CN119255818A - 多表位构建体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及疫苗接种治疗领域。更具体地说，本发明涉及一种多表位构建体，该构建体包含编码源自冠状病毒的肽或其功能变体及其片段的核酸序列。本发明还涉及组合、多肽或药物组合物用于治疗或预防受试者中的冠状病毒；特别是SARS‑CoV‑2病毒。

Description

多表位构建体

【发明领域】

本发明涉及疫苗接种治疗领域。更具体地说，本发明涉及一种多表位构建体，该构建体包含编码源自冠状病毒的肽或其功能变体及其片段的核酸序列。本发明还涉及组合、多肽或药物组合物用于治疗或预防受试者中的冠状病毒；特别是SARS-CoV-2病毒。

【发明背景】

COVID-19大流行的出现对全球人类构成威胁，因为感染具有高度传染性并导致严重疾病和死亡。到目前为止，全球健康负担和经济仍然非常严重。目前，COVD-19疫苗主要分为三种类型(mRNA疫苗、病毒载体疫苗和蛋白质亚单位疫苗)，其中mRNA和载体疫苗已成功用于全球疫苗接种策略。mRNA疫苗(Moderna；WO2021154763A1和Pfizer-BioNTech；WO2021188969A2)使用来自SARS-CoV-2的遗传信息，SARS-CoV-2是一种导致COVID-19的病毒，并指示我们的细胞如何制造病毒独有的无害蛋白质。在病毒载体疫苗(Johnson、AstraZeneca、Sputnik V、Convidecia)中，来自SARS-CoV-2的遗传信息被放置在不同病毒的改良版本中。蛋白质亚单位疫苗(Novavax)包括SARS-CoV-2的无害片段(蛋白质)，而不是整个病毒。

mRNA疫苗代表了传统疫苗方法的有前途的替代方案，因为它们易于设计、快速开发能力、低成本制造的潜力、安全给药、细胞和体液免疫的诱导以及缺乏与基因组DNA的相互作用。mRNA疫苗的最新改进可增加蛋白质翻译、调节先天性和适应性免疫原性并改善递送。虽然一些信使RNA疫苗(例如Pfizer-BioNTech COVID-19疫苗)的缺点是在分配前需要超低温储存，但其他mRNA疫苗没有这样的要求。

SARS-CoV-2是β冠状病毒属的成员，可引起肺炎。SARS-CoV-2是一种具有单链RNA的包膜病毒，属于冠状病毒科家族，可引起哺乳动物、鸟和人的感染。对SARS-CoV-2的全基因组进行了测序(Wu et al.，2020)，大约为29.9kb。基因组的可用性为开发针对这种毁灭性疾病的疫苗提供了机会。对于COVID-19疫苗，迄今为止所有批准的mRNA疫苗都使用基于刺突蛋白的方法(Moderna；WO2021154763A1和Pfizer-BioNTech；WO2021188969A2)。基于刺突蛋白的疫苗可诱导抗体，阻断SARS-CoV-2与宿主细胞受体的结合，从而中和病毒感染，从而产生有效的保护性免疫。SARS-CoV-2刺突蛋白的一个令人担忧的特征是它在病毒进化过程中如何随时间变化。与许多病毒一样，SARS-CoV-2的病毒基因组可以发生突变，并且在SARS-CoV-2大流行期间已经描述了许多此类新变体。这些突变可以改变刺突蛋白的生化特性，从而逃脱或逃避随着病毒进化针对先前变体产生的中和抗体的中和能力。因此，这为寻找改进的疫苗设计提供了机会，以避免或减少此类新的“变体担忧”(VOC)的影响。

因此，本发明的目的是设计一种基于多表位的疫苗，其包含基于结构和非结构蛋白的T细胞表位而不是源自冠状病毒的刺突蛋白，以提供对多种冠状病毒变体甚至病毒株的广泛保护和持久免疫力(泛冠状病毒疫苗)。任选地，这种多表位疫苗可以与一种或多种编码全长刺突变体的构建体结合使用，提供类似于上述已建立的COVID-19疫苗的中和抗体反应。

【发明内容】

在第一个方面，本发明涉及一种多表位构建体，该多表位构建体包含至少五个编码来源于冠状病毒的肽或其功能变体和/或其片段的核酸序列，其中所述其肽、其变体和/或其片段包含与选自SEQ ID NO：1～47的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

在本发明的以下实施方案中，核酸序列通过密码子优化进行优化。

在具体实施方案中，本发明提供了如本文定义的多表位构建体，其还包含编码冠状病毒糖蛋白或其功能变体及其片段的一个或多个核酸序列，其中所述冠状病毒糖蛋白特别是SARS-CoV-2刺突糖蛋白。

在具体实施方案中，本发明提供了一种组合，该组合包括所述多表位构建体和包含一个或多个编码冠状病毒糖蛋白或其功能变体及其片段的核酸序列的构建体，其中所述冠状病毒糖蛋白特别是SARS-CoV-2刺突糖蛋白。

在进一步的实施方案中，本发明提供所述多表位构建体或所述组合，其中编码的肽或其功能变体和/或其片段与从列表中选择的至少一种特异性分子接头分离，所述分子接头包括：柔性接头、刚性接头、和/或可切割接头。

在进一步的方面，本发明提供了本发明的多表位构建体，其中，所述构建体包含至少五个核酸序列，这些序列与SEQ ID NO：48～94中规定的序列具有至少95％的序列同一性；特别是RNA分子。

在进一步的方面，本发明提供了如本文定义的多表位构建体，其中，所述至少5个核酸序列选自以下列表中的任一项：

a.SEQ ID NO：55、89、57、53、49、92、70、71、48、74、79、77、87、65、59、88、72、60、81；

b.SEQ ID NO：55、65、59、76、83、60、94、71、49、74、79、87、88、89、48、58、68、92、51、52、57、85、81、53、67、72、70；

c.SEQ ID NO：55、65、59、76、83、60、94、71、49、74、79、87、88；

d.SEQ ID NO：89、48、58、68、92、51、52、57、85、81、53、67、72、70；

e.SEQ ID NO：60、63、54、49、84、89、71、57、65、91、48、56、66、80、79、67、78、75、59、82；

f.SEQ ID NO：91、71、78、66、86、63、60、80、90、75、73、54、67、61、89、48、65、79、62、57、50、93、84、49、59、64、69、82、56；

g.SEQ ID NO：91、71、78、66、86、63、60、80、90、75、73、54、67、61。

在另一个方面，本发明提供了一种由所述多表位构建体编码的多肽。

在具体实施方案中，本发明提供了一种药物组合物，该组合物包括所述多表位构建体、所述组合、或所述多肽，以及至少一种药学上可接受的试剂。

在另一个实施方案中，本发明提供了所述多表位构建体、所述组合、所述多肽或所述药物组合物；其在脂质体或纳米颗粒中配制，例如脂质纳米颗粒或聚合物纳米颗粒；特别是脂质纳米颗粒。

在进一步的方面，本发明提供了所述多表位构建体、所述组合、所述多肽或所述药物组合物，用于人药或兽药。

在另外实施方案中，本发明提供了所述多表位构建体、所述组合、所述多肽或所述药物组合物，用于疫苗接种，特别是肌肉疫苗接种。

在具体实施方案中，本发明提供了所述多表位构建体、所述组合、所述多肽或所述药物组合物，用于诱导针对受试者中冠状病毒的免疫反应；特别是SARS-CoV-2病毒。

在又一个具体实施方案中，本发明提供了所述多表位构建体、所述组合、所述多肽或所述药物组合物，用于治疗或预防受试者中的冠状病毒；特别是SARS-CoV-2病毒。

在进一步的方面，本发明涉及诱导针对冠状病毒的免疫反应的方法，其包括：将治疗有效量的所述的多表位构建体、所述的组合、所述的多肽或所述的药物组合物施用给受试者。

【附图简述】

现在具体参考这些附图，强调通过实施例所显示的细节和仅用于本发明的不同实施方案的说明性讨论。它们的提出是为了提供被认为是对发明的原理和概念方面的最有用和最容易的描述。在这方面，没有尝试更详细地展示发明的结构细节，只要能对本发明基本理解即可。附图的描述使本领域技术人员清楚地知道了发明的几种形式如何在实践中体现。

图1：小鼠中编码SARS-CoV-2表位的mRNA构建体的免疫原性。雌性BALB/c小鼠(6～8周龄)肌肉注射(第0天和第21天)mRNA疫苗组合物，剂量为5μg。作为阴性对照，一组小鼠接种缓冲液(TBS)。在接种mRNA-LNP疫苗初施-追施后，使用编码源自SARS-CoV-2非～结构蛋白保守区域的交界表位的mRNA进行疫苗接种，诱导了强烈的表位特异性CD8 T细胞反应。

