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CN119320816A - 用于消耗和富集核酸序列的方法和试剂盒 - Google Patents

用于消耗和富集核酸序列的方法和试剂盒 Download PDF

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CN119320816A
CN119320816A CN202411269316.0A CN202411269316A CN119320816A CN 119320816 A CN119320816 A CN 119320816A CN 202411269316 A CN202411269316 A CN 202411269316A CN 119320816 A CN119320816 A CN 119320816A
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CN
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nucleic acid
sample
acid molecules
acid molecule
sample solution
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Application number
CN202411269316.0A
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A·B·罗森伯格
C·若克
G·希莉格
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University of Washington
Original Assignee
University of Washington
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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Abstract

用于富集靶核酸序列，如包含靶核酸序列的核酸分子的试剂盒和方法，和用于消耗靶核酸序列，如包含靶核酸序列的核酸分子的试剂盒和方法。在实施方案中，所述用于富集靶核酸序列的方法包括选择性降解单链样品核酸分子，如不包含靶核酸序列的那些。在实施方案中，所述用于消耗靶核酸序列的方法包括选择性降解双链样品核酸分子，如包含靶核酸序列的那些。

Description

用于消耗和富集核酸序列的方法和试剂盒
本申请是2019年10月24日申请的PCT国际申请PCT/US2019/057939于2021年4月23日进入中国国家阶段的、申请号为201980070102.1且发明名称为“用于消耗和富集核酸序列的方法和试剂盒”的发明专利申请的分案申请。
相关申请的交叉引用
本申请要求于2018年10月24日提交的第62/750,169号美国临时申请的权益，其全部内容通过引用并入本文。
关于序列表的声明
与本申请相关联的序列表以文本格式代替纸质副本提供，并且据此通过引用并入申请文件中。包含序列表的文本文件的名称为70380_Seq_final_2019-10-24.txt。文本文件为14KB；创建于2019年10月24日；并通过EFS-Web随申请文件提交一起提交。
背景
复杂的生物样品，例如组织、细胞、细胞裂解物、血清等，对确定带有特定靶序列的核酸分子的序列和浓度提出挑战。同样，由一组条形编码的分子，如单细胞RNA测序文库确定核酸的序列和浓度也提出类似的挑战。
通常，诸如Sanger测序或下一代测序(NGS)方法的测序方法用于对这样的复杂样品和序列文库中的核酸测序，其中除了基于感兴趣的靶序列的那些以外还生成大量的过量序列。另外，在使用NGS方法的情况下，使用相对大量的测序读数来实现期望的测序深度。
在复杂样品中选择性富集靶核酸序列或消耗非靶核酸序列将简化解释序列数据，并减少实现特定测序深度所需的读取次数。
因此，目前本领域存在这样的需求，即例如在准备测序时在复杂混合物中选择性去除一些或全部非目标核酸分子，或选择性地增加目标核酸分子的比例。本发明试图满足这些需求并提供进一步的相关优点。
概述
为此，在某些方面，本发明提供了用于富集靶核酸分子的方法和试剂盒。相应地，在其他方面，本发明提供了用于消耗非目标核酸分子的方法和试剂盒。
一方面，本发明提供了一种用于富集靶核酸序列的方法。在实施方案中，所述方法包括向包含多个样品核酸分子的样品溶液中引入与所述多个样品核酸分子中的一个或多个样品核酸分子的靶核酸序列互补或部分互补的捕获引物核酸分子，所述样品核酸分子各自包含通用衔接子核酸序列；酶促延伸与所述一个或多个样品核酸分子的靶核酸序列退火的捕获引物核酸分子；和酶促降解单链样品核酸分子，以提供比所述样品溶液具有更高比例的包含靶核酸序列的样品核酸分子的富集的样品溶液。
另一方面，本发明提供了用于一种消耗靶核酸序列的方法。在实施方案中，所述方法包括向包含多个样品核酸分子的样品溶液中引入与所述多个样品核酸分子中的一个或多个样品核酸分子的靶核酸序列互补或部分互补的捕获引物核酸分子，所述样品核酸分子各自包含通用衔接子核酸序列，所述通用衔接子核酸序列包含核糖核苷酸；酶促延伸与所述一个或多个样品核酸分子的靶核酸序列退火的捕获引物核酸分子；和酶促切割所述样品核酸分子的双链核糖核酸分子，以提供比所述样品溶液具有更低比例的包含靶核酸序列的样品核酸分子的消耗的样品溶液。
一方面，本发明提供了一种用于富集靶核酸序列的试剂盒。在实施方案中，所述试剂盒包含与靶序列互补或部分互补的捕获引物核酸分子；和配置成降解单链核酸分子的降解酶。
另一方面，本发明提供了一种用于消耗靶核酸序列的试剂盒。在实施方案中，所述试剂盒包含与靶序列互补或部分互补的捕获引物核酸分子；和配置成降解双链核酸分子的降解酶。
提供该概述以通过简化形式介绍一系列构思，其将在下面的详述中进一步描述。该概述不旨在确定所要求保护的主题的关键特征，也不旨在用于帮助确定所要求保护的主题的范围。
附图说明
当结合附图时，本发明的前述方面和许多伴随的优点将变得更加容易理解，因为通过参考以下详述，本发明的前述方面和许多伴随的优点将得到更好的理解，其中：
图1A示意性地示出了根据本发明的实施方案的样品溶液，所述样品溶液包含待富集的样品核酸分子和待消耗的核酸分子。
图1B示意性地示出了根据本发明的实施方案的图1A的样品溶液，其还包含捕获引物核酸分子。
图1C示意性地示出了根据本发明的实施方案，在使待富集和消耗的样品核酸分子解链之后的图1B的样品溶液。
图1D示意性地示出了根据本发明的实施方案，在使捕获引物核酸分子与待富集的核酸分子的靶序列退火之后的图1C的样品溶液。
图1E示意性地示出了根据本发明的实施方案，在酶促延伸与靶序列退火的捕获引物核酸分子之后的图1D的样品溶液。
图1F示意性地示出了根据本发明的实施方案，在酶促降解样品溶液中的单链样品核酸分子之后的图1E的样品溶液。
图1G示意性地示出了根据本发明的实施方案，使图1F的样品溶液的核酸分子解链。
图1H示意性地示出了根据本发明的实施方案，在去除捕获引物核酸分子之后的图1G的样品溶液。
图1I示意性地示出了根据本发明的实施方案的图1H的样品溶液，该样品溶液还包含与样品溶液中的样品核酸分子的通用衔接子序列互补的聚合酶链反应(PCR)引物。
图1J示意性地示出了根据本发明的实施方案，在PCR扩增样品溶液的特定样品核酸分子之后的图1I的样品溶液。
图2A示意性地示出了根据本发明的实施方案的样品溶液，该样品溶液包含待富集的样品核酸分子和待消耗的核酸分子。
图2B示意性地示出了根据本发明的实施方案的图2A的样品溶液，该样品溶液还包含捕获引物核酸分子。
图2C示意性地示出了根据本发明的实施方案，在使待富集和消耗的样品核酸分子解链之后的图2B的样品溶液。
图2D示意性地示出了根据本发明的实施方案，在使捕获引物核酸分子与待消耗的核酸分子的靶序列退火之后的图2C的样品溶液。
图2E示意性地示出了根据本发明的实施方案，在酶促延伸与靶序列退火的捕获引物核酸分子之后的图2D的样品溶液。
图2F示意性地示出了根据本发明的实施方案，在酶促降解样品溶液中的双链样品核酸分子之后的图2E的样品溶液。
图2G示意性地示出了根据本发明的实施方案，使图2F的样品溶液的样品核酸分子解链。
图2H示意性地示出了根据本发明的实施方案，在去除捕获引物核酸分子之后的图2G的样品溶液。
图2I示意性地示出了根据本发明的实施方案的图2H的样品溶液，该样品溶液还包含与样品溶液中的样品核酸分子的通用衔接子序列互补的PCR引物。
图2J示意性地示出了根据本发明的实施方案，在PCR扩增样品溶液的样品核酸分子之后的图2I的样品溶液。
图3A示意性地示出了根据本发明的实施方案的样品溶液，该样品溶液包含待富集的样品核酸分子和待消耗的核酸分子。
图3B示意性地示出了根据本发明的实施方案的图3A的样品溶液，该样品溶液还包含捕获引物核酸分子，所述捕获引物核酸分子包括封闭的捕获引物核酸分子。
图3C示意性地示出了根据本发明的实施方案，在使待富集和消耗的样品核酸分子解链之后的图3B的样品溶液。
图3D示意性地示出了根据本发明的实施方案，在使捕获引物核酸分子与待消耗的核酸分子的靶序列退火之后的图3C的样品溶液。
图3E示意性地示出了根据本发明的实施方案，在酶促延伸与靶序列退火的捕获引物核酸分子之后的图3D的样品溶液。
图3F示意性地示出了根据本发明的实施方案，在酶促降解样品溶液中的双链样品核酸分子之后的图3E的样品溶液。
图3G示意性地示出了根据本发明的实施方案，使图2F的样品溶液的样品核酸分子解链。
图3H示意性地示出了根据本发明的实施方案，在去除捕获引物核酸分子之后的图3G的样品溶液。
图3I示意性地示出了根据本发明的实施方案的图3H的样品溶液，所述样品溶液还包含与样品溶液中的样品核酸分子的通用衔接子序列互补的PCR引物。
图3J示意性地示出了根据本发明的实施方案，在PCR扩增样品溶液的样品核酸分子之后的图3I的样品溶液。
图4示意性地示出了结合到Hygro的根据本发明的实施方案的捕获引物核酸分子。
图5示意性地示出了结合到AmpR的根据本发明的实施方案的捕获引物核酸分子。
图6示意性地示出了结合到AmpR的根据本发明的实施方案的捕获引物核酸分子，其包含通用衔接子序列，所述通用衔接子序列包含聚T序列。
图7示意性地示出了结合到Hygro的根据本发明的实施方案的捕获引物核酸分子，所述分子包含通用衔接子序列，所述通用衔接子序列包含聚T序列。
图8是根据本发明的实施方案的显示电泳实验结果的电泳凝胶的图像，该电泳实验显示包含靶序列的样品核酸分子的富集。
详述
本发明提供了用于富集靶核酸序列，如包含所述靶核酸序列的核酸分子的试剂盒和方法，和用于消耗靶核酸序列，如包含靶核酸序列的核酸分子的试剂盒和方法。
