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CN119265218A - 一种MuSK抗体检测方法及相应产品 - Google Patents

一种MuSK抗体检测方法及相应产品 Download PDF

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CN119265218A
CN119265218A CN202411460084.7A CN202411460084A CN119265218A CN 119265218 A CN119265218 A CN 119265218A CN 202411460084 A CN202411460084 A CN 202411460084A CN 119265218 A CN119265218 A CN 119265218A
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musk
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kit
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余政
张梅英
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Second Affiliated Hospital Of Fujian Medical University
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Abstract

本申请涉及一种MuSK抗体检测方法及相应产品。本申请采用的多聚核苷酸是编码重组人Flag‑MuSK‑ECD蛋白的多聚核苷酸；所述重组人Flag‑MuSK‑ECD蛋白的序列如SEQ ID NO.2所示；所述多聚核苷酸的序列如SEQ ID NO.1所示。本申请的MuSK抗体检测方法通过人工构建的目的基因表达质粒转染真核细胞，收取上清当中的分泌型Flag‑MuSK‑ECD蛋白，将分泌型Flag‑MuSK‑ECD蛋白作为检测抗原，规避了检测抗原种属差异、原核细胞表达非成熟MuSK全长蛋白、针对部分抗MuSK跨膜段和/或胞内段抗体、以及特异性差蛋白标签纯化系统导致的蛋白纯化纯度不高等原因影响检测抗原活性的因素，所以抗原活性较好，从而提高致病性抗体检测的特异性和灵敏性，为临床诊断和治疗方案提供更有价值的生物标志物检测方法。

Description

一种MuSK抗体检测方法及相应产品
技术领域
本申请涉及抗体检测领域，特别是涉及一种MuSK抗体检测方法及相应产品，如多聚核苷酸、重组蛋白表达质粒、转化体、表达系统、蛋白质、组合物、产品组合、试剂、试剂盒、体系或系统。
背景技术
重症肌无力(Myasthenia Grais，MG)是一种临床常见的自身免疫性抗体攻击神经肌肉接头(NMJ)而导致以波动性肌无力为主要表现的自身免疫性疾病。AChR及MuSK抗体是目前公认的具有MG独立致病性的两种抗体，这两种抗体的检测对于MG的诊断和疗效观察非常重要。重症肌无力的诊断需要主要临床症状加3个实验室诊断标志之一，而且重症肌无力有很多类型，需要分组，MuSK抗体检测意义在于辅助MuSKMG患者的诊断。
AChR抗体阳检测方法已经非常成熟。但MuSK抗体检测方法仍不成熟。目前自身免疫性抗体检测主要采用三种方法：放免法、ELISA以及CBA法。其中放免法是目前指南推荐的标准抗体检测方法，但由于其涉及到放射性检测资质要求，很难被推广使用。CBA检测方法的实施需要配备专业的细胞培养和荧光显微镜等昂贵设备，限制了其在临床的推广使用。ELISA检测方法的优势在于检测方便，快速，易于构建出商业化快速检测试剂盒，对检测场所配置要求不高，适宜在临床上推广使用。并且，临床上其它自身免疫性疾病的成熟抗体检测技术大部分都采用ELISA检测技术，所以值得进一步研发包括MuSK在内的MG自身免疫性抗体的ELISA检测方法。
发明内容
本申请的第一方面，在于提出一种多聚核苷酸，以解决目前检测MuSK抗体或辅助分组诊断重症肌无力存在的技术问题。
一种多聚核苷酸，所述多聚核苷酸是编码重组人Flag-MuSK-ECD蛋白的多聚核苷酸；
优选地，所述重组人Flag-MuSK-ECD蛋白的序列如SEQ ID NO.2所示；
优选地，所述多聚核苷酸的序列如SEQ ID NO.1所示。
本申请的第二方面，在于提出一种重组蛋白表达质粒，以解决目前检测MuSK抗体或辅助分组诊断重症肌无力存在的技术问题。
一种重组蛋白表达质粒，包括质粒载体和目的基因，所述目的基因是如上述第一方面所述的多聚核苷酸，所述质粒载体是pCMV。
优选地，所述重组蛋白表达质粒是pCMV-Flag-human-MuSK-ECD。
本申请的第三方面，在于提出一种重组蛋白转化体或表达系统，以解决目前检测MuSK抗体或辅助分组诊断重症肌无力存在的技术问题。
一种重组蛋白转化体或表达系统，包括受体细胞及重组蛋白表达质粒，所述重组蛋白表达质粒，如上文第二方面所述；所述受体细胞是真核细胞；
优选地，所述真核细胞是人源细胞；
更优选地，所述人源细胞是人源上皮细胞；
又更优选地，所述人源上皮细胞是人肾上皮细胞；
再更优选地，所述人肾上皮细胞是293T。
本申请的第四方面，在于提出一种蛋白质，以解决目前检测MuSK抗体或辅助分组诊断重症肌无力存在的技术问题。
