CN119301238A

CN119301238A - 用于免疫细胞大规模扩增和激活的系统和方法

Info

Publication number: CN119301238A
Application number: CN202380041907.XA
Authority: CN
Inventors: 利奥尔·拉维夫; 雪莉·巴卡尔; 多里娜·罗伯曼
Original assignee: Prairie Biotechnology Co ltd
Current assignee: Prairie Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-05-23
Filing date: 2023-05-23
Publication date: 2025-01-10
Anticipated expiration: 2043-05-23
Also published as: KR102807463B1; US20230374433A1; JP2025517978A; IL311991B1; EP4490261A1; AU2023276960A1; KR20250007697A; US20240200009A1; US12264308B2; WO2023228182A1; KR20240113975A; KR20250002852A; US11939562B2; CN119301238B; US12291702B2; IL311991A; IL311991B2; IL317934A; IL317933A; US20240392225A1

Abstract

本发明公开了用于免疫细胞的大规模扩增的三维(3D)生物反应器及其使用方法。3D生物反应器包括：包括至少一个多孔支架的至少一个填充床室；涂覆有一种或多种细胞外基质蛋白(ECM)的至少一个多孔支架；包含流体培养基的至少一个容器，该流体培养基配置成流过具有至少一个多孔涂覆支架的所述填充床室；和悬浮在流体培养基中的至少一种免疫细胞群，其中，涂覆有所述ECM的至少一个多孔支架创建模仿免疫细胞的自然生长环境的具有低剪切力的固定龛并且允许流过经涂覆的多孔支架的免疫细胞群的大规模扩增。

Description

用于免疫细胞大规模扩增和激活的系统和方法

技术领域

本发明涉及用于大规模培养和/或激活免疫细胞的系统和方法。更具体地，本发明涉及在填充床生物反应器中大规模培养和/或激活免疫细胞。

背景技术

哺乳动物细胞的培养在原理上是复杂的，这是由于它们的高敏感性、相对缓慢的增殖、复杂的分化过程和绝对无菌的基本条件。大规模细胞培养始终是具有挑战性的过程。即使小规模的细胞生长也需要关注和特定的知识，这是因为经常会遇到严重的问题。例如，在细胞培养物制备或测试过程期间，细胞培养物承受压力或损伤，因此，基于培养的细胞的任何分析都可能会显示至少部分是此类损伤的后果的结果。此外，将从在受损细胞上获得的结果得出的结论应用于体内情况或将细胞用于免疫疗法可能会导致致命的后果。此外，损伤或压力条件在单个细胞培养物之间是不可重现的并且可能会影响细胞的生长。当进行大规模细胞培养时，这些挑战变得甚至更加关键。近几十年来，已经进行了各种尝试。美国专利申请No.2006/0194320描述了用于培养细胞和/或组织的装置和方法，其模拟免疫活性组织的细胞结构和免疫功能，然而，该系统和方法被限制为4ml的体积。与本发明的领域相关的其它专利和专利申请是US 8911995和美国专利No.10472612。

另外，使用生物反应器进行细胞和组织培养是众所周知的。在https:// www.minerva-kg.de/libraryonline/upload/files/file_6400.pdf中提供了用于可重现的三维组织培养的生物反应器设计、原型设计(prototyping)和过程控制的详细概述。

在体外培养免疫细胞是进一步的挑战。近年来，人类免疫系统被用作能够识别和杀死肿瘤细胞的治疗技术的基础并且一直是抗癌免疫疗法的核心目标。因此，在提高该技术的有效性和可及性以使其广泛应用于过继细胞疗法(ACT)例如嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、树突状细胞(DC)、自然杀伤(NK)细胞等方面的兴趣日益增加。然而，为了实施该技术，当前用于培养免疫细胞的可用的系统无法满足需求，这是因为它们要么损害细胞，要么具有低效率，要么具有有限的扩大规模的能力，并且有些需要非常高的成本(参见：Ganeeva I.等人.2022“Recent Advances in the Development ofBioreactors for Manufacturing of Adoptive Cell Immunotherapies”,Bioengineering 2022,9,808.https://doi.org/10.3390/bioengineering9120808)。在这篇文章中，综述了迄今为止本领域已知的用于免疫细胞培养的主要培养方法及其优缺点。更详细地，在搅拌烧瓶(Stirred Flask)、G-Rex烧瓶(G-Rex flask)、摇摆运动生物反应器(Rocking motion bioreactor)、搅拌罐生物反应器(Stirred tank bioreactor)、中空纤维生物反应器(Hollow fiber bioreactor)和CliniMACS Prodigy之间进行比较。因此，迫切需要用于培养免疫细胞的可规模化、经济高效并且符合GMP的生物反应器。

本发明旨在提供用于大规模培养和/或激活免疫细胞群的系统和方法。

发明内容

在一个主要方面，本发明涉及用于培养和/或激活免疫细胞的大规模系统和方法。免疫细胞的有效大规模生长需要解决的挑战是避免或最小化可能会损害细胞的高剪切应力以获得高规模均质系统，并且创造允许细胞与激活剂和转染剂之间相互作用的条件，从而创造允许高的细胞间相互作用的物理龛(niche)和条件。

本发明在一个方面公开了用于使免疫细胞生长的方法和系统，其由位于流动培养基(flowing media)内的多孔固定相构成。固定相可以位于生物反应器内，或者可以位于功能上连接至生物反应器的分开的腔室中。如下文将详细描述的多孔元件位于填充床生物反应器的篮内并且是不可移动的，并且不随围绕它们并且流过它们的液体流而移动。固定相可以以各种形式实施并且旨在创建具有低流量和低剪切力的环境。

如本文所用的术语“多孔固定相”、“多孔支架”、“多孔元件”和“多孔涂覆支架”均涉及相同的含义，并且可以在下面的描述中可互换地使用。在一些实施方案中，多孔固定相涂覆有细胞外基质(Extra Cellular Matrix)(ECM)，并且其可以进一步涂覆有免疫系统细胞激活剂，以便激活和扩增免疫细胞。所有组件的组合为免疫系统细胞创建了模拟它们在组织和淋巴结中的自然环境的龛。

如本文所用的术语“激活剂”和“免疫细胞激活剂”均涉及相同的含义，并且可以在下面的描述中可互换地使用。在一些实施方案中，“激活剂”和“免疫细胞激活剂”是负载有在细胞表面上呈递的抗原的抗原呈递细胞。在另一个实施方案中，激活剂是针对免疫细胞表面上的激活受体的抗体。在又一个实施方案中，激活剂是与可以呈递至免疫细胞表面上的激活受体的分子缀合的抗原。

如本文所用的术语“龛”涉及具有孔的固定相，例如但不限于允许液体和颗粒流过的支架、珠和载体。颗粒可以是细胞，或合成或天然的其它组分。

所创建的龛在免疫细胞自然生长的微环境方面模拟淋巴结/组织，以实现最佳的细胞生长。此外，由于所创建的龛模仿细胞的自然环境，因此它允许激活细胞，使得只有某些细胞对激活有响应，从而对所需细胞进行某些选择。

此外，所创建的龛允许免疫细胞大规模生长，同时还维持相对低的剪切力以使细胞损伤最小化。

术语“培养基(Media)”和“培养基(Medium)”均旨在是同义的并且可以在下文可互换地使用。

术语“填充床室”、“填充床篮”、“篮”、“生长篮”均旨在是同义的并且可以在下文可互换地使用。

本文提及细胞或细胞群的“生长”旨在与具有或不具有细胞的激活的细胞群的扩增、细胞群的培养是同义的。

如本文所用的术语“免疫细胞”、“免疫细胞群”和“淋巴细胞”均涉及相同的含义并且可以在下面的描述中可互换地使用。

在某些实施方案中，淋巴细胞在没有实质分化的情况下扩增。在各种实施方案中，描述的扩增是在2D基材(substrate)上、在3D基材上、或者在2D基材上接着是在3D基材上。

在一些实施方案中，淋巴细胞在生物反应器中孵育，其非限制性实例是悬浮培养和在3D载体上培养。术语“生物反应器培养”指的是在通常无菌的设备(生物反应器)中培养，其中将细胞维持在受控条件下，如将在下文参考图1所描述。

本文提及免疫细胞或免疫细胞群的“激活”旨在与将免疫细胞暴露于导致细胞形态的变化并且触发通过各种各样的细胞因子和趋化因子的快速增殖和分泌而检测到的免疫应答的抗原同义。