如本文所用，术语“核酸”和“多核苷酸”是指由被称为“核苷酸”的单体单元组成的生物聚合物。通常，每个核苷酸由5-碳糖、磷酸酯基团和含氮碱基(也称为“核碱基”)组成。糖组分的结构通常限定核酸聚合物的类型。核苷酸单体连接形成核酸聚合物的线性序列。本发明涵盖的核酸可以包括脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、cDNA或本领域已知的合成核酸，例如肽核酸(PNA)、甘油核酸(GNA)、苏糖核酸(TNA)、锁核酸(LNA)或其他具有核苷酸侧链的合成聚合物，或其任意组合。核酸分子可以是单链或双链的(具有通过单个核碱基的碱基配对杂交的互补的单链多核苷酸链)。通常，cDNA、RNA、GNA、TNA或LNA是单链的。DNA可以是双链的(dsDNA)或单链的(ssDNA)。
核酸的核苷酸亚单元可以是天然存在的、人工的或修饰的。如上所述，核苷酸通常包含核碱基、糖和至少一个磷酸酯基团。核碱基通常是杂环的。合适的核碱基包括经典的嘌呤和嘧啶，更具体为腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)(或通常在RNA中是尿嘧啶(U)而不是胸腺嘧啶(T))和胞嘧啶(C)。所述糖通常是戊糖。合适的糖包括但不限于核糖和脱氧核糖。核苷酸通常是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。核苷酸通常包含单磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯。这些在本文中通常被称为核苷酸或核苷酸残基以表示该亚单元。在没有特定标识的情况下，术语核苷酸、核苷酸残基等并不旨在暗示任何特定的结构或属性。如上所述，本发明的核酸还可以包括DNA或RNA的合成变体。“合成变体”涵盖掺入了天然核苷酸/核碱基的已知类似物的核酸，其可以以类似于天然存在的核苷酸的方式与核酸杂交。示例性的合成变体包括肽核酸(PNA)、硫代磷酸DNA、锁核酸等。修饰的或合成的核碱基和类似物可以包括但不限于5-Br-UTP、5-Br-dUTP、5-F-UTP、5-F-dUTP、5-丙炔基dCTP、5-丙炔基-dUTP、二氨基嘌呤、S2T、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫尿苷、5-羧基甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基辫苷(galactosylqueosine)、肌苷、N6-异戊烯腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基辫苷、5′-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-D46-异戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、怀丁氧苷(wybutoxosine)、假尿嘧啶、辫苷、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶、(acp3)w、2，6--二-氨基嘌呤等。本领域普通技术人员可以容易地确定对于每个修饰的核碱基什么碱基配对被认为是碱基对匹配，什么碱基配对被认为是碱基对错配。
方法
一方面，本发明提供了用于富集和/或消耗靶核酸序列的方法，所述靶核酸序列如存在于复杂样品溶液中的样品核酸上的靶核酸序列，所述复杂样品溶液包含样品核酸分子，所述样品核酸分子不包含靶核酸序列。
富集方法
在实施方案中，本发明提供了用于富集靶核酸序列的方法。在实施方案中，用于富集靶核酸序列的方法包括(a)向包含多个样品核酸分子的样品溶液中引入与所述多个样品核酸分子中的一个或多个样品核酸分子的靶核酸序列互补或部分互补的捕获引物核酸分子，所述样品核酸分子各自包含通用衔接子核酸序列；(b)酶促延伸与所述一个或多个样品核酸分子的靶核酸序列退火的捕获引物核酸分子；和(c)酶促降解单链样品核酸分子，以提供比所述样品溶液具有更高比例的包含靶核酸序列的样品核酸分子的富集的样品溶液。
现在将描述根据本发明的实施方案的富集靶核酸序列的方法。在这方面，注意力指向图1A-1J，其示意性地示出了根据本发明的实施方案的富集靶核酸序列的方法。
图1A示意性地示出了样品溶液，所述样品溶液包含待富集的核酸分子和待消耗的核酸分子。如图所示，样品溶液包含核酸分子的起始库，所述核酸分子的起始库包含用于富集的双链核酸分子和用于消耗的双链核酸分子。虽然样品核酸分子显示为双链，但是在实施方案中，样品核酸分子包含单链样品核酸分子或单链和双链样品核酸分子的组合。用于富集的双链核酸分子显示包含通用衔接子核酸序列a、a*、b和b*，和靶核酸序列c和c*。用于消耗的双链核酸分子显示包含通用衔接子核酸序列a、a*、b和b*，以及不同于靶核酸序列c和c*的核酸序列d和d*。在用于富集和用于消耗的样品核酸分子二者上的通用衔接子核酸序列a、a*、b和b*显示包含共同特征，在此作为椭圆形示意性示出。如本文关于图1F所进一步讨论的，这样的共同特征适合用于在某些条件下，例如在通用衔接子核酸序列是单链的情况下的酶促降解。
本发明的方法适合于富集许多包含核酸分子的样品溶液。在实施方案中，所述样品溶液选自WGS文库、WES文库、ATAC-seq文库、ChIP-seq文库、WTS文库、Bisulfite-seq文库、RNA-seq文库、单细胞RNA-seq文库、DNA数据存储文库或在两个末端具有通用衔接子的任何其他文库。DNA分子的混合物可以是预先扩增的或未扩增的、酶促产生或化学合成的。通用衔接子(结构域a和结构域b*)可以包含DNA和/或RNA核苷酸。如本文进一步讨论的，至少一种核糖核苷酸可以是鸟嘌呤。在实施方案中，通用衔接子核酸序列存在于文库中的所有或基本上所有核酸分子上。
在实施方案中，样品溶液包含双链或单链样品核酸分子，如来自WGS文库、WES文库、ATAC-seq文库、CHIP-seq文库、WTS文库、Bisulfite-seq文库、RNA-seq文库等的双链或单链样品核酸分子，其包含配置成防止或限制自退火和延伸的3’修饰。在实施方案中，这样的3’修饰包括双脱氧核苷酸(ddNTP)、反向3’dT或降低结合能的核苷酸序列(例如腺嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶)。在一个实施方案中，起始样品溶液包含双链样品核酸分子，如WGS文库、WES文库、ATAC-seq文库、CHIP-seq文库、WTS文库、Bisulfite-seq文库、RNA-seq文库等，其通过使用在5’末端包含聚T或聚A突出端的PCR引物产生。
在实施方案中，通用衔接子核酸序列通过PCR、转座、逆转录、连接、化学合成或其他已知的向DNA序列添加衔接子的方法添加，例如本文关于本发明的试剂盒进一步讨论的。
在实施方案中，通用衔接子核酸序列包括与3’末端或5’末端相邻的核酸序列，该核酸序列被配置成不与其自身结合，例如为发夹构型，从而避免自引发。在实施方案中，通用衔接子核酸分子包含聚T序列、聚A序列或其组合。参见例如图6和7。
在实施方案中，样品溶液中的核苷酸包括核糖核苷酸或脱氧核苷酸。在实施方案中，这样的核苷酸包括选自锁核酸、肽核酸、2’-O-甲基RNA、2’-O：-甲氧基乙基RNA、硫代磷酸酯修饰的核酸等的核苷酸。因此，在实施方案中，本文中进一步讨论的降解酶，例如RNA酶T1，被能够选择性地切割单链构象的修饰的核糖核苷酸或脱氧核苷酸的降解酶代替。
如上，在实施方案中，所述方法包括向样品溶液中引入一个或多个捕获引物核酸分子，所述捕获引物核酸分子与多个样品核酸分子中的一个或多个样品核酸分子的靶核酸序列互补或部分互补。图1B示意性地示出了根据本发明的实施方案的图1A的样品溶液，其还包含捕获引物核酸分子c’。
如上，捕获引物核酸分子与靶核酸序列互补或部分互补。在实施方案中，捕获引物核酸分子与靶核酸序列部分互补。在实施方案中，捕获引物核酸分子包含不与靶核酸序列互补的多个碱基，例如在1至5个的范围内。在实施方案中，捕获引物核酸分子与靶核酸序列大于或等于90％互补。然而，例如根据本文所述的退火温度和/或其他反应条件，将这样的部分互补的捕获引物核酸分子配置成与靶核酸序列结合。
在实施方案中，所述方法包括使样品溶液的温度保持在所述多个样品核酸分子的解链温度或以上。图1C示意性地示出了根据本发明的实施方案，在使待富集和消耗的核酸分子解链之后的图1B的样品溶液。在实施方案中，解链温度大于或等于95℃。在多个样品核酸分子的解链温度下，样品溶液的温度足以完全或部分破坏样品核酸分子之间的沃森-克里克键，从而增加样品溶液中的单链或部分单链样品核酸的数量。如图所示，这样的解链使靶核酸序列c和c*以及核酸序列d和d*暴露，以与其他核酸序列如捕获引物核酸分子c’结合。
在实施方案中，所述方法包括使样品溶液保持在捕获引物核酸分子的退火温度附近或以下，所述退火温度适合使捕获引物核酸分子与靶核酸序列退火。这样的退火温度通常适合使捕获引物核酸分子的至少部分与靶核酸序列退火。在实施方案中，退火温度在约50℃至约72℃的范围内。图1D示意性地示出了根据本发明的实施方案，在使捕获引物核酸分子c’与待富集的核酸分子的靶序列c*退火之后的图1C的样品溶液。在所示出的实施方案中，捕获引物核酸分子c’中的一个与待富集的样品核酸分子的靶核酸序列c*结合。
在实施方案中，捕获引物核酸分子被配置成在退火温度下主要是单链的。在这方面，捕获引物核酸分子在退火温度下在大多数时间是单链的，因此被配置成在大多数时间结合于靶核酸序列。在实施方案中，捕获引物核酸分子被配置成在退火温度下主要是至少部分双链的。在这方面，捕获引物核酸分子的构型适合于在退火温度下在大多数时间不结合于靶核酸序列。因此，这样的双链捕获引物核酸分子与靶核酸序列的结合通常比单链捕获引物核酸分子具有更高的选择性。
在实施方案中，捕获引物核酸分子还包含与第一捕获引物核酸分子互补或部分互补的第二捕获引物核酸分子。这样的双链捕获引物核酸分子通常在退火温度下是双链的，因此，较不经常地被配置成结合于靶核酸序列。在这方面，这样的双链捕获引物核酸分子被配置成选择性更高地结合于靶核酸序列。
在实施方案中，捕获引物核酸分子与多个样品核酸分子中的一个或多个第二样品核酸分子的第二靶核酸序列互补或部分互补，其中第二靶核酸序列不同于所述靶核酸序列。在这方面，通过使样品溶液保持在捕获引物核酸分子的退火温度或附近，可以使捕获引物核酸分子与各个靶核酸序列结合。如本文关于图1E和1F所进一步讨论的，可以使包含与捕获引物核酸分子互补或部分互补的各个靶序列的样品核酸分子酶促延伸并保护其免于降解。
在实施方案中，捕获引物核酸分子包含硫代磷酸酯键。在实施方案中，硫代磷酸酯键设置在捕获引物核酸分子的3’末端处的碱基以及与所述3’末端处的碱基紧邻的碱基之间。这样的硫代磷酸酯键被配置成抵抗3’核酸外切酶活性，例如在校对聚合酶中存在的那些。