一种蛋白质，所述蛋白质为重组人Flag-MuSK-ECD蛋白，所述重组人Flag-MuSK-ECD蛋白的序列如SEQ ID NO.2所示；优选地，所述重组人Flag-MuSK-ECD蛋白的蛋白纯度为80-90％以上，浓度0.4-0.5ug/uL以上。
本申请的第五方面，在于提出一种重组蛋白的用途，以解决目前检测MuSK抗体或辅助分组诊断重症肌无力存在的技术问题。
一种重组蛋白的用途，所述蛋白质如上文第四方面所述；所述重组蛋白的用途是作为检测抗原用于检测MuSK抗体或辅助分组诊断重症肌无力，或者用于制备检测MuSK抗体或辅助分组诊断重症肌无力的组合物、产品组合、试剂、试剂盒、体系或系统；
优选地，所述重组人Flag-MuSK-ECD蛋白的序列如SEQ ID NO.2所示；
优选地，所述检测是酶标抗体法检测；
更优选地，所述酶标抗体法检测是间接法。
本申请的第六方面，在于提出一种蛋白质的制备方法，以解决目前检测MuSK抗体或辅助分组诊断重症肌无力存在的技术问题。
一种蛋白质的制备方法，所述蛋白质如上文第四方面所述；所述蛋白质的制备方法包括产物表达、产物纯化步骤，所述产物表达步骤包括使用上述第三方面所述的重组蛋白转化体或表达系统获得含有重组人Flag-MuSK-ECD蛋白的培养上清液，所述产物纯化步骤包括使用Flag磁珠进行纯化；
优选地，所述产物纯化步骤包括以下步骤：
a.将所述含有重组人Flag-MuSK-ECD蛋白的培养上清液与Flag磁珠接触，优选地，所述Flag磁珠包括抗Flag标签单克隆抗体，所述抗Flag标签单克隆抗体为M1，用量为每1mL含有重组人Flag-MuSK-ECD蛋白的培养上清液加入10-20uLFlag磁珠，1ug/uL；
b.通过洗涤将非特异性结合的蛋白质去除，留下特异性结合的重组人Flag-MuSK-ECD蛋白；优选地，所述洗涤所用的洗涤缓冲液是1％(v/v)Tween20in PBS，用量为200uL/孔；
c.洗脱获得重组人Flag-MuSK-ECD蛋白；优选地，所述洗脱采用3*Flag多肽竞争性抑制洗脱，用量为200ug，1ug/uL。
本申请的第七方面，在于提出一种组合物、产品组合、试剂、试剂盒、体系或系统，以解决目前检测MuSK抗体或辅助分组诊断重症肌无力存在的技术问题。
一种组合物、产品组合、试剂、试剂盒、体系或系统，所述组合物、产品组合、试剂、试剂盒、体系或系统包括检测抗原，所述检测抗原是如上文第四方面所述的蛋白质，或者是按照上文第六方面所述蛋白质的制备方法制备的蛋白质。
进一步，所述组合物、产品组合、试剂、试剂盒、体系或系统还包括：二抗、显色底物；
又进一步，所述组合物、产品组合、试剂、试剂盒、体系或系统还包括：阳性标准品对照血清、对照蛋白；阳性标准品对照血清为已确诊为MuSK MG患者的血清样本，对照蛋白为空载体转染细胞后上清flag磁珠纯化的蛋白。
又更进一步，所述组合物、产品组合、试剂、试剂盒、体系或系统还包括：包被缓冲液、封闭缓冲液、清洗缓冲液、终止剂；所述显色底物是显色底物缓冲液稀释的显色底物。
在上述任一技术方案基础上优选地，所述二抗是碱性磷酸酶标记山羊抗人IgG(H+L)二抗；所述显色底物是对硝基苯磷酸盐。
本申请的第八方面，在于提出一种组合物、产品组合、试剂、试剂盒、体系或系统的用途，以解决目前MuSK抗体检测存在的上述技术问题。
本申请采用以下技术方案，解决上述技术问题。
一种组合物、产品组合、试剂、试剂盒、体系或系统的用途，所述组合物、产品组合、试剂、试剂盒、体系或系统如上文第七方面任一技术方案所述，所述组合物、产品组合、试剂、试剂盒、体系或系统的用途是用于检测MuSK抗体或辅助分组诊断重症肌无力，或者用于制备检测MuSK抗体或辅助分组诊断重症肌无力的组合物、产品组合、试剂、试剂盒、体系或系统；
优选地，所述检测是酶标抗体法检测；
更优选地，所述酶标抗体法检测是间接法。
本申请的第九方面，在于提出一种非疾病诊断目的的检测MuSK抗体的方法或辅助分组诊断重症肌无力，以解决目前MuSK抗体检测存在的上述技术问题。
一种非疾病诊断目的的检测MuSK抗体或辅助分组诊断重症肌无力的方法，包括以下步骤：
1)将待测血清或血浆样本与上文第七方面又进一步的技术方案所述的组合物、产品组合、试剂、试剂盒、体系或系统中的重组人Flag-MuSK-ECD蛋白、二抗、显色底物接触；
将待测血清或血浆样本与上文第七方面又进一步的技术方案所述的组合物、产品组合、试剂、试剂盒、体系或系统中的对照蛋白、二抗、显色底物接触；
将阳性标准品对照血清与上文第七方面又进一步的技术方案所述的组合物、产品组合、试剂、试剂盒、体系或系统中的重组人Flag-MuSK-ECD蛋白、二抗、显色底物接触；
将阳性标准品对照血清与上文第七方面又进一步的技术方案所述的组合物、产品组合、试剂、试剂盒、体系或系统中的对照蛋白、二抗、显色底物接触；
设置空白对照；
2)测量OD值；
3)计算结果及判定；优选先将检测OD值进行如下转换：(Flag-MuSK-ECD蛋白OD值-空白对照OD值)/(对照蛋白OD值-空白对照OD值)，获得校准表达量值，以阳性标准品对照血清校准表达量标定为1，计算出待测血清抗体相对表达量值，并与从健康人检测数据当中划定的界值比较，得出是否是抗体检测阳性结果。
本申请的有益效果如下：
1.现有技术使用非人源蛋白作为检测抗原导致的种属差异明显，极大影响了检测结果的敏感性和特异性。本申请使用的是重组人MuSK蛋白作为检测抗原，从而避免了种属差异带来的试验结果误差，明显提升了检测的敏感性和特异性。