图2：在初施(21天)和追施(35天)时小鼠肌肉内接种剂量范围量的LNP配制的mRNA疫苗后，抗原(SARS-CoV-2刺突δ)特异性血清免疫球蛋白(IgG1和IgG2a)效价。指示的剂量(0.2至10μg)对应于在每次注射事件中递送给单只小鼠的刺突-δmRNA的量，并且是mRNA总量的一半，因为这是包含相同量的构建体2.3mRNA的组合。从相对较高的IgG效价中可以看到疫苗的明显效果，从d21到d35有非常明显的增强效果，并且mRNA超过1mg有平台效应。包含的空LNP组在配方中不含任何mRNA，并且是根据其他组的计算制备的，以便在较高剂量时包含相同量的脂质。

图3：用对应于疫苗接种抗原(SARS-CoV-2刺突，δ)的肽库再刺激后的CD8+多功能T细胞反应。在第35天(终末)从同一组(用由等量的刺突δmRNA和构建体2.3组成的不同剂量的LNP配制的针对SARS-CoV-2的mRNA疫苗接种2次的动物)收集脾细胞，并用扫描整个刺突蛋白的肽混合物再刺激并通过流式细胞术分析。我们看到再刺激后表达IFNg(和CD107a)的CD8+T细胞有明显的剂量范围反应。

图4：SARS-CoV-2构建体2.1_DCL的串联序列(SEQ ID NO：95)。

图5：SARS-CoV-2构建体2.2_DCL的串联序列(SEQ ID NO：96)。

图6：SARS-CoV-2构建体2.2.2_DCL的串联序列(SEQ ID NO：98)。

图7：SARS-CoV-2构建体2.3_DCL的串联序列(SEQ ID NO：99)。

图8：SARS-CoV-2构建体2.4_DCL的串联序列(SEQ ID NO：100)。

图9：SARS-CoV-2构建体2.4.1_DCL的串联序列(SEQ ID NO：101)。

图10：SARS-CoV-2构建体2.4.2_DCL的串联序列(SEQ ID NO：102)。

图11：SARS-CoV-2构建体2.5_DCL的串联序列(SEQ ID NO：103)。

【发明详述】

现在将进一步描述本发明。在以下段落中，更详细地定义了本发明的不同方面。除非明确说明相反，否则如此定义的每个方面都可以与任何其他方面或方面相结合。特别是，任何标明为优选或有利的特征可以与标明为首选或有利的任何其他特征或特征相结合。

如说明书和所附权利要求书中使用的，单数形式“a”、“an”和“the”包括复数指称，除非上下文明确另有规定。例如，“a compound”是指一种化合物或多种化合物。

本文中使用的术语“comprising”、“comprises”和“comprised of”与“including”或“includes”、“containing”同义，并且是包含的或开放式的，并且不排除额外的、未引用的成员、元素或方法步骤。这些术语还包括“由...构成”和“基本上由...构成”。

本文中使用的术语“大约”或“大概”是指诸如参数、量、持续时间等可测量值时，意味着包括+/-10％或更小、优选+/-5％或更低、更优选+/-1％或更低、还更优选+/-0.1％或更小的变化，以及更优选+/-0.1％或更小的指定值，只要这种变化适合于在公开的发明中执行。需要理解的是，修饰语“大约”或“大概”所指的值本身也是具体且优选地公开的。

在寻找新的泛冠状病毒疫苗时，发明者研究了基于除冠状病毒衍生的刺突糖蛋白以外的其他蛋白质表达的核酸疫苗是否可用于诱导对多种冠状病毒株的广泛保护和持久免疫。通过使用生物信息学工具，发明者选择了一组保守的肽窗口，用于进一步的表位预测。发明者出乎意料地发现了一组保守的肽窗口，它们是潜在的抗原决定因素，可唤起特定T细胞的产生，从而在宿主中产生强烈的抗病毒免疫反应。结果，发明人设计了一种多表位构建体，该构建体包含编码来源于冠状病毒的至少5个肽窗口或其功能变体和其片段的核酸序列，用于治疗或预防受试者的冠状病毒感染；特别是SARS-CoV-2病毒。与多表位疫苗相关的主要优点是诱导针对不同病毒蛋白的广泛免疫反应，从而降低病毒进化过程中免疫逃逸的风险。

在第一个方面，本发明涉及多表位构建体，该多表位构建体包含衍生自冠状病毒的至少五个编码肽或其功能变体和/或其片段的核酸序列，其中，所述肽、其变体和/或其片段包含的氨基酸序列与包含SEQ ID NO：1～47的列表中选择的序列具有至少95％的序列同一性。

在本发明的上下文中，术语“构建体”是指人工设计的核酸片段，其可用于将遗传物质掺入目标组织或细胞中。如本文所用，多表位构建体作为目标转录物递送于宿主细胞细胞质中，其中表达产生位于膜内、分泌或位于细胞内的翻译蛋白。应该理解的是，翻译的蛋白质可以是来自冠状病毒的一种或多种免疫原。

在一些实施方案中，本发明中定义的构建体可以是多表位DNA构建体或多表位RNA构建体，特别是多表位信使RNA(mRNA)构建体。

在本发明的上下文中，术语“RNA”涉及包含核糖核苷酸残基且优选地完全或基本上由核糖核苷酸残基组成的分子。“核糖核苷酸”是指在β-D-核糖基的2'-位置具有羟基的核苷酸。具体而言，该术语是指单链RNA，但也可以指双链RNA、分离的RNA，例如部分纯化的RNA、基本上纯的RNA、合成的RNA、重组产生的RNA，以及修饰的RNA，这些RNA与天然存在的RNA不同，因为它增加了、缺失、取代和/或改变了一个或多个核苷酸。这种改变可以包括添加非核苷酸物质，例如添加到RNA的末端或内部，例如在RNA的一个或多个核苷酸处。RNA分子中的核苷酸也可以包含非标准核苷酸，例如非天然存在的核苷酸或化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。这些改变的RNA可以称为天然存在的RNA的类似物或类似物。

根据本发明，术语“RNA”包括并优选地涉及“mRNA”，其意思是“信使RNA”，并且涉及“转录本”，其可以使用DNA作为模板产生并编码肽或蛋白质。mRNA通常包括一个5'非翻译区(5'-UTR)、一个蛋白质或肽编码区和一个3'非翻译区(3'-UTR)。RNA还包括一个3'poly(A)尾部和/或5'帽类似物。mRNA在细胞和体外的半衰期有限。熟练的技术人员会明白，除非另有说明，否则即时申请中列出的核酸序列可以在代表性RNA序列中列举“U”，但如果序列代表DNA，则“U”将被“T”代替。因此，本文公开的并通过本文中特定的序列标识号标识的任意RNA序列也旨在公开其与RNA互补的相应DNA序列，其中，RNA序列的每个“U”被“T”取代。

为了清楚起见，mRNA分子包含任何编码RNA分子，这些编码RNA分子可以被真核宿主翻译成蛋白质。

在一些实施方案中，所述RNA可以是非复制RNA(NRM)，也称为非扩增RNA。非扩增mRNA只有一个开放的阅读框，编码目标抗原蛋白。细胞使用的mRNA总量等于疫苗递送的mRNA量，因此，剂量强度仅限于递送的RNA量。

在一些实施方案中，所述RNA可以是自扩增RNA(SAM)。SAM有两个开放的阅读框。第一个开放阅读框，与传统mRNA一样，编码目标抗原蛋白。第二个开放阅读框编码RNA依赖性RNA聚合酶(及其辅助蛋白)，它在细胞中自我复制mRNA构建体并产生多个自我拷贝。

在一些实施方案中，所述RNA可以是线性或环状RNA，优选是线性的，更优选是线性的非扩增RNA。

术语“修饰的mRNA分子”是指含有一种或多种修饰的核苷(称为“修饰的核酸”)的mRNA分子，这些分子具有有用的特性，例如缺乏对引入mRNA的细胞的先天免疫反应的基本诱导。这些修饰的核酸提高了蛋白质生产的效率、核酸的细胞内保留和接触细胞的活力，并且具有较低的免疫原性。

在一些实施方案中，核酸中修饰的核碱基(例如RNA核酸，例如mRNA核酸)包括1-甲基假尿嘧啶(m1Ψ)、1-乙基假尿嘧啶(e1Ψ)、5-甲氧基尿嘧啶(mo5U)、5-甲基胞苷(m5C)和/或假尿嘧啶(Ψ)。在一些实施方案中，核酸中修饰的核碱基(例如RNA核酸，例如mRNA核酸)包括5-甲氧基甲基尿苷、5-甲硫基尿苷、1-甲氧基甲基假尿苷、5-甲基胞苷和/或5-甲氧基胞苷。在一些实施方案中，多核糖核苷酸包括至少两个(例如，2、3、4或更多)上述任何修饰的核碱基的组合，包括但不限于化学修饰。

优选地，mRNA通过使用DNA模板的体外转录产生。在本发明的一个实施方案中，所述RNA是通过体外转录获得的。体外转录方法为技术人员所熟知，可能包括含有启动子的纯化线性DNA模板、三磷酸核糖核苷酸、包括二硫苏糖醇(DTT)和镁离子的缓冲系统、亚精胺和适当的RNA聚合酶，如T7 RNA聚合酶。转录反应中使用的确切条件取决于特定应用所需的RNA量。市面上有多种体外转录试剂盒。

