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CN119236080A - 一种医药组合物在制备用于治疗多发性硬化药物中的应用 - Google Patents

一种医药组合物在制备用于治疗多发性硬化药物中的应用 Download PDF

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CN119236080A
CN119236080A CN202411372366.1A CN202411372366A CN119236080A CN 119236080 A CN119236080 A CN 119236080A CN 202411372366 A CN202411372366 A CN 202411372366A CN 119236080 A CN119236080 A CN 119236080A
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CN
China
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spak
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choroid plexus
eae
mmp2
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CN202411372366.1A
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郑余银
郑武
王叶萍
齐沉星
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Second Affiliated Hospital and Yuying Childrens Hospital of Wenzhou Medical University
Original Assignee
Second Affiliated Hospital and Yuying Childrens Hospital of Wenzhou Medical University
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Abstract

本发明涉及一种医药组合物在制备用于治疗多发性硬化药物中的应用，所述医药组合物包括SPAK激酶的抑制剂、降低SPAK激酶表达的下调剂、降低MMP2表达的下调剂和降低MMP9中表达的下调剂中的至少一种。SPAK激酶的抑制剂和降低SPAK激酶表达的下调剂通过减少SPAK的磷酸化从而降低MMP2、MMP9的表达，进而达到治疗多发性硬化的作用。

Description

一种医药组合物在制备用于治疗多发性硬化药物中的应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别是一种医药组合物在制备用于治疗多发性硬化药物中的应用。
背景技术
多发性硬化(Multiple sclerosis，MS)是常见的中枢神经系统(central nervoussystem，CNS)特发性炎性脱髓鞘疾病之一，其发病机制主要是人体外周血中的自身反应性T淋巴细胞通过破坏的血脑屏障迁移到CNS，形成免疫浸润，攻击保护神经的髓鞘和轴突，导致其损伤和脱落，抑制神经信号传导。典型的临床表现包括但不限于视力障碍、肢体无力或感觉丧失、认知功能障碍和潜在的残疾。
实验性自身免疫性脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)是一种以特异性致敏的CD4+T淋巴细胞介导的，以CNS血管周围出现单个核细胞浸润及白质脱髓鞘为特征的中枢神经系统自身免疫性疾病，其病理变化与MS类似，因此，EAE动物模型被普遍用于MS的致病机制及临床前研究。
脉络丛(Choroid plexus，ChP)是维持CNS免疫状态的不可或缺的组成部分。ChP上皮细胞之间的紧密连接形成了血-脑脊液屏障，以防止生物大分子和免疫细胞进入脑脊液。ChP中“第一波”T细胞浸润表明ChP在EAE中的决定性作用。
SPAK(Ste20相关的富含脯氨酸/丙氨酸激酶)可通过调节其下游基因NKCC1(钠钾氯共转运蛋白1)来调节脑脊液的分泌。有研究发现激活ChP中SPAK-NKCC1级联反应可促进免疫炎症反应加重脑卒中。另有研究表明，激活SPAK可导致ChP免疫细胞浸润增加，使脉络丛上皮细胞脑脊液产量增加从而加重脑积水。此外，SPAK的药理抑制作用使脑脊液分泌减少，减轻了脑卒中相关脑水肿，维持了ChP屏障的完整性。
目前，SPAK在ChP网关活动中的作用在很大程度上仍是未知的，尚未有通过调节SPAK蛋白活性进而调控脉络丛上皮细胞的屏障功能治疗多发性硬化药物用途的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的现状，提供一种医药组合物在制备用于治疗多发性硬化药物中的应用。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种医药组合物在制备用于治疗多发性硬化药物中的应用，所述医药组合物包括SPAK激酶的抑制剂、降低SPAK激酶表达的下调剂、降低MMP2表达的下调剂和降低MMP9中表达的下调剂中的至少一种。SPAK激酶的抑制剂和降低SPAK激酶表达的下调剂通过减少SPAK的磷酸化从而降低MMP2、MMP9的表达，调控脉络丛上皮细胞的屏障功能，进而达到治疗多发性硬化的作用。