如上，样品核酸分子包含通用衔接子核酸序列。在实施方案中，多个样品核酸分子的通用衔接子核酸序列包含衔接子标签核酸序列。在实施方案中，衔接子标签核酸序列限定独特的核酸序列。这样的独特序列可以用于确定样品核酸分子的来源，例如细胞、组织或悬液的来源，其中这样的独特核酸序列具有与用于标记其他样品中，如其他细胞、组织或细胞悬液中的样品核酸分子的另一个衔接子标签核酸序列不同的序列。
这样的衔接子标签核酸序列适合于例如通过对样品溶液测序来计数样品中的多个核酸分子。在实施方案中，每个衔接子标签核酸分子包含适合于在核酸扩增反应之后对扩增的样品核酸分子计数的许多简并碱基。
在实施方案中，捕获引物核酸分子和第二靶核酸序列的退火温度相对接近捕获引物核酸分子和靶核酸序列的退火温度，从而通过使样品溶液保持在捕获引物核酸分子和靶核酸序列的退火温度下，使至少一些捕获引物核酸分子与第二靶核酸序列结合。因此，在实施方案中，捕获引物核酸分子和第二靶核酸序列具有在退火温度的约1℃至约5℃的范围内的第二退火温度。
在实施方案中，使样品溶液保持在接近但不一定精确地处于退火温度的温度。在这方面，捕获引物核酸分子的结合特异性是变化的，从而允许捕获引物核酸分子结合于例如具有相对相似的序列的许多靶核酸序列，并因此富集许多不同的样品核酸分子。因此，在实施方案中，使样品溶液保持在捕获引物核酸分子的退火温度附近或以下包括使样品溶液保持在捕获引物核酸分子的退火温度的约1℃至约5℃的范围内的温度。
如上，在实施方案中，本发明的方法包括酶促延伸与一个或多个样品核酸分子的靶核酸序列退火的捕获引物核酸分子。在实施方案中，酶促延伸捕获引物核酸分子包括将延伸酶引入样品溶液中，所述延伸酶被配置成延伸与所述靶核酸序列退火的捕获引物核酸分子。图1E示意性地示出了根据本发明的实施方案，在酶促延伸与靶序列c*退火的捕获引物核酸分子c’之后的图1D的样品溶液。如图所示，与所述靶核酸序列c*退火的核酸序列显示延伸以另外与通用衔接子核酸序列b*结合。如本文进一步讨论的，通过与通用衔接子核酸序列结合，延伸的捕获引物核酸分子抑制了双链样品核酸分子的酶促降解。
延伸酶可以包括被配置成酶促延伸与另一核酸分子退火的捕获引物核酸分子的任何酶。在实施方案中，延伸酶选自聚合酶、逆转录酶及其组合。
在实施方案中，酶促延伸捕获引物核酸分子包括使样品溶液保持在延伸酶的延伸温度附近，所述延伸温度适合通过延伸酶酶促延伸与靶核酸序列退火的捕获引物核酸分子。这样的延伸温度可以与退火温度相同或不同。在实施方案中，延伸温度在约68℃至约72℃的范围内。
本发明的方法包括酶促降解样品溶液中的特定核酸分子以提供富集的样品溶液，所述富集的样品溶液具有比所述样品溶液更高比例的包含靶核酸序列的样品核酸分子。在实施方案中，这样的酶促降解包括酶促降解单链样品核酸分子。如以上关于图1D和1E所讨论的，包含与捕获引物核酸分子互补或部分互补的核酸序列的样品核酸分子通常可以是双链的。在这方面，通过酶促降解单链核酸分子，例如结合其他步骤，例如扩增完整的样品核酸分子的步骤，使样品溶液富集了包含靶核酸序列的这样的核酸分子。
在实施方案中，酶促降解单链样品核酸分子包括向样品溶液中引入降解酶，所述降解酶配置成降解包含通用衔接子核酸序列的单链核酸分子。在实施方案中，在酶促延伸所述捕获引物核酸分子之后，将所述降解酶引入样品溶液。在实施方案中，其中在酶促延伸所述捕获引物核酸分子之前，将所述降解酶引入样品溶液。在这样的实施方案中，降解酶在例如延伸温度下可以没有活性，因此，在延伸温度下不降解或基本上不降解单链核酸分子。相反，在实施方案中，所述降解酶在低于延伸温度的温度下是有活性的。
在实施方案中，酶促降解单链样品核酸分子包括使样品溶液的温度保持在降解酶的降解温度。在实施方案中，所述降解温度在所述退火温度以下。在实施方案中，所述降解温度在所述延伸温度以下。在实施方案中，所述降解温度小于或等于约60℃。
在实施方案中，所述降解温度是所述降解酶的活性温度。因此，通过使样品溶液保持在降解温度或附近，所述降解酶是有活性的，如在降解单链核酸分子方面有活性。在实施方案中，所述降解酶在选自延伸温度、解链温度、退火温度及其组合的温度下是无活性的。在这方面，例如在酶促延伸与靶核酸序列退火的捕获引物核酸分子之前，降解酶不酶促降解或基本上不酶促降解样品溶液中的单链核酸分子。
在实施方案中，所述降解酶在降解温度以上的温度，如延伸温度下无活性之后，在降解温度下有活性。在这方面，在实施方案中，所述降解酶被配置成在降解温度以上的温度下无活性之后优先或选择性地降解样品核酸分子，如单链样品核酸分子。不希望受理论的束缚，认为降解酶在活性温度以上是无活性的，例如当降解酶呈现无活性构象时，并且当降解酶在样品溶液的温度保持在活性范围内时呈活性构型时，降解进一步变得有活性。
在实施方案中，酶促降解单链样品核酸分子包括降解设置在单链样品核酸分子上的通用衔接子核酸序列的部分。图1F示意性地示出了根据本发明的实施方案，在酶促降解单链样品核酸分子之后的图1E的样品溶液。在示出的实施方案中，降解酶显示已酶促降解包含通用衔接子序列b*的单链核酸分子的部分，之前包括通用衔接子核酸序列的靶部分(在此示出为椭圆形)。这与双链样品核酸相反，该双链样品核酸包含靶核酸序列c*并且已经通过延伸酶进行酶促延伸。在这方面，双链样品核酸显示具有完整的通用衔接子核酸序列b*。
在实施方案中，通用衔接子核酸序列是完全单链的。在这方面，通用衔接子核酸序列不与其他核酸序列，例如在分开的核酸分子上的核酸序列碱基配对。在实施方案中，通用衔接子核酸序列仅是部分单链的。在实施方案中，通用衔接子核酸序列在被配置成当单链时被降解酶酶促降解的一个或多个核苷酸处是单链的。
单链样品核酸分子的酶促降解可以包括多种形式的降解，所述降解形式被配置成例如使降解的样品核酸不适合核酸扩增反应，例如包含通用衔接子核酸分子的那些。在实施方案中，酶促降解单链样品核酸分子包括切割单链样品核酸分子的通用衔接子核酸分子的骨架。在实施方案中，酶促降解单链样品核酸分子包括消化所述单链样品核酸分子的通用衔接子核酸分子的部分。
如上，在实施方案中，所述降解酶被配置成酶促降解单链核酸分子，如单链样品核酸分子。在实施方案中，所述降解酶是核糖核酸酶。在实施方案中，所述降解酶是核酸内切酶。在实施方案中，所述核酸内切酶是核糖核酸内切酶。在实施方案中，核糖核酸内切酶选自RNA酶T1、RNA酶A及其组合。
在实施方案中，所述降解酶是RNA酶T1。在实施方案中，所述降解酶对应于SEQ IDNO.14。在实施方案中，降解酶与SEQ ID NO.14的序列同源性大于90％、大于95％或大于99％。在实施方案中，通用衔接子核酸序列包含核糖鸟嘌呤。在实施方案中，通用衔接子核酸序列包含多个核糖鸟嘌呤。RNA酶T1选择性降解单链核糖鸟嘌呤，因此，在通用衔接子核酸序列包含一个或多个核糖鸟嘌呤的情况下，RNA酶T1降解酶被配置成例如当样品溶液保持在RNA酶T1的活性温度时降解通用衔接子核酸序列。
在实施方案中，所述降解酶是RNA酶A。在实施方案中，所述降解酶对应于SEQ IDNO.15。在实施方案中，降解酶与SEQ ID NO.15的序列同源性大于90％、大于95％或大于99％。在实施方案中，通用衔接子核酸序列包含选自核糖胞嘧啶、核糖尿嘧啶及其组合的碱基。在实施方案中，通用衔接子核酸序列包含多个核糖胞嘧啶、多个核糖尿嘧啶及其组合。RNA酶A选择性降解单链核糖胞嘧啶和核糖尿嘧啶(例如在盐浓度高于300mM时)，因此，在通用衔接子核酸序列包含一个或多个核糖胞嘧啶和/或核糖尿嘧啶的情况下，RNA酶A降解酶被配置成例如当样品溶液保持在RNA酶A的活性温度时降解通用衔接子核酸序列。
在实施方案中，本发明的方法包括重复酶促延伸捕获引物核酸分子和酶促降解单链样品核酸分子。通过重复酶促延伸和酶促降解，延伸酶、捕获引物核酸分子和降解酶可以被使用额外的一次或多次，以选择性降解不包含靶核酸序列的样品核酸分子。如上，在实施方案中，这样的降解包括降解通用衔接子核酸序列，所述通用衔接子核酸序列可以随后用于核酸扩增反应中。如本文关于图1I和1J进一步讨论的，包含完整的通用衔接子核酸序列的序列被优先富集。
在实施方案中，所述方法还包括例如在酶促延伸捕获引物核酸分子和酶促降解单链样品核酸分子之后，使样品溶液的温度保持在多个样品核酸分子和捕获引物核酸分子的解链温度或以上。在这方面，包含具有酶促降解的或完整的通用衔接子核酸序列的样品核酸分子的样品溶液是单链的，因此被配置用于进一步酶促延伸和降解。图1G示意性地示出了根据本发明的实施方案，使图1F的样品溶液的核酸分子解链。
在实施方案中，本发明的方法包括纯化富集的样品溶液中的多个样品核酸分子。图1H示意性地示出了根据本发明的实施方案，在去除捕获引物核酸分子之后的图1G的样品溶液。这样的纯化可以包括例如，用SPRI珠等的纯化。在实施方案中，纯化富集的样品溶液中的多个样品核酸分子包括从富集的样品溶液中去除选自捕获引物核酸分子、酶及其组合的试剂。样品溶液的这样的纯化可以例如通过减少样品溶液中存在的核酸分子数量来简化基于样品溶液的测序数据，从而减少基于样品溶液的测序数据量，特别是减少与靶核酸序列无关的测序数据量。
在实施方案中，本发明的方法包括在单链核酸分子酶促降解之后扩增样品核酸分子。因此，在实施方案中，该方法包括将多个扩增引物核酸分子引入富集的样品溶液中。在实施方案中，多个扩增引物核酸分子中的扩增引物核酸分子与通用衔接子核酸序列互补。图1I示意性地示出了图1H的样品溶液，其还包含聚合酶链反应(PCR)引物a*和b。如图所示，根据本发明的实施方案，PCR引物与样品溶液中的样品核酸分子的通用衔接子序列a*和b互补。
在实施方案中，该方法包括用多个扩增引物核酸分子对富集的样品溶液中的多个样品核酸分子进行核酸扩增反应，以提供扩增的富集的样品溶液。图1J示意性地示出了根据本发明的实施方案，在对样品溶液的样品核酸分子进行PCR扩增之后的图1I的样品溶液。如图所示，与包含核酸序列d和d*的样品核酸分子相比，样品溶液包含更大比例的包含靶序列c和c*的样品核酸分子。
如以上讨论和图1J中所示，因为样品核酸分子的至少一些通用衔接子核酸序列被降解，所以这些降解的样品核酸分子将不参与核酸扩增反应，因此扩增的富集的样品溶液将包含较低比例的这样的样品核酸分子。在这方面，在实施方案中，对富集的样品溶液中的多个样品核酸分子进行核酸扩增反应不扩增或基本上不扩增已经被降解酶降解的样品核酸分子。
在实施方案中，该方法包括对溶液中的扩增的富集的样品进行一个或多个酶促反应以制备用于测序的富集的样品溶液，例如下一代样品制备。因此，在实施方案中，本发明的方法包括对扩增的富集的样品溶液进行反应，所述反应选自核酸片段化反应、酶促末端修复、A加尾、衔接子连接、聚合酶链反应及其组合。