在另一个实施方案中，本发明还提供一种多表位DNA构建体，该多表位DNA构建体包含来源于冠状病毒的至少五个编码肽或其功能变体及其片段的核酸序列，其中所述肽、其变体和/或其片段包含的氨基酸序列与从包含SEQ ID NO：1～47的列表中选择的序列具有至少95％的序列同一性；其中，所述RNA序列的每个U在相应的DNA序列中被T替换。

在本发明的上下文中，术语“DNA构建体”是指一种构建体，其工作方式是注射含有编码抗原的DNA序列的基因工程质粒，该质粒随后被宿主细胞吸收并被转录并翻译成编码的目标基因针对免疫反应所寻找的，因此，细胞直接产生抗原，从而引起保护性免疫反应。与传统方法相比，这种方法具有许多潜在优势，包括刺激B细胞和T细胞反应、提高疫苗稳定性、无任何传染性病原体以及相对容易进行大规模生产。

如本领域技术人员所公认的，DNA构建体的类型可以包括但不限于细菌质粒、噬菌体载体、人工染色体或F粘粒。

在本发明的上下文中，术语“表位”是指能够诱导免疫反应，特别是细胞或体液免疫反应的抗原决定簇(例如冠状病毒的多肽)。免疫反应应被理解为免疫系统产生细胞毒性和辅助性T细胞的能力，这些细胞识别受感染宿主细胞或抗原抗体呈递的抗原。表位是抗原上的一个小位点，与抗原结合蛋白的特异性抗原结合位点相互作用，例如分子细胞受体的可变区。表位可以定义为结构性或功能性。功能性表位通常是结构表位的一个子集，并且具有直接导致相互作用亲和力的残基。表位可以是线性的或构象的，即由非线性氨基酸组成。单个抗原可能具有多个表位。本文使用的术语“多表位”是指一系列可能重叠的肽，这些肽允许诱导广泛的免疫反应。这一系列肽可能含有T细胞和B细胞表位。

术语“表位”也指抗原上T和/或B细胞反应的位点。如本文所用，应理解术语“表位”或“抗原”包括免疫原性蛋白和免疫原性片段，除非另有说明。“病毒抗原”是指由病毒编码的抗原。它们包括但不限于冠状病毒的抗原，例如COVID-19。

本发明的多表位构建体包含编码冠状病毒抗原各个位点的核酸分子。在本发明的上下文中，术语“冠状病毒抗原”应理解为构成给定冠状病毒编码的基因产物一部分的氨基酸的排列。冠状病毒的基因组组织如下：5'-前导-UTR-ORF1a-ORF1b-刺突(S)基因-包膜(E)基因-膜(M)基因-核衣壳(N)基因-3-UTR-poly(A)尾部。ORF1a和ORF1b编码复制酶多聚蛋白，复制酶多聚蛋白本身裂解形成16个非结构蛋白(nsp1～nsp16)。ORF1a编码nsp1～nsp10，而ORF1b编码nsp11～nsp16。辅助基因分布在结构基因和辅助蛋白数量之间，它们的功能根据特定的冠状病毒而独特(例如，对于SARS-CoV-2病毒，存在以下辅助基因：ORF3a、ORF6、ORF7a、ORF7b、ORF8a、ORF9b和ORF10)。

在本发明的上下文中，多表位构建体可以包含至少两个编码冠状病毒肽或其功能变体以及其片段的核酸序列，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个。在具体实施方案中，所述多表位构建体包含至少两个编码冠状病毒肽或其片段的核酸序列。在一个优选实施方案中，所述多表位构建体包含至少五个编码冠状病毒肽或其片段的核酸序列。

在一个实施方案中，本公开的多表位构建体可以包括编码冠状病毒肽或其功能变体及其片段的核酸序列，这些序列选自：E基因、M基因、N基因、ORF3a、ORF6、ORF7a、ORF7b、ORF8a、ORF9b和ORF10、ORF1a和/或ORF1b病毒基因组窗口。

在特定实施方案中，ORF1a和ORF1b冠状病毒肽或其功能变体和其片段可以从以下列表中选择，其包括：NSP1、NSP2、NSP3、NSP4、NSP5、NSP6、NSP7、NSP8、NSP9、NSP10、NSP11、NSP12、NSP13、NSP14、NSP15、NSP16或其组合。

在进一步的实施方案中，本公开的多表位构建体可以包括编码冠状病毒肽或其功能变体以及其片段的核酸序列可以从以下列表中选择，其包括：E、M、N、NSP1、NSP3、NSP4、NSP5、NSP6、NSP8、NSP9、NSP12、NSP13、NSP14、NSP15、NSP16、ORF6或其组合。

在一个实施方案中，用于冠状病毒抗原的氨基酸序列的序列号，以及编码它们的核酸序列的序列号分别列在表1和表2中。

应该理解的是，本文中描述的氨基酸序列不是限制性的，并且可以包含序列变异(即与所描述的序列具有百分比序列同一性)。

在确定两个氨基酸序列之间的序列同一性程度时，技术人员可以考虑所谓的“保守的”氨基酸取代，这通常可以描述为氨基酸取代，其中氨基酸残基被具有相似化学结构的另一个氨基酸残基取代，并且对功能影响很小或基本上没有影响，多肽的活性或其他生物学特性。这种保守的取代优选是以下组(a)～(e)中的一个氨基酸被同一组内的另一个氨基酸残基取代的取代：(a)小的脂肪族、非极性或微极性残基：Ala、Ser、Thr、Pro和Gly；(b)极性、带负电荷的残基及其(不带电荷的)酰胺：Asp、Asn、Glu和Gln；(c)极性、带正电荷的残基：His、Arg和Lys；(d)大的脂肪族非极性残基：Met、Leu、Ile、Val和Cys；(e)芳香族残基：Phe、Tyr和Trp。特别优选的保守取代如下：Ala转换为Gly或Ser；Arg转换为Lys；Asn转换为Gln或His；Asp转换为Glu；Cys转换为Ser；Gln转换为Asn；Glu转换为Asp；Gly转换为Ala或Pro；His转换为Asn或Gln；Ile转换为Leu或Val；Leu转换为Ile或Val；Lys转换为Arg、Gln或Glu；Met转换为Leu、Tyr或Ile；Phe转换为Met、Leu或Tyr；Ser转换为Thr；Thr转换为Ser；Trp转换为Tyr；Tyr转换为Trp；和/或Phe转换为Val、Ile或Leu。因此，在一个实施方案中，具有本文前面给出的给定百分比序列同一性的序列是与参考序列相比具有一个、两个、三个或更多保守氨基酸取代的序列。

另一方面，由本公开的核酸编码的变体抗原/多肽可能包含氨基酸变化，这些变化赋予许多理想性质中的任何一个，例如，增强它们的免疫原性，增强它们的表达，和/或改善它们在受试者中的稳定性或PK/PD特性。可以使用常规诱变技术制备变体抗原/多肽，并酌情进行分析以确定它们是否具有所需的特性。

正如本领域技术人员所认识到的那样，蛋白质片段、功能性蛋白质结构域和同源蛋白也被认为在感兴趣的冠状病毒抗原范围内。例如，本文提供参考蛋白的任何蛋白质片段(指多肽序列至少比参考抗原序列短一个氨基酸残基，但在其他方面相同)，前提是该片段具有免疫原性并赋予对冠状病毒的保护性免疫反应。除了与参考蛋白相同但被截短的变体之外，在一些实施方案中，抗原还包括2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多的突变，如本文提供或引用的任意序列所示。抗原/抗原多肽的长度范围从大约4、6或8个氨基酸到全长蛋白质。

因此，在特定实施方案中，本文中描述的氨基酸序列与表1中列举的序列至少有和/或约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。

在一个实施方案中，本发明涉及多表位构建体，该多表位构建体包含至少两个，例如至少五个衍生自冠状病毒的编码肽或其功能变体以及其片段的核酸序列，其中，所述肽、其变体和/或其片段包含选自包含SEQ ID NO：1～47的列表中的氨基酸序列，或与其具有至少90％的序列同一性，例如至少95％的序列同一性。

在具体实施方案中，本发明涉及多表位构建体，该多表位构建体包含至少两个，例如至少五个衍生自冠状病毒的编码肽或其功能变体以及其片段的核酸序列，其中，所述肽、其变体和/或其片段包含选自包含SEQ ID NO：1、2、6、8、10、12、13、18、23～25、27、30、32、34、40～42、45的列表中的氨基酸序列，或与其具有至少90％的序列同一性，例如至少95％的序列同一性。

在进一步的实施方案中，本发明涉及多表位构建体，该多表位构建体包含至少两个，例如至少五个衍生自冠状病毒的编码肽或其功能变体以及其片段的核酸序列，其中，所述肽、其变体和/或其片段包含选自包含SEQ ID NO：1、2、4、5、6、8、10～13、18、20、21、23～25、27、29、32、34、36、38、40～42、45、47的列表中的氨基酸序列，或与其具有至少90％的序列同一性，例如至少95％的序列同一性。