2.由于MuSK为单次跨膜蛋白，现有MuSK检测技术使用的是重组MuSK全长蛋白作为检测抗原，使得抗体阳性患者当中包括针对抗MuSK跨膜段和/或胞内段的抗体，而这部分抗体被认为无直接致病性，导致假阳性结果出现，影响检测的特异性。本申请使用的抗原MuSK胞外段蛋白，不包括MuSK跨膜段和/或胞内段，从而极大的减少了非致病性假阳性抗体被检出的可能，明显提高了检测的特异性。
3.现有MuSK抗体ELISA检测抗原获取方法均来自于原核细胞细胞裂解液当中提取的重组MuSK蛋白，由于是非真核细胞表达系统，导致蛋白修饰不完全，而且纯化的是胞内蛋白，导致获得的大部分是非成熟蛋白，这些因素导致其抗原活性明显降低，极大的影响了ELISA检测的灵敏度及特异性。本申请通过构建Flag-MuSK-ECD稳定真核表达细胞株，纯化其上清当中的分泌型Flag-MuSK-ECD蛋白，从而获得的均为成熟Flag-MuSK-ECD蛋白，极大提高其抗原活性，从而明显提升了ELISA检测的灵敏度和特异性。
4.现有MuSK抗体ELISA检测抗原蛋白纯化使用的免疫沉淀标签特异性不强(例如His标签)，导致其纯度不高，且影响了MuSK检测蛋白的抗原活性，进一步降低了ELISA检测的特异性。本申请构建的是特异性更高的flag标签重组Flag-MuSK-ECD蛋白，使用Flag磁珠免疫沉淀方法，纯化分泌型重组人Flag-MuSK-ECD蛋白，提高了蛋白纯化的纯度，进一步保持了MuSK检测蛋白的抗原活性，明显提高了检测的特异性。
附图说明
图1为pCMV-Flag-human-MuSK-ECD表达质粒图谱；
图2为Flag-MuSK-ECD蛋白纯化纯度分析图；
图3为一实施例MuSK抗体检测方法对照实验结果图。
使用本申请ELISA检测方法对实验样本进行检测，包括健康人对照组(HC)118例，疾病对照组(PC，patient control)50例，MG患者组(MG)291例，并以HC患者检测结果计算出抗体阳性界值。结果显示，MG组患者中有10例MuSK抗体阳性，疾病对照组中未检出阳性患者。
具体实施方式
试剂来源如下：
Thermo：Thermo Fisher Scientific Inc.
Gibco:Thermo Fisher Scientific Inc.
sigma：德国达姆施塔特默克集团(MerckKGaA)
MCE：MedChemExpress LLC
Abcam:艾博抗公司(Abcamplc)
术语“系统”应作为广义理解，可以为组合物、产品组合、试剂、试剂盒，也可以为含有前述组合物、产品组合、试剂、试剂盒的仪器设备，也可以为将组合物、产品组合、试剂、试剂盒用于检测时形成的混合物(体系)，以及含有前述混合物的仪器设备。
下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本申请保护的范围。
本申请通过使用特异性更好的Flag磁珠纯化真核细胞上清液当中表达的分泌型成熟重组Flag-MuSK-ECD蛋白作为检测抗原，规避了检测抗原种属差异、原核细胞表达非成熟MuSK全长蛋白、针对部分抗MuSK跨膜段和/或胞内段抗体、以及特异性差蛋白标签纯化系统导致的蛋白纯化纯度不高等原因影响检测抗原活性的因素，所以抗原活性较好，从而明显提高了致病性抗体检测的特异性和敏感性，为临床诊断和治疗方案提供更有价值的生物标志物检测方法。
本具体实施方式的第一方面，提出了一种多聚核苷酸，所述多聚核苷酸是编码重组人Flag-MuSK-ECD蛋白的多聚核苷酸；所述重组人Flag-MuSK-ECD蛋白的序列如SEQ IDNO.2所示；所述多聚核苷酸的序列如SEQ ID NO.1所示，Flag标签又被称为DYKDDDDK标签，它的本质其实是一种亲水性多肽蛋白标签，由八个氨基酸组成(Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)的融合多肽，其对应的核酸序列均能用于本申请。
SEQ ID NO.1MuSK-ECD核酸序列：
CTTCCAAAAGCTCCTGTCATCACCACTCCTCTTGAAACAGTGGATGCCTTAGTTGAAGAAGTGGCTACTTTCATGTGTGCAGTGGAATCCTACCCCCAGCCTGAGATTTCCTGGACTAGAAATAAAATTCTCATTAAACTCTTTGACACCCGGTACAGCATCCGGGAGAATGGGCAGCTCCTCACCATCCTGAGTGTGGAAGACAGTGATGATGGCATTTACTGCTGCACGGCCAACAATGGTGTGGGAGGAGCTGTGGAGAGTTGTGGAGCCCTGCAAGTGAAGATGAAACCTAAAATAACTCGTCCTCCCATAAATGTGAAAATAATAGAGGGATTAAAAGCAGTCCTACCATGTACTACAATGGGTAATCCCAAACCATCAGTGTCTTGGATAAAGGGAGACAGCCCTCTCAGGGAAAATTCCCGAATTGCAGTTCTTGAATCTGGGAGCTTGAGGATTCATAACGTACAAAAGGAAGATGCAGGACAGTATCGATGTGTGGCAAAAAACAGCCTCGGGACAGCATATTCCAAAGTGGTGAAGCTGGAAGTTGAGGTTTTTGCCAGGATCCTGCGGGCTCCTGAATCCCACAATGTCACCTTTGGCTCCTTTGTGACCCTGCACTGTACAGCAACAGGCATTCCTGTCCCCACCATCACCTGGATTGAAAACGGAAATGCTGTTTCTTCTGGGTCCATTCAAGAGAGTGTGAAAGACCGAGTGATTGACTCAAGACTGCAGCTGTTTATCACCAAGCCAGGACTCTACACATGCATAGCTACCAATAAGCATGGGGAGAAGTTCAGTACTGCCAAGGCTGCAGCCACCATCAGCATAGCAGAATGGAGTAAACCACAGAAAGATAACAAAGGCTACTGCGCCCAGTACAGAGGGGAGGTGTGTAATGCAGTCCTGGCAAAAGATGCTCTTGTTTTTCTCAACACCTCCTATGCGGACCCTGAGGAGGCCCAAGAGCTACTGGTCCACACGGCCTGGAATGAACTGAAAGTAGTGAGCCCAGTCTGCCGGCCAGCTGCTGAGGCTTTGTTGTGTAACCACATCTTCCAGGAGTGCAGTCCTGGA