在实施方案中，本发明的方法包括对所述富集的样品溶液中的核酸分子测序。在实施方案中，对所述富集的样品溶液中的核酸分子测序包括基于所述富集的样品溶液中的所述多个样品核酸分子生成样品核酸信息。如上，在某些实施方案中，通用衔接子核酸分子包含衔接子标签核酸分子。在实施方案中，对所述富集的样品溶液中的核酸分子测序包括基于衔接子标签核酸序列生成衔接子标签核酸序列信息。
消耗方法
在实施方案中，本发明提供了用于消耗靶核酸序列的方法。在实施方案中，所述方法包括(a)向包含多个样品核酸分子的样品溶液中引入与所述多个样品核酸分子中的一个或多个样品核酸分子的靶核酸序列互补或部分互补的捕获引物核酸分子，所述样品核酸分子各自包含通用衔接子核酸序列，所述通用衔接子核酸序列包含核糖核苷酸；(b)酶促延伸与所述一个或多个样品核酸分子的靶核酸序列退火的捕获引物核酸分子；和(c)酶促切割所述样品核酸分子的双链核糖核酸分子，以提供比所述样品溶液具有更低比例的包含靶核酸序列的样品核酸分子的消耗的样品溶液。
现在将描述根据本发明的实施方案的消耗靶核酸序列的方法。在这方面，注意力转向图2A-2J，其示意性地示出了根据本发明的实施方案的消耗靶核酸序列的方法。
图2A示意性地示出了样品溶液，所述样品溶液包含待富集的核酸分子和待消耗的核酸分子。如图所示，样品溶液包含核酸分子的起始库，所述核酸分子的起始库包含用于富集的双链核酸分子和用于消耗的双链核酸分子。用于富集的双链核酸分子显示包含通用衔接子核酸序列a、a*、b和b*，和靶核酸序列c和c*。用于消耗的双链核酸分子显示包含通用衔接子核酸序列a、a*、b和b*，以及不同于核酸序列c和c*的靶核酸序列d和d*。在用于富集和用于消耗的样品核酸分子二者上的通用衔接子核酸序列a、a*、b和b*显示包含共同特征，在此以椭圆形示意性示出。如本文关于图2F所进一步讨论的，这样的共同特征适用于在某些条件下，例如在通用衔接子核酸序列是双链的情况下的酶促降解。
本发明的方法适合于富集许多包含核酸分子的样品溶液。在实施方案中，所述样品溶液选自WGS文库、WES文库、ATAC-seq文库、ChIP-seq文库、WTS文库、Bisulfite-seq文库、RNA-seq文库、单细胞RNA-seq文库、DNA数据存储文库或在两个末端具有通用衔接子的任何其他文库。DNA分子的混合物可以是预先扩增的或未扩增的、酶促产生或化学合成的。通用衔接子(结构域a和结构域b*)可以包含DNA和/或RNA核苷酸。如本文进一步讨论的，至少一种核糖核苷酸可以是鸟嘌呤。在实施方案中，通用衔接子核酸序列存在于文库中的所有或基本上所有核酸分子上。
在实施方案中，样品溶液包含双链或单链样品核酸分子，如来自WGS文库、WES文库、ATAC-seq文库、CHIP-seq文库、WTS文库、Bisulfite-seq文库、RNA-seq文库等的双链或单链样品核酸分子，其包含配置成防止或限制自退火和延伸的3’修饰。在实施方案中，这样的3’修饰包括双脱氧核苷酸(ddNTP)、反向3’dT或降低结合能的核苷酸序列(例如腺嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶)。在一个实施方案中，起始样品溶液包含双链样品核酸分子，如WGS文库、WES文库、ATAC-seq文库、CHIP-seq文库、WTS文库、Bisulfite-seq文库、RNA-seq文库等，其通过使用在5’末端包含聚T或聚A突出端的PCR引物产生。
在实施方案中，通用衔接子核酸序列通过PCR、转座、逆转录、连接、化学合成或其他已知的向DNA序列添加衔接子的方法添加，例如本文关于本发明的试剂盒进一步讨论的。
在实施方案中，通用衔接子核酸序列包括与3’末端或5’末端相邻的核酸序列，该核酸序列被配置成不与其自身结合，例如为发夹构型，从而避免自引发。在实施方案中，通用衔接子核酸分子包含聚T序列、聚A序列或其组合。参见例如图6和7。
在实施方案中，样品溶液中的核苷酸包括核糖核苷酸或脱氧核苷酸。在实施方案中，这样的核苷酸包括选自锁核酸、肽核酸、2’-O-甲基RNA、2’-O：-甲氧基乙基RNA、硫代磷酸酯修饰的核酸等的核苷酸。因此，在实施方案中，降解酶，例如RNA酶HII，被配置成选择性地切割双链构象的修饰的核糖核苷酸或脱氧核苷酸的降解酶代替。在实施方案中，样品核酸分子包括甲基化的DNA，并且降解酶包括特异性切割甲基化的(或半甲基化的)双链DNA的限制酶。
如上所述，在实施方案中，该方法包括向样品溶液中引入一个或多个捕获引物核酸分子，所述捕获引物核酸分子与多个样品核酸分子中的一个或多个样品核酸分子的靶核酸序列互补或部分互补。图2B示意性地示出了根据本发明的实施方案的图2A的样品溶液，其还包含捕获引物核酸分子d’1和d’2*。如图所示，捕获引物核酸分子d’1和d’2*与用于消耗的样品核酸分子上的靶核酸序列d*和d互补或部分互补，而不与用于富集的样品核酸分子上的靶核酸序列d*和d互补或部分互补。
在实施方案中，捕获引物核酸分子与靶核酸序列互补或部分互补。在实施方案中，捕获引物核酸分子与通用衔接子核酸序列部分互补。在实施方案中，捕获引物核酸分子包含不与通用衔接子核酸序列互补的许多碱基，例如在1至5个的范围内。在实施方案中，捕获引物核酸分子与通用衔接子序列大于或等于90％互补。然而，例如根据本文所述的退火温度和/或其他反应条件，将这样的部分互补的捕获引物核酸分子配置成与靶核酸序列结合。
在实施方案中，该方法包括使样品溶液的温度保持在所述多个样品核酸分子的解链温度或以上。图2C示意性地示出了根据本发明的实施方案，在使待富集和消耗的样品核酸分子解链之后的图2B的样品溶液。在实施方案中，解链温度大于或等于95℃。在多个样品核酸分子的解链温度下，样品溶液的温度足以完全或部分破坏样品核酸分子之间的沃森-克里克键，从而增加样品溶液中的单链或部分单链样品核酸的数量。如图所示，这样的解链使靶核酸序列d和d*以及核酸序列c和c*暴露，以与其他核酸序列如捕获引物核酸分子d’1和d’2*结合。
在实施方案中，该方法包括使样品溶液保持在捕获引物核酸分子的退火温度附近或以下，所述退火温度适合使捕获引物核酸分子与靶核酸序列退火。这样的退火温度通常适合使捕获引物核酸分子的至少部分与靶核酸序列退火。在实施方案中，退火温度在约50℃至约72℃的范围内。图2D示意性地示出了根据本发明的实施方案，在使捕获引物核酸分子d’1和d’2*与待消耗的样品核酸分子的靶序列d*和d退火之后的图2C的样品溶液。在所示出的实施方案中，捕获引物核酸分子d’1和d’2*与待消耗的样品核酸分子的靶核酸序列d*和d结合。
在实施方案中，捕获引物核酸分子被配置成在退火温度下主要是单链的。在这方面，捕获引物核酸分子在退火温度下在大多数时间是单链的，因此被配置成在大多数时间结合于靶核酸序列。在实施方案中，捕获引物核酸分子被配置成在退火温度下主要是至少部分双链的。在这方面，捕获引物核酸分子的构型适合于在退火温度下在大多数时间不结合于靶核酸序列。因此，这样的双链捕获引物核酸分子与靶核酸序列的结合通常比单链捕获引物核酸分子具有更高的选择性。
在实施方案中，捕获引物核酸分子还包含与第一捕获引物核酸分子互补或部分互补的第二捕获引物核酸分子。这样的双链捕获引物核酸分子通常在退火温度下是双链的，因此，较少地被配置成结合于靶核酸序列。在这方面，这样的双链捕获引物核酸分子被配置成选择性更高地结合于靶核酸序列。
在实施方案中，捕获引物核酸分子与多个样品核酸分子中的一个或多个第二样品核酸分子的第二靶核酸序列互补或部分互补，其中第二靶核酸序列不同于所述靶核酸序列。在这方面，通过使样品溶液保持在捕获引物核酸分子的退火温度或附近，可以使捕获引物核酸分子与各种靶核酸序列结合。如本文关于图2E和2F所进一步讨论的，可以使包含与捕获引物核酸分子互补或部分互补的各种靶序列的样品核酸分子酶促延伸并标记用于降解。
在实施方案中，捕获引物核酸分子包含硫代磷酸酯键。在实施方案中，硫代磷酸酯键设置在捕获引物核酸分子的3’末端处的碱基以及与所述3’末端处的碱基紧邻的碱基之间。这样的硫代磷酸酯键被配置成抵抗3’核酸外切酶活性，例如在校对聚合酶中存在的那些。
如上，样品核酸分子包含通用衔接子核酸序列。在实施方案中，多个样品核酸分子的通用衔接子核酸序列包含衔接子标签核酸序列。在实施方案中，衔接子标签核酸序列限定独特的核酸序列。这样的独特序列可以用于确定样品核酸分子的来源，例如细胞、组织或悬液的来源，其中这样的独特核酸序列具有与用于标记其他样品中，如其他细胞、组织或细胞悬液中的样品核酸分子的另一个衔接子标签核酸序列不同的序列。
这样的衔接子标签核酸序列适合于例如通过对样品溶液测序来计数样品中的多个核酸分子。在实施方案中，每个衔接子标签核酸分子包含适合于在核酸扩增反应之后对扩增的样品核酸分子计数的许多简并碱基。
在实施方案中，捕获引物核酸分子和第二靶核酸序列的退火温度相对接近捕获引物核酸分子和靶核酸序列的退火温度，从而通过使样品溶液保持在捕获引物核酸分子和靶核酸序列的退火温度下，使至少一些捕获引物核酸分子与第二靶核酸序列结合。因此，在实施方案中，捕获引物核酸分子和第二靶核酸序列具有在退火温度的约1℃至约5℃的范围内的第二退火温度。
在实施方案中，使样品溶液保持在接近但不一定精确地处于退火温度的温度。在这方面，捕获引物核酸分子的结合特异性是变化的，从而允许捕获引物核酸分子结合于例如具有相对相似的序列的许多靶核酸序列，并因此消耗许多不同的样品核酸分子。因此，在实施方案中，使样品溶液保持在捕获引物核酸分子的退火温度附近或以下包括使样品溶液保持在捕获引物核酸分子的退火温度的约1℃至约5℃的范围内的温度。
如上所述，在实施方案中，该方法包括酶促延伸与一个或多个样品核酸分子的靶核酸序列退火的捕获引物核酸分子。图2E示意性地示出了根据本发明的实施方案，在酶促延伸与靶序列d*和d退火的捕获引物核酸分子d’1和d’2*之后的图2D的样品溶液。如图所示，捕获引物核酸分子d’1和d’2*与待消耗的样品核酸分子上的靶序列d*和d退火。还如图所示，与靶核酸序列d和d*退火的核酸序列显示延伸以另外与通用衔接子核酸序列a和b*结合。如本文进一步讨论的，通过与通用衔接子核酸序列a和b*结合，延伸的捕获引物核酸分子激活了双链样品核酸分子的酶促降解。
延伸酶可以包括被配置成酶促延伸与另一核酸分子退火的捕获引物核酸分子的任何酶。在实施方案中，延伸酶选自聚合酶、逆转录酶及其组合。
在实施方案中，酶促延伸捕获引物核酸分子包括使样品溶液保持在延伸酶的延伸温度附近，所述延伸温度适合通过延伸酶酶促延伸与靶核酸序列退火的捕获引物核酸分子。这样的延伸温度可以与退火温度相同或不同。在实施方案中，退火温度在约50℃至约72℃的范围内。
如上，本实施方案的方法包括酶促切割样品核酸分子的双链核糖核酸分子。图2F示意性地示出了根据本发明的实施方案，在酶促降解双链核酸分子之后的图2E的样品溶液。在示出的实施方案中，与酶促延伸的捕获引物核酸分子结合的通用衔接子核酸序列a和b*被降解。在这方面，捕获引物核酸分子的椭圆形显示被降解。如本文关于图2F进一步讨论的，这样的降解可以包括切割或降解双链样品核酸分子的通用衔接子核酸序列的骨架。
