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CN119137109A - 用于核酸递送的脂质 - Google Patents

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CN119137109A
CN119137109A CN202280061289.0A CN202280061289A CN119137109A CN 119137109 A CN119137109 A CN 119137109A CN 202280061289 A CN202280061289 A CN 202280061289A CN 119137109 A CN119137109 A CN 119137109A
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beta
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CN202280061289.0A
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A·鲍迪夫
G·格比何余
J·杰西
C·J·巴拉萨德
E·维洛夫斯卡亚
N·帕拉雅思
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Life Technologies Corp
Original Assignee
Life Technologies Corp
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Abstract

提供了用于将诸如核酸的大分子递送至真核细胞和组织中的新脂质。该脂质可单独使用、与其他脂质组合使用和/或与其他转染增强试剂组合使用以制备转染复合物和用于体内递送生物活性剂的复合物。

Description

用于核酸递送的脂质
相关申请的交叉引用
本申请是2022年8月12日提交的国际申请号PCT/US2022/040256的371国家阶段申请，该申请根据35 U.S.C.§119(e)要求2022年8月11日提交的美国临时申请序列号63/397,287和2021年8月12日提交的美国临时申请序列号63/232,535的优先权的权益，这些临时申请的内容据此以引用的方式整体明确地并入本文，如同在本文中完全阐述一样。
技术领域
本公开整体涉及用于将诸如核酸的大分子递送至真核细胞和组织中的脂质组合物和方法。
背景技术
转染剂(诸如包含阳离子脂质组分的脂质聚集体)已用于将大的阴离子分子(诸如核酸)递送至某些类型的细胞中。参见Felgner等人，Nature337:387-388(1989)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:7413(1987)。然而，这些试剂在所有细胞类型中不是普遍有效的，并且它们的有效性对于不同类型的核酸是不同的。在许多情况下，单独的阳离子脂质对于转染是无效的或仅部分有效。此外，这些方法并不是对所有细胞类型都起作用，通常需要相对复杂协议并且为不便的。特别地，这些方法不适合于体内递送核酸或递送至特定细胞或组织，例如递送DNA或RNA疫苗。因此，显然非常期望用于将大分子且具体来说核酸引入细胞中的新和改进的方法。具体来说，非常期望用于将核酸引入更广泛多种细胞中且具体来说到组织中的改进的方法。
发明内容
提供了新的化合物、组合物和方法，其改善了将诸如核酸的大分子引入细胞的效率，例如用于核酸和/或蛋白质的体内或离体递送。提供了新的脂质分子，以及含有这些脂质的组合物和使用这些新的脂质分子和组合物进行转染的方法。阳离子脂质/可离子化脂质可单独用于转染，或者有利地，它们可与附加的试剂组合用于转染组合物中。例如，阳离子脂质可以与一种或多种中性脂质、附加的阳离子脂质/可离子化脂质、一种或多种细胞表面配体、一种或多种融合增强剂、一种或多种核内体释放剂和/或一种或多种核定位剂或前述物质的任何组合相组合。所得的组合物可以与一种或多种大分子复合，诸如核糖(例如，DNA、siRNA、mRNA、miRNA等)、蛋白质或核酸和蛋白质的组合(例如，核糖核蛋白复合物)，并且用于将大分子递送至真核细胞中，并且对于将核酸递送至组织中特别有效。
所提供的是具有结构(I)的化合物
其中
L2选自由任选地在至多2个位置处被-OR9取代的C3-C12亚烷基、C3-C12碳环、C3-C12杂环和-(CH2)mCHOR9(CH2)nCHOR9(CH2)p-组成的组，其中m和p是1至6并且n是0至6，并且其中m+n+p＝2至8；
L1和L3选自由化学键、-COq-，其中q是1或2、任选地插入有N、O或-C(O)O-的C2-C8烷基、单不饱和C4-C8烯基、任选地插入有N、O或-C(O)O-的-COqC2-C8烷基和-COq-单不饱和C4-C8烯基组成的组，或者L1X和L3Y独立地是-CR3＝C(R4)R5；
每个L1和L3可以独立地在至多2个位置处被-OR9取代；
R1和R2独立地是H、C8-C20烷基或单不饱和C8-C20烯基，前提条件是当L1X和/或L3Y独立地是-CR3＝C(R4)R5时，则R1和R2不是H；
R9选自由H、-OH、-M-C8-C20烷基和-M-C8-C20烯基组成的组，其中M选自由化学键、-C(＝O)-、-C(＝O)N(R6)-、-N(R6)C(＝O)-、-N(R6)C(＝O)N(R7)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-S-、-S-S-、-C＝S-、-C(＝S)O-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-和-(R6)P(＝O)-组成的组；
X和Y独立地选自由以下组成的组：
L4-Het，其中L4是C1-C4亚烷基或-(CH2)mCHOR9(CH2)nCHOR9(CH2)p-，其中m和p是1至6并且n是0至6，并且其中m+n+p＝2至8，并且Het是含有至少一个氮原子的C4-C12杂环，
条件是X或Y中的任一者但不是两者都可以选自由-H、-C1-C20烷基、-NH2和-NH-C1-C20组成的组；
R3和R4各自独立地选自由H、C1-C20烷基和C3-C6环烷基、HDMS、DHDMS、R12以及由N*、R3和R4形成的任选地取代的3至7元杂环组成的组；
R5选自由H、C1-C6烷基和C3-C6环烷基组成的组；
R6至R8选自由H和C1-C4烷基组成的组；
Q选自由任选地插入有-N(H)-或-N(C1-C4烷基)-的C3-C12烷基、C4-C12烯基和环杂烷基组成的组；
R10选自由H、C1-C4烷基组成的组或者可以不存在；
R11选自由H、C1-C4烷基和-OR9组成的组；
当存在时，R12选自由PEG和基于以下项的聚合物组成的组：聚(噁唑啉)、聚(环氧乙烷)、聚(乙烯醇)、聚(甘油)、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚[N-(2-羟基丙基)甲基丙烯酰胺]和聚(氨基酸)，其中(i)该PEG或聚合物是直链或支链的；(ii)该PEG或聚合物由n个亚基聚合；(iii)n是介于5个和200个单元之间的数均聚合度；以及(iv)结构(I)的化合物具有至多两个R10基团。
在一些实施方案中，X和Y可以是相同或不同的，并且L1和L3可以是相同或不同的。有利地，R1和R2可以是相同或不同的。
在一些实施方案中，X或Y或两者是
在其他实施方案中，X或Y或两者是
在另外的实施方案中，L1是-CO-、-C(＝O)-、-OC(＝O)-或-C(＝O)O，并且X是L4Het，并且在某些另外的实施方案中，L4X是-CH＝C(R3)R4。
R3至R8独立地可以是H或-C1-C3烷基。
在一些实施方案中，L2可以是-CH2CH(OR9)CH(OR9)CH2-。
在某些实施方案中，R9是H，并且R1和R2不是H。在其他实施方案中，R9不是H，并且R1和R2是H；例如，R9可以是-C18烷基或-CO-C14-C18烷基，并且R1和R2是H。
还提供了含有如上所述的化合物和至少一种附加的脂质的组合物，其中该脂质可以是中性脂质或阳离子脂质/可离子化脂质。阳离子脂质可以选自例如由以下组成的组：DOTMA、DOTAP、DMRIE、DC-Chol、DDAB、DOSPA、DOSPER、DOGS、TMTPS、TMTOS、TMTLS、TMTMS、TMDOS、二羟基二肉豆蔻基精胺(DHDMS)、羟基二肉豆蔻基亚精胺(HDMS)、N-1-二甲基-N-1-(2,3-二油酰氧基氧基丙基)-2-羟基丙烷-1,3-二胺、N-1-二甲基-N-1-(2,3-二肉豆蔻基氧基丙基)-2-羟基丙烷-1,3-二胺、N-1-二甲基-N-1-(2,3-二棕榈基氧基丙基)-2-羟基丙烷-1,3-二胺、N-1-二甲基-N-1-(2,3-二油酰氧基丙基)-2-(3-氨基-2-羟基丙氧基)丙烷-1,3-二胺、N-1-二甲基-N-1-(2,3-二肉豆蔻基氧基丙基)-2-(3-氨基-2-羟基丙氧基)丙烷-1,3-二胺、N-1-二甲基-N-1-(2,3-二棕榈基氧基丙基)-2-(3-氨基-2-羟基丙氧基)丙烷-1,3-二胺、L-精胺-5-羧基-3-(DL-1,2-二棕榈酰基-二甲氨基丙基-β-羟乙胺、3,5-(N,N-二赖氨酰基)-二氨基苯甲酰基-甘氨酰基-3-(DL-1,2-二棕榈酰基-二甲氨基丙基-β-羟乙胺)、L-赖氨酸-双(O,O'-油酰基-β-羟基乙基)酰胺二盐酸盐、L-赖氨酸-双-(O,O'-油酰基-β-羟基乙基)酰胺二盐酸盐、1,4-双[(3-(3-氨基丙基)-烷基氨基)-2-羟基丙基)哌嗪、L-赖氨酸-双-(O,O'-肉豆寇酰-β-羟基乙基)酰胺二盐酸盐、L-鸟氨酸-双-(O,O'-肉豆寇酰-β-羟基乙基)酰胺二盐酸盐、L-鸟氨酸-双-(O,O'-油酰基-β-羟基乙基)酰胺二盐酸盐、1,4-双[(3-(3-氨基丙基)-油烯基氨基)-2-羟基丙基]哌嗪、L-鸟氨酸-双-(O,O'-棕榈酰基-β-羟基乙基)酰胺二盐酸盐、1,4,-双[(3-氨基-2-羟基丙基)-油烯基氨基]-丁烷-2,3-二醇、1,4,-双[(3-氨基-2-羟基丙基)-棕榈基氨基]-丁烷-2,3-二醇、1,4,-双[(3-氨基-2-羟基丙基)-肉豆蔻基氨基]-丁烷-2,3-二醇、1,4,-双[(3-油烯基氨基)丙基]哌嗪、L-精氨酸-双-(O,O'-油酰基-β-羟基乙基)酰胺二盐酸盐、双[(3-(3-氨基丙基)-肉豆蔻基氨基)2-羟基丙基]哌嗪、L-精氨酸-双-(O,O'-棕榈酰基-β-羟基乙基)酰胺二盐酸盐、L-丝氨酸-双-(O,O'-油酰基-β-羟基乙基)酰胺二盐酸盐、1,4-双[(3-(3-氨基丙基)-棕榈基氨基)-2-羟基丙基]哌嗪、甘氨酸-双-(O,O'-棕榈酰基-β-羟基乙基)酰胺二盐酸盐、肌氨酸-双-(O,O'-棕榈酰基-β-羟基乙基)酰胺二盐酸盐、L-组氨酸-双-(O,O'-棕榈酰基-β-羟基乙基)酰胺二盐酸盐、胆甾醇基-3β-羧基-酰胺基乙烯三甲胺碘化物、1,4-双[(3-肉豆蔻基氨基)丙基]哌嗪、1-二甲基氨基-3-三甲基铵基-DL-2-丙基-胆甾醇羧酸酯碘化物、胆甾醇基-3β-羧基酰胺基乙烯胺、胆甾醇基-3β-氧基琥珀酰胺乙烯三甲胺碘化物、1-二甲基氨基-3-三甲基铵基-DL-2-丙基-胆甾醇基-3β-氧基琥珀酸碘化物、2-[(2-三甲基铵基)-乙基甲基氨基]乙基-胆甾醇基-3β-氧基琥珀酸碘化物、3β[N-(N',N'-二甲基氨基乙烷)氨基甲酰基]胆固醇以及3β-[N-(聚乙烯亚胺)-氨基甲酰基]胆固醇、1,4-双[(3-棕榈基氨基)丙基]哌嗪、L-鸟氨酰基甘氨酰基-N-(1-十七烷基十八烷基)甘氨酰胺、N2,N5-双(3-氨基丙基)-L-鸟氨酰基甘氨酰基-N-(1-十七烷基十八烷基)甘氨酰胺、1,4-双[(3-(3-氨基-2-羟基丙基)-烷基氨基)-2-羟基丙基]哌嗪、N2-[N2,N5-双(3-氨基丙基)-L-鸟氨酰基]-N,N-双十八烷基-L-谷氨酰胺、N2-[N2,N5-双(氨基丙基)-L-鸟氨酰基]-N-N-双十八烷基-L-α-谷氨酰胺、1,4-双[(3-(3-氨基-2-羟基丙基)-油烯基氨基)2-羟基丙基]哌嗪、
N2-[N2,N5-双(氨基丙基)-L-鸟氨酰基]-N-N-双十八烷基-L-α-天冬酰胺、N-[N2-[N2,N5-双[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]-N2,N5-双[3-[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]氨基丙基]-L-鸟氨酰基-N-N-双十八烷基-L-谷氨酰胺酰]-L-谷氨酸、N2-[N2,N5-双(3-氨基丙基)-L-鸟氨酰基]-N,N-二醇基-L-谷氨酰胺、N2-[N2,N5-双(氨基丙基)-L-鸟氨酰基]-N-N-二油烯基-L-α-谷氨酰胺、4-双[(3-(3-氨基-2-羟基丙基)-肉豆蔻基氨基)-2-羟基丙基]哌嗪、
N2-[N2,N5-双(氨基丙基)-L-鸟氨酰基]-N-N-二油烯基-L-α-天冬酰胺、N-[N2-[N2,N5-双[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]-N2,N5-双[3-[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]氨基丙基]-L-鸟氨酰基-N-N-二油烯基-L-谷氨酰胺酰基]-L-谷氨酸、1,4-双[(3-(3-氨基丙基)-油烯基氨基)丙基]哌嗪、N2-[N2,N5-双(3-氨基丙基)-L-鸟氨酰基]-N,N-二棕榈基-L-谷氨酰胺、N2-[N2,N5-双(氨基丙基)-L-鸟氨酰基]-N-N-二棕榈基-L-α-谷氨酰胺、N2-[N2,N5-双(氨基丙基)-L-鸟氨酰基]-N-N-二棕榈基-L-α-天冬酰胺、
N-[N2-[N2,N5-双[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]-N2,N5-双[3-[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]氨基丙基]-L-鸟氨酰基-N-N-二棕榈基-L-谷氨酰胺]-L-谷氨酸、N2-[N2,N5-双(3-氨基丙基)-L-鸟氨酰基]-N,N-二肉豆蔻基-L-谷氨酰胺、
N2-[N2,N5-双(氨基丙基)-L-鸟氨酰基]-N-N-二肉豆蔻基-L-α-谷氨酰胺、N2-[N2,N5-双(氨基丙基)-L-鸟氨酰基]-N-N-二肉豆蔻基-L-α-天冬酰胺、1,4-双[(3-(3-氨基-2-羟基丙基)-棕榈基氨基)-2-羟基丙基]哌嗪、N-[N2-[N2,N5-双[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]-N2,N5-双[3-[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]氨基丙基]-L-鸟氨酰基-N-N-二肉豆蔻基-L-谷氨酰胺酰]-L-谷氨酸、1,4-双[(3-(3-氨基丙基)-肉豆蔻基氨基)丙基]哌嗪、N2-[N2,N5-双(3-氨基丙基)-L-鸟氨酰基]-N,N-二月桂基-L-谷氨酰胺、N2-[N2,N5-双(氨基丙基)-L-鸟氨酰基]-N-N-二月桂基-L-α-谷氨酰胺、
N2-[N2,N5-双(氨基丙基)-L-鸟氨酰基]-N-N-二月桂基-L-α-天冬酰胺、N-[N2-[N2,N5-双[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]-N2,N5-双[3-[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]氨基丙基]-L-鸟氨酸-N-N-二月桂基-L-谷氨酰胺酰基]-L-谷氨酸、3-[N',N"-双(2-叔丁氧基羰基氨基乙基)胍基]-N,N-双十八烷基-9-烯基丙酰胺、3-[N',N"-双(2-叔丁氧基羰基氨基乙基)胍基]-N,N-双棕榈基丙酰胺、3-[N',N"-双(2-叔丁氧基羰基氨基乙基)胍基]-N,N-双棕榈基丙酰胺、1,4-双[(3-(3-氨基丙基)-棕榈基氨基)丙基]哌嗪、1,4-双[(3-(3-氨基-2-羟基丙基)-油烯基氨基)丙基]哌嗪、N,N-(2-羟基-3-氨基丙基)-N-2-羟基丙基-3-N,N-二油烯基氨基丙烷、N,N-(2-羟基-3-氨基丙基)-N-2-羟基丙基-3-N,N-二棕榈基氨基丙烷、N,N-(2-羟基-3-氨基丙基)-N-2-羟基丙基-3-N,N-二肉豆蔻基氨基氨基丙烷、1,4-双[(3-(3-氨基-2-羟基丙基)-肉豆蔻基氨基)丙基]哌嗪、[(3-氨基丙基)-双-(2-十四烷基乙氧基)]甲基溴化铵、[(3-氨基丙基)-双-(2-油烯基乙氧基)]甲基溴化铵、
[(3-氨基丙基)-双-(2-棕榈基乙氧基)]甲基溴化铵、油酰基-2-羟基-3-N,N-二甲基氨基丙烷、2-二癸酰基-1-N,N-二甲基氨基丙烷、棕榈酰基-2-羟基-3-N,N-二甲基氨基丙烷、1,2-二棕榈酰基-1-N,N-二甲基氨基丙烷、