优选地，所述SPAK激酶的抑制剂包括ZT-1a。
优选地，所述ZT-1a的给药方式为腹腔注射。ZT-1a可透过血脑屏障，便于给药。
优选地，所述医药组合物包括降低MMP2表达的下调剂和降低MMP9中表达的下调剂。同时降低MMP2和MMP9的表达可以增加治疗多发性硬化的效果。
优选地，所述降低SPAK激酶表达的下调剂包括抑制SPAK激酶表达的活性肽、蛋白、寡核苷酸和小分子化合物中的至少一种。
优选地，所述降低MMP2表达的下调剂包括抑制MMP2表达的活性肽、蛋白、寡核苷酸和小分子化合物中的至少一种。
优选地，所述降低MMP9激酶表达的下调剂包括抑制MMP9表达的活性肽、蛋白、寡核苷酸和小分子化合物中的至少一种。
与现有技术相比，本发明的优点在于：揭示了在EAE/MS病理进程中，脉络丛SPAK高表达，促进MMP2/9表达，降解脉络丛基质蛋白和上皮细胞间紧密连接蛋白，从而引起脉络丛屏障功能受损，加重免疫细胞浸润及损伤；SPAK抑制剂ZT-1a透过血脑屏障靶向脉络丛治疗可以有效缓解病理进程，减轻炎症反应；本发明首次探讨脉络丛SPAK蛋白参与多发性硬化病理进程的机制，为多发性硬化的治疗提供一种新的思路。
附图说明
图1为本发明实施例中1中脉络丛SPAK、p-SPAK、p-NKCC1蛋白表达量在EAE诱导后0～20天的变化图；其中，图1A为EAE诱导不同时相脉络丛SPAK蛋白分布及荧光强度图；图1B为图1A中脉络丛SPAK相对荧光强度的定量统计图；图1C为EAE诱导不同时相脉络丛p-SPAK蛋白分布及荧光强度图；图1D为图1C中脉络丛p-SPAK相对荧光强度的定量统计图；图1E为EAE诱导不同时相脉络丛p-NKCC1蛋白分布及荧光强度图；图1F为图1E中脉络丛p-NKCC1相对荧光强度的定量统计图；(Two-Way ANOVA Repeated Measures，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，n＝5/组)；
图2为本发明实施例中2中脉络丛特异性敲减前后的脉络丛SPAK信号图；图2A中，小鼠单侧侧脑室注射SPAK敲减病毒，2周后绿色荧光蛋白特异性表达于脉络丛组织处；对脉络丛组织进行SPAK免疫荧光染色，可见SPAK敲减组的红色荧光强度明显降低；图2B为图2A中脉络丛SPAK相对荧光强度的定量统计图(Unpaired T test，***P<0.001，n＝5/组)；图2C中，小鼠单侧侧脑室注射SPAK敲减病毒，2周后PBS灌注取脉络丛组织，Q-PCR结果显示SPAK的mRNA水平降低(Unpaired T test，**P<0.01，n＝5/组)；
图3为本发明实施例中3中靶向抑制脉络丛SPAK信号对EAE的影响结果图；图3A中，靶向抑制脉络丛处SPAK信号可有效减轻EAE的病理评分(Two-Way ANOVA RepeatedMeasures，n＝5/组)；图3B、3C中，HE染色见抑制脉络丛处SPAK信号后脊髓免疫细胞浸润程度降低，(Unpaired T test，n＝5/组)；图3D、3E中，抑制脉络丛处SPAK信号后改善脊髓脱髓鞘程度，(Unpaired T test，n＝5/组)；图3F、3G中，抑制脉络丛处SPAK信号后减轻CD4+T淋巴细胞在脊髓浸润，(Unpaired T test，n＝5/组)；图3H、3I中，抑制脉络丛处SPAK信号后减轻CD4+T淋巴细胞在脉络丛浸润，(Unpaired T test，n＝5/组)；图3J、3K中，抑制脉络丛处SPAK信号后明显抑制脊髓巨噬细胞、小胶质细胞活化，(Unpaired T test，n＝5/组)；图3L、3M中，抑制脉络丛处SPAK信号后，3D重建可见脊髓小胶质细胞活化被抑制，(Unpaired Ttest，n＝30/组)；
图4为本发明实施例中3中靶向抑制脉络丛中SPAK信号的脑脊液和脊髓中免疫细胞的结果图；其中，图4A中采用流式细胞术检测脑脊液和脊髓中CD4+T细胞、IFN-γ+T细胞和IL-17+T细胞数量；图4B、4C、4D中，抑制脉络丛SPAK表达可减少脑脊液中CD4+T细胞、IFN-γ+T细胞和IL-17+T细胞数量；图4E、4F、4G中,抑制脉络丛SPAK表达可减少脊髓中CD4+T细胞、IFN-γ+T细胞和IL-17+T细胞数量；(Unpaired Ttest，*P<0.05，**P<0.01，n＝5/组)；
