CN119286796A - 鼠抗PBP2a杂交瘤细胞株、单克隆抗体及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及鼠抗PBP2a杂交瘤细胞株、单克隆抗体及应用，提取金黄色葡萄球菌PBP2a蛋白作为抗原，获得高纯度的抗原后，在小鼠体内激起良好的免疫反应，进而采用杂交瘤技术，筛选两株高亲和力和特异性的细胞株并制备相应抗体；将两个抗体用作胶体金免疫试剂盒中的金标抗体和包被抗体，试剂盒能够用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌中的PBP2a蛋白，可用于相关体外诊断试剂的开发。

Description

鼠抗PBP2a杂交瘤细胞株、单克隆抗体及应用

技术领域

本发明属于检测技术领域，尤其是涉及鼠抗PBP2a杂交瘤细胞株、单克隆抗体及应用。

背景技术

在1961年，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的一个菌株首次显示对甲氧西林的抗性，20世纪60年代中期，甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(MRSA)逐渐蔓延至欧洲多个国家及加拿大；20世纪80年代以来，MRSA在全球范围内急剧增多，已成为全球发生率最高的院内感染病原菌之一。现在，甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(MRSA)是导致医院感染和社区感染的最流行的抗生素抗性病原体之一。MRSA的固有耐药性是由于金黄色葡萄球菌通过水平基因转移获得一种名为葡萄球菌染色体mec盒（Staphylococcal chromosomalcassette mec，SCCmec）的新型可移动的遗传元件。SCCmec携带mecＡ基因，mecＡ基因编码膜蛋白青霉素结合蛋白（penicillin-binding protein，PBP）2a的表达，而PBP2a是一种对包括甲氧西林在内的β-内酰胺类抗生素具有低亲和力的青霉素结合蛋白。其PBP2a对β-内4酰胺类抗生素亲和力很低，因此可避免被β-内酰胺类抗生素破坏，表现出耐药性。免疫诊断试剂是体外诊断试剂中发展最快的的细分领域，利用抗原与抗体之间的特异性结合进行定性或定量检测。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供鼠抗PBP2a杂交瘤细胞株、单克隆抗体及应用。

本发明采用的技术方案是：鼠抗PBP2a杂交瘤细胞株，命名为2LE9，保藏编号为CGMCCNo.46008，分类为杂交瘤细胞，保藏地为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏时间为2024年6月27日，检测为存活；或者，命名为2FE11，保藏编号为CGMCCNo.46007，分类为杂交瘤细胞，保藏地为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏时间为2024年6月27日，检测为存活。

鼠抗PBP2a单克隆抗体，抗体2LE9包括轻链可变区和重链可变区，轻链可变区包括如SEQ ID NO:1所示的CDRL1，如SEQ ID NO:2所示的CDRL2，以及如SEQ ID NO:3所示的CDRL3；重链可变区包括如SEQ ID NO:4所示的CDRH1，如SEQ ID NO:5所示的CDRH2，以及如SEQ ID NO:6所示的CDRH3；

或者，

抗体2FE11包括轻链可变区和重链可变区，轻链可变区包括如SEQ ID NO:11所示的CDRL1，如SEQ ID NO:12所示的CDRL2，以及如SEQ ID NO:13所示的CDRL3；重链可变区包括如SEQ ID NO:14所示的CDRH1，如SEQ ID NO:15所示的CDRH2，以及如SEQ ID NO:16所示的CDRH3。

优选地，抗体2LE9轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:7，重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:9；

或者，抗体2FE11轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:17，重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:19。

优选地，抗体2LE9由保藏编号为CGMCCNo.46008的鼠抗PBP2a杂交瘤细胞株产生；或者，抗体2FE11由保藏编号为CGMCCNo.46007的鼠抗PBP2a杂交瘤细胞株产生。

核酸分子，包含编码鼠抗PBP2a单克隆抗体的多核苷酸。

优选地，编码抗体2LE9轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示，编码抗体2LE9重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；

或者，编码抗体2FE11轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示，编码抗体2FE11重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示。