肉豆蔻酰-2-羟基-3-N,N-二甲基氨基丙烷、1,2-二肉豆蔻酰-1-N,N-二甲基氨基丙烷、(3-氨基-丙基)-4-(3-氨基-丙基氨基)-4-十四烷基氨基甲酰基-丁胺甲酸胆固醇酯、(3-氨基-丙基)-4-(3-氨基-丙基氨基)-4-氨基甲酰基丁胺甲酸胆固醇酯、(3-氨基-丙基)-4-(3-氨基-丙基氨基)-4-(2-二甲基氨基-乙基氨基甲酰基)-丁胺甲酸胆固醇酯、精胺-5-羧基甘氨酸(N'-硬脂基-N'-油烯基)酰胺四三氟乙酸盐、精胺-5-羧基甘氨酸(N'-硬脂基-N'-反油基)酰胺四三氟乙酸盐、胍丁胺基羧基胆固醇乙酸盐、精胺-5-羧基-β-丙氨酸胆固醇酯四三氟乙酸盐、2,6-二氨基己烯基β-丙氨酸胆固醇酯双三氟乙酸盐、2,4-二氨基丁酰基β-丙氨酸胆固醇酯双三氟乙酸盐、N,N-双(3-氨基丙基)-3-氨基丙酰基β-丙氨酸胆固醇酯三三氟乙酸盐、[N,N-双(2-羟基乙基)-2-氨基乙基]氨基羧基胆固醇酯、硬脂基肉碱酯、棕榈酰肉碱酯、肉豆蔻基肉碱酯、硬脂基硬脂酰肉碱酯盐酸盐、L-硬脂基硬脂酰肉碱酯、硬脂基油酰基肉碱酯盐酸盐、棕榈基棕榈酰肉碱酯盐酸盐、肉豆蔻基肉豆寇酰肉碱酯盐酸盐、L-肉豆蔻基肉豆寇酰肉碱酯盐酸盐、1,4-双[(3-(3-氨基-2-羟基丙基)-棕榈基氨基)丙基]哌嗪、N-(3-氨基丙基)-N,N'-双-(十二烷基乙氧基)-哌嗪溴化物、N-(3-氨基丙基)-N,N'-双-(油烯基乙氧基)-哌嗪溴化物、N-(3-氨基丙基)-N,N'-双-(棕榈基乙氧基)-哌嗪溴化物、N-(3-氨基丙基)-N,N'-双-(肉豆蔻基乙氧基)-哌嗪溴化物、N-(3-氨基丙基)-N'-甲基-N,N'-(双-2-十二烷基乙氧基)-哌嗪溴化物、N-(3-氨基丙基)-N'-甲基-N,N'-(双-2-油烯基乙氧基)-哌嗪溴化物、N-(3-氨基丙基)-N'-甲基-N,N'-(双-2-棕榈基乙氧基)-哌嗪溴化物、N-(3-氨基丙基)-N'-甲基-N,N'-(双-2-肉豆蔻基乙氧基)-哌嗪溴化物、1,4-双[(3-(3-氨基丙基)-油烯基氨基)-2-羟基-丙基]哌嗪、1,4-双[(3-(3-氨基丙基)-肉豆蔻基氨基)-2-羟基-丙基]哌嗪以及1,4-双[(3-(3-氨基丙基)-棕榈基氨基)-2-羟基-丙基]哌嗪、KL22、KL25、1,2-二亚油烯基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLin-DMA)、2,2-二亚油烯基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]二氧戊环(DLin-K-DMA)、三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基4-(二甲基氨基)丁酸酯(DLin-MC3-DMA或MC3)、2,2-二亚油烯基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、1,2-二油烯基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DODMA)、2-({8-[(3.β.)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙烷-1-胺(辛基-CLinDMA)、(2R)-2-({8-[(3.β.)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z-,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙烷-1-胺(辛基-CLinDMA(2R))和(2S)-2-({8-[(3)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙烷-1-胺(辛基-CLinDMA(2S))。
中性脂质可以例如选自由甾醇或甾醇衍生物、磷脂或它们的组合组成的组。
该组合物还可含有磷脂，该磷脂选自例如由DOPE、DPhPE、胆固醇、DOPC、Lyso-PE(1-酰基-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、Lyso-PC(1-酰基-3-羟基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)组成的组。该组合物还可含有至少一种附加的中性脂质，该附加的中性脂质可以是例如选自由DOPE、DPhPE、胆固醇、DOPC、Lyso-PE(1-酰基-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)和Lyso-PC(1-酰基-3-羟基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)组成的组的磷脂。
该组合物还可含有细胞靶向肽、核定位肽、融合剂和/或肽核内体释放剂。这些肽中的每一种肽可任选地含有聚阳离子核酸结合部分。
该组合物还可含有稳定剂或非肽核内体释放剂。
该组合物可含有核酸，该核酸可以是例如RNA分子。在一些实施方案中，核酸可以是mRNA分子。
还提供了将核酸引入真核细胞中的方法，其中该细胞与上述组合物和核酸接触。该细胞可以是例如动物细胞，也可以是人细胞。组合物和核酸与细胞之间的接触可以在体内、离体或体外发生。
还提供了用于将脂质组合物递送至受试者的脾组织和/或肺组织的方法，其中如上所述的组合物被施用给受试者。
还提供了用于将生物活性剂递送至受试者的脾组织和/或肺组织的方法，该方法包括：(i)将生物活性剂与如上所述的组合物混合，从而形成生物活性剂-脂质复合物生物活性剂；以及(ii)向受试者施用有效量的所述生物活性剂-脂质复合物，从而将所述生物活性剂-脂质复合物递送至受试者的脾组织和/或肺组织。
通过下面的具体实施方式，本发明的其他目的、特征和优点将变得显而易见。然而，应当理解，具体实施方式和具体示例尽管指示本发明的优选实施方案，但仅以例证的方式给出，因为根据该具体实施方式，本发明的实质和范围内的各种变化和修改对于本领域技术人员将变得显而易见。
附图说明
图1A至图1C是描绘使用脂质-DNA制剂转染后HeLa细胞(图1A)、HDFa细胞(图1B)和A549细胞(图1C)中的GFP荧光强度(以相对荧光单位计)的图。
图2A至图2C是描绘使用脂质-DNA制剂转染后MCF7细胞(图2A)、HEK293(图2B)和CHO-K1细胞(图2C)中的GFP荧光强度(以相对荧光单位计)的图。
图3是描绘使用脂质-DNA制剂转染后HEK-293细胞中的GFP荧光强度(以相对荧光单位计)的图。
图4是描绘使用脂质-DNA制剂转染后HeLa细胞中的GFP荧光强度(以相对荧光单位计)的图。
图5是描绘使用脂质-DNA制剂转染后MCF7细胞中的GFP荧光强度(以相对荧光单位计)的图。
图6是描绘使用脂质-DNA制剂转染后HDFa细胞中的GFP荧光强度(以相对荧光单位计)的图。
图7是描绘使用脂质-DNA制剂转染后A549细胞中的GFP荧光强度(以相对荧光单位计)的图。
图8是描绘使用脂质-DNA制剂转染后HEK293细胞中的GFP荧光强度(以相对荧光单位计)的图。
图9是描绘静脉内施用脂质-mRNA制剂后小鼠肺中的荧光素酶活性(以生物发光通量计，光子/秒(p/s))的图。
图10是描绘静脉内施用脂质-mRNA制剂后小鼠脾中的荧光素酶活性(以生物发光通量计，光子/秒(p/s))的图。
具体实施方式
提供了脂质分子，该脂质分子可用于将大分子递送至真核细胞中的改进方法，并且对于多种细胞、组织和器官的递送特别有效，并且提供高效转染。这些脂质分子在特定pH(例如，生理pH)下是带正电的，并且有利地可用于制备具有一种或多种中性脂质和附加组分(诸如融合分子或融合增强分子、附加的阳离子脂质/可离子化脂质、细胞表面配体、细胞粘附分子、核定位剂和核内体释放剂)以及大分子的复合物。此类复合物容易制备并且是稳定的，因此适用于体外、离体和体内应用，例如，治疗性核酸(例如，siRNA治疗剂、mRNA疫苗制剂等)的递送、细胞治疗应用(例如，基因编辑试剂的递送)等。例如，如本文所示，体内施用包含新的阳离子脂质/可离子化脂质和核酸有效负载的脂质组合物使得将核酸有效负载有效递送至肺组织和脾组织。
令人惊奇的是，还发现通常的阳离子脂质/可离子化脂质，特别是本文所述的新的阳离子脂质/可离子化脂质的核酸转染效率在许多情况下可通过部分酰化或烷基化脂质上的任何游离伯胺官能团和仲胺官能团来减少脂质上的净正电荷而显著提高。出乎意料的是，这种电荷的减少已被证明极大地增加了含有经修饰的脂质的转染复合物有效转染细胞的能力。因此，对于具有N个伯胺或仲胺的脂质，可以酰化或烷基化至多N-1个胺基基团。本领域技术人员将认识到，在大多数情况下，酰基基团在具有不同氨基基团的脂质制剂中的分布将是统计性的，因为除非酰化作为更精细的合成方案的一部分进行，否则区域特异性酰化可能将是不可能的。因此，最初(在非酰化胺中)以及在反应期间，酰基基团的分布不仅受酰化试剂相对于脂质的化学计量的影响，而且还受胺基基团的反应性的影响，因为游离胺处的酰化活性潜在地受分子中其他地方的另一胺处的酰化影响。
转染的增强对于除了可能存在叔胺或季胺之外还含有4个或更多个反应性胺的脂质特别显著，但不一定限于这些脂质。鉴于本领域中的偏见，即期望阳离子脂质上具有相对高的电荷以增强带负电的核酸的结合，该观察到的结果是令人惊讶的。
如本文所用，术语“可离子化脂质”是指具有一个或多个官能团的脂质，该官能团可根据含有脂质的介质的pH而可逆地离子化(质子化或去质子化)。官能团可以是碱性的，诸如氨基官能团，或者可以是酸性的，诸如羧酸部分。本领域技术人员将意识到也可以使用其他可离子化官能团。可离子化脂质可含有碱性部分和酸性部分两者。有利地，可离子化脂质在生理pH下携带总体正电荷。
阳离子脂质/可离子化脂质
所提供的是具有结构(I)的化合物
其中
L2选自由任选地在至多2个位置处被-OR9取代的C3-C12亚烷基、C3-C12碳环、C3-C12杂环和-(CH2)mCHOR9(CH2)nCHOR9(CH2)p-组成的组，其中m和p是1至6并且n是0至6，并且其中m+n+p＝2至8；
L1和L3选自由化学键、-COq-，其中q是1或2、任选地插入有N、O或-C(O)O-的C3-C8烷基、单不饱和C4-C8烯基、任选地插入有N、O或-C(O)O-的-COqC2-C8烷基和-COq-单不饱和C4-C8烯基组成的组，或者L1X和L3Y独立地是-CR3＝C(R4)R5；
每个L1和L3可以独立地在至多2个位置处被-OR9取代；
R1和R2独立地是H、C8-C20烷基或单不饱和C8-C20烯基，前提条件是当L1X和/或L3Y独立地是-CR3＝C(R4)R5时，则R1和R2不是H；
R9选自由H、-OH、-M-C8-C20烷基和-M-C8-C20烯基组成的组，其中M选自由化学键、-C(＝O)-、-C(＝O)N(R6)-、-N(R6)C(＝O)-、-N(R6)C(＝O)N(R7)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-S-、-S-S-、-C＝S-、-C(＝S)O-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-和-(R6)P(＝O)-组成的组；
X和Y独立地选自由以下组成的组：
L4-Het，其中L4是C1-C4亚烷基或-(CH2)mCHOR9(CH2)nCHOR9(CH2)p-，其中m和p是1至6并且n是0至6，并且其中m+n+p＝2至8，并且Het是含有至少一个氮原子的C4-C12杂环，
条件是X或Y中的任一者但不是两者都可以选自由-H、-C1-C20烷基、-NH2和-NH-C1-C20组成的组；
R3和R4各自独立地选自由H、C1-C20烷基和C3-C6环烷基、HDMS、DHDMS、R12以及由N*、R3和R4形成的任选地取代的3至7元杂环组成的组；
R5选自由H、C1-C6烷基和C3-C6环烷基组成的组；
R6至R8选自由H和C1-C4烷基组成的组；
Q选自由任选地插入有-N(H)-或-N(C1-C4烷基)-的C3-C12烷基、C4-C12烯基和环杂烷基组成的组；
R10选自由H、C1-C4烷基组成的组或者可以不存在；
R11选自由H、C1-C4烷基和-OR9组成的组；
当存在时，R12选自由PEG和基于以下项的聚合物组成的组：聚(噁唑啉)、聚(环氧乙烷)、聚(乙烯醇)、聚(甘油)、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚[N-(2-羟基丙基)甲基丙烯酰胺]和聚(氨基酸)，其中(i)该PEG或聚合物是直链或支链的；(ii)该PEG或聚合物由n个亚基聚合；(iii)n是介于5个和200个单元之间的数均聚合度；以及(iv)结构(I)的化合物具有至多两个R10基团。
在某些实施方案中，结构(I)的化合物，其中X或Y各自独立地选自由以下组成的组：
以及
s＝0、1或2
t＝2、3、4或5。
在某些实施方案中，本文提供的阳离子脂质/可离子化脂质是结构(I)的化合物或选自包括表1中的化合物的组的其他化合物。
表1
在具有结构(I)的化合物的一些实施方案中，X和Y可以是相同或不同的，并且L1和L3可以是相同或不同的。有利地，R1和R2可以是相同或不同的。
在一些实施方案中，X或Y或两者是
在其他实施方案中，X或Y或两者是
在另外的实施方案中，L1是-CO-、-C(＝O)-、-OC(＝O)-或-C(＝O)O，并且X是L4Het，并且在某些另外的实施方案中，L4X是-CH＝C(R3)R4。
R3至R8独立地可以是H或-C1-C3烷基。
在一些实施方案中，L2可以是-CH2CH(OR9)CH(OR9)CH2-。
在某些实施方案中，R9是H，并且R1和R2不是H。在其他实施方案中，R9不是H，并且R1和R2是H；例如，R9可以是-C18烷基或-CO-C14-C18烷基，并且R1和R2是H。
R1和R2独立地可以是H、C8-C20烷基或单不饱和C8-C20烯基。
R3至R8独立地可以选自H、-C1-C6烷基-和C3-C6环烷基。在具体示例中，R3至R8独立地是H或C1-C3烷基。
R9可以是H、-CO-、C8-C20烷基、单不饱和-CO-、C8-C20烯基、C8-C20烷基或单不饱和C8-C20烯基。具体示例包括：其中R9是C14-C18烷基或单不饱和烯基；其中R9是H，并且R1和R2不是H；其中R9不是H，并且R1和R2是H；并且其中R9是C14-C18烷基或-CO、-C14-C18烷基，并且R1和R2是H。有利地，当存在时，R9中的双键是顺式双键。
在这些分子中，X和Y可以是相同或不同的，L1和L3独立地可以是相同或不同的，并且R1和R2可以是相同或不同的。
在具体实施方案中，L2可以是C4-C12亚烷基。在其他实施方案中，L2有利地是-(CH2)mCHOR9(CH2)nCHOR9(CH2)p-，其中m和p是1至6并且n是0至6，并且其中m+n+p＝2至8。在具体示例中，L2是-CH2CH(OR9)CH(OR9)CH2-。
在另外的实施方案中，分子可以含有经由酰胺键或氨基甲酸酯键连接的杂环部分，其中L1是-CO-、-C(＝O)-、-OC(＝O)-或-C(＝O)O-，并且X是L4Het，其中Het是如下定义的杂环。在又另外的实施方案中，当R1和/或R2不是H时，分子可以含有烯胺部分，其中L1X是-CR5＝C(R3)R4。在此类烯胺部分中，R3和R5可以一起形成C3-C7碳环。
结构(I)的分子对于取代基R1、R2、L2、L3以及X和Y中的每一者或全部可以独立地是对称的或非对称的；即每个R1可以是相同或不同的，每个R2可以是相同或不同的，L1和L3可以是相同或不同的，并且X和Y可以是相同或不同的。此外，L2的结构不必是对称的。
定义
本文通常使用标准命名法描述化合物。对于具有非对称中心的所述化合物，除非另外指明，否则涵盖该化合物的所有立体异构体以及它们的混合物。立体异构体的非限制性示例包括对映异构体、非对映异构体和E异构体或Z异构体。当所述化合物以各种互变异构形式存在时，该化合物旨在包括所有互变异构形式。本文使用包括变量(例如，X、L1、L2、L3、Y等)的通式描述某些化合物。除非另外指明，此类式中的每个变量独立于任何其他变量定义，并且在式中出现一次以上的任何变量在每次出现时都独立地定义。如果部分被描述为“独立地”选自一组，则每个部分彼此独立地选择。因此，每个部分可以与另一部分相同或不同。
烃基部分中的碳原子数可以用前缀“Cx-Cy”表示，其中x是该部分中的最小碳原子数，y是最大碳原子数。因此，例如，“C1-C6烷基”是指含有1个至6个碳原子的烷基取代基。进一步举例说明，C3-C6环烷基意指含有3个至6个碳环原子的饱和烃基环。多组分取代基所附带的前缀仅适用于紧随该前缀之后的第一组分。为了说明，术语“碳环基烷基”包含两种组分：碳环基和烷基。因此，例如，C3-C6碳环基C1-C6烷基是指通过C1-C6烷基基团附加到母体分子部分的C3-C6碳环基。
除非另外指明，当连接元素连接所描绘的化学结构中的两个其他元素时，该连接元素的最左侧所描述的组分结合到所描绘的结构中的左侧元素，该连接元素的最右侧所描述的组分结合到所描绘的结构中的右侧元素。为了说明，如果化学结构是-LS-M-LS”-并且M是-N(RB)S(O)-，则化学结构是-LS-N(RB)S(O)-LS”-。
如果所描绘的结构中的连接元素是键，则该连接元素左侧的元素经由共价键直接连接到该连接元素右侧的元素。例如，如果化学结构被描绘为-LS-M-LS'并且M被选择为键，则该化学结构将是“-LS-LS-”。如果所描绘的结构中的两个或更多个相邻连接元素是键，则这些连接元素左侧的元素经由共价键直接连接到这些连接元素右侧的元素。例如，如果化学结构被描绘为“-LS-M-LS-M'-LS'-”并且M和LS'被选择为键，则该化学结构将是“-LS-M'-LS-”。同样，如果化学结构被描绘为-LS-M-LS”-M'-LS”-，并且M、LS'和M'是键，则该化学结构将是-LS-LS”-。当使用化学式来描述部分时，破折号表示该部分的具有自由价的部分。
如果部分被描述为“任选地取代的”，则该部分可以是取代的或未取代的。如果部分被描述为任选地被至多特定数目的非氢自由基取代，则该部分可以是未取代的，或者被至多该特定数目的非氢自由基或者被至多该部分上最大数目的可取代位置取代，以较小者为准。因此，例如，如果部分被描述为任选地被至多三个非氢自由基取代的杂环，则具有少于三个可取代位置的任何杂环将任选地被至多仅与杂环具有可取代位置一样多的非氢自由基取代。例如，四唑基(其仅具有一个可取代位置)将任选地被至多一个非氢自由基取代。类似地，如果氨基氮被描述为任选地被至多两个非氢自由基取代，则伯氨基氮将任选地被至多两个非氢自由基取代，而仲氨基氮将任选地被至多仅一个非氢自由基取代。
当部分被氧代或硫代取代时，其意指该部分含有共价键合到至少两个氢的碳原子(例如，CH2)，并且两个氢自由基被氧代或硫代取代以分别形成C＝O或C＝S。
术语“烯基”意指含有一个或多个双键的直链烃基链或支链烃基链。相对于双键碳上取代的基团，每个碳-碳双键在烯基部分内可具有E(顺式)几何结构或Z(反式)几何结构。烯基自由基的示例包括但不限于乙烯基、E-丙烯基和Z-丙烯基、异丙烯基、E-丁烯基和Z-丁烯基、E-异丁烯基和Z-异丁烯基、E-戊烯基和Z-戊烯基、E-己烯基和Z-己烯基、E,E-己二烯基、E,Z-己二烯基、Z,E-己二烯基和Z,Z-己二烯基等。