图5为本发明实施例中4中靶向抑制脉络丛SPAK信号对紧密连接蛋白和MMP蛋白表达的影响图；图5A～5G中，侧脑室注射SPAK敲减病毒2周后，取脉络丛组织进行Q-PCR分析OCLN、ZO-1、Claudin1、Claudin3、Claudin5、MMP2、MMP9蛋白表达水平(n＝5/组)；图5H中，生理条件下，未处理组、ICV注射SPAK敲减病毒或对照病毒后ChP的OCLN免疫荧光图(n＝5/组)；图5I中，生理条件下，未处理组、ICV注射SPAK敲减病毒或对照病毒后ChP的MMP2免疫荧光图(n＝5/组)；图5J中，生理条件下，未处理组、ICV注射SPAK敲减病毒或对照病毒后ChP的MMP9免疫荧光图；图5K中，定量分析如图5H所示的OCLN荧光强度(n＝5/组)；图5L中，定量分析如图5I所示的MMP2荧光强度(n＝5/组)；图5M中，定量分析如图5J所示的MMP9荧光强度(n＝5/组)；图5N中，病理条件下，未处理组、ICV注射SPAK敲减病毒或对照病毒后ChP的OCLN免疫荧光图(n＝5/组)；图5O中，病理条件下，未处理组、ICV注射SPAK敲减病毒或对照病毒后ChP的MMP2免疫荧光图(n＝5/组)；图5P中，病理条件下，未处理组、ICV注射SPAK敲减病毒或对照病毒后ChP的MMP9免疫荧光图；图5Q中，定量分析如图5N所示的OCLN荧光强度(n＝5/组)；图5R中，定量分析如图5O所示的MMP2荧光强度(n＝5/组)；图5S中，定量分析如图5P所示的MMP9荧光强度(n＝5/组)；(Unpaired T test，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)；
图6为本发明实施例中5中SPAK-NKCC1拮抗剂对EAE病理损伤作用的结果图；其中，图6A中，EAE动物模型中，隔天腹腔注射布美他尼，小鼠的病理评分没有差异(Two-WayANOVA Repeated Measures，n＝5/组)；图6B中，EAE动物模型中，隔天腹腔注射ZT-1a，小鼠的病理评分大幅度降低(Two-Way ANOVA Repeated Measures，n＝5/组)；图6C、6D中，EAE诱导后隔天腹腔注射ZT-1a，HE染色见脊髓免疫细胞浸润程度降低，(Unpaired T test，n＝5/组)；图6E、6F中，EAE诱导后隔天腹腔注射ZT-1a，脊髓脱髓鞘程度明显改善，(Unpaired Ttest，n＝5/组)；图6G、6H中，EAE诱导后隔天腹腔注射ZT-1a，CD4+T淋巴细胞在脊髓浸润减少，(Unpaired T test，n＝5/组)；图6I、6J中，EAE诱导后隔天腹腔注射ZT-1a，CD4+T淋巴细胞在脉络丛处浸润减少，(Unpaired T test，n＝5/组)；图6K、6L中，EAE诱导后隔天腹腔注射ZT-1a，脊髓巨噬细胞、小胶质细胞活化明显被抑制，(Unpaired T test，n＝5/组)；图6M、6N中，EAE诱导后隔天腹腔注射ZT-1a，3D重建可见脊髓小胶质细胞活化被抑制，表现为胞体直径变小，细胞突触分支数目增多，分支长度变长，(Unpaired T test，n＝30/组)；(ns＝P＞0.05，**P<0.01，***P<0.001，###P<0.001)；
图7为本发明实施例中5中注射ZT-1a后小鼠的脑脊液和脊髓中免疫细胞的结果图；其中，图7A中，EAE诱导后腹腔注射ZT-1a或对照溶剂，采用流式细胞术检测脑脊液和脊髓中CD4+T细胞、IFN-γ+T细胞和IL-17+T细胞数量；图7B、7C、7D中，EAE诱导后腹腔注射ZT-1a，可减少脑脊液中CD4+T细胞、IFN-γ+T细胞和IL-17+T细胞数量；图7E、7F、7G中，EAE诱导后腹腔注射ZT-1a，可减少脊髓中CD4+T细胞、IFN-γ+T细胞和IL-17+T细胞数量；(UnpairedT test，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，n＝5/组)；
图8为本发明实施例中6中靶向抑制脉络丛MMP信号对EAE病理表现的影响结果图；其中，图8A中，靶向抑制脉络丛处MMP2、MMP9、MMP2/9可有效减轻EAE的病理评分(Two-WayANOVARepeated Measures，n＝5/组)；图8B、8C中，抑制脉络丛处MMP2、MMP9、MMP2/9后明显抑制脊髓巨噬细胞、小胶质细胞活化，(One-Way ANOVA，n＝5/组)；图8D、8E中，抑制脉络丛处MMP2、MMP9、MMP2/9改善脊髓脱髓鞘程度，(One-Way ANOVA，n＝5/组)；图8F、8G中，HE染色见抑制脉络丛处MMP2、MMP9、MMP2/9脊髓免疫细胞浸润程度降低，(One-Way ANOVA，n＝5/组)；(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，###P<0.001)；
图9为本发明实施例中7中脉络丛特异性过表达SPAK(SPAK-OE)对EAE病理的影响结果图；其中，图9A中，脉络丛特异性过表达SPAK加重EAE病理评分(Two-WayANOVARepeated Measures，n＝5/组)；图9B、9C中，脉络丛特异性过表达SPAK促进脊髓巨噬细胞、小胶质细胞活化，(Unpaired T test，n＝5/组)；图9D、9E中，脉络丛特异性过表达SPAK加重脊髓脱髓鞘，(Unpaired T test，n＝5/组)；图9F、9G中，HE染色见后脉络丛特异性过表达SPAK后脊髓免疫细胞浸润程度加重，(Unpaired T test，n＝5/组)；(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，#P<0.05)。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
