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CN119301268A - 测序缓冲液及提高具有可逆阻断基团修饰的dNTP的稳定性的方法 - Google Patents

测序缓冲液及提高具有可逆阻断基团修饰的dNTP的稳定性的方法 Download PDF

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CN119301268A
CN119301268A CN202280096352.4A CN202280096352A CN119301268A CN 119301268 A CN119301268 A CN 119301268A CN 202280096352 A CN202280096352 A CN 202280096352A CN 119301268 A CN119301268 A CN 119301268A
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CN
China
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sequencing
reversible blocking
blocking group
dntp
stability
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Application number
CN202280096352.4A
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English (en)
Inventor
王静静
李长英
贾曼
许颖颖
王雅蒙
林结桃
张桢
孟逸欣
龚梅花
李计广
徐崇钧
蒋慧
刘健
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MGI Tech Co Ltd
Original Assignee
MGI Tech Co Ltd
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Publication date
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids

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Abstract

测序缓冲液及提高具有可逆阻断基团修饰的dNTP的稳定性的方法，测序缓冲液包括：竞争试剂，竞争试剂可与具有可逆阻断基团修饰的dNTP竞争性地与特定物质发生反应。测序缓冲液中竞争试剂可与具有可逆阻断基团修饰的dNTP竞争性地与特定物质作用，减少可逆阻断基团发生变化(如被还原、水解等)，从而保证其稳定性，更好地应用于测序中，有助于提高测序质量，极大地减少了超前反应发生，降低错误率。

Description

测序缓冲液及提高具有可逆阻断基团修饰的dNTP的稳定性的方法 技术领域
本发明涉及生物领域。具体地，本发明涉及测序缓冲液及提高具有可逆阻断基团修饰的dNTP的稳定性的方法。
背景技术
目前的高通量测序中使用最广泛的边合成边测序(Sequencing by Synthesis,SBS)技术要求dNTPs的3’-羟基端连接可切除的阻断基团(亦可称为“可逆阻断基团”)，且这个可切除的阻断基团需要满足两个条件：1)不影响修饰的dNTPs被DNA聚合酶高效准确的聚合到测序链的3’-羟基端；2)足够稳定：在其反应缓冲液中，可切除的阻断基团稳定地连接在dNTPs的3’-羟基端，不断裂；3)易切除：测完一个循环后，可切除的阻断基团可以被高效的切掉并恢复测序链的3’-羟基结构。
