CN119301250A - 用于将生物样品分区的方法和水凝胶组合物 - Google Patents

Abstract

提供了在纳米小瓶中制备和形成分区的方法。公开了其中在中空纳米小瓶中将寡核苷酸与细胞核酸连接，所述方法包含将细胞装载到中空纳米小瓶中的开口中；将一个或多个水凝胶珠粒插入到所述开口中，由此阻塞所述开口并且防止所述细胞从所述开口扩散。

Description

用于将生物样品分区的方法和水凝胶组合物

相关申请交叉引用

本申请要求保护于2022年5月31日提交的美国临时专利申请第63/347,419号的优先权的权益，所述美国临时专利申请出于所有目的通过引用并入。

背景技术

已发现将试剂分区可用于许多分子反应。例如，基于液滴的单细胞测序允许高分辨率基因测序。

在单细胞下一代测序(NGS)样品制备中，需要进行复杂的微流控以将细胞和珠粒递送到条形码编码分区中。这种复杂性增加了解决方案的成本，因为其通常需要微流控芯片以及微流控控制器。在分区是液滴的情况下，芯片会产生液滴，并且仪器执行流控压力控制以递送所述分区。

此外，由于创建分区通常是以连续操作进行的，因此对所产生的液滴的数量存在上限。这是由于产生增加数量的分区所需的时间会成比例增加。另外，所需要的额外时间意味着，细胞可以落座在分区产生上游的缓冲液中，使得生物学可能开始受到影响，这将影响生物学数据和结果。

在条形码编码分区形成后，可能需要对分区的内容物进行成像，以分析例如由细胞产生的分泌的产物，并且然后基于成像结果对所关注的细胞进行分选。这在油包水液滴的情况下是困难的，因为所述液滴与物理地固定在空间中的细胞分选器和微孔是不相容的。

最后，典型条形码编码分区可能不允许缓冲液交换，因为所述分区是以流控方式彼此分离的。这会阻止多步骤生物化学反应，所述多步骤生物化学反应中的一些是对如甲基化的DNA等复合细胞底物进行条形码编码所需的。

发明内容

在一些实施例中，提供了一种在中空纳米小瓶或微孔中将寡核苷酸与细胞核酸连接的方法。在一些实施例中，所述方法包含：

将细胞装载到中空纳米小瓶或微孔中的开口中；

将一个或多个水凝胶珠粒插入到所述开口中，由此阻塞所述开口并且防止所述细胞从所述开口扩散；

使所述细胞在所述中空纳米小瓶或微孔中裂解；

将一种或多种寡核苷酸与由经裂解的细胞产生的核酸连接，由此对所述核酸进行条形码编码，其中所述寡核苷酸在所述装载之前存在于所述中空纳米小瓶或微孔中或通过所述水凝胶珠粒引入到所述中空纳米小瓶或微孔中。

在一些实施例中，所述阻塞包含诱导插入到所述纳米小瓶或微孔中的一个或多个水凝胶珠粒溶胀。在一些实施例中，所述阻塞包含诱导所述纳米小瓶溶胀。

在一些实施例中，所述纳米小瓶或微孔中的大多数含有一个或零个细胞。在一些实施例中，为了实现一个或零个细胞装载，λ或可替代地纳米小瓶或微孔的作为分数的细胞的平均数量为大约0.05个至0.1个细胞/纳米小瓶或微孔。在一些实施例中，为了实现一个或零个细胞装载，λ或可替代地纳米小瓶或微孔的作为分数的细胞的平均数量为大约0.01个至0.4个细胞/纳米小瓶或微孔。

在一些实施例中，所述寡核苷酸与所述水凝胶珠粒连接，并且任选地在密封之后从所述水凝胶珠粒中释放。在一些实施例中，所述寡核苷酸与所述水凝胶珠粒连接，并且任选地在所述连接之前从所述水凝胶珠粒中释放。在一些实施例中，所述寡核苷酸具有条形码序列，其中单独的水凝胶珠粒包含所述寡核苷酸的克隆拷贝，并且其中与单独的水凝胶珠粒连接的所述条形码序列是唯一的，使得条形码将所述水凝胶珠粒与其它水凝胶珠粒区分开。

在一些实施例中，所述寡核苷酸具有条形码序列，其中单独的纳米小瓶或微孔包含所述寡核苷酸的克隆拷贝，并且其中与单独的纳米小瓶或微孔连接的经测序的条形码是唯一的，使得条形码将所述纳米小瓶或微孔与其它纳米小瓶或微孔区分开。

在一些实施例中，所述方法进一步包含从所述纳米小瓶或微孔中提取经条形码编码的核酸，并且将来自不同纳米小瓶或微孔的经条形码编码的核酸组合成本体溶液，并且对来自所述本体溶液的所述经条形码编码的核酸进行核苷酸测序。

在一些实施例中，所述裂解包含在所述纳米小瓶或微孔中使一种或多种裂解试剂扩散到所述细胞中。在一些实施例中，在所述连接之前从所述纳米小瓶或微孔中去除裂解试剂或使所述裂解试剂失活。

在一些实施例中，所述裂解包含在所述纳米小瓶或微孔中使蛋白质变性和或降解试剂扩散到所述细胞中。在一些实施例中，在所述连接之前从所述纳米小瓶或微孔中去除裂解试剂或使所述裂解试剂失活。

在一些实施例中，所述连接包含将所述寡核苷酸与所述核酸粘结，并且任选地使用所述核酸作为模板来对所述寡核苷酸进行模板依赖性延伸。

在一些实施例中，所述连接包含使一种或多种连接试剂扩散到含有所述经裂解的细胞的经密封的纳米小瓶或微孔中。在一些实施例中，所述核酸是DNA，并且所述连接试剂包含DNA聚合酶或连接酶。在一些实施例中，所述核酸是RNA，并且所述连接试剂包含逆转录酶。

在一些实施例中，所述连接包含通过点击化学反应将所述寡核苷酸与所述核酸连接。

在一些实施例中，所述中空纳米小瓶包含右旋糖酐和聚乙二醇(PEG)。

在一些实施例中，所述水凝胶珠粒包含聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、二氧化硅、聚甲基丙烯酸甲酯、藻酸盐、聚乙二醇(PEG)、尼龙(nylon)或琼脂糖。

在一些实施例中，所述水凝胶珠粒包含与双丙烯酰胱胺交联的聚丙烯酰胺。在一些实施例中，溶胀是在所述水凝胶珠粒中通过使所述水凝胶珠粒与二硫键还原剂接触来诱导的。

在一些实施例中，所述水凝胶珠粒包含通过使丙烯酰胺聚合而形成的聚丙烯酰胺和可光切割交联剂。在一些实施例中，可光切割交联剂是邻硝基苄基(o-NB)双丙烯酸酯。在一些实施例中，溶胀是在所述水凝胶珠粒中通过对所述可光切割交联剂进行接触光切割来诱导的。

在一些实施例中，提供了多种中空纳米小瓶或微孔，其包含阻塞的开口，所述阻塞的开口防止细胞和所释放的细胞产物扩散。在一些实施例中，所述中空纳米小瓶或微孔中的至少一些包含一个或多个细胞，并且所述开口被封闭所述开口的水凝胶珠粒阻塞。在一些实施例中，所述阻塞的开口是通过将一个或多个水凝胶珠粒引入到所述开口中并且然后诱导所述水凝胶珠粒溶胀使得所述水凝胶珠粒堵塞所述开口来形成的。在一些实施例中，所述中空纳米小瓶包含右旋糖酐和聚乙二醇(PEG)。在一些实施例中，所述水凝胶珠粒包含聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、二氧化硅、聚甲基丙烯酸甲酯、藻酸盐、聚乙二醇(PEG)、尼龙或琼脂糖。在一些实施例中，所述多个中空纳米小瓶或微孔中的大多数含有一个或零个细胞。在一些实施例中，单独的水凝胶珠粒包含寡核苷酸的克隆拷贝，并且所述寡核苷酸具有条形码序列，并且其中与单独的水凝胶珠粒连接的所述条形码序列是唯一的，使得条形码将所述水凝胶珠粒与其它水凝胶珠粒区分开。在一些实施例中，所述条形码序列通过点击化学与单独的水凝胶珠粒连接。在一些实施例中，所述寡核苷酸具有条形码序列，其中单独的纳米小瓶或微孔包含寡核苷酸的克隆拷贝，并且所述寡核苷酸具有条形码序列，并且其中与单独的纳米小瓶或微孔连接的经测序的条形码是唯一的，使得条形码将所述纳米小瓶或微孔与其它纳米小瓶或微孔区分开。

在一些实施例中，所述寡核苷酸具有条形码序列，其中单独的纳米小瓶包含寡核苷酸的克隆拷贝，并且所述寡核苷酸具有条形码序列，并且其中与单独的纳米小瓶连接的所述条形码序列是唯一的，使得条形码将所述纳米小瓶与其它纳米小瓶区分开。在一些实施例中，所述条形码序列通过点击化学与单独的纳米小瓶连接。