GTAGTGCCTACTCCTATTCCCATTTGCAGAGAGTACTGCTTGGCAGTAAAGGAGCTCTTCTGCGCAAAAGAATGGCTGGTAATGGAAGAGAAGACCCACAGAGGACTCTACAGATCCGAGATGCATTTGCTGTCCGTGCCAGAATGCAGCAAGCTTCCCAGCATGCATTGGGACCCCACGGCCTGTGCCAGACTGCCACATCTAGATTATAACAAAGAAAACCTAAAAACATTCCCACCAATGACGTCCTCAAAGCCAAGTGTGGACATTCCAAATCTGCCTTCCTCCTCCTCTTCTTCCTTCTCTGTCTCACCTACATACTCCATGACTSEQ ID NO.2：MuSK-ECD蛋白序列
LPKAPVITTPLETVDALVEEVATFMCAVESYPQPEISWTRNKILIKLFDTRYSIRENGQLLTILSVEDSDDGIYCCTANNGVGGAVESCGALQVKMKPKITRPPINVKIIEGLKAVLPCTTMGNPKPSVSWIKGDSPLRENSRIAVLESGSLRIHNVQKEDAGQYRCVAKNSLGTAYSKVVKLEVEVFARILRAPESHNVTFGSFVTLHCTATGIPVPTITWIENGNAVSSGSIQESVKDRVIDSRLQLFITKPGLYTCIATNKHGEKFSTAKAAATISIAEWSKPQKDNKGYCAQYRGEVCNAVLAKDALVFLNTSYADPEEAQELLVHTAWNELKVVSPVCRPAAEALLCNHIFQECSPGVVPTPIPICREYCLAVKELFCAKEWLVMEEKTHRGLYRSEMHLLSVPECSKLPSMHWDPTACARLPHLDYNKENLKTFPPMTSSKPSVDIPNLPSSSSSSFSVSPTYSMT
本具体实施方式的第二方面提出了一种重组蛋白表达质粒，所述重组蛋白表达质粒，包括质粒载体和目的基因，包括如上文第一方面所述的多聚核苷酸，即所述多聚核苷酸是编码重组人Flag-MuSK-ECD蛋白的多聚核苷酸；所述重组人Flag-MuSK-ECD蛋白的序列如SEQ ID NO.2所示；所述多聚核苷酸的序列如SEQ ID NO.1所示；所述质粒载体是pCMV。优选地，所述重组蛋白表达质粒是pCMV-Flag-human-MuSK-ECD
本具体实施方式的第三方面提出了一种重组蛋白转化体或表达系统，包括受体细胞及重组蛋白表达质粒，所述重组蛋白表达质粒如本具体实施方式第二方面所述，即所述重组蛋白表达质粒包括如上文第一方面所述的多聚核苷酸，即所述多聚核苷酸是编码重组人Flag-MuSK-ECD蛋白的多聚核苷酸；所述重组人Flag-MuSK-ECD蛋白的序列如SEQ IDNO.2所示；所述多聚核苷酸的序列如SEQ ID NO.1所示。所述重组蛋白表达质粒的受体细胞是真核细胞；优选地，所述真核细胞是人源细胞，更优选地，所述人源细胞是人源上皮细胞，又更优选地，所述人源上皮细胞是人肾上皮细胞，再更优选地，所述人肾上皮细胞是293T。
本具体实施方式的第四方面提出了一种蛋白质，所述蛋白质为重组人Flag-MuSK-ECD蛋白，所述重组人Flag-MuSK-ECD蛋白的序列如SEQ ID NO.2所示；优选地，所述重组人Flag-MuSK-ECD蛋白的蛋白纯度为80-90％以上，浓度0.4-0.5ug/uL以上；优选地，所述重组人Flag-MuSK-ECD蛋白是如SEQ ID NO.1所示的多聚核苷酸编码。优选地，所述重组人Flag-MuSK-ECD蛋白由本具体实施方式的第三方面提出的转化体或表达系统表达获得。
本具体实施方式的第五方面，提出了一种蛋白质的用途，所述蛋白质如本具体实施方式第四方面所述；所述蛋白质的用途是作为检测抗原用于检测MuSK抗体或辅助分组诊断重症肌无力，或者用于制备检测MuSK抗体或辅助分组诊断重症肌无力的组合物、产品组合、试剂、试剂盒、体系或系统；优选地，所述重组人Flag-MuSK-ECD蛋白的序列如SEQ IDNO.2所示；优选地，所述检测是酶标抗体法检测；更优选地，所述酶标抗体法检测是间接法。ELISA目前有四种方法，包括直接法、间接法、夹心法、竞争法。间接法是将已知的抗体与固相载体(如ELISA板)结合，再与待测样本中的抗原反应，形成抗原-抗体复合物。清洗后，加入酶标记的二抗，与抗原-抗体复合物反应，形成酶标记的抗原-抗体复合物。最后，加入显色底物显色，根据颜色反应判断结果。
本具体实施方式的的第六方面，提出了一种蛋白质的制备方法，所述蛋白质如本具体实施方式第四方面所述；所述蛋白质的制备方法包括产物表达、产物纯化步骤，所述产物表达步骤包括使用如本具体实施方式第三方面所述的转化体或表达系统获得含有重组人Flag-MuSK-ECD蛋白的培养上清液，所述产物纯化步骤包括使用Flag磁珠进行纯化；
