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CN119161440A - 耐盐碱相关的转录因子LcbZIP46及其编码基因与应用 - Google Patents

耐盐碱相关的转录因子LcbZIP46及其编码基因与应用 Download PDF

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CN119161440A
CN119161440A CN202411695932.2A CN202411695932A CN119161440A CN 119161440 A CN119161440 A CN 119161440A CN 202411695932 A CN202411695932 A CN 202411695932A CN 119161440 A CN119161440 A CN 119161440A
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salt
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Abstract

本发明公开了一种耐盐碱相关的转录因子LcbZIP46及其编码基因与应用。耐盐碱相关的转录因子LcbZIP46，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。耐盐碱相关的转录因子LcbZIP46的编码基因，其核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示。本发明还包括含有耐盐碱相关的转录因子LcbZIP46的编码基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系、转基因植物组织、转基因植物器官或重组菌体。本发明所提供的LcbZIP46蛋白可以调控植物抗盐碱胁迫能力，受盐碱胁迫诱导，可以参与羊草对盐碱胁迫的响应，提高植物的抗盐碱性，可应用于农作物与重要畜牧草所需的抗盐碱新品种的培育。

Description

耐盐碱相关的转录因子LcbZIP46及其编码基因与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种耐盐碱相关的转录因子LcbZIP46及其编码基因与应用。
背景技术
世界上有10亿hm2的盐渍化土壤，我国是世界上盐碱土壤面积第三大的国家，其中松嫩平原的苏打盐碱地，是世界上三大苏打盐渍化土壤分布区之一。随着全球气候环境的变化及人类活动的影响，土地盐碱化趋势日益严峻，盐碱化土壤严重制约植物的生长发育，造成农作物减产，限制了农牧业的发展，甚至影响世界粮食安全。开展耐盐碱植物种质资源的挖掘及耐盐碱机制研究，对植物耐盐碱抗性育种具有重要意义。
植物生长发育受到土壤盐渍化等逆境因素的不利影响，植物细胞会感知环境中的胁迫信号，并通过信号转导，表现出特定的生理、代谢以及基因表达的变化，从而产生抗逆性。植物脱落酸（Abscisic acid, ABA）是调节植物生长发育和各类非生物胁迫响应的重要植物激素。ABA依赖的信号转导途径是植物对盐碱胁迫响应的主要信号转导途径。胁迫信号的传递调节气孔开放，激活转录因子与下游靶基因启动子区域的顺式作用元件的相互结合，调控下游盐碱胁迫相关基因表达，从而增强植物抗逆性。脱落酸作为一种关键的胁迫内源信使，参与对多种生物胁迫及非生物胁迫的响应。针对模式植物拟南芥和水稻的转录表达研究表明，基因组中5-10%的基因受ABA、干旱、盐碱和低温胁迫调节，且一半以上基因为ABA、干旱、盐胁迫响应共有。
大部分bZIP基因在受到非生物胁迫条件诱导表达时，它们有的对胁迫环境响应起负调控作用，有的可作为积极调节因子参与植物对应激的响应。bZIP转录因子可与下游基因启动子区的ABRE、G-box（CACGTG）等顺式作用元件结合，调控下游基因表达，从而参与盐碱、干旱等多种非生物胁迫。
羊草作为松嫩平原原始自然植被的优势种群，常年生长于含有Na+、Cl-、HCO3-、CO32-等盐分离子的盐碱化土壤环境中，进化出了极强的耐盐碱性，富含耐盐碱基因资源。开展羊草种质资源耐盐碱性研究具有重要意义。挖掘羊草中耐盐碱基因，并探索其耐盐碱分子机理，可为植物抗盐碱基因工程育种提供技术基础。
国内外学者已从分子生物学角度深入探讨羊草对非生物逆境胁迫的适应机理与抗逆机制，并挖掘了许多与抗逆相关的基因。前人研究发现，羊草对干旱、盐碱、低温等非生物逆境胁迫的应答网络中，有诸多转录因子的参与，其中羊草WRKY、DREB、MADS-box、AP2/ERF、MYB 、NAC转录因子在非生物胁迫响应中的功能均已有所报道，但bZIP家族转录因子在羊草盐碱胁迫抗性调控中的研究鲜有报道。