在一些实施例中，所述水凝胶珠粒包含与双丙烯酰胱胺交联的聚丙烯酰胺。

在一些实施例中，所述水凝胶珠粒包含通过使丙烯酰胺聚合而形成的聚丙烯酰胺和可光切割交联剂。在一些实施例中，所述可光切割交联剂是邻硝基苄基(o-NB)双丙烯酸酯。

还提供了一种检测中空纳米小瓶或微孔中的细胞蛋白的方法。在一些实施例中，所述方法包含：

将细胞装载到中空纳米小瓶或微孔中的开口中；

将一个或多个水凝胶珠粒插入到所述开口中，由此阻塞所述开口并且防止所述细胞从所述开口扩散；以及

检测阻塞的纳米小瓶中的分泌的细胞蛋白。

在一些实施例中，所述纳米小瓶或微孔包含结合剂(其可以是但不限于抗体、生物素或链酶亲和素)，所述结合剂与一种或多种分泌的细胞蛋白特异性结合，并且所述分泌的细胞蛋白与所述结合剂结合，并且对所述分泌的细胞蛋白具有特异性的第二结合剂(其可以直接或间接标记)扩散到所述阻塞的纳米小瓶或微孔中，以特异性地检测在所述纳米小瓶或微孔中结合的所述分泌的细胞蛋白。例如，所述第二结合剂(例如，抗体或其它结合剂)通常与可检测标记缀合或以其它方式缔合。缔合可以是直接的，例如共价键，或间接的，例如使用第二结合剂、螯合剂或接头。

定义

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语通常具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。通常，本文所用的命名法和下文所述的细胞培养、分子遗传学、有机化学和核酸化学和杂交中的实验室程序是本领域熟知和常用的那些。标准技术用于核酸和肽合成。技术和程序通常根据本领域的常规方法和各种一般参考文献来执行(通常参见，Sambrook等人《分子克隆：实验室手册(MOLECULAR CLONING：ALABORATORY MANUAL)》，第2版(1989)纽约冷泉港的冷泉港实验室出版社(Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor,N.Y)，所述文献通过引用并入本文)，所述常规方法和各种一般参考文献在本文档中通篇提供。本文所用的命名法以及分析化学和下文描述的有机合成中的实验室程序是本领域熟知和常用的那些。

如本文所用，术语“一个(a)”、“一种(an)”或“所述(the)”不仅包括具有一个成员的方面，而且还包括具有多于一个成员的方面。例如，除非上下文另有明确说明，否则单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”包括复数指示物。因此，例如，提及“珠粒”包括多个此类珠粒，并且提及“所述序列”包括提及本领域的技术人员已知的一种或多种序列等。

术语“扩增反应”是指使核酸的靶序列的拷贝以线性或指数方式扩增的任何体外手段。此类方法包括但不限于：双引物方法，如聚合酶链式反应(PCR)；连接酶方法，如DNA连接酶链式反应(参见美国专利第4,683，195号和第4,683,202号；《PCR方案：方法和应用指南(PCR Protocols：A Guide to Methods andApplications)》(Innis等人编辑，1990))(LCR)；QBeta RNA复制酶和基于RNA转录的扩增反应(例如，涉及T7、T3或SP6引发的RNA聚合的扩增)，如转录扩增系统(TAS)、基于核酸序列的扩增(NASBA)和自主序列复制(3SR)；等温扩增反应(例如，单引物等温扩增(SPIA))；以及本领域技术人员已知的其它技术。

“扩增”是指在反应的所有组分都完好无损的情况，将溶液置于足以允许多核苷酸扩增的条件下的步骤。扩增反应的组分包括例如引物、多核苷酸模板、聚合酶、核苷酸等。术语“扩增”通常是指靶核酸的“指数”增加。然而，如本文所使用的“扩增”还可指核酸的选定靶序列的数量的线性增加，如通过循环测序或线性扩增获得的。在示例性实施例中，扩增是指使用第一扩增引物和第二扩增引物进行的PCR扩增。

“引物”是指与靶核酸上的序列杂交并作为核酸合成的起始点的多核苷酸序列。引物可以具有多种长度，并且长度通常小于50个核苷酸，例如长度为12-30个核苷酸。用于PCR的引物的长度和序列可以基于本领域的技术人员已知的原理来设计，参见例如，Innis等人，同上。引物可以是DNA、RNA或DNA部分与RNA部分的嵌合体。在一些情况下，引物可以包括一个或多个经修饰的或非天然核苷酸碱基。在一些情况下，引物是标记的。

核酸或其一部分在一定条件下与另一种核酸“杂交”，使得非特异性杂交在生理缓冲液(例如，pH 6-9，25-150mM氯化物盐)中在限定的温度下是最小化的。在一些情况下，核酸或其一部分与一组靶核酸中共有的保守序列杂交。在一些情况下，如果存在至少约6个、8个、10个、12个、14个、16个或18个连续的互补核苷酸，包括与多于一个核苷酸配偶体互补的“通用”核苷酸的话，则引物或其部分可以与引物结合位点杂交。可替代地，如果至少约12个、14个、16个、18个或20个连续核苷酸上存在0个或少于2个或3个互补错配的话，则引物或其部分可以与引物结合位点杂交。在一些实施例中，特异性杂交发生的限定温度为室温。在一些实施例中，特异性杂交发生的限定温度高于室温。在一些实施例中，特异性杂交发生的限定温度为至少约37℃、40℃、42℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃或80℃。在一些实施例中，特异性杂交发生的限定温度为37℃、40℃、42℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃或80℃。

“模板”是指包含要扩增的多核苷酸、邻近引物杂交位点或侧接一对引物杂交位点的多核苷酸序列。因此，“靶模板”包含邻近引物的至少一个杂交位点的靶多核苷酸序列。在一些情况下，“靶模板”包含侧接“正向”引物和“反向”引物的杂交位点的靶多核苷酸序列。

如本文所使用的，“核酸”意指DNA、RNA、单链、双链或更高度聚集的杂交基序以及其任何化学修饰。修饰包括但不限于提供并入另外的电荷、极化性、氢键合、静电相互作用、与核酸配体碱基或整个核酸配体的附接点和功能的化学基团的修饰。此类修饰包括但不限于肽核酸(PNA)、磷酸二酯基团修饰(例如，硫代磷酸酯、甲基膦酸酯)、2′-位置糖修饰、5-位置嘧啶修饰、8-位置嘌呤修饰、外环胺处的修饰、4-硫尿苷的取代、5-溴或5-碘-尿嘧啶的取代；主链修饰、甲基化、不寻常的碱基配对组合，如异碱基、异胞苷和异胍等。核酸还可以包括非天然碱，例如硝基吲哚。修饰还可以包括3′修饰和5′修饰，包括但不限于用荧光团(例如，量子点)或另一个部分封端。

“聚合酶”是指对多核苷酸(例如，DNA和/或RNA)进行模板导向的合成的酶。所述术语涵盖全长多肽和具有聚合酶活性的结构域两者。DNA聚合酶是本领域的技术人员众所周知的，包括但不限于分离自或源自强烈火球菌(Pyrococcus furiosus)、嗜热高温球菌(Thermococcus litoralis)和海栖热袍菌(Thermotoga maritime)的DNA聚合酶或其经修饰的版本。可商购获得的聚合酶的另外实例包括但不限于：Klenow片段(New England股份有限公司(New EnglandInc.))、Taq DNA聚合酶(凯杰公司(QIAGEN))、9°N^TM DNA聚合酶(New England股份有限公司)、Deep Vent^TM DNA聚合酶(New England股份有限公司)、Manta DNA聚合酶Bst DNA聚合酶(New England股份有限公司)和phi29 DNA聚合酶(New England股份有限公司)。

聚合酶包括DNA依赖性聚合酶和RNA依赖性聚合酶两者，如逆转录酶。DNA依赖性DNA聚合酶的至少五个家族是已知的，但是大多数属于家族A、B和C。其它类型的DNA聚合酶包括噬菌体聚合酶。类似地，RNA聚合酶典型地包括真核RNA聚合酶I、II和III和细菌RNA聚合酶以及噬菌体和病毒聚合酶。RNA聚合酶可以是DNA依赖性的和RNA依赖性的。

如本文所使用的，术语“分区”或“分区的”是指将样品分离为多个部分或“分区”。分区通常是物理的，使得一个分区中的样品不会或基本上不会与相邻分区中的样品混合。分区可以是固体或流体。在一些实施例中，分区是固体分区，例如，微通道或微孔，或如本文所述的，珠粒。在一些实施例中，分区是流体分区，例如，液滴。在一些实施例中，流体分区(例如，液滴)是不混溶流体(例如，水和油)的混合物。在一些实施例中，流体分区(例如，液滴)是被不混溶载体流体(例如，油)包围的水性液滴。孔的示例性阵列和孔描述可以见于例如美国专利第9，103,754号和第10,391,493号中。孔阵列(纳米孔、微孔、孔组)可以用于捕获固相载体，任选地在可寻址的已知位置中。因此，孔阵列可以被配置成促进将珠粒捕获在单固相载体形式中的至少一种或任选地小组固相载体中。示例性微孔阵列和将珠粒递送到微孔的方法以及其分析描述于例如PCT/US2021/034152中。

如本文所使用的，“条形码”是鉴定其所缀合或其所源自的分区或样品的分子的短核苷酸序列(例如，至少约4个、6个、8个、10个、12个、15个、20个、50个或75个或100个核苷酸长或更长)。例如，条形码可以用于鉴定源自分区、或如稍后由本体反应进行测序的珠粒的分子。例如，与其它分区或珠粒中存在的条形码相比，这种条形码对于所述分区或珠粒可以是唯一的。例如，含有来自单独细胞的靶RNA的分区(可以是中空纳米小瓶)可以经受使用在每个分区中含有不同分区特定的条形码序列的引物的逆转录条件，由此将唯一的“细胞条形码”(因为不同细胞在不同分区中，并且每个分区具有唯一的分区特定的条形码)的副本并入到每个分区的经逆转录的核酸中。因此，来自每个细胞的核酸可以由于唯一的“细胞条形码”而与其它细胞的核酸区分开。在本文所述的一些实施例中，其它条形码唯一地标识其所缀合的分子，即，条形码充当唯一分子标识符(UMI)，或又其它条形码可以指示来源样品(“样品条形码”)。底层条形码序列的长度决定可以区分多少个唯一样品。例如，根据简并性，1个核苷酸条形码可以区分4个或更少的不同分区；4个核苷酸条形码可以区分4⁴个或256个分区或更少分区；6个核苷酸条形码可以区分4096个不同分区或更少分区；并且8个核苷酸条形码可以索引65,536个不同分区或更少分区。

