CN119136826A

CN119136826A - 肢体痉挛的治疗

Info

Publication number: CN119136826A
Application number: CN202380036887.7A
Authority: CN
Inventors: N·格里戈尔; L·庞斯; K·拉弗尔; P·皮考特
Original assignee: Ipsen Biopharm Ltd
Current assignee: Ipsen Biopharm Ltd
Priority date: 2022-04-29
Filing date: 2023-04-28
Publication date: 2024-12-13
Also published as: GB202206348D0; EP4514379A1; CA3246904A1; AU2023260765A1; WO2023209385A1; KR20250004871A; JP2025514277A

Abstract

本发明涉及使用修饰的肉毒杆菌神经毒素A(BoNT/A)治疗肢体痉挛，该修饰的肉毒杆菌神经毒素A包含BoNT/A轻链和易位结构域，以及BoNT/B受体结合结构域(H_C结构域)。还提供了所述修饰的BoNT/A的单位剂型和相应的试剂盒。

Description

肢体痉挛的治疗

发明领域

本发明涉及使用修饰的肉毒杆菌神经毒素A(BoNT/A)治疗肢体痉挛。

背景技术

痉挛是一种运动症状，其特点是速度依赖性牵张反射增加，伴有由牵张反射的兴奋过度引起的过度的腱反射(tendon jerk)，是运动神经元综合征的一个组成部分。痉挛与各种神经障碍有关，例如多发性硬化、脑或脊髓损伤、创伤性脑损伤(TBI)和脑血管障碍(中风)。其特点是运动损伤(肌张力增加、异常肢体姿势、拮抗肌过度收缩和反射亢进)、功能性失能、疼痛和不适。

成人上肢(AUL)痉挛是中风后的常见并发症；它通常很痛苦(与痉挛性肌肉收缩相关)，并且可以通过干扰上肢运动和限制使用肢体进行主动功能性任务而导致显著残疾。在严重的情况下，它还会妨碍“被动功能”，例如对受影响的肢体进行清洗、穿衣和护理，从而增加护理者的负担。继发性并发症可包括自尊心和身体形象差、生活质量受损(社交和家庭互动减少)和压疮。

由于患者表现及其目标的多样性，中风后上肢痉挛管理是具有挑战性的。在这些患者中，肌肉张力亢进通常表现为几种常见的临床模式，这些模式由受影响的肌肉决定，而这又与中枢神经系统病变的大小、位置和年龄相关。这些模式在一项针对31个国家的临床医生进行的国际横断面研究中有所描述，随后用于建立AUL痉挛的5种典型模式的分类方法。这些模式是相对于肩关节、肘关节、前臂关节和腕关节的位置来定义的。目前的临床共识和现有指南推荐，在为患者选择治疗方法时应当考虑痉挛的确切模式，并且应当根据选择适当的注射肌肉来相应地定制肉毒杆菌神经毒素A(BoNT/A)疗法所。然而，没有两个患者是相同的，因此需要定制/个性化的治疗方案。

专家小组进一步研究了这些模式，以便为每种临床模式的上肢痉挛(ULS)和目标肌肉提供治疗参数指导(参见图1)。值得注意的是，专家小组定义了三种总体姿势组合以针对BoNT进行治疗。这些模式是：

(1)肩部内收、肘部屈曲、前臂旋前(Pronated forearm)、手腕屈曲、握拳；

(2)肘部屈曲、前臂旋前、手腕屈曲、握拳；以及

(3)手腕屈曲、握拳。

已知图1中所示的四个上肢关节涉及>90％的个体(参见图1)。大多数痉挛性上肢模式(五种中的四种)由肩部的内旋和内收以及肘关节处的屈曲引起，其中姿势的差异由前臂和手腕的姿势引起。

总体上，ULS治疗旨在缓解痉挛的体征和症状-减少肌肉痉挛和疼痛、改善姿势、促进活动和灵巧性(自主运动功能伸手、抓握、移动和释放)、最低程度减少挛缩和畸形并且改善患者护理的便利性以及卫生/自我护理和/或生活质量。可用的药理学治疗选择如口服(苯二氮卓、巴氯芬、替扎尼定和丹曲林)和鞘内(巴氯芬)药物大多数会导致非选择性肌无力，具有副作用如全身无力和对中枢神经系统的不良影响，包括共济失调、困倦、镇静和甚至戒断症状。

治疗痉挛的最有效的方法是理疗和肌内(i.m.)注射BoNT/A的组合，这在近年来已经由若干指南推荐。BoNT/A已成为一种选择的治疗方法，因为它的全身性副作用最小，并且是一种局部注射治疗方法，可通过选择性地针对受影响的肌肉而适应个体的疾病表现。

是一种包含从肉毒梭菌(Clostridium botulinum)A型菌株分离和纯化的药物物质BoNT/A血凝素复合物(BTX-A-HAC)的医药产品。市场上还销售有其他几种由肉毒梭菌天然产生的医药BoNT/A产品(例如和)。

BoNT/A选择性地抑制突触前神经末梢释放乙酰胆碱，从而阻断神经肌肉接头处的胆碱能传递，从而诱导肌肉收缩和肌张力的降低，导致注射肌肉的松弛。二十多年来，这种作用机制在治疗上已经用于治疗多种临床神经系统疾病，包括局灶性肌张力障碍、局灶性肌肉痉挛和美学疾病。

然而，目前可用的BoNT/A产品的作用持续时间约为12至14周，即当新的神经末梢萌发时，允许神经功能恢复正常，并且最初的症状再次出现。因此，为了保持效果，需要定期重复注射。

因此，考虑到病情的慢性和所需长期治疗的特性，BoNT/A注射的频率是治疗痉挛的重要考虑因素。实际上，它对患者和护理者所涉及的直接和间接健康成本、医院/诊所内注射的组织工作以及最重要的患者生活质量有影响。

被批准用于治疗上肢和下肢痉挛，每个治疗期的最大总剂量为1,500单位(见图2–治疗上肢痉挛的最大剂量为1,000单位)。临床医生需要对四肢上的多块肌肉施用每个治疗期总剂量上限为1,500单位。临床医生被迫在患者的治疗期间做出困难的选择。换句话说，在常规治疗方案中，临床医生必须在可施用的相对低的BoNT/A总量(由于BoNT/A的高毒性特性而需要的1,500单位或1,000单位用于上肢痉挛)和在多个不同肌肉的有效量之间找到平衡。因此，某些肌肉被忽略，而其他肌肉接受次优量的BoNT/A，导致次优的治疗。此外，目前的治疗方案排除了肩部的治疗，肩部的治疗需要在其多块肌肉处的多个单位剂量。

此外，常规治疗方案很复杂，并且导致临床医生在努力避免对患者的毒性时给药不足。因此，需要一种方便、安全和有效的在治疗期间可向肢体施用的单剂量单位以及对单位数量的相应指导(包括每块肌肉的注射部位的数量)，而不会导致患者毒性。

总之，需要一种改进的肢体痉挛的治疗，其允许以患者为中心的个体化的方法，根据目标临床模式定制治疗，允许根据痉挛的分布、程度和严重性对肢体肌肉的不同组合进行注射，同时避免毒性并提供更持久的治疗(导致施用频率更低)。还需要一种改进的治疗方案，其允许治疗被忽视的肌肉，例如肩部的肌肉。