在另一个实施方案中，本发明涉及多表位构建体，该多表位构建体包含至少两个，例如至少五个衍生自冠状病毒的编码肽或其功能变体以及其片段的核酸序列，其中，所述肽、其变体和/或其片段包含选自包含SEQ ID NO：1、2、7、9、10、12、13、16、18～20、24、28、31～33、35、37、42、44的列表中的氨基酸序列，或与其具有至少90％的序列同一性，例如至少95％的序列同一性。

在具体实施方案中，本发明涉及多表位构建体，该多表位构建体包含至少两个，例如至少五个衍生自冠状病毒的编码肽或其功能变体以及其片段的核酸序列，其中，所述肽、其变体和/或其片段包含选自包含SEQ ID NO：1、2、3、7、9、10、12～20、22、24、26、28、31～33、35、37、39、42～44、46的列表中的氨基酸序列，或与其具有至少90％的序列同一性，例如至少95％的序列同一性。

在具体实施方案中，本发明涉及多表位构建体，该多表位构建体包含至少两个，例如至少五个衍生自冠状病毒的编码肽或其功能变体以及其片段的核酸序列，其中，所述肽、其变体和/或其片段包含选自包含SEQ ID NO：1、2、10、12、13、18、20、24、32、42的列表中的氨基酸序列，或与其具有至少90％的序列同一性，例如至少95％的序列同一性。

在表3中，列出了具有编码冠状病毒抗原的氨基酸序列的相应核酸序列(SEQ IDNO：95～103)的多表位构建体的例子。

在具体实施方案中，本发明涉及根据SEQ ID NO：95(构建体2.1)的多表位构建体，该构建体包含SEQ ID NO：55、89、57、53、49、92、70、71、48、74、79、77、87、65、59、88、72、60、81或与其具有至少90％例如至少95％序列同一性的核酸序列。

在具体实施方案中，本发明涉及根据SEQ ID NO：96(构建体2)的多表位构建体，该构建体包含SEQ ID NO：55、65、59、76、83、60、94、71、49、74、79、87、88、89、48、58、68、92、51、52、57、85、81、53、67、72、70或与其具有至少90％例如至少95％序列同一性的核酸序列。

在具体实施方案中，本发明涉及根据SEQ ID NO：97(构建体2.2.1)的多表位构建体，该构建体包含SEQ ID NO：55、65、59、76、83、60、94、71、49、74、79、87、88或与其具有至少90％例如至少95％序列同一性的核酸序列。

在具体实施方案中，本发明涉及根据SEQ ID NO：98(构建体2.2.2)的多表位构建体，该构建体包含SEQ ID NO：89、48、58、68、92、51、52、57、85、81、53、67、72、70或与其具有至少90％例如至少95％序列同一性的核酸序列。

在具体实施方案中，本发明涉及根据SEQ ID NO：99(构建体2.3)组成的多表位构建体，该构建体包含SEQ ID NO：60、63、54、49、84、89、71、57、65、91、48、56、66、80、79、67、78、75、59、82或与其具有至少90％例如至少95％序列同一性的核酸序列。

在具体实施方案中，本发明涉及根据SEQ ID NO：100(构建体2.4)组成的多表位构建体，该构建体包含SEQ ID NO：91、71、78、66、86、63、60、90、90、75、73、54、67、61、89、48、65、79、62、57、50、93、84、49、59、64、69、82、56或与其具有至少90％例如至少95％序列同一性的核酸序列。

在具体实施方案中，本发明涉及根据SEQ ID NO：101(构建体2.4.1)的多表位构建体，该构建体包含SEQ ID NO：91、71、78、66、86、63、60、80、90、75、73、54、67、61或与其具有至少90％例如至少95％序列同一性的核酸序列。

在具体实施方案中，本发明涉及根据SEQ ID NO：102(构建体2.4.2)的多表位构建体，该构建体包含SEQ ID NO：89、48、65、79、62、57、50、93、84、49、59、64、69、82、56或与其具有至少90％例如至少95％序列同一性的核酸序列。

在具体实施方案中，本发明涉及根据SEQ ID NO：103(构建体2.5)的多表位构建体，该构建体包含SEQ ID NO：89、59、60、49、65、79、71、67、57、48或与其具有至少90％例如至少95％序列同一性的核酸序列。

在表4中，列出了具有密码子优化的RNA序列(三个版本)的多表位构建体的例子。因此，很明显，本发明还涉及根据SEQ ID NO：104～130的多表位构建体，或与其具有至少90％例如至少95％的序列同一性。

为了清楚起见，多表位构建体可以指一个核酸(例如mRNA)分子，该分子包含至少5个编码冠状病毒表位的核酸序列，或者它可以指两个或多个核酸(例如mRNA)分子，其中每个mRNA分子包含一组特定的编码冠状病毒表位的至少5个选定的核酸序列。换句话说，长的构建体(例如＞11Kb)并不总是很好地表达，因此可能更优选在两个或多个单独的核酸(例如mRNA)构建体上编码表位(另见示例)。

在本发明的上下文中，术语“冠状病毒”包括所有人冠状病毒(hCoV)，例如但不限于HCoV-OC43、HCoV-HKU1、HCoV-229E、HCoV-NL63、SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV。应该理解，由多表位构建体编码的肽或其片段至少在包括SARS-CoV-2在内的Sarbeco病毒中很常见，因此，诱导针对所有这些类型的冠状病毒的免疫反应。如本文所述，多表位构建体也可用于泛冠状病毒疫苗的背景下。

在具体实施方案中，本发明提供了一种组合，该组合包括所述多表位构建体和包含编码冠状病毒糖蛋白或其功能变体以及其片段的一个或多个核酸序列的构建体，特别是SARS-CoV-2刺突糖蛋白。

可选地，本发明还提供一种构建体，其中编码冠状病毒糖蛋白的序列与编码衍生自冠状病毒的其肽或其功能变体以及其片段的序列(包含选自包含SEQ ID NO：1～47的列表或与其具有至少90％例如至少95％序列同一性的氨基酸序列)相结合。

在本发明的上下文中，术语“组合”是指至少两个单独的多表位构建体，其中一种类型的构建体表达如表1所定义的肽或其片段，以及至少一种表达附加蛋白质和/或佐剂的其他类型的多表位构建体。应该理解的是，该组合可能包括多种不同的多表位设计。

附加蛋白的例子可以是免疫刺激蛋白、共刺激分子、细胞因子、趋化因子和/或先天途径触发分子。佐剂可用于保护疫苗不被降解或增强或延长疫苗免疫原性。

在具体实施方案中，所述组合是指至少两个独立的构建体，其中一种类型的构建体是表达如表1中定义的肽或其片段的多表位构建体，以及至少一种表达冠状刺突糖蛋白的其它构建体。

在本发明的上下文中，术语“刺突糖蛋白(S)”是指一种专门的病毒蛋白三聚体，其作用是作为与宿主细胞受体结合和病毒进入的主要介质。在一个实施方案中，该组合包括编码冠状病毒糖蛋白或其功能变体及其片段的核酸序列，这些序列选自HCoV-OC43、HCoV-HKU1、HCoV-229E、HCoV-NL63、MERS-CoV、SARS-CoV-2、SARS-CoV或其组合，特别是SARS-CoV-2。应该理解的是，冠状病毒家族中的S蛋白具有氨基酸序列相似性。例如，SARS-CoV和SARS-CoV2的S蛋白在氨基酸序列中具有大约76％的同一性。因此，本文描述的组合可以包含的构建体包含至少一个编码冠状病毒糖蛋白(例如全长-S)或其功能变体或至少其片段的核酸分子，该构建体涵盖所有类型的冠状病毒，或至少一种类型的冠状病毒。

在一些实施方案中，编码冠状病毒糖蛋白的构建体包含编码冠状病毒抗原变体的核酸序列。抗原变体或其他多肽变体是指在氨基酸序列上与野生型、天然或参考序列不同的分子。与天然或参考序列相比，抗原/多肽变体可能在氨基酸序列中的某些位置具有替换、缺失和/或插入。通常，变体与野生型、天然或参考序列具有至少50％的同一性。在一些实施方案中，变体与野生型、天然序列或参考序列共享至少80％或至少90％的同一性。

在表5中，列出了编码SARS-CoV-2刺突糖蛋白的构建体(SEQ ID NO：131～134)的密码子优化的RNA序列的例子。

在另一个具体实施方案中，该组合包括本发明的多表位构建体，其与包含编码SARS-CoV-2刺突糖蛋白的一个或多个核酸序列的构建体组合，所述刺突糖蛋白包含如SEQID NO：131～134中规定的氨基酸序列或与其具有至少90％的序列同一性，例如至少95％的序列同一性。

在另一个具体实施方案中，该组合是指至少两个独立的构建体，其中一种类型是表达表1中定义的肽或其片段的多表位构建体，以及至少一种表达至少2种免疫刺激蛋白的其他构建体，该免疫刺激蛋白选自包含CD40L、CD70和caTLR4的组。在一个优选实施方案中，至少一个其它多表位构建体包含编码CD40L和CD70(即“DiMix”)的核酸分子。在更优选的实施方案中，至少一个其它构建体可以另外包含编码caTLR4的核酸分子，从而产生所谓的“TriMix”。

