CN119372174A - 一种高效同源重组的工程菌及提高基因编辑效率的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种高效同源重组的工程菌及提高基因编辑效率的方法。基因组编辑工作的受到宿主菌同源重组效率的限制，因此，提供一种具有具有更高同源重组效率的工程菌对于提高基因组编辑工作的效率具有重要意义。为了实现该目的，本发明针对宿主菌的核酸外切酶VII进行改造，对双亚基中的xseA亚基进行敲除，同时过表达xseB亚基，可实现dsDNA重组介导的单区编辑效率提高220％，显著提高细菌同源重组效率，具有普适性与便捷性。

Description

一种高效同源重组的工程菌及提高基因编辑效率的方法

技术领域

本发明属于基因编辑工程菌技术领域，具体涉及一种高效同源重组的工程菌、用于该工程菌的试剂盒及一种通过修饰宿主菌核酸外切酶VII提高基因组编辑效率的方法。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

当前细菌基因组编辑技术中受到广泛应用的主要有Red/ET重组工程和CRISPR/Cas系统。Red/ET重组工程(Red/ET Recombineering)是由来源于大肠杆菌λ噬菌体的重组蛋白对Redα/Redβ或来源于大肠杆菌Rac原噬菌体的重组蛋白对RecE/RecT介导的同源重组技术，能够完成传统DNA克隆技术不能解决的难题，能够利用噬菌体重组酶Redαβγ或RecET介导的短链同源臂同源重组对目标DNA进行删除、插入、替换、点突变和克隆，不依赖酶切位点、不受位置限制、准确度高、不脱靶，已广泛应用于微生物生物合成途径克隆与异源表达、细菌基因组快速精准编辑与表型优化、基因打靶与人源化转基因动物构建、病毒疫苗开发等多个重要领域。成簇规则间隔短回文重复序列/相关蛋白Cas9核酸酶(CRISPR/Cas，Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-CRISPR associatednuclease)系统最近作为一种高效和通用的工具用于各种生物的基因组编辑。CRISPR/Cas系统是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种获得性免疫防御机制，用于对抗入侵的病毒及外源DNA，包含与目的DNA片段匹配的向导RNA(Single guide RNA，sgRNA)以及具有核酸酶功能的Cas蛋白。向导RNA引导Cas蛋白结合靶标位点，切割靶DNA，产生双链断裂，再通过细菌内源的同源重组进行修复，是目前应用最广泛的基因组编辑工具。然而，其在细菌中的基因组靶向和操作能力往往受到同源重组效率以及细胞毒性的限制。

综上所述，细菌基因组编辑(敲除、插入和替换)的上限主要由宿主菌株的同源重组效率决定。Red/ET重组工程是促进细菌同源重组最为有效的方法。在Red/ET重组工程介导重组过程中，外源底物最终以ssDNA的形式从复制叉进入基因组完成编辑。然而，ssDNA在细菌中容易被外切酶降解，因此抑制外切酶、增强ssDNA在细菌中的稳定性理论上可以提高重组效率。常见的ssDNA外切酶有ExoI、ExoVII、ExoX和RecJ，其中ExoVII比较特殊，由两个亚基组成(由一个XseA亚基和四个XseB亚基组成的复合体)。ExoVII具有5’-3’及3’-5’两个方向的核酸外切酶活性，也可以降解DNA双链末端的单链区域和移位的单链区域。核酸外切酶VII在细菌中普遍存在，有报道称敲除xseA可促进同源重组，但是完全失活ExoVII会导致细胞的损伤。

发明内容

本发明设计提供一种提高工程菌基因组同源重组效率的方法，通过对细菌核酸外切酶VII中xseA亚基、xseB亚基进行调控，可使重组介导的单区编辑效率显著提高。本发明提供的改造方法，具有良好的普适性，可适用于大部分基因编辑工程涉及的宿主菌，并且改造方法简单，效果稳定。

基于上述技术效果，本发明提供如下的技术方案：

第一方面，本发明提供一种高效同源重组的工程菌，相比野生型，所述工程菌的核酸外切酶VII中xseA亚基表达被抑制，和/或xseB亚基表达增加。

为了提高宿主菌同源重组效率，本发明针对宿主菌中的核酸外切酶进行改造；进一步的，本发明针对核酸外切酶VII中xseA及xseB表达情况进行调控，结果表明，抑制xseA、增加xseB表达能够提高宿主菌株的重组效率。