术语“亚烯基”是指二价不饱和烃基链，其可以是直链或支链的并且具有至少一个碳-碳双键。亚烯基的非限制性示例包括-C(H)＝C(H)-、-C(H)＝C(H)-CH2-、-C(H)＝C(H)-CH2-CH2-、-CH2-C(H)＝C(H)-CH2-、-C(H)＝C(H)-CH-(CH3)-和-CH2-C(H)＝C(H)-CH-(CH2CH3)-。
术语“烷基”意指直链饱和烃基链或支链饱和烃基链。烷基的非限制性示例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基和己基。
术语“亚烷基”表示二价饱和烃基链，其可以是直链或支链的。亚烷基的代表性示例包括但不限于-CH2-、-CH2CH2-、-CH2CH2CH2-、-CH2CH2CH2CH2-和-CH2CH(CH3)CH2-。
术语“炔基”意指含有一个或多个三键的直链烃基链或支链烃基链。炔基的非限制性示例包括乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、3-丙炔基、癸炔基、1-丁炔基、2-丁炔基和3-丁炔基。
术语“炔基”，单独或与任何其他术语组合，是指具有一个或多个三键的直链烃自由基或支链烃自由基，其含有指定数目的碳原子，或者其中未指定数目，在一个实施方案中为2个至约10个碳原子。炔基自由基的示例包括但不限于乙炔基、丙炔基、炔丙基、丁炔基、戊炔基等。
术语“烷氧基”是指烷基醚自由基，其中术语“烷基”如上定义。合适的烷基醚自由基的示例包括但不限于甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基等。
术语“芳基”，单独或与任何其他术语组合，是指碳环芳族自由基(诸如苯基或萘基)，其含有指定数目的碳原子，在一个实施方案中为6个至15个碳原子(即(C6-15)芳基)，并且在另一个实施方案中为6个至10个碳原子(即(C6-10)芳基)，任选地被一个或多个选自烷基、烷氧基(例如，甲氧基)、硝基、卤素(例如，氯)、氨基、羧酸酯和羟基的取代基取代。芳基自由基的示例包括但不限于苯基、对甲苯基、4-羟基苯基、1-萘基、2-萘基、茚基、茚满基、甘菊环基、芴基、蒽基等。
单独或组合使用的术语“芳烷基”意指如上所定义的烷基自由基，其中一个氢原子是苯基、苄基、2-苯乙基等。
单独或组合使用的术语“芳烷氧基羰基”意指式-C(O)-O-芳烷基的自由基，其中术语“芳烷基”具有以上给出的含义。芳烷氧基羰基自由基的示例是苄氧基羰基。
单独或组合使用的术语“芳氧基”意指式芳基-O-的自由基，术语“芳基”具有以上给出的含义。
术语“亚炔基”是指二价不饱和烃基团，其可以是直链或支链的并且具有至少一个碳-碳三键。以举例的方式，代表性亚炔基基团包括-C≡C-、-C≡C-CH2-、-C≡C-CH2-CH2-、-CH2-C≡C-CH2-、-C≡C-CH(CH3)-和-CH2-C≡C-CH(CH2CH3)-。
单独或组合使用的术语“烷酰基”意指衍生自链烷羧酸的酰基自由基，其示例包括乙酰基、丙酰基、丁酰基、戊酰基、4-甲基戊酰基等。
术语“芳氧基烷酰基”意指式芳基-O-烷酰基的酰基自由基，其中芳基和烷酰基具有以上给出的含义。
术语“芳烷酰基”意指衍生自芳基取代的链烷羧酸的酰基自由基，诸如苯基乙酰基、3-苯基丙酰基(氢化肉桂酰基)、4-苯基丁酰基、(2-萘基)乙酰基、4-氯氢化肉桂酰基、4-氨基氢化肉桂酰基、4-苯基丁酰基、(1-萘基)乙酰基、4-氯氢化肉桂酰基、4-氨基氢化肉桂酰基、4-甲氧基氢化肉桂酰基等。
术语“芳酰基”意指衍生自芳族羧酸的酰基自由基。此类自由基的示例包括芳族羧酸、任选地取代的苯甲酸或萘甲酸，诸如苯甲酰基、4-氯苯甲酰基、4-羧基苯甲酰基、4-(苄氧基羰基)苯甲酰基、1-萘甲酰基、2-萘甲酰基、6-羧基-2-萘甲酰基、6-(苄氧基羰基)-2-萘甲酰基、3-苄氧基-2-萘甲酰基、3-羟基-2-萘甲酰基、3-(苄氧基甲酰胺基)-2-萘甲酰基等。
单独或组合使用的术语“氨基羰基”意指衍生自氨基取代的羧酸的氨基取代的羰基(氨基甲酰基)，其中氨基基团可以是伯氨基基团连续取代基、仲氨基基团连续取代基或叔氨基基团连续取代基，该取代基选自氢自由基、烷基自由基、芳基自由基、芳烷基自由基、环烷基自由基、环烷基烷基自由基等。
术语“氨基烷酰基”意指衍生自氨基取代的链烷羧酸的酰基自由基，其中氨基基团可以是含有选自由氢自由基、环烷基自由基、环烷基烷基自由基等组成的组的取代基的伯氨基基团、仲氨基基团或叔氨基基团，其示例包括N,N-二甲基氨基乙酰基和N-苄基氨基乙酰基。
术语“碳环”或“碳环的”或“碳环基”是指含有零个杂原子环原子的饱和的(例如“环烷基”)、部分饱和的(例如“环烯基”或“环炔基”)或完全不饱和的(例如，“芳基”)3元至8元碳环系统。“环原子”或“环成员”是结合在一起形成环的原子。碳环基可以是但不限于单个环、两个稠环、或桥环或螺环。取代的碳环基可以具有顺式几何结构或反式几何结构。碳环基基团的代表性示例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、环戊烯基、环戊二烯基、环己二烯基、金刚烷基、十氢-萘基、八氢-茚基、环己烯基、苯基、萘基、茚满基、1,2,3,4-四氢-萘基、茚基、异茚基、十氢萘基和降蒎烷基。碳环基团可以通过任何可取代的碳环原子附接到母体分子部分。在碳环基团为在所描绘的化学结构中连接两个其他元素的二价部分的情况下，该碳环基团可通过任何两个可取代的环原子附接到该两个其他元素。同样，在碳环基团为在所描绘的化学结构中连接三个其他元素的三价部分的情况下，该碳环基团可分别通过任何三个可取代的环原子附接到该三个其他元素。碳环可以附接在产生稳定结构的任何桥环碳原子处。在一个实施方案中，碳环具有5个至7个碳。
术语“环烷基”是指含有零个杂原子环成员的饱和碳环基基团。环烷基的非限制性示例包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、十氢萘基和降蒎烷基。
单独或组合施用的术语“环烷基”意指含有约3个至约8个碳原子且为环状的烷基自由基。此类环烷基自由基的示例包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基等。
术语“环烷基烷基”意指被含有约3个至约8个(在一个实施方案中为约3个至约6个)碳原子的环烷基自由基取代的如上所定义的烷基自由基。
术语“环烷基羰基”意指衍生自单环或桥连环烷羧酸的酰基基团，诸如环丙烷羰基、环己烷羰基、金刚烷羰基等，或衍生自任选地被例如烷酰基氨基取代的苯并稠合的单环环烷羧酸的酰基基团，诸如1,2,3,4-四氢-2-萘甲酰基、2-乙酰氨基-1,2,3,4-四氢-2-萘甲酰基。
术语“环烷基烷氧羰基”意指衍生自式环烷基烷基-O-COOH的环烷基烷氧基羧酸的酰基基团，其中环烷基烷基具有以上给出的含义。
术语“碳环基烷基”是指通过亚烷基基团附加到母体分子部分的碳环基基团。例如，C3-C6碳环基C1-C6烷基是指通过C1-C6亚烷基附加到母体分子部分的C3-C6碳环基基团。
术语“环烯基”是指具有零个杂原子环成员的非芳族、部分不饱和的碳环基部分。环烯基基团的代表性示例包括但不限于环丁烯基、环戊烯基、环己烯基和八氢萘基。
前缀“卤代”表示该前缀所附带的取代基被一个或多个独立地选择的卤素自由基取代。例如，“C1-C6卤代烷基”意指其中一个或多个氢原子被独立地选择的卤素自由基取代的C1-C6烷基取代基。C1-C6卤代烷基的非限制性示例包括氯甲基、1-溴乙基、氟甲基、二氟甲基、三氟甲基和1,1,1-三氟乙基。应当认识到，如果取代基被多于一个卤素自由基取代，则那些卤素自由基可以是相同或不同的(除非另外说明)。
术语“杂环”或“杂环的”或“杂环基”是指饱和的(例如，“杂环烷基”)、部分不饱和的(例如，“杂环烯基”或“杂环炔基”)或完全不饱和的(例如，“杂芳基”)环系，其中环原子中的至少一个环原子是杂原子(即氮、氧或硫)，其余环原子独立地选自由碳、氮、氧和硫组成的组。杂环可以是但不限于单个环、两个稠环、或桥环或螺环。杂环基团可以经由基团中任何可取代的碳原子或氮原子连接到母体分子部分。在杂环基团为在所描绘的化学结构中连接两个其他元素的二价部分的情况下，该杂环基团可通过任何两个可取代的环原子附接到该两个其他元素。同样，在杂环基团为在所描绘的化学结构中连接三个其他元素的三价部分的情况下，该杂环基团可分别通过任何三个可取代的环原子附接到该三个其他元素。
在本发明化合物中，“Het”表示含有4个至12个碳原子的杂环，其中至少一个氮原子存在于环中。杂环基可以是但不限于含有单个环的单环。单环的非限制性示例包括呋喃基、二氢呋喃基、四氢呋喃基、吡咯基、异吡咯基、吡咯啉基、吡咯烷基、咪唑基、异咪唑基、咪唑啉基、咪唑烷基、吡唑基、吡唑啉基、吡唑烷基、三唑基、四唑基、二硫醇基、氧杂硫醇基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、异噻唑基、噻唑啉基、异噻唑啉基、噻唑烷基、异噻唑烷基、噻二唑基、氧杂噻唑基、氧杂二唑基(包括1,2,3-噁二唑基、1,2,4-噁二唑基(也被称为“恶二唑基”)、1,2,5-噁二唑基(也被称为“呋咕基”)和1,3,4-噁二唑基)、氧杂三唑基(包括1,2,3,4-氧杂三唑基和1,2,3,5-氧杂三唑基)、二恶唑基(包括1,2,3-二恶唑基、1,2,4-二恶唑基、1,3,2-二恶唑基和1,3,4-二恶唑基)、吡啶基、哌啶基、二嗪基(包括哒嗪基(也被称为“1,2-二嗪基”)、嘧啶基(也被称为“1,3-二嗪基”)和吡嗪基(也被称为“1,4-二嗪基”))、哌嗪基、三嗪基(包括s-三嗪基(也被称为“1,3,5-三嗪基)、as-三嗪基(也被称为“1,2,4-三嗪基)和v-三嗪基(也被称为“1,2,3-三嗪基)、恶嗪基(包括1,2,3-恶嗪基、1,3,2-恶嗪基、1,3,6-恶嗪基(也被称为“戊基恶唑酮基”、1,2,6-恶嗪基和1,4-恶嗪基)、异恶嗪基(包括o-异恶嗪基和p-异恶嗪基)、噁唑烷基、异噁唑烷基、氧杂噻嗪基(包括1,2,5-氧杂噻嗪基或1,2,6-氧杂噻嗪基)、氧杂二嗪基(包括1,4,2-氧杂二嗪基和1,3,5,2-氧杂二嗪基)、吗啉基、氮杂卓基和二氮杂卓基。
杂环基还可以是但不限于含有两个稠环的双环，诸如例如萘啶基(包括[1,8]萘啶基和[1,6]萘啶基)、噻唑嘧啶基、噻吩并嘧啶基、嘧啶并嘧啶基、吡啶并嘧啶基、吡唑并嘧啶基、吲嗪基、吡啶并茚基、吡喃并吡咯基、4H-喹嗪基、嘌呤基、吡啶并吡啶基(包括吡啶并[3,4-b]-吡啶基、吡啶并[3,2-b]-吡啶基和吡啶并[4,3-b]-吡啶基)、吡啶并嘧啶和蝶啶基。稠环杂环的其他非限制性示例包括苯并稠合杂环基，诸如吲哚基、异吲哚基、假吲哚基(indoleninyl)(也被称为“假吲哚基(pseudoindolyl)”)、异吲唑基(也被称为“苯并吡唑基”或吲唑基)、苯并吡啶基(包括喹啉基(也被称为“1-苯并吡啶基”)和异喹啉基(也被称为“2-苯并吡啶基”))、苯并咪唑基、酞嗪基、喹噁啉基、苯并二嗪基(包括噌啉基(也被称为“1,2-苯并二嗪基”和喹唑啉基(也被称为“1,3-苯并二嗪基”))、苯并噻唑基、4,5,6,7-四氢苯并[d]噻唑基、苯并噻二唑基、苯并咪唑基、苯并三唑基、苯并嗪基(包括1,3,2-苯并嗪基、1,4,2-苯并嗪基、2,3,1-苯并嗪基和3,1,4-苯并嗪基)、苯并异嗪基(包括1,2-苯并异嗪基和1,4-苯并异嗪基)和四氢异喹啉基。
杂环基还可以是但不限于螺环体系，诸如例如1,4-二氧杂-8-氮杂螺[4.5]癸基。杂环基可包含一个或多个硫原子作为环成员；并且在一些情况下，硫原子被氧化成SO或SO2。杂环基中的氮杂原子可以被季铵化或不被季铵化，并且可以被氧化或不被氧化成N-氧化物。此外，氮杂原子可以是或可以不是N-保护的。
杂环或碳环可进一步被取代。除非另外指明，术语“取代的”是指通过用取代基独立地替换一个、两个或三个或更多个氢原子的取代，该取代基包括但不限于-F、-Cl、-Br、-I、羟基、被保护的羟基、-NO2、-N3、-CN、-NH2、被保护的氨基、氧代、硫代、-NH-C2-C8-链烯基、-NH-C2-C8-炔基、-NH-C3-C12-环烷基、-NH-芳基、-NH-杂芳基、-NH-杂环烷基、-二烷基氨基、-二芳基氨基、-二杂芳基氨基、-O-C1-C12-烷基、-O-C2-C8-烯基、炔基、-O-C3-C12-环烷基、-O-芳基、-O-杂芳基、-O-杂环烷基、-C(O)-C1-C12-烷基、-C(O)-C2-C8-烯基、-C(O)-C2-C8-炔基、-C(O)-C3-C12-环烷基、-C(O)-芳基、-C(O)-杂芳基、-C(O)-杂环烷基、-CONH2、-CONH-C1-C12-烷基、-CONH-C2-C8-烯基、-CONH-C2-C8-炔基、-CONH-C3-C12-环烷基、-CONH-芳基、-CONH-杂芳基、-CONH-杂环烷基、-OCO2-C1-C12-烷基、-OCO2-C2-C8-烯基、-OCO2-C2-C8-炔基、-OCO2-C3-C12-环烷基、-OCO2-芳基、-OCO2-杂芳基、-OCO2-杂环烷基、-OCONH2、-OCONH-C1-C12-烷基、-OCONH-C2-C8-烯基、-OCONH-C2-C8-炔基、-OCONH-C3-C12-环烷基、-OCONH-芳基、-OCONH-杂芳基、-OCONH-杂环烷基、-NHC(O)-C1-C12-烷基、-NHC(O)-C2-C8-烯基、-NHC(O)-C2-C8-炔基、-NHC(O)-C3-C12-环烷基、-NHC(O)-芳基、-NHC(O)-杂芳基、-NHC(O)-杂环烷基、-NHCO2-C1-C12-烷基、-NHCO2-C2-C8-烯基、-NHCO2-C2-C8-炔基、-NHCO2-C3-C12-环烷基、-NHCO2芳基、-NHCO2-杂芳基、-NHCO2-杂环烷基、-NHC(O)NH2、-NHC(O)NH-C1-C12-烷基、-NHC(O)NH-C2-C8-烯基、-NHC(O)NH-C2-C8-炔基、-NHC(O)NH-C3-C12-芳基、-NHC(O)NH-芳基、-NHC(O)NH-杂芳基、-NHC(O)NH-杂环烷基、-NHC(S)NH2、-NHC(S)NH-C1-C12-烷基、-NHC(S)NH-C2-C8-烯基、-NHC(S)NH-C2-C8-炔基、-NHC(S)NH-C3-C12-环烷基、-NHC(S)NH-芳基、-NHC(S)NH-杂芳基、-NHC(S)NH-杂环烷基、-NHC(NH)NH2、-NHC(NH)NH-C1-C12-烷基、-NHC(NH)NH-C2-C8-烯基、NHC(NH)NH-C2-C8-炔基、-NHC(NH)NH-C3-C12-环烷基、-NHC(NH)NH-芳基、-NHC(NH)NH-杂芳基、-NHC(NH)NH-杂环烷基、-NHC(NH)-C1-C12-烷基、-NHC(NH)-C2-C8-烯基、-NHC(NH)-C2-C8-炔基、-NHC(NH)-C3-C12-环烷基、-NHC(NH)-芳基、-NHC(NH)-杂芳基、-NHC(NH)-杂环烷基、-C(NH)NH-C1-C12-烷基、-C(NH)NH-C2-C8-烯基、-C(NH)NH-C2-C8-炔基、-C(NH)NH-C3-C12-环烷基、-C(NH)NH-芳基、-C(NH)NH-杂芳基、-C(NH)NH-杂环烷基、-S(O)-C1-C12-烷基、-S(O)-C2-C8-烯基、-S(O)-C2-C8-炔基、-S(O)-C3-C12-环烷基、-S(O)-芳基、-S(O)-杂芳基、-S(O)-杂环烷基、-SO2NH2、-SO2NH-C1-C12-烷基、-SO2NH-C2-C8-烯基、-SO2NH-C2-C8-炔基、-SO2NH-C3-C12-环烷基、-SO2NH-芳基、-SO2NH-杂芳基、-SO2NH-杂环烷基、-NHSO2-C1-C12-烷基、-NHSO2-C2-C8-烯基、-NHSO2-C2-C8-炔基、-NHSO2-C3-C12-环烷基、-NHSO2-芳基、-NHSO2-杂芳基、-NHSO2-杂环烷基、-CH2NH2、-CH2SO2CH3、-芳基、-芳基烷基、-杂芳基、-杂芳基烷基、-杂环烷基、-C3-C12-环烷基、聚烷氧基烷基、聚烷氧基、-甲氧基甲氧基、-甲氧基乙氧基、-SH、-S-C1-C12-烷基、-S-C2-C8-烯基、-S-C2-C8-炔基、-S-C3-C12-环烷基、-S-芳基、-杂芳基、-S-杂环烷基或甲硫基甲基。应当理解，芳基、杂芳基、烷基等可被进一步取代。
术语“N-保护基团”或“N-保护的”是指能够保护氨基基团不发生不期望的反应的那些基团。常用的N-保护基团描述于Greene和Wuts，Protecting Groups in ChemicalSynthesis(第3版，John Wiley&Sons，NY(1999年)中。N-保护基团的非限制性示例包括酰基基团，诸如甲酰基、乙酰基、丙酰基、新戊酰基、叔丁基乙酰基、2-氯乙酰基、2-溴乙酰基、三氟乙酰基、三氯乙酰基、邻苯二甲酰基、o-硝基苯氧基乙酰基、苯甲酰基、4-氯苯甲酰基、4-溴苯甲酰基或4-硝基苯甲酰基；磺酰基基团，诸如苯磺酰基或对甲苯磺酰基；亚磺酰基基团，诸如苯基亚磺酰基(苯基-S-)、三苯基甲基亚磺酰基(三苯甲基-S-)；亚磺酰基基团，诸如对甲基苯基亚磺酰基(对甲基苯基-S(O)-)、叔丁基亚磺酰基(t-Bu-S(O)-)；氨基甲酸酯形成基团，诸如苄氧基羰基、对氯苄氧基羰基、对甲氧基苄氧基羰基、对硝基苄氧基羰基、2-硝基苄氧基羰基、对溴苄氧基羰基、3,4-二甲氧基苄氧基羰基、3,5-二甲氧基苄氧基羰基、2,4-二甲氧基苄氧基羰基、4-甲氧基苄氧基羰基、2-硝基-4,5-二甲氧基苄氧基羰基、3,4,5-三甲氧基苄氧基羰基、1-(对联苯基)-1-甲基乙氧基羰基、二甲基-3,5-二甲氧基苄氧基羰基、二苯甲基氧基羰基、叔丁氧基羰基、二异丙基甲氧基羰基、异丙氧基羰基、乙氧基羰基、甲氧基羰基、烯丙氧基羰基、2,2,2-三氯-乙氧基-羰基、苯氧基羰基、4-硝基-苯氧基羰基、环戊氧基羰基、金刚烷氧基羰基、环己氧基羰基或苯基硫代羰基；烷基基团，诸如苄基、对甲氧基苄基、三苯基甲基或苄氧基甲基；对甲氧基苯基；和甲硅烷基基团，诸如三甲基甲硅烷基。优选的N-保护基团包括甲酰基、乙酰基、苯甲酰基、新戊酰基、叔丁基乙酰基、苯基磺酰基、苄基、叔丁氧羰基(Boc)和苄氧基羰基(Cbz)。