因此，现有技术中亟需一种参与盐碱胁迫应答的羊草bZIP转录因子、其编码基因及其在培育增强抗盐碱性转基因植物中的应用。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的不足，提供一种耐盐碱相关的转录因子LcbZIP46、耐盐碱相关的转录因子LcbZIP46的编码基因及转录因子LcbZIP46或其编码基因在培育增强抗盐碱性转基因植物中的应用。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：本发明首先挖掘到一种来源于耐盐碱植物羊草（Leymus Chinensis（Trin.）Tzvel）的，被盐碱胁迫强烈诱导的转录因子，标记为LcbZIP46，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。耐盐碱相关的转录因子LcbZIP46的编码基因，其核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示。
为了使序列SEQ ID No.1中的蛋白质便于纯化和检测，可在由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上特异性的标签抗体。
SEQ ID No.1所示的LcbZIP46蛋白质可以人工合成，也可以先合成其编码基因再进行生物表达得到。
序列SEQ ID No.1中的LcbZIP46蛋白质的编码基因可以通过SEQ ID No.2的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上编码序列得到。
本发明还涉及编码LcbZIP46蛋白质的核酸分子。
本发明还涉及含有所述核酸分子的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系、转基因植物组织、转基因植物器官或重组菌体这些生物材料。
上述生物材料中，所述核酸分子可为如下b1)、b2)、b3)或b4)：
b1)编码序列是序列表中序列SEQ ID No.2的cDNA分子或DNA分子；
b2)核苷酸序列是序列表中序列SEQ ID No.2的cDNA分子或DNA分子；
b3)与b1)或b2)限定的核苷酸序列具有94.54%以上同源性，且编码LcbZIP46的cDNA分子或基因组DNA分子；
b4)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码LcbZIP46的cDNA分子或基因组DNA分子。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码LcbZIP46蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的LcbZIP46蛋白质的核苷酸序列94.54%更高同源性的核苷酸，只要编码LcbZIP46蛋白质且具有LcbZIP46蛋白质功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
本发明还涉及转录因子LcbZIP46或编码基因在培育增强抗盐碱性转基因植物中的应用。
所述植物为拟南芥或水稻。
本发明还涉及含有耐盐碱相关的转录因子LcbZIP46的编码基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系、转基因植物组织、转基因植物器官或重组菌体在培育增强抗盐碱性转基因植物中的应用。
上述应用中，所述重组表达载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述重组表达载体具体可为pHB-LcbZIP46、pBWA(V)HS-LcbZIP46-3×flag或pBWA(V)HS-LcbZIP46-Glosgfp，所述pHB-LcbZIP46为将pHB的HindIII和BamHⅠ识别序列间的DNA片段替换为序列SEQ ID No.2所示的DNA片段导得到的重组载体，所述pHB-LcbZIP46能表达序列SEQ IDNo.1所示的LcbZIP46蛋白质；所述pBWA(V)HS-LcbZIP46-3×flag或pBWA(V)HS-LcbZIP46-Glosgfp为将pBWA(V)HS载体的BsaI和Eco31I识别序列间的DNA片段替换为序列SEQ IDNo.2所示的DNA片段，并连接3×flag标签或Glosgfp标签得到的重组载体，所述pBWA(V)HS-LcbZIP46-3×flag能表达LcbZIP46融合3×flag标签的融合蛋白质，pBWA(V)HS-LcbZIP46-Glosgfp能表达LcbZIP46融合GFP标签的融合蛋白质。