一种实施方式中，所述工程菌的核酸外切酶VII中xseA亚基表达被抑制；该实施方式可使重组效率提高130％；

一种实施方式中，所述工程菌的核酸外切酶VII中xseB亚基表达增加；该实施方式可使重组效率提高80％；

效果较好的一种实施方式中，所述工程菌的核酸外切酶VII中被改造为同时具有xseA亚基表达被抑制及xseB亚基表达增加，该实施方式可使重组效率提高220％。

所述工程菌可以是常用于基因编辑工作的任意菌株，只要其基因组中具有核酸外切酶VII，即可进行如上所述的改造，具体实例如大肠杆菌、伯克氏菌、酿酒酵母等。所述xseA、xseB亚基的具体序列可依据宿主菌的不同进行调整，属于本领域技术人员可常规推知的技术内容。

进一步的，所述xseA亚基表达被抑制的方式可以是xseA亚基中70％及以上的序列缺失，而xseB亚基过表达的方式如xseB亚基的拷贝数目增加，增加数目如一个、两个或多个；上述序列缺失和/或增加的改造方式如通过载体对宿主细胞的基因序列进行编辑，在本发明中使用的载体没有具体限制，只要它能够在宿主细胞中复制，并且可以使用本领域中任何已知的载体。常规载体的实例可包括重组质粒、黏粒、病毒和噬菌体。

本发明验证的一种实施方式中，采用重组质粒转染实现上述工程菌的制备，即本发明第二方面，提供一种用于同源重组的工程菌的改造试剂盒，所述试剂盒用于对宿主菌中核酸外切酶VII进行改造，所述试剂盒中至少包括重组酶质粒，其表达盒如下：包括鼠李糖诱导型启动子控制大肠杆菌重组酶(Redαβγ)-xseB-xseA-靶向gRNA和xseA敲除盒。

上述改造试剂盒用于对宿主菌中核酸外切酶VII中xseB、xseA两亚基同时进行改造，具体为对xseA亚基表达进行抑制，同时过表达xseB亚基。

优选的，所述试剂盒中还包括dsDNA底物、诱导剂、dNTPs。

进一步的，上述dsDNA底物长度不超过100bp，该序列应当能够锚定多个靶标位点。

进一步的，所述诱导剂选自IPTG、鼠李糖中的一种。

进一步的，所述dNTPs中GC碱基的含量应当与宿主菌基因组中GC含量接近。

第三方面，本发明提供一种通过修饰宿主菌核酸外切酶VII提高基因组编辑效率的方法，所述方法基于第二方面所述试剂盒对宿主菌的核酸外切酶VII进行改造，步骤如下：

将上述重组酶质粒加入宿主菌中进行培养，向培养基中添加诱导剂诱导重组酶表达，之后制备感受态宿主菌，通过电转化导入dsDNA底物；该电转后的感受态细胞低温下复苏，复苏过程中添加dNTPs；复苏后的感受态细胞通过抗性筛选得到上述工程菌。

一种具体的实施方式中，所述宿主菌为大肠杆菌(E.coli)BL21；带有重组酶质粒的宿主菌制备感受态方式为本领域常用操作；该感受态细胞的复苏温度为28～32℃，复苏时间5～7小时。

第四方面，提供第一方面所述工程菌在基因组编辑工作中的应用。

上述工程菌可适用的基因编辑方式如基因敲除、插入和替换等，优选的实施方式中，为Red/ET重组工程。

以上一个或多个技术方案的有益效果是：

本发明首次公开了一种通过将细菌核酸外切酶VII XseA亚基敲除盒和由鼠李糖启动子控制过表达的XseB亚基同时构建在重组酶质粒上实现细菌基因组编辑效率提高的方法的建立与应用，能够有效地使大肠杆菌E.coli BL21 dsDNA重组介导的单区编辑效率提高220％。本发明建立的方法能够显著提高细菌同源重组效率，具有普适性与便捷性。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为ExoVII亚基对单突变的影响与质粒构建；

