CN119280211B - 二价金属乳酸盐在制备修复神经损伤的制品中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及二价金属乳酸盐在制备预防、改善、修复、治疗神经损伤的制品中的应用。优选地，所述二价金属乳酸盐包括乳酸钙、乳酸镁、乳酸锌、乳酸亚铁的一种或多种的组合。本发明提供了一种修复中枢和外周神经损伤的新治疗方式，在外伤等原因导致的中枢神经损伤或者病毒、糖尿病、化疗药等原因导致的周围神经炎或周围神经感觉异常的治疗和修复方面具有广阔的应用前景。

Description

二价金属乳酸盐在制备修复神经损伤的制品中的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及二价金属乳酸盐在制备预防、改善、修复、治疗神经损伤的制品中的应用。

背景技术

中枢和周围神经系统构成了人体的完整神经系统，神经系统在维持机体内环境稳态，保持机体完整统一性及其与外环境的协调平衡中起着主导作用。随着社会现代化进程的加深，交通事故、运动意外等不可避免的增加，同时潜在的暴力事件以及自然灾害都有可能导致神经系统的损伤。

脊髓损伤是一种严重的中枢神经系统损伤，可导致患者的感觉和运动功能受损，给患者的家庭和社会带来严重负担。脊髓损伤是一个复杂而精细的过程，根据神经元损伤病理过程分为原发性损伤和继发性损伤。其中，决定脊髓损伤严重程度的主要在继发性损伤阶段，这主要是因为在继发性损伤过程中，脊髓损伤微环境发生明显变化，主要包括活性氧水平上升，受损的血管阻碍了氧气的输送进而导致的缺氧，炎症反应增加等，再加上神经自身恢复能力较差，导致脊髓损伤后不能自然再生。在临床中，手术或康复训练对脊髓损伤患者的疗效有限，不能有效促进神经再生和功能恢复。因为脊髓损伤后复杂的病理生理过程，临床上现有的单一疗法在脊髓损伤治疗中的效果均不尽如人意。目前自体神经移植被认为是治疗神经缺损的金标准，但是供体神经来源有限以及供区神经功能缺损都极大限制了其临床应用。因而，临床上对于使用安全、疗效确切、价格低廉、给药方法简单的用于治疗脊髓损伤的药物存在持续且迫切的需求。

另外，周围神经损伤特别是长距离缺损的修复与神经功能重建也是临床治疗中的世界性难题。自体或异体神经移植也是目前临床治疗周围神经损伤常用的临床修复手段，但存在供体来源有限，供体和受体神经结构差异，且有供区神经功能丧失、瘢痕和免疫排斥等一系列问题。周围神经炎和周围神经感觉异常是目前临床上最常见的周围神经损伤。周围神经炎也称为末梢神经炎或多发性神经炎，是各种病因引起的肢体远端神经功能障碍。周围神经炎可能由营养代谢、药物及中毒、血管炎、肿瘤、外伤或机械压迫等多种原因引起，表现主要为受损神经支配范围内的感觉、运动及植物神经功能异常。周围神经炎的症状包括感觉减退、疼痛、麻木或针刺、蚁走、灼烧、感觉过敏等。周围神经炎可能为多发性或单一性，对称性或非对称性，是神经系统最常见的疾病种类之一。当周围神经炎的病因已知时，针对病因进行治疗，可减轻症状恢复受损神经，但是对病因不明或原发难治的周围神经炎则疗效不佳。有资料表明，大约40％的周围神经炎患者会留下后遗症，具有较高的致残率，严重影响患者身心健康和生活质量。目前临床上对于周围神经炎的治疗手段不多，且主要为西药。例如，在临床上，由各种原因引起的周围神经炎都可以使用大剂量B族维生素治疗，例如，维生素B₁、B₆、B₁₂等。疼痛明显者使用止痛剂、镇静剂。有炎性脱髓鞘病变可以使用肾上腺皮质激素，如甲泼尼松、地塞米松或氢化可的松等。但是，这些药物如果长期使用大多有较高毒副作用，容易产生药物依赖性，并且也很难达到彻底治愈的目的。

