。

检测结果显示，经protein A一步纯化的人源化C5 VHH抗体C5006d1-G1和C5006e3-G1，在溶液状态下的单体纯度分别达到了96%和98%，纯度优异（图4和图5）。

实施例7：人源化C5 VHH抗体结合活性检测

实施例7.1 包被抗体检测抗原的ELISA

为检测人源化C5 VHH抗体与抗原人C5的结合能力，将抗体用PBS稀释到0.5μg/mL,取100μL包被酶标板（Corning,货号：42592），4℃孵育过夜。次日，去除包被液后使用PBST洗涤3次，使用含2.5%脱脂奶粉的PBS于37℃封闭1小时。对实施例1.1制备的hC5蛋白用含2.5%脱脂奶粉的PBS进行梯度稀释，从1 μg/mL开始5倍稀释，共7个浓度点，阴性对照点不含hC5。PBST洗板3次后加入稀释好的hC5溶液，37℃孵育1小时。PBST洗板3次后加入100μL 1:5000稀释的HRP标记的兔抗HIS二抗（jackson，货号:300-035-240），37℃孵育1小时。PBST洗板3次后加入TMB（Invitrogen™，货号：002023）底物显色5-10分钟，加入ELISA终止液（生工，货号：E661006-0500）终止反应后使用酶标仪读取OD450吸光值。

检测结果显示，当包被抗体检测梯度稀释的抗原人C5时，人源化C5 VHH抗体C5006d1-G1、C5006e3-G1均能与人C5结合，且随着C5浓度提高结合信号逐渐增强。相比较之下，两者的结合能力相似，且与对照抗体依库珠单抗的结合能力基本一致，实验结果参见图6。

实施例7.2 包被抗原检测抗体的ELISA

为进一步检测人源化C5 VHH抗体与抗原人C5的结合能力，将人C5蛋白用PBS稀释到1μg/mL，取100μL包被酶标板（Corning,货号：42592），4℃孵育过夜。次日，去除包被液后使用PBST洗涤3次，使用含2.5%脱脂奶粉的PBS于37℃封闭1小时。对待检测抗体用含2.5%脱脂奶粉的PBS进行梯度稀释，从1 μg/mL开始5倍稀释，共7个浓度点，阴性对照点不含抗体。PBST洗板3次后加入稀释好的抗体溶液，37℃孵育1小时。PBST洗板3次后加入100μL 1:5000稀释的HRP标记的山羊抗人IgG抗体（jackson，货号:109-035-098），37℃孵育1小时。PBST洗板3次后加入TMB（Invitrogen™，货号：002023）底物显色5-10分钟，加入ELISA终止液（生工，货号：E661006-0500）终止反应后使用酶标仪读取OD450吸光值。

检测结果显示，当包被抗原人C5蛋白检测梯度稀释的抗体时，人源化C5 VHH抗体C5006d1-G1、C5006e3-G1均能与人C5结合，且随着抗体浓度提高结合信号逐渐增强。相比较之下，两者的结合能力相似，且均强于对照抗体依库珠单抗的结合能力，实验结果参见图7 。

实施例8：人源化C5 VHH抗体溶血抑制活性检测

实施例8.1 人源化C5 VHH抗体对正常人血清（NHS）CP/AP溶血的抑制活性检测

为检测人源化C5 VHH抗体对在人血清中补体介导的溶血抑制活性，采用与实施例4中相同的方法进行检测，将抗体配制成80μg/mL的溶液（终浓度20μg/mL），进行2倍梯度稀释，共10个浓度点。

结果显示，对于CP介导的绵羊红细胞的溶血，人源化C5 VHH抗体C5006d1-G1、C5006e3-G1具有类似的抑制活性，IC50分别为0.46和0.52μg/mL，二者的活性强于对照抗体依库珠单抗，后者的抑制活性IC50为0.76μg/mL（图8）；对于AP介导的兔红细胞的溶血，人源化C5 VHH抗体C5006d1-G1、C5006e3-G1同样具有类似的抑制活性，IC50分别为1.52和1.63μg/mL，二者的活性也强于对照抗体依库珠单抗，后者的抑制活性IC50为2.08μg/mL（图9）。综上所述，人源化C5 VHH抗体C5006d1-G1和C5006e3-G1具有良好的人补体抑制活性，且活性强于对照抗体依库珠单抗。

实施例8.2 人源化C5 VHH抗体对猴血清（NMS）CP/AP溶血的抑制活性检测

作为与人类最接近的模式动物，非人灵长类（NHP）常常被用于药物研发过程中对于药物安全性和有效性的评估，这可以大大提升药物研发的成功率和降低药物后期开发的风险。为检测人源化C5 VHH抗体对在NHP血清中补体介导的溶血抑制活性，采用实施例4中相同的方法和常用模式动物食蟹猴血清（苏州熙华新药开发有限公司）进行检测，将抗体配制成80μg/mL的溶液（终浓度20μg/mL），进行2倍梯度稀释，共10个浓度点。