优选地，所述产物纯化步骤包括以下步骤：
a.将所述含有重组人Flag-MuSK-ECD蛋白的培养上清液加入Flag磁珠,优选地，所述Flag磁珠包括抗Flag标签单克隆抗体，所述抗Flag标签单克隆抗体为M1，用量为每1mL含有重组人Flag-MuSK-ECD蛋白的培养上清液加入10-20uL Flag磁珠，1ug/uL；
b.通过洗涤将非特异性结合的蛋白质去除，留下特异性结合的重组人Flag-MuSK-ECD蛋白；优选地，所述洗涤所用的洗涤缓冲液是1％(v/v)Tween20in PBS，用量为200uL/孔；
c.洗脱获得重组人Flag-MuSK-ECD蛋白；优选地，所述洗脱采用3*Flag多肽竞争性抑制洗脱，用量为200ug，1ug/uL。
本具体实施方式的第七方面，提出了一种组合物、产品组合、试剂、试剂盒、体系或系统，所述组合物、产品组合、试剂、试剂盒、体系或系统包括检测抗原，所述检测抗原是如本具体实施方式第四方面所述的蛋白质，或者是按照本具体实施方式第六方面所述蛋白质的制备方法制备的蛋白质。所述组合物、产品组合、试剂、试剂盒、体系或系统还包括：二抗、显色底物。
所述组合物、产品组合、试剂、试剂盒、体系或系统还包括：阳性标准品对照血清、对照蛋白；阳性标准品对照血清为已确诊为MuSK MG患者的血清样本，对照蛋白为空载体转染细胞后上清flag磁珠纯化的蛋白。
所述组合物、产品组合、试剂、试剂盒、体系或系统还包括：包被缓冲液、封闭缓冲液、清洗缓冲液、终止剂；所述显色底物是显色底物缓冲液稀释的显色底物。
优选地，所述二抗是抗人抗体。示例性的，所述二抗包括但不限于山羊抗人抗体，大鼠抗人抗体，小鼠抗人抗体，猪抗人抗体，驴抗人抗体，绵羊抗人抗体，鸡抗人抗体，马抗人抗体，兔抗人抗体，仓鼠抗人抗体，狗抗人抗体，牛抗人抗体等，优选山羊抗人抗体。更优选地，所述山羊抗人抗体是碱性磷酸酶标记山羊抗人IgG(H+L)二抗。
所述显色底物是对硝基苯磷酸盐。
本具体实施方式的第八方面，提出了一种组合物、产品组合、试剂、试剂盒、体系或系统的用途，所述组合物、产品组合、试剂、试剂盒、体系或系统如本具体实施方式第七方面任一技术方案所述，所述组合物、产品组合、试剂、试剂盒、体系或系统的用途是用于检测MuSK抗体或辅助分组诊断重症肌无力，或者用于制备检测MuSK抗体或辅助分组诊断重症肌无力的组合物、产品组合、试剂、试剂盒、体系或系统；优选地，所述检测是酶标抗体法检测；更优选地，所述酶标抗体法检测是间接法。
本具体实施方式的第九方面，提出了一种非疾病诊断目的的检测MuSK抗体或辅助分组诊断重症肌无力的方法，包括以下步骤：
1)将待测血清或血浆样本与本具体实施方式第七方面又进一步的技术方案所述的组合物、产品组合、试剂、试剂盒、体系或系统中的重组人Flag-MuSK-ECD蛋白、二抗、显色底物接触；
将待测血清或血浆样本与本具体实施方式第七方面又进一步的技术方案所述的组合物、产品组合、试剂、试剂盒、体系或系统中的对照蛋白、二抗、显色底物接触；
将阳性标准品对照血清与本具体实施方式第七方面所述的组合物、产品组合、试剂、试剂盒、体系或系统中的重组人Flag-MuSK-ECD蛋白、二抗、显色底物接触；
将阳性标准品对照血清与本具体实施方式第七方面又进一步的技术方案所述的组合物、产品组合、试剂、试剂盒、体系或系统中的对照蛋白、二抗、显色底物接触；
设置空白对照；
2)测量OD值；
3)计算结果及判定；优选先将检测OD值进行如下转换：(Flag-MuSK-ECD蛋白OD值-空白对照OD值)/(对照蛋白OD值-空白对照OD值)，获得校准表达量值，以阳性标准品对照血清校准表达量标定为1，计算出待测血清抗体相对表达量值，并与从健康人检测数据当中划定的界值比较，得出是否是抗体检测阳性结果。
实施例1
由于MuSK为单次跨膜蛋白，现有MuSK检测技术包被抗原使用的是重组MuSK全长蛋白，导致检出的抗体当中包括一部分抗MuSK跨膜段和/或胞内段抗体，降低了致病性抗体检测的特异性。本申请通过构建并纯化稳定表达细胞株上清当中的分泌型MuSK-ECD蛋白，提高其抗原活性，从而提高了其作为检测抗原的ELISA检测试剂盒的灵敏度和特异性。一实施例的MuSK抗体检测方法包括以下步骤：
步骤一、构建重组人MuSK-ECD蛋白表达质粒，质粒图谱见图1；
步骤二、构建重组人MuSK-ECD蛋白293T真核细胞转化体或表达系统；
步骤三、使用flag凝胶从重组人MuSK-ECD蛋白293T真核细胞转化体上清及空载质粒载体293T真核细胞转化体上清中纯化出重组人MuSK-ECD蛋白(见图2)及对照蛋白；
步骤四、用纯化好的重组人MuSK-ECD蛋白及对照蛋白溶解于碳酸钠缓冲液中，包被96孔ELISA板(NUNC maxisorpApogent Cat.No.80040LE 0903)，每孔10ng，放置在4℃，过夜；
步骤五、用清洗缓冲液(0.5％PBST)洗6次，每次5分钟；
步骤六、每孔均加入封闭缓冲液(2％BSAin 0.5％PBST)100ul，常温下孵育2小时；
步骤七、根据实验设计，在不同孔中分别加入用封闭缓冲液稀释了的患者血清、阳性对照血清(1：100)，在4℃孵育过夜；
步骤八、用清洗缓冲液洗6次，每次5分钟；
步骤九、所有孔中加入封闭缓冲液稀释了的二抗：Goat anti-Mouse/Human IgG(H+L)AP 1:1000，常温孵育2小时；
步骤十、用清洗缓冲液洗6次，每次5分钟；
步骤十一、所有孔中都加入底物反应液稀释的反应底物pnpp(15mg in 100μl)，常温下孵育15分钟；