本发明人在此前的研究中发现聚左旋乳酸(Poly-L-lactic acid，PLLA)降解过程中，PLLA的分子结构逐渐被破坏，缓慢水解成为乳酸，乳酸可诱导人体成纤维细胞增加胶原蛋白的生成，导致真皮内胶原纤维增加，产生填充修复效果。在此基础上，本发明人又发现了PLLA和乳酸及其相关乳酸盐化合物在修复软骨、结缔组织、肌腱、筋膜、神经等组织方面具有有益作用(参见CN202210028046.9)。本发明是对此前工作的延续，本发明发现了二价金属乳酸盐在制备预防、改善、修复、治疗神经损伤的制品中的新用途。

发明内容

为了克服现有技术中存在的缺陷和不足，本发明提供了一种二价金属乳酸盐的新用途。本发明人在研究过程中意外地发现，二价金属乳酸盐能够有效预防、改善、修复、治疗中枢神经和外周神经损伤，并且在此基础上进行深入研究，完成了本发明。

为了达到本发明的目的，本发明采用了如下技术方案：

本发明提供了二价金属乳酸盐在制备预防、改善、修复、治疗神经损伤的制品中的应用，出现神经损伤的组织选自富含胶原蛋白的神经组织。

作为可选的方式，在上述应用中，所述神经损伤是中枢神经损伤或外周神经损伤，所述预防、改善、修复、治疗神经损伤是神经再生、神经数量增加和/或神经修复。

作为可选的方式，在上述应用中，所述中枢神经损伤包括脊髓损伤或脑脊髓神经炎，所述外周神经损伤包括周围神经损伤、周围神经炎或周围神经病变。

作为可选的方式，在上述应用中，所述周围神经炎选自以下一种或多种：面神经炎、糖尿病周围神经炎、病毒性周围神经炎、化疗药导致的周围神经炎或格林巴利综合征。

作为可选的方式，在上述应用中，所述周围神经炎的症状包括感觉减退、疼痛、麻木或针刺、蚁走、灼烧、感觉过敏。

作为可选的方式，在上述应用中，所述二价金属乳酸盐包括乳酸钙、乳酸镁、乳酸锌、乳酸亚铁的一种或多种的组合。

作为可选的方式，在上述应用中，所述二价金属乳酸盐选自乳酸镁或乳酸锌和乳酸镁的组合物。

优选地，以重量份数计，在所述组合物中，所述乳酸镁与所述乳酸锌的用量比例为1：10-10：1。

更优选地，以重量份数计，在所述组合物中，所述乳酸镁与所述乳酸锌的用量比例为1：10、1：9、1：8、1：7、1：6、1：5、1：4、1：3、1：2、1：1、2：1、3：1、4：1、5：1、6：1、7：1、8：1、9：1或10：1。

最优选地，以重量份数计，在所述组合物中，所述乳酸镁与所述乳酸锌的用量比例为4：1。

作为可选的方式，在上述应用中，所述制品选自药物、试剂盒、医疗器械的一种或多种。

所述二价金属乳酸盐在所述制品中的浓度为10-80mmol/L，更优选地，所述二价金属乳酸盐在所述制品中的浓度为20-60mmol/L。

作为可选的方式，在上述应用中，所述医疗器械包括医用胶布、绷带、纱布、敷贴、海绵、医用缝合线的一种或多种的组合。

作为可选的方式，在上述应用中，在所述药物中，二价金属乳酸盐是活性成分，所述药物中还包含药学上可接受的载体或赋形剂。

优选地，在所述药物中，二价金属乳酸盐是唯一活性成分。

作为可选的方式，在上述应用中，所述药物的剂型包括注射剂或外用制剂。

优选地，所述外用制剂包括软膏剂、乳膏剂、贴剂、喷雾剂、溶液剂、洗剂的一种或多种的组合。

优选地，所述制品的给药方式包括以下一种或多种：静脉注射、原位注射、肌肉注射、皮下注射、口服或涂抹。

另外，本领域技术人员知晓，所述制品的使用方式，以及施用剂量和施用体积与对象的年龄、身体状况和所患疾病相关，并且可以由临床医师根据情况确定。

本发明相对于现有技术，具有以下有益效果：

本发明提供了一种修复中枢和外周神经损伤的安全、疗效确切、价格低廉、给药方法简单的新治疗方式，特别地，本发明发现了包括乳酸钙、乳酸镁、乳酸锌、乳酸亚铁的一种或多种的组合的二价金属乳酸盐在制备预防、改善、修复、治疗神经损伤的制品中的应用。因此，在外伤等原因导致的中枢神经损伤或者病毒、糖尿病、化疗药等原因导致的周围神经炎或周围神经感觉异常的治疗和修复方面具有广阔的应用前景。