本发明克服了一个或多个上述问题。

发明内容

本发明人惊奇地发现，修饰的BoNT/A在治疗肢体痉挛中特别有用。本发明的修饰的BoNT/A包括BoNT/A轻链和易位结构域(H_N结构域)以及BoNT/B受体结合结构域(H_C结构域)，这导致修饰的BoNT/A表现出在给药位点的滞留增加(减少施用部位的扩散)和/或作用持续时间增加(例如6-9个月)。有利地，当与未修饰的BoNT/A(例如)相比时，修饰的BoNT/A具有改进的安全性。这种改进的安全性特征可用本文所述的修饰的BoNT/A的高安全比来表示。

基于本文的临床前和临床数据，已经显示，可以将更高总量的本发明的修饰的BoNT/A施用于个体，同时在如此高的剂量下实现与未修饰的BoNT/A(例如)相似的安全性。因此，在达到最大总剂量之前，在肢体痉挛的治疗中，本发明的修饰的BoNT/A可被注射和/或可被注射到更多的肌肉/部位。这是一个重要且有利的发现，并且产生肢体痉挛的改进的治疗，同时为临床医生提供更大范围的治疗选择。它还首次提供了能够治疗其他大肌肉的选项，例如肩部的肌肉，同时还在最大剂量范围内治疗肘部、前臂和/或手腕。该治疗可以得到改进，因为与未修饰的BoNT/A(例如)治疗相比，它能够提供更持久的治疗(从而减少给药频率)和/或能够针对个体进行定制和/或导致个体的生活质量改善。因此，本发明的治疗与常规治疗方案相比得到改进。

此外，本发明提供了方便、安全和有效的可以在单次治疗中安全施用的单个单位剂量以及总(最大)剂量。本发明还提供了可向肢体施用所述单位剂量的次数的相应指导(例如包括每块肌肉注射部位的数量)，而不会导致患者毒性。因此，根据本发明的治疗对于临床医生而言复杂度小得多，并且有助于避免给药剂量不足和/或给药剂量过量。此外，与传统的肢体痉挛治疗相比，根据本发明的治疗对于患者更加令人满意，因为它更好地根据患者的需要定制。

具体实施方式

在一方面，本发明提供了修饰的BoNT/A，其用于治疗肢体痉挛(成人肢体痉挛)，其中修饰的BoNT/A通过肌内注射施用至个体的多块受影响的肌肉，

其中所述修饰的BoNT/A以大于17,000pg修饰的BoNT/A的单位剂量在多块受影响的肌肉上施用，

其中所述多块受影响的肌肉选自：

第一组，包括：指浅屈肌、指深屈肌、桡侧腕屈肌、尺侧腕屈肌、肱桡肌、旋前圆肌、肱二头肌、腓肠肌内侧头(内侧腓肠肌)、腓肠肌外侧头(外侧腓肠肌)、趾长屈肌、拇长屈肌(flexor hallucis longus)、腓肠肌、三角肌、肩胛提肌、旋前方肌、拇长屈肌(flexorpolicis longus)、拇收肌、拇短屈肌(flexor policis brevis)、掌长肌、蚓状肌、拇对掌肌、大收肌、长收肌、短收肌、股薄肌、内侧腘绳肌、外侧腘绳肌、阔筋膜张肌、股直肌、股外侧肌、股内侧肌、股中间肌、臀大肌、胫骨前肌、趾短屈肌、拇长伸肌、拇短屈肌(flexorhallucis brevis)；以及

第二组，包括：肱三头肌(长头)、肩胛下肌、胸肌(例如，胸大肌)、背阔肌、肱二头肌、肱肌、比目鱼肌、胫骨后肌、肱桡肌、大圆肌、髂腰肌、大收肌、腘绳肌(例如，股二头肌、半膜肌和/或半腱肌)、股直肌和腓肠肌；以及

其中在受影响的第一组肌肉处(优选在选定的注射部位)施用单个单位剂量和/或在受影响的第二组肌肉处(优选在选定的不同注射部位)施用多个单位剂量，并且其中在治疗期间施用的总剂量为最多600,000pg，并且

其中所述修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域，以及BoNT/B受体结合结构域(H_C结构域)。

在另一方面，本发明提供了修饰的BoNT/A，其用于治疗个体的肢体痉挛(成人肢体痉挛)，治疗持续时间比未修饰的BoNT/A(例如SEQ ID NO:2[例如双链形式的SEQ ID NO:2])的治疗持续时间更长，其中修饰的BoNT/A通过肌内注射施用至个体的多块受影响的肌肉，

其中所述多块受影响的肌肉选自：

在一方面，本发明提供了一种治疗肢体痉挛的方法，该方法包括通过肌内注射将修饰的BoNT/A施用至个体的多块受影响的肌肉，

其中所述多块受影响的肌肉选自：

在相关方面，本发明提供了一种治疗个体肢体痉挛(成人肢体痉挛)的方法，其持续时间比用未修饰的BoNT/A(例如SEQ ID NO:2[例如双链形式的SEQ ID NO:2])治疗的持续时间更长，该方法包括将修饰的BoNT/A通过肌内注射施用至个体的多块受影响的肌肉，

其中所述多块受影响的肌肉选自：

在另一方面，本发明提供了修饰的BoNT/A在制造用于治疗肢体痉挛(成人肢体痉挛)的药物中的用途，其中修饰的BoNT/A通过肌内注射施用至个体的多块受影响的肌肉，

其中所述多块受影响的肌肉选自：

在另一方面，本发明提供了修饰的BoNT/A在制造用于治疗个体的肢体痉挛(成人肢体痉挛)的药物中的用途，治疗持续时间比未修饰的BoNT/A(例如SEQ ID NO:2[例如双链形式的SEQ ID NO:2])的治疗持续时间更长，其中修饰的BoNT/A通过肌内注射施用至个体的多块受影响的肌肉，

其中所述多块受影响的肌肉选自：

单位剂量可以大于17,000pg的修饰BoNT/A。单位剂量范围的上限可以是40,000、39,000、38,000、37,000、36,000、35,000、30,000、25,000、24,000、22,000、20,000或18,000pg的修饰的BoNT/A，优选上限是38,000pg。单位剂量范围的下限可以是17,500、18,000、20,000、22,000、24,000、25,000、26,000、27,000、28,000、29,000、30,000、35,000、36,000、37,000、38,000或39,000pg修饰的BoNT/A，优选下限是17,500pg、22,753pg、22,790pg或33,181pg。优选地，修饰的BoNT/A的单位剂量大于17,000pg至最多40,000pg修饰的BoNT/A，例如大于17,000pg至最多36,000pg，或20,000pg至最多39,000pg。修饰的BoNT/A的单位剂量可以是22,000至38,000pg，优选23,000至38,000pg或34,000至38,000pg。修饰的BoNT/A的单位剂量可以是24,000至36,000pg或25,000至36,000pg。单位剂量可以是25,000pg至最多40,000pg的修饰BoNT/A。在优选的实施方案中，修饰的BoNT/A的单位剂量是24,000、25,000、30,000或36,000pg。在更优选的实施方案中，修饰BoNT/A的单位剂量是30,000或36,000pg(例如36,000pg)。