“寡核苷酸”是多核苷酸。一般来讲，在一些实施例中，寡核苷酸将具有少于250个核苷酸，介于4-200个之间，例如10-150个核苷酸。

多核苷酸的“克隆”拷贝意指拷贝在序列上是相同的。在一些实施例中，存在至少100个、1000个、10⁴个或更多个与珠粒连接的寡核苷酸的克隆拷贝。

寡核苷酸上的“3′捕获序列”是指寡核苷酸的最3′的部分。捕获序列的长度可以少至1-2个核苷酸，但更通常地长度为6-12个核苷酸，并且在一些实施例中长度为4-20个或更多个核苷酸。捕获序列可以与靶核酸(例如，靶核酸的3′末端)完全互补，但如在一些实施例中和某些条件下将理解的，1个、2个、3个、4个或更多个核苷酸在仍允许寡核苷酸的3′捕获序列与靶核酸粘结的同时可以错配。在其它实施例中，条件可以选择，使得仅完全互补的序列将粘结。3′捕获序列可以是随机序列、poly T或poly A序列、靶特异性序列或通用序列。例如，在其中转座子(例如，经修饰的Tn5，如标记酶)插入端部序列以对核酸进行采样的实施例中，捕获3′端部序列可以与所添加的端部互补或相同。

抗体可以以完整免疫球蛋白或包括特异性抗原结合活性的许多充分表征的片段中的任一种存在。此类片段可以通过用各种肽酶进行消化来产生。胃蛋白酶使铰链区中的位于二硫键下方的抗体消化，以产生F(ab)′2，即Fab的本身是通过二硫键与V_H-C_H1连接的轻链的二聚体。F(ab)′₂可以在温和条件下还原以破坏铰链区中的二硫键，由此将F(ab)′₂二聚体转化为Fab'单体。Fab'单体基本上为具有铰链区的一部分的Fab(参见《基础免疫学(Fundamental Immunology)》(Paul编辑，第3版，1993))。尽管就完整抗体的消化定义了各种抗体片段，但是本领域的技术人员将理解，可以在化学上或通过使用重组DNA方法从头合成此类片段。因此，如本文所使用的，术语抗体还包括通过修饰完整抗体产生的抗体片段、或使用重组DNA方法从头合成的抗体片段(例如，单链Fv)或使用噬菌体展示文库标识的抗体片段(参见，例如，McCafferty等人，《自然(Nature)》348：552-554(1990))。

对于单克隆抗体或多克隆抗体的制备，可以使用本领域已知的任何技术(参见例如，Kohler和Milstein，《自然》256：495-497(1975)；Kozbor等人，《今日免疫学(ImmunologyToday)》4：72(1983)；Cole等人，《单克隆抗体与癌症疗法(Monoclonal Antibodies andCancer Therapy)》，pp.77-96.Alan R.Liss公司(Alan R.Liss，Inc.)1985)。用于产生单链抗体的技术(美国专利第4,946,778号)可以适于产生针对本发明的多肽的抗体。而且，可以使用转基因小鼠或如其它哺乳动物等其它生物体以表达人源化抗体。可替代地，可以使用噬菌体展示技术以标识与选定抗原特异性结合的抗体和异源Fab片段(参见，例如，McCafferty等人，同上；Marks等人，《生物技术(Biotechnology)》10：779-783(1992))。

抗体与抗原上的“表位”结合。表位是抗原上的特异性抗体结合相互作用位点，并且可以包括几个氨基酸或几个氨基酸的部分，例如5或6个或更多个氨基酸，例如20个或更多个氨基酸，或那些氨基酸的部分。在一些情况下，表位包括例如来自碳水化合物、核酸或脂质的非蛋白质组分。在一些情况下，表位是三维部分。因此，例如，在靶标是蛋白质的情况下，表位可以包含连续氨基酸或来自蛋白质的不同部分的通过蛋白质折叠(例如，不连续表位)接近的氨基酸。对于形成三维结构的其它类型的靶分子来说也是如此。

术语“特异性结合”是指以一定亲和力与靶标结合的分子(例如抗体或抗体片段)，所述亲和力是与非靶化合物结合的分子的亲和力的至少2倍，例如，至少4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、25倍、50倍或100倍。例如，特异性结合的抗体α ταργετ πρoτειv通常将以一定亲和力与ταργετ πρoτsv结合，所述亲和力是与非靶标(例如，其它细胞蛋白)结合的抗体的亲和力的至少2倍。

“标记”或“可检测部分”是可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其它物理手段检测到的组合物。例如，有用的标记包括³²P、荧光染料、电子致密试剂、酶(例如，ELISA中常用的)、生物素、地高辛(digoxigenin)或半抗原以及蛋白质或可以例如通过将放射性标记并入到与靶肽具有特异反应性的肽或抗体中而变得可检测到的其它实体。可以采用本领域已知的用于使抗体与标记缀合的任何方法，例如使用以下中描述的方法：Hermanson，《生物缀合物技术(Bioconjugate Techniques)》1996，学术出版社公司(Academic Press，Inc.)，圣地亚哥。

附图说明

图1描绘了用条形码珠粒塞进行条形码编码：A)允许核心空的凝胶珠粒或纳米小瓶沉降到2D表面上。B)将细胞添加到溶液中并通过沉降和/或离心进入纳米小瓶。所述细胞附着到纳米小瓶的基底，C)将条形码凝胶珠粒添加到溶液中并且所述条形码凝胶珠粒进入纳米小瓶。所述条形码凝胶珠粒还与纳米小瓶的内部结合。D)将细胞裂解和逆转录试剂添加到塞-细胞-纳米小瓶复合物中。逆转录酶的分子量低到足以支持在整个包含纳米小瓶和条形码凝胶珠粒的水凝胶复合物中扩散。从裂解细胞释放的RNA/DNA的分子量高到足以被捕集在复合物内。E)使用条形码珠粒上的条形码寡核苷酸以引发RNA进行逆转录和经条形码编码的cDNA产生。制备样品用于NGS并进行测序。

图2描绘了用溶胀的条形码珠粒塞进行条形码编码：A)允许核心空的凝胶珠粒或纳米小瓶沉降到2D表面上。B)将细胞添加到溶液中并通过沉降和/或离心进入纳米小瓶。所述细胞附着到纳米小瓶的基底，C)将条形码凝胶珠粒添加到溶液中并且所述条形码凝胶珠粒进入纳米小瓶。所述条形码凝胶珠粒还与纳米小瓶的内部结合。D)添加凝胶珠粒溶胀溶液。凝胶珠粒溶胀，以在纳米小瓶的孔口处产生塞。应用细胞裂解和逆转录试剂。逆转录酶的分子量低到足以支持在整个复合物中扩散。从裂解细胞释放的RNA/DNA的分子量高到足以被捕集在复合物内。E)使用条形码珠粒上的条形码寡核苷酸以引发RNA进行逆转录和经条形码编码的cDNA产生。制备样品用于NGS并进行测序。

图3描绘了用多个溶胀的条形码珠粒塞进行条形码编码：A)允许核心空的凝胶珠粒或纳米小瓶沉降到2D表面上。将细胞添加到溶液中并通过沉降和/或离心进入纳米小瓶。所述细胞附着到纳米小瓶的基底，C)将高浓度的条形码凝胶珠粒添加到溶液中并且所述条形码凝胶珠粒进入纳米小瓶。所述条形码凝胶珠粒还与纳米小瓶的内部结合。D)将细胞裂解和逆转录试剂添加到塞-细胞-纳米小瓶复合物中。逆转录酶的分子量低到足以支持在整个复合物中扩散。从裂解细胞释放的RNA/DNA的分子量高到足以被捕集在复合物内。E)使用条形码珠粒上的条形码寡核苷酸以引发RNA进行逆转录和经条形码编码的cDNA产生。制备样品用于NGS并进行测序。

图4描绘了用条形码珠粒和油进行条形码编码：A)细胞和珠粒通过重力沉降或离心进入阵列排布的纳米小瓶。尽管描绘了每纳米小瓶多于一个凝胶珠粒，但是纳米小瓶和凝胶珠粒的几何形状可以使得仅单个凝胶珠粒进入纳米小瓶。B)将油添加到混合物中，并且将含细胞的纳米小瓶和珠粒溶液搅动，以如(C)中所示在纳米小瓶周围形成液滴。D)将混合物置于热循环器中以进行条形码编码，制备经条形码编码的核酸样品并且随后进行NGS。