具体实施方式

下面参照具体的实施例对本发明做进一步说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明的范围。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买得到的常规产品。

下面实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售产品。

下述实施例中，所有实验均重复三次，每个组别样本至少三个。实验所得数据通过SPSS21.0软件进行统计分析，对于计量资料的统计描述采用均数±标准差(Mean±SD)，采用方差分析进行组间指标比较。P＜0.05认为差异具有统计学差异。当P＜0.05时，可通过LSD-t检验进行两两样本检验。

实施例1：二价金属乳酸盐对坐骨神经损伤模型动物的影响1.坐骨神经损伤模型建立与实验分组

SD大鼠(雌雄均有，数量为1：1)，8周龄，体重200-220g，共40只，置于温控室(22±2℃)。用3.0％(w/v)戊巴比妥钠(0.2ml/100g)腹腔注射麻醉动物。待完全麻醉后，对大鼠左臀部进行备皮处理，用酒精棉球和碘棉球对备皮处进行消毒处理。随后做斜切口，于臀肌间隙钝性分离显露左侧坐骨神经。距梨状肌下缘0.5cm处用止血钳夹坐骨神经3次(每次10s，间隔10s)，用手术缝线在钳夹处旁边的肌肉缝线标记，并立即缝合肌肉和皮肤，再次进行消毒。术后将动物随机分为4组，每组10只。将大鼠分笼饲养，随后根据分组情况给予腹腔注射药物或生理盐水，1次/日，连续4周。实验分组和处理方法如表1所示。术后密切观察大鼠的一般情况、切口周围皮肤溃疡，以及术侧肢体功能恢复情况。

表1：实验分组及处理

2.足印采集和坐骨神经指数评分

自制大鼠步态记录箱，通道长90cm，宽15cm，高20cm。在底部放置15cm宽的连续记录纸。术后1周、2周、3周和4周时，在大鼠后足底涂以有颜色无毒染料，在连续记录纸行走以留下双侧足迹。选实验侧足(E)和正常侧足(N)的足印，测量如下变量：①足印长度(printlength，PL)，指足跟到足尖的距离；②足趾宽度(toe spread，TS)，指第一趾到第五趾连线的距离；③中间足趾距离(inter toe distance，IT)，指第一趾到第四趾连线的距离。将上述三个变量带入如下公式计算坐骨神经指数(sciatic nerve function index，SFI)，当SFI＝0为正常，SFI＝-100为完全损伤。计算公式如下所示：SFI＝-38.3×(EPL-NPL)/NPL+109.5×(ETS-NTS)/NTS+13.3×(EIT-NIT)/NIT-8.8

术后各时间点(1周、2周、3周和4周)采集大鼠足迹并计算SFI，评价各组大鼠运动功能以及恢复情况，结果如表2所示。结果显示，在术后2周、3周和4周时，低、中、高剂量乳酸镁组SFI均显著优于生理盐水处理的对照组(表2，中剂量乳酸镁组P＜0.0 1，低剂量和高剂量乳酸镁组P＜0.05)。说明低、中、高剂量乳酸镁具有一定的治疗效果，可以促进坐骨神经功能的恢复。同时，术后2周、3周和4周时，中剂量乳酸镁组SFI显著优于低剂量和中剂量乳酸镁组(P＜0.05)，说明中剂量乳酸镁对于神经损伤的治疗效果更好，更有利于神经功能的恢复。

表2：术后不同时间点各组坐骨神经指数(n＝10)