有研究报道实验性自身免疫性脊髓炎(Experimental autoimmuneencephalomyelitis，EAE)病理情况下，“第一波”免疫细胞首先通过脉络丛浸润中枢神经系统，并介导后续免疫细胞通过血脑屏障向中枢迁移。另有研究表明，脉络丛上皮细胞中SPAK和NKCC1的表达远远超过其他细胞类型，SPAK是调节炎症信号和脑脊液之间的重要关联点，激活SPAK可导致脉络丛免疫细胞浸润增加。
实施例1EAE不同时相上SPAK、p-SPAK、p-NKCC1的变化特征
(一)实验方法
首先对C57BL/6小鼠进行EAE造模，分别在第0、4、8、12、16、20天这六个时间点，对小鼠进行PBS灌注并取材后对SPAK、p-SPAK、p-NKCC1进行免疫荧光染色。本实验主要使用野生型C57BL/6雌性小鼠，体重22-25g，鼠龄8-10周，购自北京斯贝福实验动物中心，饲养于温州医科大学实验动物中心，饲养温度维持在(24±0.5℃)，湿度维持在(60±2％)，遵循12h光暗周期循环规律。实验所涉及的动物完全以国家科学技术委员会《实验动物管理条例》为准则，并遵守温州医科大学动物使用伦理委员会的实验动物伦理条例。
其中，实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)造模及病理评分的方法如下：
(1)制备MOG抗原乳剂：将4mg髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG35-55，Anaspec)溶于2mL磷酸盐缓冲液(PBS)制备成水溶液，将16mg人结核分枝杆菌(H37Ra)溶于2mL不完全弗氏佐剂制备成完全弗氏佐剂油溶液，将上述水、油溶液以1：1等体积充分混匀，再在冰浴条件下置于超高速匀浆机中涡旋15min，即制成MOG抗原乳剂；
(2)小鼠EAE造模：将小鼠用3.6％水合氯醛麻醉后，在其颈、背及尾部选4点皮下注射总剂量为10mL/kg的MOG抗原乳剂；在注射MOG抗原乳剂后第0h和第48h腹腔注射浓度为500ng/mL的百日咳毒素(PT，Biological Laboratories Inc.)，注射剂量为5mg/kg；
(3)神经功能缺损评分：采用weaver’s 15分法进行评分，具体评分标准如下：
尾巴：活动无异常0分、尾半瘫1分、尾全瘫2分；
四肢：活动无异常0分、步态改变1分、轻瘫2分、全瘫3分；
四肢和尾巴评分总和记为小鼠当天的神经功能缺损评分，死亡记为15分。
其中，本发明中涉及到的免疫荧光染色的方法如下：
脉络丛铺片染色步骤如下：
①脉络丛样本制备：小鼠用PBS灌注后迅速在显微镜下取出脉络丛组织，于4％PFA中浸泡固定1h；
②将固定后的脉络丛在PBS中清洗3次，5min/次；
③封闭：将脉络丛置于封闭液中室温孵育2h；
④一抗孵育：将脉络丛置于一抗液中，室温孵育过夜，孵育结束后用PBS洗涤5次，5min/次；
⑤二抗孵育：将脉络丛置于荧光二抗液中，避光室温孵育2小时(注意：之后所有步骤均需在避光条件下进行)，孵育结束后用PBS洗涤5次，5min/次；
⑥DAPI染核：将脉络丛置于DAPI染液中，避光室温孵育10min，孵育结束后用PBS洗涤3次，5min/次，
⑦封片：显微镜下将脉络丛铺在载玻片上，擦去多余水分，避光晾干，滴加抗淬灭剂后，盖玻片封片。
冰冻切片染色步骤如下：
①冰冻切片样本制备：小鼠用PBS及4％PFA灌注后取出全脑和脊髓，置于4％PFA中浸泡过夜；将组织置于30％蔗糖溶液脱水2～3天；将组织用OCT胶包埋冷冻后，冰冻切片机冠状位切片，切片厚度：脑30μm，脊髓40μm，将其贴附于载玻片上，室温过夜晾干；
②将组织置于PBS中洗涤3次，5min/次；
③封闭：洗涤后擦去多余水分，利用组化笔围绕组织画闭圈环，滴加封闭液，于湿盒中室温孵育2h；
④一抗孵育：滴加一抗液，室温孵育过夜，孵育结束后用PBS洗涤5次，5min/次；
⑤二抗孵育：滴加荧光二抗液，避光室温孵育2小时，孵育结束后用PBS洗涤5次，5min/次；
⑥DAPI染核：滴加DAPI染液，避光室温孵育10min，结束后用PBS洗涤3次，5min/次，结束后擦去多余水分，避光晾干，滴加抗淬灭剂后，盖玻片封片。
石蜡切片染色步骤如下：
①石蜡切片样本制备：小鼠用PBS及4％PFA灌注后取出全脑及脊髓，置于石蜡固定液中浸泡过夜；自动脱水机中脱水后，浸蜡包埋；石蜡切片机冠状位切片，切片厚度为：脑10μm，脊髓7μm，并将切片贴附于载玻片上，室温过夜晾干；
②烘片：将石蜡切片放置在切片架上，于60℃烘箱中烘烤1.5～2h；
③脱蜡复水：于二甲苯中浸泡2次，10min/次；于无水乙醇中浸泡2次，5min/次；于95％、85％、75％、50％酒精、蒸馏水及PBS中各浸泡5min；
④抗原修复：切片浸泡于柠檬酸钠溶液(PH＝6.0)中，用微波炉高火至沸腾，再用中火维持7min，停止加热后使其自然冷却，于PBS中浸泡洗涤3次，5min/次；
后续操作步骤，包括封闭、一抗孵育、二抗孵育、DAPI染核与冰冻切片染色③～⑥一致。
(二)实验结果
如图1所示，侧脑室SPAK、p-SPAK、p-NKCC1蛋白均匀分布在细胞边缘，且在EAE病理进程中，SPAK(见图1A、1B)、p-SPAK(见图1C、1D)、p-NKCC1(见图1E、1F)蛋白在脉络丛上的表达水平均有所升高，说明SPAK-NKCC1信号通路在EAE病理进程中的重要性。进一步证明了EAE病理进程中，脉络丛是重要的免疫浸润调控位点。