一种检测试剂盒，包括鼠抗PBP2a单克隆抗体。

优选地，制作成胶体金免疫试剂盒、化学发光试剂盒、放射免疫试剂盒、酶联免疫试剂盒或荧光免疫试剂盒，或者制作为微流体芯片。

优选地，制作成胶体金免疫试剂盒时，将抗体2LE9用作包被抗体，将抗体2FE11用作金标抗体。

检测试剂盒在非疾病诊断治疗目的检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染中的应用。

本发明具有的优点和积极效果是：提供两种鼠抗PBP2a抗体，能够特异性结合金黄色葡萄球菌PBP2a蛋白，抗体效价均能够达到1:1280000以上，并在灵敏度、特异性和稳定性上均具有较佳表现；可将其制作成试剂盒，用于检测含有PBP2a蛋白的细菌感染；如用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染。

附图说明

图1是实施例1中PBP2a蛋白电泳图；

图2是实施例2制备得到的抗体2LE9和抗体2FE11的蛋白电泳图；

图3是实施例4制备的PBP2a检测卡样本检测情况；

生物材料：2LE9，分类为杂交瘤细胞，保藏日期为2024年6月27日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号是CGMCC No. 46008；

生物材料：2FE11，分类为杂交瘤细胞，保藏日期为2024年6月27日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号是CGMCC No. 46007。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的实施例做出说明。

本发明涉及鼠抗PBP2a杂交瘤细胞株、单克隆抗体及应用。提取金黄色葡萄球菌PBP2a蛋白作为抗原，获得高纯度的抗原后，在小鼠体内激起良好的免疫反应，进而采用杂交瘤技术，筛选高亲和力和特异性的细胞株并制备相应抗体，开发胶体金免疫层析法的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌PBP2a检测试剂盒，可用于相关体外诊断试剂的开发。

经筛选获得两株鼠抗PBP2a杂交瘤细胞株，一株命名为2LE9，保藏编号为CGMCCNo.46008，保藏地为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏时间为2024年6月27日，检测为存活；另一株命名为2FE11，保藏编号为CGMCCNo.46007，保藏地为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏时间为2024年6月27日，检测为存活。本发明通过小鼠杂交瘤单克隆抗体筛选及RT-PCR法克隆Ig可变区基因，获得稳定分泌鼠抗PBP2a单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并分析得到其可变区序列，并用ELISA方式对抗体结合特异性进行了鉴定。

鼠抗PBP2a杂交瘤细胞株2LE9产生的抗体2LE9包括轻链可变区和重链可变区，轻链可变区包括如SEQ ID NO:1所示的CDRL1，如SEQ ID NO:2所示的CDRL2，以及如SEQ IDNO:3所示的CDRL3；重链可变区包括如SEQ ID NO:4所示的CDRH1，如SEQ ID NO:5所示的CDRH2，以及如SEQ ID NO:6所示的CDRH3。

SEQ ID NO:1 RTSENIYRNLA（CDRL1）

SEQ ID NO:2 TATNLAD（CDRL2）

SEQ ID NO:3 QHFWGTPFT（CDRL3）

SEQ ID NO:4 GFTVSTYAMS（CDRH1）

SEQ ID NO:5 TISSGGGYTYYTDSVKG（CDRH2）

SEQ ID NO:6 QYYGSESYFDY（CDRH3）

抗体2LE9轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:7，编码轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；抗体2LE9重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:9，编码抗体EB8重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；

轻链可变区氨基酸序列，SEQ ID NO:7

DIVMTQTPASLSVSVGETVTITCRTSENIYRNLAWYQQKQGKSPQLLLYTATNLADGVPSRFSGSGSGTHFSLKINSLQSEDFGSYYCQHFWGTPFTFGGGTKLEIK

轻链可变区碱基序列，SEQ ID NO:8

GACATTGTCATGACCCAGACTCCAGCCTCCCTATCTGTTTCTGTGGGAGAAACTGTCACCATCACATGTCGAACAAGTGAGAATATTTATAGAAATTTAGCATGGTATCAGCAGAAACAGGGAAAATCTCCTCAACTCCTGCTCTATACTGCAACAAACTTAGCAGATGGTGTGCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACACATTTCTCCCTCAAGATCAACAGCCTGCAGTCTGAAGATTTTGGGAGTTATTACTGTCAACATTTTTGGGGAACTCCGTTCACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA

重链可变区氨基酸序列，SEQ ID NO:9

GGGLVKPGGSLRLSCAATGFTVSTYAMSWLRQTPEKTLEWVATISSGGGYTYYTDSVKGRFTISKDNAKNSLYLQMSSLRSEDTAMYYCTRQYYGSESYFDYWGQGATLTVSSAKT

重链可变区碱基序列，SEQ ID NO:10

GGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCACTGGATTCACTGTCAGCACTTATGCCATGTCTTGGCTTCGACAGACTCCGGAGAAGACGCTGGAGTGGGTCGCAACCATAAGTAGTGGTGGTGGTTACACATACTACACAGACAGTGTGAAGGGGCGATTCACCATCTCCAAAGACAATGCCAAGAACTCCCTGTACCTGCAAATGAGTAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCATGTATTATTGTACAAGACAATACTACGGTAGTGAGTCATACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCGCCACTCTCACAGTCTCCTCAGCCAAAACG

鼠抗PBP2a杂交瘤细胞株2FE11产生的抗体2FE11包括轻链可变区和重链可变区，轻链可变区包括如SEQ ID NO:11所示的CDRL1，如SEQ ID NO:12所示的CDRL2，以及如SEQID NO:13所示的CDRL3；重链可变区包括如SEQ ID NO:14所示的CDRH1，如SEQ ID NO:15所示的CDRH2，以及如SEQ ID NO:16所示的CDRH3；

SEQ ID NO:11 KSSQSLLDTDGKTYLN（CDRL1）

SEQ ID NO:12 VVSKKDS（CDRL2）

SEQ ID NO:13 WQGTHFPLT（CDRL3）

SEQ ID NO:14 GFNIKDIYIN（CDRH1）

SEQ ID NO:15 RIDPANGNTIYDPKFLG（CDRH2）

SEQ ID NO:16 SSRY（CDRH3）

抗体2FE11轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:17，编码轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示；抗体2FE11重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:19，编码抗体CG2重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示；

轻链可变区氨基酸序列，SEQ ID NO:17

DIVMTQSPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLDTDGKTYLNWLLQRPGQSPKRLIYVVSKKDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCWQGTHFPLTFGAGTKLELK

轻链可变区碱基序列，SEQ ID NO:18

GACATTGTGATGACCCAGTCTCCACTCACTTTGTCGGTTACCATTGGACAACCAGCCTCCATCTCTTGCAAGTCAAGTCAGAGCCTCTTAGATACTGATGGAAAGACATATTTGAATTGGTTGTTACAGAGGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCGCCTAATTTATGTGGTGTCTAAAAAGGACTCTGGAGTCCCTGACAGGTTCACTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTGAAAATCAGTAGAGTGGAGGCTGAGGATTTGGGAGTTTATTATTGCTGGCAAGGTACACATTTTCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAACTGAAA

重链可变区氨基酸序列，SEQ ID NO:19

GAELVKPGASVKLSCIASGFNIKDIYINWVKQRPEQGLEWIGRIDPANGNTIYDPKFLGKATITADTFSNTAYLHLSSLTSEDTAVYYCARSSRYWGQGTTLTVSSAKT

重链可变区碱基序列，SEQ ID NO:20

GGGGCAGAGCTTGTGAAGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCATAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACATCTATATAAACTGGGTGAAACAGAGGCCTGAGCAGGGCCTGGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTGCGAATGGTAATACTATTTATGACCCGAAGTTCCTGGGCAAGGCCACTATAACAGCAGACACATTTTCCAACACAGCCTACCTGCACCTCAGCAGCCTGACTTCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCTAGATCCTCTCGCTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAGCCAAAACG

两个鼠抗PBP2a单克隆抗体通过系统性评价，包括对抗体亚型及效价、试剂盒灵敏度、特异性和稳定性的评价，鼠抗PBP2a单克隆抗体在各方面均有较佳表现，两个抗体效价均达到了1:1280000以上，从而适合作为免疫诊断试剂用于制备体外诊断试剂盒。可以制作成胶体金免疫层析试剂盒、化学发光试剂盒、放射免疫试剂盒、酶联免疫试剂盒或荧光免疫试剂盒，或者制作为微流体芯片；制作的试剂盒能够检测检测金黄色葡萄球菌PBP2a蛋白。例如，抗体2LE9和抗体2FE11可分别作为胶体金免疫层析法检测试剂条中的金标抗体和包被抗体。

下面结合附图对本发明方案做出说明，其中，未具体说明操作步骤的实验方法，均按照相应商品说明书进行，实施例中所用到的仪器、试剂、耗材如无特殊说明，均可从商业公司购买得到。

实施例1：鼠抗PBP2a单克隆抗体制备

PBP2a蛋白制备

全基因合成mecA转肽酶区氨基酸片段，将重组质粒转化到大肠杆菌中进行诱导表达，纯化方法为镍柱亲和层析，菌体湿重约2g重悬于平衡缓冲液（pH 7.4），冰水浴中超声，超声至菌液澄清，高速离心，上清过膜后过镍柱，洗脱出目的蛋白，分子量和预计相符，SDS-PAGE如图1所示。

1.2小鼠免疫

用纯化的PBP2a蛋白免疫6周龄左右的雌性Balb/c小鼠，进行抗体制备，按照免疫剂量分为2组，每组5只小鼠；按照抗原含量计算，第一组免疫剂量为25ug/只，第二组免疫剂量为50ug/只，首免，取适量PBP2a蛋白经生理盐水稀释至500ul，加入等量弗氏完全佐剂500ul乳化均匀，皮下多点注射免疫小鼠；两周后，取相同剂量进行二免，二免将佐剂换为弗氏不完全佐剂，并腹腔注射免疫小鼠，两周后再追加免疫一次，亦为腹腔注射免疫小鼠，7天后鼠尾采血，ELISA测定小鼠血清效价。具体步骤为：PBP2a蛋白 0.2ug/ml，100ul/孔，4℃过夜包被ELISA板，甩干，PBST洗涤3次。5%脱脂乳粉，200ul/孔，37℃封闭2h。小鼠鼠尾采血，3000转/min，离心后收集血清，从1:1000开始用PBS进行倍比稀释至1:512000，备用。甩干，PBST洗涤3次，1:1000倍起加入PBS稀释的一抗，100ul/孔，37℃，1h。甩干，PBST洗涤3次，加PBS 1:10000倍稀释的羊抗鼠二抗，100ul/孔，37℃，45min。甩干，PBST洗涤5次,加100ulTMB/孔，37℃，显色10min，终止，读值。

