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CN119162181A - 一种用于提高外源基因在植物种子中表达量的重组启动子及方法 - Google Patents

一种用于提高外源基因在植物种子中表达量的重组启动子及方法 Download PDF

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CN119162181A
CN119162181A CN202411490903.2A CN202411490903A CN119162181A CN 119162181 A CN119162181 A CN 119162181A CN 202411490903 A CN202411490903 A CN 202411490903A CN 119162181 A CN119162181 A CN 119162181A
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林朝阳
何逸洋
佘明君
赵宇
余媛美
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Anhui Meirui Biotechnology Co ltd
Zhejiang University ZJU
Original Assignee
Anhui Meirui Biotechnology Co ltd
Zhejiang University ZJU
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Abstract

本发明公开了一种用于提高外源基因在植物种子中表达量的重组启动子及方法，本发明通过将抑制种子贮藏蛋白表达的序列添加至启动子与外源基因之间，实现在种子中特异性表达外源重组蛋白的同时抑制种子中贮藏蛋白的表达，营造更适宜外源蛋白表达和积累的环境，提高外源重组蛋白在植物种子中的表达量，降低植物生产重组蛋白的成本。

Description

一种用于提高外源基因在植物种子中表达量的重组启动子及 方法
(一)技术领域
本发明属于植物分子生物学领域，涉及一种能够提高外源蛋白在植物种子中表达量的重组启动子及方法。
(二)背景技术
应用植物生产重组蛋白是规模化生产重组蛋白的新方法，当前已经有亲和素(Avidin)、胰蛋白酶(Trypzean)、漆酶(Laccase)、乳铁蛋白(Lacromin)和溶菌酶等多种在植物中生产的重组蛋白实现商业化应用。植物具有容易扩大规模、产能弹性大、硬件要求低等优点，但重组蛋白表达量往往不如传统的细胞培养和微生物发酵，因此只有提高植物中重组蛋白表达量，才能够更大程度发挥植物生产重组蛋白的优势。
种子被认为是植物生产和储存重组蛋白的理想场所，种子具有更高的蛋白生产潜力，而且干燥状态下的种子处于代谢惰性状态，种子中的蛋白质可以稳定储存较长时间。如何提高重组蛋白在种子中的表达量在推动植物源重组蛋白的商业化应用至关重要。
影响种子中蛋白表达的因素有很多，比如：转录水平、翻译效率、重组蛋白修饰和定位等等。为了提高种子中重组蛋白的表达量，往往需要同时对转录、翻译、转运和积累等各个方面进行优化设计。比如转录水平的优化主要是通过筛选高表达的启动子，并改变启动子拷贝数、顺式作用元件、转录因子结合间距及核心启动子序列等要素，获得驱动目标基因高水平转录的人工启动子(赵婉彤等，分子植物育种，2019,17(22)：7377-7358)。通过优化密码子提高提高翻译效率；设计信号肽或亚细胞定位序列改善重组蛋白的转运、定位和积累。这一系列的优化为种子中重组蛋白的表达提供更稳定的条件，但是种子中蛋白总量相当稳定，表达重组蛋白需要和其它贮藏蛋白竞争资源，研究显示抑制种子中贮藏蛋白合成后，游离氨基酸或氮源会增加，并重新分配用于合成其他蛋白质，从而实现种子中蛋白质总量的平衡。因此将降低种子中贮藏蛋白表达与提高重组蛋白表达设计相结合，营造更适宜重组蛋白表达的环境，能够提高重组蛋白表达量、降低重组蛋白生产成本，提高植物生产重组蛋白的竞争力。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种用于提高植物种子中外源蛋白表达量的重组启动子及方法，所述重组启动子在种子中特异性表达外源蛋白的同时能够抑制种子贮藏蛋白基因的表达，实现外源蛋白在种子中高水平表达和积累。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种用于提高外源基因在植物种子中表达水平的重组启动子，所述重组启动子由启动外源基因在植物中表达的启动子序列和抑制种子贮藏蛋白基因表达的核酸序列两部分功能性连接而成。