实施例2病毒特异敲减靶向抑制脉络丛部位SPAK水平
(一)实验方法
为进一步研究SPAK在脉络丛中的功能，我们采用侧脑室注射SPAK敲减病毒(SPAK-Kd，rAAV2/5-U6-shRNA(SPAK)-CMV-EGFP)的方式实现脉络丛SPAK特异性敲减，达到靶向抑制脉络丛SPAK信号的目的；同时对SPAK特异性敲减后的小鼠脉络丛进行SPAK免疫荧光染色。
其中，小鼠单侧侧脑室注射SPAK敲减病毒及对照病毒(rAAV2/5-U6-Scramble-CMV-EGFP)的方法如下：
①麻醉与固定：用3.6％水合氯醛按10mg/kg腹腔注射麻醉小鼠，将小鼠头骨上的毛发剔除；将脑立体定位仪双侧耳杆固定在小鼠外耳道，小鼠门齿固定于前端的门齿固定器，眼睛涂抹红霉素眼膏；
②暴露视野：75％酒精消毒头皮，沿两耳间正中线剪开皮肤，充分暴露颅骨，使得前后囟在显微镜下清晰可见；
③调整注射平面：将针尖定位于前囟表面，X、Y、Z轴坐标归零，以前囟位置为参考点，左右移动2.5mm，当针尖定位于两点颅骨，两侧Z轴数值差在0.05mm以内视为左右调平，反之，则通过调整两侧耳杆高度将左右调平；前后调平通过前囟点与后囟点调平，方法同前；
④定位：以前囟为坐标原点，侧脑室注射位点为：前囟后(AP)-0.4mm，旁开(ML)±1.10mm，深度(DV)-2.10mm，本实验进行单侧侧脑室注射；
⑤钻颅孔：针尖接触颅骨平面后标记注射点，用直径0.5mm的手持钻头钻开颅骨，充分暴露脑组织；
⑥注射病毒：进针前排空针尖中可能存在的空气，将10μL的Hamilton微量注射器进针至颅骨下2mm，以0.4μL/min的速度注射病毒2μL，结束后留置5min并缓慢拔出针尖；
⑦术后处理：用医用针线缝合小鼠头部皮肤并进行消毒，然后将小鼠置于恒温电热毯上复温至苏醒，待小鼠苏醒转运至鼠笼饲养。
此外，再次对小鼠侧脑室注射病毒，2周后脉络丛取材进行实时荧光定量PCR检测。
其中，实时荧光定量PCR的方法如下：
①小鼠用PBS灌注后迅速在显微镜下取出脉络丛组织置于1.5mL离心管中，液氮速冻30s，加入500μL Trizol提取液，用冷冻研磨仪振荡6次，1min/次，随后冰上静置5min；
②加入100μL氯仿，充分涡旋15s混匀，冰上静置10min；
③4℃13000rpm离心15min，将上清液小心转移至新的1.5mL离心管，加入等体积的异丙醇，轻柔混匀后，冰上静置10min；
④4℃13000rpm离心5～10min，弃上清，可见白色絮状沉淀，立即用500μL 75％酒精重悬RNA沉淀，轻摇管身湿润管壁；
⑤4℃8000rpm离心5min，弃上清，洁净通风橱中晾干30min；
⑥加入15μL DEPC水溶解RNA沉淀，用NanoDrop测定RNA浓度；
⑦取RNA总量为1μg，根据已设定好的RNA逆转录程序，将RNA逆转录为cDNA。采用SYBR Green法，按照说明书配制定量PCR反应体系，共20μL，点样于96孔板中，置入PCR仪，根据说明书设置好扩增温度运行。运行后分析定量结果。
⑧本研究选择在脉络丛稳定表达的PPIA基因作为内参，利用Primer Bank网站，设计Q-PCR引物，所有基因引物序列如表1所示，其他实施例中的实时荧光定量PCR参照本实施例进行。
表1引物序列
⑨根据设定程序进行荧光定量PCR实验，PCR循环程序如表2所示：
表2Q-PCR程序
程序 设定 循环次数
1 95℃30s 1次
2 95℃5s，60℃30s 40次
3 95℃15s，60℃60s，95℃15s 1次
⑩根据Ct值计算相对荧光定量值(Relative Quantification，RQ)。
(二)实验结果
结果如图2所示，小鼠单侧侧脑室注射自带绿色荧光标记的SPAK敲减病毒表达2周后，侧脑室及第三脑室的脉络丛均表达绿色荧光蛋白(见图2A)。脉络丛SPAK免疫荧光染色的结果显示，与侧脑室注射对照病毒相比，敲减组的红色荧光强度明显降低(见图2A、2B)，验证了SPAK特异性敲减技术的可行性。
此外，2周后脉络丛取材的实时荧光定量PCR检测发现SPAK基因的mRNA水平降低(见图2C)，再次说明我们成功建立了脉络丛SPAK特异性敲减技术。
实施例3靶向抑制脉络丛SPAK信号改善疾病的发生
(一)实验方法
在实现脉络丛SPAK特异性敲减之后，我们首先对小鼠进行侧脑室注射对照病毒和SPAK敲减病毒，2周后均进行EAE造模。在EAE病理评分高峰期取脉络丛、脊髓组织进行染色，同时我们通过免疫荧光染色检测T淋巴细胞免疫浸润程度是否受到影响。此外，我们还对脊髓组织进行免疫荧光染色。
另外，我们通过流式细胞术的方法检测脑脊液和脊髓中浸润的免疫细胞的数量变化和类型。
本发明中，脊髓组织的苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色步骤如下：
①将制作好的脊髓石蜡包块置于石蜡切片机上，随后切成厚度为7μm的组织，将蜡片贴附于载玻片上，烘片、脱蜡复水、抗原修复，洗涤后擦去多余水分；
②核染：将切片置入苏木精溶液中，使溶液充分没过组织，放置5min，流水洗涤1min；
③分化：将切片置入1％盐酸酒精中分化，待切片的染液颜色变浅立即取出，流水洗净，吸干切片表面水分；
④复染：将切片置于伊红染液中3min；