因此，在一个主要方面，本发明涉及用于免疫细胞的大规模扩增的三维(3D)生物反应器，其包括：a)包括至少一个多孔支架的至少一个填充床室；b)涂覆有一种或多种细胞外基质蛋白(ECM)的至少一个多孔支架；c)包含流体培养基的至少一个容器，该流体培养基配置成流过具有至少一个多孔涂覆支架的所述填充床室；和d)悬浮在流体培养基中的至少一种免疫细胞群；其中，涂覆有所述ECM的至少一个多孔支架配置为创建模仿免疫细胞的自然生长环境的具有低剪切力的固定龛并且允许流过经涂覆的多孔支架的免疫细胞群的大规模扩增。

所述至少一个多孔支架可以进一步涂覆有或连接有至少一种免疫细胞激活剂。在一些任选的实施方案中，免疫细胞激活剂是负载有抗原或未负载有抗原的抗原呈递细胞(APC)或直接与经涂覆的多孔支架缀合的抗原中的一者。在APC未负载抗原的情况下，抗原可以根据需要在稍后阶段呈递以激活免疫细胞。

在进一步的选择中，在将免疫细胞群暴露于与免疫细胞激活剂缀合的至少一个多孔涂覆支架后，扩增的免疫细胞可以在填充床室内被进一步激活。

在另一种选择中，在暴露于悬浮的可溶性免疫细胞激活剂后，扩增的免疫细胞可以在填充床室内被进一步激活，并且用至少一个多孔ECM涂覆支架进一步扩增。

在本发明的一些实施方案中，扩增和/或激活的免疫细胞群被收获或在将附着于至少一个经涂覆的多孔支架的APC暴露于抗原后被重新激活，以对免疫细胞群产生额外激活信号。

此外，在一些进一步的实施方案中，免疫细胞群被收获或通过将扩增的免疫细胞转移至包括涂覆有不同或相似的免疫细胞激活剂的至少一个多孔支架的不同生物反应器来被重新激活。

多孔支架可以是在填充床室内部空间内扩展的单一多孔支架基质(porousscaffold matrix)，或者其可以是填充填充床室的多个微型(mini)多孔支架或微(micro)多孔支架。

在本发明的一些进一步任选的实施方案中，通过使用掺入生物反应器培养基中的基因修饰剂对免疫细胞群进行基因修饰。

本发明进一步涉及用于在三维(3D)生物反应器中大规模扩增免疫细胞的方法，其包括：a)将至少一个多孔支架插入至少一个填充床室中；b)用一种或多种细胞外基质蛋白(ECM)涂覆所述至少一个多孔支架；c)使来自至少一个容器的流体培养基循环，该流体培养基配置成流过包括至少一个多孔涂覆支架的所述填充床室；和d)将至少一种免疫细胞群悬浮在循环的流体培养基中；其中，涂覆有所述ECM的至少一种多孔支架配置为创建模仿免疫细胞的自然生长环境的具有低剪切力的固定龛并且允许流过至少一个多孔支架的免疫细胞群的大规模扩增。

该方法可以进一步包括在用ECM涂覆支架的步骤之后用至少一种免疫细胞激活剂涂覆至少一个多孔支架的步骤，以及在将至少一种免疫细胞群悬浮在循环的流体培养基中之后将免疫细胞群暴露于至少一种激活剂的步骤，以在所述填充床室内扩增和激活免疫细胞群。

该方法可以进一步包括使用掺入流体培养基中的基因修饰剂对3D生物反应器内的免疫细胞进行基因修饰的步骤。

在一些任选的实施方案中，该方法进一步包括收获免疫细胞或细胞的一部分并且在相同的生物反应器中或在不同的生物反应器中进一步扩增和重新激活免疫细胞群的步骤。

另外地或可选地，上述方法可以进一步包括收获免疫细胞的步骤，接着是在系统外部进行基因修饰、然后将经基因修饰的免疫细胞重新接种到相同的生物反应器中或不同的生物反应器中的步骤。

此外，在进一步的方面，本发明旨在提供用于免疫细胞群的大规模扩增和激活的三维(3D)生物反应器，其包括：a)包括至少一个多孔抗原呈递细胞模拟支架(AntigenPresenting Cell Mimetic Scaffold)(APC-MS)的至少一个填充床室；b)涂覆有一种或多种细胞外基质蛋白(ECM)的至少一个APC-MS；c)包含流体培养基的至少一个容器，该流体培养基配置为流过所述经涂覆的多孔APC-MS；和d)悬浮在所述流体培养基中的至少一种免疫细胞群；其中，所述至少一个APC-MS创建模仿免疫细胞群的自然生长环境的具有低剪切力的固定微环境并且允许流过其的所述免疫细胞群的大规模扩增和/或激活。

在将经涂覆的多孔APC-MS暴露于抗原后，免疫细胞群可以被重新激活，以对免疫细胞群产生额外激活信号。

在一些任选的实施方案中，通过将细胞转移至包括至少一个具有不同或相似抗原的经涂覆的多孔APC-MS的不同生物反应器来重新激活免疫细胞群。

按照本发明的实施方案，所述至少一个多孔APC-MS可以由在填充床室内部空间内扩增的单一单元制成，或者其可以是填充填充床室的多个微型多孔APC-MS/微多孔APC-MS。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管与本文所述的方法和材料相似或等同的方法和材料可以用于本发明的实践或测试中，但下面描述了合适的方法和材料。在冲突的情况下，以包括定义的专利说明书为准。另外，材料、方法和实例仅是说明性的并且不旨在限制。

附图说明

在本文中仅通过实施例的方式参考附图描述本发明。在现在详细地具体参考附图的情况下，需要强调的是，通过实施例的方式示出细节并且仅出于对本发明的实施方案的说明性讨论的目的，并且为了提供对本发明的原理和概念方面的有用且易于理解的说明而呈现。在这一点上，没有试图比基本理解本发明所必需的更详细地显示出本发明的结构细节，结合附图进行的描述使本发明的数种形式可以如何在实践中实施对于本领域技术人员而言是显而易见的。

在附图中：

图1是根据本发明的实施方案的用于生长、激活和收获免疫细胞群的任选的填充床生物反应器的示意图。

图2是以高水平描述制备和使用填充床生物反应器以激活、扩增和收获免疫细胞的主要步骤顺序的流程图。

图3A-3D是图1的填充床生物反应器100在免疫细胞群的生长过程的不同阶段的示意性局部正视图，其中图3A示出了其中填充床篮包含未涂覆支架的初始阶段；图3B示出了包含涂覆支架并且填充有ECM蛋白溶液的填充床篮；图3C示出了其中图3B的涂覆支架进一步连接到至少一种类型的免疫细胞激活剂的填充床篮；并且图3D示出了其中涂覆支架连接到一种或多种激活剂并且免疫细胞在培养基中流动的填充床生物反应器。

图4是在填充床生物反应器中生长7天后T细胞激活和增殖的流式细胞图，其中细胞的激活和增殖在第0、5和7天测量。

图5A是在填充床生物反应器中生长10天的MAIT细胞的激活和增殖的流式细胞图，其中细胞的激活和增殖在第0、5、7和10天测量。

图5B是在第10天将细胞从第一生物反应器转移到第二生物反应器并且在第二生物反应器中额外生长7天后MAIT细胞生长的流式细胞图。

图6是针对三种不同免疫细胞类型Jurkat、PBMC和MAIT细胞的在生物反应器填充床内部和外部的细胞分布的图示。

图7是不同尺寸的填充床生物反应器的示意图，示出了本发明的系统的高的可扩展性(scalability)。

具体实施方式

在详细解释本发明的至少一个实施方案之前，应当理解本发明在其应用中不限于以下描述中阐述的或由实施例示例的细节。本发明能够有其它实施方案或以各种方式实践或进行。此外，应当理解，本文采用的措辞和术语是出于描述的目的并且不应该被视为限制性的。

本发明旨在提供用于各种免疫细胞群的大规模扩增和激活的系统和方法。

在一个主要方面，本发明提供用于免疫细胞的大规模扩增的3D生物反应器，其包括：a)包括至少一个多孔支架的至少一个填充床室；b)涂覆有一种或多种ECM蛋白的至少一个多孔支架；c)包含流体培养基的至少一个容器，该流体培养基配置成流过具有至少一个多孔涂覆支架的所述填充床室；和d)悬浮在流体培养基中的至少一种免疫细胞群；其中，涂覆有所述ECM的至少一个多孔支架配置为创建模仿免疫细胞的自然生长环境的具有低剪切力的固定龛并且允许流过该经涂覆的多孔支架的免疫细胞群的大规模扩增。

在进一步的方面，本发明提供用于在三维(3D)生物反应器中大规模扩增免疫细胞的方法，其包括：a)将至少一个多孔支架插入至少一个填充床室中；b)用一种或多种细胞外基质蛋白(ECM)涂覆所述至少一个多孔支架；c)使来自至少一个容器的流体培养基循环，该流体培养基配置成流过包括至少一个多孔涂覆支架的所述填充床室；和d)将至少一种免疫细胞群悬浮在循环的流体培养基中；其中，涂覆有所述ECM的至少一个多孔支架配置为创建模仿免疫细胞的自然生长环境的具有低剪切力的固定龛并且允许流过所述至少一个多孔支架的免疫细胞群的大规模扩增。