本发明所述抑制种子贮藏蛋白基因表达的序列为本领域技术人员根据贮藏蛋白基因核苷酸序列设计的可以抑制贮藏蛋白基因表达的重组核苷酸序列。所述抑制贮藏蛋白基因表达的核苷酸序列连接在启动子和外源基因之间。
进一步，所述种子贮藏蛋白包括玉米19kDa和22kDa醇溶蛋白，抑制种子贮藏蛋白基因表达的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
进一步，启动子包括种子特异性启动子及本领域公知的能够启动外源基因在植物中表达的启动子，比如水稻谷蛋白启动子，核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示。所述外源蛋白包括各种能够在植物种子中表达的蛋白，比如脂肪酶蛋白。
本发明还提供一种所述重组启动子提高外源基因在种子中表达水平的方法，所述方法是将含有重组启动子的外源基因表达框转入植物基因组，筛选外源蛋白表达显著提高的种子。
进一步，所述外源基因表达框从5’端到3’端依次由启动外源基因表达的启动子、抑制种子贮藏蛋白基因表达的核酸序列、外源基因和终止子功能性连接构成。所述外源基因表达框还可以与筛选标记基因表达框一起转入植物基因组，所述筛选标记基因表达框采用本领域公知的表达框即可。
本发明方法适用各种利用植物种子表达外源蛋白的情况，能够启动外源基因表达以及抑制贮藏蛋白表达的序列组合均在本发明保护范围内。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明通过将抑制种子贮藏蛋白基因表达的序列添加至启动子与外源基因之间，对启动外源基因在植物中表达的种子特异性启动子进行改造设计，将结合了抑制种子贮藏蛋白基因表达序列的人工合成启动子构建的外源重组蛋白表达框转入植物基因组中，实现在种子中特异性表达外源基因的同时抑制种子中贮藏蛋白基因的表达，营造更适宜外源蛋白表达和积累的环境，提高外源蛋白在植物种子中的表达量，降低植物生产重组蛋白的成本。
(四)附图说明
图1、GI-L载体图谱。
图2、G-L载体图谱。
图3、种子全蛋白电泳图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
本发明以下实施例中所使用的分子生物学和生物化学方法均为已知的技术。在Ausubel编写的John Wiley and Sons公司出版的Current Protocols in MolecularBiology，和J.Sambrook等编写的Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)出版的Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd ED.等文献均有详细的说明。
实施例1：启动子、抑制种子贮藏蛋白表达序列的获得
人工合成水稻谷蛋白启动子，核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。根据玉米α-醇溶蛋白核苷酸序列(NCBI编号NM_001112530.2，22kDa)和α-醇溶蛋白核苷酸序列(NCBI编号NM_001112275.2，19kDa)设计含有抑制玉米α-醇溶蛋白表达的5’端非编码重组核苷酸，核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
实施例2：构建植物转化质粒载体
人工合成转化筛选标记基因抗草甘膦表达框，核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。根据疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)脂肪酶蛋白序列(NCBI编号：O59952.1)密码子优化后人工合成含终止子序列的重组脂肪酶基因，核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。以植物转化载体pCambia1300(GenBank:AF234296.1)为载体框架，用HindⅢ/XhoⅠ双酶切去除载体中潮霉素筛选标记基因，通过同源重组方法将水稻谷蛋白启动子(SEQ ID NO：1)、5’端非编码核苷酸(SEQ ID NO：2)、目的基因(SEQ ID NO：4)和抗草甘膦表达框(SEQ ID NO：3)连入转化载体中，获得植物转化载体GI-L(图1)；以植物转化载体pCambia1300(GenBank:AF234296.1)为载体框架，用HindⅢ/XhoⅠ双酶切去除载体中潮霉素筛选标记基因，通过同源重组方法将水稻谷蛋白启动子(SEQ ID NO：1)、目的基因(SEQ ID NO：4)和抗草甘膦表达框(SEQ ID NO：3)连入转化载体中，获得启动子不含5’端非编码核苷酸的植物转化载体G-L(图2)；电击法导入农杆菌LBA4404中，分别获得含有转化载体GI-L和G-L的农杆菌。