⑤透明封片：将切片放入特殊分色液中分色：无水乙醇2min，无水乙醇2min，90％酒精2min，80％酒精2min，70％酒精2min，二甲苯I 5min，二甲苯II 10min，将切片从二甲苯里取出后晾干，随后使用中性树胶封片。
其中，脑脊液抽取的方法如下：
①麻醉与固定：用3.6％水合氯醛按10mg/kg腹腔注射麻醉小鼠，剔除小鼠头背部上毛发；将小鼠固定于脑立体定位仪上，调整位置使其头和身体成135°；
②暴露视野：75％酒精消毒皮肤，沿两耳间正中线剪开，再钝性分离表层皮肤下的结缔组织，随后沿颅脑正中白线轻柔剪开表层肌肉，将中层肌肉分离至两边，在显微镜辅助下使用精细镊将颅骨外最后一层肌肉轻轻剥开，充分暴露小脑延髓池，用棉签干燥该区域；
③使用微电极拉制仪拉动直径为0.5mm的毛细玻璃管，使其头部变尖锐，在小脑延髓池血管两侧或血管之间穿刺收集脑脊液，初始时毛细玻璃管液面迅速上升，直至液面不再上升时，拔除毛细玻璃管，用1mL注射器将液体转移至离心管中；每只小鼠收集约5-10μL脑脊液；
④收集的脑脊液置于冰上备用。
其中，流式细胞术的方法如下：
①小鼠用PBS灌注后，取出脊髓，制备脊髓单细胞悬液；取5-10μl从延髓池中收集的脑脊液，标记具体体积，用预冷PBS处理脑脊液细胞；
②加入FVS780(565388，BD Horizon)、CD3-FITC(11-0032-82，Invitrogen)、CD4-APC(2376140，Invitrogen)、CD196-AF647(129804，Biolegend)抗体，充分混匀后4℃避光孵育30min；
③离心后，加入含有1％BSA的PBS，促进细胞重悬；
④使用流式细胞仪对染色细胞进行单独评估。
(二)实验结果
如图3A所示，相较于对照组，SPAK敲减病毒处理组的疾病严重程度大幅度减轻，神经功能缺损评分明显降低。
HE染色结果如图3B、3C所示，脊髓的HE染色可见炎症细胞病理改变明显减轻；免疫荧光染色结果如图3D、3E(兔抗MBP抗体、小鼠抗NF-H抗体，Cell Signaling Technology；抗兔488二抗，抗小鼠594二抗，Invitrogen)所示，免疫荧光染色可见脊髓的脱髓鞘程度大幅度改善。
T淋巴细胞免疫荧光染色结果提示，SPAK敲减后大幅度降低了CD4+T淋巴细胞在脊髓(见图3F、3G(大鼠抗CD4抗体，抗大鼠594二抗，Invitrogen))、脉络丛处(见图3H、3I(大鼠抗CD4抗体，抗大鼠594二抗，Invitrogen))浸润的数量。
对脊髓组织的免疫荧光染色结果显示，SPAK敲减后明显抑制脊髓巨噬细胞、小胶质细胞活化(见图3J、3K(大鼠抗CD68抗体，Bio-Rad；兔抗Iba1抗体，Wako；抗大鼠594二抗，抗兔488二抗，Invitrogen))，3D重建可见EAE诱导后小胶质细胞活化，表现为胞体直径变大，细胞突触分支数目减少，分支长度变短，但SPAK敲减后则抑制其活化(见图3L、3M(兔抗Iba1抗体，Wako；抗兔488二抗，Invitrogen))。说明靶向抑制脉络丛SPAK信号可有效减少免疫细胞在脉络丛及脊髓的聚集，明显改善EAE的疾病严重程度。
流式细胞术的结果分析发现，SPAK敲减病毒处理组免疫细胞明显减少(见图4A～G)。再次说明靶向抑制脉络丛SPAK蛋白后可改善EAE免疫浸润程度。
紧密连接在维持上皮细胞极性和屏障完整性中起关键作用，其中Occludin(OCLN)、Claudin、ZO蛋白是组成紧密连接的主要蛋白。基质金属蛋白酶(MMP)参与调控细胞外基质稳态，可增加血脑屏障通透性。有研究表明，在神经系统中，MMP-2/9可破坏血脑屏障，促进炎症和小胶质细胞激活。
实施例4靶向抑制脉络丛SPAK信号影响脉络丛上皮细胞紧密连接蛋白和基质金属蛋白酶
(一)实验方法
为进一步研究SPAK如何影响脉络丛上皮细胞间连接状态和细胞基质状态，我们利用Q-PCR检测脉络丛中SPAK相关的紧密连接蛋白(OCLN、ZO-1、Claudin1/3/5)和基质金属蛋白酶(MMP，如MMP2、MMP9)表达水平。
实验进一步采用免疫荧光染色的方法检测OCLN、MMP2/9蛋白的表达水平及细胞定位。
(二)实验结果
紧密连接蛋白和基质金属蛋白酶表达水平的结果分析显示，与侧脑室注射对照病毒相比，侧脑室注射SPAK敲减病毒后脉络丛处OCLN、ZO-1和Claudin1/3/5的mRNA表达水平均有明显升高，相反，MMP2/9的mRNA表达水平则明显下降(图5A～5G)。
免疫荧光染色的结果显示，OCLN、MMP2/9蛋白分布在脉络丛上皮细胞基质侧；生理条件下，相较于未处理组或侧脑室注射对照病毒组，侧脑室注射SPAK敲减病毒组脉络丛OCLN蛋白表达水平升高，而MMP2/9蛋白表达水平下降(图5H～5M)；EAE病理条件下，侧脑室注射对照病毒后脉络丛OCLN蛋白表达水平较未处理组下降，MMP2/9蛋白表达水平则升高，而侧脑室注射SPAK敲减病毒后脉络丛OCLN蛋白表达水平较侧脑室注射对照病毒升高，MMP2/9蛋白表达水平则与之相反(图5N～5S)，说明靶向抑制脉络丛SPAK信号可部分逆转EAE对OCLN、MMP蛋白表达的影响。
布美他尼(Bumetanide)是一种袢利尿剂，在低浓度时可抑制NKCC1，已在临床上有所应用，但因其高电离度，全身给药后不易穿过血脑屏障而限制应用。ZT-1a是一种选择性SPAK激酶抑制剂，通过磷酸化抑制NKCC1。已有研究表明其可以通过减少SPAK，减轻脑水肿，保护脑损伤，改善神经功能。