上述应用中所述的含有编码LcbZIP46蛋白质的核酸分子的表达盒（LcbZIP46基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达LcbZIP46蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动LcbZIP46基因转录的启动子，还可包括终止LcbZIP46基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列，如翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以表型筛选转化植株。
可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，及诱导型启动子。可用现有的表达载体构建含有所述LcbZIP46基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于基因枪法的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。
上述应用中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可为农杆菌或大肠杆菌，如农杆菌EHA105，GV3101，大肠杆菌DH5α，BL21（DE3）。
所述重组表达载体可通过使用Ti质粒，植物病毒栽体，直接DNA转化，微注射，电穿孔这些常规生物技术方法导入植物细胞。
上述应用中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。
本发明涉及植物抗盐碱产品，所述产品含有LcbZIP46或所述生物材料。
所述植物抗盐碱产品可以为LcbZIP46或所述生物材料作为其活性成分，还可以将LcbZIP46或所述生物材料与其他具有植物抗盐碱作用的物质一起作为其活性成分。
本发明还提供LcbZIP46或所述生物材料的下述任一应用：
C1)在调控植物抗盐碱性中的应用；
C2)在制备调控植物抗盐碱性产品中的应用；
C3)在提高植物抗盐碱性中的应用；
C4)在制备提高植物抗盐碱性产品中的应用；
C5)在培育抗盐碱性增强植物中的应用。
本发明提到的在培育增强抗盐碱性转基因植物中的应用，包括：增加目的植物中LcbZIP46的活性、增加目的植物中LcbZIP46的含量或促进LcbZIP46的编码基因的表达，得到与所述目的植物相比抗盐碱性增强的抗盐碱植物。
上述方法中，所述抗盐碱植物是通过向所述目的植物中导入LcbZIP46的编码基因得到。
所述植物，可为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物具体可为拟南芥，如哥伦比亚生态型（Col-0）拟南芥。所述单子叶植物具体可为水稻，如日本晴水稻（Nipponbare）。
LcbZIP46的编码基因可为所述核酸分子。
其中所述LcbZIP46编码基因可先进行如下修饰，再导入目的植物中，以达到更好的表达效果：
1)根据实际需要进行修饰和优化，以使基因高效表达；例如，可根据目的植物所偏爱的密码子，在保持本发明所述LcbZIP46的编码基因的氨基酸序列的同时改变其密码子以符合植物偏好性；
2)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；
3)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；
4)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；
所述抗盐碱植物理解为不仅包含将所述LcbZIP46的编码基因转化目的植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述抗盐碱植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
在本发明中，以上的所述抗盐碱可体现为抗30mM NaCl+3mM NaHCO350mM NaCl+5mM NaHCO3，70mM NaCl+7mM NaHCO3胁迫处理。
本发明的有益效果是：本发明所提供的LcbZIP46蛋白可以调控植物抗盐碱胁迫能力，受盐碱胁迫诱导，可以参与羊草对盐碱胁迫的响应，提高植物的抗盐碱性，LcbZIP46及其编码基因可用于农作物与重要畜牧草所需的抗盐碱新品种的培育。
附图说明
图1是西乌珠穆沁羊草总RNA的琼脂糖凝胶电泳图；
图2是西乌珠穆沁羊草中LcbZIP46基因的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图；
图3是羊草中LcbZIP46基因在盐碱胁迫条件下的相对表达量分析；
图4是LcbZIP46基因在羊草不同组织中的表达量分析；
图5是pBWA(V)HS- -Glosgfp空载体在小麦原生质体中瞬时表达的激光共聚焦/TIRF显微镜图；
图6是pBWA(V)HS-LcbZIP46-Glosgfp融合表达载体在小麦原生质体中瞬时表达的激光共聚焦/TIRF显微镜图；