在示出的实施方案中，降解酶显示已酶促降解包含通用衔接子序列a和b*的双链核酸分子的部分，包括通用衔接子核酸序列的靶部分(在此示出为椭圆形)。包含靶核酸序列d和d*的样品核酸分子具有酶促降解的通用衔接子序列a和b*。这与包含核酸序列c和c*的单链样品核酸相反，所述单链样品核酸具有完整的通用衔接子序列。在这方面，单链样品核酸显示具有完整的通用衔接子核酸序列。
双链样品核酸分子的酶促降解可以包括多种形式的降解，所述降解形式被配置成例如使降解的样品核酸不适合核酸扩增反应，例如包含通用衔接子核酸分子的那些。在实施方案中，酶促降解双链样品核酸分子包括切割双链样品核酸分子的通用衔接子核酸分子的骨架。在实施方案中，酶促降解双链样品核酸分子包括降解设置在双链样品核酸分子上的通用衔接子核酸序列的部分。在实施方案中，酶促切割双链样品核酸分子包括切割双链样品核酸分子的通用衔接子核酸序列的骨架。在实施方案中，酶促切割双链样品核酸分子包括消化双链样品核酸分子的通用衔接子核酸序列的部分。
在实施方案中，酶促降解双链样品核酸分子包括使样品溶液的温度保持在降解酶的降解温度。在实施方案中，所述降解温度在所述退火温度以下。在实施方案中，所述降解温度在所述延伸温度以下。在实施方案中，所述降解温度小于或等于约60℃。
在实施方案中，所述降解温度是所述降解酶的活性温度。因此，通过使样品溶液保持在降解温度或附近，所述降解酶是有活性的，如在降解双链核酸分子方面有活性。在实施方案中，所述降解酶在选自延伸温度、解链温度、退火温度及其组合的温度下是无活性的。在这方面，例如在酶促延伸与靶核酸序列退火的捕获引物核酸分子之前，降解酶不酶促降解或基本上不酶促降解样品溶液中的双链核酸分子。
在实施方案中，所述降解酶在降解温度以上的温度，如延伸温度下无活性之后，在降解温度下有活性。在这方面，在实施方案中，所述降解酶被配置成在降解温度以上的温度下无活性之后优先或选择性地降解样品核酸分子，如双链样品核酸分子。不希望受理论的束缚，认为降解酶在活性温度以上是无活性的，例如当降解酶呈现无活性构象时，并且当降解酶在样品溶液的温度保持在活性范围内时呈活性构型时，降解进一步变得有活性。
如上，在实施方案中，所述降解酶被配置成酶促降解双链核酸分子，如双链样品核酸分子。在实施方案中，所述降解酶不是限制性核酸内切酶。在实施方案中，所述降解酶是核糖核酸酶。在实施方案中，所述降解酶是核酸内切酶。在实施方案中，所述核酸内切酶是核糖核酸内切酶。在实施方案中，核糖核酸内切酶选自RNA酶HII、RNA酶H、RNA酶III及其组合。
在实施方案中，所述降解酶是RNA酶HII。在实施方案中，所述降解酶对应于SEQ IDNO.16。在实施方案中，降解酶与SEQ ID NO.16的序列同源性大于90％、大于95％或大于99％。
在实施方案中，所述降解酶是RNA酶H。在实施方案中，所述降解酶对应于SEQ IDNO.17。在实施方案中，降解酶与SEQ ID NO.17的序列同源性大于90％、大于95％或大于99％。
在实施方案中，所述降解酶是RNA酶III。在实施方案中，所述降解酶对应于SEQ IDNO.18。在实施方案中，降解酶与SEQ ID NO.18的序列同源性大于90％、大于95％或大于99％。
在实施方案中，本发明的方法包括重复酶促延伸捕获引物核酸分子和酶促降解双链样品核酸分子。通过重复酶促延伸和酶促降解，延伸酶、捕获引物核酸分子和降解酶可以被使用额外的一次或多次，以选择性降解不包含靶核酸序列的样品核酸分子，如靶序列d和d*。如上，在实施方案中，这样的降解包括降解通用衔接子核酸序列，所述通用衔接子核酸序列可以随后用于核酸扩增反应中。如本文关于图2I和2J进一步讨论的，包含完整的通用衔接子核酸序列的核酸序列被优先富集。因此，通过酶促降解具有靶核酸序列的另外的样品核酸序列，不具有靶核酸序列的样品核酸分子被配置成不参与这样的选择性或优先富集。
在实施方案中，所述方法还包括例如在酶促延伸捕获引物核酸分子和酶促降解双链样品核酸分子之后，使样品溶液的温度保持在多个样品核酸分子和捕获引物核酸分子的解链温度或以上。在这方面，包含具有酶促降解的或完整的通用衔接子核酸序列的样品核酸分子的样品溶液是单链的，因此被配置用于随后与捕获引物核酸分子结合。图2G示意性地示出了根据本发明的实施方案，使图2F的样品溶液的核酸分子解链。
在实施方案中，本发明的方法包括纯化消耗的样品溶液中的多个样品核酸分子。图2H示意性地示出了根据本发明的实施方案，在去除捕获引物核酸分子d’1和d’2*之后的图2G的样品溶液。这样的纯化可以包括例如，用SPRI珠等的纯化。在实施方案中，纯化消耗的样品溶液中的多个样品核酸分子包括从消耗的样品溶液中去除选自捕获引物核酸分子、酶及其组合的试剂。样品溶液的这样的纯化可以例如通过减少样品溶液中存在的核酸分子数量来简化基于样品溶液的测序数据，从而减少基于样品溶液的测序数据量，特别是减少与靶核酸序列无关的测序数据量。
在实施方案中，本发明的方法包括在双链核酸分子酶促降解之后扩增样品核酸分子。因此，在实施方案中，该方法包括将多个扩增引物核酸分子引入消耗的样品溶液中。在实施方案中，多个扩增引物核酸分子中的扩增引物核酸分子与通用衔接子核酸序列互补。图2I示意性地示出了图2H的样品溶液，其还包含聚合酶链反应(PCR)引物a和b*。如图所示，根据本发明的实施方案，PCR引物与样品溶液中的核酸分子的通用衔接子序列a*和b互补。
在实施方案中，该方法包括用多个扩增引物核酸分子对消耗的样品溶液中的多个样品核酸分子进行核酸扩增反应，以提供扩增的消耗的样品溶液。图2J示意性地示出了根据本发明的实施方案，在对样品溶液的核酸分子进行PCR扩增之后的图2I的样品溶液。如图所示，与包含靶核酸序列d和d*的样品核酸分子相比，样品溶液包含更大比例的包含核酸序列c和c*的样品核酸分子。
如以上讨论和图2J中所示，因为样品核酸分子的至少一些通用衔接子核酸序列被降解，所以这些降解的样品核酸分子将不参与核酸扩增反应，因此扩增的消耗的样品溶液将包含较低比例的这样的样品核酸分子。在这方面，在实施方案中，对消耗的样品溶液中的多个样品核酸分子进行核酸扩增反应不扩增或基本上不扩增已经被降解酶降解的样品核酸分子。因此，与图2A所示的原始样品溶液相比，扩增的消耗的样品溶液包含比包含序列d或d*的核酸分子更大比例的包含序列c或c*的核酸分子。
在实施方案中，该方法包括对溶液中的扩增的消耗的样品进行一个或多个酶促反应以制备用于测序的消耗的样品溶液，例如下一代样品制备。因此，在实施方案中，本发明的方法包括对扩增的消耗的样品溶液进行反应，所述反应选自核酸片段化反应、酶促末端修复、A加尾、衔接子连接、聚合酶链反应及其组合。
在实施方案中，本发明的方法包括对所述消耗的样品溶液中的核酸分子测序。在实施方案中，对所述消耗的样品溶液中的核酸分子测序包括基于所述消耗的样品溶液中的多个样品核酸分子生成样品核酸信息。如上，在某些实施方案中，通用衔接子核酸分子包含衔接子标签核酸分子。在实施方案中，对所述消耗的样品溶液中的核酸分子测序包括基于衔接子标签核酸序列生成衔接子标签核酸序列信息。
在实施方案中，捕获引物核酸分子是封闭的捕获引物核酸分子。在这方面，注意力转向图3A-3J，其中示出了根据本发明的实施方案的方法。图3A-3D类似于在本文别处描述的图1A-1D，不同之处在于捕获引物核酸分子包括捕获引物核酸分子d’，其为封闭的捕获引物核酸分子。在这方面，在实施方案中，封闭的捕获引物核酸分子d’被配置成阻断封闭的捕获引物核酸分子d’通过延伸酶在3’末端的酶促延伸。如图所示，样品溶液还包含非封闭的捕获引物核酸分子a。
在实施方案中，封闭的捕获引物核酸分子包括反向核酸。在实施方案中，封闭的捕获引物核酸分子在3’末端包含一个或多个悬突的腺嘌呤或胸腺嘧啶。
如图3E所示，在其中封闭的捕获引物核酸分子与靶核酸序列d*退火的酶促延伸中，延伸酶无法延伸越过封闭的捕获引物核酸分子，而在其他样品核酸分子上，延伸酶已成功跨越其中不包含靶核酸序列d*的整个分子，例如用于富集的样品核酸分子延伸。
如图3F所示，降解酶已经酶促降解了待消耗的样品核酸的单链通用衔接子分子。在这方面，由于随后对样品溶液解链(图3G)、纯化(图3H)和扩增(图3I和3J)，包含靶核酸序列d*的分子被消耗，并且与具有靶核酸序列d和d*的样品核酸分子相比，样品溶液显示具有更高比例的具有序列c和c*的样品核酸分子。因此，样品溶液中具有靶核酸序列的样品核酸分子被消耗。
根据本发明的实施方案，虽然封闭的捕获引物核酸分子显示与配置成降解单链核酸分子的降解酶一起消耗样品核酸分子，但是封闭的捕获引物核酸分子可以与配置成降解双链样品核酸分子的降解酶结合使用，以富集具有与封闭的捕获引物核酸分子互补的靶核酸序列的样品核酸分子。
试剂盒
另一方面，本发明提供了试剂盒，所述试剂盒包含用于富集和/或消耗靶核酸序列的试剂，所述靶核酸序列如存在于复杂样品溶液中的靶核酸序列，所述复杂样品溶液包含核酸分子，所述核酸分子不包含靶核酸序列。
富集试剂盒
在实施方案中，本发明提供了用于富集包含靶核酸序列的样品核酸分子的试剂盒。在实施方案中，所述试剂盒包含与靶序列互补或部分互补的捕获引物核酸分子；和配置成降解单链核酸分子的降解酶。
如上，所述试剂盒包含捕获引物核酸分子。在实施方案中，所述捕获引物核酸分子与靶核酸序列完全互补。在实施方案中，所述捕获引物核酸分子与一个或多个靶核酸分子部分互补。如本文进一步讨论的，所述捕获引物核酸分子可以与许多靶核酸序列至少部分互补，因此，根据本发明的试剂盒所采用的反应条件，本发明的试剂盒被配置成富集具有许多不同靶核酸序列的样品核酸分子。
如本文关于图1D进一步讨论的，例如在捕获引物核酸分子与其靶核酸序列之间的退火温度下，捕获引物核酸分子可以是单链的、至少部分双链的或双链的。
在实施方案中，捕获引物核酸分子包含硫代磷酸酯键。在实施方案中，硫代磷酸酯键设置在捕获引物核酸分子的3’末端处的碱基以及与所述3’末端处的碱基紧邻的碱基之间。这样的硫代磷酸酯键被配置成抵抗3’核酸外切酶活性，例如在校对聚合酶中存在的那些。
在实施方案中，所述试剂盒还包含多个配置成偶联到样品核酸分子的通用衔接子核酸分子。如本文关于本发明的方法进一步讨论的，通用衔接子核酸分子适用于核酸扩增反应。
在实施方案中，通用衔接子核酸分子包含核糖鸟嘌呤，例如其中所述降解酶是RNA酶T1。在实施方案中，通用衔接子核酸分子包含核糖胞嘧啶、核糖尿嘧啶或其组合，例如其中所述降解酶是RNA酶A。
在实施方案中，通用衔接子核酸分子包含与3’末端或5’末端相邻的核酸序列，该核酸序列被配置成不与其自身结合，例如为发夹构型，从而避免自引发。在实施方案中，通用衔接子核酸分子包括聚T序列、聚A序列或其组合。
在实施方案中，试剂盒还包含用于使通用衔接子核酸分子偶联到样品核酸分子的试剂。在实施方案中，试剂盒包含选自以下的试剂：负载有包含通用衔接子核酸分子的寡核苷酸的转座酶；限制性核酸内切酶；包含通用衔接子核酸分子的寡核苷酸或寡核苷酸复合物；包含T7启动子的寡核苷酸或寡核苷酸复合物；针对转录因子的抗体或抗体片段；及其组合。