图5描绘了使用溶胀的条形码珠粒塞的多步骤过程：A)允许核心空的凝胶珠粒或纳米小瓶沉降到2D表面上。B)将细胞添加到溶液中并通过沉降和/或离心进入纳米小瓶。所述细胞附着到纳米小瓶的基底，C)将条形码凝胶珠粒添加到溶液中并且所述条形码凝胶珠粒进入纳米小瓶。所述条形码凝胶珠粒还与纳米小瓶的内部结合。D)添加凝胶珠粒溶胀溶液。凝胶珠粒溶胀，以在纳米小瓶的孔口处产生塞。E)添加蛋白质降解试剂，以使所有蛋白质变性并破坏所有蛋白质，包括与DNA结合的组蛋白。在此步骤期间，高分子量核酸不可以扩散到核心之外，细胞曾处于所述核心之外。在蛋白质破坏完成后，使蛋白质降解溶液失活和/或洗涤掉所述蛋白质降解溶液。F)添条形码编码酶，之后是进行条形码编码、样品制备和NGS。

图6描绘了可能的纳米小瓶的层，所述可能的纳米小瓶如所描绘的从底部到顶部具有PEG相层、明胶层和与明胶层连接的寡核苷酸。图的右侧描绘了其中三臂PEG间隔子与明胶连接的实施例。

图7描绘了使用点击化学以使细胞条形码编码寡核苷酸与纳米小瓶附接。如所示出的，NHS-PEG-叠氮化物三臂接头(如图6所示与明胶连接)与DBCO修饰的寡核苷酸的键合可以通过点击化学反应发生。

具体实施方式

介绍

已经确定，可以含有所引入的细胞的中空纳米小瓶中的开口随后可以通过将水凝胶珠粒引入到开口中而被阻塞，从而在功能上使纳米小瓶成为保留如RNA和DNA等大生物分子但试剂可以扩散到其中以执行许多分子生物学过程的分区。例如，阻塞的纳米小瓶中的细胞可以裂解，并且来自经裂解的细胞的核酸可以与经条形码编码的寡核苷酸连接，所述经条形码编码的寡核苷酸可以存在于纳米小瓶中或可以通过水凝胶珠粒引入(例如，与其连接)。因此，例如，过去已经在液滴中进行的单细胞核苷酸测序方法可以相反在如本文所述的阻塞的纳米小瓶中进行。可以在阻塞的纳米小瓶中而非其它类型的分区中进行的技术的实例包括ATAC-seq和RNA-seq等。对微孔可以应用类似方法，例如用水凝胶珠粒阻塞微孔开口，如本文关于纳米小瓶开口所解释的。类似地，使用阻塞的纳米小瓶的方法可以同等地应用于阻塞的微孔。

可以根据需要将细胞引入到中空纳米小瓶或微孔中。例如，在一些实施例中，将细胞与中空纳米小瓶混合。在一些实施例中，中空纳米小瓶呈新月形(例如，“C”)形状，并且允许沉降到平面表面上。由于中空纳米小瓶的形状和偏心重量，其开口将面向上，并且由此可以允许细胞沉降到中空纳米小瓶的开口中。在一些实施例中，纳米小瓶的开口和空腔的大小使得平均空腔仅可以容纳一个细胞。在一些实施例中，大多数(例如，珠粒中的至少50％、60％、70％、80％或90％)仅含有一个细胞，或任选地一个或零个细胞。这是通过平均每纳米小瓶装载0.05-0.1个细胞来实现的。如果纳米小瓶上存在结合部分(例如，生物素或链霉亲和素)，则细胞可以与纳米小瓶结合，只要相应结合配偶体位于细胞的外膜上即可。用一种或多种整合素或另一种细胞结合剂涂覆纳米小瓶的基底是提供用于与进入纳米小瓶空腔的细胞结合的捕获补片的另一种方式。在一些实施例中，细胞捕获是不可逆的。在一些实施例中，结合部分是可逆的，并且由此细胞捕获是可逆的。

纳米小瓶通常是具有用于样品和试剂进入和离开的开口的中空亲水性珠粒。示例性中空纳米小瓶描述于例如de Rutte等人，《bioRxiv杂志(bioRxiv)》2020年9月18日(https：//doi.org/10.1101/2020.03.09.984245)；de Rutte，《美国化学学会·纳米(ACSNano)》(2022)https：//doi.org/10.1021/acsnano.1c11420；以及美国专利公开第2021/0268465号(将中空珠粒描述为“滴粒(dropicle)”或“滴载颗粒”)中。中空珠粒的直径可以例如介于约10μm与约500μm之间，例如，介于约20μm与200μm之间，例如，介于40μm与20μm之间。在一些实施例中，中空珠粒是新月形形状，使得所述中空珠粒在其开口向上的情况下具有在重力下沉降的趋势。这是因为重力的中心在与纳米小瓶开口相反的方向上偏离中心。珠粒其中包括空隙体积或空腔。空隙或空腔界定容纳分散相溶液或流体(例如，水相)的至少一部分的三维体积。容纳在空隙或空腔内的示例性流体体积可以为例如约100fL-10nL。珠粒内的空隙或空腔的长度尺寸(例如，球形空隙的直径)可以为几微米，例如大于约5μm并且小于约250μm。

在一些实施例中，中空纳米小瓶是通过使两种相流动以形成乳剂从而产生中空纳米小瓶而产生的。含有空腔的微凝胶珠粒可以例如使用与液滴微流控组合的水相两相系统(ATPS)来制造。参见例如美国专利公开第US 2021/0268465号；S.Ma等人《Small》.8，2356-2360(2012)；B.D.Fairbanks等人，经由硫醇-降冰片烯光聚合产生的多功能合成细胞外基质模拟物(Aversatile synthetic extracellular matrix mimic via thiol-norbornenephotopolymerization).《先进材料(Adv.Mater.)》(2009)。在一些实施例中，水性两相系统的一种相包含可交联组分，而另一种相不含有可交联组分。在一些实施例中，使可交联PEG相和右旋糖酐相与含有表面活性剂的第三油相一起在微流控液滴产生装置中共流，以产生经混合的水性乳剂，在所述水性乳剂中，在悬浮在油相中的每个液滴中存在PEG相和右旋糖酐相的均匀级分。在其它实施例中，代替右旋糖酐，使用明胶。例如，在一些实施例中，使可交联PEG相和明胶相与含有表面活性剂的第三油相一起在微流控液滴产生装置中共流，以产生经混合的水性乳剂，在所述水性乳剂中，在悬浮在油相中的每个液滴中存在PEG相和明胶相的均匀级分。参见例如Lee，《美国化学学会·纳米》2022，16，38-49。在一些实施例中，使聚(乙二醇)二丙烯酸酯(PEGDA)和聚(丙二醇)二丙烯酸酯(PPGDA)的单独预聚物溶液共流，在流中成形为微通道流中的所期望的横截面形态，并且然后进行光交联。参见例如Wu等人，《科学进展(Sci.Adv.)》2020。同一参考文献显示，还可以使用与水不混溶的其它连续相，包括聚(二甲基硅氧烷共-二苯基硅氧烷)(PSDS)、PPG、癸醇和甲苯。

纳米小瓶(或微孔)、水凝胶珠粒或两者可以与寡核苷酸连接，所述寡核苷酸包含分别标识纳米小瓶和/或水凝胶的条形码，所述条形码充当分区特定的条形码。在一些实施例中，中空纳米小瓶与具有3′捕获序列的多个克隆细胞条形码编码寡核苷酸连接或以其它方式缔合。在一些实施例中，细胞条形码编码寡核苷酸可以根据需要与水凝胶珠粒连接(参见下文)。将细胞条形码编码寡核苷酸与水凝胶珠粒或纳米小瓶连接的方法将取决于珠粒的组成。在一些实施例中，细胞条形码编码寡核苷酸的5′端与珠粒连接，或细胞条形码编码寡核苷酸以其它方式连接，使得3′捕获序列可用于与互补序列杂交。

在一些实施例中，细胞条形码编码寡核苷酸通过间隔子与纳米小瓶连接，从而允许条形码编码寡核苷酸更可用于与互补序列粘结。在一些实施例中，间隔子允许多于一种条形码编码寡核苷酸与间隔子连接，从而允许纳米小瓶上有更高密度的条形码编码寡核苷酸。例如，在一些实施例中，对纳米小瓶的明胶空腔可以使用具有末端NHS基团的3臂聚乙二醇(PEG)，并且所述PEG将使空腔表面上的官能团加倍以用于寡核苷酸附接。示例性三臂PEG间隔子在式I中示出

在一些实施例中，可以使用点击化学以将细胞条形码编码寡核苷酸与纳米小瓶或珠粒附接。例如，NHS-PEG-叠氮化物可以在空腔上或纳米小瓶上其它地方与胺(NH₂)部分附接，之后是DBCO修饰的寡核苷酸通过点击化学与叠氮化物基团附接。参见图7-8。点击化学涉及叠氮化物炔惠斯根环加成反应(azide alkyne Huisgen cycloaddition reaction)，在所述反应中，在本文所述的一些实施例中，使具有末端炔部分(例如但不限于DBCO修饰的)的第一寡核苷酸与具有末端叠氮化物部分并且促进或催化部分之间的反应以与两种寡核苷酸共价连接的间隔子反应。在一些实施例中，叠氮化物-炔惠斯根环加成是叠氮化物与末端或内部炔之间的用于得到1，2，3-三唑的1，3-二极环加成。例如，在一些实施例中，反应可以通过铜(铜(I)催化的叠氮化物-炔环加成(CuAAC))来催化，或通过应变的二氟环辛炔(DIFO)(应变促进的叠氮化物-炔环加成(SPAAC))来促进。参见例如《化学评论：点击化学(Chemical Reviews：Click Chemistry)》，2021年6月23日，第121卷，第12期，第6697-7248页，包括例如Fantoni等人，“点击化学与核酸的搭便车指南(A Hitchhiker's Guide toClick-Chemistry with Nucleic Acids)”《化学评论(Chem.Rev.)》2021，121，7122-7154。在一些实施例中，点击连接可以通过在存在维生素C、Cu(II)-TBTA、MgSO₄、THPTA和DMSO的情况下在45℃下温育例如2小时来进行。