在整个发明中，术语“TriMix”代表编码CD40L、CD70和caTRLA4免疫刺激蛋白的mRNA分子的混合物。

在进一步优选的实施方案中，使用冠状病毒糖蛋白和TriMix的特异性组合来提高如表1中所定义的编码冠状病毒表位的构建体的免疫刺激作用。

在具体实施方案中，本发明的组合包括至少两个独立的构建体，其中一种类型是表达如表1中定义的肽或其片段的多表位构建体，以及至少一种表达多个预定义附加蛋白的其他构建体，特别是冠状病毒糖蛋白或免疫刺激蛋白，例如TriMix。

在具体实施方案中，本发明还可以提供表达如表1中定义的肽或其片段的构建体，并表达一种或多种预定义的附加蛋白，特别是冠状病毒糖蛋白或免疫刺激蛋白，例如TriMix。

在本发明的上下文中，应该理解额外的蛋白质和/或佐剂可以由相同的附加构建体编码；或由多个单独的结构编码。

在进一步的实施方案中，本发明提供了所述多表位构建体或所述组合，其中，编码的肽与从列表中选择的至少一种特定分子接头进行分离，该接头包括：柔性接头、刚性接头和/或可切割接头。

在另一个方面，本发明提供了一种由所述多表位构建体编码的多肽。

在一些实施方案中，多表位构建体编码不止一种称为融合蛋白的多肽。在一些实施方案中，该构建体还编码位于融合蛋白的至少一个或每个结构域之间的接头。接头在将表位剪接在一起并产生扩展构象(灵活性)、蛋白质折叠和功能结构域分离方面起着至关重要的作用，因此，使蛋白质结构更加稳定。柔性和刚性接头共价将功能域连接在一起，在整个体内过程中作为一个分子发挥作用，因此不会被切割。在一些实施方案中，柔性接头选自包含Gly、Ser、Thr、Lys、Glu、Thr、Ala或其组合的组。具体地，一个例子可以是Gly和Ser残基(GS_n接头)的片段，其中n表示该GS接头的长度。最广泛使用的柔性接头的一个例子具有(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n、GGS、GGSG、G序列。其他例子可以是包含其他氨基酸的GS接头，以提高溶解度和柔韧性。其他几种类型的柔性接头包括KESGSVSSEQ LAQFRSLD(SEQ ID NO：135)和EGKSSGSGSE SKST(SEQ ID NO：136)。在一些实施方案中，刚性接头可以是例如具有(EAAAK)n序列的α螺旋形成接头，这经常应用于许多重组融合蛋白的构建。另一种类型的刚性接头具有富含Pro的序列(XP)_n，其中X表示任何氨基酸，优选为Ala、Lys或Glu。刚性接头的一个例子可以是Glu和Pro残基的片段“(GP_n”接头)，其中n表示该GP接头的长度，特别是GPG、GPPPG、GPGPG、GP8G或PAPAP、PA。

另一方面，接头可以是体内可切割接头，以在体内释放游离的功能域。这种类型的接头可以减少空间位阻，提高生物活性，或在接头切割后实现重组融合蛋白各个结构域的独立作用/代谢。为清楚起见，本领域已知的可切割接头可用于与本公开内容连接。此类接头的示例包括：F2A接头、T2A接头、P2A接头、E2A接头及其组合(例如，参见WO2017/127750)。熟练的技术人员会意识到其他领域认可的接头可能适合用于本公开的构建体(例如，由本公开的核酸编码)。熟练的技术人员同样会欣赏到其他多顺反子构建体(在同一分子中分别编码多个抗原/多肽的mRNA)可能适合按照本文的规定使用。

在一些实施方案中，接头可以从包含GGGGS、GGS、GGGS、GGSG、G、GS、锚蛋白重复、EAAAK、GPG、GPPPG、GPGPG、GP8G、GTP、PAPAP、KK、AP、F2A、E2A、P2A、T2A、AAY和/或AYY的组中选择。在一些实施方案中，融合蛋白包含三个结构域，中间有接头，其结构为：结构域-接头-结构域-接头-结构域。

在进一步的实施方案中，编码来自冠状病毒的肽的核酸序列是单个核酸分子的一部分。这种单个核酸分子优选能够独立表达多种蛋白质。在一个优选的实施方案中，编码来自冠状病毒的肽的核酸序列通过内部核糖体进入位点(IRES)在单个核酸分子中连接，从而能够将两个或多个核酸序列中的每一个分别翻译成氨基酸序列。或者，在不同冠状病毒抗原的编码序列之间掺入自切割的2a肽编码序列。这样，两个或多个因子可以由一个核酸分子编码。

因此，本发明进一步提供了一种多表位构建体，该构建体包含编码来自冠状病毒的两个或多个肽的核酸序列，其中两个或多个冠状病毒衍生的肽或者通过在两个或多个编码序列之间使用IRES从单个核酸分子中单独翻译。或者，本发明提供了一种mRNA分子，该分子编码由自切割的2a肽编码序列分隔的两个或多个冠状病毒衍生肽，能够在翻译后切割两个蛋白质序列。

在本发明的以下实施方案中，核酸序列通过密码子优化进行优化。

密码子优化方法是本领域已知的。例如，本文提供的任意一个或多个序列的ORF可以进行密码子优化。密码子优化，在一些实施方案中，可用于匹配目标生物体和宿主生物体中的密码子频率，以增加GC含量，以增加mRNA的稳定性或减少二级结构；尽量减少可能损害转录或翻译的串联重复密码子或碱基运行；定制转录和翻译对照区域；插入或去除蛋白质运输序列；添加、删除或随机排列蛋白质结构域；插入或删除限制性位点；修饰核糖体结合位点和mRNA降解位点；调整翻译速率，使蛋白质的各个结构域正确折叠；或减少或消除多核苷酸中的问题二级结构。密码子优化工具、算法和服务是本领域已知的。使用不同的程序或方法生成的密码子优化的mRNA序列可能会有很大差异，因为不同的密码子优化策略在如何量化密码子使用和实施密码子变化方面有所不同。因此，通过不同的密码子分配编码相同多肽的mRNA可能显示蛋白质表达量的变化。在本发明的上下文中，未优化的RNA序列和优化的RNA序列之间可能存在可接受的RNA序列变化。在一些实施方案中，使用优化算法对开放阅读框(ORF)序列进行优化。

在一些实施方案中，密码子优化序列与天然存在或野生型序列ORF(例如，编码冠状病毒抗原的天然或野生型mRNA序列)具有小于约99％、小于约95％、小于约90％、小于约85％、小于约80％、小于约75％、小于约70％、小于约65％的序列同一性。在一些实施方案中，密码子优化的序列与天然存在的或野生型的序列(例如，编码冠状病毒抗原的天然存在的或野生型mRNA序列)共享65％至85％(例如，约67％至约85％之间或约67％至约80％之间的)序列同一性。在一些实施方案中，密码子优化的序列与天然存在的或野生型的序列(例如，编码冠状病毒抗原的天然存在或野生型mRNA序列)共享65％到75％之间或大约80％的序列同一性。在具体实施方案中，密码子优化序列与天然存在的或野生型序列(例如，编码冠状病毒抗原的天然存在或野生型mRNA序列)共享70％的序列同一性。

在一些实施方案中，密码子优化的序列编码的抗原的免疫原性与由非密码子优化序列编码的冠状病毒抗原的免疫原性相比一样或更多(例如，至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少100％或至少200％)。

在一些实施方案中，密码子优化的RNA可以是G/C水平增强的RNA。核酸分子(例如mRNA)的G/C含量可能会影响RNA的稳定性。鸟嘌呤(G)和/或胞嘧啶(C)残基数量增加的RNA可能比含有大量腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)核苷酸的RNA在功能上更稳定。例如，WO02/098443公开了含有通过翻译区序列修饰来稳定的mRNA的药物组合物。由于遗传密码的简并性，修饰的工作原理是将现有的密码子替换为那些在不改变所得氨基酸的情况下促进更高RNA稳定性的密码子。该方法仅限于RNA的编码区。

为了比较两个或多个核苷酸序列，第一核苷酸序列和第二个核苷酸序列之间的“序列同一性”的百分比可以通过以下方法计算：[第一核苷酸序列中与第二核苷酸序列在相应位置的核苷酸相同的核苷酸数]除以[第一核苷酸序列中的核苷酸总数]并乘以[100％]。其中，与第一个核苷酸序列相比，第二个核苷酸序列中核苷酸的每次缺失、插入、替换或添加都被视为单个核苷酸(位置)的差异。或者，可以使用已知的序列比对计算机算法(例如NCBI Blast v2.0)使用标准设置来计算两个或多个核苷酸序列之间的序列同一性程度。