步骤十二、加入终止反应液(3M NaOH)；
步骤十三、立即用酶标仪在405nm波长测量各孔的光密度(OD值)，
步骤十四、对各组数据进行分析，计算出抗体相对表达量，与从健康人检测数据当中划定的界值比较，得出抗体检测结果。
以下将对MuSK抗体检测方法及试剂盒进行更为详细说明。
步骤一：质粒构建
通过基因编辑技术，如亚克隆技术，构建一种重组蛋白表达质粒pCMV-Flag-human-MuSK-ECD；质粒图谱见图1。
步骤二：转染使用Lippo3000(Thermo,L3000075)将pCMV-Flag-human-MuSK-ECD质粒或空载质粒载体转染入HEK293T细胞。
步骤三：产物表达
10％(v/v)FBS(Gibco，10099141C)in DMEM培养基(Gibco，11995-65)培养48小时后，换液DMEM(Gibco，11995-65)促进蛋白分泌，24-48小时后收含有重组人Flag-MuSK-ECD蛋白及对照蛋白的培养上清液。
步骤四：纯化
使用Flag磁珠(货号：sigma M8823)从前述蛋白293T真核细胞转化体的上清中纯化出分泌型成熟重组人Flag-MuSK-ECD蛋白及对照蛋白。对照蛋白是含有Flag标签的空载质粒转染细胞取上清用Flag磁珠进行蛋白纯化得到的产物，过程与Flag-MuSK-ECD蛋白纯化过程相同，并同时进行。Flag-MuSK-ECD蛋白浓度0.4-0.5ug/uL，对照蛋白浓度0.4-0.5ug/ul(BSA蛋白定量法)。
所述步骤四包括以下步骤：
a.将所述含有重组人Flag-MuSK-ECD蛋白及对照蛋白的培养上清液加入Flag磁珠，所述Flag磁珠包括抗Flag标签单克隆抗体，所述抗Flag标签单克隆抗体为M1，用量为每1mL上清加入20uLFlag磁珠，1ug/uL。
b.通过洗涤将非特异性结合的蛋白质去除，留下特异性结合的重组人Flag-MuSK-ECD蛋白及对照蛋白；所述洗涤所用的洗涤缓冲液是1％(v/v)Tween20 in PBS，用量为200uL/孔；
c.洗脱获得重组人Flag-MuSK-ECD蛋白及对照蛋白；所述洗脱采用3*Flag多肽(MCE,货号：HY-P0319)竞争性抑制洗脱，用量为200ug，1ug/uL。
重组人Flag-MuSK-ECD蛋白纯化纯度分析见图2。使用ImageJ软件对图2进行灰度分析，得出纯度为80-90％；Flag-MuSK-ECD蛋白浓度0.4-0.5ug/uL(考马斯蓝染色法)。本申请的重组人Flag-MuSK-ECD蛋白，在采用本申请的纯化方法后，无需继续浓缩和/或纯化，即可作为MuSK抗体检测用的蛋白。
步骤五：包被
将所述Flag-MuSK-ECD蛋白及对照蛋白分别溶解于碳酸钠缓冲液(pH9.6)中，包被ELISA板，每孔10ng，在4℃放置12小时；
步骤六：洗涤
采用清洗缓冲液(1％(v/v)Tween20 inPBS(PBST))多次冲洗所述ELISA板，每孔中均加入100ul封闭缓冲液(2％(v/v)BSAinPBST)，并在25℃孵育2小时。
步骤七：封闭
将采用所述封闭缓冲液稀释了的待测血清和阳性标准品对照血清(MusK抗体浓度8nmol/L)，稀释比例1：100(体积比)，加入所述ELISA板的目标孔中，在一个板中，每个样本3个复孔，1-3和7-9列孵育对照蛋白，4-6和10-12列孵育检测抗原重组人Flag-MuSK-ECD蛋白，在4℃放置12小时。
步骤八：洗涤后加入二抗
采用所述清洗缓冲液六次冲洗所述ELISA板，并在所述目标孔中加入采用所述封闭缓冲液稀释了的二抗：碱性磷酸酶标记山羊抗人IgG(H+L)二抗(Goat anti-Human IgG(H+L)AP，abcam,ab6859)，稀释比例1:1000，25℃孵育2小时。
步骤九：洗涤后加入显色底物
采用所述清洗缓冲液六次冲洗所述ELISA板，在所述目标孔中加入显色底物反应液稀释的反应底物(即显色底物)pNPP(对硝基苯磷酸盐，碧云天，ST1042-5g)，也即下文所述的显色底物显影剂(0.015g p-NITROPHENYL Phosphate(sigma ca#N-3254)溶解于显色底物缓冲液(10mM Diethanolamme(sigma,ca#D8885),0.5mM Magnesium chloride,PH9.8溶解于PBS)，25℃下孵育15分钟。
步骤十：终止，加入终止剂(3M NaOH)。
步骤十一：测量OD值
用酶标仪在405nm波长测量各孔的光密度(OD值)，测量所述目标孔的光密度。
步骤十二：计算结果
先将检测OD值进行如下转换：(Flag-MuSK-ECD蛋白OD值-空白对照OD值)/(对照蛋白OD值-空白对照OD值)，获得校准表达量值，以阳性标准品对照血清校准表达量标定为1，计算出待测血清抗体相对表达量值，并与从健康人检测数据当中划定的界值(见图3)比较，得出是否是抗体检测阳性结果。
举例：
同一96孔板检测：
阳性标准品对照血清校准表达量值＝(Flag-MuSK-ECD蛋白OD值1.044333333-空白对照OD值0.075)/(对照蛋白OD值0.124333333-空白对照OD值0.076333333)＝20.32867133，
待测血清抗体校准表达量值(Flag-MuSK-ECD蛋白OD值1.731666667-空白对照OD值0.075)/(对照蛋白OD值0.16-空白对照OD值0.076333333)＝19.80079681，
此待测血清抗体相对表达量值＝19.80079681/20.32867133＝0.974033005.