更优选的是单位剂量是30,000pg至40,000pg，例如35,000pg至37,000pg的修饰的BoNT/A。更优选地，单位剂量是36,000pg的修饰BoNT/A。

甚至更优选的是，单位剂量是20,000pg至30,000pg，例如24,000pg至26,000pg的修饰的BoNT/A。最优选地，单位剂量是25,000pg修饰的BoNT/A。

当进行本发明的治疗方案时，施用的总剂量可以最多600,000pg。换句话说，在给定治疗期内施用的修饰BoNT/A总量可最多600,000pg。总剂量可以是最多580,000、560,000、540,000、520,000、500,000、480,000、460,000、450,000、440,000、420,000、400,000、380,000、360,000、340,000、320,000、300,000、280,000、260,000、240,000、220,000或200,000pg。优选地，总剂量可以最多540,000pg修饰的BoNT/A，更优选375,000pg。总剂量可以是至少17,500、20,000、22,500、25,000、27,500、30,000、35,000、36,000、37,000、38,000、39,000或40,000pg。总剂量可以是至少250,000、255,000、260,000、270,000、280,000、290,000、300,000、320,000、340,000、360,000、380,000、400,000、450,000、500,000、550,000或575,000pg。优选地，总剂量可以大于255,000pg或大于341,849pg，更优选至少350,000pg修饰BoNT/A，例如至少497,700pg或500,000pg。总剂量可以是250,000-600,000pg或255,000-600,000pg，优选大于255,000pg至最多600,000pg、350,000-600,000或500,000-600,000pg。在更优选的实施方案中，施用的总剂量为520,000-600,000pg，更优选350,000-400,000pg。总剂量可以是360,000、450,000或540,000pg，优选450,000或540,000pg(例如540,000pg)。

更优选的总剂量是450,000pg至600,000pg，如525,000pg至555,000pg的修饰的BoNT/A。最优选地，总剂量为最多540,000pg修饰的BoNT/A(例如总剂量可以是540,000pg)。

甚至更优选的总剂量是300,000pg至450,000pg，如360,000pg至390,000pg的修饰的BoNT/A。最优选地，总剂量为最多375,000pg修饰的BoNT/A(例如总剂量可以是375,000pg)。

因此，单位剂量可以大于17,000pg修饰的BoNT/A，并且进行本发明的治疗方案时施用的总剂量可以最多600,000pg。在优选的实施方案中，单位剂量可以是24,000pg，总剂量可以是360,000pg或可以是最多360,000pg。在另一外优选的实施方案中，单位剂量可以是30,000pg，总剂量可以是450,000pg或可以是最多450,000pg。在另一外优选的实施方案中，单位剂量可以是36,000pg，总剂量可以是540,000pg或可以是最多540,000pg。更优选地，单位剂量可以是25,000pg，总剂量可以是375,000pg或可以是最多375,000pg。

在一方面，本发明提供了修饰的BoNT/A，其用于治疗小儿肢体痉挛，其中修饰的BoNT/A通过肌内注射施用至个体的多块受影响的肌肉，

其中修饰的BoNT/A以大于8,500pg修饰的BoNT/A的单位剂量在多块受影响的肌肉上施用，

其中所述多块受影响的肌肉选自：

其中在受影响的第一组肌肉处(优选在选定的注射部位)施用单个单位剂量和/或在受影响的第二组肌肉处(优选在选定的不同注射部位)施用多个单位剂量，并且其中在治疗期间施用的总剂量为最多300,000pg，并且

在另一方面，本发明提供了修饰的BoNT/A，其用于治疗个体的小儿肢体痉挛，治疗持续时间比未修饰的BoNT/A(例如SEQ ID NO:2[例如双链形式的SEQ ID NO:2])的治疗持续时间更长，其中修饰的BoNT/A通过肌内注射施用至个体的多块受影响的肌肉，

其中所述多块受影响的肌肉选自：

在一方面，本发明提供了一种治疗小儿肢体痉挛的方法，该方法包括通过肌内注射将修饰的BoNT/A施用至个体的多块受影响的肌肉，

其中所述多块受影响的肌肉选自：

在相关方面，本发明提供了一种治疗个体的小儿肢体痉挛的方法，其持续时间比用未修饰的BoNT/A(例如SEQ ID NO:2[例如双链形式的SEQ ID NO:2])治疗的持续时间更长，该方法包括将修饰的BoNT/A通过肌内注射施用至个体的多块受影响的肌肉，

其中所述多块受影响的肌肉选自：

在另一方面，本发明提供了修饰的BoNT/A在制造用于治疗小儿肢体痉挛的药物中的用途，其中修饰的BoNT/A通过肌内注射施用至个体的多块受影响的肌肉，

其中所述多块受影响的肌肉选自：

在另一方面，本发明提供了修饰的BoNT/A在制造用于治疗个体的小儿肢体痉挛的药物中的用途，治疗持续时间比未修饰的BoNT/A(例如SEQ ID NO:2[例如双链形式的SEQID NO:2])的治疗持续时间更长，其中修饰的BoNT/A通过肌内注射施用至个体的多块受影响的肌肉，

其中所述多块受影响的肌肉选自：

术语“治疗个体的肢体痉挛的持续时间比用未修饰的BoNT/A治疗的持续时间更长”和“治疗个体的小儿肢体痉挛的持续时间比用未修饰的BoNT/A治疗的持续时间更长”可能意味着，与施用未修饰的BoNT/A相比，在施用本发明的修饰的BoNT/A之后，个体的肢体痉挛的一种或多种症状减轻持续更长的时间段。所述作用持续时间可以至少为1.25×、1.5×、1.75×、2.0×或2.25×以上。修饰的BoNT/A的作用持续时间可以在6至9个月之间。例如，作用的持续时间可以至少是：至少4.5个月(从发作起)、5.0个月、5.5个月、6个月、6.5个月、7.0个月、7.5个月、8.0个月、8.5个月或9.0个月。在具体实施方案中，作用持续时间可大于9.0个月。所述减轻可以通过与已经用未修饰的BoNT/A治疗的表现出等同症状的等同对照个体进行比较来确定。在对照个体的一种或多种症状的严重程度与未修饰的BoNT/A治疗之前基本相同(例如，相同)的时间段，用根据本发明的修饰的BoNT/A治疗的个体在与用修饰的BoNT/A治疗之前的一种或多种症状的严重程度相比时，可表现出等同的一种或多种症状至少5％、10％、25％或50％的改善。未修饰的BoNT/A优选是以双链形式存在的SEQ IDNO:2。