为了比较两个或多个氨基酸序列，第一氨基酸序列和第二氨基酸序列之间的“序列同一性”百分比(在本文中也称为“氨基酸同一性”)的计算方法是：将[第一氨基酸序列中与第二氨基酸序列在相应位置的氨基酸残基相同的氨基酸残基的数量]除以[总第一氨基酸序列中的氨基酸残基数]并乘以[100％]，其中第二氨基酸序列中氨基酸残基的每次缺失、插入、替换或添加-与第一氨基酸序列相比-被视为单个氨基酸残基(位置)的差异，即本文定义的“氨基酸差异”。或者，可以使用已知的计算机算法计算两个氨基酸序列之间的序列同一性程度，例如上面提到的用于确定核苷酸序列序列同一性程度的算法，同样使用标准设置。一种特定的方法利用WU-BLAST-2的BLAST模块设置为默认参数，重叠跨度和重叠分数分别设置为1和0.125。

在具体实施方案中，本发明提供了一种药物组合物，该组合物包括所述多表位构建体、所述组合或所述多肽，以及至少一种药学上可接受的试剂。

本文中使用的“组合物”是指两种或多种产品或组分(例如试剂、调节剂、调控剂等)的任何混合物。它可以是溶液、悬浮液、液体或水性制剂或其任何组合。

在本发明的上下文中，通过术语“药物组合物”是指具有药物特性的组合物。换句话说，指的是提供药理学和/或生理作用的组合物。药物组合物可以包括一种或多种药学上可接受的试剂，例如赋形剂、载体、稀释剂。

在一些实施方案中，药学上可接受的试剂包括但不限于生物相容性载体、佐剂、添加剂和稀释剂，以实现可用作剂型的组合物。其他合适的药物载体和稀释剂，以及使用它们的药物必需品，在Remington's Pharmaceutical Sciences中进行了描述。

如本文所述，除非另有说明，术语“赋形剂”应理解为包含的与活性化合物一起配制的任何物质，目的是长期稳定，例如防止在预期保质期内变性或聚集，膨胀的含有少量有效活性化合物的液体或固体制剂(因此通常称为“膨胀剂”，“填充剂”或“稀释剂”)，或在最终剂型中赋予活性化合物增强作用，例如促进吸收、降低粘度或增强溶解度。

在另一个实施方案中，本发明提供了所述多表位构建体、所述组合、所述多肽或所述药物组合物；在脂质体或纳米颗粒中配制，例如脂质纳米颗粒或聚合纳米颗粒；特别是脂质纳米颗粒。

本文定义的构建体、组合、多肽或药物组合物可以配制在脂质纳米颗粒(LNP)中，这些脂质纳米颗粒封装了构建体以保护它们免受降解并促进细胞摄取。

在本发明的上下文中，通过术语“脂质纳米颗粒”或LNP，指的是由一种或多种脂质组成的纳米级颗粒，例如不同脂质的组合。LNP中使用的可能脂质可以是例如但不限于至少一种磷脂、至少一种改性脂质如PEG脂质、至少一种可电离脂质、至少一种甾醇。本公开的脂质纳米颗粒及其组合物是本领域普遍已知的。

在本发明的上下文中，术语“PEG脂质”或“聚乙二醇化脂质”是指用PEG(聚乙二醇)基团修饰的任何合适的脂质。例如，在本发明的上下文中，PEG脂质可以是C14-PEG脂质，例如DMG-PEG2000(1,2-二肉豆蔻酰-消旋-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000)。C14-PEG脂质包含一个定义脂质分子量的聚乙二醇部分，以及一个包含14个C原子的脂肪酸尾部。可选地，本发明的PEG脂质可以是C16-或C18-脂质。

在本发明的上下文中，术语“可电离”(或其他阳离子)在化合物或脂质的上下文中是指所述化合物或脂质中任何不带电基团的存在，该基团能够通过产生离子(通常是H+离子)来解离，因此自身带正电。或者，所述化合物或脂质中的任何不带电的基团都可能产生电子，从而带负电。如本文所用，任何类型的可电离脂质都可以适当地使用。例如，合适的可电离脂质是可电离的氨基脂质，它由2个通过S-S键连接的相同或不同的尾部组成。

在本发明的上下文中，术语“磷脂”是指由两个疏水性脂肪酸“尾部”和一个由磷酸基团组成的亲水性“头”组成的脂质分子。这两种组分最常通过甘油分子连接在一起，因此，在本发明的磷脂中优选为甘油-磷脂。此外，磷酸基团通常用简单的有机分子修饰，例如胆碱(即提磷酸胆碱)或乙醇胺(即提磷酸乙醇胺)。

在本发明的上下文中，术语“甾醇”，也称为类固醇，是天然存在于植物、动物和真菌中的类固醇的一个亚组，或者可以由某些细菌产生。在本发明的上下文中，可以使用任何合适的甾醇，例如从包含胆甾醇、麦角甾醇、油菜甾醇、氧化固醇、Antrosterol、链甾醇、Nicasterol、谷甾醇和豆甾醇的列表中选择；优选为胆固醇。

在具体实施方案中，所述LNP包含所述可电离脂质的约10mol％至60mol％之间；优选在40mol％和60mol％之间。

在又一个具体实施方案中，所述LNP包含约15mol％至50mol％之间的甾醇；优选在20mol％和40mol％之间。

在进一步的实施方案中，所述LNP包含约0.5mol％至10mol％之间的所述PEG脂质；优选在0.5mol％和5mol％之间。

在另一个具体实施方案中，所述LNP包含约5mol％至40mol％之间的所述磷脂；优选在5mol％和15mol％之间。

因此，在更具体的实施方案中，本发明的LNP包含所述可电离脂质的约10mol％和70mol％之间；和/或所述甾醇的约15mol％和50mol％之间；和/或所述PEG脂质的约0.5mol％和10mol％之间；和/或所述磷脂的大约5mol％和40mol％之间。

在另一个具体实施方案中，本发明的LNP包含所述可电离脂质的约40mol％至60mol％之间；以及大约20mol％和40mol％之间的所述甾醇；所述PEG脂质的约0.5mol％和5mol％之间；以及所述磷脂的约5mol％和15mol％之间。

在具体实施方案中，本发明的LNP包括50mol％的可电离脂质、10mol％的磷脂、1.5mol％的PEG脂质和38.5mol％的甾醇。

如本文所用，术语“纳米颗粒”是指任何颗粒的直径使该颗粒适合于全身给药，特别是肌肉注射或静脉内给药，通常具有小于1000纳米(nm)的直径，优选小于500纳米，甚至更优选小于200纳米，例如在50至200纳米之间；优选在70至160nm之间。

在一些实施方案中，脂质的混合物形成脂质纳米颗粒。在一些实施方案中，所述构建体是在脂质纳米颗粒中配制的。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒首先形成为空脂质纳米颗粒，并在给药前立即(例如，在几分钟到一个小时内)与疫苗的构建体结合。

为避免任何误解，本发明的LNP可以包含单个多表位构建体，或者它们可以包含多个构建体，例如编码免疫调节蛋白的一个或多个构建体和/或编码抗原特异性蛋白的一个或多个构建体的组合。

在非常具体的实施方案中，所述编码免疫调节分子的构建体可以与编码源自冠状病毒的肽的一个或多个构建体组合。例如，本发明的LNP可以包含编码源自冠状病毒的肽的构建体；与编码免疫刺激分子CD40L、CD70和/或caTLR4(如Dimix或Trimix)的一个或多个构建体组合；进一步与编码冠状病毒糖蛋白的一个或多个构建体组合。

此外，应该理解的是，本发明的LNP可以包括根据本发明的所述组合、所述多肽或所述药物组合物。

在一些实施方案中，编码抗原的两个或多个不同的构建体(例如，mRNA)可以配制在同一个脂质纳米颗粒中。

在进一步的方面，本发明提供了所述多表位构建体、所述组合、所述多肽或所述药物组合物，用于人药或兽药。

药物组合物特别适合作为疫苗。

在本发明的上下文中，本文使用的术语“疫苗”是指旨在提供针对疾病的适应性免疫(T细胞反应和抗体)的任何制剂。为此，本文所指的术语“疫苗”包括至少一种多表位构建体、至少一种组合、至少一种多肽或至少一种药物组合物，可选配制成LNP，使适应性免疫反应增强。

在一些实施方案中，所述疫苗可以包括裸露的多表位构建体、悬浮在缓冲溶液中的裸露多肽。

疫苗可以是预防性的(例如：预防或改善任何自然或“野生”病原体未来感染的影响)或治疗性疫苗(例如，积极治疗或减轻持续疾病的症状)。疫苗的给药称为疫苗接种。

本发明还提供用于人类或兽医医药的疫苗。还打算使用疫苗。最后，该发明提供了一种预防和治疗人类和兽类疾病的方法，方法是对有需要的受试者施用疫苗。

在具体实施方案中，本发明提供了一种用于治疗或预防受试者中的冠状病毒的疫苗；特别是SARS-CoV-2病毒。

在本申请的上下文中，术语“treatment”、“treating”、“treat”等是指获得所需的药理学和/或生理效果。该效果可以是预防性的，即完全或部分预防疾病或其症状，和/或可以是治疗性的，部分或完全稳定或治愈疾病和/或疾病引起的不良反应。“治疗”包括对哺乳动物，特别是人类疾病的任何治疗，包括：(a)防止疾病或症状发生在可能易患疾病或症状但尚未被诊断患有疾病或症状的受试者身上；(b)抑制疾病症状，即阻止其发展；或(c)缓解疾病症状，即导致疾病或症状消退。