术语“卤素”意指氟、氯、溴或碘。
术语“核外体”是指通过含有转运到在组织的不同位置处的其他细胞的蛋白、脂质和基因材料和其他生物分子的细胞具体有效负载的大部分细胞分泌的小膜囊泡。核外体可被认为是脂质体颗粒。从其获得的核外体或脂质混合物可与其他转染剂或辅助脂质混合物组合使用。核外体也被称为微泡、附睾小体、顶体、核外体样囊泡、微粒、前泌体、前列腺小体、外泌体、肿瘤细胞胞外体、古细胞体和癌小体。在核外体的一个示例中，脂质成分是Lyso-PC(其非限制性示例是C-18、C-16、C-14和混合物)、Lyso-双磷脂酸(其非限制性示例是C-18、C-16和C-14)、鞘磷脂、神经酰胺(其非限制性示例是C-8-C-24)、二饱和PC(其非限制性示例是DSPC、DPPC、DMPC和其中Cn(n＝8-25)的其他示例)、二不饱和PC-MIX(其非限制性示例是DOPC、DP(db)PC)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PI)、二饱和PE(其非限制性示例是DSPE、DPPE、DMPE)、二不饱和PE-MIX(其非限制性示例是DOPE、DP(db)PE)、磷脂酰甘油(PG)(其非限制性示例是C-18-C-22、胆固醇、甘油二酯诸如心磷脂)。
术语“表面配体”或“细胞表面配体”是指将结合到细胞的表面受体的化学化合物或结构。如本文所用，术语“细胞表面受体”是指配体可附接的在细胞表面上的具体化学物质分组。细胞表面受体可以对特定细胞是特异性的，即主要在一种细胞中而不是在另一种类型的细胞中发现(例如，LDL和脱唾液酸糖蛋白受体对肝细胞是特异性的)。受体促进配体和附着分子的内化。细胞表面受体包括但不限于叶酸受体、生物素受体、硫辛酸受体、低密度脂蛋白受体、脱唾液酸糖蛋白受体、胰岛素样生长因子II型/阳离子非依赖性甘露糖-6-磷酸受体、降钙素基因相关肽受体、胰岛素样生长因子I受体、烟碱乙酰胆碱受体、肝细胞生长因子受体、内皮素受体、胆汁酸受体、骨形态发生蛋白受体、软骨诱导因子受体或糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定蛋白(例如，β-肾上腺素能受体、T细胞活化蛋白、Thy-1蛋白、GPI锚定5'核苷酸酶)。这些是非限制性示例。
受体是配体特异性结合并且具有相对高亲和力的分子。它通常是蛋白质或糖蛋白，但也可以是糖脂、脂质多糖、糖胺聚糖或多糖包被。为了本公开的目的，抗体或其片段结合的表位被解释为受体，因为抗原:抗体复合物发生内吞。此外，表面配体包括能够通过细胞吞噬(例如，内吞作用、摄液作用、胞饮作用)进入细胞的任何物质。
如本文所用，术语“配体”是指将与受体结合的化合物或结构。这包括但不限于配体，诸如脱唾液酸血清类粘蛋白、脱唾液酸糖蛋白、硫辛酸、生物素、载脂蛋白E序列、胰岛素样生长因子II、降钙素基因相关肽、促胸腺生成素、肝细胞生长因子、内皮素-1、心房利钠因子、含RGD的细胞黏着肽等。配体也可以是植物病毒运动蛋白或来源于此类蛋白的肽。合适的肽和蛋白质描述于例如美国专利10,538,784号中，其内容据此全文以引用方式并入。
本领域的技术人员将容易地认识到所选择的配体将取决于结合哪个受体。因为不同类型的细胞具有不同受体，根据使用哪个细胞表面配体，这提供将核酸靶向到具体细胞类型的方法。因此，优选的细胞表面配体可取决于靶向的细胞类型。
如本文所用，术语“核定位剂”、“核定位信号”或“核配体”是指配体，诸如肽，其将使共价或非共价连接到其的试剂定位于细胞核，通常通过结合核受体。如本文所用，术语“核受体”是指核膜上的化学基团，其将结合特异性配体并帮助转运配体和附带的连接部分通过核膜。核受体可以是但不限于结合核定位序列的那些受体。核配体的非限制性示例包括GYSTPPKKKRKVEDP(SEQ ID NO.1)、GYSTPPKTRRRP(SEQ ID NO.2)、GYSTPGRKKR(SEQ IDNO.3)、GYSTPRRNRRRRW(SEQ ID NO.4)、PDEVKRKKKPPTSYG(SEQ ID NO.5)、PRRRTKPPTSYG(SEQ ID NO.6)、RKKRGPTSYG(SEQ ID NO.7)、WRRRRNRRPTSYG(SEQ ID NO.8)和(GYGPPKKKRKVEAPYKA(K)20-40K(SEQ ID NO.584)，可用于将核酸转运到细胞核中。
如本文所用，术语“聚阳离子核酸结合部分“是指在生理pH下含有多个正电荷的部分，其允许该部分结合带负电的核酸。聚阳离子核酸结合部分可以连接到例如细胞表面配体、融合剂和/或核定位肽。该连接可以是共价的。合适的聚阳离子核酸结合部分包括含有例如多个赖氨酸残基、鸟氨酸残基或组氨酸残基的多胺和多环肽。
如本文所用，术语“裂解剂”或“核内体释放剂”是指能够分解核内体并将DNA转运蛋白释放到细胞的细胞质中的分子、化合物、蛋白质或肽。此术语包括但不限于病毒、合成化合物、裂解肽或其衍生物。术语“裂解肽”是指渗透膜使得损失膜的结构组织和完整性的任何化学分组。由于存在裂解剂，膜经历裂解、融合或两者。裂解剂/核内体释放剂的示例包括氯喹、多胺和聚酰胺胺。合适的试剂描述于例如ei和Buyanova，Bioconjugate Chem，30:273-283(2009年)和Juliano，Nucleic Acid Therapeutics，28:166-177(2018年)中。
术语“核酸”，当不应用于特定类型的分子诸如未经修饰的DNA或RNA时，是指目前已知的或将来制备或鉴定的任何类型的核酸，条件是当与结构(I)的任何脂质混合时，核酸带足够的负电荷以形成脂质聚集体、脂质体或脂质体样复合物。如本文所用，核酸是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸以及它们的混合物和聚合物。该术语涵盖含有已知核苷酸类似物或经修饰的骨架残基或键联的核酸，该核酸是合成的、天然存在的和非天然存在的，具有类似于参考核酸的结合特性，并且代谢的方式类似于参考核苷酸。此类类似物的示例包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、膦酸甲酯、手性膦酸甲酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽核酸(PNA)。核酸可以是反义分子的形式，例如含有激活RNAseH的RNA-DNA-RNA结构的“间隔寡核苷酸”。核酸可以是例如DNA或RNA，或RNA-DNA杂交体，并且可以是寡核苷酸、质粒、质粒DNA的部分、预缩合的DNA、聚合酶链反应(PCR)的产物、载体、表达盒、嵌合序列、染色体DNA或这些组的衍生物或其他形式的核酸分子。核酸可以是用于通过RNA干扰抑制基因表达的类型的双链RNA分子。核酸可以是短的干扰双链RNA分子(siRNA)。核酸分子也可以是StealthTMRNAi分子(Invitrogen Corporation/Life Technologies Corporation，Carlsbad，CA)。有利地，核酸是单链RNA分子，特别是mRNA分子。另选地，核酸是oRNA，例如，如WO 2020/0237227A中所述，或自扩增RNA。
术语“两亲性肽”是指其二级结构将疏水性氨基酸残基和亲水性氨基酸残基置于肽的不同面上的肽。肽通常采用螺旋二级结构。在一些情况下，两亲性肽也可作为融合剂起作用。适用于本文所述组合物中的两亲肽的示例包括但不限于包含选自由以下组成的组的序列的肽：FEAALAEALAEALA(SEQ ID NO.42、Ac-LARLLPRLLARL-NHCH3(SEQ ID NO.43)、GLLEELLELLEELWEELLEG(SEQ ID NO.44)、GWEGLIEGIEGGWEGLIEG(SEQ ID NO.45)、GLFEALAEFIEGGWEGLIEG(SEQ ID NO.46)、GLFEALLELLESLWELLLEA(SEQ ID NO.47)、GGYCLEKWMIVASELKCFGNTA(SEQ ID NO.48)、GGYCLTRWMLIEAELKCFGNTAV(SEQ ID NO.49)和WEAALAEALAEALAEHLAEALAEALEALAA(SEQ ID NO.50)。两亲性肽可例如经由共价键任选地连接到聚阳离子核酸结合部分。
结构(I)的化合物的具体示例包括具有以下结构的化合物：
在这些分子中，R1或R2各自例如可以是但不限于C14-18烷基或C14-18烯基；并且R9各自独立地可以是但不限于H、-(CO)C14-C18烷基或-(CO)C14-C18烯基。
本领域技术人员将认识到，尽管本发明的分子在这里为了方便以它们的中性(未质子化的)形式显示，但是这些分子将以部分或完全质子化的形式存在于适当pH的溶液中，并且本发明包括所有它们的质子化、未质子化、离子化和非离子化形式的分子，没有限制，除非另外特别指出。
脂质的制备
通式结构(I)的对称阳离子脂质和非对称阳离子脂质可使用本领域公知的方法合成，如例如方案1所示。
方案1
方酰胺类似物的合成
化合物(诸如24)的合成示于方案1中。通常，化合物20与胺(诸如21)组合。然后使产物22与胺23反应以产生最终产物24。
1,4,8,11-四氮杂环十四烷(cyclam)类似物的合成
方案2
烷基取代的cyclam是本领域公知的，并且可以通过例如美国专利3,860,576号和4,168,265号中描述的方法制备，这两篇专利均援引加入。
通常，在碱基(诸如N,N-二异丙基乙胺)的存在下，用化合物(诸如27)将cyclam(诸如26)烷基化以产生28。仲胺可以用boc保护以产生29。与肼水合物在醇(诸如乙醇)中于回流条件下温育16小时将产生伯胺30，其可以用2当量的31烷基化，之后在强酸(诸如HCL)中温育产生化合物32。另选地，用33烷基化以产生烯烃34。
方案3
化合物38的合成可以如下完成：使cyclam 26与环氧化物35反应以形成氨基醇，之后进行胺的肼介导的脱保护以产生36。然后胺发生酰化、LAH介导的酰胺还原和盐形成以产生38。
化合物39的合成可通过使36与酰氯反应，之后进行酸化来完成。
方案4
步骤a的酒石酸二甲酯4-1可以用烷基胺在升高的温度下(例如，70℃)在密封的压力反应器中处理以获得化合物4-2。该化合物可以如步骤b中所示用甲磺酸烷基酯烷基化以获得化合物4-3，然后在步骤c中使用氢化铝锂还原以产生二胺4-4。化合物4-4可以与N-(3-溴丙基)-邻苯二甲酰亚胺反应，之后进行肼解以提供四胺4-5，如步骤d中所示。然后可使化合物4-5在步骤e中与3-(甲基氨基)-4-甲氧基环丁-3-烯-1,2-二酮反应以提供化合物4-6。3-(甲基氨基)-4-甲氧基环丁-3-烯-1,2-二酮可通过3,4-二甲氧基-3-环丁烯-1,2-二酮与甲胺反应获得。
另选地，非对称阳离子脂质(即，缺乏对称平面的化合物)可使用例如酒石酸单酯来制备，该酒石酸单酯易于由二乙酰酒石酸酐制备(参见Organic Syntheses,Coll.第4卷，第242页(1963年)；第35卷，第49页(1955年))，如图所示。参见方案5。保护二醇(g)，之后进行DIBAL还原、还原胺化和胺保护(h)产生被保护的2,3,4-三羟基丁胺。温和氧化、还原胺化和保护产生差异保护的2,3-二羟基-1,4-二胺化合物(i)。二醇脱保护和烷基化产生化合物5-5。然后可以使用类似于方案4中那些的逐步选择性胺脱保护和偶联反应来制备非对称化合物。
方案6步骤k至p中所示的类似合成路线可用于制备其中长链部分经由酯部分连接的化合物。
方案5
方案6
结构(I)的化合物可通过本领域熟知的方法由上述结构4的中间体制备。例如，其中R2是烷基的化合物4可以与合适的被保护的环氧胺(例如，环氧邻苯二甲酰亚胺)反应，之后进行脱保护以提供β-羟基胺，诸如
制备结构(I)的化合物的其他方法对本领域技术人员来说是显而易见的。例如，被保护的碳水化合物分子的还原胺化可用于提供在R2中含有多个羟基基团的结构(I)的化合物。
结构(I)的脂质可与一种或多种核酸组合以将核酸递送至靶细胞或组织。然而，有利地，脂质与附加组分以及核酸一起组合，如下文所详述。在某些实施方案中，结构(I)的脂质与一种或多种附加组分和一种或多种核酸组合以形成脂质纳米颗粒组合物。
阳离子脂质/可离子化脂质制剂
本文提供的阳离子脂质/可离子化脂质组合物涵盖脂质纳米颗粒、脂质体(例如，脂质囊泡)和脂质体复合物形式的复合物。如本文所用，术语“脂质体”涵盖由脂质双层包封的任何隔室。术语脂质体包括单室囊，其由单个脂质双层构成，并且通常具有约20nm至约400nm范围内的直径。脂质体也可以是直径在大约1μm至大约10μm范围内的多室。多室脂质体可由若干个(从两个到数百个)单室囊组成，形成一个在另一个内部，尺寸逐渐缩小，产生由水层分隔的同心磷脂球的多室结构。另选地，多室脂质体可以由大脂质体内的许多较小的非同心脂质球组成。在实施方案中，脂质体包括多室囊(MLV)、大单室囊(LUV)以及小单室囊(SUV)。在一些实施方案中，该组合物包含含有任何合适的可离子化脂质和中性脂质以及本文提供的肽的脂质体。
在一些实施方案中，该组合物包含脂质纳米颗粒(LNP)。LNP组合物的尺寸通常为微米级或小，并且可包括脂质双层。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒组合物包含脂质制剂，其中该尺寸为约20nm至约1μm。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒组合物包含脂质制剂，其中该尺寸为约20nm至约900μm。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒组合物包含脂质制剂，其中该尺寸为约20nm至约800μm。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒组合物包含脂质制剂，其中该尺寸为约20nm至约700μm。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒组合物包含脂质制剂，其中该尺寸为约20nm至约600μm。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒组合物包含脂质制剂，其中该尺寸为约20nm至约500μm。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒组合物包含脂质制剂，其中该尺寸为约20nm至约400μm。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒组合物包含脂质制剂，其中该尺寸为约20nm至约300μm。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒组合物包含脂质制剂，其中该尺寸为约20nm至约200μm。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒组合物包含脂质制剂，其中该尺寸为约20nm至约100μm。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒组合物包含脂质制剂，其中该尺寸为约20nm至约50μm。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒组合物包含脂质制剂，其中该尺寸为约100nm至约900μm。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒组合物包含脂质制剂，其中该尺寸为约100nm至约800μm。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒组合物包含脂质制剂，其中该尺寸为约100nm至约700μm。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒组合物包含脂质制剂，其中该尺寸为约100nm至约600μm。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒组合物包含脂质制剂，其中该尺寸为约100nm至约500μm。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒组合物包含脂质制剂，其中该尺寸为约100nm至约400μm。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒组合物包含脂质制剂，其中该尺寸为约100nm至约300μm。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒组合物包含脂质制剂，其中该尺寸为约100nm至约200μm。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒组合物包含脂质制剂，其中该尺寸为约100nm至约150μm。
在实施方案中，该组合物包含如本文所提供的结构(I)的脂质，包括其实施方案，还包括生物活性剂。如本文所提供的“生物活性剂”是指在施用于细胞，组织或生物体时对所述细胞，组织或生物体的生物学功能具有可检测的作用的化合物。在实施方案中，可检测的作用是生物学作用。在实施方案中，可检测的作用是治疗作用。在实施方案中，可检测的作用是诊断作用。生物活性剂能够与本文提供的包括其实施方案的组合物形成脂质聚集体。在实施方案中，生物活性剂是测试化合物。如本文提供的“测试化合物”是相对于对照化合物确定其对生物学功能的影响的化合物。如本文所提供的“对照化合物”是指对生物学功能具有已知作用的化合物。在实施方案中，生物活性剂是对照化合物。在实施方案中，生物活性剂是治疗剂或诊断剂。在实施方案中，生物活性剂是治疗剂或诊断剂。在实施方案中，生物活性剂是治疗剂。在实施方案中，生物活性剂是诊断剂。在实施方案中，生物活性剂包括蛋白质。在实施方案中，生物活性剂包括核酸，核糖核蛋白或小分子。在实施方案中，生物活性剂包括核酸。在实施方案中，生物活性剂包括核糖核蛋白。在实施方案中，生物活性剂包括小分子。在实施方案中，核酸是mRNA、siRNA、miRNA或引导RNA(gRNA)。在实施方案中，核酸是mRNA。在实施方案中，核糖核酸是siRNA。在实施方案中，核糖核酸是miRNA。在实施方案中，核酸是gRNA。在实施方案中，生物活性剂包括核酸和核糖核蛋白。在实施方案中，核糖核蛋白是CRISPR相关蛋白9(Cas9)。如本文所提供的“mRNA”是指核糖核酸分子，其包括一种或多种编码一种或多种蛋白质或多肽或其他DNA分子的可表达核酸序列。