图7是转LcbZIP46基因拟南芥植物的PCR检测结果；
图8是转LcbZIP46基因水稻植株的PCR检测结果；
图9是T3代转LcbZIP46基因拟南芥萌发期的抗盐碱性检测结果；
图10是T3代转LcbZIP46基因拟南芥株系与野生型拟南芥在盐碱胁迫下的根长实验结果；
图11是T3代转LcbZIP46基因水稻株系与野生型水稻在盐碱胁迫下的根长实验结果。
具体实施方式
以下结合附图对本发明作详细描述。
本发明提供了一种来源于羊草(Leymus chinensis(Trin .)Tzvel .)品种西乌珠穆沁羊草的抗盐碱相关转录因子，其名称为LcbZIP46，其氨基酸序列如SEQ ID No .1所示。耐盐碱相关的转录因子LcbZIP46的编码基因序列如SEQ IDNo .2所示。
本发明的以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA的3′末端核苷酸。
实施例1 羊草LcbZIP46基因的克隆及CDS序列的获得
1、将三叶期的西乌珠穆沁羊草幼苗，用100mM NaCl和200mM NaHCO3混合溶液胁迫处理2h。取胁迫后的羊草植株幼叶，立即液氮冷冻，-80℃保存备用。
2、采用TRIzol法提取步骤1中羊草植株幼叶总RNA。采用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA质量。结果如图1所示，RNA显示两条明显的电泳条带，从上到下依次为28S RNA和18SRNA。结果表明，获得了纯度较高、较完整的总RNA。
3、采用天根（Tiangen）的Fast King RT Mix试剂进行cDNA的合成：取2μg 步骤2中提取的总RNA作为模板，加入4μL 的5×Fast King RT Mix，加ddH2O至20μL。反转录反应条件为：42℃，15min；95℃，3min（酶灭活）。
4、以步骤3得到的cDNA为模板，用Q5酶进行PCR扩增，扩增反应体系见表3-1，反应程序见表3-2。PCR扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示，所用引物如下：
LcbZIP46cds-F：ATGGAGATGCCGGGAGGGAGC（如SEQ IDNo .3所示）
LcbZIP46cds-R：CTAAACTGGAAGTGTCAGATCACATCAACGAATAAAGTACAACAT（如SEQIDNo .4所示）
表3-1 PCR扩增反应体系
组分（Component） 用量（Volume）（μL）
ddH2O 16.25
5× Q5 反应缓冲液 5
Q5高保真DNA聚合酶 0.25
引物(+)(10μM) 1.25
引物(-)(10μM) 1.25
模板DNA 1
总体积 25
表3-2 PCR扩增反应程序
温度（Temperature） 时间（Time） 循环数（Cycles）
98℃ 30 sec 1
98℃ 5-10 sec 30
50℃ 10-30 sec 30
72℃ 30 sec 30
72℃ 2 min 1
10℃ 30 min 1
5、用Tiangen的DNA胶回收试剂盒回收目的片段。成功扩增到LcbZIP46的cDNA全长。
6、将上述扩增获得的目的片段，通过Sangon的零背景TOPO Blunt平末端克隆试剂盒，连接到DH5α感受态细胞。挑选阳性单克隆菌株进行测序，确认LcbZIP46基因CDS序列。
实施例2 羊草LcbZIP46基因的胁迫条件下及组织特异性的表达分析
1、胁迫条件下的表达分析
西乌珠穆沁羊草种子在培养室内萌发至三叶期，羊草幼苗采用100mM NaCl和200mM NaHCO3混合溶液进行盐碱胁迫处理；处理时间设0h（CK）、2h、6h、12h、24h、48h、72h七个梯度。取胁迫后的羊草植株幼叶，提取总RNA，以羊草Actin基因为内参，使用SangonBiotech的2×SG Fast qPCR Master Mix（Low Rox）试剂盒通过qRT-PCR方法分析LcbZIP46基因的表达模式，使用2-ΔΔCt法计算基因的相对表达量。结果如图3所示（将0h时LcbZIP46基因的表达量设定为1），LcbZIP46基因受盐碱胁迫的诱导，转录水平在胁迫2h后剧烈上升，随着胁迫时间延长，胁迫6h后，LcbZIP46的表达量回落至正常水平，表明LcbZIP46在盐碱胁迫初期受到显著诱导。所用引物如下：
LcbZIP46-qF：TCAGGGCAATGTGGTCGC（如SEQ IDNo .5所示）
LcbZIP46-qR：TCTTCCCAAACCCATTCAGC（如SEQ IDNo .6所示）
LcActin-F：TGTCAGCCATACTGTGCCAATC（如SEQ IDNo .7所示）
LcActin-R：CCCGTTCAGCAGTCGTGGT（如SEQ IDNo .8所示）