此外，在一个进一步的方面，本发明提供用于免疫细胞群的大规模扩增和激活的3D生物反应器，其包括：a)包括至少一个多孔APC-MS的至少一个填充床室；b)涂覆有一种或多种ECM蛋白的至少一个APC-MS；c)包含流体培养基的至少一个容器，该流体培养基配置为流过所述经涂覆的多孔APC-MS；和d)悬浮在所述流体培养基中的至少一种免疫细胞群；其中，所述至少一个APC-MS创建模仿免疫细胞群的自然生长环境的具有低剪切力的固定微环境并且允许流过其的所述免疫细胞群的大规模扩增和/或激活。

本发明的主要方面和实践本发明的任选方式将通过下文描述的各种示例性非限制性附图和实施例的以下详细描述而得以更好地理解。现在参考附图：

图1是根据本发明的实施方案的用于免疫细胞群的生长、激活和收获的任选的填充床生物反应器100的示意性截面图。

在所描绘的实施方案中，生长和振动室116(下文中表示为“篮”)负载有至少一个多孔支架10。术语“载体”和“支架”可以可互换地使用并且两者都是指配置为如将参考图2详细描述的那样被涂覆并且在篮内创建减少剪切力并且模拟免疫细胞群的自然环境的固定龛的多孔元件。篮壁1161优选地与生物反应器内壁40分开并且可以上下移动。生物反应器100是经由入口管120的液体培养基，入口管120被配置并且可操作以将各种培养基递送到生物反应器中，然后任选地进行高压灭菌。在其他实施方案中，在灭菌之后，用生长培养基替换液体，生长培养基充满篮116及其内容物。篮116实际上将生物反应器100内的流体分成三个主要部分：上部122，其主要包含经由入口管120插入的新鲜培养基，中部124，其包含围绕涂覆支架的篮116内的培养基，以及下部126，其主要包含流过篮的培养基，并且与上部122处的新鲜培养基相比，其通常缺乏由中部处的免疫细胞消耗的营养物质(在中部，当它们流过至少一个多孔涂覆支架、与其它细胞相互作用、和/或被激活时，它们的流速降低)，并且富含由免疫细胞分泌的化合物和碎片(debris)。在本文描述的实施方案中，上部122处的培养基由叶轮119搅拌，叶轮119产生如箭头109所示的流体的运动。在又进一步的实施方案中，各种参数例如温度、pH、溶解氧浓度等在作为系统建立程序的过程的开始设定(参见下图2的流程)，并且根据需要不断地调整以适应悬浮条件。在另外进一步的实施方案中，使用培养基的缓慢初始搅拌速率来促进细胞粘附到涂覆支架，然后搅拌速率可以增加。如果需要，可以从培养基中收获细胞用于进行最终产品制造或用于免疫细胞的进一步扩增，如以下所详细描述(图2)。在一些实施方案中，叶轮119的旋转在导流管150中产生负压，其将具有细胞的培养基从下部126拉过导流管150，然后通过叶轮119端口进入上部122，从而使培养基和免疫细胞在连续环路中均匀地沿根据箭头109的方向循环。在本发明的又进一步的实施方案中，可以通过经由电极106监测各种参数来进行培养基的调整以便控制培养基的各种参数。在一些任选的实施方案中，环形喷射器(ring sparger)(不可见)位于叶轮曝气室11内部，用于经由从外部端口103添加的气体和喷射器管线7对流过叶轮119端口的培养基供氧，外部端口103可以保持在壳体5内部。在一些其他任选的实施方案中，气体可以通过入口120添加。可选地，喷射的气体可以被限制在远端室中并且被冲刷系统的营养培养基吸收。在一些任选的实施方案中，水套117覆盖生物反应器100内的培养基区域，具有用于将水套水移入13和移出14的端口。移除管110沿着生物反应器设置并且在下部培养基部分126内具有开口，以允许(如果需要)从篮116下方的培养基中收获免疫细胞。移除管110也可以用于移除碎片，并且在部分移除使用过的培养基和添加新鲜培养基后更新培养基。

在一些实施方案中，可以使用连续搅拌罐生物反应器，其中将培养基连续地给送到生物反应器中并且将产物连续地抽出，以在生物反应器内维持时间常数稳态(time-constant steady state)。具有纤维床篮的搅拌罐生物反应器是可从例如New BrunswickScientific Co.,Edison,NJ)获得的。可以使用的其它生物反应器例如但不限于固定床生物反应器、具有多活性泡沫的灌注生物反应器、包括管状聚-L-乳酸(PLLA)多孔支架的径向流灌注生物反应器和适用于本发明的目的的本领域已知的任何其他生物反应器。“固定床生物反应器”指的是在生长培养基的存在下细胞生长基材通常不会从孵育容器的底部升起的生物反应器。例如，基材可以具有足够的密度以防止被升起和/或其可以通过机械压力来填充以防止其被升起。基材可以是单一主体或多个主体。通常，基材在生物反应器的标准搅拌速率期间基本保持在原位。在一些实施方案中，多个载体松散地填充，例如形成浸没在营养培养基中的松散填充床。

此外，在某些实施方案中，使用灌注生物反应器，其中灌注室包含3D基材。在某些实施方案中，3D基材呈多孔支架10的形式。多孔支架可以由包围填充床室的全部体积或大部分体积的单一大单元制成。可选地，使用的多孔支架可以是多个微型颗粒。在一些进一步任选的实施方案中，多孔支架可以是例如大载体(macro carrier)、微载体(microcarrier)或其混合物。商购可得的载体的非限制性实例包括基于藻酸盐(GEM,Global CellSolutions)、基于葡聚糖(GE Healthcare)、基于胶原(PercellBiolytica)和基于聚苯乙烯(SoloHill Engineering)的微载体。

在某些实施方案中，T细胞在具有“APC-MS”的生物反应器中孵育，在本文中使用的术语“APC-MS”是指附着有淋巴细胞激活部分或与淋巴细胞激活部分关联的支架(在更具体的实施方案中，其可以是本文提及的任何支架)，其更具体的实施方案是附着至激活部分或涂覆有激活部分的纤维载体或介孔二氧化硅微棒(mesoporous silica micro-rod)。

除非另有说明，否则术语填充床生物反应器是指在生长培养基的存在下细胞生长基材通常不会从孵育容器的底部升起的生物反应器。例如，基材可以具有足够的密度以防止被升起和/或其可以通过机械压力来填充以防止其被升起。基材可以是单一主体或多个主体。通常，基材在以生物反应器的标准灌注速率进行灌注期间基本保持在原位。在某些实施方案中，该定义不排除基材可能会在异常快的灌注速率下(例如大于200rpm)被升起。

在其他实施方案中，生物容器用于扩增细胞，在进一步的实施方案中，其适用于悬浮培养。在各种实施方案中，生物容器用于和/或适用于分批培养、补料分批培养或连续培养。

图2是以高水平描述根据本发明的实施方案的用于扩增、激活和收获免疫细胞群的填充床生物反应器系统的制备和使用的主要步骤顺序的流程图。

系统建立步骤310包括系统的组装、用所需量的多孔支架填充生物反应器篮、连接所需电极用于在系统使用期间监测和控制培养参数(例如pH、溶解氧、温度)、连接必要的管道用于新鲜营养物质供给和副产物移除、密封和进行完整性测试以及通过在高压灭菌器中的蒸汽灭菌对系统进行灭菌。灭菌后，将系统连接到生物反应器控制站并且校准电极。

在下文中也表示为“载体”的多孔支架可以由天然材料或合成材料制成并且可以具有各种尺寸。商购可得的载体的一些非限制性实例包括基于藻酸盐(GEM,Global CellSolutions)、基于葡聚糖(GE Healthcare)、基于胶原(PercellBiolytica)和基于聚苯乙烯(SoloHill Engineering)的载体。可选地或另外地，支架可以包括纤维材料，任选粘附性纤维材料，其可以是例如织造纤维基质、非织造纤维基质或二者之一。纤维支架的非限制性实例是包含聚酯网的载体，例如New Brunswick ScientificCo.^TM 盘，可从Eppendorf^TMAG,Germany商购获得，并且包括聚丙烯支承体；和微多孔载体，例如BioNOC^TMII载体，可从CESCO BioProducts(Atlanta,GA)商购获得并且由PET(聚对苯二甲酸乙二醇酯)制成。在某些实施方案中，所提及的纤维基质包括聚酯、聚丙烯、聚亚烷基、聚氟氯乙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯或聚砜。在更具体的实施方案中，纤维基质选自聚酯和聚丙烯。