在测序反应中，往往由于测序缓冲液或修饰的dNTPs本身结构的原因，导致dNTPs的可逆阻断基团不够稳定，例如可逆阻断基团二硫键易被还原成巯基，可逆阻断基团酯键易水解，导致可逆阻断基团的dNTPs的阻断基团容易脱落，失去阻断功能，进而使得测序反应超前进行(可切除的阻断基团掉了，导致聚合反应该停止时没有停止，一个循环聚合上了两个或两个以上的修饰或未修饰的dNTPs)；反映在测序数据上，表现为测序质量下降，错误率升高。因此，提高具有可逆阻断基团修饰的dNTP的稳定性，是测序成功的关键因素之一，仍有待研究。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本发明提出了测序缓冲液、测序溶液在测序中的应用、提高具有可逆阻断基团修饰的dNTP稳定性的方法和测序试剂盒，该测序缓冲液包括竞争试剂，其可与具有可逆阻断基团修饰的dNTP竞争性地发生反应，减少可逆阻断基团发生变化(如被还原、水解等)，从而保证其稳定性，更好地应用于测序中，有助于提高测序质量，极大地减少了Runon(超前反应)发生，降低错误率。
在本发明的一个方面，本发明提出了一种测序缓冲液。根据本发明的实施例，所述测序缓冲液包括：竞争试剂，所述竞争试剂可与具有可逆阻断基团修饰的dNTP竞争性地与特定物质发生反应。
根据本发明实施例的测序缓冲液中，通过添加竞争试剂，使其与具有可逆阻断基团修饰的dNTP竞争性地与特定物质发生反应，从而减少具有可逆阻断基团发生变化(如被还原、水解等)，保证其稳定性，进一步有助于提高测序质量，极大地减少了Runon(超前反应)发生，降低错误率。
需要说明的是，本发明所描述的“特定物质”是指能够与可逆阻断基团反应而使基团发生变化的物质，例如可以为含氧化合物、含OH -化合物或含H +化合物。本发明对于“特定物质”的来源不作严格限定，例如可以来源于测序缓冲液中其他组成(如溶解在溶液中的氧气)或者测序缓冲液所处环境(如酸性、碱性环境中含有的OH -或H +)；“发生反应”的类型也不做严格限定，可以为氧化反应、还原反应或水解反应等。
根据本发明的实施例，所述测序缓冲液还可以具有下列附加技术特征：
根据本发明的实施例，所述可逆阻断基团包括酯键和/或二硫键。由此，可以进行可逆反应，被可逆的切除。任一具有酯键和/或二硫键的dNTP均可应用于本发明，对此，本发明不作严格限定。
根据本发明的实施例，所述可逆阻断基团包括二硫键；所述竞争试剂包括2-羟乙基二硫化物。该竞争试剂可与二硫键修饰的dNTP竞争性地被还原，使得二硫键更不易被还原，从而提高了被保护的二硫键的稳定性。
根据本发明的实施例，所述可逆阻断基团包括酯键；所述竞争试剂包括5-溴尿嘧啶。该竞争试剂可与酯键修饰的dNTP竞争性地被水解，使得酯键更不易被水解，从而提高了被保护的酯键的稳定性。
在本发明的另一方面，本发明提出了一种测序溶液。根据本发明的实施例，所述测序溶液包括：前面所述测序缓冲液和具有可逆阻断基团修饰的dNTP。由此，根据本发明实施例的测序溶液中，具有可逆阻断基团修饰的dNTP的稳定性强，不易发生水解、被还原等，从而提高了测序质量，极大地减少了Runon(超前反应)发生，降低错误率。
根据本发明的实施例，所述dNTP的浓度为0.1μM～50mM，优选为0.1μM～10mM。根据本发明的另一实施例，所述竞争试剂的浓度为10μM～100mM，优选为1～10mM。发明人经过大量实验得到上述浓度，由此，可以更好地提高可逆阻断基团的稳定性。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种提高具有可逆阻断基团修饰的dNTP稳定性的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：使竞争试剂与所述具有可逆阻断基团修饰的dNTP进行接触；其中，所述竞争试剂可与所述可逆阻断基团竞争性地与特定物质发生反应。通过添加竞争试剂，使其与具有可逆阻断基团修饰的dNTP竞争性地与特定物质发生反应，从而减少具有可逆阻断基团发生变化(如被还原、水解等)，保证其稳定性，进 一步有助于维持测序的准确性，提高测序质量，极大地减少了Runon(超前反应)发生，降低错误率。
根据本发明的实施例，所述可逆阻断基团包括二硫键；所述竞争试剂包括2-羟乙基二硫化物。该竞争试剂可与二硫键修饰的dNTP竞争性地被还原，使得二硫键更不易被还原，从而提高了被保护的二硫键的稳定性。
根据本发明的实施例，所述可逆阻断基团包括酯键；所述竞争试剂包括5-溴尿嘧啶。该竞争试剂可与酯键修饰的dNTP竞争性地被水解，使得酯键更不易被水解，从而提高了被保护的酯键的稳定性。