本次实验共纳入118例健康受试者，根据以上公式得出相对表达量值，计算出阳性界值cut line＝mean+4*SD＝0.070916712+4*0.030071085＝0.191201051
此待测血清被判断为MuSK抗体阳性。
阳性界值是为了评估患者抗体是否阳性存在，为临床诊断提供信息，但不是直接诊断的依据。
一实施例的试剂盒，包括上述检测方法中的Flag-MuSK-ECD蛋白，还包括阳性标准品对照血清、包被缓冲液、封闭缓冲液(2％<v/v>BSAin PBST)、清洗缓冲液(1％<v/v>Tween20 in PBS(PBST))、显色底物显影剂(0.015g p-NITROPHENYL Phosphate(sigma ca#N-3254)溶解于显色底物缓冲液(10mM Diethanolamme(sigma,ca#D8885),0.5mMMagnesium chloride,PH9.8溶解于PBS)、终止缓冲液(3MNaOH)。
与首都医科大学宣武医院合作进行单盲回顾性临床研究，使用该试剂盒对118例健康受试者，291例确诊MG患者及50例其它疾病对照组进行MuSK抗体检测，同时以MuSK放免法(北京北方生物技术研究所)检测结果作为阳性对照(现有技术中采用MuSK放免法检测结果作为阳性对照，参考文献Oeztuerk M,Henes A,Schroeter CB,Nelke C,Quint P,Theissen L,Meuth SG,Ruck T.Current biomarker strategies in autoimmuneneuromuscular diseases.Cells.2023；12)，见图3。
结果显示，使用本申请检测291例MG患者当中共检出10例MuSK抗体阳性患者，在健康人对照和其它疾病对照组当中均未检出MuSK抗体。这一结果与MuSK放免法检测结果一致。在揭盲后发现，其中19例患者既往被诊断为MuSK阳性，其中9例阳性患者与本申请和放免法检测阳性结果一致，但另外10例检测阳性患者本申请和放免法检测为阴性。且有1例患者本申请和放免法检测均为阳性，但既往被诊断为MuSK阴性。在对总共三种方法检测有阳性结果的20例患者的临床表现及体征进行深入分析后发现，本申请ELISA检测与放免法共同检测为MuSK抗体阳性患者的临床表现更加符合MuSKMG的特征性表现，而既往较多具有MuSK MG非典型疾病特征的患者，判定为阳性，且1例具有MuSK MG典型疾病特征的患者判断为阴性。这显示本具体实施方式下的试剂盒的特异性和敏感性更为理想，尤其是特异性方面有明显进步，能避免MG患者误诊。以上结果提示，本申请显著提高了MuSK抗体ELISA检测与MuSK放免法检测结果的一致性，从而提高了MuSK抗体ELISA检测的灵敏度及特异性。
本申请通过使用特异性更好的Flag凝胶纯化真核细胞上清当中表达的分泌型成熟Flag-MuSK-ECD蛋白作为检测抗原，规避了检测抗原种属差异、原核细胞表达非成熟MuSK全长蛋白、针对部分抗MuSK跨膜段和/或胞内段抗体、以及特异性差蛋白标签纯化系统导致的蛋白纯化纯度不高等原因影响检测抗原活性的因素，从而明显提高了致病性抗体检测的特异性和敏感性。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本申请专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (13)

1.一种多聚核苷酸，其特征在于，所述多聚核苷酸是编码重组人Flag-MuSK-ECD蛋白的多聚核苷酸；
优选地，所述重组人Flag-MuSK-ECD蛋白的序列如SEQ ID NO.2所示；
优选地，所述多聚核苷酸的序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种重组蛋白表达质粒，包括质粒载体和目的基因，其特征在于，所述目的基因是如权利要求1所述的多聚核苷酸，所述质粒载体是pCMV。
3.一种重组蛋白转化体或表达系统，包括受体细胞及重组蛋白表达质粒，其特征在于，所述重组蛋白表达质粒如权利要求2所述；所述受体细胞是真核细胞；
优选地，所述真核细胞是人源细胞，更优选地，所述人源细胞是人源上皮细胞，又更优选地，所述人源上皮细胞是人肾上皮细胞，再更优选地，所述人肾上皮细胞是293T。
4.一种蛋白质，其特征在于，所述蛋白质为重组人Flag-MuSK-ECD蛋白，所述重组人Flag-MuSK-ECD蛋白的序列如SEQ ID NO.2所示；
优选地，所述重组人Flag-MuSK-ECD蛋白的蛋白纯度为80-90％以上，浓度0.4-0.5ug/uL以上。