将结构(I)的脂质与核酸和/或蛋白质有效负载组合以产生脂质复合物制剂。例如，结构(I)的脂质与选自以下中的一种或多种的有效负载组合：siRNA、miRNA、mRNA、shRNA、自扩增RNA、stRNA、oRNA(或非天然存在的环状RNA)、反义寡核苷酸(ASO)、gRNA、核糖核蛋白(例如，CRISPR复合物)、dsDNA、质粒DNA等。
在递送核酸的情况下，脂质复合物制剂中核酸(例如，mRNA、自扩增RNA等)的量可取决于核酸的大小、序列和其他特性。脂质复合物制剂中核酸的量还可取决于脂质复合物制剂的大小、组成、期望的靶标和其他特性。mRNA和其他元素(例如，脂质)的相对量也可以变化。在一些实施方案中，脂质复合物组合物中脂质组分与核酸(诸如mRNA)的重量/重量比可为约5:1至约50:1，诸如5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1和50:1。例如，脂质组分与核酸(诸如mRNA)的重量/重量比可为约10:1至约40:1。脂质复合物组合物中核酸的量可例如使用吸收光谱法(例如，紫外-可见(UV-vis)光谱法)测量。
脂质复合物制剂可包含浓度为大约0.1mg/ml至2mg/ml的核酸，诸如但不限于0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.6mg/ml、0.7mg/ml、0.8mg/ml、0.9mg/ml、1.0mg/ml、1.1mg/ml、1.2mg/ml、1.3mg/ml、1.4mg/ml、1.5mg/ml、1.6mg/ml、1.7mg/ml、1.8mg/ml、1.9mg/ml、2.0mg/ml或大于2.0mg/ml。
优选地，可选择一种或多种核酸(例如，mRNA)、脂质以及它们的量以提供特定的N:P比。组合物的N:P比是指一种或多种脂质中的氮原子与核酸(例如，mRNA)中的磷酸酯基团数目的摩尔比。一般来讲，优选较低的N:P比。可选择一种或多种mRNA、脂质以及它们的量以提供约2:1至约8:1，诸如2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1和8:1的N:P比。在某些实施方案中，N:P比可为约2:1至约5:1。在优选实施方案中，N:P比可为约4:1。在其他实施方案中，N:P比为约5:1至约8:1。例如，N:P比可为约5.0:1、约5.5:1、约5.67:1、约6.0:1、约6.5:1或约7.0:1。附加的脂质组分
有利地，除了结构(I)的脂质之外，脂质复合物制剂还包含一种或多种共脂质，最有利地是中性共脂质，尽管本领域技术人员将认识到可以使用其他脂质，包括阳离子脂质/可离子化脂质。然而，一些制剂仅包含与核酸组合的结构(I)的脂质。
本文所述的可离子化脂质是指具有至少一个可质子化基团或可去质子化基团的脂质，使得脂质在等于或低于生理pH(例如，pH 7.4)的pH下是带正电的，并且在第二pH下，优选在等于或高于生理pH下为中性。优选地，当并入脂质复合物(诸如例如脂质纳米颗粒和脂质体)中时，本文提供的可离子化脂质具有约4至约11，例如约4至约7，例如约5和7之间，诸如约5.5和6.9之间的可质子化基团的pKa。
因此，除了结构(I)的脂质外，脂质复合物制剂还包含中性脂质(诸如磷脂)。可用于本文公开的组合物中的磷脂包括但不限于DOPE、DPhPE、DOPC、Lyso-PE(1-酰基-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、Lyso-PC(1-酰基-3-羟基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰油酰-磷脂酰乙醇胺(POPE)和二油酰磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-羧酸酯(DOPE-mal)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰磷脂乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、16-O-单甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE、1-硬脂酰-2-油酰基-磷脂酰乙醇胺(SOPE)和1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂乙醇胺(反式DOPE)或它们的任何组合。可用于本文提供的组合物中的磷脂可以例如以脂质复合物制剂的约5摩尔％至约20摩尔％存在。有利地，磷脂以约1摩尔％至约40摩尔％，例如1摩尔％至约25摩尔％的范围存在。优选地，本文公开的脂质复合物制剂中磷脂的量为总脂质复合物制剂的至少约0.5摩尔％、1摩尔％、2摩尔％、3摩尔％、4摩尔％、5摩尔％、6摩尔％、7摩尔％、8摩尔％、9摩尔％、10摩尔％、12摩尔％、14摩尔％、16摩尔％、18摩尔％或20摩尔％，或其间的任何量。
可有利地包括在本文提供的脂质复合物制剂中的其他中性脂质包括甾醇或含有甾醇部分(“甾醇衍生物”)的脂质。如本文所定义的，“甾醇”是由类固醇醇组成的类固醇亚组。可用于本文提供的脂质复合物制剂中的示例性甾醇和含有甾醇部分的脂质包括但不限于多孔甾醇、粪生甾醇、谷甾醇、麦角甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、芸苔甾醇、番茄碱、番茄素、乌索酸、α-生育酚、藿烷类、植物甾醇、类固醇以及它们的混合物。在一些实施方案中，结构脂质是甾醇。本文提供的一些脂质复合物制剂包含甾醇或甾醇衍生物。甾醇或甾醇衍生物可以总脂质复合物制剂的约5摩尔％至60摩尔％存在。有利地，甾醇或甾醇衍生物以约15摩尔％至50摩尔％，例如25摩尔％至40摩尔％存在。优选地，本文公开的脂质组合物中甾醇(诸如胆固醇)或甾醇衍生物的量为总脂质制剂的至少约20摩尔％、21摩尔％、22摩尔％、23摩尔％、24摩尔％、25摩尔％、26摩尔％、27摩尔％、28摩尔％、29摩尔％、30摩尔％、31摩尔％、32摩尔％、33摩尔％、34摩尔％、35摩尔％、36摩尔％、37摩尔％、38摩尔％、39摩尔％、40摩尔％、41摩尔％、42摩尔％、43摩尔％、44摩尔％、45摩尔％、46摩尔％、47摩尔％、48摩尔％、49摩尔％、50摩尔％、51摩尔％、52摩尔％、53摩尔％、54摩尔％、55摩尔％、56摩尔％、57摩尔％、58摩尔％、59摩尔％或60摩尔％。本文提供的一些脂质复合物制剂不包含甾醇或甾醇衍生物。
本文提供的脂质复合物制剂还可包含稳定剂，诸如稳定脂质。稳定脂质可以是中性脂质，或者它们可以是带电荷的。可有利地用于本文提供的制剂中的稳定脂质包括但不限于聚乙二醇(PEG)修饰的脂质。PEG-脂质的非限制性示例包括PEG修饰的磷脂酰乙醇胺和磷脂酸、PEG-神经酰胺缀合物(例如，PEG-CerC14或PEG-CerC20)、PEG修饰的二烷基胺和PEG修饰的1,2-二酰氧基丙烷-3-胺。此类脂质也被称为聚乙二醇化的脂质。例如，PEG脂质可以是PEG-c-DOMG、PEG-DMG、PEG-DLPE、PEG-DMPE、PEG-DPPC或PEG-DSPE脂质。可用于本文公开的组合物中的其他稳定脂质包括例如聚乙二醇脂质、聚氧乙烯烷基醚、二嵌段聚氧乙烯醚共聚物、三嵌段聚氧乙烯烷基醚共聚物和两亲性支化聚合物。在实施方案中，稳定剂可以是聚氧乙烯(20)油基醚、聚氧乙烯(23)月桂基醚、聚氧乙烯(40)硬脂酸酯(“Myrj52”)、聚(丙二醇)11-嵌段-聚(乙二醇)16-嵌段-聚(丙二醇)11、聚(丙二醇)12-嵌段-聚(乙二醇)28-嵌段-聚(丙二醇)12、聚山梨酸酯80(也被称为吐温80，IUPAC名称2-[2-[3,4-双(2-羟基乙氧基)氧戊环-2-基]-2-(2-羟基乙氧基)乙氧基]乙基十八-9-烯酸酯)、Myrj52(聚氧乙烯(40)硬脂酸酯)、BrijTMS10(聚氧乙烯(10)硬脂基醚)、BRIJTML4＝聚氧乙烯(4)月桂基醚；BRIJTMS20＝聚氧乙烯(20)硬脂基醚；BRIJTMS35＝聚氧乙烯(23)月桂基醚；TPGS1000＝D-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯；等比例的吐温20/聚山梨醇酯80/十三烷基-D-麦芽糖苷以及它们的组合。在某些组合物中，稳定剂以脂质复合物制剂的约0.1摩尔％至5摩尔％存在。例如，在一些组合物中，稳定剂以脂质复合物制剂的约0.5摩尔％、1摩尔％、1.5摩尔％、2摩尔％、2.5摩尔％、3摩尔％、3.5摩尔％、4摩尔％、4.5摩尔％、5摩尔％或其间的任何值存在。
除了结构(I)的脂质之外，脂质复合物制剂还可包含一种或多种阳离子脂质/可离子化脂质。例如，一些脂质复合物制剂包含阳离子脂质/可离子化脂质，该阳离子脂质/可离子化脂质选自由以下组成的组：DOTMA、DOTAP、DMRIE、DC-Chol、DDAB、DOSPA、DOSPER、DOGS、TMTPS、TMTOS、TMTLS、TMTMS、TMDOS、N-1-二甲基-N-1-(2,3-二油酰氧基氧基丙基)-2-羟基丙烷-1,3-二胺、N-1-二甲基-N-1-(2,3-二肉豆蔻基氧基丙基)-2-羟基丙烷-1,3-二胺、N-1-二甲基-N-1-(2,3-二棕榈基氧基丙基)-2-羟基丙烷-1,3-二胺、N-1-二甲基-N-1-(2,3-二油酰氧基丙基)-2-(3-氨基-2-羟基丙氧基)丙烷-1,3-二胺、N-1-二甲基-N-1-(2,3-二肉豆蔻基氧基丙基)-2-(3-氨基-2-羟基丙氧基)丙烷-1,3-二胺、N-1-二甲基-N-1-(2,3-二棕榈基氧基丙基)-2-(3-氨基-2-羟基丙氧基)丙烷-1,3-二胺、L-精胺-5-羧基-3-(DL-1,2-二棕榈酰基-二甲氨基丙基-β-羟乙胺、3,5-(N,N-二赖氨酰基)-二氨基苯甲酰基-甘氨酰基-3-(DL-1,2-二棕榈酰基-二甲氨基丙基-β-羟乙胺)、L-赖氨酸-双(O,O'-油酰基-β-羟基乙基)酰胺二盐酸盐、L-赖氨酸-双-(O,O'-油酰基-β-羟基乙基)酰胺二盐酸盐、1,4-双[(3-(3-氨基丙基)-烷基氨基)-2-羟基丙基)哌嗪、L-赖氨酸-双-(O,O'-肉豆寇酰-β-羟基乙基)酰胺二盐酸盐、L-鸟氨酸-双-(O,O'-肉豆寇酰-β-羟基乙基)酰胺二盐酸盐、L-鸟氨酸-双-(O,O'-油酰基-β-羟基乙基)酰胺二盐酸盐、1,4-双[(3-(3-氨基丙基)-油烯基氨基)-2-羟基丙基]哌嗪、L-鸟氨酸-双-(O,O'-棕榈酰基-β-羟基乙基)酰胺二盐酸盐、1,4,-双[(3-氨基-2-羟基丙基)-油烯基氨基]-丁烷-2,3-二醇、1,4,-双[(3-氨基-2-羟基丙基)-棕榈基氨基]-丁烷-2,3-二醇、1,4,-双[(3-氨基-2-羟基丙基)-肉豆蔻基氨基]-丁烷-2,3-二醇、1,4,-双[(3-油烯基氨基)丙基]哌嗪、L-精氨酸-双-(O,O'-油酰基-β-羟基乙基)酰胺二盐酸盐、双[(3-(3-氨基丙基)-肉豆蔻基氨基)2-羟基丙基]哌嗪、L-精氨酸-双-(O,O'-棕榈酰基-β-羟基乙基)酰胺二盐酸盐、L-丝氨酸-双-(O,O'-油酰基-β-羟基乙基)酰胺二盐酸盐、1,4-双[(3-(3-氨基丙基)-棕榈基氨基)-2-羟基丙基]哌嗪、甘氨酸-双-(O,O'-棕榈酰基-β-羟基乙基)酰胺二盐酸盐、肌氨酸-双-(O,O'-棕榈酰基-β-羟基乙基)酰胺二盐酸盐、L-组氨酸-双-(O,O'-棕榈酰基-β-羟基乙基)酰胺二盐酸盐、胆甾醇基-3β-羧基-酰胺基乙烯三甲胺碘化物、1,4-双[(3-肉豆蔻基氨基)丙基]哌嗪、1-二甲基氨基-3-三甲基铵基-DL-2-丙基-胆甾醇羧酸酯碘化物、胆甾醇基-3β-羧基酰胺基乙烯胺、胆甾醇基-3β-氧基琥珀酰胺乙烯三甲胺碘化物、1-二甲基氨基-3-三甲基铵基-DL-2-丙基-胆甾醇基-3β-氧基琥珀酸碘化物、2-[(2-三甲基铵基)-乙基甲基氨基]乙基-胆甾醇基-3β-氧基琥珀酸碘化物、3β[N-(N',N'-二甲基氨基乙烷)氨基甲酰基]胆固醇以及3β-[N-(聚乙烯亚胺)-氨基甲酰基]胆固醇、1,4-双[(3-棕榈基氨基)丙基]哌嗪、L-鸟氨酰基甘氨酰基-N-(1-十七烷基十八烷基)甘氨酰胺、N2,N5-双(3-氨基丙基)-L-鸟氨酰基甘氨酰基-N-(1-十七烷基十八烷基)甘氨酰胺、1,4-双[(3-(3-氨基-2-羟基丙基)-烷基氨基)-2-羟基丙基]哌嗪、N2-[N2,N5-双(3-氨基丙基)-L-鸟氨酰基]-N,N-双十八烷基-L-谷氨酰胺、N2-[N2,N5-双(氨基丙基)-L-鸟氨酰基]-N-N-双十八烷基-L-α-谷氨酰胺、1,4-双[(3-(3-氨基-2-羟基丙基)-油烯基氨基)2-羟基丙基]哌嗪，
N2-[N2,N5-双(氨基丙基)-L-鸟氨酰基]-N-N-双十八烷基-L-α-天冬酰胺、N-[N2-[N2,N5-双[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]-N2,N5-双[3-[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]氨基丙基]-L-鸟氨酰基-N-N-双十八烷基-L-谷氨酰胺酰]-L-谷氨酸、N2-[N2,N5-双(3-氨基丙基)-L-鸟氨酰基]-N,N-二醇基-L-谷氨酰胺、N2-[N2,N5-双(氨基丙基)-L-鸟氨酰基]-N-N-二油烯基-L-α-谷氨酰胺、4-双[(3-(3-氨基-2-羟基丙基)-肉豆蔻基氨基)-2-羟基丙基]哌嗪，
N2-[N2,N5-双(氨基丙基)-L-鸟氨酰基]-N-N-二油烯基-L-α-天冬酰胺、N-[N2-[N2,N5-双[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]-N2,N5-双[3-[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]氨基丙基]-L-鸟氨酰基-N-N-二油烯基-L-谷氨酰胺酰基]-L-谷氨酸、1,4-双[(3-(3-氨基丙基)-油烯基氨基)丙基]哌嗪、N2-[N2,N5-双(3-氨基丙基)-L-鸟氨酰基]-N,N-二棕榈基-L-谷氨酰胺、N2-[N2,N5-双(氨基丙基)-L-鸟氨酰基]-N-N-二棕榈基-L-α-谷氨酰胺、N2-[N2,N5-双(氨基丙基)-L-鸟氨酰基]-N-N-二棕榈基-L-α-天冬酰胺，
N-[N2-[N2,N5-双[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]-N2,N5-双[3-[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]氨基丙基]-L-鸟氨酰基-N-N-二棕榈基-L-谷氨酰胺]-L-
谷氨酸、N2-[N2,N5-双(3-氨基丙基)-L-鸟氨酰基]-N,N-二肉豆蔻基-L-谷氨酰胺，
N2-[N2,N5-双(氨基丙基)-L-鸟氨酰基]-N-N-二肉豆蔻基-L-α-谷氨酰胺、N2-[N2,N5-双(氨基丙基)-L-鸟氨酰基]-N-N-二肉豆蔻基-L-α-天冬酰胺、1,4-双[(3-(3-氨基-2-羟基丙基)-棕榈基氨基)-2-羟基丙基]哌嗪、N-[N2-[N2,N5-双[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]-N2,N5-双[3-[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]氨基丙基]-L-鸟氨酰基-N-N-二肉豆蔻基-L-谷氨酰胺酰]-L-谷氨酸、1,4-双[(3-(3-氨基丙基)-肉豆蔻基氨基)丙基]哌嗪、N2-[N2,N5-双(3-氨基丙基)-L-鸟氨酰基]-N,N-二月桂基-L-谷氨酰胺、N2-[N2,N5-双(氨基丙基)-L-鸟氨酰基]-N-N-二月桂基-L-α-谷氨酰胺，