根据本发明的实施例，在所述接触所得混合溶液中，所述dNTP的浓度为0.1μM～50mM，优选为0.1μM～10mM。根据本发明的另一实施例，在所述接触所得混合溶液中，所述竞争试剂的浓度为10μM～100mM，优选为1～10mM。发明人经过大量实验得到上述浓度，由此，可以更好地提高可逆阻断基团的稳定性。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种测序试剂盒。根据本发明的实施例，所述测序试剂盒包括：前面所述测序缓冲液或测序溶液。由此，根据本发明实施例的测序试剂盒中具有可逆阻断基团修饰的dNTP稳定性好，有助于提高测序质量，极大地减少了Runon(超前反应)发生，降低错误率。
在本发明的又一方面，本发明提出了前面所述测序缓冲液、测序溶液或测序试剂盒在测序中的应用。前面所述测序溶液或测序试剂盒中具有可逆阻断基团修饰的dNTP稳定性好，有助于提高测序质量，降低错误率，适于广泛应用。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种测序方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：使用前面所述测序缓冲液、测序溶液或测序试剂盒。由此，根据本发明实施例的测序方法的测序质量高，错误率低，适于广泛应用。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1 2-羟乙基二硫化物作为竞争试剂
1、实验材料
表1试剂、耗材信息
2、仪器
表2仪器信息
仪器 型号
基因扩增仪 6337
测序仪 MGISEQ-2000RS
Qubit仪 Qubit4.0
电子天平 MS204TS
3、实验样本
样品名称：标准文库试剂V3(26ng/支,E320，Barcode 97-104，华大智造1000005033)。
4、实验设计
分别将HotMPS dNTPs Mix和HotMPS dNTPs Mix II进行如下实验：
将HotMPS dNTPs Mix和HotMPS dNTPs Mix II分别加入到含有终浓度为2mM的2- 羟乙基二硫化物(HED)的LTE缓冲液中作为测试组以及加入到LTE缓冲液中作为对照组。分别在加入后的半小时内上机，和在4℃放置24小时后上机测SE50，测序酶上机前加入。比较新鲜配制的试剂(半小时内)和4℃放置24小时两个时间点的数据，尤其是Runon(％)、Q30(％)、AvgErrorRate(％)、TotalReads(M)等指标。
继续进行浓度梯度测试：设置HED终浓度为2、5、10、20mM几个梯度，将HotMPS dNTPs Mix和HotMPS dNTPs Mix II加入到含有HED的LTE缓冲液或者不含HED的LTE缓冲液中，进行SE50测序。比较测序数据，尤其是Runon(％)、Q30(％)、AvgErrorRate(％)、TotalReads(M)等指标，选择出最合适的浓度。
5、评价指标及标准
表3评价标准
评价指标 合格标准
Runon(％) 越低越好
Q30(％) 越高越好
AvgErrorRate(％) 越低越好
TotalReads(M) 越高越好
6、实验步骤
6.1 DNB制备
按下表体系加入试剂及文库
表4 DNB制备反应体系
组份 加入量(μL)
文库ssDNA 3
LTE缓冲液 17
DNB制备缓冲液 20
总体积 40
将上述反应体系用漩涡振荡器震荡混匀，离心机离心5s，置于PCR仪中进行引物杂交，反应条件见下表：
表5 DNB制备反应引物杂交条件
温度 时间
热盖(105℃) On
95℃ 1min
65℃ 1min
40℃ 1min
4℃ Hold
取出DNB聚合酶混合液II(LC)置于冰盒上，短暂离心5s，置于冰盒上备用。当PCR仪达到4℃后取出PCR管，离心机离心5s后，在冰上往此PCR管中加入如下组分：
表6 DNB制备反应组分2
组分 加入量(μL)
DNB聚合酶混合液I 40
DNB聚合酶混合液II(LC) 4
反应体系用漩涡振荡器震荡混匀，离心机离心5s，即刻置于PCR仪中，反应条件如下：
表7 DNB制备滚环扩增条件
温度 时间
热盖(35℃) On
30℃ 25min
4℃ Hold
当PCR仪温度达到4℃后立即加入20μL DNB终止缓冲液，用阔口吸头缓慢地吹打混匀5-8次。
用Qubit测DNB浓度。