为了创建模拟免疫细胞的自然环境的环境，进行ECM涂覆步骤312。在该步骤中，通过使用盘上的亲水性端基，通过简单地将支架浸入包含ECM蛋白的溶液中以产生静电相互作用，使得用不同材料涂覆支架是可应用的。细胞外基质对免疫细胞的作用的详细描述在Sutherland T.E等人,“The extracellular matrix and the immune system:A mutually dependent relationship”,Science.2023Feb.17；379(6633)；PMID:36795835中提供。应当清楚的是，可以使用其他支架并且描述的盘是非限制性实例。另外，可以用天然ECM组分或合成ECM组分进行支架的涂覆。

以这种方式，例如，不同的蛋白质例如但不限于白蛋白、纤连蛋白、纤维蛋白、纤维蛋白原、胶原、透明质酸、弹性蛋白、层粘连蛋白、选择素等可以用于涂覆支架并且创建与自然环境相似的环境。例如，为了模拟淋巴结的结构，支架可以用III型胶原涂覆，III型胶原是作为淋巴结ECM的主要组分的网状纤维的主要构建要素(building block)。此外，不同的器官具有不同的ECM蛋白组合并且因此不同的组合或浓度可以用于涂覆。在不同的实施方案中，粘附分子可以缀合至支架或涂覆支架的蛋白质以促进免疫细胞与ECM涂覆的支架之间更强的相互作用。例如，本领域已知E-选择素、P-选择素、ICAM1、ICAM2和VCAM1是白细胞与ECM之间相互作用的促进剂，并且有助于将白细胞导向发炎组织。基于此，用这些分子涂覆支架可以增加白细胞和ECM涂覆的支架之间的相互作用。可选地，ECM涂覆(步骤312)在系统建立(步骤310)之后发生，并且接着是支架的激活涂覆步骤(步骤314)。在不同的实施方案中，(取决于产物和其激活配体)多孔支架的激活涂覆步骤(步骤314)在ECM涂覆(步骤312)之后发生。

步骤314描述了用免疫细胞激活配体涂覆支架的部分。部分314可以在312之前或之后进行。免疫细胞需要被通常发生在淋巴结中或受感染组织中的抗原呈递来激活。通过用ECM组分涂覆支架并且在低剪切环境中提供抗原呈递，所创建的龛模拟激活发生的自然环境。在一个实施方案中，在用血清ECM蛋白涂覆ECM后，贴壁或半贴壁细胞可以附着于构成支架的纤维。由于一些免疫细胞需要与由抗原呈递细胞(APC)呈递的抗原相互作用以便被激活，因此在涂覆步骤312之后的步骤314期间接种负载有抗原的APC。APC粘附在支架上并且可以将抗原呈递至不同的免疫细胞，例如T细胞、B细胞及其所有亚群。在不同的实施方案中，可以将APC接种到生物反应器中并且以非抗原呈递形式粘附到支架上，然后在细胞粘附后，可以将抗原掺入填充生物反应器的培养基中以便呈递给例如T细胞和B细胞等免疫细胞。该实施方案的更具体实例是使用单核细胞来激活粘膜相关恒定T细胞(Mucosal-associated invariant T cell，MAIT)。在该实例中，在用胎牛血清蛋白涂覆支架后将PBMC接种到生物反应器中，单核细胞粘附在支架上并且其余细胞悬浮在培养基中。在初始细胞接种后，将5-OP-RU(5-(2-氧代亚丙基氨基)-6-D-核糖醇基氨基尿嘧啶)(用于MAIT的激活的抗原)掺入培养基中以便由单核细胞呈递并且特异性地激活MAIT细胞。在本发明的一个不同的实施方案中，免疫细胞的激活可以通过缀合到没有APC的支架上的抗原来调节。抗原可以是针对免疫细胞上的特定激活受体的抗体、被例如TCR等激活受体识别的蛋白质。例如，将支架用单克隆抗CD3(OKT3)抗体和抗CD28(CD28.2)抗体涂覆，以提供与T细胞受体结合的共刺激信号。在孵育期之后，进行阻断步骤，然后进行洗涤步骤。在洗涤步骤之后，进行用胎牛血清蛋白涂覆支架。当更换培养基并且将PBMC接种到生物反应器中时，细胞通过与ECM和抗体涂覆的支架的相互作用而被激活。

另一个实例是使用负载或未负载5-OP-RU的MR1单体、四聚体和其他形式来激活MAIT细胞。当使用未负载5-OP-RU的MR1时，5-OP-RU的掺入在进行阻断和洗涤步骤后发生。

步骤316描述了包括用于激活和扩增的目标细胞的细胞的接种的部分。在该步骤中，不同来源的免疫细胞可以用于接种目标细胞，即从血液单采术(blood apheresis)收集的PBMC、从特定器官或肿瘤分离的PBMC。免疫细胞可以使用新鲜的或冷冻的。在该步骤中，将免疫细胞接种到生物反应器中。使用不同的环境参数，例如但不限于搅拌速度、PH、溶解氧、温度等，细胞可以粘附或保持悬浮在生物反应器中。贴壁细胞可以进入填充床室，与涂覆支架上的ECM蛋白相互作用，并且在填充床内部创建细胞组织的微观结构(cellularorganized microstructure)。根据该实施方案，可以将APC接种到生物反应器中并且以非抗原呈递模式粘附到支架上，并且创建模拟淋巴结的环境直到激活发生。该实施方案的更具体实例是使用单核细胞以便激活粘膜相关恒定T细胞(MAIT)。在这样的实例中，在将支架用胎牛血清蛋白涂覆后，将PBMC接种在生物反应器中，单核细胞粘附在支架上并且其余细胞悬浮在培养基中。非贴壁细胞可以保持悬浮在生物反应器中(在流动相内)，并且迁移到填充床室中或迁移出填充床室，以产生与贴壁细胞的细胞间相互作用。

在步骤316接种免疫细胞之后，需要决定是否对扩增的细胞群进行基因编辑(步骤318)。如果不进行基因编辑，则转到步骤326。

步骤326描述了目标细胞的扩增阶段，其中控制环境参数例如搅拌速度、PH、溶解氧、温度等。在该步骤中，生物反应器不断加热，并且向系统中提供预设的气体混合物，以便将所需的条件维持在预定的所需范围内。一旦细胞被接种并且激活发生，无论是通过具有所负载配体的APC或是通过涂覆有激活剂(抗体)的支架，都会在生物反应器中模拟感染状态并且触发一系列机制，其导致抗原特异性免疫细胞的克隆扩增，在此期间抗原特异性免疫细胞大量扩增并且高达～90％的总免疫细胞可能会变为抗原特异性的。为了支持免疫细胞的快速扩增，进行足够的营养物质的供给和抑制性代谢物的移除，而不干扰局部微环境。在某些实施方案中，生物反应器可以以分批模式、补料分批模式和/或灌注模式运行。在本发明的另一个实施方案中，灌注系统(TFF、ATF、BioSep等)可以连接到生物反应器。使用灌注系统，可以更换来自生物反应器的培养基而不从系统中提取细胞。灌注系统允许从系统中移除条件培养基，将悬浮细胞与条件培养基分离并且同时通过来自液位电极(levelelectrode)的指令、重量、根据预设的流速或手动地将新鲜培养基供给到生物反应器中。在该实例中，每天对条件培养基取样以测量培养基中悬浮细胞的数量和必需底物(substrate)的浓度，根据细胞的量和营养物质的浓度，计算要供给的新鲜培养基的量。

在步骤328中，将培养基与免疫细胞一起从用于收获目标细胞的系统中排出并且洗涤步骤优选在生物反应器系统外部继续进行。在该实施方案中，培养基更换步骤可以使用间歇式离心机或连续流离心机(kSep和unifuge等)进行。在培养基更换之后，在步骤332可以使细胞或细胞的一部分返回到生物反应器中以用新鲜的生长培养基继续扩增。可选地，可以在步骤330将收获的细胞转移到免疫细胞的下游加工以制造最终产品。

如果对目标细胞进行基因编辑，则在步骤322对免疫细胞进行基因修饰以添加或删除特定的性状。使用例如添加新的靶向受体或激活受体、或删除用于自我识别的特定受体或删除不需要的目标受体等修饰来转化免疫细胞以用于更好地治疗不同适应症。在该步骤(322)中，基因修饰剂可以通过非病毒剂例如脂质体(liposomes)(脂质转染胺(lipofectamine)等)、聚合物(PEI等)或如下文所述的电穿孔过程、或通过病毒载体例如逆转录病毒(Retrovirus)、慢病毒(Lentivirus)、腺病毒(Adenovirus)、腺相关病毒(Adeno-Associated virus)或其它插入生物反应器中。这些基因修饰剂可以负载有如下的RNA或DNA构建体，所述RNA或DNA构建体可以使用例如CRISPR/Cas9、转座体(睡美人(sleepingbeauty)，PiggyBac)和DNA结合域(锌指结构域等)等方法将新数据添加到基因组中或删除。在这些实施方案中，在支架涂覆(312、314)、细胞接种(316)激活之后和在细胞扩增(326)期间，将基因修饰剂例如病毒载体掺入生物反应器培养基中。在该阶段，可以改变搅拌和其他环境参数例如PH和温度以使细胞为被基因修饰剂更好地穿透做好准备。在掺入后，在适当的条件下进行孵育期以允许基因修饰剂穿透到细胞中。