在另一个具体实施方案中，本发明提供了一种疫苗，用于在受试者中诱导针对冠状病毒的免疫反应；特别是SARS-CoV-2病毒。

整个描述中使用的术语“免疫反应”并不局限于本文可能已举例说明的免疫反应类型。因此，该术语包括疫苗接种对受试者有益的所有传染性媒介。

本发明的疫苗可用于诱导免疫反应，特别是针对疾病相关抗原或表达疾病相关抗原的细胞的免疫反应，例如针对冠状病毒抗原的免疫反应。优选所述免疫反应是T细胞反应。在一个实施方案中，疾病相关抗原是冠状病毒抗原。由本文描述的纳米颗粒中包含的构建体来编码的抗原优选地是疾病相关抗原或引发针对疾病相关抗原或表达疾病相关抗原的细胞的免疫反应。

在进一步的方面，本发明涉及诱导针对冠状病毒的免疫反应的方法，包括：向受试者施用治疗有效量的所述疫苗。

在本发明的背景下，该疫苗可以作为健康个体主动免疫计划的一部分进行预防性或治疗性给药，或在感染早期的潜伏期或症状出现后的活动性感染期间施用。

在一些实施方案中，该疫苗可以作为单一疗法或作为与其他冠状病毒疫苗的联合疗法给药。

在一些实施方案中，疫苗可以作为单剂、两剂、三剂、四剂或重复给药(如适用)。

在一些实施方案中，单药治疗中的给药时间可以且不限于1周、2周、3周、4周、2个月、3个月、6个月、1年，并且可以每年重复一次。

在另一个实施方案中，联合治疗中注射之间的给药时间可以但不限于1分钟至30分钟、30分钟至1小时、3小时、6小时、12小时、1天、1周、2周、3周、4周、2个月、3个月、6个月、1年。

在特定实施方案中，向受试者注射约10至100μg(μg)之间的剂量。如本文所述，该构建体的有效量可低至10μg，例如以单剂量或两个5μg剂量给药。在一些实施方案中，有效量为10μg～100μg的总剂量。例如，有效量可以是10μg、20μg、30μg、40μg、50μg、60μg、70μg、80μg、90μg、100μg的总剂量。在一些实施方案中，有效量为总剂量为10μg。在一些实施方案中，有效量为总剂量为20μg。在一些实施方案中，有效量为总剂量为30μg。在一些实施方案中，有效量为总剂量为60μg。在一些实施方案中，有效量为总剂量为80μg。在一些实施方案中，有效量为总剂量为100μg。

在又一个实施方案中，本发明提供了所述多表位构建体、所述组合体、所述多肽或所述药物组合物，用于疫苗接种，特别是肌内疫苗接种。

在一些实施方案中，疫苗可以通过肌肉内、皮下、鼻内、皮内或通过淋巴系统施用，类似于本领域已知的灭活疫苗的施用。

本发明的疫苗特别用于肌肉注射，即将液体物质直接注射到肌肉中。

本发明还提供了一种疫苗；其中，给药是静脉内给药的，即将液体物质直接注入静脉中。

【表1：冠状病毒衍生肽的氨基酸序列】

【表2：冠状病毒衍生肽的核酸序列】

在本发明的上下文中，上表的RNA序列也可以替换为相应的DNA序列，其中本文定义的序列中的“U”被替换为“T”。

【实施例】

本发明由以下非限制性实施例说明。

【实施例1：SARS-COV-2保守免疫原性T细胞表位的预测】

SARS-CoV-2保守和表位预测多表位构建(MyNEO)(表2)。

进行了计算机预测，以确定哪些SARS-CoV-2抗原可能被加工、转运到MHC分子，并与其成分稳定结合并引发免疫反应。对SARS-CoV-2表达的每种蛋白质进行预测。对于每种蛋白质，分析了长度为9、10或11个氨基酸的每种可能的肽在MHC I类等位基因上的呈递可能性。用于呈递预测的MHC等位基因是根据它们在人群中的流行来选择的。此外，对于预测的在MHC I类上呈递的每种肽，预测呈递肽引发T细胞反应的可能性。

此外，对于肽呈递和免疫原性预测，进行了序列保守分析，以确定在SARS-CoV-2感染者中发现的SARS-CoV-2变体中高度保守的蛋白质区域。优先考虑位于保守蛋白质区域的表位具有明显的优势，因为它确保了最终疫苗对已经确定的不同SARS-CoV-2病毒株的广泛疗效。此外，由于保守性和功能重要性之间的内在联系，基于进化保守的表位选择将表位逃逸的风险降至最低，因为病毒通过人类群体传播并积累新的突变。

保守水平是根据SARS-CoV-2感染者采样的基因组序列数据计算的。保守以时间分辨和窗口式方式计算。对于SARS-CoV-2蛋白序列上的特定窗口，计算了平均序列保守性且较新的变体权重更高来考虑病毒进化。

对于疫苗的冠状病毒衍生肽选择，使用了混合体评分方法来增加引发更有效克隆型的机会，并更有效地防止T细胞逃逸。根据肽的整体保守水平以及它们所包含的表位的数量和质量对肽进行优先级排序，优先考虑包含多种靶向抗原的肽区域。

在最终构建体中，选定的肽被连接成一个长序列。新表位有可能出现在肽序列之间的连接处，即所谓的交界表位。这种交界表位可能会干扰对相关表位的免疫反应，从而有利于不相关的交界表位。为了减少这些表位的潜在负面影响，窗口的排序方式使预测的交界表位数量最小化。

【实施例2：RNA构建体的制备】

【RNA构建体的制备】

编码表2中定义的冠状病毒衍生肽的不同串联核酸序列的DNA序列在框架中克隆到LAMP1衍生的信号肽和DC-LAMP序列中，以优化加工和呈递到MHC I类和II类。由于长构建体(例如＞11Kb)表达不佳，因此也可以在两个单独的mRNA构建体上编码表位。例如，2Kb的构建体2.2也可以生成两个单独的构建体2.2.1(1Kb)和构建体2.2.2(1Kb)；或者类似地，构建体2.4(2Kb)也可以在两个单独的构建体2.4.1和构建体2.4.2中生成。通过修饰野生型或参考编码DNA序列来制备表3中定义的结果DNA序列，以实现稳定性和表达优化。将序列引入DNA载体中，该载体包含稳定的5'-UTR和3'-UTR序列，另外还包括一个至少90个腺苷的片段。

获得的质粒DNA构建体使用本领域已知的常用方案在细菌中转化和繁殖。最终，纯化和线性化的质粒DNA构建体用于随后的RNA体外转录。在适当的缓冲条件下，在包含N1-甲基假尿嘧啶核苷和cap1类似物的核苷酸混合物存在下，使用T7 RNA聚合酶进行体外转录。在体外转录过程中掺入N1-甲基假尿嘧啶核苷，以改进表达并减少mRNA构建体本身的有害先天免疫激活。纯化获得的RNA构建体并用于体外和体内实验。【使用western blot对连接T细胞表位RNA构建体进行表达分析】

为了分析表位构建体表达，使用Lipofectamine MessengerMAX作为转染试剂，用未配制的mRNA转染HeLa细胞。将HeLa细胞以320,000个细胞/孔的密度接种在6孔板中。使用Lipofectamine MessengerMAX(Invitrogen)用2μg未配制的mRNA转染HeLa细胞。实验中使用根据实施例2制备的mRNA构建体并列于表3中，包括阴性对照(注射用水)。转染后24小时，用胰蛋白酶分离HeLa细胞，收获并制备细胞裂解物。对细胞裂解物进行SDS-PAGE，然后进行western blot检测。使用抗DC-LAMP蛋白抗体与合适的第二抗体联合使用进行蛋白质印迹分析。

【实施例2的结果】

使用的mRNA构建体导致可检测的表达，该表达根据序列优化而变化(未显示蛋白质印迹)。优选构建体的优化RNA序列列于表4中，而构建体的非优化RNA序列列于表3中，可能包含以下序列号：

1.SARS-CoV-2构建体2.1_DCL(SEQ ID NO：95)：包含以下核酸序列的多表位构建体：SEQ ID NO：55、89、57、53、49、92、70、71、48、74、79、77、87、65、59、88、72、60、81(见图4)。

2.SARS-CoV-2构建体2.2_DCL(SEQ ID NO：96)：包含以下核酸序列的多表位构建体：SEQ ID NO：55、65、59、76、83、60、94、71、49、74、79、87、88、89、48、58、68、92、51、52、57、85、81、53、67、72、70(见图5)。

3.SARS-CoV-2构建体2.2.1_DCL(SEQ ID NO：97)：包含以下核酸序列的多表位构建体：SEQ ID NO：55、65、59、76、83、60、94、71、49、74、79、87、88(见图6)。