实施例3：转基因玉米获得
采用农杆菌介导进行玉米遗传转化，具体根据Frame等(Plant Physiol,2002,129:13-22)报道的方法和培养基配方进行转化，使用草甘膦为筛选试剂，步骤如下：玉米自交系A188授粉后8～10天的玉米穗用于遗传转化，收集大小为1.0-1.5mm未成熟胚。将含有转化载体的农杆菌与未成熟胚在22℃共培养3天。共培养后的未成熟胚转移到含有终浓度200mg/L特美汀抗生素(葛兰素史克，美国)的培养基上诱导愈伤组织，28℃暗培养14天。然后转移到含有2mM草甘膦的筛选培养基上，28℃暗培养，每3周继代培育。将筛选获得的抗性组织转到再生培养基上，28℃暗培养14天后转移到新鲜的再生培养基上，26℃光照培养10-14天后转移到生根培养基上，26℃光照培养直到根发育完全，将生根后的再生苗移植到温室中，以非转基因自交系A188为父本，转基因T0代为母本杂交授粉，收获GI-L转化体158个，G-L转化体182个。
实施例4：重组蛋白表达量分析
将收获的转基因种子每个转化体选3粒种子，分别称重后单粒研磨匀浆，离心取上清用CP4-EPSPS试纸条(上海佑隆，货号AA0832-BGB)检测显示阳性的样品用于脂肪酶活性测试，筛选高酶活的转化体。以自交系A188种子为空白对照，以商业酶TLL(诺维信，Lipozyme TL100L，cas号：9001-62-1)为阳性对照。
酶提取液上清稀释100倍后用于酶活性检测，以对硝基苯酚丁酸酯(p-NPB)为底物，根据江慧芳(化学与生物工程2007.24(8).8(24)72-75)中的方法测定和计算酶活性，取50μL p-NPB底物溶液，50μL稀释后的酶液和900μL反应缓冲液，45℃水浴反应5min，405nm测定吸光度，对照标准曲线算出生产的对硝基苯酚浓度，进而计算出酶活力。酶活性分析结果显示转GI-L的转基因玉米酶活性普遍高于转G-L载体的转基因玉米，筛选获得的酶活性最高的5个转化体如表1所示。
表1转基因玉米种子脂肪酶活性
转化体名称 平均酶活性(单位/克)
GI-L15 58.52±3.35
GI-L4 39.61±4.32
GI-L78 25.53±3.22
GI-L36 18.62±3.37
GI-L21 11.34±1.27
G-L8 22.12±2.25
G-L2 9.24±1.12
G-L65 5.13±0.97
G-L19 4.26±0.25
G-L82 4.32±0.34
CK(A188) 0.06±0.01
TLL(Lipozyme TL100L) 231.21±8.33
实施例5：转基因种子蛋白组成分析
取酶活性最高转化体GI-L15、GI-L4、G-L8和G-L2转化体种子单粒称重后用1倍的蛋白电泳上样缓冲液匀浆提取种子全蛋白，CP4-EPSPS试纸条(上海佑隆，货号AA0832-BGB)检测显示阳性的样品沸水煮10分钟后用于蛋白电泳，SDS电泳结果显示，不含有抑制醇溶蛋白表达的5’端非编码核苷酸的G-L2和G-L8转化体中高表达19kDa和22kDa醇溶蛋白，外源重组蛋白条带明显弱于GI-L4和GI-L15，GI-L4和GI-L15中19kDa和22kDa大小的醇溶蛋白条带基本缺失，说明应用本发明的提供的含有抑制醇溶蛋白表达的启动子能够降低醇溶蛋白表达的同时提高外源蛋白的表达(图3)。

Claims (6)

1.一种用于提高植物种子中外源蛋白表达量的重组启动子，其特征在于，所述重组启动子由启动外源基因在植物中表达的启动子序列和抑制种子贮藏蛋白基因表达的核酸序列两部分功能性连接而成。
2.如权利要求1所述的重组启动子，其特征在于，所述抑制贮藏蛋白基因表达的核苷酸序列连接在启动子和外源基因之间。
3.如权利要求1所述的重组启动子，其特征在于，所述种子贮藏蛋白包括玉米19kDa和22kDa醇溶蛋白。
4.如权利要求1所述的重组启动子，其特征在于，抑制种子贮藏蛋白基因表达的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
5.一种权利要求1所述重组启动子提高外源基因在种子中表达量的方法，其特征在于，所述方法是将含有重组启动子的外源基因表达框转入植物基因组，筛选外源蛋白表达显著提高的种子。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述外源基因表达框从5’端到3’端依次由启动外源基因表达的启动子、抑制种子贮藏蛋白基因表达的核酸序列、外源基因和终止子功能性连接构成。
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