2、组织特异性的表达分析
取2年生西乌珠穆沁羊草植株初花期的根、根茎芽、茎、叶、叶鞘、旗叶、幼穗组织，提取总RNA，通过qRT-PCR方法分析LcbZIP46组织特异性表达分析。结果如图4所示（将根中LcbZIP46基因的表达量设定为1），LcbZIP46在羊草各组织中的表达量存在差异，在穗中表达量最高。
实施例3 LcbZIP46基因的亚细胞定位
1、以实施例1所得的测序正确的阳性克隆质粒为模板，扩增LcbZIP46的ORF区域，所用引物如下：
LcbZIP46-GFP-F: atttggagagaacacgggggactttgcaacatggagatgccgggagggagcgggg（如SEQ IDNo .9所示）
LcbZIP46-GFP-R: ggaaccactccctgaagcggccgctgtacaccatggacccgtcagtgttcgtcgc（如SEQ IDNo .10所示）
PCR扩增反应体系如表3-3所示，反应程序如表3-4所示。
表3-3 PCR扩增反应体系
组分（Component） 用量（Volume）（μL）
ddH2O 20
PCR Mix 25
引物(+)(10μM) 2
引物(-)(10μM) 2
模板DNA 1
总体积 50
表3-4 PCR扩增反应程序
温度（Temperature） 时间（Time） 循环数（Cycles）
94℃ 5 min 1
94℃ 30 sec 30
50℃ 45 sec 30
72℃ 62 sec 30
72℃ 10 min 1
16℃ 30 min 1
将PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳，5v/cm电压，20分钟，将LcbZIP46的电泳片段在紫外灯下切胶并用Tiangen的DNA胶回收试剂盒回收，具体见厂家的试剂盒说明书。用总体积40μL的无菌水溶解回收DNA，检测无误后用于载体重组。
2、将含SEQ IDNo .2序列所示LcbZIP46基因的回收产物连接到含GFP（Greenfluorescence protein）的pBWA(V)HS载体，并利用BsaI/Eco31I进行酶切，将载体酶切产物和回收片段酶切产物共同用PCR纯化试剂盒纯化。按表3-5所示酶切连接体系，37℃下消化1h。将载体酶切产物用PCR纯化试剂盒纯化（纯化产物标记为GFP（D）），按表3-6的反应体系37℃重组30h，将连接产物转化感受态细胞。
表3-5载体酶切PCR反应体系
组分（Component） 用量（Volume）（μL）
ddH2O 13
10×Buffer 2
BsaI/Eco31I 1
pBWA(V)HS-ccdb-Glosgfp 4
总体积 20
表3-6 重组PCR反应体系
组分（Component） 用量（Volume）（μL）
2×EasyClone Mix 10
PCR 回收产物 5
GFP(D) 5
总体积 20
3、将5-10μL连接产物转化感受态细胞，转化至含卡纳霉素的抗性平板，37℃培养12h。挑取10个菌斑进行菌落PCR鉴定。鉴定引物HS)35seq，NOSseq-R。取3个阳性条带对应的菌液测序，提取目标质粒。PCR鉴定反应体系如表3-7所示，反应程序见表3-8。
表3-7 菌落PCR反应体系
组分（Component） 用量（Volume）（μL）
ddH2O 9.5
PCR Mix 12.5
HS)35seq(10μM) 1
NOSseq-R(10μM) 1
Template 1
Total 25
表3-8 菌落PCR反应程序
温度（Temperature） 时间（Time） 循环数（Cycles）
94℃ 5 min 1
94℃ 30 sec 30
50℃ 45 sec 30
72℃ 62 sec 30
72℃ 10 min 1
16℃ 30 min 1
4、将得到的序列正确的重组表达载体命名为pBWA(V)HS-LcbZIP46-Glosgfp。根据对LcbZIP46及其它禾本科物种中的同源蛋白序列分析，发现羊草与小麦遗传关系最近，是小麦的野生近缘种，故将构建好的GFP融合载体在小麦原生质体中进行瞬时表达，同时以转入pBWA(V)HS- -Glosgfp空载体的小麦原生质体作为对照，采用激光共聚焦显微镜检测GFP荧光，具体步骤如下：
取生长7-10d的小麦幼苗叶片，切成1mm左右小段，加入5-10mL酶解液，24℃静置酶解4h；用40μm滤网过滤后，300rpm离心3min，去上清；用预冷的W5溶液10mL洗涤2次，4℃，300rpm离心3min；根据需要加入500μL MMG溶液悬浮。40倍镜下镜检，每个视野20-40个完整原生质体。取100μL 原生质体悬液+10 μL DNA（500ng以上纯化的pBWA(V)HS-LcbZIP46-Glosgfp载体质粒），取与DNA和原生质体体积之和相等的PEG-4000溶液（110 μL），轻柔均匀混合；用1mL的W5稀释终止反应，300rpm离心3min收集原生质体，去上清；加入1mL W5洗涤1-2次。最后加入1mL W5溶液，24℃培养18-24 h；去上清，只留100μL的原生质体，采用激光共聚焦显微镜检测GFP荧光。