注：^a指与A组比较，P＜0.05；^aa指与A组比较，P＜0.01；^b指与B组和D组比较，P＜0.05。

3.实时定量PCR

3.1提取总RNA

取出坐骨神经，在DEPC处理水中清洗，加入0.5mL Trizol，充分研磨，离心取上清。加入0.1mL氯仿，离心取上清。加入0.8mL异丙醇，离心弃上清。加入1mL 75％乙醇，离心弃上清。加入20μL DEPC处理水，溶解RNA。用核酸蛋白检测仪，测定总RNA溶液浓度和纯度。

3.2实时定量PCR反应

通过RT-qPCR方法检测各组坐骨神经组织中的Caspase-3和GAP-43表达。

引物设计

Caspase-3上游引物5`-GAGCTTGGAACGGTACGATA-3`

下游引物5`-CCGTACCAGAGCGAGATGAC-3`

GAP-43上游引物5`-GTGTGTGAGCCTGTCCTCTC-3`

下游引物5`-AAAACCGGGGTACAGTGCAA-3`

Caspase-3在细胞凋亡过程中起着关键作用也是潜在的药物靶点。研究证明Caspase-3可严重抑制DNA复制、转录和损伤修复功能，最终导致细胞发生不可逆的凋亡效应，因此降低Caspase-3的激活，就可以有效地抑制细胞凋亡的进行。Caspase-3的实时定量PCR结果如表3所示。结果显示生理盐水对照组的Caspase-3mRNA在各时间段的表达无明显变化。与该组同时间比较，低、中、高剂量乳酸镁组Caspase-3mRNA的表达量在建模后第1天、第3天和第7天明显下调(P＜0.05)。同时，在建模后7天内，低、中、高剂量乳酸镁组Caspase-3mRNA水平随时间逐渐降低(P<0.05)。与低剂量组相比，中、高剂量乳酸镁组Caspase-3mRNA表达量在第1天、第3天和第7天均明显下调(P<0.05)。与高剂量组相比，中剂量乳酸镁组Caspase-3mRNA表达量在各时间点显著降低(P<0.05)。坐骨神经损伤形成后大鼠神经元中Caspase-3表达显著增强，神经细胞凋亡数目也随之增加。通过乳酸镁注射后，可起到降低Caspase-3蛋白，减少神经损伤而引起的细胞凋亡发生的作用。

表3：建模后不同时间点术后不同时间点Caspase-3mRNA表达比较

注：与A组比较，^aP<0.05；与B组比较，^bP<0.05；与D组比较，^dP<0.05；第3天与本组第1天比较，^eP＜0.05；第7天与本组第3天比较，^fP<0.05。

GAP-43是一种膜磷酸蛋白，广泛存在于神经元中，是神经元再生的标志之一，可通过调节肌动蛋白细胞骨架进而在神经元的再生反应中起到关键作用。GAP-43的实时定量PCR结果如表4所示。结果显示生理盐水对照组GAP-43mRNA的表达无明显改变。与该组同时间比较，低、中、高剂量乳酸镁组GAP-43mRNA的表达量，在建模后第1天、第3天和第7天均明显升高(P<0.05)。同时，在建模后7天内，低、中、高剂量乳酸镁组GAP-43mRNA水平随时间逐渐升高，第7天最高(P＜0.05)。与低剂量组相比，中、高剂量乳酸镁组GAP-43mRNA表达量在第1天、第3天和第7天均明显上调(P<0.05)。与高剂量组相比，中剂量乳酸镁组GAP-43mRNA表达量在各时间点显著升高(P＜0.05)。乳酸镁能够增加GAP-43的表达减轻大鼠坐骨神经损伤以及促进神经再生。

表4：建模后不同时间点术后不同时间点GAP-43mRNA表达比较

注：与A组比较，aP<0.05；与B组比较，^bP<0.05；与D组比较，^dP<0.05；第3天与本组第1天比较，eP＜0.05；第7天与本组第3天比较，^fP<0.05。