本实施方案的试剂盒包含降解酶。在实施方案中，降解酶被配置成降解单链核酸分子。在实施方案中，所述降解酶被配置成降解包含通用衔接子核酸分子的单链核酸分子。在实施方案中，所述降解酶是核糖核酸酶。在实施方案中，所述降解酶是核酸内切酶。在实施方案中，所述核酸内切酶是核糖核酸内切酶。在实施方案中，核糖核酸内切酶选自RNA酶T1、RNA酶A及其组合。
在实施方案中，所述降解酶是RNA酶T1。在实施方案中，所述降解酶对应于SEQ IDNO.14。在实施方案中，降解与SEQ ID NO.14的序列同源性大于90％、大于95％或大于99％。在实施方案中，通用衔接子核酸序列包含核糖鸟嘌呤。在实施方案中，通用衔接子核酸序列包含多个核糖鸟嘌呤。RNA酶T1选择性降解单链核糖鸟嘌呤，因此，在通用衔接子核酸序列包含一个或多个核糖鸟嘌呤的情况下，RNA酶T1降解酶被配置成例如当样品溶液保持在RNA酶T1的活性温度时降解通用衔接子核酸序列。
在实施方案中，所述降解酶是RNA酶A。在实施方案中，所述降解酶对应于SEQ IDNO.15。在实施方案中，降解酶与SEQ ID NO.15的序列同源性大于90％、大于95％或大于99％。在实施方案中，通用衔接子核酸序列包含选自核糖胞嘧啶、核糖尿嘧啶及其组合的碱基。在实施方案中，通用衔接子核酸序列包含多个核糖胞嘧啶、多个核糖尿嘧啶及其组合。RNA酶A选择性降解单链核糖胞嘧啶和核糖尿嘧啶(例如在盐浓度高于300mM时)，因此，在通用衔接子核酸序列包含一个或多个核糖胞嘧啶和/或核糖尿嘧啶的情况下，RNA酶A降解酶被配置成例如当样品溶液保持在RNA酶A的活性温度时降解通用衔接子核酸序列。
在实施方案中，所述降解酶在活性温度范围以上对于降解单链核酸分子是无活性的；并且在无活性之后，在活性温度范围内对于降解单链核酸分子是有活性的。如本文进一步讨论的，在实施方案中，所述降解酶在升高的温度下，例如在酶促延伸温度下是无活性的，但是一旦样品溶液的温度在升高后降低，则是有活性的。
在实施方案中，试剂盒还包含延伸酶，所述延伸酶被配置成延伸与靶核酸序列退火的捕获引物核酸分子。在实施方案中，延伸酶选自聚合酶、逆转录酶及其组合。
在实施方案中，试剂盒还包括用于富集靶核酸序列，例如包含样品核酸分子的样品中的靶核酸序列的说明书。在实施方案中，试剂盒包括用于富集包含靶核酸序列的样品核酸分子的说明书。在实施方案中，所述说明书包括：(a)向包含多个样品核酸分子的样品溶液中引入与所述多个样品核酸分子中的一个或多个样品核酸分子的靶核酸序列互补或部分互补的捕获引物核酸分子，所述样品核酸分子各自包含通用衔接子核酸序列；(b)酶促延伸与所述一个或多个样品核酸分子的靶核酸序列退火的捕获引物核酸分子；和(c)酶促降解单链样品核酸分子，以提供比所述样品溶液具有更高比例的包含靶核酸序列的样品核酸分子的富集的样品溶液。在实施方案中，所述说明书还包括对富集的样品溶液重复步骤(b)和(c)一次或多次。在实施方案中，所述说明书还包括使样品溶液的温度保持在多个样品核酸分子和捕获引物核酸分子的解链温度或以上。
在实施方案中，用于酶促延伸捕获引物核酸分子的说明书包括：使样品溶液的温度保持在所述多个样品核酸分子的解链温度或以上；向样品溶液中引入延伸酶，所述延伸酶被配置成延伸与靶核酸序列退火的捕获引物核酸分子；和使样品溶液保持在捕获引物核酸分子的退火温度附近或以下，所述退火温度适合使捕获引物核酸分子与靶核酸序列退火；和使样品溶液保持在延伸酶的延伸温度附近，所述延伸温度适合通过延伸酶酶促延伸与所述靶核酸序列退火的捕获引物核酸分子。
在实施方案中，用于酶促降解单链样品核酸分子的说明书包括：向样品溶液中引入降解酶，所述降解酶配置成降解包含通用衔接子核酸序列的单链核酸分子；和使样品溶液的温度保持在降解酶的降解温度。
在实施方案中，所述说明书还包括使通用衔接子分子偶联到样品溶液中的样品核酸分子的说明。
消耗试剂盒
在实施方案中，本发明提供了用于消耗包含靶核酸序列的样品核酸分子的试剂盒。在实施方案中，所述试剂盒包含与靶序列互补或部分互补的捕获引物核酸分子；和配置成降解双链核酸分子的降解酶。
如上，所述试剂盒包含捕获引物核酸分子。在实施方案中，所述捕获引物核酸分子与靶核酸序列完全互补。在实施方案中，所述捕获引物核酸分子与一个或多个靶核酸分子部分互补。如本文进一步讨论的，所述捕获引物核酸分子可以与许多靶核酸序列至少部分互补，因此，根据本发明的试剂盒所采用的反应条件，本发明的试剂盒被配置成富集具有许多不同靶核酸序列的样品核酸分子。
如本文关于图2D进一步讨论的，例如在捕获引物核酸分子与其靶核酸序列之间的退火温度下，捕获引物核酸分子可以是单链的、至少部分双链的或双链的。
在实施方案中，捕获引物核酸分子包含硫代磷酸酯键。在实施方案中，硫代磷酸酯键设置在捕获引物核酸分子的3’末端处的碱基以及与所述3’末端处的碱基紧邻的碱基之间。这样的硫代磷酸酯键被配置成抵抗3’核酸外切酶活性，例如在校对聚合酶中存在的那些。
在实施方案中，所述试剂盒还包含多个配置成偶联到样品核酸分子的通用衔接子核酸分子。如本文关于本发明的方法进一步讨论的，通用衔接子核酸分子适用于核酸扩增反应。
在实施方案中，通用衔接子核酸分子包含与3’末端或5’末端相邻的核酸序列，该核酸序列被配置成不与其自身结合，例如为发夹构型，从而避免自引发。在实施方案中，通用衔接子核酸分子包括聚T序列、聚A序列或其组合。
在实施方案中，试剂盒还包含用于使通用衔接子核酸分子偶联到样品核酸分子的试剂。在实施方案中，试剂盒包含选自以下的试剂：负载有包含通用衔接子核酸分子的寡核苷酸的转座酶；限制性核酸内切酶；包含通用衔接子核酸分子的寡核苷酸或寡核苷酸复合物；包含T7启动子的寡核苷酸或寡核苷酸复合物；针对转录因子的抗体或抗体片段；及其组合。
本实施方案的试剂盒包含降解酶。在实施方案中，降解酶被配置成切割包含通用衔接子核酸分子的双链核酸分子。在实施方案中，所述降解酶被配置成降解包含通用衔接子核酸分子的双链核酸分子。在实施方案中，所述降解酶是核糖核酸酶。在实施方案中，所述降解酶是核酸内切酶。在实施方案中，所述核酸内切酶是核糖核酸内切酶。在实施方案中，所述降解酶不是限制性核酸内切酶。在实施方案中，所述降解酶是核糖核酸酶。在实施方案中，所述降解酶是核酸内切酶。在实施方案中，所述核酸内切酶是核糖核酸内切酶。在实施方案中，核糖核酸内切酶选自RNA酶HII、RNA酶H、RNA酶III及其组合。
在实施方案中，所述降解酶是RNA酶HII。在实施方案中，所述降解酶对应于SEQ IDNO.16。在实施方案中，降解与SEQ ID NO.16的序列同源性大于90％、大于95％或大于99％。
在实施方案中，所述降解酶是RNA酶H。在实施方案中，所述降解酶对应于SEQ IDNO.17。在实施方案中，降解与SEQ ID NO.17的序列同源性大于90％、大于95％或大于99％。
在实施方案中，所述降解酶是RNA酶III。在实施方案中，所述降解酶对应于SEQ IDNO.18。在实施方案中，降解与SEQ ID NO.18的序列同源性大于90％、大于95％或大于99％。
在实施方案中，试剂盒还包含延伸酶，所述延伸酶被配置成延伸与靶核酸序列退火的捕获引物核酸分子。在实施方案中，延伸酶选自聚合酶、逆转录酶及其组合。
在实施方案中，试剂盒还包括用于消耗靶核酸序列，例如包含样品核酸分子的样品中的靶核酸序列的说明书。在实施方案中，说明书包括用于进行本发明的消耗方法的说明。在实施方案中，所述说明书包括：(a)向包含多个样品核酸分子的样品溶液中引入与所述多个样品核酸分子中的一个或多个样品核酸分子的靶核酸序列互补或部分互补的捕获引物核酸分子，所述样品核酸分子各自包含通用衔接子核酸序列，所述通用衔接子核酸序列包含核糖核苷酸；(b)酶促延伸与所述一个或多个样品核酸分子的靶核酸序列退火的捕获引物核酸分子；和(c)酶促切割样品核酸分子的双链核糖核酸分子，以提供比所述样品溶液具有更低比例的包含靶核酸序列的样品核酸分子的消耗的样品溶液。在实施方案中，所述说明书还包括对消耗的样品溶液重复步骤(b)和(c)一次或多次。在实施方案中，所述说明书还包括使样品溶液的温度保持在多个样品核酸分子和捕获引物核酸分子的解链温度或以上。
在实施方案中，用于酶促延伸捕获引物核酸分子的说明书包括使样品溶液的温度保持在所述多个样品核酸分子的解链温度或以上；向样品溶液中引入延伸酶，所述延伸酶被配置成延伸与靶核酸序列退火的捕获引物核酸分子；和使样品溶液保持在捕获引物核酸分子的退火温度附近或以下，所述退火温度适合使捕获引物核酸分子与靶核酸序列退火；和使样品溶液保持在延伸酶的延伸温度附近，所述延伸温度适合通过延伸酶酶促延伸与所述靶核酸序列退火的捕获引物核酸分子。
在实施方案中，用于酶促切割双链样品核酸分子的说明书包括：向样品溶液中引入降解酶，所述降解酶配置成切割包含通用衔接子核酸序列的双链核酸分子；和使样品溶液的温度保持在降解酶的降解温度。
在实施方案中，所述说明书还包括：将多个扩增引物核酸分子引入消耗的样品溶液，其中所述多个扩增引物核酸分子中的扩增引物核酸分子与通用衔接子核酸序列互补；和对具有多个扩增引物核酸分子的消耗的样品溶液中的多个样品核酸分子进行核酸扩增反应。
在实施方案中，所述说明书还包括使通用衔接子分子偶联到样品溶液中的样品核酸分子的说明。
实施例
实施例1：使用选择探针的富集策略的示例结果：
通过由质粒(AmpR：421bp和Hygro：774bp)扩增序列，产生具有通用衔接子的不同长度的两种不同的扩增子。引物BC 0328和BC 0330用于产生AmpR扩增子(图6)。引物BC_0332和BC_0334用于产生Hygro扩增子(图4)。
将等量的两种扩增子(各0.2ng)添加到20uL反应中。
为了富集AmpR扩增子，我们使用以下混合物，其中BC_306_amp_capture是与AmpR扩增子互补但不与Hygro扩增子互补的寡核苷酸。
表1：
为了富集Hygro扩增子，我们使用以下混合物，其中BC_301_hygro_capture是与Hygro扩增子互补但不与AmpR扩增子互补的寡核苷酸。
表2：
组分 20uL反应
10x标准Taq缓冲液 2
10mM DNTP 0.4
Amp+Hygro扩增子混合物(总共0.4ng) 1
Taq DNA聚合酶 0.1
BC_0301_hygro_capture 0.4
10x稀释的RNA酶T1 1
无核酸酶H2O 15.1
总体积 20
然后在以下条件下循环样品：
根据以下方案对样品进行1或3个循环的热循环：
1.95℃-30s
2.58℃-20s
3.68℃-20s
4.37℃或42C或50C-15min
然后将样品立即放在冰上。
然后将2uL的每种反应物添加到具有通用引物的25uL qPCR反应物。一旦反应开始达到平稳，将其从qPCR中移出并在1.25％琼脂糖凝胶上电泳。结果如图8所示。
顶行丛左到右：
1.100碱基对梯状条带(New England Biolabs)
2.Amp capture，1个循环，步骤4，在37℃下