结果如图5、图6所示。图5为将pBWA(V)HS- -Glosgfp空载体在小麦原生质体中瞬时表达的激光共聚焦/TIRF显微镜图。在图5中，（a）为荧光通道下的小麦原生质体，（b）为叶绿体荧光通道下的小麦原生质体，（c）为明场下的小麦原生质体，（d）为a,b,c的叠加图。图5（a）可观测到空载体和GFP荧光蛋白融合后产生的绿色荧光分布于细胞质，细胞核部分；图5（b）可观测到叶绿体发出红色荧光信号；图5（c）明场图显示了小麦原生质体的整体形态和结构，包括细胞核、细胞质及细胞膜，但无荧光信号；图5（d）将荧光通道与明场图像叠加后，可以同时看到原生质体的形态结构和荧光蛋白融合后的荧光信号弥散分布于细胞内。
图6为将pBWA(V)HS-LcbZIP46-Glosgfp融合表达载体在小麦原生质体中瞬时表达的激光共聚焦/TIRF显微镜图。在图6中，（a）为荧光通道下的小麦原生质体，（b）为叶绿体荧光通道下的小麦原生质体，（c）为明场下的小麦原生质体，（d）为a,b,c的叠加图。由图6（a）可以看到LcbZIP46蛋白与GFP荧光蛋白融合后发出的绿色荧光定位于细胞核；由图6（b）可见在叶绿体荧光通道下观测到叶绿体发出红色荧光信号；图6（c）明场图像显示了小麦原生质体的整体形态和结构，包括细胞核、细胞质及细胞膜，但无荧光信号；图6（d）将荧光通道与明场图像叠加后，可以同时看到原生质体的形态结构和LcbZIP46蛋白的荧光定位，明确了LcbZIP46蛋白定位于细胞核中。
综上所述，转入pBWA(V)HS- -Glosgfp空载体的小麦原生质体中表达的蛋白分布在整个细胞内；转入重组表达载体pBWA(V)HS-LcbZIP46-Glosgfp的小麦原生质体中表达的蛋白则特异地定位于细胞核内。这一结果表明LcbZIP46蛋白定位于小麦原生质体的细胞核中。
实施例4 转LcbZIP46基因拟南芥的获得及其抗盐碱性检测
1、表达载体pHB-LcbZIP46的构建
用酶切连接法，将植物遗传转化载体pHB的HindIII和BamHⅠ识别序列间的DNA片段替换为序列2所示的LcbZIP46基因，将得到的序列正确的重组表达载体命名为pHB-LcbZIP46，所用引物如下：
pHB-LcbZIP46-F：ACCAGTCTCTCTCTCAAGCTTATGGAGATGCCGGGAGGGAG（如SEQ IDNo.11所示）
pHB-LcbZIP46-R：GCTCCTGCAGCTCGAGGATCCCTACCATGGACCCGTCAGTG（如SEQ IDNo.12所示）
2、转LcbZIP46基因拟南芥植株的获得
将重组质粒pHB-LcbZIP46导入根癌农杆菌GV3101，采用农杆菌介导的浸花法转化哥伦比亚生态型（Col-0）拟南芥，并进行潮霉素抗性筛选，收集具有潮霉素抗性的转基因拟南芥T1代种子，并在含潮霉素的培养基平板上培养，20d后用PCR法鉴定阳性苗，共获得15个转基因植株，经检测有10个阳性株系，标记为oe1、oe2、oe3、oe4、oe5、oe6、oe7、oe9、oe10及oe15。反应体系如表3-9，反应程序如表3-10。结果如图7，泳道M为Marker，泳道Col-0表示未转基因的野生型拟南芥（哥伦比亚）植株对照，泳道1、2、3、4、5、6、7、9、10及15分别表示pHB-LcbZIP46转基因株系oe1、oe2、oe3、oe4、oe5、oe6、oe7、oe9、oe10及oe15。鉴定引物如下：
HPT-F：GGTCGCGGAGGCTATGGATGC（如SEQ IDNo .13所示）
HPT-R：GCTTCTGCGGGCGATTTGTGT（如SEQ IDNo .14所示）
表3-9 转基因拟南芥阳性苗检测PCR反应体系
组分（Component） 用量（Volume）（μL）
ddH2O 7.2
2×Taq Mix 10
引物(+)(10μM) 0.4
引物(-)(10μM) 0.4
模板DNA 2
总体积 20
表3-10 转基因拟南芥阳性苗检测PCR反应程序
温度（Temperature） 时间（Time） 循环数（Cycles）
94℃ 3 min 1
94℃ 30 sec 35
55℃ 30 sec 35
72℃ 1 min 35
72℃ 5 min 1
选取健壮、长势一致的阳性苗进行传代繁种。选取T2代中抗生素筛选出的存活率为3:1分离的株系并继续繁殖获取T3代种子进行后续验证试验。
3、T3代转LcbZIP46基因拟南芥的抗盐碱性检测
选取长势一致的野生型拟南芥（Col-0）和不同拟南芥转基因株系T3代植株的叶片，分别提取RNA后合成cDNA。以AtActin基因作为内参基因，通过qRT-PCR检测不同转基因株系中LcbZIP46基因的表达量。