在其它实施例中，分区特定的条形码编码寡核苷酸不与中空纳米小瓶连接或缔合，并且在这些实施例中的一些实施例中，寡核苷酸可以如下文更详细描述的通过水凝胶珠粒递送到中空纳米小瓶内的空腔。

在一些实施例中，中空纳米小瓶套组可以与相同的哈希寡核苷酸连接或以其它方式缔合，其中不同的套组具有不同的哈希寡核苷酸，从而允许通过哈希寡核苷酸中的哈希条形码来跟踪不同纳米小瓶套组。这些套组将例如用于细胞哈希，例如，在例如Stoeckius等人，《基因组生物学(Genome Biology)》(2018)19∶224中所述。所述哈希寡核苷酸可以包含例如5′PCR柄序列，所述柄序列允许通用引物结合序列，例如相对于其它纳米小瓶标识纳米小瓶套组的哈希条形码序列；以及(i)3′序列，所述3′序列与分区特定的条形码编码寡核苷酸中的条形码区段下游的3′序列互补；和/或(ii)夹板序列，所述夹板序列允许所述哈希寡核苷酸稍后与分区特定的条形码编码寡核苷酸附接。在一些实施例中，附接可以包含使哈希寡核苷酸在具有或不具有引物模板化的DNA合成的情况下直接与分区特定的条形码编码寡核苷酸杂交。在一些实施例中，附接可以包含通过与夹板寡核苷酸在进行或不进行连接的情况下杂交而使哈希寡核苷酸间接与分区特定的条形码编码寡核苷酸杂交。在一些实施例中，附接可以包含将哈希寡核苷酸与由分区特定的条形码编码寡核苷酸和来自经裂解的细胞的靶核酸通过引物模板化的杂交延伸和/或连接形成的扩增子连接。在一些实施例中，纳米小瓶可以与哈希寡核苷酸和分区特定的条形码编码寡核苷酸连接。

哈希寡核苷酸可用于提供纳米小瓶套组的标记。纳米小瓶套组可以接收不同的样品，例如，从而允许哈希寡核苷酸标记不同的样品，所述不同样品之后可以混合并通过条形码编码来跟踪。在一些实施例中，纳米小瓶套组可以接收来自相同样品的细胞的不同等分试样，例如，从而允许哈希寡核苷酸标记来自相同样品的不同等分试样，所述不同等分试样之后可以混合并通过条形码编码来跟踪。在一些实施例中，纳米小瓶套组可以接收不同样品和来自相同样品的细胞的不同等分试样，所述不同样品或所述不同等分试样之后可以混合并通过条形码编码来跟踪。在一些实施例中，如本文所述，可以将细胞引入到包含哈希寡核苷酸的纳米小瓶中，可以将具有不同哈希寡核苷酸的不同套组组合并阻塞(次序可以是阻塞和组合或组合和阻塞)。然后可以对细胞核酸进行分区特定的条形码编码，并且可以将哈希寡核苷酸与所产生的分区特定的经条形码编码的样品核酸连接。之后可以使用核苷酸序列以通过哈希寡核苷酸来跟踪来自不同纳米小瓶套组的序列，并且可以通过分区特定的条形码来跟踪特定分区。

可以将任何类型的细胞引入到中空纳米小瓶(或微孔)中。在一些实施例中，细胞是真核细胞，例如人、小鼠、大鼠或其它哺乳动物细胞。在一些实施例中，细胞是免疫细胞，例如包括但不限于杂交瘤、T细胞或B细胞。在一些实施例中，细胞是细菌或真菌或植物细胞。

在将细胞引入到中空纳米小瓶(或微孔)中之后，可以在床中的开口中形成阻塞，由此防止细胞从纳米小瓶(或微孔)中扩散。例如，在一些实施例中，虽然细胞和来自经裂解的细胞的细胞产物可以容易地从纳米小瓶开口扩散，但是在开口被阻塞后，细胞和细胞产物将基本上不从纳米小瓶中逸出，从而允许使用阻塞的纳米小瓶作为分区，不需要液滴、微孔或其它分区技术。这可以例如通过将一个或多个水凝胶珠粒引入到中空纳米小瓶中的开口中，由此防止细胞从中空纳米小瓶中的空腔离开来实现。在一些实施例中，将水凝胶珠粒引入到开口中足以阻塞开口，不会例如使纳米小瓶中的完整细胞释放。水凝胶珠粒可以根据需要引入到纳米小瓶中，例如，可以通过重力或通过离心允许珠粒沉降到纳米小瓶中。在其它实施例中，在将水凝胶珠粒引入到纳米小瓶中的开口中之后，引入一种或多种药剂或条件变化(例如，温度变化)，以使水凝胶珠粒溶胀，由此降低所述水凝胶珠粒从开口逸出并填充纳米小瓶的内部与凝胶珠粒表面之间的间隙的能力。在一些实施例中，水凝胶珠粒包含聚丙烯酰胺，并且珠粒的溶胀可以通过使珠粒与乙醇接触来诱导。

在一些实施例中，水凝胶珠粒可包含在切割时导致溶胀，由此阻塞纳米小瓶的开口的组分。例如，在一些实施例中，珠粒包含在与还原剂接触时裂解的组分。此组分的实例是例如与双丙烯酰胱胺交联的聚丙烯酰胺。示例性还原剂可以应用于切割接头中的二硫键。示例性还原剂可以包括但不限于二硫苏糖醇(DTT)或三(2-羧乙基)膦(TCEP)或其它还原剂。

在其它实施例中，水凝胶包含可光切割的组分。在暴露于光或光切割组分的波长的光时，珠粒将溶胀，使得在存在于纳米小瓶的开口中时，将阻塞纳米小瓶开口。在一些实施例中，可以将可光切割元件例如通过一个或多个丙烯酸酯基团并入到水凝胶珠粒基质中。在一些实施例中，可光切割组分是丙烯酸酯官能化的右旋糖酐。在一些实施例中，珠粒包含丙烯酰胺或其它水凝胶组分，所述其它水凝胶组分包含可光切割交联剂，例如邻硝基苄基(o-NB)双丙烯酸酯。

另外或可替代地，可以使用低盐缓冲液或纯水以使珠粒溶胀，而可以使用高盐缓冲液以使珠粒收缩，所述珠粒例如可以被诱导以允许珠粒进入纳米小瓶。可以使水凝胶凝胶珠粒收缩的示例性高盐缓冲液是例如100mM MgCl₂。可以使珠粒溶胀的示例性低盐缓冲液是例如10 mM Tris 1mM EDTA。在另一个实施例中，聚乙二醇(PEG)溶液(例如，15％w/vPEG 6000)也将使珠粒收缩。在这种情况下，如果PEG溶液被不含有PEG或含有较低浓度的PEG的溶液代替的话，珠粒随后将溶胀。

在一些实施例中，阻塞防止细胞产物以及细胞本身逃逸。例如，如多核苷酸和蛋白质等大分子通常将不能够从阻塞的纳米小瓶内的空腔中显著扩散。任选地，如果期望特定细胞产物和/或核酸物种逸出，则可以初始地对那些底物进行切割，以产生扩散通过纳米小瓶-凝胶珠粒复合物的较低分子量产物。可以以检测所述纳米小瓶相较于开放纳米小瓶(例如，不接收水凝胶珠粒)保留分子的能力的任何方式测量纳米小瓶的成功阻塞。在一些实施例中，可以进行物种混合实验以测量阻塞。例如，可以将小鼠和人细胞装载在纳米小瓶中。在条形码编码、样品制备和下一代测序时，来自不含在纳米小瓶内的物种的核酸的量可以是塞-纳米小瓶复合物防止核酸从一个纳米小瓶移动到另一个纳米小瓶的程度的量度。这被称为“细胞纯度”度量。

先前已描述了各种组合物的水凝胶珠粒。应认识到，水凝胶是亲水性的，并且因此在一些实施例中，“纳米小瓶”和“水凝胶珠粒”可以由相同的材料构成，而在其它实施例中，两者是由不同材料构成的。在任何情况下，为了维持含有细胞的中空珠粒与阻塞开口的珠粒之间的明确性，术语“中空纳米小瓶”或“纳米小瓶”用于描述前者，而“水凝胶珠粒”用于描述后者。

水凝胶珠粒可以由各种材料构成。示例性水凝胶珠粒可以是例如琼脂糖水凝胶珠粒或聚丙烯酰胺水凝胶珠粒。在其它实施例中，水凝胶包含例如进行或不进行交联的聚苯乙烯、二氧化硅、聚甲基丙烯酸甲酯、藻酸盐、聚乙二醇(PEG)、尼龙和/或其它聚合物。其它水凝胶包括但不限于在例如，美国专利第4,438,258号；第6,534,083号；第8,008,476号；第8,329,763号；美国专利申请第2002/0,009,591号；第2013/0,022,569号；第2013/0,034,592号；以及国际专利公开第WO/1997/030092号；以及第WO/2001/049240号中描述的水凝胶。一般来说，可以如本文所描述的选择水凝胶珠粒的大小，以允许水凝胶珠粒进入中空纳米小瓶中的开口，但大到足以阻塞开口。水凝胶珠粒也可对如本文所述的收缩剂和溶胀剂敏感。水凝胶的基质百分比确定水凝胶的孔隙度，并且可以被选择以防止靶分子在纳米小瓶凝胶珠粒复合物外部移动，同时允许缓冲液和低分子量蛋白质自由扩散。大于3％水凝胶材料的水凝胶通常捕集高分子量核酸，但允许低分子量酶、离子和去污剂扩散。