1.3细胞融合

融合前三天进行小鼠加强免疫，接种量同前次免疫，不加佐剂，腹腔注射。融合前一天准备饲养层细胞，取6-8周龄小鼠Balb/c 1只，取眼球放血后颈椎脱位致死，放于75％酒精中消毒5min，固定于盘上，在超净台中无菌剪开腹部皮肤。用无菌注射器吸取HAT选择培养液10ml注入小鼠腹腔，用酒精棉球轻揉腹部，抽回培养基。加入40ml HAT培养液中，铺入到4块96孔细胞培养板中，100μL/ 孔，37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养。融合前一周复苏骨髓瘤细胞（Sp2/0细胞），用含10%胎牛血清的PRMI-1640培养基培养，37℃，5％CO₂培养箱中传代培养。将处于对数生长期的细胞收集至离心管中，细胞计数，把细胞稀释为10⁷个/ml备用。取加强免疫3天的Balb/c小鼠，摘眼球放血制备阳性血清，脱颈椎处死，75％酒精消毒5min，在超净工作台无菌取出脾脏，在无菌平皿中冼涤数次，剥离结缔组织。将脾脏放在微孔铜网上，加入新鲜的RPMI-1640培养液，先用注射器吸取培养液由脾脏一段注入，吹下脾细胞，反复数次之后，用注射器的内塞轻轻将剩余脾脏研磨，直到无明显的红色组织块。将平皿中脾细胞悬液轻轻吹打后转移到50ml离心管中，1000r/min离心5min，收集脾细胞，计数后备用。将免疫鼠脾细胞与Sp2/0细胞按细胞数量10:1混合，加入50ml的离心管内，1000r/min离心5min，弃上清，在手心轻轻摩擦使两种细胞充分混匀，将离心管至于100mL蓝盖瓶内，蓝盖瓶内装有37℃热水，将预热好的1ml DMSO/PEG在1min内逐滴加入融合管内，先慢后快，边加边轻轻旋转离心管。然后立即加入无抗无血RPMI-1640培养液终止反应，第一分钟加1ml，第二分钟加2ml，第三分钟加3ml，第四分钟加4ml。37℃水浴5min，后800r/min离心5min，弃上清，将沉淀以HAT悬起，混匀到40ml含37℃预热的20％小牛血清的HAT选择培养液中，铺入已加有饲养细胞的96孔细胞板中，100μL/孔，将培养板放入37℃，5％CO₂培养箱培养。7d后将用新鲜的HAT培养基对细胞板半换液，10天后用HT培养基全换液。将96孔板中检测阳性的细胞采用有限稀释法进行亚克隆：首先按照上述方法制备饲养层细胞，取待克隆杂交瘤细胞进行细胞计数，用HT培养基将细胞稀释至5-8个细胞/ml，加入到已铺饲养细胞的96孔细胞板中100μL/孔，每株杂交瘤细胞克隆一块96孔细胞板，37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养。约5天后数出细胞孔里的克隆数，标记，7天时并换新的培养基，待细胞铺满整个孔底的1/3～1/2时检测。经过2-3次克隆化，待96孔板所有细胞孔均为阳性时，即可进行扩大培养，定株，冻存。将检测阳性确定定株的杂交瘤细胞扩大培养并冻存。具体过程如下：将生长旺盛、状态良好的杂交瘤细胞用无抗无血DMEM轻轻从细胞瓶上吹下，1000 r/min离心5min，弃去上清。加入冻存液（含40%RPMI-1640培养液、50%胎牛血清、10%DMSO），将细胞吹散后分装到细胞冻存管中。将冻存管放入冻存盒置于-70℃冰箱中，一天后将冻存管转移入液氮中，做好记录。

1.4腹水制备

取8-10周龄雌性 Balb/c小鼠，腹腔注射无菌液体石蜡，0.5mL/只，7天后腹腔注射培养至对数期的杂交瘤细胞，5×10⁶个细胞/只。每天注意观察，约7-10天，待小鼠腹部出现明显隆起后，用75％酒精棉球消毒下腹部皮肤，用16号针头刺入腹腔，收集腹水。待腹水再生积聚后，再次收集。将收集的腹水3000 r/min离心10min，取中间澄清部分，-70℃保存。

1.5抗体纯化

用Protein-G柱子进行腹水纯化，步骤如下：取腹水2ml，10000g离心，取澄清部分，加入2ml洗涤缓冲液，混匀，柱子用20%乙醇流尽后用8mL洗涤液平衡，样本过柱子，反复上样3次，然后用15mL洗涤缓冲液进行洗涤淀，洗涤完毕后用10mL的洗脱缓冲液进行洗脱，洗脱完毕后用1M Tris PH=9调PH至7.4，浓缩后于50kd透析袋，PBS，4℃透析过夜。

实施例2：鼠抗PBP2a单克隆抗体鉴定

2.1抗体亚类鉴定

按照SIGMA试剂盒说明书，以捕获ELISA的方法进行单抗的亚类鉴定，具体如下：将单抗亚类鉴定试剂1:1000稀释后，加入酶标孔中，100μL/孔，37℃孵育1h；PBST洗三次，拍干；将抗体1:1000倍稀释后加样，100 μL/孔，37℃孵育1h；PBST洗三次，拍干；HRP酶标羊抗鼠IgG二抗以1:10000稀释后加样， 100μL/孔，室温孵育30min；显色10～20min。以OD450读值明显高于其他孔所加亚类试剂为单抗所属亚类类型。抗体2FE11、2LE9的抗体亚类为IgG1。