实施例5SPAK-NKCC1拮抗剂对EAE病理损伤的作用
(一)实验方法
腹腔注射SPAK、NKCC1拮抗剂ZT-1a、布美他尼
①ZT-1a的制备：称量1.5mg ZT-1a至5mL离心管中，溶于360μLDMSO，加入等体积的蓖麻油，充分混匀后，再加入1680μL PBS溶液，再次充分混匀，制成终浓度为0.625mg/mL的ZT-1a；在每天相同时间点根据小鼠体重腹腔注射ZT-1a，注射量为5mg/kg；
②布美他尼的制备：称量1.5mg布美他尼至5mL离心管中，溶于375μL DMSO中，再加入2025μL生理盐水，充分混合，制成终浓度为0.625mg/mL的布美他尼；在每天相同时间点根据小鼠体重腹腔注射布美他尼，注射量为5mg/kg。
在明确ZT-1a对EAE的保护作用后，我们在EAE病理评分高峰期取脉络丛、脊髓组织进行染色。同时，我们通过免疫荧光染色检测T淋巴细胞免疫浸润程度是否受到影响并还对脊髓组织进行免疫荧光染色，
此外，我们通过流式细胞术的方法检测脑脊液和脊髓中浸润的免疫细胞的数量变化和类型。
(二)实验结果
结果发现EAE诱导后隔天腹腔注射给药布美他尼(第0天开始)并不能改善小鼠的病理损伤程度，神经功能缺损评分没有显著性差异(图6A)。进一步说明药物想要对EAE起作用需要通过血脑屏障。EAE诱导后腹腔注射SPAK拮抗剂ZT-1a，发现隔天腹腔给药(第0天开始)可以改善小鼠的病理损伤程度，两组间的神经功能缺损评分有显著性差异(图6B)。
脊髓的HE染色可见炎症细胞病理改变明显减轻(图6C、6D)，免疫荧光染色可见脱髓鞘程度大幅度改善(图6E、6F(兔抗MBP抗体、小鼠抗NF-H抗体，Cell SignalingTechnology；抗兔488二抗，抗小鼠594二抗，Invitrogen))。
T淋巴细胞的免疫荧光染色结果提示，ZT-1a大幅度降低了CD4+T淋巴细胞在脊髓(图6G、6H(大鼠抗CD4抗体，抗大鼠594二抗，Invitrogen))、脉络丛处(图6I、6J(大鼠抗CD4抗体，抗大鼠594二抗，Invitrogen))浸润的数量。
对脊髓组织的免疫荧光染色结果显示，ZT-1a明显抑制脊髓巨噬细胞、小胶质细胞活化(图6K、6L(大鼠抗CD68抗体，Bio-Rad；兔抗Iba1抗体，Wako；抗大鼠594二抗，抗兔488二抗，Invitrogen))，小胶质细胞3D重建可见相较于对照溶剂组，ZT-1a给药后小胶质细胞胞体直径变小，细胞突触分支数目增多，分支长度变长(图6M、6N(兔抗Iba1抗体，Wako；抗兔488二抗，Invitrogen))。说明ZT-1a可通过抑制SPAK信号有效减少免疫细胞在脉络丛及脊髓的聚集，明显改善EAE的疾病严重程度。
流式细胞术的结果分析发现，ZT-1a处理组免疫细胞明显减少(图7A～7G)。再次说明ZT-1a可逆转EAE病理程度。
实施例6靶向抑制脉络丛MMP信号对EAE具有保护作用
(一)实验方法
此前我们已经说明靶向抑制脉络丛SPAK对MMP2、MMP9具有抑制作用，为进一步研究MMP2、MMP9对EAE的影响，我们分别对小鼠进行侧脑室注射对照病毒(rAAV2/5-U6-Scramble-CMV-EGFP)、MMP2敲减病毒(MMP2-Kd，rAAV2/5-CMV-MMP2-Kd)、MMP9敲减病毒(MMP9-Kd，rAAV2/5-CMV-MMP9-Kd)及MMP2/9双敲减病毒(MMP2/9-Kd，rAAV2/5-CMV-MMP2/9-Kd)，达到靶向抑制脉络丛MMP2、MMP9、MMP2/9的目的，2周后均进行EAE造模。在EAE病理评分高峰期取脊髓组织进行免疫荧光染色。
(二)实验结果
结果发现，相较于侧脑室注射对照病毒，侧脑室注射MMP2敲减病毒、MMP9敲减病毒、MMP2/9双敲减病毒处理组的疾病严重程度大幅度减轻，神经功能缺损评分明显降低，且双敲减病毒处理组的发病时间延迟、疾病改善程度最明显(图8A)。
在EAE病理评分高峰期取脊髓组织进行免疫荧光染色，结果发现，侧脑室注射MMP2敲减病毒、MMP9敲减病毒、MMP2/9双敲减病毒后明显抑制脊髓巨噬细胞、小胶质细胞活化(图8B、8C)，脊髓的脱髓鞘程度大幅度改善(图8D、8E)。
脊髓的HE染色可见炎症细胞病理改变明显减轻(图8F、8G)。说明靶向抑制脉络丛MMP信号可有效减少免疫细胞在脊髓的聚集，明显改善EAE的疾病严重程度。
实施例7脉络丛特异性过表达SPAK加重EAE病理
(一)实验方法
我们已经证实靶向抑制脉络丛SPAK可以改善EAE病理，为进一步确定SPAK信号的作用，我们诱导SPAK在脉络丛过表达，反向论证SPAK对EAE的影响。我们分别对小鼠进行侧脑室注射对照病毒、SPAK过表达病毒(SPAK-OE，rAAV2/5-CMV-SPAK-OE)，达到脉络丛特异性过表达SPAK的目的，2周后均进行EAE造模。
(二)实验结果
结果发现，相较于侧脑室注射对照病毒，侧脑室注射SPAK过表达病毒处理组的疾病严重程度加重(图9A)。在EAE病理评分高峰期取脊髓组织进行免疫荧光染色。结果发现，脉络丛SPAK过表达后明显加重脊髓巨噬细胞、小胶质细胞活化(图9B、9C)，加重脊髓的脱髓鞘程度(图9D、9E)。脊髓的HE染色可见炎症细胞病理改变增加(图9F、9G)。说明脉络丛特异性过表达SPAK可进一步强化免疫细胞在脊髓的聚集，加重EAE的疾病严重程度。