在一些实施例中，可以使大小设定为比中空纳米小瓶中的开口略(例如，0.5％-25％)大的水凝胶(例如，与双丙烯酰胺交联的丙烯酰胺)官能化的珠粒(例如，含有与水凝胶珠粒连接的官能化的寡核苷酸)的群体暴露于含有产生较小平衡大小的官能化的珠粒的材料的缓冲液(例如，10mM MgCl₂)，由此使大多数收缩到比中空纳米小瓶开口的大小小的大小，从而将官能化的珠粒装载到中空纳米小瓶开口中，并且然后改变周围缓冲液(例如，改变为较低盐的缓冲液、例如Tris EDTA缓冲液等)以产生溶胀，但其中官能化的珠粒保留在中空纳米小瓶开口中。此过程通过一个或多个可半渗透的官能化的珠粒有效地将中空纳米小瓶开口闭合。

在一些实施例中，除了阻塞纳米小瓶(或微孔)中的开口之外，水凝胶珠粒还可以将寡核苷酸递送到纳米小瓶(或微孔)的空腔，例如以与空腔中的靶细胞核酸附接。寡核苷酸可以根据需要与珠粒连接。珠粒的固相载体表面可以被修饰成包括用于与条形码寡核苷酸附接的接头。接头可以包含可切割部分。可切割部分的非限制性实例包括二硫键、二氧尿苷部分和限制酶识别位点。将寡核苷酸与珠粒连接的方法描述于例如WO 2015/200541中。在一些实施例中，被配置成将水凝胶珠粒与条形码连接的寡核苷酸与水凝胶共价连接。用于将寡核苷酸与一种或多种水凝胶基质共价连接的许多方法是本领域已知的。作为仅一个实例，醛衍生化的琼脂糖可以与合成寡核苷酸的5′-胺基团共价连接。

任选地，多个纳米小瓶(其中许多但不是全部含有细胞)可以针对含有细胞的珠粒富集。这可以例如在细胞发出荧光信号，从而允许通过FACS对珠粒进行分选的情况下实现。可替代地，可以使用如差异沉降或离心等方法以使更高密度的含细胞的珠粒富集。荧光信号可以在整个纳米小瓶中、在整个凝胶珠粒中和/或在整个纳米小瓶凝胶珠粒复合物中的某个特定位置中(如在纳米小瓶开口的基底处)累积。

在中空纳米小瓶(或微孔)中的开口阻塞之后，可以使纳米小瓶(或微孔)内的细胞裂解。裂解可以通过温度或引入一种或多种导致细胞裂解的试剂来诱导。示例性裂解剂可以包含例如洗涤剂(例如，SDS)、蛋白质变性剂和/或蛋白酶。由于纳米小瓶和阻塞性水凝胶珠粒的性质，小分子可以扩散到纳米小瓶的空腔中。因此，裂解试剂可以与纳米小瓶一起温育，从而允许裂解试剂扩散到细胞所驻留的床的空腔中。在一些实施例中，蛋白质变性剂包含胍。蛋白质变性剂和/或蛋白酶可用于例如在细胞DNA是靶细胞核酸时从染色体DNA中去除组蛋白。任选地，在裂解之后，可以对纳米小瓶进行一个或多个洗涤/冲洗步骤，以使裂解试剂在裂解发生之后扩散开，从而在纳米小瓶的空腔中留下来自经裂解的细胞的较大分子。

如DNA和RNA等来自经裂解的细胞的大分子(例如，大于1kbp(650KDa)的核酸物种)将基本上保持处于纳米小瓶的空腔中，从而允许对核酸应用分子方法，从而基本上与单独纳米小瓶内的核酸分离。另一方面，可以使包括例如聚合酶的较小分子扩散到纳米小瓶的空腔中，从而允许引发各种分子反应。因此，例如，存在于纳米小瓶的空腔中的寡核苷酸(例如，引入、与纳米小瓶连接或通过水凝胶珠粒递送)可以与来自细胞的一个或多个核酸连接。核酸可以是例如RNA或DNA。

可以使用寡核苷酸以执行引物延伸或其它基于杂交的反应。在一些实施例中，寡核苷酸的3′端序列与靶核酸直接粘结。例如，如果靶核酸是mRNA，则3′端序列可以是polydT序列(例如，6-20个连续dT核苷酸)，或者3′端可以包括用于随机地引发靶标的随机体(例如，6-10个或更多个核苷酸的随机序列)，或者3′端序列可以是基因特异性的以使一个或多个靶核酸特异性地扩增。在一些实施例中，寡核苷酸的3′序列与靶核酸上的通用序列粘结。例如，酶切法片段化可以引起衔接子序列插入到片段化的核酸的端部，并且3′端可以与衔接子序列反向互补。在一些实施例中，寡核苷酸可以与细胞DNA连接或在使用DNA聚合酶和细胞DNA作为模板的引物延伸反应中用作引物，以形成包含寡核苷酸序列以及细胞DNA的至少一部分的DNA分子。在这些实施例中的任何实施例中，寡核苷酸可以在其5′端处与固相载体(例如，任一珠粒)连接，或者可以在空腔中在与细胞核酸连接之前从载体中释放到溶液中。

在本文所述的实施例中的任何实施例中，与珠粒连接的寡核苷酸可以包含一个或多个条形码核苷酸序列的多个克隆拷贝。在一些实施例中，寡核苷酸包括对于其所附接的珠粒来说唯一的条形码序列，并且由此可以用于例如在寡核苷酸释放并且用于生成测序读段之后将寡核苷酸与不同珠粒区分开。例如，与寡核苷酸连接的大多数或基本上所有细胞核酸将包括相同的条形码序列，或者在多于一个水凝胶珠粒已引入多于一个寡核苷酸条形码(空腔中每个珠粒一个条形码克隆集合)的情况下，可以存在两个或若干个与来自相同细胞的不同核酸连接的不同条形码序列，从而需要向下游解卷积以去除或解密源自相同细胞的不同条形码编码的核酸。另外的条形码(如但不限于唯一分子标识符(UMI))或样品特定的条形码也可包括在寡核苷酸序列中，并且由此与细胞核酸连接。

任选地，可以将阻塞的纳米小瓶引入到液滴或其它分区中，以用于进一步操纵。在其它实施例中，不将阻塞的纳米小瓶引入到液滴或其它分区中，并且采用阻塞的纳米小瓶本身作为分区。

在中空纳米小瓶(或微孔)中完成如上所述的分子反应(例如条形码已与细胞核酸附接)后，可以将纳米小瓶(或微孔)的内容物组合成本体溶液。在一些实施例中，使阻塞纳米小瓶(或微孔)或纳米小瓶本身或两者中的开口的水凝胶珠粒消化或以其它方式降解，以允许纳米小瓶(或微孔)的内容物释放。这可以例如通过施加热或一种或多种使水凝胶珠粒或纳米小瓶或两者降解或溶解的试剂，从而使内容物释放来实现。在一些实施例中，水凝胶珠粒包含聚丙烯酰胺和作为可逆交联剂的N,N'-双(丙烯酰基)胱胺，所述可逆交联剂在与如二硫苏糖醇(DTT)或三(2-羧乙基)膦(TCEP)等还原剂或其它还原剂反应时溶解。在一些实施例中，改变纳米小瓶周围的溶剂，以使水凝胶珠粒收缩，并由此使纳米小瓶内容物释放。如上提到的，可以在存在例如乙醇、PEG(例如15％)和/或100mM MgCl₂的情况下诱导水凝胶珠粒收缩。

核酸然后可以是经核苷酸测序的。在已用寡核苷酸对核酸加标签后，可以根据需要制备用于核苷酸测序的加标签的核酸。例如，可以在加标签的序列的两个端部上添加通用引发序列(每个端部上一个通用引发序列)。可以根据需要使用任何核苷酸测序方法，只要确定DNA区段序列和条形码序列中的至少一些即可。用于高通量测序和基因分型的方法是本领域已知的。例如，此类测序技术包括但不限于焦磷酸测序、连接测序、单分子测序、合成序列(SBS)、大规模平行克隆、大规模平行单分子SBS、大规模平行单分子实时、大规模平行单分子实时纳米孔技术等。Morozova和Marra在《基因组学(Genomics)》，92：255(2008)中提供了对一些此类技术的综述，所述文献通过引用整体并入本文。

示例性DNA测序技术包括基于荧光的测序方法(参见例如，Birren等人，《基因组分析：分析DNA(Genome Analysis：Analyzing DNA)》，1，纽约的冷泉港实验室；所述文献通过引用以其整体并入本文)。在一些实施例中，利用本领域中理解的自动测序技术。在一些实施例中，本技术提供经分区的扩增子的平行测序(PCT公开第WO 2006/084132号，所述文献通过引用整体并入本文)。在一些实施例中，DNA测序通过平行寡核苷酸延伸来实现(参见例如，美国专利第5,750,341号；以及第6,306,597号，所述美国专利中的两者通过引用以其整体并入本文)。测序技术的另外的实例包括Church polony技术(Mitra等人，2003，《分析生物化学(Analytical Biochemistry)》320，55-65；Shendure等人，2005《科学(Science)》309，1728-1732；以及美国专利第6,432,360号；第6,485,944号；第6,511，803号；所述文献通过引用整体并入本文)；454皮滴定焦测序技术(Margulies等人，2005《自然》437，376-380；美国公开第2005/0130173号；所述文献通过引用整体并入本文)；Solexa单碱加成技术(Bennett等人，2005，《药物基因组学(Pharmacogenomics)》，6，373-382；美国专利第6,787,308号；以及第6,833,246号；所述文献通过引用整体并入本文)；Lynx大规模平行标记测序技术(Brenner等人(2000).《自然生物技术(Nat.Biotechnol.)》18∶630-634；美国专利第5,695,934号；第5,714,330号；所述文献通过引用整体并入本文)；以及Adessi PCR群落技术(Adessi等人(2000).《核酸研究(Nucleic Acid Res.)》28，E87；WO 2000/018957；所述文献通过引用以其整体并入本文)。