实施例2：二价金属乳酸盐对脊髓损伤模型动物的影响

1.大鼠脊髓损伤模型建立

SD大鼠(雌雄均有，数量为1：1)，8周龄，体重200-220g，共40只，置于温控室(22±2℃)。用3.0％(w/v)戊巴比妥钠(0.2mL/100g)腹腔注射麻醉动物，待完全麻醉后，将麻醉动物俯卧位固定，备皮后常规消毒，以其第十二胸椎(T12)为基点在背中线纵向剪口(2～3cm)，并由外向内以此剪开直至皮下筋膜，准确切除大鼠T9-11的背侧椎板显露脊髓的硬脊膜。用动脉瘤夹夹击暴露脊髓的中间部位40s，以制备脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)模型。实验期间，每日要通过挤压脊髓损伤组大鼠的膀胱帮助其排尿，早晚各一次。排尿后清理会阴部，使其保持干燥，浸湿尿液的肢体及时清洗，吹干，并经常变换体位。此外，为了防止感染，术后3天常规肌肉注射庆大霉素(2000U/kg·d)术后将动物随机分为4组，每组10只，将大鼠分笼饲养，随后根据分组情况给予腹腔注射药物或生理盐水，1次/日，连续4周。实验分组和处理方法如表5所示。

表5：实验分组及处理

2.运动系统评分(BBB评分)

利用美国研究人员Basso等提出的神经功能评定法，即BBB评分法对大鼠脊髓损伤后肢体功能进行评判。方法为：将动物放入开口盆，轻敲盆壁，使其爬行，观察动物的臀、膝、踝关节行走、驱赶运动及其协调情况，结果列于表6。

由表6可知，乳酸镁处理后各组大鼠均有不同程度的功能恢复，其中中剂量乳酸镁组恢复最快。术后1天，各组大鼠的BBB评分差异无统计学意义(P>0.05)；其中各组的BBB评分随着时间逐渐上升，并且差异逐渐增大。到术后4周，中剂量乳酸镁组评分最高，高剂量乳酸镁组次之，低剂量乳酸镁组再次，生理盐水处理对照组最低，其中低和高剂量乳酸镁组的差异无统计学意义(P＝0.213)外，其余各组差异均具有统计学意义(P＜0.05)。

表6：各组术前术后BBB评分情况

注：^a指与A组比较，P＜0.05；^b指与B组比较，P＜0.05；^c指与C组比较，P＜0.05；^d指与D组比较，P＜0.05。

3.实时定量PCR

以损伤区域为中心截取0.5cm损伤脊髓，进行RT-PCR测量脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)、脑质纤维酸性蛋白(glial fibrillaryacidic protein，GFAP)、神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)基因表达情况。

3.1提取总RNA

将1mL加入到匀浆管中。取100mg组织放置匀浆管中，加入RNA提取液充分研磨，离心取上清备用。加入250μL氯仿，离心取上清。加入0.8mL异丙醇，离心弃上清。加入1mL 75％乙醇，离心弃上清。加入15μL无RNA酶的水溶解RNA。用核酸蛋白检测仪，测定总RNA溶液浓度和纯度。

3.2反转录反应

3.3实时定量PCR反应

引物设计

BDNF上游引物5`-GTCAAGTGCCTTTGGAGCCT-3`

下游引物5`-CATGGGATTGCACTTGGTCTC-3`GFAP上游引物5`-AGTCGGCGAGTTACCAGGAG-3`

下游引物5`-TTAATGACCTCGCCATCCCG-3`NSE上游引物5`-TATCCTGGAGAACAGCGAAGC-3`

下游引物5`-GACAAAGTCCTGGTAGAGTGCCC-3`

BDNF是哺乳动物大脑中分布最广、表达丰富的神经营养因子，在突触的正常生长、发育和可塑性中发挥重要作用，可通过激活下游通路抑制细胞发生凋亡。根据表7可以发现，术后1周，生理盐水处理的对照组BDNF的表达在低、中、高剂量乳酸镁三组中的差异具有统计学意义(P＜0.05)。低剂量乳酸镁组同高剂量乳酸镁组BDNF表达差异无统计学意义(P＝0.628)。术后4周，在BDNF的表达上除生理盐水处理对照组与低剂量乳酸镁组之间的差异无统计学意义(P＝0.820)外，其余各组间的差异具有统计学意义(P＜0.05)。术后4周时四组在GFAP和NSE的表达上的差异具有统计学意义(P＜0.05)。BDNF作为一种重要的神经递质，通过与特异性受体结合，激活下游通路，对神经元的生长、分化以及对突触的可塑性调节发挥重要作用。从表7中可以看出，二价金属乳酸盐可提高BDNF的表达，进而可以通过激活下游抗凋亡通路，减少脊髓损伤后神经细胞凋亡，参与神经重塑过程。