结果显示，对于CP介导的绵羊红细胞的溶血，人源化C5 VHH抗体C5006d1-G1、C5006e3-G1具有相同的抑制活性，IC50均为0.81μg/mL。相比之下，对照抗体依库珠单抗仅有很弱的溶血抑制活性（图10）；对于AP介导的兔红细胞的溶血，人源化C5 VHH抗体C5006d1-G1、C5006e3-G1具有类似的抑制活性，IC50分别为3.54和4.06μg/mL。同样地，对照抗体依库珠单抗仅有微弱的溶血抑制活性（图11）。综上所述，人源化C5 VHH抗体C5006d1-G1和C5006e3-G1具有良好的猴补体抑制活性，而照抗体依库珠单抗则活性很弱。

实施例9：人源化C5 VHH抗体的耐热稳定性检测

抗体的热稳定性是评价抗体药物可开发性的重要指标，良好的耐热稳定性往往意味着抗体药物具有更好的储藏稳定性和货架有效期。本实验使用梯度加热的方法对抗体进行加热处理，然后对经过不同温度处理的样品进行活性检测，以评估人源化C5 VHH抗体的耐热稳定性。

实施例9.1 抗体热处理

将待测抗体用CP缓冲液配制成100nM的溶液，分装后将抗体在不同的温度下孵育1小时,温度设定为从85℃开始5℃递减至55℃，共准备7个温度点，使用未经加热处理，4℃孵育的样品作为对照。

实施例9.2 热处理抗体的CP活性检测

为检测经不同温度处理后抗体的活性变化，采用与实施例4中相同的CP检测方法进行检测，抗体终浓度25nM。

结果显示，经70℃及上温度处理的依库珠单抗就完全失去了补体抑制活性；经80℃及上温度处理的C5006d1-G1完全失去了补体抑制活性；而经85℃处理的C5006e3-G1才完全失去补体抑制活性。相比之下，人源化C5 VHH抗体C5006d1-G1和C5006e3-G1具有更好的耐热稳定性，结果如图12所示。

Claims (18)

1.特异性结合补体C5的VHH抗体，其包含三个互补决定区域（CDR）CDR1、CDR2和CDR3其中

(i) CDR1由SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列组成，CDR2由SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列组成，CDR3由SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列组成；或

(ii) CDR1由SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列组成， CDR2由SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列组成，CDR3由SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列组成；

(iii) CDR1由SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列组成， CDR2由SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列组成，CDR3由SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列组成；或

(iv) CDR1由SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列组成， CDR2由SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列组成， CDR3由SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列组成。

2.权利要求1的VHH抗体，其包含重链可变区或由其组成，所述重链可变区包含SEQ IDNO:34、33和11-14中任一项所示的氨基酸序列。

3.特异性结合补体C5的VHH抗体，其由SEQ ID NO: 34、33和11-14中任一项所示的氨基酸序列组成。

4.特异性结合补体C5的重链抗体，其包含权利要求1-3中任一项所述的VHH抗体。

5.权利要求4的重链抗体，其包含与抗体恒定区或Fc区连接的权利要求1-3中任一项所述的VHH抗体。

6.权利要求5的重链抗体，其中所述抗体恒定区或Fc区来自人IgG1、人IgG2、人IgG3或人IgG4。

7.权利要求5或6的重链抗体，其中所述VHH抗体与所述Fc区通过铰链区连接。

8.权利要求7的重链抗体，其中所述铰链区由SEQ ID NO:38或39所示的氨基酸序列组成。

9.权利要求5或6的重链抗体，其中所述Fc区由SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列组成。

10.权利要求4-6中任一项的重链抗体，其包含选自SEQ ID NO: 36、35和27-30中任一项所示的氨基酸序列。

11.特异性结合补体C5的重链抗体，其由SEQ ID NO: 36、35和27-30中任一项所示的氨基酸序列组成。

12.核酸分子，其编码权利要求1-3中任一项的VHH抗体，或权利要求4-11中任一项的重链抗体。

13.权利要求12的核酸分子，其由SEQ ID NO:32、31和7-10中任一项所述的核酸序列组成。

14.表达载体，其包含权利要求12或13所述的核酸分子。

15.宿主细胞，其包含权利要求12或13所述的核酸分子或权利要求14所述的表达载体。

16.制备权利要求1-3中任一项的VHH抗体，或权利要求4-11中任一项的重链抗体的方法，所述方法包括，在适合所述VHH抗体或重链抗体或其链表达的条件下，培养权利要求15的宿主细胞，和从所述宿主细胞或宿主细胞培养基回收所述VHH抗体或重链抗体。

17.药物组合物，其包含一种或多种权利要求1-3中任一项的VHH抗体，或权利要求4-11中任一项的重链抗体。

18.权利要求17的药物组合物，其还包含药用辅料。