5.一种重组蛋白的用途，其特征在于，所述重组蛋白如权利要求4所述；所述重组蛋白的用途是作为检测抗原用于检测MuSK抗体或辅助分组诊断重症肌无力，或者用于制备检测MuSK抗体或辅助分组诊断重症肌无力的组合物、产品组合、试剂、试剂盒、体系或系统；
优选地，所述重组人Flag-MuSK-ECD蛋白的序列如SEQ ID NO.2所示；
优选地，所述检测是酶标抗体法检测；更优选地，所述酶标抗体法检测是间接法。
6.一种蛋白质的制备方法，其特征在于，所述蛋白质如权利要求4所述；所述蛋白质的制备方法包括产物表达、产物纯化步骤，所述产物表达步骤包括使用如权利要求3所述的转化体或表达系统获得含有重组人Flag-MuSK-ECD蛋白的培养上清液，所述产物纯化步骤包括使用Flag磁珠进行纯化；
优选地，所述产物纯化步骤包括以下步骤：
a.将所述含有重组人MuSK-ECD-Flag蛋白的培养上清液与Flag磁珠接触，优选地，所述Flag磁珠包括抗Flag标签单克隆抗体，所述抗Flag标签单克隆抗体为M1，用量为每1mL含有重组人MuSK-ECD-Flag蛋白的培养上清液加入10-20uLFlag磁珠，Flag磁珠浓度为1ug/uL；
b.通过洗涤将非特异性结合的蛋白质去除，留下特异性结合的重组人Flag-MuSK-ECD蛋白；优选地，所述洗涤所用的洗涤缓冲液是1％(v/v)Tween20in PBS，用量为200uL/孔；
c.洗脱获得重组人Flag-MuSK-ECD蛋白；优选地，所述洗脱采用3*Flag多肽竞争性抑制洗脱，用量为200ug/200uL。
7.一种组合物、产品组合、试剂、试剂盒、体系或系统，其特征在于，所述组合物、产品组合、试剂、试剂盒、体系或系统包括检测抗原，所述检测抗原是如权利要求4所述的蛋白质，或者是按照权利要求6所述蛋白质的制备方法制备的蛋白质。
8.根据权利要求7所述的组合物、产品组合、试剂、试剂盒、体系或系统，其特征在于，所述组合物、产品组合、试剂、试剂盒、体系或系统还包括：二抗、显色底物。
9.根据权利要求8所述的组合物、产品组合、试剂、试剂盒、体系或系统，其特征在于，所述组合物、产品组合、试剂、试剂盒、体系或系统还包括：阳性标准品对照血清、对照蛋白；阳性标准品对照血清为已确诊为MuSKMG患者的血清样本，对照蛋白为空载体转染细胞后上清flag磁珠纯化的蛋白。
10.根据权利要求9所述的组合物、产品组合、试剂、试剂盒、体系或系统，其特征在于，所述组合物、产品组合、试剂、试剂盒、体系或系统还包括：包被缓冲液、封闭缓冲液、清洗缓冲液、终止剂；所述显色底物是显色底物缓冲液稀释的显色底物。
11.根据权利要求8-10任一项所述的组合物、产品组合、试剂、试剂盒、体系或系统，其特征在于，所述二抗是碱性磷酸酶标记山羊抗人IgG(H+L)二抗；所述显色底物是对硝基苯磷酸盐。
12.一种组合物、产品组合、试剂、试剂盒、体系或系统的用途，所述组合物、产品组合、试剂、试剂盒、体系或系统如权利要求7-11任一项所述，所述组合物、产品组合、试剂、试剂盒、体系或系统的用途是用于检测MuSK抗体或辅助分组诊断重症肌无力，或者用于制备检测MuSK抗体或辅助分组诊断重症肌无力的组合物、产品组合、试剂、试剂盒、体系或系统；
优选地，所述检测是酶标抗体法检测；更优选地，所述酶标抗体法检测是间接法。
13.一种非疾病诊断目的的检测MuSK抗体或辅助分组诊断重症肌无力的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将待测血清或血浆样本与权利要求9-11任一项所述的组合物、产品组合、试剂、试剂盒、体系或系统中的重组人Flag-MuSK-ECD蛋白、二抗、显色底物接触；
将待测血清或血浆样本与与权利要求9-11任一项所述的组合物、产品组合、试剂、试剂盒、体系或系统中的对照蛋白、二抗、显色底物接触；
将阳性标准品对照血清与权利要求9-11任一项所述的组合物、产品组合、试剂、试剂盒、体系或系统中的重组人Flag-MuSK-ECD蛋白、二抗、显色底物接触；
将阳性标准品对照血清与与权利要求9-11任一项所述的组合物、产品组合、试剂、试剂盒、体系或系统中的对照蛋白、二抗、显色底物接触；
阳性标准品对照血清为已确诊为MuSKMG患者的血清样本，对照蛋白为空载体转染细胞后上清flag磁珠纯化的蛋白；
设置空白对照；
测量OD值；
计算结果及判定；
优选先将检测OD值进行如下转换：(Flag-MuSK-ECD蛋白OD值-空白对照OD值)/(对照蛋白OD值-空白对照OD值)，获得校准表达量值，以阳性标准品对照血清校准表达量标定为1，计算出待测血清抗体相对表达量值，并与从健康人检测数据当中划定的界值比较，得出是否是抗体检测阳性结果。
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