其中图a，不同ExoVII亚基对单突变的影响；

ΔxseA,xseA基因被庆大霉素耐药基因失活；

P-xseB，xseB基因与重组酶共表达；

ΔxseA-oligo，加入靶向xseA基因的寡核苷酸使该基因失活；

ΔxseA+P-xseB的单突变率增加了2.2倍；

图b为ExoVII亚基修饰质粒的构建，重组酶和xseB在同一启动子的控制下共表达；在质粒中加入XseA失活盒，表达cas9基因可在体内失活XseA。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

实施例1重组工程菌的构建及编辑效率验证

本实施例中，以大肠杆菌(E.coli)BL21作为出发菌株，分别探讨了过表达大肠杆菌内源xseB、干扰大肠杆菌内源xseA、两者同时实现对重组编辑效率的影响：

1、实验材料

1)以下实施例中涉及的试剂与仪器：单链核苷酸是从上海生工生物技术有限公司合成，限制性内切酶、DNA聚合酶和DNA标记来自新英格兰生物公司(New EnglandBiolabs)，抗生素从英杰公司(Invitrogen)购买。实施例中涉及的大肠杆菌(E.coli)BL21来自本实验室，为标准质控菌株，可通过市售途径购买。

2、实验方法

2.1出发菌株：大肠杆菌(E.coli)BL21；

2.2重组介导的单区域基因编辑效率统计方法：

分别采用对照组及实验组重组质粒对出发菌株进行编辑，对抗性平板上的单菌落进行计数，计算出每10⁸个细胞中正确菌落数，即代表编辑效率。数值为生物重复的平均值，误差线表示所有(n≥3)个生物重复的标准误差。P值采用two-tailed Student′s t检验:****P<0.001。

对照组：采用空白质粒对出发菌株进行转染，其余操作与实验组相同。

实验组构建方法如下：

1)过表达xseB质粒构建：xseB来源于大肠杆菌BL21，序列如下：

ATGCCGAAGAAAAATGAGGCGCCCGCCAGCTTTGAAAAGGCGCTGA

GCGAGCTGGAACAGATTGTAACCCGTCTGGAAAGTGGCGACCTGCCGCTG

GAAGAGGCGCTGAACGAGTTCGAACGCGGCGTGCAGCTGGCACGTCAGG

GGCAGGCCAAATTACAACAAGCCGAACAGCGCGTACAAATTCTGCTGTCT

GACAATGAAGACGCCTCTCTAACCCCTTTTACACCGGACAATGAGTAA

(SEQ ID NO.1)。

将上述序列的xseB与重组酶(Redαβγ)转入pBBR1载体中，构建多拷贝重组酶表达质粒(pBBR1-PRha-Redαβγ-xseB-Km)。重组介导的单区编辑效率提高80％。

2)xseA表达干扰质粒构建：采用CRISPR-Cas介导的敲除对出发菌株中的xseA进行失活，该CRISPR质粒的gRNA序列如下：ATTACGCTCTACGAGCCGCG(SEQ ID NO.2)。对于xseA，根据上述编辑效率统计方法，失活xseA可使重组效率提高130％。

3)同时过表达xseB和失活xseA载体构建：基于上述结果，重构重组酶和Cas9表达载体：将BL21菌株的xseB基因置于重组酶(Redαβγ)后，由鼠李糖启动子控制过表达，将xseA-靶向gRNA和xseA敲除盒(KO region-xseA gRNA-tracRNA)置于同一质粒上，进行xseA预失活，表达盒结构如图1b所示。同时过表达xseB和失活xseA可以将重组介导的单区编辑效率提高220％，具体步骤如下：

(1)将鼠李糖诱导型启动子控制大肠杆菌重组酶(Redαβγ)并构建在合适的骨架质粒上，BL21菌株的xseB基因置于重组酶后，由鼠李糖启动子控制实现xseB基因的瞬时过表达，涉及引物如下：

(2)将大肠杆菌xseA-靶向gRNA(SEQ ID NO.2)和xseA敲除盒(KO region-xseAgRNA-tracRNA)置于同一质粒上，采用CRISPR-Cas介导的敲除进行xseA预失活，该步骤涉及引物如下：