通常，高通量测序方法共有大规模平行高通量策略的共同特征，目标是与较旧测序方法相比降低成本(参见例如，Voelkerding等人，《临床化学(Clinical Chem.)》，55：641-658，2009；MacLean等人，《自然综述：微生物学(Nature Rev.Microbiol.)》，7：287-296；所述文献各自通过引用以其整体并入本文)。此类方法可以广泛地分成典型地使用模板扩增的方法和不使用模板扩增的方法。需要扩增的方法包括由罗氏公司(Roche)以454个技术平台(例如，GS20和GS FLX)商业化的焦磷酸测序、由因美纳公司(Illumina)商业化的Solexa平台和由应用生物系统公司(Applied Biosystems)商业化的支持寡核苷酸连接和检测(SOLiD)平台。非扩增方法(还被称为单分子测序)通过由螺旋生物科学公司(HelicosBioSciences)商业化的HeliScope平台和分别由VisiGen公司(VisiGen)、牛津纳米孔技术公司(OxfordNanopore Technologies Ltd.)、生命技术公司(Life Technologies)/IonTorrent和太平洋生物科学公司(Pacific Biosciences)商业化的平台例示。

本发明的实践可以采用本领域的技术之内的化学、生物化学、分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学和药理学的常规方法。此类技术在文献中得到充分解释。参见例如Gennaro，A.R.编辑(1990)《雷明顿氏药物科学(Remington's PharmaceuticalSciences)》，第18版，马克出版有限公司(MackPublishing Co.)；Hardman，J.G.，Limbird，L.E.和Gilman，A.G.编辑(2001)《治疗学的药理学基础(The Pharmacological Basis ofTherapeutics)》，第10版，麦克劳-希尔公司(McGraw-Hill Co.)；Colowick，S.等人编辑.，《酶学方法(Methods In Enzymology)》，学术出版社(Academic Press，Inc.)；Weir,D.M.和Blackwell，C.C.编辑(1986)《实验免疫学手册(Handbook ofExperimental Immunology)》，第I-IV卷，布莱克威尔科学出版社(BlackwellScientific Publications)；Maniatis，T.等人编辑(1989)《分子克隆：实验室手册》，第2版，第I-III卷，冷泉港实验室出版社；Ausubel，F.M.等人编辑(1999-2010)《当代分子生物学实验指南(Current Protocols in MolecularBiology)》，约翰威利父子出版公司(John Wiley&Sons)；Ream等人编辑(1998)《分子生物学技术：强化实验室课程(Molecular Biology Techniques：An Intensive LaboratoryCourse)》，学术出版社；Newton，C.R.和Graham，A.编辑(1997)《PCR(生物技术系列介绍)(PCR(Introduction to BiotechniquesSeries))》，第2版，施普林格出版社(SpringerVerlag)；Sambrook等人，《分子克隆：实验室手册》(第2版)(1989)。

在一些实施例中，在生成测序读段后，测序读段可以解卷积，以合并具有不同的但源自同一分区的条形码的测序读段。因此，在一些实施例中，可以使用上面所描述的方法，所述方法涉及确定共有的相同片段和组合样品读段的百分比，以假定在相同片段的百分比超过阈值时所有此类读段来自同一分区，例如美国专利公开2020/0056231中所述。用于使测序读段解卷积的其它方法(确定读段是来自同一分区还是不同分区)可以包括例如PCTWO2017/120531中描述的方法。例如，在一些实施例中，方法可以涉及在分区中提供包含条形码序列或重复克隆条形码序列的底物；并且在所述分区中，将与包含第一条形码序列的寡核苷酸引物缀合的第一颗粒和与包含第二条形码序列的寡核苷酸引物缀合的第二颗粒与来自所述底物的条形码序列缔合；由此生成所述分区中的颗粒的核酸签名，所述核酸签名可以用于将单独的条形码与同一分区中的条形码区分开(参见PCT WO2017/120531)。在用于使测序读段解卷积的其它方面(确定读段是来自同一分区还是不同分区)，方法可以包含：形成靶核酸的分区，所述分区包含正向引物或其反向补体，所述正向引物包含条形码和与3′序列互补的捕获序列，其中不同分区含有不同正向引物和分区ID标签寡核苷酸，所述不同正向引物包含不同条形码序列，所述分区ID标签寡核苷酸包含所述捕获序列的反向补体和可变分区ID标签序列；在分区中，使至少一种正向引物与分区ID标签寡核苷酸杂交，以形成经杂交的产物；对所述经杂交的产物进行扩增，以形成扩增子，其中至少一些扩增子是由正向引物和分区ID标签寡核苷酸形成的；以及对扩增子进行测序，其中如果不同正向引物形成具有相同可变分区ID标签序列的扩增子的话，则所述不同正向引物被视为来自同一分区。在这些实施例中的一些实施例中，正向引物和分区ID标签寡核苷酸在递送到分区时与相同底物连接；或分区ID标签寡核苷酸具有封闭的3′端，使得聚合酶在扩增期间不可以使封闭的3′端延伸；或分区ID标签寡核苷酸包含双链可变分区ID标签序列和一个或两个单链3′端，所述一个或两个单链3′端包含捕获序列的反向补体。参见例如PCT/US2019/015638。

阻塞的纳米小瓶或微孔还可以用于检测由细胞表达和任选地从细胞分泌的蛋白质。例如，在一些实施例中，与细胞靶蛋白特异性结合(例如，对其具有亲和力)的一种或多种结合剂可以与纳米小瓶或微孔连接。在一些实施例中，不同的靶蛋白存在不同的(例如，2种、3种、4种或更多种)结合剂。随后可以将细胞装载到如上所述的纳米小瓶或微孔中，并且可以用一个或多个水凝胶珠粒阻塞开口，同样如上所述。从细胞分泌的蛋白质可以累积在纳米小瓶或微孔中，并且将与亲和剂结合，由此基本上防止靶蛋白从纳米小瓶或微孔扩散。在一些实施例中，可以如上所述诱导细胞裂解，从而允许靶蛋白从细胞中释放，从而允许靶蛋白与亲和剂结合。

然后可以特异性地检测通过阻塞的纳米小瓶或微孔中的亲和剂结合的靶蛋白。在一些实施例中，例如通过扩散将直接或间接标记的第二结合剂引入到阻塞的纳米小瓶或微孔中，并且可以检测靶蛋白的存在、不存在或数量。这可以产生用于检测靶蛋白的夹心测定形式。在一些实施例中，来自结合的第二结合剂的信号足以允许对纳米小瓶进行分选(例如，FACS分选)，从而允许检测靶蛋白。在一些实施例中，在进行或不进行分选的情况下，可以洗涤来自纳米小瓶或微孔的过量未结合的第二结合剂，随后是特异性检测来自第二结合剂上的标记的信号。如本文所述，在一些实施例中，第一结合剂、第二结合剂或两种结合剂是抗体或其它结合分子，如链霉亲和素或生物素。在一些实施例中，标记是荧光的。在一些实施例中，存在多种(例如，2种、3种、4种或更多种)不同的第二结合剂，每种第二结合剂具有单独的可区分标记，从而允许单独检测(和任选地分选)不同靶蛋白。

还提供了如本文所述的组合物或用于执行所描述的方法的试剂盒。示例性组合物可以包括例如多个中空纳米小瓶(或微孔)，所述多个中空纳米小瓶含有一个或多个完整的或经裂解的细胞和阻塞纳米小瓶(或微孔)中的开口的一个或多个水凝胶珠粒。