此外，在一些任选的实施方案中，可以根据步骤(328)从生物反应器收获激活的免疫细胞并且无菌地转移至电穿孔或其他2D烧瓶装置以允许基因修饰剂在步骤322通过电穿孔或病毒和非病毒方法穿透到细胞中。在该实施方案中，在孵育期之后，可以将免疫细胞重新接种到生物反应器中进行洗涤步骤或在2D烧瓶中进行洗涤步骤。

在孵育期之后，开始洗涤步骤324。在洗涤步骤(324)期间，将生物反应器中的培养基更换几次以从系统中提取基因修饰剂。在本发明的一个实施方案中，灌注系统(TFF、ATF和BioSep等)连接到生物反应器。使用灌注系统，可以更换来自生物反应器的培养基而无需从系统中提取细胞。灌注系统转移出旧培养基，并且同时通过来自液位电极的指令、重量或手动地将新培养基注射到生物反应器中。该过程可以进行数个室体积直到在提取的培养基中没有发现基因修饰剂。可选地，在细胞的扩增(步骤326)之后在步骤328中从系统中排出或收获具有细胞和基因修饰剂的培养基，并且洗涤步骤在生物反应器外部继续进行。在该实施方案中，培养基更换步骤可以通过使用间歇式离心机或连续流离心机(例如kSep、Unifuge)来完成。在培养基更换之后，可以将细胞重新接种到起始生物反应器或新的生物反应器(332)中以进一步扩增。

在达到扩增持续时间或者达到所需的最终产物或将细胞接种到更大规模生物反应器所需的免疫细胞浓度后，进行细胞收获步骤(328，340)。在一个实施方案中，通过在搅拌或不搅拌的情况下简单地将培养基排出系统来进行收获步骤。在不同的实施方案中，填充床篮连接到如同一申请人在WO 2012/140519中详细描述的收获系统，WO 2012/140519通过引用以其整体并入本文，然后在排出步骤期间进行支架篮的缓慢振动以从所创建的填充床支架龛中释放捕获的悬浮免疫细胞而不会对细胞造成物理损伤。此外，在收获步骤的所有实施方案中，可以进行培养基重新填充和排出的循环以从系统收集所有细胞。在每个循环中将提取的细胞排入无菌的收集元件中用于进一步加工。

在本发明的一个进一步的实施方案中，在收获步骤(328,340)结束时，对细胞或收获的细胞的一部分进行进一步下游加工(330,342)以制造最终产品。该步骤包括使用不同系统例如连续流离心机、过滤器、声学过滤装置等完成的浓缩和洗涤步骤。浓缩和洗涤步骤之后是使用各种各样的分离方法的特定的细胞收集步骤和或产品的最终配制，然后将最终产品装入其最终包装(小瓶或冷冻袋)中。

此外，在本发明的不同实施方案中，在收获步骤之后，将收获的免疫细胞或收获的细胞的一部分用于进一步扩增(332)。进一步扩增通过如下来完成：在现有的生物反应器中进行步骤316或将细胞转移到更大规模的生物反应器，例如具有30g支架的1.5L生物反应器、具有100g支架的3.5L生物反应器或具有375g支架的10L生物反应器。此外，新的生物反应器的目的可以仅用于使用ECM涂覆支架进行扩增(步骤334)，或进行另一激活步骤以重新激活细胞。重新激活可以例如在新的生物反应器中用相同的激活剂完成(步骤336)，或者其可以在新的生物反应器中用新的激活剂进行(步骤338)。在这两个任选的实施方案中，新的生物反应器均根据上述步骤310至314预先准备。

在不同的任选的实施方案中，目标细胞的重新激活可以在第一生物反应器中或在新的生物反应器中通过添加可溶性激活剂例如transact或抗CD3和抗CD28抗体或通过添加可以由APC呈递的可溶性抗原(如果它们已经位于生物反应器中)来进行。

图3A-3D是填充床生物反应器在免疫细胞的培养过程的不同阶段的示意性局部正视图。图3A示出了其中生物反应器100的填充床篮116仅包含未涂覆的多孔支架10的系统的建立阶段。

更详细地，填充床室116的顶部边界和底部边界由各自具有预定直径的多个孔1321的穿孔盘132构成。穿孔盘132在下文中也表示为：“盘(disc)”、“网格(grid)”、“上部网格(upper grid)”、“下部网格(lower grid)”、“中间网格(middle grid)”，都可以可互换地使用，并且是指篮416的上壁、中壁或下壁。在一些任选的实施方案中，如上面参考图2详细描述的，多孔支架插入篮116中并且可以占据篮的部分体积或大部分体积。在该阶段，生物反应器100可以没有液体。篮116优选连接到一个或多个配置成允许篮116的竖直运动的振动杆136。篮116的振动可以用于在如图2所述的扩增过程期间或结束时收获目标细胞。篮116具有与生物反应器100的壁40分离的壁1161以允许篮的上下移动，同时还维持具有目标细胞的培养基的流动方向仅通过上盘和下盘132。篮116位于生物反应器100内生物反应器底部的上方，使得上部122和下部126界定包括填充床篮116的中部124。

图3B示出了包含涂覆支架10'并且填充有液体培养基50的填充床篮116。为了创建适合于模拟免疫细胞群的自然环境的环境，如以上图2和本发明的实施例中详细描述的，多孔支架应该首先用ECM涂层涂覆。在进行ECM涂覆之后，可以将多孔支架10'进一步涂覆或连接到至少一种类型的抗体1022或抗体呈递细胞(APC)1033，如图3C所示。在多孔支架的制备完成后，可以将免疫细胞1044接种在生物反应器中，如图3D所示。如图3D所示，免疫细胞随着培养基流接种在生物反应器的所有部分内，并且可以在篮116内的上部122、下部126和中部124中找到，这是因为多孔涂覆支架创建了模拟免疫细胞的自然环境的具有低剪切力的龛，从而允许免疫细胞1044的最佳扩增。另外，在暴露于抗原和/或APC后，免疫细胞1044如前所述被激活。

在某些实施方案中，免疫细胞1044在生物反应器100中在APC模拟支架(APC-MS)上孵育。在进一步的实施方案中，随后从多孔涂覆支架收获免疫细胞，用于掺入药物组合物中。

在进一步任选的实施方案中，例如在填充床或固态支架的情况下，将免疫细胞在轻柔搅拌下接种以促进均匀分布。在微载体的情况下，将APC-MS和T细胞轻柔地悬浮并且轻柔地混合。在任一情况下，在接种后，灌注和搅拌停止至少一段时间以允许T细胞和APC-MS之间的相互作用以及随后的激活。

图4是在填充床生物反应器中生长7天后T细胞激活和增殖的流式细胞图，其中细胞的激活和增殖在第0、5和7天测量。通过包括3个激光器(405nm、488nm、638nm)和13个用于荧光检测的通道的流式细胞仪CytoFLEX^TM分析细胞群分布。

将PBMC细胞接种到包含具有针对T细胞激活提供信号的固定抗体(抗CD3抗体和抗CD28抗体两者)的载体的生物反应器填充床中。在第0、5、7天，通过测量CD69(经由TCR激活后表达的可诱导的细胞表面标志物)和CD25(IL-2受体的α-链)表达来评估T细胞的激活，CD69和CD25是通常与T细胞激活相关的激活标志物。获得的结果证明成功刺激T淋巴细胞激活和增殖，由CD3标志物从第0天的～44％增加到第7天的～91％表明。这些结果具体地表明，T淋巴细胞经7天时间增殖。CD69和CD25从第0天的～4％、～8％上调至第7天的～42％、90％，表明T细胞的激活。此外，在第7天的收获步骤之后，在所有细胞的收集样品中，未检测到细胞标志物的变化，表明生物反应器内没有其他细胞群。此外，未检测到激活标志物水平的变化，表明细胞的收获不影响细胞状态。

CD69是经由TCR或IL-2受体(CD25)激活后表达的可诱导的细胞表面标志物。它在激活的T淋巴细胞的增殖和存活中起作用。

图5A是在填充床生物反应器中生长10天的MAIT细胞的激活和增殖的流式细胞图，其中细胞的激活和增殖在第0、5、7和10天测量。通过流式细胞仪CytoFLEX^TM分析细胞群分布。