治疗小儿肢体痉挛的单位剂量可以大于8,500pg的修饰的BoNT/A。单位剂量范围的上限可以是20,000、19,500、19,000、18,500、18,000、17,500、15,000、12,500、12,000、11,000、10,000或9,000pg的修饰的BoNT/A，优选上限是19,000pg。单位剂量范围的下限可以是8,750、9,000、10,000、11,000、12,000、12,500、13,000、13,500、14,000、14,500、15,000、17,500、18,000、18,500、19,000或19,500pg修饰的BoNT/A，优选下限是8,750pg、11,376pg、11,377pg、11,395pg、11,400pg或16,591pg。优选修饰的BoNT/A的单位剂量大于8,500pg至最多20,000pg修饰的BoNT/A，例如大于8,500pg至最多18,000pg，10,000pg至最多19,500pg。修饰的BoNT/A的单位剂量可以是11,000pg至19,000pg，优选11,500至19,000pg或17,000至19,000pg。修饰的BoNT/A的单位剂量可以是12,000pg至18,000pg或12,500pg至18,000pg。单位剂量可以是12,500pg至20,000pg的修饰BoNT/A。修饰的BoNT/A的单位剂量可以是12,000、12,500、15,000或18,000pg。在更优选的实施方案中，修饰BoNT/A的单位剂量是15,000或18,000pg(例如18,000pg)。

更优选治疗小儿肢体痉挛的单位剂量是15,000pg至20,000pg，例如17,500至18,500pg修饰的BoNT/A。更优选地，用于治疗小儿肢体痉挛的单位剂量是18,000pg的修饰的BoNT/A。

甚至更优选治疗小儿肢体痉挛的单位剂量是10,000pg至15,000pg，例如12,000pg至13,000pg的修饰的BoNT/A。更优选地，用于治疗小儿肢体痉挛的单位剂量是12,500pg的修饰的BoNT/A。

当进行本发明的小儿痉挛治疗方案时，施用的总剂量可以最多300,000pg。换句话说，在给定治疗期内施用的修饰BoNT/A总量可最多300,000pg。总剂量可以是最多290,000、280,000、270,000、260,000、250,000、240,000、230,000、225,000、220,000、210,000、200,000、190,000、180,000、170,000、160,000、150,000、140,000、130,000、120,000、110,000或100,000pg。优选地，总剂量可以是最多270,000pg的修饰的BoNT/A。总剂量可以是至少8,750、10,000、11,250、12,500、13,750、15,000、17,500、18,000、18,500、19,000、19,500或20,000pg。总剂量可以是至少125,000、127,500、130,000、135,000、140,000、145,000、150,000、160,000、170,000、180,000、190,000、200,000、225,000、250,000、275,000、290,000pg或287,500pg。优选地，总剂量可以大于127,500pg或大于170,924pg或170,925pg，更优选至少175,000pg修饰的BoNT/A，例如至少248,850pg、248,851pg或250,000pg。总剂量可以是125,000-300,000pg或127,500-300,000pg，优选大于127,500pg至最多300,000pg、175,000-300,000或250,000-300,000pg。在更优选的实施方案中，施用的总剂量为260,000-300,000pg，更优选175,000-200,000pg。总剂量可以是180,000、225,000或270,000pg，优选225,000或270,000pg(例如270,000pg)。

更优选的是，当治疗小儿肢体痉挛时总剂量是225,000pg至300,000pg，例如262,500pg至277,500pg修饰的BoNT/A。最优选地，当治疗小儿肢体痉挛时总剂量为最多270,000pg修饰的BoNT/A(例如总剂量可以是270,000pg)。

甚至更优选的，治疗小儿肢体痉挛时总剂量为150,000pg至225,000pg，例如180,000pg至195,000pg的修饰的BoNT/A。最优选地，当治疗小儿肢体痉挛时总剂量为最多187,500pg修饰的BoNT/A(例如总剂量可以是187,500pg)。

因此，治疗小儿肢体痉挛的单位剂量可以是大于8,500pg修饰的BoNT/A，而进行本发明的治疗小儿肢体痉挛的治疗方案时施用的总剂量可以最多300,000pg。在优选的实施方案中，单位剂量可以是12,000pg，总剂量可以是180,000pg或可以是最多180,000pg。在另一外优选的实施方案中，单位剂量可以是15,000pg，总剂量可以是225,000pg或可以是最多225,000pg。在另一外优选的实施方案中，单位剂量可以是18,000pg，总剂量可以是270,000pg或可以是最多270,000pg。更优选地，单位剂量可以是12,500pg，总剂量可以是187,500pg或可以是最多187,500pg。

单位剂量可以用本发明修饰的BoNT/A的量、修饰的BoNT/A的单位或其组合来表示。因此，修饰的BoNT/A的单位剂量也可同时以单位和量(pg或ng，优选pg)表示。

其中修饰的BoNT/A以大于707单位的修饰的BoNT/A的单位剂量在多块受影响的肌肉上施用，并且其中1单位是对应于小鼠计算的半数致死量(LD₅₀)的修饰BoNT/A的量，

其中所述多块受影响的肌肉选自：

其中在受影响的第一组肌肉处(优选在选定的注射部位)施用单个单位剂量和/或在受影响的第二组肌肉处(优选在选定的不同注射部位)施用多个单位剂量，并且其中在治疗期间施用的总剂量为最多24,958单位，并且

在相关方面，本发明提供了修饰的BoNT/A，其用于治疗个体的肢体痉挛(成人肢体痉挛)，治疗持续时间比未修饰的BoNT/A(例如SEQ ID NO:2[例如双链形式的SEQ ID NO:2])的治疗持续时间更长，其中修饰的BoNT/A通过肌内注射施用至个体的多块受影响的肌肉，

其中所述多块受影响的肌肉选自：

在相关方面，本发明提供了一种治疗肢体痉挛(成人肢体痉挛)的方法，该方法包括通过肌内注射将修饰的BoNT/A施用至个体的多块受影响的肌肉，

其中所述多块受影响的肌肉选自：

在相关方面，本发明提供了一种治疗个体的肢体痉挛的方法，其持续时间比用未修饰的BoNT/A(例如SEQ ID NO:2[例如双链形式的SEQ ID NO:2])治疗的持续时间更长，该方法包括将修饰的BoNT/A通过肌内注射施用至个体的多块受影响的肌肉，

其中所述多块受影响的肌肉选自：

在另一相关方面，本发明提供了修饰的BoNT/A在制造用于治疗肢体痉挛(成人肢体痉挛)的药物中的用途，其中修饰的BoNT/A通过肌内注射施用至个体的多块受影响的肌肉，

其中所述多块受影响的肌肉选自：

在另一相关方面，本发明提供了修饰的BoNT/A在制造用于治疗个体的肢体痉挛(成人肢体痉挛)的药物中的用途，治疗持续时间比未修饰的BoNT/A(例如SEQ ID NO:2[例如双链形式的SEQ ID NO:2])的治疗持续时间更长，其中修饰的BoNT/A通过肌内注射施用至个体的多块受影响的肌肉，