N2-[N2,N5-双(氨基丙基)-L-鸟氨酰基]-N-N-二月桂基-L-α-天冬酰胺、N-[N2-[N2,N5-双[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]-N2,N5-双[3-[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]氨基丙基]-L-鸟氨酸-N-N-二月桂基-L-谷氨酰胺酰基]-L-谷氨酸、3-[N',N"-双(2-叔丁氧基羰基氨基乙基)胍基]-N,N-双十八烷基-9-烯基丙酰胺、3-[N',N"-双(2-叔丁氧基羰基氨基乙基)胍基]-N,N-双棕榈基丙酰胺、3-[N',N"-双(2-叔丁氧基羰基氨基乙基)胍基]-N,N-双棕榈基丙酰胺、1,4-双[(3-(3-氨基丙基)-棕榈基氨基)丙基]哌嗪、1,4-双[(3-(3-氨基-2-羟基丙基)-油烯基氨基)丙基]哌嗪、N,N-(2-羟基-3-氨基丙基)-N-2-羟基丙基-3-N,N-二油烯基氨基丙烷、N,N-(2-羟基-3-氨基丙基)-N-2-羟基丙基-3-N,N-二棕榈基氨基丙烷、N,N-(2-羟基-3-氨基丙基)-N-2-羟基丙基-3-N,N-二肉豆蔻基氨基氨基丙烷、1,4-双[(3-(3-氨基-2-羟基丙基)-肉豆蔻基氨基)丙基]哌嗪、[(3-氨基丙基)-双-(2-十四烷基乙氧基)]甲基溴化铵、[(3-氨基丙基)-双-(2-油烯基乙氧基)]甲基溴化铵、[(3-氨基丙基)-双-(2-棕榈基乙氧基)]甲基溴化铵、油酰基-2-羟基-3-N,N-二甲基氨基丙烷、2-二癸酰基-1-N,N-二甲基氨基丙烷、棕榈酰基-2-羟基-3-N,N-二甲基氨基丙烷、1,2-二棕榈酰基-1-N,N-二甲基氨基丙烷、肉豆蔻酰-2-羟基-3-N,N-二甲基氨基丙烷、1,2-二肉豆蔻酰-1-N,N-二甲基氨基丙烷、(3-氨基-丙基)-4-(3-氨基-丙基氨基)-4-十四烷基氨基甲酰基-丁胺甲酸胆固醇酯、(3-氨基-丙基)-4-(3-氨基-丙基氨基)-4-氨基甲酰基丁胺甲酸胆固醇酯、(3-氨基-丙基)-4-(3-氨基-丙基氨基)-4-(2-二甲基氨基-乙基氨基甲酰基)-丁胺甲酸胆固醇酯、精胺-5-羧基甘氨酸(N'-硬脂基-N'-油烯基)酰胺四三氟乙酸盐、精胺-5-羧基甘氨酸(N'-硬脂基-N'-反油基)酰胺四三氟乙酸盐、胍丁胺基羧基胆固醇乙酸盐、精胺-5-羧基-β-丙氨酸胆固醇酯四三氟乙酸盐、2,6-二氨基己烯基β-丙氨酸胆固醇酯双三氟乙酸盐、2,4-二氨基丁酰基β-丙氨酸胆固醇酯双三氟乙酸盐、N,N-双(3-氨基丙基)-3-氨基丙酰基β-丙氨酸胆固醇酯三三氟乙酸盐、[N,N-双(2-羟基乙基)-2-氨基乙基]氨基羧基胆固醇酯、硬脂基肉碱酯、棕榈酰肉碱酯、肉豆蔻基肉碱酯、硬脂基硬脂酰肉碱酯盐酸盐、L-硬脂基硬脂酰肉碱酯、硬脂基油酰基肉碱酯盐酸盐、棕榈基棕榈酰肉碱酯盐酸盐、肉豆蔻基肉豆寇酰肉碱酯盐酸盐、L-肉豆蔻基肉豆寇酰肉碱酯盐酸盐、1,4-双[(3-(3-氨基-2-羟基丙基)-棕榈基氨基)丙基]哌嗪、N-(3-氨基丙基)-N,N'-双-(十二烷基乙氧基)-哌嗪溴化物、N-(3-氨基丙基)-N,N'-双-(油烯基乙氧基)-哌嗪溴化物、N-(3-氨基丙基)-N,N'-双-(棕榈基乙氧基)-哌嗪溴化物、N-(3-氨基丙基)-N,N'-双-(肉豆蔻基乙氧基)-哌嗪溴化物、N-(3-氨基丙基)-N'-甲基-N,N'-(双-2-十二烷基乙氧基)-哌嗪溴化物、N-(3-氨基丙基)-N'-甲基-N,N'-(双-2-油烯基乙氧基)-哌嗪溴化物、N-(3-氨基丙基)-N'-甲基-N,N'-(双-2-棕榈基乙氧基)-哌嗪溴化物、N-(3-氨基丙基)-N'-甲基-N,N'-(双-2-肉豆蔻基乙氧基)-哌嗪溴化物、1,4-双[(3-(3-氨基丙基)-油烯基氨基)-2-羟基-丙基]哌嗪、1,4-双[(3-(3-氨基丙基)-肉豆蔻基氨基)-2-羟基-丙基]哌嗪以及1,4-双[(3-(3-氨基丙基)-棕榈基氨基)-2-羟基-丙基]哌嗪、KL22、KL25、1,2-二亚油烯基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLin-DMA)、2,2-二亚油烯基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]二氧戊环(DLin-K-DMA)、三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基4-(二甲基氨基)丁酸酯(DLin-MC3-DMA或MC3)、2,2-二亚油烯基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、1,2-二油烯基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DODMA)、2-({8-[(3.β.)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙烷-1-胺(辛基-CLinDMA)、(2R)-2-({8-[(3.β.)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z-,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙烷-1-胺(辛基-CLinDMA(2R))和(2S)-2-({8-[(3)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙烷-1-胺(辛基-CLinDMA(2S))。
优选地，结构(I)的脂质或结构(I)的脂质与一种或多种阳离子脂质/可离子化脂质的组合以脂质复合物制剂的约5摩尔％至80摩尔％存在。例如，一些脂质复合物制剂包括小于50摩尔％的结构(I)，或结构(I)与一种或多种附加的阳离子脂质/可离子化脂质的组合。其他脂质复合物制剂包括大于50摩尔％的结构(I)，或结构(I)与一种或多种附加的阳离子脂质/可离子化脂质的组合。
因此，一些脂质复合物制剂包含结构(I)的脂质，或结构(I)与一种或多种阳离子脂质/可离子化脂质(占脂质复合物制剂的15摩尔％至80摩尔％)、甾醇(占脂质复合物制剂的20摩尔％至60摩尔％)、稳定剂(占脂质复合物制剂的0.5摩尔％至5摩尔％)和磷脂(占脂质复合物制剂的1摩尔％至40摩尔％)的组合。示例性脂质复合物制剂可包含约20摩尔％至60摩尔％的结构(I)脂质，或结构(I)脂质与一种或多种附加的阳离子脂质/可离子化脂质的组合、约5摩尔％至25摩尔％的磷脂、约25摩尔％至55摩尔％的甾醇或甾醇衍生物；和约0.5摩尔％至15摩尔％的稳定剂。另一示例性脂质复合物制剂包含约50摩尔％的结构(I)的脂质，或结构(I)的脂质与一种或多种阳离子脂质/可离子化脂质的组合、约1.5摩尔％的稳定剂、约38.5摩尔％的甾醇或甾醇衍生物和约10摩尔％的磷脂。另一示例性脂质复合物制剂包含约55摩尔％的结构(I)的脂质，或结构(I)的脂质与一种或多种阳离子脂质/可离子化脂质的组合、约2.5摩尔％的稳定剂、约32.5摩尔％的甾醇或甾醇衍生物和约10摩尔％的磷脂。
多胺组分
其他制剂还可包括一种或多种多胺转染剂，诸如致密星形树枝状体、PAMAM树枝状体、NH3核树枝状体、乙二胺核树枝状体、第5代或更高代的树枝状体、具有取代基团的树枝状体、包含一个或多个氨基酸的树枝状体、接枝树枝状体、活化树枝状体、聚乙烯亚胺和/或聚乙烯亚胺缀合物。
转染增强剂
其他制剂可包括转染增强剂，诸如融合剂(诸如核内体释放剂)、细胞表面配体和/或核定位剂，诸如核受体配体肽。转染增强剂的示例包括但不限于呼肠孤病毒相关基因融合肽(参见WO07/130073，其以引用方式全文并入本文)、胰岛素、转铁蛋白、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、细胞靶向抗体、乳铁蛋白、纤粘蛋白、腺病毒五邻体碱基、球节(Knob)、六邻体蛋白、水泡性口炎病毒醣蛋白、胜利基森林病毒核心蛋白、流感红血球凝集素、B型肝炎核心蛋白、HIV Tat蛋白、单纯疱疹病毒VP22蛋白、组蛋白蛋白、富精氨酸细胞透过性蛋白、高移动性基团蛋白和侵袭素蛋白、内化蛋白蛋白、内毒素、白喉毒素、志贺杆菌属毒素、蜂毒肽、爪蟾抗菌肽、短杆菌肽、天蚕抗菌肽、防御素、抗微生物肽、鲎素、硫素、indolicidin、牛抗菌肽、果蝇霉素、蜜蜂抗菌肽、组织蛋白酶抑制素、杀菌-透气-提高蛋白、乳链菌肽、蟾蜍苷元以及它们的片段。可用于本文提供的组合物中的其他细胞穿透肽包括下表2中提供的那些：
表2
本文提供的脂质复合物组合物还可与一种或多种核外体或衍生自或纯化自核外体的生物材料(例如、脂质、蛋白质、核酸等)组合。
示例性组合物可包含，例如，结构(I)的脂质和一种或多种核外体；结构(I)的脂质，以及一种或多种核外体和一种或多种中性脂质；结构(I)的脂质，以及一种或多种核外体、一种或多种中性脂质和一种或多种稳定剂；结构(I)的脂质，以及一种或多种核外体和一种或多种中性脂质，任选地一种或多种稳定剂和任选地一种或多种细胞穿透肽。
其他示例性组合物包含，例如：结构(I)的脂质，和一种或多种衍生自或纯化自核外体的生物材料；结构(I)的脂质，以及衍生自或纯化自核外体的一种或多种生物材料和一种或多种中性脂质；结构(I)的脂质，以及衍生自或纯化自核外体的一种或多种生物材料、一种或多种中性脂质和或多种稳定剂；结构(I)的脂质，以及衍生自或纯化自核外体的一种或多种生物材料和一种或多种中性脂质，任选地一种或多种稳定剂和任选地一种或多种细胞穿透肽。
脂质制剂的使用方法和制备方法
这些组合物在转染中的应用可通过本领域已知的方法进行。例如，本文所述的组合物可用于体外或离体转染细胞。
对于体外递送，WO07/130073在第54页至第60页描述了用于转染的“之前”和“之后”方案，其中转染复合物的组分在加入细胞培养物之前以不同的顺序混合。通常，制备含有或不含兼性辅助脂的脂质体制剂，然后与大分子，诸如DNA分子或RNA分子，诸如mRNA分子或RNAi分子混合，以形成转染复合物。然后将复合物加入到细胞培养物中，并使用熟知的方法监测转染。附加组分(诸如细胞表面配体、融合剂、核定位剂等)可以在与脂质体混合之前加入到核酸中，或者可以在加入核酸之前加入到脂质体中。
可根据这些方法转染的细胞包括但不限于几乎任何真核细胞，包括原代细胞、培养物中的细胞、传代细胞培养物或细胞系以及培养组织中的细胞。合适的细胞包括人类细胞系和动物细胞系。细胞可以是成纤维细胞。细胞可以是附着细胞或悬浮状态细胞(悬浮细胞)。在某些例示性方面，细胞是悬浮CHO-S细胞和悬浮293-F细胞。可使用的其他细胞包括但不限于293、293-S、CHO、Cos、3T3、Hela、原代成纤维细胞、A549、Be2C、SW480、CHOK1、Griptite 293、HepG2、Jurkat、LNCaP、MCF-7、NIH-3T3、PC12、C6、Caco-2、COS-7、HL60、HT-1080、IMR-90、K-562、SK-BR3、PHP1、HUVEC、MJ90、NHFF、NDFF和原代神经元。
对于体内施用，脂质复合物制剂优选肠胃外(即，关节内、静脉内、腹膜内、皮下或肌内)施用。在具体实施方案中，通过弹丸式注射来静脉内或腹膜内施用药物组合物。例如，参见Stadler等人，美国专利5,286,634号，该美国专利以引用方式并入本文。细胞内核酸递送在以下文献中也进行了讨论：Straubringer等人，Methods in Enzymology，AcademicPress，New York.101:512-527(1983年)；Mannino等人，Biotechniques 6:682-690(1988年)；Nicolau等人，Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Syst.6:239-271(1989年)和Behr，Acc.Chem.Res.26:274-278(1993年)。施用基于脂质的治疗剂的其他方法描述于例如Rahman等人，美国专利3,993,754号；Sears，美国专利4,145,410号；Papahadjopoulos等人，美国专利4,235,871号；Schneider，美国专利4,224,179号；Lenk等人，美国专利4,522,803号；和Fountain等人，美国专利4,588,578号中。
另一个实施方案是用于生产蛋白质的方法，其包括使细胞与如上所述的脂质-核酸复合物接触，其中该核酸编码该蛋白质。温育细胞以产生蛋白质并收集蛋白质。上面描述了可用于蛋白质生产的细胞。此外，包含结构(I)的脂质的任何组合物可用于转染细胞。此类组合物在本文中进一步讨论，并且包括但不限于包含结构(I)的脂质、共脂质和任选的转染增强剂(诸如基因融合肽或蛋白质)的组合物。在此类方法中，使细胞与脂质-核酸复合物接触可在体外、离体或体内发生。
另一个实施方案是用于抑制细胞中蛋白产生的方法，其包括使细胞与如上所述的脂质-核酸复合物接触，其中核酸是双链RNA分子，诸如设计用于抑制蛋白表达的RNAi分子或siRNA分子。设计此类RNA分子的方法是本领域熟知的。结构(I)的脂质特别适于以这种方式递送RNAi分子。温育细胞并观察抑制所选择的蛋白质的产生的表型结果。在此类方法中，使细胞与脂质-核酸复合物接触可在体外、离体或体内发生。
在其他实施方案中，提供了用于将脂质组合物递送至受试者的脾组织和/或肺组织的方法，其包括将如上所述的阳离子脂质组合物施用至受试者。在一些实施方案中，提供了用于将生物活性剂递送至受试者的脾组织和/或肺组织的方法，其包括将阳离子脂质-生物活性剂复合物施用至受试者。
在一些实施方案中，还提供了用于将生物活性剂递送至受试者的脾组织的方法，该方法包括：(i)将生物活性剂与如上所述的组合物混合，从而形成生物活性剂-脂质复合物生物活性剂；以及(ii)向受试者施用有效量的所述生物活性剂-脂质复合物，从而将所述生物活性剂-脂质复合物递送至受试者的脾组织。
在一些实施方案中，还提供了用于将生物活性剂递送至受试者的肺组织的方法，该方法包括：(i)将生物活性剂与如上所述的组合物混合，从而形成生物活性剂-脂质复合物生物活性剂；以及(ii)向受试者施用有效量的所述生物活性剂-脂质复合物，从而将所述生物活性剂-脂质复合物递送至受试者的肺组织。
在某些实施方案中，阳离子脂质组合物或生物活性剂-脂质复合物向受试者的施用是经由全身施用。在一些实施方案中，此类阳离子脂质组合物或生物活性剂脂质复合物还包含至少一种中性脂质。在一些实施方案中，此类阳离子脂质组合物或生物活性剂脂质复合物还包含至少一种中性脂质和至少一种转染增强剂，诸如细胞穿透肽和/或基因融合肽。在某些实施方案中，用于体内递送的生物活性剂是核酸分子。
在某些实施方案中，在用于将阳离子脂质组合物或生物活性剂-脂质复合物递送至受试者的脾和/或肺的方法中，阳离子脂质组合物或生物活性剂-脂质复合物包含结构(I)的脂质化合物，其中X或Y中的仅一者是
上述脂质可通过各种方法配制以用于转染和体内施用。最简单的配制方法中的一种方法是反向蒸发，如美国专利9,259,475号中所述，其全文以引用方式并入本文。在一些实施方案中，脂质膜可以用水水合，水合的脂质膜和核酸有效负载在缓冲液中稀释，并且通过移液和/或涡旋机械混合以形成脂质体群体。可使用的其他配制方法是超声处理和微流化。有利地，使用例如在Roces等人，Pharmaceutics，12:1095(2020年)中描述的微流体混合将脂质配制为脂质纳米颗粒。合适的微流体混合装置可从例如Precision Nanosystems(Vancouver,BC)商购获得。通常，微流体混合组合两种流体流，一种含有核酸，另一种含有结构(I)的脂质和其他组分，诸如肽、配体和如下所述的其他脂质组分。
在一些实施方案中，本文提供了一种用于制备一组含有核酸分子的脂复合物制剂的方法，其包括：(a)将包含缓冲液和核酸分子的水性溶液转移到混合容器中；任选地添加其他组分，诸如本文所述的肽、配体或其他脂质组分；(b)将包含阳离子脂质/可离子化脂质和中性脂质的脂质溶液注射到水性溶液中，其中注射包括挤出、在管线中混合、微流体混合、蒸发或涡旋；以及(c)产生与核酸复合的脂质制剂群体。
例如，在一些实施方案中，对于包含RNA的脂质复合物组合物，将浓度为0.1mg/ml的RNA在去离子水中的溶液在pH为3和4之间的50mM柠檬酸钠缓冲液中稀释以形成储备溶液。可通过透析处理脂质复合物组合物以除去乙醇并实现缓冲液交换。制剂可以使用期望的分子量截断值(例如，10kD)针对磷酸盐缓冲盐水(PBS)，pH 7.4透析。所得脂质复合物悬浮液可通过0.2μm无菌过滤器(Sarstedt，Numbrecht，Germany)过滤到玻璃小瓶中并密封。
测定纳米颗粒制剂中粒径的方法是本领域熟知的。例如，Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments Ltd，Malvern，UK)可用于测定纳米颗粒组合物的粒度、多分散指数(PDI)和ζ电势。UV-可见光谱可用于测定脂质复合物组合物中核酸(例如，mRNA)的浓度。将一定量的组合物在合适的溶剂中稀释，并在分光光度计上记录溶液的吸收光谱，例如在230nm和330nm之间。脂质复合物组合物中治疗剂和/或预防剂的浓度可以基于组合物中使用的治疗剂和/或预防剂的消光系数并且基于例如260nm的波长下的吸光度与例如330nm的波长下的基线值之间的差值来计算。
对于包含RNA的脂质复合物组合物，QUANT-ITTM RNA测定(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)可用于使用制造商提供的方法来评价脂质组合物对RNA的包封。添加RIBOGREEN试剂后产生的荧光强度可以使用荧光读板机在例如约480nm的激发波长和例如约520nm的发射波长下测定。从样本中的每个样本的荧光值中减去试剂空白的荧光值，并且通过将完整样本(不添加Triton X-100)的荧光强度除以破裂样本(由添加Triton X-100引起)的荧光值来确定游离RNA的百分比。
试剂盒
上述转染和脂质制剂组合物的组分可在试剂盒中提供。试剂盒含有结构(I)的脂质以及附加组分，诸如中性脂质、阳离子脂质、细胞表面配体、融合剂和/或核定位剂等。试剂盒组分可以是单独的或者可以以任何方式预混合。例如，结构(I)的脂质(或结构(I)脂质和一种或多种阳离子脂质/可离子化脂质的组合)可以与一种或多种中性脂质、甾醇、稳定剂、转染增强剂等混合。附加组分也可存在于同一容器中或者可存在于一个或多个分开的容器中。试剂盒通常包括容器，诸如小瓶和/或管，它们包装在一起，例如包装在纸板盒中。试剂盒可以从供应商运送到消费者。例如，在一个示例中，本文提供了一种包括小瓶的试剂盒，该小瓶包含如上所述的脂质体制剂以及任选的转染剂和转染增强肽。试剂盒还可以包括，例如，包含转染增强剂的单独容器，该转染增强剂诸如转染增强肽，例如Plus ReagentTM(Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA)。试剂盒还可以在分开的容器中包含细胞、细胞培养基和报告核酸序列，诸如表达报告基因的质粒。在某些示例中，培养基可以是减少血清培养基和/或蛋白质表达培养基。
还提供了含有结构(I)的化合物和附加的试剂的试剂盒，该附加的试剂诸如阳离子脂质/可离子化脂质、中性脂质(例如，磷脂)、甾醇、两亲性肽、包含聚阳离子核酸结合部分的两亲性肽、细胞表面配体、包含聚阳离子核酸结合部分的细胞表面配体、融合剂、包含聚阳离子核酸结合部分的融合剂、核定位肽或蛋白质以及包含聚阳离子核酸结合部分的核定位肽或蛋白质。试剂盒可以以任何可能的组合包含这些附加的试剂中的一种、一些或全部。有利地，附加的试剂包括阳离子脂质、两亲性肽和含有聚阳离子核酸结合部分的细胞表面配体。当细胞表面配体是肽或蛋白质时，聚阳离子核酸结合部分是多元氨基酸序列。