(3)通过PCR的方法获得带有能够锚定不同靶标位点短的同源臂(100bp)的dsDNA底物，所用氯霉素抗性基因片段序列如下(波浪线部分为同源臂)：

(4)将步骤(2)中的带有重组酶质粒的宿主细胞用合适培养基培养至对数生长期，添加诱导剂，诱导重组酶的表达，制备带有重组酶质粒的宿主细胞感受态，将dsDNA底物(抗生素抗性片段)通过电转化导入到感受态细胞内；

(5)将电转化后的感受态细胞，在低于最适生长温度的温度下进行复苏，在复苏过程中添加终浓度为10nM的dNTPs(GC含量与宿主基因组GC含量相近或者相同)，大肠杆菌BL21复苏温度30℃，复苏时间6小时；

(6)将复苏后的感受态细胞离心弃上清后重悬于100μL适宜培养基中，均匀涂布于带有相应抗性的固体培养基平板上，在复苏温度下进行孵育直至单菌落长出；

(7)重组编辑效率结果如图1a所示。实验组分别为xseA基因被庆大霉素耐药基因失活(ΔxseA)、xseB基因与重组酶共表达(P-xseB)，加入靶向xseA基因的寡核苷酸使该基因失活(ΔxseA-oligo)、同时失活xseA基因且过表达xseB基因(ΔxseA+P-xseB)时重组介导的单区域基因编辑效率。

结果如图1a所示，同时过表达xseB和失活xseA可以将重组介导的单区域基因编辑效率提高220％。

另外，上述改造后的宿主菌生长状态生长状态与野生型相比未见明显差异。

在本实施例中，成功将细菌核酸外切酶VII XseA亚基敲除盒和由鼠李糖启动子控制过表达的XseB亚基同时构建在重组酶质粒上，实现了大肠杆菌BL21dsDNA重组介导的单区编辑效率的显著提高。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种高效同源重组的工程菌，其特征在于，相比野生型，所述工程菌的核酸外切酶VII中xseA亚基表达被抑制，和/或xseB亚基表达增加。

2.如权利要求1所述高效同源重组的工程菌，其特征在于，所述工程菌的核酸外切酶VII中被改造为同时具有xseA亚基表达被抑制及xseB亚基表达增加。

3.如权利要求1所述高效同源重组的工程菌，其特征在于，所述工程菌为大肠杆菌、伯克氏菌、酿酒酵母中的一种。

4.一种用于同源重组的工程菌的改造试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于对宿主菌中核酸外切酶VII进行改造，所述试剂盒中至少包括重组酶质粒，其表达盒如下：包括鼠李糖诱导型启动子控制大肠杆菌重组酶(Redαβγ)-xseB-xseA-靶向gRNA和xseA敲除盒。

5.如权利要求4所述用于同源重组的工程菌的改造试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括dsDNA底物、诱导剂、dNTPs。

6.如权利要求5所述用于同源重组的工程菌的改造试剂盒，其特征在于，所述dsDNA底物长度不超过100bp，该序列应当能够锚定多个靶标位点；

或，所述诱导剂选自IPTG、鼠李糖中的一种；

或，所述dNTPs中GC碱基的含量与宿主菌基因组中GC含量接近。

7.一种通过修饰宿主菌核酸外切酶VII提高基因组编辑效率的方法，其特征在于，所述方法基于权利要求4-6任一项所述试剂盒对宿主菌的核酸外切酶VII进行改造，步骤如下：将上述重组酶质粒加入宿主菌中进行培养，向培养基中添加诱导剂诱导重组酶表达，之后制备感受态宿主菌，通过电转化导入dsDNA底物；该电转后的感受态细胞低温下复苏，复苏过程中添加dNTPs；复苏后的感受态细胞通过抗性筛选得到上述工程菌。

8.如权利要求7所述通过修饰宿主菌核酸外切酶VII提高基因组编辑效率的方法，其特征在于，所述宿主菌为大肠杆菌BL21；该感受态细胞的复苏温度为28～32℃，复苏时间5～7小时。

9.权利要求1-3任一项所述工程菌在基因组编辑工作中的应用。

10.如权利要求9所述应用，其特征在于，所述基因编辑工作为Red/ET重组工程。