其中所述多块受影响的肌肉选自：

单位剂量可以大于707单位的修饰的BoNT/A。单位剂量范围的上限可以是1664、1650、1600、1550、1500、1450、1400、1350、1300、1250、1150、1100、1050、1000、950、900、850、800或750单位的修饰的BoNT/A，优选上限是1500单位。单位剂量范围的下限可以是725、750、775、800、825、850、875、900、925、950、975、1000、1025、1050、1075、1100、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600或1650单位的修饰的BoNT/A，优选下限是725单位、949单位或1381单位。优选地，修饰的BoNT/A的单位剂量为大于707单位至最多1664单位的修饰的BoNT/A，例如大于707单位至最多1,498单位或832单位至1622单位。修饰的BoNT/A的单位剂量可以是915至1581单位，优选949至1581单位或1414至1581单位。修饰的BoNT/A的单位剂量可以是998至1,498单位或1,040至1,498单位。在优选的实施方案中，修饰的BoNT/A的单位剂量是998、1,040、1,248或1,498单位修饰的BoNT/A。在更优选的实施方案中，单位剂量包含1,248或1,498单位(例如1,498单位)的修饰的BoNT/A。

更优选的是，单位剂量为1,248单位至1,664单位，例如1,456单位至1,539单位的修饰的BoNT/A。更优选地，单位剂量为1,498单位修饰的BoNT/A。

甚至更优选的是，单位剂量为832单位至1,248单位，例如998单位至1,082单位的修饰的BoNT/A。最优选地，单位剂量为1,040单位的修饰的BoNT/A。

当进行本发明的治疗方案时，施用的总剂量可以最多24,958单位。换句话说，在给定治疗期内施用的修饰的BoNT/A总量可最多24,958单位。总剂量可以是最多24,500、24,000、23,500、23,000、22,500、22,000、21,500、21,000、20,500、20,000、19,500、19,000、18,500、18,000、17,500、17,000、16,500、16,000、15,500、15,000、14,500、14,000、13,500、13,000、12,500、12,000、11,500、11,000、10,500、10,000、9,500、9,000或8,500单位。优选地，总剂量可以是最多22,463单位的修饰的BoNT/A，更优选15,599单位。总剂量可以是至少725、750、775、800、825、850、875、900、925、950、975、1000、1,100、1,200、1,300、1,400、1,500或1,600单位。总剂量可以是至少10,000、11,000、12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,000、20,000、21,000、22,000、23,000、24,000或24,500单位。优选地，总剂量可以大于10,607单位或大于14,220单位，更优选至少14,559单位的修饰的BoNT/A，例如至少20,703单位或20,799单位。总剂量可以是10,339-24,958单位、10,399-24,958单位或10,607-24,958单位，优选大于10,607单位至最多24,958单位、14,559-24,958单位或20,799-24,958单位。更优选地，施用的总剂量为21,631-24,958单位，更优选14,559-16,639单位。总剂量可以是14,975单位、18,719单位或22,463单位，优选18,719或22,463单位(例如22,463单位)。

更优选的总剂量是18,719单位至24,958单位，例如21,839单位至23,087单位的修饰的BoNT/A。最优选地，总剂量为最多22,463单位的修饰的BoNT/A(例如总剂量可以是22,463单位)。

甚至更优选的总剂量为12,479单位至18,719单位，例如14,975单位至16,223单位的修饰的BoNT/A。最优选地，总剂量为最多15,599单位的修饰的BoNT/A(例如总剂量可以是15,599单位)。

因此，单位剂量可以大于707单位修饰的BoNT/A，并且进行本发明的治疗方案时施用的总剂量可以最多24,958单位。在优选实施方案中，单位剂量可以是998单位的修饰的BoNT/A，总剂量可以是14,975单位或可以是最多14,975单位。在另一外优选实施方案中，单位剂量可以是1248单位的修饰的BoNT/A，总剂量可以是18,719单位或可以是最多18,719单位。在另一外优选实施方案中，单位剂量可以是1498单位的修饰的BoNT/A，总剂量可以是22,463单位或可以是最多22,463单位。更优选地，单位剂量可以是1,040单位的修饰的BoNT/A，总剂量可以是15,599单位或可以是最多15,599单位。

在一方面，本发明提供了一种修饰的BoNT/A，其用于治疗小儿肢体痉挛，其中修饰的BoNT/A通过肌内注射施用至个体的多块受影响的肌肉，

其中修饰的BoNT/A以大于353.5单位修饰的BoNT/A的单位剂量施用至多块受影响的肌肉，其中1单位是与小鼠中计算的半数致死量(LD₅₀)相对应的修饰的BoNT/A的量，

其中多块受影响的肌肉选自：

其中在受影响的第一组肌肉处(优选在选定的注射部位)施用单个单位剂量和/或在受影响的第二组肌肉处(优选在选定的不同注射部位)施用多个单位剂量，并且其中在治疗期间施用的总剂量为最多12,479单位，并且

在另一相关方面，本发明提供了修饰的BoNT/A，其用于治疗个体的小儿肢体痉挛，治疗持续时间比未修饰的BoNT/A(例如SEQ ID NO:2[例如双链形式的SEQ ID NO:2])的治疗持续时间更长，其中修饰的BoNT/A通过肌内注射施用至个体的多块受影响的肌肉，

其中修饰的BoNT/A以大于353.5单位的修饰的BoNT/A的单位剂量在多块受影响的肌肉上施用，并且其中1单位是对应于小鼠计算的半数致死量(LD₅₀)的修饰BoNT/A的量，

其中所述多块受影响的肌肉选自：

在相关方面，本发明提供了一种治疗小儿肢体痉挛的方法，该方法包括将修饰的BoNT/A通过肌内注射施用至个体的多块受影响的肌肉，

其中多块受影响的肌肉选自：

其中所述多块受影响的肌肉选自：

在另一相关方面，本发明提供了修饰的BoNT/A在制造用于治疗小儿肢体痉挛的药物中的用途，其中修饰的BoNT/A通过肌内注射施用至个体的多块受影响的肌肉，

其中多块受影响的肌肉选自：

在另一相关方面，本发明提供了修饰的BoNT/A在制造用于治疗个体的小儿肢体痉挛的药物中的用途，治疗持续时间比未修饰的BoNT/A(例如SEQ ID NO:2[例如双链形式的SEQ ID NO:2])的治疗持续时间更长，其中修饰的BoNT/A通过肌内注射施用至个体的多块受影响的肌肉，

其中所述多块受影响的肌肉选自：

用于治疗小儿肢体痉挛的合适单位剂量可以是大于353.5单位的修饰的BoNT/A。治疗小儿肢体痉挛的单位剂量范围的上限可以是832、825、800、775、750、725、700、675、650、625、600、575、550、525、500、475、450或425单位的修饰的BoNT/A，优选上限是790单位。治疗小儿肢体痉挛的单位剂量范围的下限可以是364、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825或830单位的修饰的BoNT/A，优选下限是364单位、475单位或690单位。优选地，用于治疗小儿肢体痉挛的修饰的BoNT/A的单位剂量为大于353.5单位至最多832单位的修饰的BoNT/A，例如大于353.5单位至最多749单位或416单位至811单位。用于治疗小儿肢体痉挛的修饰的BoNT/A的单位剂量可以是458单位至790单位或458单位至791单位，优选475单位至790单位，475单位至791单位，707单位至790单位，或707单位至791单位。在优选的实施方案中，修饰的BoNT/A的单位剂量是499、520、624或749单位。在更优选的实施方案中，修饰BoNT/A的单位剂量是624或749单位(例如749单位)。