先知实例

使跨开口的直径为35微米并且在内部空腔的基部处还具有整合素贴片的纳米小瓶悬浮在PBS、0.1％BSA、0.1％F68 pluronic和15％PEG 6000中。允许纳米小瓶通过重力沉降在位于皮氏培养皿(petri dish)的底部处的2D平面中。由于重力的中心被定位成远离开口，因此纳米小瓶在开口向上的情况下沉降。允许也悬浮在PBS、O.1％BSA、0.1％F68pluronic和15％PEG 6000中的B细胞通过重力沉降到纳米小瓶中。在所述细胞落到开口的基底后，细胞通过与整合素附接而与纳米小瓶结合。以<0.06的λ装载细胞，使得纳米小瓶中的大多数具有一个细胞或无细胞。还将悬浮在PBS、0.1％BSA、0.1％F68 pluronic和15％PEG 6000中的直径为三十二微米的克隆条形码凝胶珠粒添加到皮氏培养皿中，并且允许所述凝胶珠粒通过重力沉降到纳米小瓶的内部空腔中。仅存在足以装载每纳米小瓶一个凝胶珠粒的空间，因此所述凝胶珠粒不必以较低λ装载。最终结果是纳米小瓶中的＞80％将含有单个条形码凝胶珠粒。然后，这些克隆条形码凝胶珠粒通过用不含PEG的溶液交换缓冲液溶胀并密封开口。将含有1％NP-40的裂解试剂添加到缓冲液中。使非离子洗涤剂流动到细胞所位于的纳米小瓶空腔的中心，从而使细胞裂解。高分子量DNA和RNA被捕集在纳米小瓶与凝胶珠粒之间的空间中，因为纳米小瓶和凝胶珠粒中的孔径太小以至于不允许所述分子扩散。对含有捕集的RNA和DNA的纳米小瓶-凝胶珠粒复合物进行洗涤，以去除细胞裂解物，所述细胞裂解物是下游分子生物学反应的抑制剂。然后将小分子量逆转录酶与含核苷酸的主混合缓冲液一起添加到溶液中。由于酶的小分子量以及由此小的大小，所述酶和主混合物扩散到捕集的DNA和RNA。在mRNA的poly A尾与作为条形码寡核苷酸的一部分的poly T引物结合后，发生逆转录，从而对来自单个细胞的RNA进行条形码编码。为了使经条形码编码的RNA释放，然后将PEG以15％添加回到溶液中。凝胶珠粒由于PEG的存在而收缩，从而允许经条形码编码的cDNA自由扩散。分批完成样品制备，之后是进行测序。可以对单细胞RNA进行分组，并且由此可以通过根据克隆条形码序列对序列读段进行分箱来重构单细胞转录组。

应理解，本文所描述的实例和实施例仅出于说明性目的，并且根据其进行的各种修改或改变将由本领域的技术人员想到并且包括在本申请的精神和范围以及所附权利要求书的范围内。本文引用的所有出版物、专利和专利申请出于所有目的以全文引用的方式特此并入。

Claims (39)

1.一种在中空纳米小瓶中将寡核苷酸与细胞核酸连接的方法，所述方法包含：

将细胞装载到中空纳米小瓶中的开口中；

将一个或多个水凝胶珠粒插入到所述开口中，由此阻塞所述开口并且防止所述细胞从所述开口扩散；

使所述细胞在所述中空纳米小瓶中裂解；

将一种或多种寡核苷酸与由经裂解的细胞产生的核酸连接，由此对所述核酸进行条形码编码，其中所述寡核苷酸在所述装载之前存在于所述中空纳米小瓶中或通过所述水凝胶珠粒引入到所述中空纳米小瓶中。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述阻塞包含诱导插入到所述纳米小瓶中的所述一个或多个水凝胶珠粒溶胀。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述阻塞包含诱导所述纳米小瓶溶胀。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述纳米小瓶中的大多数含有一个或零个细胞。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述寡核苷酸与所述水凝胶珠粒连接，并且任选地在密封之后从所述水凝胶珠粒中释放。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述寡核苷酸与所述水凝胶珠粒连接，并且任选地在所述连接之前从所述水凝胶珠粒中释放。

7.根据权利要求5所述的方法，其中所述寡核苷酸具有条形码序列，其中单独的水凝胶珠粒包含所述寡核苷酸的克隆拷贝，并且其中与单独的水凝胶珠粒连接的所述条形码序列是唯一的，使得条形码将所述水凝胶珠粒与其它水凝胶珠粒区分开。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述寡核苷酸具有条形码序列，其中单独的纳米小瓶包含所述寡核苷酸的克隆拷贝，并且其中与单独的纳米小瓶连接的经测序的条形码是唯一的，使得条形码将所述纳米小瓶与其它纳米小瓶区分开。

9.根据权利要求1所述的方法，其进一步包含从所述纳米小瓶中提取经条形码编码的核酸，并且将来自不同纳米小瓶的经条形码编码的核酸组合成本体溶液，并且对来自所述本体溶液的所述经条形码编码的核酸进行核苷酸测序。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述裂解包含在所述纳米小瓶中使一种或多种裂解试剂扩散到所述细胞。

11.根据权利要求10所述的方法，其中在所述连接之前从所述纳米小瓶中去除裂解试剂或使所述裂解试剂失活。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述裂解包含在所述纳米小瓶中使蛋白质变性和或降解试剂扩散到所述细胞。

13.根据权利要求12所述的方法，其中在所述连接之前从所述纳米小瓶中去除裂解试剂或使所述裂解试剂失活。

14.根据权利要求1所述的方法，其中所述连接包含将所述寡核苷酸与所述核酸粘结，并且任选地使用所述核酸作为模板来对所述寡核苷酸进行模板依赖性延伸。

15.根据权利要求1所述的方法，其中所述连接包含使一种或多种连接试剂扩散到含有所述经裂解的细胞的经密封的纳米小瓶中。

16.根据权利要求14所述的方法，其中所述核酸是DNA，并且所述连接试剂包含DNA聚合酶或连接酶。

17.根据权利要求14所述的方法，其中所述核酸是RNA，并且所述连接试剂包含逆转录酶。

18.根据权利要求1所述的方法，其中所述连接包含通过点击化学反应将所述寡核苷酸与所述核酸连接。

19.根据权利要求1所述的方法，其中所述中空纳米小瓶包含右旋糖酐和聚乙二醇(PEG)。

20.根据权利要求1所述的方法，其中所述水凝胶珠粒包含聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、二氧化硅、聚甲基丙烯酸甲酯、藻酸盐、聚乙二醇(PEG)、尼龙(nylon)或琼脂糖。

21.根据权利要求1所述的方法，其中所述水凝胶珠粒包含与双丙烯酰胱胺交联的聚丙烯酰胺。

22.根据权利要求21所述的方法，其中溶胀是在所述水凝胶珠粒中通过使所述水凝胶珠粒与二硫键还原剂接触来诱导的。

23.根据权利要求1所述的方法，其中所述水凝胶珠粒包含通过使丙烯酰胺聚合而形成的聚丙烯酰胺和可光切割交联剂。

24.根据权利要求21所述的方法，其中所述可光切割交联剂是邻硝基苄基(o-NB)双丙烯酸酯。

25.根据权利要求23所述的方法，其中溶胀是在所述水凝胶珠粒中通过对所述可光切割交联剂进行接触光切割来诱导的。

26.多种中空纳米小瓶，其包含阻塞的开口，所述阻塞的开口防止细胞和所释放的细胞产物扩散，其中所述中空纳米小瓶中的至少一些包含一个或多个细胞，并且所述开口被封闭所述开口的水凝胶珠粒阻塞。

27.根据权利要求26所述的多种中空纳米小瓶，其中所述阻塞的开口是通过将一个或多个水凝胶珠粒引入到所述开口中并且然后诱导所述水凝胶珠粒溶胀使得所述水凝胶珠粒堵塞所述开口来形成的。

28.根据权利要求26所述的多种中空纳米小瓶，其中所述中空纳米小瓶包含右旋糖酐和聚乙二醇(PEG)。

29.根据权利要求26所述的多种中空纳米小瓶，其中所述水凝胶珠粒包含聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、二氧化硅、聚甲基丙烯酸甲酯、藻酸盐、聚乙二醇(PEG)、尼龙或琼脂糖。

30.根据权利要求26所述的多种中空纳米小瓶，其中所述多个中空纳米小瓶中的大多数含有一个或零个细胞。

31.根据权利要求26所述的多种中空纳米小瓶，其中单独的水凝胶珠粒包含寡核苷酸的克隆拷贝，并且所述寡核苷酸具有条形码序列，并且其中与单独的水凝胶珠粒连接的所述条形码序列是唯一的，使得条形码将所述水凝胶珠粒与其它水凝胶珠粒区分开。

32.根据权利要求31所述的多种中空纳米小瓶，其中所述条形码序列通过点击化学与单独的水凝胶珠粒连接。

33.根据权利要求26所述的多种中空纳米小瓶，其中所述寡核苷酸具有条形码序列，其中单独的纳米小瓶包含寡核苷酸的克隆拷贝，并且所述寡核苷酸具有条形码序列，并且其中与单独的纳米小瓶连接的所述条形码序列是唯一的，使得条形码将所述纳米小瓶与其它纳米小瓶区分开。

34.根据权利要求33所述的多种中空纳米小瓶，其中所述条形码序列通过点击化学与单独的纳米小瓶连接。

35.根据权利要求26至33中任一项所述的多种中空纳米小瓶，其中所述水凝胶珠粒包含与双丙烯酰胱胺交联的聚丙烯酰胺。

36.根据权利要求26至33中任一项所述的多种中空纳米小瓶，其中所述水凝胶珠粒包含通过使丙烯酰胺聚合而形成的聚丙烯酰胺和可光切割交联剂。

37.根据权利要求21所述的多种中空纳米小瓶，其中所述可光切割交联剂是邻硝基苄基(o-NB)双丙烯酸酯。

38.一种检测中空纳米小瓶或微孔中的细胞蛋白的方法，所述方法包含：

将细胞装载到中空纳米小瓶或微孔中的开口中；

将一个或多个水凝胶珠粒插入到所述开口中，由此阻塞所述开口并且防止所述细胞从所述开口扩散；以及

检测阻塞的纳米小瓶中的分泌的细胞蛋白。

39.根据权利要求38所述的方法，其中所述纳米小瓶或微孔包含结合剂，所述结合剂与一种或多种分泌的细胞蛋白特异性结合，并且所述分泌的细胞蛋白与所述结合剂结合，并且对所述分泌的细胞蛋白具有特异性的第二结合剂扩散到所述阻塞的纳米小瓶或微孔中，以特异性地检测在所述纳米小瓶或微孔中结合的所述分泌的细胞蛋白。