将IVB的单核细胞接种到包含模拟自然环境并且促进APC的附着的ECM涂覆的载体的填充床生物反应器中。MAIT细胞激活由5-OP-RU抗原和IL-15诱导。在数个时间点(第0、5、7和10天)评估MAIT细胞的激活和增殖。通过CD3、Vα7.2、CD161标志物的表达检测MAIT细胞群。结果表明MAIT细胞的比例增加，从第0天的22.6％开始并且在第10天高达96.26％。此外，激活标志物CD69和CD25的表达从第0天至第7天增高并且到第10天降低。

图5B是在第10天将细胞从第一生物反应器转移到第二生物反应器并且在第二生物反应器中额外生长7天后MAIT细胞生长的流式细胞图。收获在第一生物反应器中到第10天达到最大生长能力的细胞，然后将这些细胞中的约30％接种到设计与第一生物反应器相似的第二生物反应器中。使细胞额外生长7天。流式细胞术结果证明，MAIT百分比在大部分时间相似，但表现出从第14天的>90％下降至第17天的82％。CD69标志物表达在第17天从30％上调至87％，表明MAIT细胞维持它们的激活信号，而CD25如预期的那样逐渐降低。

图6是在两个不同的生长日、针对三种不同免疫细胞类型Jurkat、PBMC和MAIT细胞的在生物反应器填充床内部和外部的细胞分布的图示。以百分比显示。

盘特性和填充床结构允许在生物反应器系统内部创建模拟细胞的自然环境的龛，细胞可以在其中停留一段时间，内部剪切应力低。图6显示了生物反应器填充床内部和外部的细胞分布。根据通过伴随填充床振动的数个洗涤步骤进行的填充床收获之前和之后的细胞计数来计算这些值。结果显示，在整个生长期的不同的填充床收获时间点，在所有三种给定的免疫细胞类型下，所有活细胞中的至少40％在填充床内部。

由于在细胞接种后几小时观察到细胞浓度的显著降低，因此可以推测在整个细胞扩增期维持以下细胞分布模式。

图7是不同尺寸的填充床生物反应器的示意图，示出了本发明的系统的高的可扩展性。根据本发明的任选的实施方式，免疫细胞群的第一次接种可以在具有微型篮416的微型填充床生物反应器400中进行，其中微型生物反应器400的总最大体积由其容器尺寸490限定。细胞在生物反应器400中扩增后，可以将细胞或细胞的一部分重新接种在具有大于篮416并且相对于生物反应器400允许更大数量的多孔支架和更高的细胞扩增的填充床篮516的更大尺寸的生物反应器500中，这是因为生物反应器500的总体积更高并且由其容器尺寸590决定。可以对具有篮616和容器690的更大的生物反应器600进行相同的过程，依此类推直至达到具有允许免疫细胞的多倍生长的容器尺寸790的、具有最大篮716的最大生物反应器700。根据以上提供的方法和实例，可以理解在每个生物反应器中，免疫细胞群的生长和激活的条件可以与在较小生物反应器中的前一生长阶段相似，或者可以不同。在该过程结束时，获得由相似或不同激活剂激活的免疫细胞的大规模生长。

实施例

现在参考以下实施例，其与以上描述一起以非限制性方式说明某些实施方案。

实施例1

填充床生物反应器中Jurkat细胞的扩增。

组装0.5L填充床MiniBio反应器，其包含2.5克盘，然后在高压灭菌器中在122.5℃的温度下和超过大气压1巴的压力下通过蒸汽灭菌进行灭菌30分钟。之后，将MiniBio反应器连接到Applikon MiniBio控制站。

将盘用补充有10％热灭活胎牛血清(HI-FBS)和0.1％50mg/ml庆大霉素的RPMI-1640在37℃预孵育约24小时，在孵育期间，血清蛋白与盘上的亲水性端基静电相互作用并且在上产生模拟细胞自然环境的细胞外基质(ECM)涂层。

将81.6×10⁶个细胞解冻到补充有10％ HI-FBS和0.1％50mg/ml庆大霉素的RPMI-1640中，在接种时将解冻的细胞稀释至0.24×10⁶个细胞/ml的目标浓度。将制备的细胞悬液接种到设定为以下条件的生物反应器系统中：温度为37℃、80％溶解氧(DO)、pH7.4和150rpm的搅拌，使得生物反应器内部的总体积达到340ml。

在培养的第3天，将培养基更新25％(意味着添加25％的新鲜培养基)。在培养的第4天，由于在非常短的时间内大量增殖，因此从填充床生物反应器中收获细胞。总细胞数达到830×10⁶个细胞，意味着扩增10.4倍(结果详见表1)。填充床内部和外部的细胞分布如图6所示。

实施例2

填充床生物反应器中外周血单核细胞(PBMC)的激活、扩增和收获。

将外周血单核细胞(PBMC)从人外周血中分离，并且通过过滤和密度梯度培养基Lymphoprep^TM(Ficoll)分离。通过RBC X1裂解缓冲液耗竭红细胞(Red blood cells)(红血球(erythrocytes))。将分离的群体在HI-FBS和二甲基亚砜(DMSO)冷冻溶液中冷冻保存。

用单克隆抗CD3(OKT3)抗体和抗CD28(CD28.2)抗体涂覆盘，二者都提供与T细胞受体结合的共刺激信号。根据在PBS中稀释为0.21μg/cm²计算各激活剂的量。将最终溶液在100rpm下在室温(RT)下孵育3小时并且在37℃下孵育1.5小时。

用激活剂孵育后进行阻断程序，额外用1％BSA溶液在RT和100rpm下孵育1小时。然后，排干并且用PBS以150rpm洗涤10分钟。

然后准备填充床生物反应器并且用由补充有10％HI-FBS、1％丙酮酸钠(100mM)和0.1％50mg/ml庆大霉素的RPMI-1640构成的生长培养基在37℃下平衡培养约24小时。在该孵育期间，血清蛋白与盘上的亲水性端基静电相互作用并且在上产生模拟细胞自然环境的ECM涂层。

将262×10⁶个细胞解冻到补充有10％HI-FBS、1％丙酮酸钠(100mM)、IL-2(100U/L)和0.1％50mg/ml庆大霉素的RPMI-1640中，在接种时将解冻的细胞稀释至0.97×10⁶个细胞/ml的目标浓度。将制备的细胞悬液接种到设定为以下条件的生物反应器系统中：温度为37℃、80％DO、pH7.4和100rpm的搅拌，使得生物反应器内部的总体积达到270ml。接种后，细胞在生物反应器内分布在填充床和“外部”环境之间，并且接种后3小时观察到细胞浓度的降低。

在生长期期间，每天对生长培养基和细胞悬液(在“外部”环境中)取样以测量pH、细胞浓度(通过Vi-Cell)、根据营养物质消耗测量细胞代谢活性(通过Cedex生物分析仪)和通过流式细胞仪(CytoFLEX^TM)测量细胞群分布。

在第3、5和6天分别进行5.5％、32％和20％的培养基更新。在培养的第7天，从填充床生物反应器中收获细胞，这是因为已经达到最大生长能力。总细胞数达到1073×10⁶个，91％CD3阳性，意味着扩增8.5倍。培养物内不同细胞群的比例及其随时间的变化如图4所示。填充床内部和外部的细胞分布如图6所示。

实施例3

填充床生物反应器中粘膜相关恒定T细胞(MAIT)的培养：激活、扩增、收获、重新扩增和第二次收获。

将血液单核细胞从人胎盘静脉血(IVB)中分离，并且通过过滤和密度梯度培养基Lymphoprep^TM(Ficoll)分离。通过RBC X1裂解缓冲液耗竭红细胞(红血球)。将分离的群体在HI-FBS和二甲基亚砜(DMSO)冷冻溶液中冷冻保存。

将盘用补充有10％ HI-FBS的RPMI-1640在37℃孵育约24小时，在孵育期间，血清蛋白与盘上的亲水性端基静电相互作用，并且在上产生模拟细胞自然环境的ECM涂层。

将300±20×10⁶个细胞解冻到补充有1％的L-谷氨酰胺200mM和0.1％50mg/ml庆大霉素的 Nutri-T GMP培养基中，将解冻的细胞稀释至1×10⁶个细胞/ml的目标浓度。将制备的细胞悬液接种到设定为以下条件的生物反应器系统中：温度为37℃、80％DO、pH7.4和100rpm的搅拌，至最终体积为300ml。接种后，细胞在生物反应器内分布在填充床和“外部”环境之间，并且接种后3小时观察到细胞浓度的降低。