更优选的是，用于治疗小儿肢体痉挛的单位剂量为624单位至832单位，例如728单位至770单位的修饰的BoNT/A。更优选地，用于治疗小儿肢体痉挛的单位剂量是749单位的修饰的BoNT/A。

甚至更优选的是，用于治疗小儿肢体痉挛的单位剂量为416单位至624单位，例如499单位至541单位的修饰的BoNT/A。最优选地，用于治疗小儿肢体痉挛的单位剂量是520单位的修饰的BoNT/A。

当进行本发明的治疗小儿肢体痉挛的治疗方案时，施用的总剂量可以最多12,479单位。换句话说，在给定治疗期内施用的用于治疗小儿肢体痉挛的修饰BoNT/A的总量可以最多12,479单位。治疗小儿肢体痉挛的总剂量可以最多12,250、12,000、11,750、11,500、11,250、11,000、10,750、10,500、10,000、9,750、9,500、9,250、9,000、8,750、8,500、8,250、8,000、7,750、7,500、7,250、7,000、6,750、6,500、6,250、6,000、5,750、5,500、5,250、5,000、4,750、4,500或4,250单位。治疗小儿肢体痉挛的总剂量可以最多11,250单位的修饰的BoNT/A。优选地，治疗小儿肢体痉挛的总剂量可以最多11,232单位修饰的BoNT/A，更优选7,800单位。治疗小儿肢体痉挛的总剂量可以是至少350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825或850单位。总剂量可以是至少5,000、5,500、6,000、6,500、7,000、7,500、8,000、8,500、9,000、9,500、10,000、10,500、11,000或11,500单位。优选地，治疗小儿肢体痉挛的总剂量可以是至少5,304单位或大于7,110单位，更优选至少7,280单位的修饰的BoNT/A，例如至少10,351单位或10,400单位。治疗小儿肢体痉挛的总剂量可以是5,200-12,479单位或5,304-12,479单位，优选大于5,200单位至最多12,479单位，大于5,301单位至最多12,479单位、7,280-12,479单位或10,400-12,479单位。在更优选的实施方案中，施用的总剂量为10,815-12,479单位或10,816-12,479单位，更优选为7,280-8,320单位。总剂量可以为7,488、9,360、9,359、11,231或11,232单位。在更优选的实施方案中，总剂量为9,359或11,231单位(例如11,231单位)。

更优选的是，当治疗小儿肢体痉挛时总剂量为9,360单位至12,479单位，例如10,920单位至11,544单位的修饰的BoNT/A。最优选地，当治疗小儿肢体痉挛时总剂量为最多11,232单位的修饰的BoNT/A(例如总剂量可以是11,232单位)。

甚至更优选的是，当治疗小儿肢体痉挛时总剂量为6,240单位至9,360单位，例如7,488单位至8,112单位的修饰的BoNT/A。最优选地，当治疗小儿肢体痉挛时总剂量为最多7,800单位的修饰的BoNT/A(例如总剂量可以是7,800单位)。

因此，治疗小儿肢体痉挛的单位剂量可以是大于353.5单位修饰的BoNT/A，而进行本发明的治疗小儿肢体痉挛的治疗方案时施用的总剂量可以最多12,479单位。在优选实施方案中，单位剂量可以是499单位的修饰的BoNT/A，总剂量可以是7,488单位或可以是最多7,488单位。在另外优选实施方案中，单位剂量可以是624单位的修饰BoNT/A，总剂量可以是9,359单位或9,360单位，或者可最多9,359单位，或者可最多9,360单位。在另外优选实施方案中，单位剂量可以是749单位的修饰的BoNT/A，总剂量可以是11,231单位或可以是最多11,231单位。在另外优选实施方案中，单位剂量可以是749单位的修饰的BoNT/A，总剂量可以是11,232单位或可以是最多11,232单位。最优选地，单位剂量可以是520单位，并且总剂量可以是7,800单位或可最多7,800单位。

“受影响的肌肉”是表现出痉挛症状或导致受影响肢体痉挛的肌肉。例如，所述肌肉可表现出增加的肌肉张力或僵硬。

所述多块受影响的肌肉选自如本文所述的第一组和第二组。所选的多块受影响的肌肉可以是第一组的至少一块肌肉和/或第二组的至少一块肌肉。可替代地，多块受影响的肌肉可以是来自同一组的两块或更多块肌肉(例如，两块或更多块第一组肌肉或两块或更多块第二组肌肉)。优选地，多块受影响的肌肉包括至少一块第一组肌肉和至少一块第二组肌肉。

所述多块肌肉可以是同一肢体的肌肉或不同肢体的肌肉。然而，优选地，所述多块肌肉是同一肢体的肌肉。本发明包括同时治疗一个或多个肢体的痉挛。例如，可以每个治疗期将修饰的BoNT/A施用至个体的一个或两只上肢、每个治疗期将修饰的BoNT/A施用至个体的一只或两只下肢、或者每个治疗期将修饰的BoNT/A施用至下肢和上肢的组合。无论治疗两个还是多个肢体，优选每个肢体治疗至少2块肌肉，例如每个肢体至少3、4或5块肌肉。

根据本发明使用的修饰的BoNT/A的效力可以根据标准技术通过小鼠LD₅₀试验来确定。在所述试验中，1单位定义为对应于小鼠中计算的半数致死量(LD₅₀)的修饰的BoNT/A的量。优选地，小鼠中的计算的半数致死腹膜内剂量。

具体地，在所述试验中，相当于1单位的修饰BoNT/A的量优选为24.04pg。

优选地，修饰的BoNT/A的剂量通过肌内注射施用至受影响的肌肉。更优选地，每个注射部位施用单个单位剂量。术语“施用单个单位剂量”是指施用基本上全部的单个单位剂量。例如，单位剂量的残留量(例如最多1％、0.1％或0.01％)可能残留在其中修饰的BoNT/A已被重构的小瓶中。然而，优选施用全部的单个单位剂量(例如在一个或多个注射部位)。根据肌肉的性质，施用单个单位剂量(即，施用至选自本文所述的第一组的肌肉)或施用多个单位剂量(即，施用至选自本文所述的第二组的肌肉)。所述单个单位剂量或多个单位剂量可以在一个或多个注射部位(例如每块肌肉)施用。例如，在一些实施方案中，每个注射部位可以施用少于单个单位剂量。在优选实施方案中，一些肌肉仅在一个部位注射(即，选自本文所述的第一组的肌肉)，而一些肌肉在两个或更多个部位注射(即，选自本文所述的第二组的肌肉)。

在一个实施方案中，在受影响的第一组肌肉的多个注射部位施用单个单位剂量和/或在受影响的第二组肌肉的多个注射部位施用多个单位剂量。

术语“最多”在用于提及值(例如最多600,000pg)时是指最多并包括所引用的值。因此，作为一个示例，提到施用“最多600,000pg”的修饰的BoNT/A包括施用600,000pg的修饰的BoNT/A以及施用少于600,000pg的修饰的BoNT/A。