Claims (7)

1.一种医药组合物在制备用于治疗多发性硬化药物中的应用，其特征在于：所述医药组合物包括SPAK激酶的抑制剂、降低SPAK激酶表达的下调剂、降低MMP2表达的下调剂和降低MMP9中表达的下调剂中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述SPAK激酶的抑制剂包括ZT-1a。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述ZT-1a的给药方式为腹腔注射。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述医药组合物包括降低MMP2表达的下调剂和降低MMP9中表达的下调剂。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述降低SPAK激酶表达的下调剂包括抑制SPAK激酶表达的活性肽、蛋白、寡核苷酸和小分子化合物中的至少一种。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述降低MMP2表达的下调剂包括抑制MMP2表达的活性肽、蛋白、寡核苷酸和小分子化合物中的至少一种。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述降低MMP9激酶表达的下调剂包括抑制MMP9表达的活性肽、蛋白、寡核苷酸和小分子化合物中的至少一种。
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110171291A1 (en) * 2010-01-07 2011-07-14 Sanford-Burnham Medical Research Institute Pathologically-activated therapeutics
US20190359730A1 (en) * 2016-12-16 2019-11-28 Universite de Bordeaux Mmp9 inhibitors and uses thereof in the prevention or treatment of a depigmenting disorder
US20220313632A1 (en) * 2021-03-26 2022-10-06 United States Government As Represented By The Department Of Veterans Affairs Use of ZT-1A and Analogs Thereof to Prevent and/or Treat Neurodegenerative and Neurocognitive Disorders
WO2023015169A1 (en) * 2021-08-02 2023-02-09 Tavotek Biotech (Suzhou) Ltd Anti-cdh17 monoclonal and bispecific antibodies and uses thereof
CN117751144A (zh) * 2021-08-02 2024-03-22 杭州优诺健生物科技有限公司 抗cd38抗体、抗cd3抗体和双特异性抗体以及它们的用途

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110171291A1 (en) * 2010-01-07 2011-07-14 Sanford-Burnham Medical Research Institute Pathologically-activated therapeutics
US20190359730A1 (en) * 2016-12-16 2019-11-28 Universite de Bordeaux Mmp9 inhibitors and uses thereof in the prevention or treatment of a depigmenting disorder
US20220313632A1 (en) * 2021-03-26 2022-10-06 United States Government As Represented By The Department Of Veterans Affairs Use of ZT-1A and Analogs Thereof to Prevent and/or Treat Neurodegenerative and Neurocognitive Disorders
WO2023015169A1 (en) * 2021-08-02 2023-02-09 Tavotek Biotech (Suzhou) Ltd Anti-cdh17 monoclonal and bispecific antibodies and uses thereof
CN117751144A (zh) * 2021-08-02 2024-03-22 杭州优诺健生物科技有限公司 抗cd38抗体、抗cd3抗体和双特异性抗体以及它们的用途

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