6.2 DNB pooling及加载
6.2.1取DNB 100μL，再加入32μL DLBⅡ，然后用扩口枪头混匀。
6.2.2 DNB加载
用MGIDL-200H将DNB加载到载片上，待载片加载完成，将载片取下，待上机测序。
6.3上机测序
按照表8-1和8-2，分别配制4套同批次试剂，其中2套作为对照，另外2套加入终浓度为2mM 2-羟乙基二硫化物作为测试组，配好后半小时内上机测对照和测试组的其中的1套；4℃放置24小时后测另外1套；选用相同的脚本进行SE50测序。
不同浓度的添加剂测试：按照表8-1和8-2，分别配制5套同批次试剂，其中1套作为对照，其他4套分别加入终浓度为2mM、5mM、10mM、20mM的HED，选用相同的脚本进行SE50测序。
实验条件：
表8-1 Hot dNTP试剂槽配制组分
HotMPS dNTPs Mix conc. 0.6μM
Enzyme DNA聚合酶
Enzyme conc. 10μg/mL
表8-2 Cold dNTP试剂槽配制组分
HotMPS dNTPs Mix II conc. 2μM
Enzyme DNA聚合酶
Enzyme conc. 10μg/mL
脚本条件：
表9脚本条件
步骤 Tm(℃) Time(s)
Hot聚合 60 120
Cold聚合 60 120
切除 65 120
7、实验结果与分析
如表10所示，对照组测试：新鲜配制的试剂，runon(％)0.54％；4℃放置24小时后，runon(％)增加至0.73％；
HED测序组：新鲜配制的试剂runon(％)降低至0.41％，放置24小时，runon(％)增加至0.58％，远低于对照组放24小时的Runon(％)。
由此表明，2-羟乙基二硫化物的添加对提高HotMPS dNTPs Mix和HotMPS dNTPs Mix II在测序缓冲液中的稳定性有帮助。
表10不同添加剂的比较
如表11所示，5-20mM HED的Runon(％)基本一致，均比2mM的Runon(％)低；MappingRate(％)的差异可能来自于不同的芯片间差异；加HED的Q30(％)均比对照组好；不同浓度之间差异不大。
表11 HED浓度测试比较
8、实验结论
HED对提高HotMPS dNTPs Mix和HotMPS dNTPs Mix II在测序缓冲液中的稳定性有帮助；5mM、10mM和20mM的HED对Runon的影响基本一致，优选5-10mM。
实施例2 5-溴尿嘧啶作为竞争试剂
1、实验材料
表12试剂、耗材信息
2、仪器
表13仪器信息
仪器 型号
基因扩增仪 6337
测序仪 MGISEQ-2000RS
Qubit仪 Qubit4.0
电子天平 MS204TS
3、实验样本
同实施例1。
4、实验设计
配置两个SE50测序试剂盒，一个试剂盒作为对照，一个试剂盒的测序缓冲液中加入终浓度为5mM 5-溴尿嘧啶，室温加速6小时后，在MGISEQ-2000RS测序仪上进行SE50测序，比较Runon(％)、Q30(％)、AvgErrorRate(％)和TotalReads(M)。
5、评价指标及标准
表14评价标准
评价指标 合格标准
Runon(％) 越低越好
Q30(％) 越高越好
AvgErrorRate(％) 越低越好
TotalReads(M) 越高越好
6、实验步骤
6.1 DNB制备
同实施例1。
6.2：DNB pooling及加载
同实施例1。
6.3上机测序
按照表15-1和15-2，分别配制2套同批次试剂，其中1套作为对照，另外1套加入5mM5-溴尿嘧啶作为测试组，配好后半小时内上机测对照和测试组进行SE50测序。
实验条件：
表15-1 Hot dNTP试剂槽配制组分
表15-2 Cold dNTP试剂槽配制组分
脚本条件：
表16脚本条件
步骤 Tm(C) Time(s)
Hot聚合 60 120
Cold聚合 60 120
切除 65 120
7、实验结果与分析
表17实验结果
5-Br(5mM) 对照
Q30(％) 93.32 92.85
ESR(％) 85.11 84.78
MappingRate(％) 99.37 99.33
AvgErrorRate(％) 0.38 0.43
Lag(％) 0.15 0.17
Runon(％) 0.52 0.58