当选择所述第一组肌肉进行治疗时，将单个单位剂量的修饰的BoNT/A施用至选自本文所述第一组的肌肉。

将多个单位剂量的修饰的BoNT/A施用至选自第二组的肌肉(例如当选择所述第二组肌肉进行治疗时)。例如，可以施用至少2×、3×或4×单位剂量。在一些实施方案中，可以施用2-4×单位剂量。优选地，将2×单位剂量的修饰的BoNT/A施用于选自第二组的肌肉。

一些肌肉可存在于第一肌肉群和第二肌肉群中。因此，临床医生可以决定是向所述肌肉施用单个单位剂量或施用多个单位剂量。

肢体痉挛可以是上肢痉挛或下肢痉挛。

当治疗下肢痉挛时，可将修饰的BoNT/A施用至选自下列的多块肌肉：第一组，其包含(优选由以下组成)：腓肠肌内侧头、腓肠肌外侧头、腓肠肌、趾长屈肌、拇长屈肌、大收肌、长收肌、短收肌、股薄肌、内侧腘绳肌、外侧腘绳肌、阔筋膜张肌、股直肌、股外侧肌、股内侧肌、股中间肌、臀大肌、胫骨前肌、趾短屈肌、拇长伸肌、拇短屈肌；以及第二组，其包含(优选由以下组成)：比目鱼肌、胫骨后肌、髂腰肌和腓肠肌。

当向拇长屈肌施用时，在一些情况下，可以施用单个单位剂量，而在其他情况下，可以施用2×单位剂量。

下肢肌肉的合适剂量如下所示：

注射的肌肉	剂量
		腓肠肌(内侧头)	1×UD
腓肠肌(外侧头)	1×UD
		比目鱼肌	2×UD或3×UD
胫骨后肌	2×UD
		趾长屈肌(FDL)	1×UD
拇长屈肌	1×或2×UD

修饰的BoNT/A可以以上表所示剂量施用至一块或多块肌肉。

修饰的BoNT/A可以以下剂量施用于以下肌肉中的一块或多块：

注射的肌肉	剂量
		大收肌	1×UD
长收肌	1×UD
		短收肌	1×UD
股薄肌	1×UD
		内侧腘绳肌	1×UD
外侧腘绳肌	1×UD
		阔筋膜张肌	1×UD
股直肌	1×UD
		股外侧肌	1×UD
股内侧肌	1×UD
		股中间肌	1×UD
臀大肌	1×UD
		胫骨前肌	1×UD
FDL	1×UD
		趾短屈肌(FDB)	1×UD
拇长屈肌	1×UD
		拇长伸肌	1×UD
拇短屈肌	1×UD
		髂腰肌	2×UD
腓肠肌	2×UD
		胫骨后肌	2×UD
比目鱼肌	2×UD

优选地，当治疗下肢痉挛时，可将修饰的BoNT/A施用于选自以下的多块肌肉：第一组，其包含(优选由以下组成)：腓肠肌内侧头(又称，内侧腓肠肌)、腓肠肌外侧头(又称，外侧腓肠肌)、胫骨前肌、趾长屈肌、趾短屈肌、拇长屈肌、拇短屈肌、股薄肌、臀大肌；以及第二组，其包含(优选由以下组成)：比目鱼肌、胫骨后肌、股直肌、腘绳肌(例如，股二头肌、半膜肌和/或半腱肌)和大收肌。

腘绳肌可以是股二头肌、半膜肌和/或半腱肌。例如，可将修饰的BoNT/A施用于股二头肌、半膜肌和/或半腱肌中的一种或多种(例如全部)。

优选地，将三个单位剂量施用至比目鱼肌。优选地，将两个单位剂量施用至胫骨后肌。优选地，将两个单位剂量施用至股直肌。优选地，将两个单位剂量施用到腘绳肌，例如可将两个单位施用至股二头肌，可将两个单位施用至半膜肌，和/或将两个单位施用至半腱肌)。优选地，将两个单位剂量施用至内大收肌。

修饰的BoNT/A可以以下剂量施用于以下肌肉中的一块或多块：

优选地，所述肢体痉挛为上肢痉挛。

当治疗上肢痉挛时，可将修饰的BoNT/A施用至多块受影响的肌肉，所述肌肉选自：第一组，其包含(优选由以下组成)：指浅屈肌、指深屈肌、桡侧腕屈肌、尺侧腕屈肌、肱桡肌、旋前圆肌、三角肌、肩胛提肌、旋前方肌、拇长屈肌、拇收肌、拇短屈肌、掌长肌、蚓状肌、拇对掌肌；以及第二组，其包含(优选由以下组成)：肱三头肌(长头)、肩胛下肌、胸肌(例如，胸大肌)、背阔肌、肱二头肌、肱肌、肱桡肌和大圆肌。

优选地，当治疗上肢痉挛时，可以将修饰的BoNT/A施用于多块受影响的肌肉，所述肌肉选自：第一组，其包含(优选由以下组成)：指浅屈肌、指深屈肌、桡侧腕屈肌、尺侧腕屈肌、肱桡肌、旋前圆肌、肱二头肌；以及第二组，其包含(优选由以下组成)：肱三头肌(长头)、肩胛下肌、胸大肌、背阔肌、肱二头肌和肱肌。

例如，优选地，当治疗上肢痉挛时，可将修饰的BoNT/A施用于多块受影响的肌肉，所述肌肉选自：第一组，其包含(优选由以下组成)：指浅屈肌，指深屈肌，桡侧腕屈肌，尺侧腕屈肌，肱桡肌；以及第二组，其包含(优选由以下组成)：肱肌、肱二头肌、肱三头肌(长头)、肩胛下肌、胸肌(例如胸大肌)和背阔肌。

更优选地，可以将修饰的BoNT/A施用于与肩部痉挛相关的肌肉，例如肩部内收。修饰的BoNT/A可施用至背阔肌、肩胛下肌、胸大肌和肱三头肌(长头)中的至少一个。例如，可以将修饰的BoNT/A施用于背阔肌、肩胛下肌、胸大肌或肱三头肌(长头)中的至少两个或三个(优选全部)。

当在一些情况下对肱二头肌施用时，可以施用单个单位剂量，而在其他情况下可以施用2×单位剂量。因此，肱二头肌落入第一和第二组肌肉中。优选地，将2×单位剂量施用至肱二头肌，并且该肌肉包含在第二组肌肉中。

上肢肌肉的合适剂量如下所示：

优选地，修饰的BoNT/A可以上表所示剂量施用至一块或多块肌肉。在一些情况下，当治疗肢体痉挛时，旋前圆肌可以省略。

因此，优选地，上肢肌肉的合适剂量如下所示：

注射的肌肉	剂量
		指浅屈肌(FDS)	1×UD
指深屈肌(FDP)	1×UD
		桡侧腕屈肌(FCR)	1×UD
尺侧腕屈肌(FCU)	1×UD
		肱桡肌	1×UD
肱肌	2×UD
		肱二头肌	2×UD
肱三头肌(长头)	2×UD
		胸大肌	2×UD
肩胛下肌	2×UD
		背阔肌	2×UD