在一个实施方案中，试剂盒包含阳离子脂质(诸如结构(I)的脂质)和肽、蛋白质或其片段或修饰的肽、蛋白质或其片段的单个部分或混合物。在另一个实施方案中，试剂盒包含多阳离子聚合物和肽、蛋白质或其片段或修饰的肽、蛋白质或其片段的单个部分或混合物。阳离子脂质转染试剂盒可任选地包含中性脂质以及其他转染增强剂或其他添加剂，并且可调节试剂盒中组分的相对量以促进转染组合物的制备。试剂盒组分可包括用于其他试剂盒组分的适当介质或溶剂。
可通过本发明的方法转染的核酸包括来自包含天然碱基或非天然碱基的任何来源的任何大小的DNA和RNA(包括mRNA和RNAi/siRNA)，并且包括编码并且能够在细胞中表达治疗性蛋白质或以其他方式有用的蛋白质的那些、抑制细胞中不期望的核酸表达的那些、抑制不期望的酶活性或激活期望的酶的那些、催化反应的那些(核酶)以及在诊断测定中起作用的那些(例如，诊断核酸)。治疗性核酸包括编码或者可在细胞中表达治疗上有用的蛋白质、肽或多肽的那些、抑制细胞中不期望的核酸表达的那些以及抑制细胞中不期望的酶活性或激活期望的酶的那些。
鉴于本文的公开内容，本文提供的组合物和方法也可容易地适用于将除核酸以外的生物活性大分子(包括多胺、多胺酸、多肽和蛋白质等)引入真核细胞中。其他有用的材料，例如作为治疗剂、诊断材料、研究试剂，可以结合到肽和修饰的肽，并且通过本发明的方法引入真核细胞。
实施例
实施例1
向装有十二烷基胺盐酸盐(1.4g，6.5mmol，1.1当量)的吡啶溶液(15ml)的圆底烧瓶中加入丁烯-1,2-二酮(1.0g，5.87mmol)，并且将所得溶液在氮气下加热至50℃并搅拌4小时。然后将反应物加热至60℃并搅拌16小时。使反应物冷却至室温，然后过滤以除去沉淀。将滤液减压浓缩以产生油状物，将该油状物通过闪速色谱法用24g正相柱与(0％至100％)MeOH/DCM纯化以产生3-(十二烷基氨基)-4-乙氧基环丁-3-烯-1,2-二酮(0.75g，41.6％产率)。
实施例2
向装有HDMS(0.87g，1.57mmol)的无水DMF溶液(10ml)的干燥圆底烧瓶中加入3-(十二烷基氨基)-4-乙氧基环丁-3-烯-1,2-二酮(0.53g，1.57mmol)的无水DMF溶液(5ml)。将该溶液加热至50℃，并在氮气下搅拌22小时。将所得溶液减压浓缩至干。将所得油状物通过闪速色谱法使用25g正相柱与(0％至100％)MeOH/DCM纯化以产生3-(十二烷基氨基)-4-((2-羟基-3-(十四烷基(4-(十四烷基氨基)丁基)氨基)丙基)氨基)环丁-3-烯-1,2-二酮(0.4g，0.489mmol，31％)和3-(十二烷基氨基)-4-((3-((4-((2-(十二烷基氨基)-3,4-二氧代环丁-1-烯-1-基)(十四烷基)氨基)丁基)(十四烷基)氨基)-2-羟基丙基)氨基)环丁-3-烯-1,2-二酮(0.23g)。
实施例3
向装有3-(十二烷基氨基)-4-((2-羟基-3-(十四烷基(4-(十四烷基氨基)丁基)氨基)丙基)氨基)环丁-3-烯-1,2-二酮(0.4g，0.489mmol)的无水DMF溶液(10ml)的圆底烧瓶中加入4.0M HCl的二氧杂环己烷溶液(0.49ml)，并在氮气下于室温搅拌1.5小时。将所得溶液减压浓缩以产生粗制油状物，将该粗制油状物在RP-HPLC上用(95％至100％)MeOH/水纯化以产生单(N1-(3-((2-(十二烷基氨基)-3,4-二氧代环丁-1-烯-1-基)氨基)-2-羟基丙基)-N1,N4-双十四烷基丁烷-1,4-二铵)一氯化物(0.2g，48％)。(M+H)+＝817.7m/z。
实施例4
向装有3-(十二烷基氨基)-4-((3-((4-((2-(十二烷基氨基)-3,4-二氧代环丁-1-烯-1-基)(十四烷基)氨基)丁基)(十四烷基)氨基)-2-羟基丙基)氨基)环丁-3-烯-1,2-二酮(0.23g，0.21mmol)的无水DMF溶液(5ml)的圆底烧瓶中加入4.0M HCl的二氧杂环己烷溶液(0.21ml)，并在氮气下于室温搅拌1.5小时。将所得溶液减压浓缩以产生粗制油状物，将该粗制油状物在RP-HPLC上用(95％至100％)MeOH/水纯化以产生N1-(2-(十二烷基氨基)-3,4-二氧代环丁-1-烯-1-基)-N4-(3-((2-(十二烷基氨基)-3,4-二氧代环丁-1-烯-1-基)氨基)-2-羟基丙基)-N1,N4-双十四烷基丁烷-1,4-二氯化铵(0.13g，54％)。(M+H)+＝1080.95。
实施例5
按照与13相同的反应和步骤合成16。
实施例6
向装有3,4-二乙氧基环丁-3-烯-1,2-二酮(0.5g，2.94mmol)的EtOH溶液(5ml)的圆底烧瓶中加入2,5,8,11,14,17-六氧杂十九烷-19-胺(0.91g，3.1mmol，1.05当量)。将反应溶液于室温搅拌16小时。将反应溶液在冰箱中放置16小时，然后减压浓缩至干以产生油状物。将该粗制油状物在正相10g柱上用(0％至20％)MeOH/DCM纯化以产生3-((2,5,8,11,14,17-六氧杂十九烷-19-基)氨基)-4-乙氧基环丁-3-烯-1,2-二酮(0.82g，60％)。
实施例7
向装有DHDMS(1.03g，1.3mmol，1.1当量)的圆底烧瓶中加入3-((2,5,8,11,14,17-六氧杂十九烷-19-基)氨基)-4-乙氧基环丁-3-烯-1,2-二酮(0.5g，1.19mmol)的DMF溶液(16ml)，在50℃下搅拌16小时。将所得溶液减压浓缩至干以产生油状物。将该粗制油在25g正相柱上用(0％至100％)MeOH/DCM纯化以产生3-((2,5,9,13,17,21-六氧杂二十三烷-23-基)氨基)-4-((2-羟基-3-(十四烷基(4-(十四烷基氨基)丁基)氨基)丙基)氨基)环丁-3-烯-1,2-二酮(0.24g，22％)。
实施例8
向装有3-((2,5,9,13,17,21-六氧杂二十三烷-23-基)氨基)-4-((2-羟-3-(十四烷基(4-(十四烷基氨基)丁基)氨基)丙基)氨基)环丁-3-烯-1,2-二酮(0.24g，259mmol)的DCM溶液(5ml)的圆底烧瓶中加入HCl(4M，二氧杂环己烷溶液)(0.284ml)，并在氮气下于室温搅拌1.25小时。将所得溶液减压浓缩至干以产生粗制油状物，将该粗制油状物在具有C18柱的RP-HPLC上使用(75％至100％)MeOH/水纯化以产生N1-(3-((2-((2,5,9,13,17,21-六氧杂二十三烷-23-基)氨基)-3,4-二氧代环丁-1-烯-1-基)氨基)-2-羟基丙基)-N1,N4-双十四烷基丁烷-1,4-氯化二铵(236mg，91％产率)。
实施例9
向装有3,4-二乙氧基环丁-3-烯-1,2-二酮(0.12g，0.7mmol)的DMF溶液(10ml)的100ml圆底烧瓶中加入HDMS(0.788g，1.42mmol，2.0当量)。将反应物加热至50℃保持5小时。将反应物冷却至室温，并减压浓缩以产生油状物，将该油状物在C18反相柱上用(2％至70％)MeOH/氯仿纯化以产生3,4-双((2-羟基-3-(十四烷基(4-(十四烷基氨基)丁基)氨基)丙基)氨基)环丁-3-烯-1,2-二酮(0.41g，48％产率)。
实施例10
方案3中所示的化合物6的合成可以如下完成：使cyclam A与环氧化物反应以形成氨基醇，之后进行胺的肼介导的脱保护。然后胺发生酰化、LAH介导的酰胺还原和盐形成。
实施例11
化合物烷基化cyclam盐化合物E和F的合成可以从1,8-二甲基-1,4,8,11-四氮杂环十四烷开始，其将发生烷基化，之后进行甲基化和胺的肼介导的脱保护。然后伯胺与溴酯进行烷基化，之后进行盐形成。
实施例12
用绿荧光蛋白(GFP)表达质粒转染六种不同的细胞类型是使用含有本文提供的阳离子脂质/可离子化脂质的制剂进行的。以下提供了示例性制剂和结果。
接种细胞使得在转染当天细胞80％至90％汇合在96孔组织培养液板中。将含有阳离子脂质和中性辅助脂质DOPE的脂质溶液与含有SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:540的肽混合。如表3所示，所检验的制剂在例如阳离子脂质的类型(参见表1)和制剂中阳离子脂质与中性脂质的比率方面有所变化。
表3.示例性脂质制剂：
将2mg/ml阳离子脂质/DOPE脂质水溶液与含有肽SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:540的肽溶液以1:1.5(v/v)比率(脂质溶液:肽溶液)混合。阳离子脂质/DOPE/肽溶液含有0.8mg/ml阳离子脂质/DOPE、1.2mg/ml肽SEQ ID NO:540和0.05mg/ml肽SEQ ID NO:47。在这些实验中使用CMV-绿荧光蛋白(GFP)表达质粒。
用于形成转染复合物的所有溶液都于室温进行转染。向含有0.05mL OptiMEM培养基的六个试管中等分1μL至6μL表3的脂质制剂。将0.05mL的20μg/mL eGFP质粒DNA的OptiMEM溶液等分到含有脂质制剂等分试样的每个管中。通过上下吸液两次混合脂质制剂和DNA溶液。转染复合物于室温形成持续10分钟。复合10分钟后，向每个孔的细胞中加入0.01mL的转染复合物(0.1μL至0.6μL脂质制剂，100ng DNA/孔)。HeLa、人原代成人真皮成纤维细胞(HDFa)、A549、MCF7、HEK293和CHO-K1细胞用于这些实验。细胞在37℃下在5％ CO2下温育48小时。在Perkin-Elmer荧光板读板机上读板以测定GFP强度。
示例性转染结果示出于图1至图8中。结果显示，如通过GFP表达所测量的，本文所述的脂质化合物在所有细胞类型中提供有效的转染效率。还用荧光显微镜在显微镜下视觉检查细胞以评定转染程度(根据经转染细胞的百分比)。当编码GFP的mRNA而不是质粒DNA与脂质制剂一起使用时，获得了等效的结果。
实施例13
基于系统实验设计(DOE)方法，制备包含至少一种示例性结构(I)的阳离子脂质/可离子化脂质和一种或多种中性脂质的组合物，并使用先前开发的方案与mRNA复合。
如表4中所示，所检验的制剂在例如阳离子脂质/可离子化脂质的类型(参见表1)和脂质复合物类型(即脂质纳米颗粒(LNP)或脂质体)方面有所变化。
表4.示例性脂质复合物制剂：
筛选具有至少一种阳离子脂质/可离子化脂质和至少一种中性脂质的脂质复合物制剂，并使用复合物的RNA有效负载通过体内功能测试进行评估。性能和转染效率分析包括有效负载递送、生物分布和有效负载编码的蛋白质的表达。
基于脂质的纳米颗粒复合物含有至少一种示例性结构(I)的阳离子脂质/可离子化脂质，其选自脂质化合物2游离碱、脂质化合物2HCl盐、脂质化合物1游离碱和脂质化合物1HCl盐。使用反向蒸发或微流体仪器配制脂质复合物。
脂质纳米颗粒复合物也用DOPE、胆固醇和1,2-二肉豆蔻基-外消旋-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000(DMG-PEG 2000)配制。将脂质称重并溶解于乙醇中，使用微流体仪器包封RNA有效负载。
脂质体复合物含有(i)化合物1游离碱和DOPE或(ii)化合物1HCl盐和DOPE。将脂质称重并溶解于氯仿中，随后在旋转蒸发器上蒸发。将脂质膜用水进行水合并用于脂质体制备。对于脂质体复合物，将水合脂质膜和核酸在缓冲液中稀释，通过移液和/或涡旋机械混合，并在递送至啮齿动物模型中之前于室温温育10分钟至20分钟。
将脂质复合物温育过夜，第二天注射到小鼠中或在4℃下储存直至使用。6周龄至10周龄的雌性BALB/c小鼠购自The Jackson Laboratory并在研究前适应7天。
萤火虫荧光素酶mRNA与每种脂质制剂复合。使用总体积为200μl的静脉内尾静脉注射液给小鼠注射10μg fLuc mRNA配制的脂质复合物。在注射后4小时，用异氟烷麻醉进行小鼠麻醉，并在腹膜内注射100μL Rediject D-虫荧光素(Perkin Elmer)后进行10分钟成像。使用IVIS Lumina III成像系统(Perkin Elmer)在体内(全身)和离体(器官)定量生物发光成像，并使用Living Image软件进行分析。
各种脂质复合物制剂的静脉内施用在注射小鼠的肺(图9)和脾(图10)中实现mRNA递送和荧光素酶表达。脂质纳米颗粒与化合物1(HCl或游离碱)的复合物在肺中递送高水平的mRNA有效负载表达(参见图9中的肺通量结果了解LP14、LP15和LP16)。脂质体与化合物1(HCl或游离碱)的复合物在脾中递送高水平的mRNA有效负载表达(参见图10中的脾通量结果了解LP22和LP23)。

Claims (54)

1.一种具有结构I的化合物
其中
L2选自由任选地在至多2个位置处被-OR9取代的C3-C12亚烷基，C3-C12碳环，C3-C12杂环和-(CH2)mCHOR9(CH2)nCHOR9(CH2)p-组成的组，其中m和p是1至6并且n是0至6，并且其中m+n+p＝2至8；
L1和L3选自由以下组成的组：化学键，-COq-，其中q是1或2，任选地插入有N、O或-C(O)O-的C2-C8烷基，单不饱和C4-C8烯基，任选地插入有N、O或-C(O)O-的-COqC2-C8烷基，和-COq-单不饱和C4-C8烯基，或者L1X和L3Y独立地是-CR3＝C(R4)R5；
每个L1和L3能够独立地在至多2个位置处被-OR9取代；
R1和R2独立地是H、C8-C20烷基或单不饱和C8-C20烯基，前提条件是当L1X和/或L3Y独立地是-CR3＝C(R4)R5时，则R1和R2不是H；
R9选自由H、-OH、-M-C8-C20烷基和-M-C8-C20烯基组成的组，其中M选自由化学键、O、-C(＝O)-、-C(＝O)N(R6)-、-N(R6)C(＝O)-、-N(R6)C(＝O)N(R7)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-S-、-S-S-、-C＝S-、-C(＝S)O-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-和-(R6)P(＝O)-组成的组；
X和Y独立地选自由以下组成的组：
L4-Het，其中L4是C1-C4亚烷基或-(CH2)mCHOR9(CH2)nCHOR9(CH2)p-，其中m和p是1至6并且n是0至6，并且其中m+n+p＝2至8，并且Het是含有至少一个氮原子的C4-C12杂环，
条件是X或Y中的任一者但不是两者都能够选自由-H、-C1-C20烷基、-NH2和-NH-C1-C20组成的组；
R3和R4各自独立地选自由H、C1-C20烷基和C3-C6环烷基、HDMS、DHDMS、R12以及由N*、R3和R4形成的任选地取代的3至7元杂环组成的组；
R5选自由H、C1-C6烷基和C3-C6环烷基组成的组；
R6至R8选自由H和C1-C4烷基组成的组；
Q选自由任选地插入有-N(H)-或-N(C1-C4烷基)-的C3-C12烷基、C4-C12烯基、环杂烷基组成的组；
R10选自由H、C1-C4烷基组成的组或者能够不存在；
R11选自由H、C1-C4烷基或-OR9组成的组；
当存在时，R12选自由PEG和基于以下项的聚合物组成的组：聚(噁唑啉)、聚(环氧乙烷)、聚(乙烯醇)、聚(甘油)、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚[N-(2-羟基丙基)甲基丙烯酰胺]和聚(氨基酸)，其中(i)所述PEG或聚合物是直链或支链的；(ii)所述PEG或聚合物由n个亚基聚合；(iii)n是介于5个和200个单元之间的数均聚合度；并且(iv)结构(I)的化合物具有至多两个R10基团。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中X或Y各自独立地选自由以下组成的组：
s＝0、1或2
t＝2、3、4或5。
3.根据权利要求1所述的化合物，所述化合物选自由以下组成的组：
4.根据权利要求1所述的化合物，其中X和Y是相同的。
5.根据权利要求1所述的化合物，其中X和Y是不同的。
6.根据权利要求1所述的化合物，其中R1和R2是相同的。
7.根据权利要求1所述的化合物，其中R1和R2是不同的。
8.根据权利要求1所述的化合物，其中X或Y或者X和Y两者是
9.根据权利要求1所述的化合物，其中X或Y或者X和Y两者是
10.根据权利要求1所述的化合物，其中L1选自由-CO-、-C(＝O)-、-OC(＝O)-或-C(＝O)O-组成的组，并且X是L4Het。
11.根据权利要求1所述的化合物，其中L4X是-CH＝C(R3)R4。
12.根据权利要求1所述的化合物，其中R3至R8是H或C1-C3烷基。
13.根据权利要求1所述的化合物，其中L2是-CH2CH(OR9)CH(OR9)CH2-。
14.根据权利要求1所述的化合物，其中R9是H，并且R1和R2不是H。
15.根据权利要求1所述的化合物，其中R9不是H，并且R1和R2是H。
16.根据权利要求1所述的化合物，其中R9选自由-C18烷基或-CO-C14-C18烷基组成的组，并且R1和R2是H。
17.根据权利要求1所述的化合物，其中R1和R2独立地选自由H、C8-C20烷基或单不饱和C8-C20烯基组成的组。
18.根据权利要求1所述的化合物，其中R3至R8独立地选自由H、C1-C6烷基和C3-C6环烷基组成的组。
19.根据权利要求1所述的化合物，其中R3至R8独立地选自由H或C1-C3烷基组成的组。
20.根据权利要求1所述的化合物，其中R9选自由H、-CO-、C8-C20烷基、单不饱和-CO-、C8-C20烯基、C8-C20烷基或单不饱和C8-C20烯基组成的组。
21.根据权利要求1所述的化合物，其中R9选自由C14-C18烷基或单不饱和烯基组成的组。
22.根据权利要求1所述的化合物，其中L2是C4-C12亚烷基。
23.根据权利要求1所述的化合物，其中L2是-(CH2)mCHOR9(CH2)nCHOR9(CH2)p-，其中m和p是1至6并且n是0至6，并且其中m+n+p＝2至8。