3.Amp capture，1个循环，步骤4，在42℃下
4.Amp capture，1个循环，步骤4，在50℃下
5.Hygro capture，1个循环，步骤4，在37℃下
6.Hygro capture，1个循环，步骤4，在42℃下
7.Hygro capture，1个循环，步骤4，在50℃下
8.对照：仅DNA
底行从左到右：
9.100碱基对梯状条带(New England Biolabs)
10.Amp capture，3个循环，步骤4，在37℃下
11.Amp capture，3个循环，步骤4，在42℃下
12.Amp capture，3个循环，步骤4，在50℃下
13.Hygro capture，3个循环，步骤4，在37℃下
14.Hygro capture，3个循环，步骤4，在42℃下
15.Hygro capture，3个循环，步骤4，在50℃下
16.对照：仅DNA
寡核苷酸序列：
参见图5：AmpR_扩增子序列.pdf
参见图4：Hygro_扩增子序列.pdf
BC_0108_TSO_PCR AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT(SEQ ID NO.12)
BC_0062_Primer_Bind CAGACGTGTGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO.13)
BC_0328_amp_fwd__3ribo
AAGCAGTGGTATCAACrGCArGAGTrGAATGGGTACCAAACGACGAGCGTGACA(SEQ ID NO.1)
BC_0330_amp_rev_3ribo
GTGACTGGAGTTCAGACrGTGTrGCTCTTCCrGATCTCCAATGCTTAATCAGTGAGGCACC(SEQ IDNO.2)
BC_0306_Amp_capture ACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGA(SEQ ID NO.19)
BC_0359_amp_ribo_dT_fwd
TTTTTTTTTTAAGCAGTGGTATCAACrGCArGAGTrGAATGGGTACCAAACGACGAGCGTGACA(SEQID NO.20)
BC_0360_amp_ribo_dT_rev
TTTTTTTTTTCAGACrGTGTrGCTCTTCCrGATCTCCAATGCTTAATCAGTGAGGCACC(SEQ IDNO.21)
BC_0332_hygro_fwd_3ribo
AAGCAGTGGTATCAACrGCArGAGTrGAATGGGCCCGCTGTTCTGCAGCC(SEQ ID NO.3)
BC_0334_hygro_rev_3ribo
GTGACTGGAGTTCAGACrGTGTrGCTCTTCCrGATCTATTCCTTTGCCCTCGGACG(SEQ ID NO.4)
BC_0301_hygro_capture AGAAGTACTCGCCGATAGTGGAAACCGA(SEQ ID NO.22)
图8中凝胶图像的结果显示在各种条件下的期望的靶分子的富集。泳道2-4和10-12显示了AmpR分子的富集。泳道5-7和13-15显示了Hygro分子的富集。在降解步骤的整个温度范围内都发生富集(37℃-50℃)。凝胶还显示，与单个循环相比(泳道10-12与泳道4-6相比，以及泳道13-15与泳道5-7相比)，使核酸解链，使捕获引物退火，延伸捕获引物和降解单链核糖鸟嘌呤的多个循环可导致等同或更高的倍数富集。
实施例2：
在该实施例中，富集单细胞RNA测序文库(来自扩增的原代T细胞)的与以下基因的部分匹配的特定序列：ACTB(ATGGCCCAGTCCTCTCCCAA，SEQ ID NO.5)，GAPDH(AGGAGTAAGACCCCTGGACCAC，SEQ ID NO.6)，TRAC(AGAACCCTGACCCTGCCG，SEQ ID NO.7)，TRBC 1(CTGAAAAACGTGTTCCCACCCGAG，SEQ ID NO.8)，和TRBC2(ACCTGAACAAGGTGTTCCCACC，SEQ ID NO.9)。
TRAC对应于T细胞受体α链的恒定区，而TRBC1和TRCB2对应于T细胞受体β链的两个可能的恒定区。通过VJ和VDJ重组产生T细胞受体α和β链，导致各自的可能序列的很高的多样性。然而，通过富集包含TRAC序列的部分的核酸序列，可以富集编码T细胞受体α链的所有或几乎所有核酸序列，并且类似地通过富集包含TRBC1或TRBC2的部分的核酸序列，可以富集编码T细胞受体β链的所有或几乎所有核酸序列。
根据公开的SPLiT-seq方法生成扩增的cDNA的单细胞RNA测序文库。使用引物BC_385和BC_386将1ng扩增的cDNA再扩增11个PCR循环，以将核糖鸟苷引入双链DNA分子的每个5’末端。根据制造商的说明，使用2：1的磁珠与PCR产物的比例，用SPRI磁珠(Kapa PureBeads)纯化得到的PCR产物。使用Qubit dsDNA HS分析试剂盒测量得到的纯化的PCR产物的浓度。
总共比较了12种不同的富集变化。测试了3种不同的聚合酶混合物，测试了两种不同的聚合酶延伸时间，并测试了两种RNA酶T1的浓度(3x 2x 2＝12个组合变化)。
变化1(在1x标准Taq缓冲液中的热启动Taq，30s聚合酶延伸，100uRNA酶T1)
变化2(在1x标准Taq缓冲液中的热启动Taq，120s聚合酶延伸，100uRNA酶T1)
变化3(在1x标准Taq缓冲液中的热启动Taq，30s聚合酶延伸，20u RNA酶T1)
变化4(在1x标准Taq缓冲液中的热启动Taq，120s聚合酶延伸，20uRNA酶T1)
变化5(在1x OneTaq标准反应缓冲液中的OneTaq热启动，30s聚合酶延伸，100uRNA酶T1)
变化6(在1x OneTaq标准反应缓冲液中的OneTaq热启动，120s聚合酶延伸，100uRNA酶T1)
变化7(在1x OneTaq标准反应缓冲液中的OneTaq热启动，30s聚合酶延伸，20u RNA酶T1)
变化8(在1x OneTaq标准反应缓冲液中的OneTaq热启动，120s聚合酶延伸，20uRNA酶T1)
变化9(在1x ThermoPol反应缓冲液中的Deep Vent Exo-，30s聚合酶延伸，100uRNA酶T1)
变化10(在1x ThermoPol反应缓冲液中的Deep Vent Exo-，120s聚合酶延伸，100uRNA酶T1)
变化11(在1x ThermoPol反应缓冲液中的Deep Vent Exo-，30s聚合酶延伸，20uRNA酶T1)
变化12(在1x ThermoPol反应缓冲液中的Deep Vent Exo-，120s聚合酶延伸，20uRNA酶T1)
用以下制备每个反应：
(2uL 10x标准Taq缓冲液/4uL OneTaq标准反应缓冲液/2uLThermoPol反应缓冲液)，1.6uL 2.5mM dNTP，(0.1uL热启动Taq聚合酶/0.1uL 热启动DNA聚合酶/0.1uLDeep(exo-)DNA聚合酶)，1uL合并的捕获引物(共10uM，各2uM)，(11.3/13.3uL水)，1uL扩增的cDNA(来自使用BC 385和BC 386进行的PCR)，和1uL RNA酶T1(稀释到100u/uL或20u/uL)。引物BC_0344ACTB_probe(SEQ ID NO.5)，BC_0343_GAPDH_probe(SEQ IDNO.6)，BC_0391_TRAC_probe(SEQ ID NO.7)，BC_0392TRBC1_probe(SEQ ID NO.8)，BC_0393_TRBC2_probe(SEQ ID NO.9)用作合并的捕获引物。
变化1、3、5、7如下循环：
a.95C持续30s，b.95C持续30s，c.53C持续20s，d.68C持续30s，e.37C持续15min，f.重复步骤b-e另外两个循环(三个循环，包括第一个循环在内)。
变化2、4、6、8如下循环：
a.95C持续30s，b.95C持续30s，c.53C持续20s，d.68C持续2min，e.37C持续15min，f.重复步骤b-e另外两个循环(三个循环，包括第一个循环在内)。
变化9和11如下循环：
a.95C持续30s，b.95C持续30s，c.55C持续20s，d.72C持续30s，e.37C持续15min，f.重复步骤b-e另外两个循环(三个循环，包括第一个循环在内)。
变化10和12如下循环：
a.95C持续30s，b.95C持续30s，c.55C持续20s，d.72C持续2min，e.37C持续15min，f.重复步骤b-e另外两个循环(三个循环，包括第一个循环在内)。
然后根据制造商的说明(2倍磁珠与PCR产物的比例)，使用单面SPRI净化(singlesided SPRI cleanup)(Kapa Pure Beads)纯化所有12个反应物。然后使用引物BC 0062(SEQ ID NO.12)和BC 0108TSO PCR(SEQ ID NO.12)通过PCR扩增12个纯化的反应物中的每一个。然后，通过片段化、末端修复(包括A加尾)、衔接子连接和采用添加索引的Illumina衔接子(P7和P5)的引物的PCR，来制备在Illumina测序仪上进行下一代测序的扩增PCR产物。
也使用相同的方法(片段化、末端修复(包括A加尾)、衔接子连接和采用添加索引的Illumina衔接子(P7和P5)的引物的PCR)制备原始的扩增的cDNA文库(未经历任何富集)用于下一代测序。
在Illumina NextSeq上对所有13个文库(12个富集的变化和原始非富集文库)一起测序。根据最终PCR过程中添加的索引对所得文库进行多路分解(demultiplex)。
然后，针对预期被富集的5个序列中的每个序列，计算12个富集变化中每个富集变化相对于非富集文库的倍数变化富集：ACTB(ATGGCCCAGTCCTCTCCCAA，SEQ ID NO.5)，GAPDH(AGGAGTAAGACCCCTGGACCAC，SEQ ID NO.6)，TRAC(AGAACCCTGACCCTGCCG，SEQ ID NO.7)，TRBC 1(CTGAAAAACGTGTTCCCACCCGAG，SEQ ID NO.8)，和TRBC2(ACCTGAACAAGGTGTTCCCACC，SEQ ID NO.9)。
表3：倍数变化富集：
表3中的结果显示了在各种条件下期望的靶分子的富集。对于五个靶序列中的每个靶序列，包含给定序列的核酸在不同的实验条件下富集。可以调节RNA酶T1的浓度、聚合酶的类型和聚合酶延伸时间，导致不同的靶序列的倍数富集。
尽管已经示出和描述了说明性实施方案，但是应当理解，可以在不脱离本发明的精神和范围的情况下在其中进行各种改变。