接种后3小时，MAIT细胞经由其T细胞受体(TCR)激活。通过TCR的激活途径需要共刺激信号，其包括在MHC I类样(MHC Class I-like)分子MR1上呈递的源自微生物的核黄素代谢产物的识别，以及CD28、TLR激动剂、细菌产物或细胞因子的共刺激。

从人胎盘IVB分离的初始细胞群包括可以经由MR1激活MAIT细胞的各种抗原呈递细胞(APC)例如树突状细胞、单核细胞、B细胞。将作为源自微生物的核黄素中间体的5-OP-RU以250nM的浓度添加到生长培养基中，以由MR1上的APC呈递至MAIT细胞TCR。还将浓度为50ng/ml的IL-15添加到生长培养基中，以刺激MAIT细胞(经由在MAIT细胞上表达的IL-15R)来产生IFN-γ并且释放颗粒酶B和穿孔素。

在生长期期间，每天对生长培养基和细胞悬液取样以测量pH、细胞浓度(通过Vi-Cell)、根据营养物质消耗测量细胞代谢活性(通过Cedex^TM生物分析仪)和通过流式细胞仪(CytoFLEX^TM)测量细胞群分布。

细胞在填充床生物反应器中生长10天，在第3、5和7天分别进行5％、5.2％和100％的培养基更新。在培养的第10天，从填充床生物反应器中收获细胞，这是因为已经达到最大生长能力。总细胞数达到1089×10⁶个，94％MAIT细胞(Vα7.2阳性，CD161高)，意味着扩增43.5倍。培养物内不同细胞群的比例及其随时间的变化如图5A所示。

在培养的第10天从生物反应器收获细胞后，检查细胞的进一步扩增。组装额外的0.5L填充床MiniBio反应器并且与先前相同地制备包含2.5克盘的无菌系统，用补充有10％HI-FBS的RPMI-1640在37℃下预孵育约24小时，以在盘上提供ECM涂层并且为重新接种的细胞创建自然环境。

ECM涂覆后，将填充床生物反应器用由补充有1％的L-谷氨酰胺200mM和0.1％50mg/ml庆大霉素的 Nutri-T GMP培养基构成的生长培养基预平衡培养。将295×10⁶个收获的细胞接种到生长培养基中，稀释至～1×10⁶个细胞/ml的目标浓度。将制备的细胞悬液接种到设定为以下条件的生物反应器系统中：温度为37℃、80％DO、pH7.4和100rpm的搅拌，至最终体积为300ml。将浓度为50ng/ml的IL-15添加到生长培养基中以诱导MAIT细胞扩增。

在生长期期间，每天对生长培养基和细胞悬液取样以测量pH、细胞浓度(通过Vi-Cell)、根据营养物质消耗测量细胞代谢活性(通过Cedex生物分析仪)和通过流式细胞仪(CytoFLEX^TM)测量细胞群分布。

使细胞在填充床生物反应器中额外生长7天，在培养的第12天和第14天分别进行26.5％和100％的培养基更新。在培养的第17天，从填充床生物反应器收获细胞。总细胞数达到490×10⁶个，88％ MAIT细胞(Vα7.2阳性，CD161高)，意味着扩增1.5倍。培养物内MAIT细胞的相对百分比及其随时间的变化如图5B所示。

下表1总结了三种不同免疫细胞类型Jurkat、PBMC和MAIT的初始和最终总活细胞、它们的相对群体份额和生长期期间的扩增倍数：

表1

如表中所示，所有扩增倍数结果均高于1，表明所有三种给定免疫细胞类型以及MAIT细胞的第二生长阶段的细胞扩增。另外，表1显示了细胞群平衡的转变，其在所考察的生长期结束时达到超过94％的目标细胞(生长7天后的T细胞和生长10天后的MAIT细胞)。MAIT第二生长期显示MAIT细胞百分比的轻微下降(从94％至86％)。

实施例4

填充床生物反应器中源自外周血单核细胞(PBMC)的B细胞的扩增、激活和收获。

将外周血单核细胞(PBMC)从人外周血中分离，并且通过过滤和密度梯度培养基Lymphoprep^TM(Ficoll)分离。通过RBC X1裂解缓冲液耗竭红细胞(红血球)。将分离的群体在HI-FBS和二甲基亚砜(DMSO)冷冻溶液中冷冻保存。

组装0.5L填充床MiniBio反应器，其包含2.5克盘，然后在高压灭菌器中在122.5℃的温度和超过大气压1巴的压力下通过蒸汽灭菌进行灭菌30分钟。之后，将MiniBio反应器连接到Applikon MiniBio控制系统。

用抗CD40抗体涂覆盘，以提供激活信号。激活剂的量根据在PBS中稀释为1μg/cm²来计算。将最终溶液在100rpm下在室温下孵育3小时并且在37℃下孵育1.5小时。用激活剂孵育之后是阻断程序，额外用1％BSA溶液在室温、100rpm下孵育1小时。然后排干并且用PBS以150rpm洗涤10分钟。

将盘用补充有10％ HI-FBS和100IU/ml青霉素-链霉素的RPMI 1640在37℃预孵育约24小时，在孵育期间，血清蛋白与盘上的亲水性端基静电相互作用并且在上产生模拟细胞自然环境的ECM涂层。

将300×10⁶个细胞解冻到补充有5％热灭活胎牛血清(FBS)、2mM的L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、50μM的β-巯基乙醇、100IU/ml青霉素-链霉素、重组人IL-4(10ng/ml)和IL-21(10ng/ml)的RPMI 1640中。在接种时将解冻的细胞稀释至1×10⁶个细胞/ml的目标浓度。将制备的细胞悬液接种到设定为以下条件的生物反应器系统中：温度为37℃、80％DO、pH7.4和100rpm的搅拌，使得生物反应器内部的总体积达到300ml。接种后，细胞在生物反应器内分布在填充床和填充床篮周围的“外部”环境之间，每天取样以测量pH、细胞浓度(通过Vi-Cell)、细胞代谢活性。

在生长期期间，生长培养基和细胞悬液(在“外部”环境中)根据营养物质消耗(通过Cedex生物分析仪)和通过流式细胞仪(CytoFLEX^TM)的细胞群分布。

在第4天和第6天进行50％的培养基更新。在培养的第8天，从填充床生物反应器收获细胞。

实施例5

填充床生物反应器中源自外周血单核细胞(PBMC)的iNKT细胞的激活、扩增和收获。

组装0.5L填充床MiniBio反应器，其包含2.5克盘，然后在高压灭菌器中在122.5℃的温度下和超过大气压1巴的压力下通过蒸汽灭菌进行灭菌30分钟。之后，将MiniBio反应器连接到Applikon MiniBio控制系统。

将盘用补充有10％HI-FBS和100IU/ml青霉素-链霉素的RPMI 1640在37℃预孵育约24小时，在孵育期间，血清蛋白与盘上的亲水性端基静电相互作用，并且在上产生模拟细胞自然环境的ECM涂层。

将600×10⁶个细胞解冻到补充有10％HI-FBS、2mM的L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、10mM HEPES缓冲液、0.1mM MEM非必需氨基酸、5.5μM的β-巯基乙醇、100IU/ml青霉素-链霉素和100IU/ml重组人IL-2的RPMI 1640中。在接种时将解冻的细胞稀释至2×10⁶个细胞/ml的目标浓度。将制备的细胞悬液接种到设定为以下条件的生物反应器系统中：温度为37℃、80％DO、pH7.4和100rpm的搅拌，使得生物反应器内部的总体积达到300ml。接种后，细胞在生物反应器内分布在填充床和“外部”环境之间。接种后3小时，通过向生物反应器培养基中掺入100ng/mlα-半乳糖神经酰胺以在位于粘附在盘上的抗原呈递细胞(来自PBMC群体)上的CD1d上呈递来开始激活步骤。

在第3天和第6天进行70％的培养基更新。在培养的第7天，从填充床生物反应器收获细胞。

实施例6

填充床生物反应器中源自外周血单核细胞(PBMC)的γδT细胞的激活、扩增和收获。

将300×10⁶个细胞解冻到补充有10％HI-FBS、2mM的L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、10mM HEPES缓冲液、0.1mM MEM非必需氨基酸、50μM的β-巯基乙醇、100IU/ml青霉素-链霉素和300IU/ml的IL-2的RPMI 1640中。在接种时将解冻的细胞稀释至1×10⁶个细胞/ml的目标浓度。将制备的细胞悬液接种到设定为以下条件的生物反应器系统中：温度为37℃、80％DO、pH7.4和100rpm的搅拌，使得生物反应器内部的总体积达到300ml。接种后，细胞在生物反应器内分布在填充床和“外部”环境之间。接种后3小时通过向生物反应器培养基掺入5μM唑来膦酸来开始激活步骤。