24.根据权利要求1所述的化合物，其中L2是-CH2CH(OR9)CH(OR9)CH2-。
25.一种组合物，所述组合物包含根据任一前述权利要求所述的化合物以及至少一种附加的脂质，其中所述附加的脂质是中性脂质或阳离子脂质/可离子化脂质。
26.根据权利要求25所述的组合物，其中所述附加的脂质是阳离子脂质，所述阳离子脂质选自由以下组成的组：DOTMA、DOTAP、DMRIE、DC-Chol、DDAB、DOSPA、DOSPER、DOGS、TMTPS、TMTOS、TMTLS、TMTMS、TMDOS、DHDMS、HDMS、N-1-二甲基-N-1-(2,3-二油酰氧基氧基丙基)-2-羟基丙烷-1,3-二胺、N-1-二甲基-N-1-(2,3-二肉豆蔻基氧基丙基)-2-羟基丙烷-1,3-二胺、N-1-二甲基-N-1-(2,3-二棕榈基氧基丙基)-2-羟基丙烷-1,3-二胺、N-1-二甲基-N-1-(2,3-二油酰氧基丙基)-2-(3-氨基-2-羟基丙氧基)丙烷-1,3-二胺、N-1-二甲基-N-1-(2,3-二肉豆蔻基氧基丙基)-2-(3-氨基-2-羟基丙氧基)丙烷-1,3-二胺、N-1-二甲基-N-1-(2,3-二棕榈基氧基丙基)-2-(3-氨基-2-羟基丙氧基)丙烷-1,3-二胺、L-精胺-5-羧基-3-(DL-1,2-二棕榈酰基-二甲氨基丙基-β-羟乙胺、3,5-(N,N-二赖氨酰基)-二氨基苯甲酰基-甘氨酰基-3-(DL-1,2-二棕榈酰基-二甲氨基丙基-β-羟乙胺)、L-赖氨酸-双(O,O'-油酰基-β-羟基乙基)酰胺二盐酸盐、L-赖氨酸-双-(O,O'-油酰基-β-羟基乙基)酰胺二盐酸盐、1,4-双[(3-(3-氨基丙基)-烷基氨基)-2-羟基丙基)哌嗪、L-赖氨酸-双-(O,O'-肉豆寇酰-β-羟基乙基)酰胺二盐酸盐、L-鸟氨酸-双-(O,O'-肉豆寇酰-β-羟基乙基)酰胺二盐酸盐、L-鸟氨酸-双-(O,O'-油酰基-β-羟基乙基)酰胺二盐酸盐、1,4-双[(3-(3-氨基丙基)-油烯基氨基)-2-羟基丙基]哌嗪、L-鸟氨酸-双-(O,O'-棕榈酰基-β-羟基乙基)酰胺二盐酸盐、1,4,-双[(3-氨基-2-羟基丙基)-油烯基氨基]-丁烷-2,3-二醇、1,4,-双[(3-氨基-2-羟基丙基)-棕榈基氨基]-丁烷-2,3-二醇、1,4,-双[(3-氨基-2-羟基丙基)-肉豆蔻基氨基]-丁烷-2,3-二醇、1,4,-双[(3-油烯基氨基)丙基]哌嗪、L-精氨酸-双-(O,O'-油酰基-β-羟基乙基)酰胺二盐酸盐、双[(3-(3-氨基丙基)-肉豆蔻基氨基)2-羟基丙基]哌嗪、L-精氨酸-双-(O,O'-棕榈酰基-β-羟基乙基)酰胺二盐酸盐、L-丝氨酸-双-(O,O'-油酰基-β-羟基乙基)酰胺二盐酸盐、1,4-双[(3-(3-氨基丙基)-棕榈基氨基)-2-羟基丙基]哌嗪、甘氨酸-双-(O,O'-棕榈酰基-β-羟基乙基)酰胺二盐酸盐、肌氨酸-双-(O,O'-棕榈酰基-β-羟基乙基)酰胺二盐酸盐、L-组氨酸-双-(O,O'-棕榈酰基-β-羟基乙基)酰胺二盐酸盐、胆甾醇基-3β-羧基-酰胺基乙烯三甲胺碘化物、1,4-双[(3-肉豆蔻基氨基)丙基]哌嗪、1-二甲基氨基-3-三甲基铵基-DL-2-丙基-胆甾醇羧酸酯碘化物、胆甾醇基-3β-羧基酰胺基乙烯胺、胆甾醇基-3β-氧基琥珀酰胺乙烯三甲胺碘化物、1-二甲基氨基-3-三甲基铵基-DL-2-丙基-胆甾醇基-3β-氧基琥珀酸碘化物、2-[(2-三甲基铵基)-乙基甲基氨基]乙基-胆甾醇基-3β-氧基琥珀酸碘化物、3β[N-(N',N'-二甲基氨基乙烷)氨基甲酰基]胆固醇以及3β-[N-(聚乙烯亚胺)-氨基甲酰基]胆固醇、1,4-双[(3-棕榈基氨基)丙基]哌嗪、L-鸟氨酰基甘氨酰基-N-(1-十七烷基十八烷基)甘氨酰胺、N2,N5-双(3-氨基丙基)-L-鸟氨酰基甘氨酰基-N-(1-十七烷基十八烷基)甘氨酰胺、1,4-双[(3-(3-氨基-2-羟基丙基)-烷基氨基)-2-羟基丙基]哌嗪、N2-[N2,N5-双(3-氨基丙基)-L-鸟氨酰基]-N,N-双十八烷基-L-谷氨酰胺、N2-[N2,N5-双(氨基丙基)-L-鸟氨酰基]-N-N-双十八烷基-L-α-谷氨酰胺、1,4-双[(3-(3-氨基-2-羟基丙基)-油烯基氨基)2-羟基丙基]哌嗪，
N2-[N2,N5-双(氨基丙基)-L-鸟氨酰基]-N-N-双十八烷基-L-α-天冬酰胺、N-[N2-[N2,N5-双[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]-N2,N5-双[3-[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]氨基丙基]-L-鸟氨酰基-N-N-双十八烷基-L-谷氨酰胺酰]-L-谷氨酸、N2-[N2,N5-双(3-氨基丙基)-L-鸟氨酰基]-N,N-二醇基-L-谷氨酰胺、N2-[N2,N5-双(氨基丙基)-L-鸟氨酰基]-N-N-二油烯基-L-α-谷氨酰胺、4-双[(3-(3-氨基-2-羟基丙基)-肉豆蔻基氨基)-2-羟基丙基]哌嗪，
N2-[N2,N5-双(氨基丙基)-L-鸟氨酰基]-N-N-二油烯基-L-α-天冬酰胺、N-[N2-[N2,N5-双[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]-N2,N5-双[3-[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]氨基丙基]-L-鸟氨酰基-N-N-二油烯基-L-谷氨酰胺酰基]-L-谷氨酸、1,4-双[(3-(3-氨基丙基)-油烯基氨基)丙基]哌嗪、N2-[N2,N5-双(3-氨基丙基)-L-鸟氨酰基]-N,N-二棕榈基-L-谷氨酰胺、N2-[N2,N5-双(氨基丙基)-L-鸟氨酰基]-N-N-二棕榈基-L-α-谷氨酰胺、N2-[N2,N5-双(氨基丙基)-L-鸟氨酰基]-N-N-二棕榈基-L-α-天冬酰胺，
N-[N2-[N2,N5-双[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]-N2,N5-双[3-[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]氨基丙基]-L-鸟氨酰基-N-N-二棕榈基-L-谷氨酰胺]-L-谷氨酸、N2-[N2,N5-双(3-氨基丙基)-L-鸟氨酰基]-N,N-二肉豆蔻基-L-谷氨酰胺，
N2-[N2,N5-双(氨基丙基)-L-鸟氨酰基]-N-N-二肉豆蔻基-L-α-谷氨酰胺、N2-[N2,N5-双(氨基丙基)-L-鸟氨酰基]-N-N-二肉豆蔻基-L-α-天冬酰胺、1,4-双[(3-(3-氨基-2-羟基丙基)-棕榈基氨基)-2-羟基丙基]哌嗪、N-[N2-[N2,N5-双[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]-N2,N5-双[3-[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]氨基丙基]-L-鸟氨酰基-N-N-二肉豆蔻基-L-谷氨酰胺酰]-L-谷氨酸、1,4-双[(3-(3-氨基丙基)-肉豆蔻基氨基)丙基]哌嗪、N2-[N2,N5-双(3-氨基丙基)-L-鸟氨酰基]-N,N-二月桂基-L-谷氨酰胺、N2-[N2,N5-双(氨基丙基)-L-鸟氨酰基]-N-N-二月桂基-L-α-谷氨酰胺、N2-[N2,N5-双(氨基丙基)-L-鸟氨酰基]-N-N-二月桂基-L-α-天冬酰胺、N-[N2-[N2,N5-双[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]-N2,N5-双[3-[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]氨基丙基]-L-鸟氨酸-N-N-二月桂基-L-谷氨酰胺酰基]-L-谷氨酸、3-[N',N"-双(2-叔丁氧基羰基氨基乙基)胍基]-N,N-双十八烷基-9-烯基丙酰胺、3-[N',N"-双(2-叔丁氧基羰基氨基乙基)胍基]-N,N-双棕榈基丙酰胺、3-[N',N"-双(2-叔丁氧基羰基氨基乙基)胍基]-N,N-双棕榈基丙酰胺、1,4-双[(3-(3-氨基丙基)-棕榈基氨基)丙基]哌嗪、1,4-双[(3-(3-氨基-2-羟基丙基)-油烯基氨基)丙基]哌嗪、N,N-(2-羟基-3-氨基丙基)-N-2-羟基丙基-3-N,N-二油烯基氨基丙烷、N,N-(2-羟基-3-氨基丙基)-N-2-羟基丙基-3-N,N-二棕榈基氨基丙烷、N,N-(2-羟基-3-氨基丙基)-N-2-羟基丙基-3-N,N-二肉豆蔻基氨基氨基丙烷、1,4-双[(3-(3-氨基-2-羟基丙基)-肉豆蔻基氨基)丙基]哌嗪、[(3-氨基丙基)-双-(2-十四烷基乙氧基)]甲基溴化铵、[(3-氨基丙基)-双-(2-油烯基乙氧基)]甲基溴化铵、[(3-氨基丙基)-双-(2-棕榈基乙氧基)]甲基溴化铵、油酰基-2-羟基-3-N,N-二甲基氨基丙烷、2-二癸酰基-1-N,N-二甲基氨基丙烷、棕榈酰基-2-羟基-3-N,N-二甲基氨基丙烷、1,2-二棕榈酰基-1-N,N-二甲基氨基丙烷，
肉豆蔻酰-2-羟基-3-N,N-二甲基氨基丙烷、1,2-二肉豆蔻酰-1-N,N-二甲基氨基丙烷、(3-氨基-丙基)-4-(3-氨基-丙基氨基)-4-十四烷基氨基甲酰基-丁胺甲酸胆固醇酯、(3-氨基-丙基)-4-(3-氨基-丙基氨基)-4-氨基甲酰基丁胺甲酸胆固醇酯、(3-氨基-丙基)-4-(3-氨基-丙基氨基)-4-(2-二甲基氨基-乙基氨基甲酰基)-丁胺甲酸胆固醇酯、精胺-5-羧基甘氨酸(N'-硬脂基-N'-油烯基)酰胺四三氟乙酸盐、精胺-5-羧基甘氨酸(N'-硬脂基-N'-反油基)酰胺四三氟乙酸盐、胍丁胺基羧基胆固醇乙酸盐、精胺-5-羧基-β-丙氨酸胆固醇酯四三氟乙酸盐、2,6-二氨基己烯基β-丙氨酸胆固醇酯双三氟乙酸盐、2,4-二氨基丁酰基β-丙氨酸胆固醇酯双三氟乙酸盐、N,N-双(3-氨基丙基)-3-氨基丙酰基β-丙氨酸胆固醇酯三三氟乙酸盐、[N,N-双(2-羟基乙基)-2-氨基乙基]氨基羧基胆固醇酯、硬脂基肉碱酯、棕榈酰肉碱酯、肉豆蔻基肉碱酯、硬脂基硬脂酰肉碱酯盐酸盐、L-硬脂基硬脂酰肉碱酯、硬脂基油酰基肉碱酯盐酸盐、棕榈基棕榈酰肉碱酯盐酸盐、肉豆蔻基肉豆寇酰肉碱酯盐酸盐、L-肉豆蔻基肉豆寇酰肉碱酯盐酸盐、1,4-双[(3-(3-氨基-2-羟基丙基)-棕榈基氨基)丙基]哌嗪、N-(3-氨基丙基)-N,N'-双-(十二烷基乙氧基)-哌嗪溴化物、N-(3-氨基丙基)-N,N'-双-(油烯基乙氧基)-哌嗪溴化物、N-(3-氨基丙基)-N,N'-双-(棕榈基乙氧基)-哌嗪溴化物、N-(3-氨基丙基)-N,N'-双-(肉豆蔻基乙氧基)-哌嗪溴化物、N-(3-氨基丙基)-N'-甲基-N,N'-(双-2-十二烷基乙氧基)-哌嗪溴化物、N-(3-氨基丙基)-N'-甲基-N,N'-(双-2-油烯基乙氧基)-哌嗪溴化物、N-(3-氨基丙基)-
N'-甲基-N,N'-(双-2-棕榈基乙氧基)-哌嗪溴化物、N-(3-氨基丙基)-N'-甲基-N,N'-(双-2-肉豆蔻基乙氧基)-哌嗪溴化物、1,4-双[(3-(3-氨基丙基)-油烯基氨基)-2-羟基-丙基]哌嗪、1,4-双[(3-(3-氨基丙基)-肉豆蔻基氨基)-2-羟基-丙基]哌嗪以及1,4-双[(3-(3-氨基丙基)-棕榈基氨基)-2-羟基-丙基]哌嗪、KL22、KL25、1,2-二亚油烯基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLin-DMA)、2,2-二亚油烯基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]二氧戊环(DLin-K-DMA)、三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基4-(二甲基氨基)丁酸酯(DLin-MC3-DMA或MC3)、2,2-二亚油烯基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、1,2-二油烯基氧基-
N,N-二甲基氨基丙烷(DODMA)、2-({8-[(3.β.)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙烷-1-胺(辛基-CLinDMA)、(2R)-2-({8-[(3.β.)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z-,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙烷-1-胺(辛基-CLinDMA(2R))和(2S)-2-({8-[(3)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙烷-1-胺(辛基-CLinDMA(2S))。
27.根据权利要求25所述的组合物，其中所述中性脂质选自由甾醇或甾醇衍生物、磷脂或它们的组合组成的组。
28.根据权利要求25所述的组合物，所述组合物包含选自由以下组成的组：DOPE、DPhPE、DOPC、Lyso-PE(1-酰基-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、Lyso-PC(1-酰基-3-羟基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰油酰-磷脂酰乙醇胺(POPE)和二油酰磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-羧酸酯(DOPE-mal)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰磷脂乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、16-O-单甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE、1-硬脂酰-2-油酰基-磷脂酰乙醇胺(SOPE)和1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂乙醇胺(反式DOPE)。
29.根据权利要求16至28中任一项所述的组合物，所述组合物还包含至少一种附加的中性脂质。
30.根据权利要求29所述的组合物，其中所述附加的中性脂质是选自由DOPE、DPhPE、胆固醇、DOPC、Lyso-PE(1-酰基-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、Lyso-PC(1-酰基-3-羟基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)组成的组的磷脂。
31.根据权利要求25至30中任一项所述的组合物，所述组合物还包含细胞靶向肽，其中所述肽任选地包含聚阳离子核酸结合部分。
32.根据权利要求25至30中任一项所述的组合物，所述组合物还包含核定位肽，其中所述肽任选地包含聚阳离子核酸结合部分。
33.根据权利要求25至32中任一项所述的组合物，所述组合物还包含融合剂，其中所述融合剂任选地包含聚阳离子核酸结合部分。
34.根据权利要求25至33中任一项所述的组合物，所述组合物还包含肽核内体释放剂或非肽核内体释放剂。
35.根据权利要求25至34中任一项所述的组合物，所述组合物还包含稳定剂。
36.根据权利要求25至34中任一项所述的组合物，所述组合物还包含核外体或衍生自或分离自核外体的生物材料。
37.一种组合物，所述组合物包含根据权利要求1至24中任一项所述的化合物以及核酸。
38.根据权利要求25至36中任一项所述的组合物，所述组合物还包含核酸。
39.根据权利要求37或38所述的组合物，其中所述核酸是RNA分子。
40.根据权利要求39所述的组合物，其中所述RNA分子是mRNA分子。
41.一种将核酸引入真核细胞中的方法，所述方法包括使所述细胞与所述核酸和根据权利要求25至40中任一项所述的组合物接触，从而将所述核酸引入所述细胞中。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述细胞是动物细胞。
43.根据权利要求41所述的方法，其中所述细胞是人类细胞。
44.根据权利要求41所述的方法，其中所述接触在体内发生。
45.根据权利要求41所述的方法，其中所述接触在体外或离体发生。
46.一种用于将脂质组合物递送至受试者的脾组织和/或肺组织的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求25至40中任一项所述的组合物。
47.一种用于将生物活性剂递送至受试者的脾组织和/或肺组织的方法，所述方法包括：
(i)将生物活性剂与根据权利要求25至36中任一项所述的组合物混合，从而形成生物活性剂-脂质复合物；以及
(ii)向受试者施用有效量的所述生物活性剂-脂质复合物，从而将所述生物活性剂-脂质复合物递送至受试者的脾组织和/或肺组织。
48.根据权利要求47所述的方法，其中具有结构I的所述化合物
在X或Y处包含单个
49.根据权利要求47所述的方法，其中所述组合物包含选自由表1的化合物组成的组的化合物。
50.根据权利要求47所述的方法，其中所述生物活性剂-脂质复合物包含脂质纳米颗粒。
51.根据权利要求47所述的方法，其中所述生物活性剂包含核酸。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述核酸包括RNA分子。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述RNA分子包括mRNA、siRNA、miRNA、shRNA、自扩增RNA、stRNA、gRNA或它们的组合。
54.根据权利要求47所述的方法，其中所述施用为经由全身施用。
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