2.2抗体效价测定

采用间接ELISA法进行纯化后抗体效价测定，步骤如下：PBP2a蛋白稀释至0.2ug/mL，100ul/孔，同时设立不包被对照，4℃过夜包被，PBST洗涤3次；5%脱脂乳粉，200ul/孔，37℃封闭2h；PBST洗涤3次，加入从1:1000倍开始进行倍比稀释的抗体（浓度为1mg/ml），共计12个梯度，同时设立不包被对照100ul/孔，37℃，1h。PBST洗涤3次，加 PBS 1:10000倍稀释的羊抗鼠二抗，100ul/孔，37℃，45min。PBST洗涤5次，加100ul TMB/孔，37℃，显色10min，终止，读值。纯化后抗体稀释至1mg/ml，效价达到了1:1280000以上。

2.3抗体纯度及分子量鉴定

采用SDS-PAGE法进行抗体分子量及纯度鉴定；制胶，分离胶为12%，浓缩胶为5%；制样，20ul样品+20ul buffer，混匀，煮沸3min；每孔上样20ul，同时设立蛋白预染Marker对照；80伏30min，120伏2h；电泳完毕后，放入考马斯亮蓝溶液进行染色；去离子水煮沸脱色；纯化后的单克隆抗体经SDS-PAGE鉴定，条带清晰，无杂带，如图2所示，在50KDa和25KDa处各有清晰的条带。

实施例3：鼠抗PBP2a单克隆抗体基因验证

总RNA提取，单链cDNA合成：

用Trizol法（试剂盒购自Invitrogen）提取2FE11、2LE9杂交瘤细胞株的总RNA，用M-MLV逆转录酶（购自Invitrogen）将总RNA逆转为cDNA文库。

重链骨架区上游引物

P1：5’SAGGTGMAGCTKCASSARTCWGG3’ （SEQ ID NO:21）

重链可变区下游引物

P2：5’TGGGGSTGTYGTTTTGGCTGMRGAGACRGTGA3’ （SEQ ID NO:22）

轻链前导肽上游引物

P3：5’ATGGATTTTCAAGTGCAGATTTTCAG3’ （SEQ ID NO:23）

轻链可变区下游引物

P4：5’GGATACAGTTGGTGCAGCATCAGCCCGTTT3’ （SEQ ID NO:24）

配制PCR反应体系（50μl）如下：

cDNA:2μl；上游引物(10μM):2μl；下游引物(10μM):2μl；dNTP mixture:2μl；pfuDNA聚合酶(5U/μl):1μl；10 X pfu Buffer Ⅱ:5μl；ddH₂O:补足至50μl。

反应条件：95℃预变性5min；重复如下循环35次：95℃30s，58℃30s，72℃1min；最后，72℃延伸10min。

琼脂糖凝胶电泳分离并回收VL、VH片段。将回收后的VL、VH片段分别与pMD19-T(sKPCle)载体(Takara公司)进行连接，连接体系如下：

VL PCR产物/VH PCR产物各70ng，pMD19-T(sKPCle) 载体1μl，Solution I连接反应液5μl；ddH₂O补足至10μl，37℃连接30min。

连接产物转化入E.coli DH5α感受态细菌中，37℃过夜培养后，挑取单个菌落，37℃震摇2小时后进行菌液PCR鉴定，以对应抗体的cDNA为阳性对照。配制反应体系（25μl）如下：

菌液：1μl，上游引物(10μM)：1μl；下游引物(10 μM) ：1μl；dNTP Mixture (各2.5Mm) 2 μl；Taq DNA聚合酶 (5U/μl)：0.5 μl；10×Taq Buffer (Mg²⁺ plus)：2.5 μl；补水至25μl。反应条件同前。

选取菌PCR阳性的克隆扩大培养，用质粒提取试剂盒(Takara公司)提取阳性克隆质粒，送检测序。每个抗体的每条链至少送检5个克隆样品，至少三个样品测序结果相同为止。成功克隆得到抗体2FE11、2LE9的重链、轻链可变区序列，经比对符合典型抗体可变区序列特征。