在生长期期间，每天对生长培养基和细胞悬液(在“外部”环境中)取样以测量pH、细胞浓度(通过Vi-Cell)、根据营养物质消耗测量细胞代谢活性(通过Cedex生物分析仪)和通过流式细胞仪(CytoFLEX^TM)测量细胞群体分布。

在第4、7、10和13天进行50％的培养基更新。在培养的第14天，从填充床生物反应器收获细胞。

实施例7

填充床生物反应器中源自外周血单核细胞(PBMC)的自然杀伤(NK)细胞的激活、扩增和收获。

使用RosetteSep(STEMCELL Technologies；常规≥95％ CD56+CD3-)将自然杀伤(NK)细胞从人外周血单核细胞(PBMC)中分离，并且通过过滤和密度梯度培养基Lymphoprep^TM(Ficoll)分离。通过RBC X1裂解缓冲液耗竭红细胞(红血球)。然后将分离的群体在HI-FBS和DMSO冷冻溶液中冷冻保存。

将盘用补充有10％HI-FBS和100IU/ml青霉素-链霉素的RPMI 1640在37℃预孵育约24小时，在孵育期间，血清蛋白与盘上的亲水性端基静电相互作用，并且在上产生模拟细胞自然环境的细胞外基质(ECM)涂层。

将900×10⁶个NK细胞解冻到补充有10％HI-FBS、2mM的L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、10mM HEPES缓冲液、0.1mM MEM非必需氨基酸、100IU/ml青霉素-链霉素的RPMI 1640中。在接种时将解冻的细胞稀释至3×10⁶个细胞/ml的目标浓度。将制备的细胞悬液接种到设定为以下条件的生物反应器系统中：温度为37℃、80％DO、pH7.4和100rpm的搅拌，使得生物反应器内部的总体积达到300ml。接种后，细胞在生物反应器内分布在填充床和“外部”环境之间。对于预激活，向培养基补充重组人IL-12(10ng/mL)、IL-18(50ng/mL)和IL-15(50ng/mL)并且培养16±2小时，随后进行洗涤步骤，然后在补充有重组人IL-15(1ng/mL)的生长培养基中培养。

在生长期期间，每天对生长培养基和细胞悬液(在“外部”环境中)取样以测量pH、细胞浓度(通过Vi-Cell)、根据营养物质消耗测量细胞代谢活性(通过Cedex生物分析仪)和通过流式细胞仪CytoFLEX^TM测量细胞群分布。

在第4天和第7天进行30％的培养基更新。在培养的第8天，从填充床生物反应器收获细胞。

应当理解，为了清楚起见而在分开的实施方案的上下文中描述的本发明的某些特征也可以在单一实施方案中组合提供。相反，为了简洁起见而在单一实施方案的上下文中描述的本发明的各种特征也可以分开地或以任何合适的子组合提供。

尽管已经结合本发明的具体实施方案描述了本发明，但是对于本领域技术人员，许多替代物、修改和变化将是显而易见的。因此，本发明旨在包括落入权利要求和说明书的精神和广泛范围内的替代物、修改和变化。本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请以及GenBank登录号以其整体通过引用至说明书中并入本文，其程度如同每个单个的出版物、专利或专利申请或GenBank登录号被具体地和单独地指示通过引用并入本文。另外，本申请中任何参考文献的引用或标识不应被解释为承认此类参考文献可作为本发明的现有技术。

Claims

1.一种用于免疫细胞的大规模扩增的三维(3D)生物反应器，其包括：

a.包括至少一个多孔支架的至少一个填充床室；

b.涂覆有一种或多种细胞外基质蛋白(ECM)的至少一个多孔支架；

c.包含流体培养基的至少一个容器，所述流体培养基配置成流过具有至少一个多孔涂覆支架的所述填充床室；和

d.悬浮在所述流体培养基中的至少一种免疫细胞群；

其中，涂覆有所述ECM的所述至少一个多孔支架配置为创建模仿免疫细胞的自然生长环境的具有低剪切力的固定龛并且允许流过经涂覆的多孔支架的免疫细胞群的大规模扩增。

2.根据权利要求1所述的3D生物反应器，其中所述至少一个多孔支架进一步涂覆或连接有至少一种免疫细胞激活剂。

3.根据权利要求2所述的3D生物反应器，其中所述免疫细胞激活剂是负载有抗原或未负载有抗原的抗原呈递细胞(APC)或直接与所述经涂覆的多孔支架缀合的抗原中的一者。

4.根据前述权利要求中任一项所述的3D生物反应器，其中所述扩增的免疫细胞在将所述免疫细胞群暴露于与所述免疫细胞激活剂缀合的至少一个多孔涂覆支架后在所述填充床室内被进一步激活。

5.根据前述权利要求中任一项所述的3D生物反应器，其中所述扩增的免疫细胞在暴露于悬浮的可溶性免疫细胞激活剂后在所述填充床室内被进一步激活，并且用至少一个多孔的涂覆有ECM的支架进一步扩增。

6.根据前述权利要求中任一项所述的3D生物反应器，其中所述免疫细胞群被收获或在将附着于至少一个经涂覆的多孔支架的APC暴露于抗原后被重新激活，以对所述免疫细胞群产生额外激活信号。

7.根据前述权利要求中任一项所述的3D生物反应器，其中所述免疫细胞群被收获或通过将扩增的免疫细胞转移至包括涂覆有不同或相似的免疫细胞激活剂的至少一个多孔支架的不同的生物反应器来被重新激活。

8.根据前述权利要求中任一项所述的3D生物反应器，其中所述至少一个多孔支架是在所述填充床室内部空间内扩展的单一多孔支架基质、或填充所述填充床室的多个微型多孔支架或微多孔支架。

9.根据前述权利要求中任一项所述的3D生物反应器，其中使用掺入生物反应器培养基中的基因修饰剂对所述免疫细胞群进行基因修饰。

10.一种用于在三维(3D)生物反应器中大规模扩增免疫细胞的方法，其包括：

a.将至少一个多孔支架插入至少一个填充床室中；

b.用一种或多种细胞外基质蛋白(ECM)涂覆所述至少一个多孔支架；

c.使来自至少一个容器的流体培养基循环，所述流体培养基配置成流过包括至少一个多孔涂覆支架的所述填充床室；和

d.将至少一种免疫细胞群悬浮在循环的流体培养基中；

其中，涂覆有所述ECM的所述至少一个多孔支架配置为创建模仿免疫细胞的自然生长环境的具有低剪切力的固定龛并且允许流过所述至少一个多孔支架的免疫细胞群的大规模扩增。

11.根据权利要求10所述的方法，其进一步包括在步骤9(b)之后用至少一种免疫细胞激活剂涂覆所述至少一个多孔支架的步骤以及在步骤9(d)之后将所述免疫细胞群暴露于所述至少一种激活剂的步骤，以在所述填充床室内扩增和激活所述免疫细胞群。

12.根据权利要求11所述的方法，其进一步包括使用掺入所述流体培养基中的基因修饰剂对所述3D生物反应器内部的免疫细胞进行基因修饰的步骤。

13.根据权利要求10-12所述的方法，其进一步包括收获免疫细胞或所述细胞的一部分并且在相同的生物反应器中或在不同的生物反应器中进一步扩增和重新激活所述免疫细胞群的步骤。

14.根据权利要求13所述的方法，其进一步包括收获免疫细胞的步骤，接着是在系统外部进行基因修饰、然后将经基因修饰的免疫细胞重新接种到相同的生物反应器中或不同的生物反应器中的步骤。

15.一种用于免疫细胞群的大规模扩增和激活的三维(3D)生物反应器，其包括：

a.包括至少一个多孔抗原呈递细胞模拟支架(APC-MS)的至少一个填充床室；

b.涂覆有一种或多种细胞外基质蛋白(ECM)的至少一个APC-MS；

c.包含流体培养基的至少一个容器，所述流体培养基配置为流过所述经涂覆的多孔APC-MS；和

d.悬浮在所述流体培养基中的至少一种免疫细胞群；

其中，所述至少一个APC-MS创建模仿所述免疫细胞群的自然生长环境的具有低剪切力的固定微环境并且允许流过其的所述免疫细胞群的大规模扩增和/或激活。

16.根据权利要求15所述的3D生物反应器，其中所述免疫细胞群在将所述经涂覆的多孔APC-MS暴露于抗原后被重新激活，以对所述免疫细胞群产生额外激活信号。

17.根据权利要求15-16所述的3D生物反应器，其中所述免疫细胞群通过将细胞转移至包含至少一个具有不同或相似抗原的经涂覆的多孔APC-MS的不同生物反应器而被重新激活。

18.根据权利要求15-17所述的3D生物反应器，其中所述至少一个多孔APC-MS是在所述填充床室内部空间内扩展的单一单元，或者是填充所述填充床室的多个微型多孔APC-MS/微多孔APC-MS。