表7：术后1周和4周大鼠脊髓BDNF相对表达情况

注：a指与A组比较，P＜0.05；^b指与B组比较，P＜0.05；^d指与D组比较，P＜0.05。

GFAP表达是脊髓神经细胞生长、增殖和分化的重要参考指标，被作为急性脊髓损伤的治疗靶点。根据表8可以发现，术后1周，生理盐水处理的对照组GFAP的表达在低、中、高剂量乳酸镁三组中的差异具有统计学意义(P＜0.05)。四组在术后1周时GFAP的表达差异具有统计学意义(P<0.05)。术后4周时四组在GFAP的表达上的差异具有统计学意义(P＜0.05)。GFAP是星形胶质细胞特异性标志蛋白，星形胶质细胞是中枢神经系统中数量最多的细胞，因此在术后有较大的表达水平。与其他组相比，中剂量二价乳酸盐组GFAP表达明显降低，说明是起到抑制星形胶质细胞增生进而抑制胶质瘢痕的形成，该过程可促进轴突再生和神经重构。。

表8：术后1周和4周大鼠脊髓GFAP相对表达情况

注：^a指与A组比较，P＜0.05；^b指与B组比较，P＜0.05；^d指与D组比较，P＜0.05。

NSE是神经细胞内呼吸作用中起关键作用的酶，广泛存在于脑组织和其他外周神经细胞。NSE可参与机体糖酵解代谢，当机体出现缺氧、缺血以及中毒等损伤时，NSE会被释放，随着血脑屏障的破坏可以进入血液循环。根据表9可以发现，术后1周，生理盐水处理的对照组NSE的表达在低、中、高剂量乳酸镁三组中的差异具有统计学意义(P<0.05)。低、中、高剂量乳酸镁三组术后1周时NSE的表达无统计学意义(P＞0.05)。术后4周时四组在NSE的表达上的差异具有统计学意义(P<0.05)。中、高剂量二价乳酸盐组可提高NSE表达水平，其中中剂量组提高NSE效果更为显著。由于NSE参与细胞糖代谢过程中的催化反应，因此NSE表达增多可改善细胞的能量代谢，促进受损细胞的恢复。

表9：术后1周和4周大鼠脊髓NSE相对表达情况

注：^a指与A组比较，P＜0.05；^b指与B组比较，P＜0.05；^d指与D组比较，P＜0.05。

实施例3：二价金属乳酸盐对自身免疫性神经炎模型动物的影响

1.自身免疫性神经炎模型建立与实验分组

SD大鼠(雌雄均有，数量为1：1)，8周龄，体重200-220g，共40只，置于温控室(22±2℃)。将200μg P0_180-199、1mg H37Ra、100μL生理盐水、100μLIFA混合液充分乳化，作为一只大鼠的注用量，注射入双后肢足底皮下(每只足底100μL)。建模成功后，各组大鼠灌胃给予相应的药物或生理盐水。每天1次，连续4周。