实施例4：胶体金免疫层析法制备PBP2a检测卡

制备双抗体夹心法免疫胶体金试纸条，制备方法如下；

向胶体金溶液中边搅拌边加入0.1M K₂CO₃溶液，调节pH值后加入鼠抗PBP2a单克隆抗体2FE11，搅拌后加入10%的牛血清白蛋白溶液，2%PEG20000，搅拌后低速离心取上清，再高速离心后取沉淀，用胶体金重悬液定容形成金标抗体；将金标抗体喷于玻璃纤维素膜，烘干制成金标垫；向鼠抗PBP2a单克隆抗体2LE9中加入1%的硫柳汞钠溶液，混匀后形成检测线包被液，再向羊抗鼠IgG中加入PBS和1%的硫柳汞钠溶液，混匀后形成质控线包被液，将质控线包被液和检测线包被液划在硝酸纤维素膜上，烘干后获得包被膜；将包被膜贴在底板上，将金标垫和吸水纸搭上包被膜，层压后切割获得胶体金免疫层析法制备PBP2a检测卡。

用胶体金免疫层析法制备PBP2a检测卡检测空白对照、PBP2a抗原、MRSA样本，检测结果如图3所示，PBP2a检测卡能准确检测各个样本中PBP2a的存在情况。

以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。

Claims (10)

1.鼠抗PBP2a杂交瘤细胞株，其特征在于：命名为2LE9，保藏编号为CGMCCNo.46008；或者，命名为2FE11，保藏编号为CGMCCNo.46007。

2.鼠抗PBP2a单克隆抗体，其特征在于：抗体2LE9包括轻链可变区和重链可变区，轻链可变区包括如SEQ ID NO:1所示的CDRL1，如SEQ ID NO:2所示的CDRL2，以及如SEQ ID NO:3所示的CDRL3；重链可变区包括如SEQ ID NO:4所示的CDRH1，如SEQ ID NO:5所示的CDRH2，以及如SEQ ID NO:6所示的CDRH3；

或者，

抗体2FE11包括轻链可变区和重链可变区，轻链可变区包括如SEQ ID NO:11所示的CDRL1，如SEQ ID NO:12所示的CDRL2，以及如SEQ ID NO:13所示的CDRL3；重链可变区包括如SEQ ID NO:14所示的CDRH1，如SEQ ID NO:15所示的CDRH2，以及如SEQ ID NO:16所示的CDRH3。

3.根据权利要求1所述的鼠抗PBP2a单克隆抗体，其特征在于：抗体2LE9轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:7，重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:9；

或者，抗体2FE11轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:17，重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:19。

4.根据权利要求3所述的鼠抗PBP2a单克隆抗体，其特征在于：抗体2LE9由保藏编号为CGMCCNo.46008的鼠抗PBP2a杂交瘤细胞株产生；或者，抗体2FE11由保藏编号为CGMCCNo.46007的鼠抗PBP2a杂交瘤细胞株产生。

5.核酸分子，其特征在于：包含编码权利要求2或3所述的鼠抗PBP-2a单克隆抗体的多核苷酸。

6.根据权利要求5所述的核酸分子，其特征在于：编码抗体2LE9轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示，编码抗体2LE9重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；

或者，编码抗体2FE11轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示，编码抗体2FE11重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示。

7.一种检测试剂盒，其特征在于：包括权利要求2-4中任一所述的鼠抗PBP2a单克隆抗体。

8.根据权利要求7所述的检测试剂盒，其特征在于：制作成胶体金免疫试剂盒、化学发光试剂盒、放射免疫试剂盒、酶联免疫试剂盒或荧光免疫试剂盒，或者制作为微流体芯片。

9.根据权利要求8所述的检测试剂盒，其特征在于：制作成胶体金免疫试剂盒时，将抗体2LE9用作包被抗体，将抗体2FE11用作金标抗体。

10.权利要求7-9中任一所述的检测试剂盒在非疾病诊断治疗目的检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染中的应用。