将消毒后野生型拟南芥种子（Col-0）和2个表达量较高的T3代转基因拟南芥株系（oe2, oe10）种子及分别点播在含有不同浓度盐碱混合溶液（30mM NaCl+3mM NaHCO3；50mMNaCl+5mM NaHCO3；70mM NaCl+7mM NaHCO3)的1/2MS（基本培养基）固体培养基上，以未经胁迫处理的1/2MS固体培养基为对照，4℃春化2d后，于光照培养箱培养7d，观测其生长并统计萌发率。转LcbZIP46基因水稻植株的PCR检测结果如图8所示，泳道WT表示未转基因的野生型水稻植株对照，其余泳道表示不同的pBWA(V)HS-LcbZIP46-3×flag转基因株系。随着盐碱胁迫浓度的增加，转基因株系和野生型植株的萌发率均发生剧烈降低，但转基因株系萌发率仍显著高于野生型植株，当盐碱胁迫浓度达到70mM NaCl+7mM NaHCO3时，野生型的萌发率仅为9.2%，而转基因株系萌发率仍可保持18.1%和27.3%，这表明转LcbZIP46基因株系和野生型拟南芥相比，抗盐碱能力得到明显提高。
将拟南芥野生型及转基因种子分别点播在含有盐碱混合溶液（30mM NaCl+3mMNaHCO3)及未处理的1/2MS固体培养基上，封口膜密封后，4℃春化2d后，平板竖直放置培养14d后观察主根长度，结果如图9、图10所示。
图9为T3代转LcbZIP46基因拟南芥萌发期的抗盐碱性检测结果。其中，（a）为野生型(Col-0)与转LcbZIP46基因拟南芥株系(oe2，oe10)未进行处理前萌发情况；（b）为野生型与转LcbZIP46基因拟南芥株系在30mM NaCl+ 3mM NaHCO3胁迫处理下的萌发情况；（c）为野生型与转LcbZIP46基因拟南芥株系在50mM NaCl+ 5mM NaHCO3胁迫处理下的萌发情况；（d）为野生型与转LcbZIP46基因拟南芥株系在70mM NaCl+ 7mM NaHCO3胁迫处理下的萌发情况；（e）为不同浓度盐碱胁迫下野生型与转LcbZIP46基因拟南芥的萌发率统计图。如图9（a）、9（e）所示，未受胁迫处理时，野生型拟南芥和转基因拟南芥的萌发率无显著差异；图9（b）、9（e）所示，30mM NaCl+3mM NaHCO3混合盐碱胁迫对转基因株系和野生型植株萌发率无显著影响；图9（c）、9（e）所示，随着盐碱胁迫浓度增加至50mM NaCl+5mM NaHCO3，转基因株系和野生型植株的萌发率均发生剧烈降低，但转基因株系萌发率仍显著高于野生型植株；如图9（d）、9（e）所示，当盐碱胁迫浓度达到70mM/7mM NaCl/NaHCO3时，野生型的萌发率仅为9.2%，而转基因株系萌发率仍可保持18.1%和27.3%，即转LcbZIP46基因提高了转基因拟南芥幼苗的耐盐碱性。
图10为T3代转LcbZIP46基因拟南芥株系(oe2，oe10)与野生型拟南芥(Col-0)在盐碱胁迫下的根长实验结果。其中，（a）为野生型(Col-0)与转LcbZIP46基因拟南芥株系(oe2，oe10)未进行处理下萌发的根系发育情况；（b）为野生型与转LcbZIP46基因拟南芥株系在30mM NaCl+ 3mM NaHCO3胁迫处理下萌发的根系发育情况。如图10（a）所示，在正常生长条件下，野生型植株与转基因拟南芥的根系长度无显著差异；图10（b）显示，30mM NaCl+ 3mMNaHCO3盐碱处理下，野生型植株的根生长受到较强烈的抑制，显著低于转基因株系的根长，说明转基因株系的根长受盐碱胁迫影响较弱，即LcbZIP46基因增强了转基因拟南芥幼苗的耐盐碱性。
实施例5 转LcbZIP46基因水稻的获得及其抗盐碱性检测
1、表达载体pBWA(V)HS-LcbZIP46-3×flag的构建
将连接了3×flag标签的植物表达载体pBWA(V)HS--3×flag的BsaI和Eco31I识别序列间的DNA片段替换为序列2所示的LcbZIP46基因，将得到的序列正确的重组表达载体命名为pBWA(V)HS-LcbZIP46-3×flag,所用引物如下：
LcbZIP46-flag-F: atttggagagaacacgggggactttgcaacatggagatgccgggagggagcgggg（如SEQ IDNo .15所示）
LcbZIP46-flag-R: tttgtagtctccgtcgtggtctttgtaatcccatggacccgtcagtgttcgtcgc（如SEQ IDNo .16所示）
2、转LcbZIP46基因水稻植株的获得