表10：实验分组及处理

2.行为学评分

给药期间每天观察大鼠并进行行为学评分。0分，无任何临床症状；5分，四肢瘫痪或死亡。

自身免疫性神经炎组在给予生理盐水灌胃后的第1天，部分大鼠开始出现不同程度的神经功能损伤症状，包括精神不振、皮毛不洁、双后足红肿等；第5天，所有大鼠均出现不同程度的自身免疫性神经炎症状，陆续出现肌张力消失、拖尾且伴有瘫痪的现象；第8天，大鼠自身免疫性神经炎症状达到高峰，神经功能缺损评分最高，为4.0±0.5。低剂量乳酸镁组在给药第6天，部分大鼠出现不同程度的神经功能损伤症状；第11天，所有大鼠均出现不同程度的自身免疫性神经炎症状；第15天，大鼠自身免疫神经炎症状达到高峰，神经功能缺损评分最高，为3.0±0.5；之后，大鼠自身免疫神经炎症状逐渐缓解；第28天时，神经功能缺损评分为0～1。中剂量乳酸镁组在给药第10天，部分大鼠出现不同程度的神经功能损伤症状；第16天，所有大鼠均出现不同程度的自身免疫性神经炎症状；第21天，大鼠自身免疫神经炎症状达到高峰，神经功能缺损评分最高，为2.0±0.5。之后，大鼠自身免疫神经炎症状逐渐缓解；第25天时，神经功能缺损评分为0。高剂量乳酸镁组在给药第8天，部分大鼠出现不同程度的神经功能损伤症状；第12天，所有大鼠均出现不同程度的自身免疫性神经炎症状；第16天，大鼠自身免疫神经炎症状达到高峰，神经功能缺损评分最高，为2.5±0.5；之后，大鼠自身免疫神经炎症状逐渐缓解；第33天时，神经功能缺损评分为0～1。以上结果说明乳酸镁对自身免疫性神经炎所导致的神经功能缺损起到一定的治疗作用，其中中剂量乳酸镁的效果最为显著。

3.炎症因子水平检测

现有理论认为炎性因子是加重自身免疫性神经炎病情的因素之一。Th17细胞分泌的特征性细胞因子IL-17通过诱导靶器官炎症级联反应参与自身免疫性疾病的发生。从大鼠眼眶后静脉丛采血，离心取上清。通过酶标仪测定血清中IL-17和IFN-γ的浓度，结果列于表11中。与经生理盐水灌胃的自身免疫性神经炎组相比，乳酸镁灌胃大鼠血清中IL-17和IFN-γ水平显著降低(P＜0.05)。与低和高剂量乳酸镁组相比，中剂量乳酸镁组IL-17和IFN-γ水平显著降低(P＜0.05)。说明乳酸镁可以减少自身免疫性神经炎所引起的炎症细胞因子的分泌，其中中剂量乳酸镁的作用最为显著。

表11：各组大鼠血清中IL-17和IFN-γ水平比较

注：^a指与A组比较，P＜0.05；^b指与B组比较，P＜0.05；^d指与D组比较，P＜0.05。

在上述应用中，其余二价金属乳酸盐包括乳酸钙、乳酸锌、乳酸亚铁以及多种组合结果与上述乳酸镁结果相似，在此不再赘述。

实施例4：二价金属乳酸盐对自身免疫性脑脊髓炎模型动物的影响

1.自身免疫性脑脊髓炎模型建立与实验分组

SD大鼠(雌雄均有，数量为1：1)，8周龄，体重200-220g，共40只，置于温控室(22±2℃)。MOG_35-55多肽将PBS稀释至6mg/mL，与CFA等体积混合。使用双通道连接器连接5mL注射器，反复推拉混合制成MOG_35-55油包水抗原乳剂。取实验用大鼠进行抗原免疫，背部多点皮下注射抗原乳剂，每只大鼠4点，共注射0.2mL抗原乳剂(MOG_35-55多肽含量为每只600μg)；抗原乳剂免疫结束后0小时和48小时，给予PTX腹腔注射作为增敏剂以提高模型发病率。建模成功后，各组大鼠灌胃给予相应的药物或生理盐水。每天1次，连续4周。