4.SARS-CoV-2构建体2.2.2_DCL(SEQ ID NO：98)：包含以下核酸序列的多表位构建体：SEQ ID NO：89、48、58、68、92、51、52、57、85、81、53、67、72、70(见图7)。

5.SARS-CoV-2构建体2.3_DCL(SEQ ID NO：99)：包含以下核酸序列的多表位构建体：SEQ ID NO：60、63、54、49、84、89、71、57、65、91、48、56、66、80、79、67、78、75、59、82(见图8)。

6.SARS-CoV-2构建体2.4_DCL(SEQ ID NO：100)：包含以下核酸序列的多表位构建体：SEQ ID NO：91、71、78、66、86、63、60、80、90、75、73、54、67、61、89、48、65、79、62、57、50、93、84、49、59、64、69、82、56(见图9)。

7.SARS-CoV-2构建体2.4.1_DCL(SEQ ID NO：101)：包含以下核酸序列的多表位构建体：SEQ ID NO：91、71、78、66、86、63、60、80、90、75、73、54、67、61(见图10)。

8.SARS-CoV-2构建体2.4.2_DCL(SEQ ID NO：102)：包含以下核酸序列的多表位构建体：SEQ ID NO：89、48、65、79、62、57、50、93、84、49、59、64、69、82、56(见图11)。

9.SARS-CoV-2构建体2.5_DCL(SEQ ID NO：103)：包含以下核酸序列的多表位构建体：SEQ ID NO：89、59、60、49、65、79、71、67、57、48(见图12)。【实施例3：使用mRNA编码的SARS-COV-2表位疫苗接种小鼠】

【RNA构建体的制备】

SARS-CoV-2表位构建体如实施例1所述制备，并在用于体内疫苗接种实验之前用LNP配制。

【小鼠疫苗接种和流式细胞术】

雌性BALB/c小鼠(6～8周龄)以5μg的剂量肌肉注射mRNA疫苗组合物。作为阴性对照，一组小鼠免疫接种缓冲液。所有动物在第0天和第21天免疫接种。

根据本领域已知的标准方案分离来自接种疫苗的小鼠的脾细胞。简而言之，分离的脾脏通过细胞过滤器研磨并在PBS中洗涤，然后进行红细胞裂解。用PBS进行大量洗涤步骤后，将RPMI中的脾细胞接种到96孔板(2×10⁶个细胞/孔)中。在蛋白质转运抑制剂存在下，在37℃下，用与mRNA构建体中表位匹配的特异性肽表位混合物(每种肽2μg/ml)刺激细胞5小时。刺激后，根据制造商的说明使用Cytofix/Cytoperm试剂(BD Biosciences)洗涤细胞并进行细胞内细胞因子染色。以下抗体用于染色：Thy1.2-Alexa700(BioLegend)、CD4-FITC(BioLegend)、CD8-V450(BD Biosciences)、CD107a-BV711(BD Biosciences)和IFNγ-PE(BD Biosciences)。Zombie Aqua用于区分活细胞/死细胞(Invitrogen)。使用Attune流式细胞仪(Thermo Fisher Scientific)获取细胞。使用FlowJo软件包(Tree Star Inc.)分析流式细胞术数据。

【实施例3的结果】

如图1所示，在初施/追施接种mRNA-LNP疫苗后，使用编码源自SARS-CoV-2非结构蛋白保守区域的交界表位的mRNA进行疫苗接种诱导了强烈的表位特异性CD8 T细胞反应。

【实施例4：使用mRNA构建体2.3opt2对小鼠进行疫苗接种】

在这个实施例中，设想了一种联合疫苗策略。

根据实施例2的细节制备RNA构建体，根据实施例3的细节进行疫苗接种和结果分析。

体液反应由全长SARS-CoV-2刺突mRNA引起，T细胞反应由编码串联蛋白的mRNA引起，其中串联蛋白包含由病毒全基因组编码的表位(构建体2.3opt2-SEQ ID NO：117)。在此，两种mRNA构建体在体内结合。选择剂量反应方法，其中根据下表测试两种成分的等摩尔比，每种成分从0.2μg到10μg：

【结果】

每次疫苗接种事件(初施或追施)后都会发生非常轻微的短暂体重减轻(最大5％)(数据未显示)。即使在较高剂量下，mRNA候选疫苗中的抗原组合也不会引起毒性迹象增加(数据未显示)。

我们观察到接种疫苗后IgG1和IgG2a反应的明显诱导，第二次疫苗接种具有特异性的增强效果(图2)。剂量范围效应对于较低剂量更为明显。对于高于1mg的剂量，观察到疫苗接种剂量的平台效应。

此外，在所有测试的剂量中都可以看到多功能CD8+T细胞活化的剂量反应增加(图3)。

【结论】

从mRNA的组合中几乎看不到任何可见的毒性。几乎所有测试的细胞因子，尤其是INF II型相关细胞因子在追施后增加，具有明显的剂量反应效应。

在d21和d35中观察到高S特异性IgG1效价，从d21到d35的诱导效果良好。对于所有超过1mg的剂量，观察到明显的平台效应。

最后，我们观察到CD8+T细胞反应有明显的剂量范围效应。

因此，这些数据证明，其中公开的构建体在针对COVID感染的疫苗接种策略中具有潜力。

【表3：多表位构建体的非优化RNA序列】

在本发明的上下文中，上表的RNA序列也可以替换为相应的DNA序列，其中如本文定义的序列中的“U”被“T”替换。

【表4：多表位构建体的密码子优化RNA序列(_opt1；_opt2；_opt3是指同一构建体的三个不同的密码子优化序列)】

【表5：SARS-CoV-2刺突糖蛋白构建体的密码子优化RNA序列(_opt1；_opt2是指同一构建体的两个不同密码子优化序列)】

【参考文献】

Wu,F.,Zhao,S.,Yu,B.et al.,A new coronavirus associated with humanrespiratory disease in China.Nature 579,265-269(2020)。

Claims (13)

1.编码源自冠状病毒的肽或其功能变体和/或其片段的多表位核酸构建体，其中，所述肽、其变体和/或其片段包含与SEQ ID NO：1、2、7、9、10、12、13、16、18、19、20、24、28、31、32、33、35、37、42和44具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的多表位构建体，其中，所述构建体包含选自下列的序列：SEQID NO：116、117或118；特别是SEQ ID NO：117；或与其具有至少95％序列同一性的序列。

3.根据权利要求1～2中任一项所述的多表位构建体，其还包含一个或多个编码冠状病毒糖蛋白或其功能变体和/或其片段的核酸序列，其中所述冠状病毒糖蛋白特别是SARS-CoV-2刺突糖蛋白。

4.一种组合，其包含：

根据权利要求1～3中任一项所述的多表位构建体，以及

包含一个或多个编码冠状病毒糖蛋白或其功能变体和/或其片段的核酸序列的构建体，其中所述冠状病毒糖蛋白特别是SARS-CoV-2刺突糖蛋白。

5.根据权利要求1～3中任一项所述的多表位构建体，或根据权利要求4所述的组合，其中，所述编码的肽或其功能变体和/或其片段与选自下列的至少一种分子接头分离：柔性接头、刚性接头和/或可切割接头。

6.一种多肽，由根据权利要求1～3或5中任一项所述的多表位构建体编码。

7.一种药物组合物，其包含根据权利要求1～3或权利要求5中任一项所述的多表位构建体，根据权利要求4的组合，或根据权利要求6所述的多肽，以及至少一种药学上可接受的试剂。

8.根据权利要求1～3或5中任一项所述的多表位构建体，根据权利要求4所述的组合，根据权利要求6所述的多肽或根据权利要求7所述的药物组合物；其在脂质体或纳米颗粒中配制，例如脂质纳米颗粒或聚合物纳米颗粒；特别是脂质纳米颗粒。

9.根据权利要求1～3或5中任一项所述的多表位构建体，根据权利要求4所述的组合，根据权利要求6所述的多肽或根据权利要求8所述的药物组合物；用于人或兽医医药。

10.根据权利要求1～3或5中任一项所述的多表位构建体，根据权利要求4所述的组合，根据权利要求6所述的多肽或根据权利要求8所述的药物组合物；用于疫苗接种，特别是肌肉疫苗接种。

11.根据权利要求1～3或5中任一项所述的多表位构建体，根据权利要求4所述的组合，根据权利要求6所述的多肽或根据权利要求8所述的药物组合物；用于包括在受试者中诱导针对冠状病毒的免疫反应；特别是SARS-CoV-2病毒。

12.根据权利要求1～3或5中任一项所述的多表位构建体，根据权利要求4所述的组合，根据权利要求6所述的多肽或根据权利要求8所述的药物组合物；用于治疗或预防受试者的冠状病毒感染；特别是SARS-CoV-2病毒。

13.一种诱导针对冠状病毒的免疫反应的方法，其包括：

将治疗有效量的根据权利要求1～3或5中任一项所述的多表位构建体、根据权利要求4所述的组合、根据权利要求6所述的多肽或根据权利要求8所述的药物组合物施用给受试者。