采用优化的农杆菌介导的水稻（粳稻）遗传转化法（SLAMET-LOEDIN et al, 2014；刘德芳, 2019），采用电转化法将构建好的载体质粒转至农杆菌EHA105中。待生根后，30℃光照培养7-10 d，共获得21个转基因植株，标记为line1、line2、line3、line4、line5、line6、line7、line8、line9、line10、line11、line12、line13、line14、line15、line16、line17、line18、line19、line20及line21。采用CTAB法（POREBSKI et al, 1997）提取水稻基因组DNA，进行PCR检测阳性苗，反应体系见表3-11，反应程序见表3-12，结果如图8，泳道M为Marker，泳道WT表示未转基因的野生型水稻植株对照，泳道1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20及21分别表示pBWA(V)HS-LcbZIP46-3×flag转基因株系line1、line2、line3、line4、line5、line6、line7、line8、line9、line10、line11、line12、line13、line14、line15、line16、line17、line18、line19、line20及line21。检测引物如下：
LcbZIP46-RF：cgatctactcgctcacgttc（如SEQ IDNo .17所示）
LcbZIP46-RR：gcagaagcccatgatgtcgc（如SEQ IDNo .18所示）
表3-11转基因水稻阳性苗检测PCR反应体系
组分（Component） 用量（Volume）（μL）
ddH2O 7.2
2×Taq Mix 10
引物(+)(10μM) 0.4
引物(-)(10μM) 0.4
模板DNA 2
总体积 20
表3-12转基因水稻阳性苗检测PCR反应程序
温度（Temperature） 时间（Time） 循环数（Cycles）
94℃ 3 min 1
94℃ 30 sec 35
55℃ 30 sec 35
72℃ 1 min 35
72℃ 5 min 1
用转基因阳性植株进行传代繁种，用T3代种子进行后续的功能验证试验。
3、T3代转LcbZIP46基因水稻的抗盐碱性检测
选取饱满健康的野生型水稻种子及3个LcbZIP46表达量较高的转基因水稻株系种子（OE1, OE2, OE3），将种子灭菌后分别点播在含有盐碱混合溶液（50mM NaCl+5mMNaHCO3)及未处理的1/2MS固体培养基上，竖直放置培养，14d后观察主根长度，结果如图11所示。
图11为T3代转LcbZIP46基因水稻株系OE1(Line5)，OE2(Line7), OE3(Line13)与野生型水稻(WT)在盐碱胁迫下的根长实验结果。其中，（a）为野生型水稻与转LcbZIP46基因水稻株系(OE1，OE2, OE3)未进行处理下萌发的根系发育情况；（b）为野生型与转LcbZIP46基因水稻株系在50mM NaCl+ 5mM NaHCO3胁迫处理下萌发的根系发育情况。如图11（a）所示，在正常生长条件下，野生型植株与转基因水稻的根系长度无显著差异；如图11（b）所示，在50mM NaCl+ 5mM NaHCO3盐碱处理下，野生型植株的根生长受到较强烈的抑制，显著低于转基因株系的根长，说明LcbZIP46基因可增强转基因水稻苗期对盐碱胁迫的抗性。
最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (6)

1.一种耐盐碱相关的转录因子LcbZIP46，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.权利要求1所述的耐盐碱相关的转录因子LcbZIP46的编码基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示。
3.含有权利要求2所述的耐盐碱相关的转录因子LcbZIP46的编码基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系、转基因植物组织、转基因植物器官或重组菌体。
4.权利要求1所述的转录因子LcbZIP46或权利要求2所述的编码基因在培育增强抗盐碱性转基因植物中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述植物为拟南芥或水稻。
6.权利要求3所述的含有耐盐碱相关的转录因子LcbZIP46的编码基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系、转基因植物组织、转基因植物器官或重组菌体在培育增强抗盐碱性转基因植物中的应用。
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US20120005773A1 (en) * 2008-10-01 2012-01-05 Aasen Eric D Transgenic plants with enhanced agronomic traits
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