在室温加速6小时后，加5-溴尿嘧啶的实验组Runon(％)降低了10％，AvgErrorRate(％)降低了11.6％。由此，表明5-溴尿嘧啶的添加有助于提高HotMPS dNTPs Mix和HotMPS dNTPs Mix II的稳定性。
对比例
实验材料(除2-羟乙基二硫化物)、仪器、实验样本同实施例1。
实验步骤：
1、DNB制备、DNB pooling、加载同实施例1。
2、上机测序
按照表8-1和8-2，分别配制6套同批次试剂，其中2套作为对照，2套加入终浓度为2mM DMTU(N,N′-二甲基硫脲，品牌：Merck，货号：D188700)作为测试组1，2套加入终浓度为2mM APDC(吡咯烷二硫代甲酸铵盐，品牌：Merck，货号：P8765)作为测试组2，配好后半小时内上机测对照和测试组1、测试组2的其中的1套；4℃放置24小时后测另外1套；选用相同的脚本(同实施例1)进行SE50测序。
结果如表18所示，可以看出，测序缓冲液中加入DMTU和APDTC，在4℃放置24小时后，比对照组还差。由此表明DMTU和APDTC不能提高HotMPS dNTPs Mix和HotMPS dNTPs Mix II在测序缓冲液中的稳定性。
表18 DMTU和APDTC的测序结果分析
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (19)

  1. 一种测序缓冲液，其特征在于，包括：
    竞争试剂，所述竞争试剂可与具有可逆阻断基团修饰的dNTP竞争性地与特定物质发生反应。
  2. 根据权利要求1所述的测序缓冲液，其特征在于，所述可逆阻断基团包括酯键和/或二硫键。
  3. 根据权利要求1或2所述的测序缓冲液，其特征在于，所述可逆阻断基团包括二硫键，所述竞争试剂包括2-羟乙基二硫化物。
  4. 根据权利要求1或2所述的测序缓冲液，其特征在于，所述可逆阻断基团包括酯键，所述竞争试剂包括5-溴尿嘧啶。
  5. 一种测序溶液，其特征在于，包括：权利要求1～4任一项所述测序缓冲液和具有可逆阻断基团修饰的dNTP。
  6. 根据权利要求5所述的测序溶液，其特征在于，所述dNTP的浓度为0.1μM～50mM。
  7. 根据权利要求5或6所述的测序溶液，其特征在于，所述dNTP的浓度为0.1μM～10mM。
  8. 根据权利要求5所述的测序溶液，其特征在于，所述竞争试剂的浓度为10μM～100mM。
  9. 根据权利要求5-8任一项所述的测序溶液，其特征在于，所述竞争试剂的浓度为1～10mM。
  10. 一种提高具有可逆阻断基团修饰的dNTP稳定性的方法，其特征在于，包括：
    使竞争试剂与所述具有可逆阻断基团修饰的dNTP进行接触；
    其中，所述竞争试剂可与所述可逆阻断基团竞争性地与特定物质发生反应。
  11. 根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述可逆阻断基团包括二硫键，所述竞争试剂包括2-羟乙基二硫化物。
  12. 根据权利要求10或11所述的方法，其特征在于，所述可逆阻断基团包括酯键，所述竞争试剂包括5-溴尿嘧啶。
  13. 根据权利要求10所述的方法，其特征在于，在所述接触所得混合溶液中，所述竞争试剂的浓度为10μM～100mM。
  14. 根据权利要求10或13所述的方法，其特征在于，在所述接触所得混合溶液中，所述竞争试剂的浓度为1～10mM。
  15. 根据权利要求10所述的方法，其特征在于，在所述接触所得混合溶液中，所述dNTP的浓度为0.1μM～50mM。
  16. 根据权利要求10或15所述的方法，其特征在于，在所述接触所得混合溶液中，所述dNTP的浓度为0.1μM～10mM。
  17. 一种测序试剂盒，其特征在于，包括：权利要求1～4任一项所述测序缓冲液或权利要求5～9任一项所述测序溶液。
  18. 权利要求1～4任一项所述测序缓冲液、权利要求5～9任一项所述测序溶液或权利要求17所述测序试剂盒在测序中的应用。
  19. 一种测序方法，其特征在于，包括：使用权利要求1～4任一项所述测序缓冲液、权利要求5～9任一项所述测序溶液或权利要求17所述测序试剂盒。
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