Claims (60)

1.一种用于消耗靶核酸序列的方法，所述方法包括：
(a)向包含多个样品核酸分子的样品溶液中引入与所述多个样品核酸分子中的一个或多个样品核酸分子的靶核酸序列互补或部分互补的捕获引物核酸分子，所述样品核酸分子各自包含通用衔接子核酸序列，所述通用衔接子核酸序列包含核糖核苷酸；
(b)酶促延伸与所述一个或多个样品核酸分子的靶核酸序列退火的捕获引物核酸分子；和
(c)酶促切割所述样品核酸分子的双链核糖核酸分子，以提供比所述样品溶液具有更低比例的包含靶核酸序列的样品核酸分子的消耗的样品溶液。
2.权利要求1所述的方法，其中酶促延伸所述捕获引物核酸分子包括：
使样品溶液的温度保持在所述多个样品核酸分子的解链温度或以上；
向样品溶液中引入延伸酶，所述延伸酶被配置成延伸与所述靶核酸序列退火的捕获引物核酸分子；和
使样品溶液保持在捕获引物核酸分子的退火温度附近或以下，所述退火温度适合使捕获引物核酸分子与靶核酸序列退火；和
使样品溶液保持在延伸酶的延伸温度附近，所述延伸温度适合通过延伸酶酶促延伸与所述靶核酸序列退火的捕获引物核酸分子。
3.权利要求2所述的方法，其中所述延伸酶选自聚合酶、逆转录酶及其组合。
4.权利要求2和3中任一项所述的方法，其中酶促切割双链样品核酸分子包括：
向样品溶液中引入降解酶，所述降解酶配置成降解包含通用衔接子核酸序列的双链核糖核酸分子；和
使样品溶液的温度保持在降解酶的降解温度。
5.权利要求4所述的方法，其中在酶促延伸所述捕获引物核酸分子之后，将所述降解酶引入样品溶液。
6.权利要求4所述的方法，其中在酶促延伸所述捕获引物核酸分子之前，将所述降解酶引入样品溶液。
7.权利要求4所述的方法，其中所述降解温度在所述退火温度以下。
8.权利要求4所述的方法，其中所述降解温度在所述延伸温度以下。
9.权利要求4所述的方法，其中所述降解温度是所述降解酶的活性温度。
10.权利要求4-9中任一项所述的方法，其中所述降解酶是核糖核酸酶。
11.权利要求4-9中任一项所述的方法，其中所述降解酶是核酸内切酶。
12.权利要求11所述的方法，其中所述核酸内切酶是核糖核酸内切酶。
13.权利要求12所述的方法，其中所述核糖核酸内切酶选自RNA酶HII、RNA酶H、RNA酶III及其组合。
14.权利要求4-12中任一项所述的方法，其中所述降解酶是RNA酶HII。
15.权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述捕获引物核酸分子是封闭的捕获引物核酸分子，其中所述封闭的捕获引物核酸分子被配置成阻断封闭的捕获引物核酸分子通过延伸酶在3’末端的酶促延伸。
16.权利要求4-15中任一项所述的方法，其中酶促切割所述双链样品核酸分子包括降解设置在所述双链样品核酸分子上的通用衔接子核酸序列的部分。
17.权利要求16所述的方法，其中酶促切割所述双链样品核酸分子包括切割所述双链样品核酸分子的通用衔接子核酸分子的骨架。
18.权利要求16所述的方法，其中酶促切割所述双链样品核酸分子包括消化所述双链样品核酸分子的通用衔接子核酸分子的部分。
19.权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述捕获引物核酸分子与所述多个样品核酸分子的一个或多个第二样品核酸分子的第二靶核酸序列互补或部分互补，其中所述第二靶核酸序列不同于所述靶核酸序列。
20.权利要求2-19中任一项所述的方法，其中使样品溶液保持在捕获引物核酸分子的退火温度附近或以下包括使样品溶液保持在捕获引物核酸分子的退火温度的约1℃至约5℃的范围内的温度。
21.权利要求19和20中任一项所述的方法，其中捕获引物核酸分子和所述第二靶核酸序列具有在退火温度的约1℃至约5℃的范围内的第二退火温度。
22.权利要求1-21中任一项所述的方法，还包括对消耗的样品溶液重复步骤(b)和(c)一次或多次。
23.权利要求22所述的方法，还包括使样品溶液的温度保持在所述多个样品核酸分子和所述捕获引物核酸分子的解链温度或以上。
24.权利要求1-23中任一项所述的方法，还包括：
将多个扩增引物核酸分子引入消耗的样品溶液，其中所述多个扩增引物核酸分子中的扩增引物核酸分子与所述通用衔接子核酸序列互补；和
对具有所述多个扩增引物核酸分子的消耗的样品溶液中的所述多个样品核酸分子进行核酸扩增反应，以提供扩增的消耗的样品溶液。
25.权利要求24所述的方法，其中对所述消耗的样品溶液中的所述多个样品核酸分子进行核酸扩增反应不扩增或基本上不扩增已经被降解酶降解的样品核酸分子。
26.权利要求1-25中任一项所述的方法，还包括对所述扩增的消耗的样品溶液进行反应，所述反应选自核酸片段化反应、酶促末端修复、A加尾、衔接子连接、聚合酶链反应及其组合。
27.权利要求1-26中任一项所述的方法，还包括纯化所述消耗的样品溶液中的所述多个样品核酸分子。
28.权利要求27所述的方法，其中纯化所述消耗的样品溶液中的所述多个样品核酸分子包括从所述消耗的样品溶液中去除选自捕获引物核酸分子、酶及其组合的试剂。
29.权利要求1-28中任一项所述的方法，还包括对所述消耗的样品溶液中的核酸分子测序。
30.权利要求1-29中任一项所述的方法，其中所述多个样品核酸分子的通用衔接子核酸序列包含衔接子标签核酸序列。
31.权利要求30所述的方法，其中所述衔接子标签核酸序列限定独特的核酸序列。
32.权利要求29-31中任一项所述的方法，其中对所述消耗的样品溶液中的核酸分子测序包括基于所述消耗的样品溶液中的所述多个样品核酸分子生成样品核酸信息。
33.权利要求32所述的方法，其中对所述消耗的样品溶液中的核酸分子测序包括基于所述衔接子标签核酸序列生成衔接子标签核酸序列信息。
34.权利要求1-33中任一项所述的方法，其中所述捕获引物核酸分子包含硫代磷酸酯键。
35.权利要求34所述的方法，其中所述硫代磷酸酯键设置在所述捕获引物核酸分子的3’末端处的碱基以及与所述3’末端处的碱基紧邻的碱基之间。
36.权利要求1-35中任一项所述的方法，其中所述捕获引物核酸分子被配置成在退火温度下主要是单链的。
37.权利要求1-35中任一项所述的方法，其中所述捕获引物核酸分子被配置成在退火温度下主要是至少部分双链的。
38.权利要求1-37中任一项所述的方法，其中所述捕获引物核酸分子与所述靶核酸序列部分互补，并且其中所述捕获引物核酸分子包含在1到5个范围内的与通用衔接子核酸序列不互补的多个碱基。
39.权利要求1-38中任一项所述的方法，其中所述捕获引物核酸分子与所述靶核酸序列部分互补，并且其中所述捕获引物核酸分子与通用衔接子序列大于或等于90％互补。
40.权利要求1-39中任一项所述的方法，其中所述捕获引物核酸分子还包含与第一捕获引物核酸分子互补或部分互补的第二捕获引物核酸分子。
41.一种试剂盒，其包含：
与靶序列互补或部分互补的捕获引物核酸分子；和
配置成降解双链核酸分子的降解酶。
42.权利要求41所述的试剂盒，其中所述降解酶是核糖核酸酶。
43.权利要求41所述的试剂盒，其中所述降解酶是核酸内切酶。
44.权利要求43所述的试剂盒，其中所述核酸内切酶是核糖核酸内切酶。
45.权利要求44所述的试剂盒，其中所述核糖核酸内切酶选自RNA酶HII、RNA酶H、RNA酶III及其组合。
46.权利要求41-45中任一项所述的试剂盒，其中所述降解酶是RNA酶HII。
47.权利要求41-46中任一项所述的试剂盒，其中所述捕获引物核酸分子是封闭的捕获引物核酸分子，其中所述封闭的捕获引物核酸分子被配置成阻断封闭的捕获引物核酸分子通过延伸酶在3’末端的酶促延伸。
48.权利要求41-47中任一项所述的试剂盒，其中所述降解酶：
在活性温度范围以上对于降解双链核酸分子是无活性的；和
在无活性之后，在活性温度范围内对于降解双链核酸分子是有活性的。
49.权利要求41-48中任一项所述的试剂盒，还包含多个配置成偶联到样品核酸分子的通用衔接子核酸分子。
50.权利要求41-49中任一项所述的试剂盒，还包含选自以下的试剂：负载有包含通用衔接子核酸分子的寡核苷酸的转座酶；限制性核酸内切酶；包含通用衔接子核酸分子的寡核苷酸或寡核苷酸复合物；包含T7启动子的寡核苷酸或寡核苷酸复合物；针对转录因子的抗体或抗体片段；及其组合。
51.权利要求50所述的试剂盒，其中所述降解酶被配置成切割包含所述通用衔接子核酸分子的双链核酸分子。
52.权利要求41-51中任一项所述的试剂盒，还包括用于消耗靶核酸序列的说明书，所述说明书包括：
(a)向包含多个样品核酸分子的样品溶液中引入与所述多个样品核酸分子中的一个或多个样品核酸分子的靶核酸序列互补或部分互补的捕获引物核酸分子，所述样品核酸分子各自包含通用衔接子核酸序列，所述通用衔接子核酸序列包含核糖核苷酸；
(b)酶促延伸与所述一个或多个样品核酸分子的靶核酸序列退火的捕获引物核酸分子；和
(c)酶促切割样品核酸分子的双链核糖核酸分子，以提供比所述样品溶液具有更低比例的包含靶核酸序列的样品核酸分子的消耗的样品溶液。
53.权利要求52所述的试剂盒，其中用于酶促延伸所述捕获引物核酸分子的说明书包括：
使样品溶液的温度保持在所述多个样品核酸分子的解链温度或以上；
向样品溶液中引入延伸酶，所述延伸酶被配置成延伸与所述靶核酸序列退火的捕获引物核酸分子；
使样品溶液保持在捕获引物核酸分子的退火温度附近或以下，所述退火温度适合使捕获引物核酸分子与靶核酸序列退火；和
使样品溶液保持在延伸酶的延伸温度附近，所述延伸温度适合通过延伸酶酶促延伸与所述靶核酸序列退火的捕获引物核酸分子。
54.权利要求52和53中任一项所述的试剂盒，其中用于酶促切割双链样品核酸分子的说明书包括：
向样品溶液中引入降解酶，所述降解酶配置成切割包含通用衔接子核酸序列的双链核酸分子；和
使样品溶液的温度保持在降解酶的降解温度。
55.权利要求52-54中任一项所述的试剂盒，其中所述说明书还包括对消耗的样品溶液重复步骤(b)和(c)一次或多次。
56.权利要求55所述的试剂盒，其中所述说明书还包括使样品溶液的温度保持在所述多个样品核酸分子和所述捕获引物核酸分子的解链温度或以上。
57.权利要求52-56中任一项所述的试剂盒，其中所述说明书还包括：
将多个扩增引物核酸分子引入消耗的样品溶液，其中所述多个扩增引物核酸分子中的扩增引物核酸分子与所述通用衔接子核酸序列互补；和
对具有所述多个扩增引物核酸分子的消耗的样品溶液中的所述多个样品核酸分子进行核酸扩增反应。
58.权利要求52-57中任一项所述的试剂盒，其中所述说明书还包括以下说明：
使通用衔接子分子偶联到样品溶液中的样品核酸分子。
59.权利要求41-58中任一项所述的试剂盒，还包括被配置成延伸与所述靶核酸序列退火的捕获引物核酸分子的延伸酶。
60.权利要求41-59中任一项所述的试剂盒，其中所述延伸酶选自聚合酶、逆转录酶及其组合。
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