表12：实验分组及处理

2.神经功能缺损评分

给药期间每天观察大鼠并进行神经功能缺损评分。0分，无任何临床症状；5分，濒死状态或死亡。

自身免疫性脑脊髓炎组在给予生理盐水灌胃后的第5天，部分大鼠开始出现不同程度的神经功能损伤症状；第9天，所有大鼠均出现不同程度的自身免疫性脑脊髓炎症状，陆续出现肌张力消失、拖尾且伴有瘫痪的现象；第12天，大鼠自身免疫性脑脊髓炎症状达到高峰，神经功能缺损评分最高，为3.5±0.5。低剂量乳酸镁组在给药第7天，部分大鼠出现不同程度的神经功能损伤症状；第12天，所有大鼠均出现不同程度的自身免疫性脑脊髓炎症状；第16天，大鼠自身免疫脑脊髓炎症状达到高峰，神经功能缺损评分最高，为2.5±0.5；之后，大鼠自身免疫脑脊髓炎症状逐渐缓解；第28天时，神经功能缺损评分为0～1。中剂量乳酸镁组在给药第12天，部分大鼠出现不同程度的神经功能损伤症状；第18天，所有大鼠均出现不同程度的自身免疫性脑脊髓炎症状；第23天，大鼠自身免疫脑脊髓炎症状达到高峰，神经功能缺损评分最高，为1.5±0.5。；之后，大鼠自身免疫脑脊髓炎症状逐渐缓解；第26天时，神经功能缺损评分为0。高剂量乳酸镁组在给药第10天，部分大鼠出现不同程度的神经功能损伤症状；第15天，所有大鼠均出现不同程度的自身免疫性脑脊髓炎症状；第19天，大鼠自身免疫脑脊髓炎症状达到高峰，神经功能缺损评分最高，为2.5±0.5；之后，大鼠自身免疫脑脊髓炎症状逐渐缓解；第31天时，神经功能缺损评分为0～1。乳酸镁对自身免疫性脑脊髓炎所导致的神经功能缺损起到一定的治疗作用，其中中剂量二价乳酸盐的效果最为显著。

3.炎症因子水平检测

处死大鼠后，取脊髓组织，加入组织裂解液匀浆，离心取上清，测定TNF-α，IL-6，IL-β浓度，结果列于表13。与经生理盐水灌胃的自身免疫性脑脊髓炎组相比，乳酸镁灌胃大鼠脊髓中TNF-α，IL-6，IL-β水平显著降低(P＜0.05)。与低和高剂量乳酸镁组相比，中剂量乳酸镁组TNF-α，IL-6，IL-β水平显著降低(P＜0.05)。说明乳酸镁可以减少使经自身免疫性脑脊髓炎所引起的炎症细胞因子的分泌，进而减少对髓鞘组织的破坏，其中中剂量乳酸镁的作用更为显著。

表13：各组大鼠脊髓中TNF-α，IL-6，IL-β水平比较

注：^a指与A组比较，P＜0.05；^b指与B组比较，P＜0.05；^d指与D组比较，P＜0.05。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (13)

1.二价金属乳酸盐在制备预防、改善、修复、治疗神经损伤的制品中的应用，其特征在于：出现神经损伤的组织选自富含胶原蛋白的神经组织，所述神经损伤是中枢神经损伤或外周神经损伤，所述中枢神经损伤是脊髓损伤或脑脊髓神经炎，所述外周神经损伤是周围神经损伤、周围神经炎或周围神经病变，所述二价金属乳酸盐选自乳酸钙、乳酸镁、乳酸锌、乳酸亚铁的一种或多种的组合。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述预防、改善、修复、治疗神经损伤是神经再生、神经数量增加和/或神经修复。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述周围神经炎选自以下一种或多种：面神经炎、糖尿病周围神经炎、病毒性周围神经炎、化疗药导致的周围神经炎或格林巴利综合征，所述周围神经炎的症状包括感觉减退、疼痛、麻木或针刺、蚁走、灼烧、感觉过敏。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述二价金属乳酸盐选自乳酸镁或乳酸锌和乳酸镁的组合物。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：以重量份数计，在所述组合物中，所述乳酸锌与所述乳酸镁的用量比例为1：10-10：1。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述制品选自药物、试剂盒、医疗器械的一种或多种。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述二价金属乳酸盐在所述制品中的浓度为5-250mmol/L。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述二价金属乳酸盐在所述制品中的浓度为30-150mmol/L。

9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述医疗器械包括医用胶布、绷带、纱布、敷贴、海绵、医用缝合线的一种或多种的组合。

10.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：在所述药物中，二价金属乳酸盐是活性成分，所述药物中还包含药学上可接受的载体或赋形剂。

11.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述药物的剂型包括注射剂或外用制剂。

12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于：所述外用制剂包括软膏剂、乳膏剂、贴剂、喷雾剂、溶液剂、洗剂的一种或多种的组合。

13.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述制品的给药方式包括以下一种或多种：静脉注射、原位注射、肌肉注射、皮下注射、口服或涂抹。