修饰的BoNT/A可以以下剂量施用于以下肌肉中的一块或多块：

为了治疗上肢痉挛临床表现“握拳”，可以将修饰的BoNT/A施用至指浅屈肌和/或指深屈肌。为了治疗上肢痉挛临床表现“手腕屈曲”，可以将修饰的BoNT/A施用至桡侧腕屈肌和/或尺侧腕屈肌。为了治疗上肢痉挛临床表现“肘部屈曲”，可以将修饰的BoNT/A施用至肱桡肌、肱肌和/或肱二头肌。为了治疗上肢痉挛临床表现“肩部内收”，可以将修饰的BoNT/A施用至肱三头肌(长头)、肩胛下肌、胸大肌和/或背阔肌。

特别优选地，在上肢痉挛的治疗期间，至少治疗临床表现“肘部屈曲”和“肩部内收”。更优选地，在上肢痉挛的治疗期间，治疗临床表现“肘部屈曲”和“肩部内收”，并且治疗“握拳”或“手腕屈曲”(优选地仅治疗其中之一)。

在给定治疗中施用的单位剂量的总数可以是最多15×单位剂量。换句话说，在一个实施方案中，可以将15×单个单位剂量施用至15×注射部位。在另外的实施方案中，可以将15×单个单位剂量施用至多于15×注射部位。单位剂量的总数将根据所治疗的肌肉来划分，例如可以将2×单位剂量施用至背阔肌，2×施用至肩胛下肌，2×施用至胸大肌，1×施用至尺侧腕屈肌，从而产生7×单位剂量的总施用倍数。例如，施用的单位剂量的总数可以是最多14×、13×、12×、11×、10×、9×、8×或7×。施用的单位剂量的总数可以是单位剂量的至少2×、3×、4×、5×、6×、7×，优选至少2×。施用的单位剂量的总数可以是2×至15×、7×至15×或10×至14×。优选地，施用的单位剂量的数目是15×。

本领域技术人员将考虑个体最近是否接受过(或随后将接受)梭菌神经毒素(例如未修饰的BoNT)的额外治疗，例如作为美容治疗或不同适应症的治疗的一部分。使用本领域常规技术，技术人员将相应地调整本治疗方案。

优选地，根据本发明的治疗的肢体痉挛是成人肢体痉挛。优选地，上面提供的剂量细节是用于治疗成人肢体痉挛(除非上下文表明所提供的剂量细节是用于治疗小儿肢体痉挛)。然而，也涵盖治疗小儿肢体痉挛。当治疗小儿肢体痉挛时，组合的总剂量通常是治疗成人肢体痉挛时所用的50％或更少。在一些实施方案中，组合总剂量通常为治疗成人肢体痉挛时使用的70％或更少(例如67％或更少)。

在用于治疗小儿肢体痉挛的给定治疗中施用的单位剂量的总数可以最多10×单位剂量。换句话说，在一个实施方案中，可以将10×单个单位剂量施用至10×注射部位。然而，在用于治疗小儿肢体痉挛的给定治疗中施用的单位剂量的总数可以最多15×单位剂量。在另外的实施方案中，可以将10×单个单位剂量施用至多于10×注射部位。单位剂量的总数将根据所治疗的肌肉来划分，例如可以将2×单位剂量施用至背阔肌，2×施用至肩胛下肌，2×施用至胸大肌，1×施用至尺侧腕屈肌，从而产生7×单位剂量的总施用倍数。例如，施用的单位剂量的总数可以是最多9×、8×、7×、6×、5×、4×或3×。施用的单位剂量的总数可以是单位剂量的至少2×、3×、4×、5×、6×、7×，优选至少2×。施用的单位剂量的总数可以是2×至10×、7×至10×或4×至8×。优选地，施用的单位剂量的数目是10×。优选地，施用的单位剂量的数目是15×。

当与未修饰的BoNT/A(例如)相比时，本发明的修饰的BoNT/A优选具有更长的作用持续时间(例如，一种或多种症状改善至少5％、10％、25％或50％)。所述作用持续时间可以至少为1.25×、1.5×、1.75×、2.0×或2.25×以上。修饰的BoNT/A的作用持续时间可以在6至9个月之间。例如，作用的持续时间可以至少是：至少4.5个月(从发作起)、5.0个月、5.5个月、6个月、6.5个月、7.0个月、7.5个月、8.0个月、8.5个月或9.0个月。在具体实施方案中，作用持续时间可大于9.0个月。

根据本发明的对多块肌肉的施用优选在同一治疗期间中进行。

在施用修饰的BoNT/A后的适当时间重复治疗。鉴于作用的持续时间是未修饰的BoNT/A(例如)的大约两倍，因此在随后的施用之间存在比当用未修饰的BoNT/A(例如)治疗个体时适当更长的时期。在前一次施用后至少18、20、25或30周，可以对个体重新施用根据本发明的修饰的BoNT/A。例如，可以在前次施用后至少18-45周，优选20-35周，对个体再施用本发明的修饰的BoNT/A。

本文所用的“个体”可以是哺乳动物，例如人或其他哺乳动物。优选地，“个体”是指人类个体。“个体”优选是成年个体，即至少18岁的个体。术语“个体”和“患者”在本文中同义使用。当治疗小儿肢体痉挛时，个体小于18岁，例如小于15、10或5岁，如1-17、5-17或10-17岁。优选地，所述个体已被诊断为患有肢体痉挛。所述个体可能已被诊断患有痉挛性轻偏瘫。肢体痉挛可能在中风或创伤性脑损伤之后出现(例如，由中风或创伤性脑损伤引起)。

本领域技术人员将理解，在肢体痉挛是成人肢体痉挛的情况下，个体是成人个体，并且在肢体痉挛是小儿肢体痉挛的情况下，个体是小儿个体。

根据本发明进行治疗的个体可以是不适于用未修饰的BoNT/A和/或另一种梭菌神经毒素进行治疗的个体。所述个体可以是对用未修饰的BoNT/A和/或用另一种梭菌神经毒素治疗有抗性的个体。抗性可能由于个体对梭菌神经毒素的免疫应答的发展而产生，包括抗梭菌神经毒素抗体的产生。

除非另外指明，本文所述的剂量(例如单位剂量和总剂量)是用于成人肢体痉挛。

如本文所用的术语“治疗(treat)”或“治疗(treating)”包括预防性治疗(例如，以预防病症的发作)以及矫正性治疗(治疗已经患有病症的个体)。优选地，如本文所用的“治疗(treat)”或“治疗(treating)”意指矫正性治疗。如本文所用的术语“治疗(treat)”或“治疗(treating)”是指病症和/或其症状。

合适的修饰的BoNT/A多肽(和编码其的核苷酸序列，如果存在)描述于WO 2015/004461A1和WO 2017/191315中，所述文献均以引用的方式整体并入本文中。

BoNT/A是由梭菌属细菌产生的梭菌神经毒素的一个示例。这种梭菌神经毒素的其他示例包括由破伤风梭菌(C.Tetani,TeNT)和肉毒杆菌(C.Botulinum,BoNT)血清型B-G和X产生的那些(参见WO 2018/009903 A2)，以及由巴氏梭菌(C.baratii)和丁酸梭菌(C.butyricum)产生的那些。所述神经毒素具有很强的效力和特异性，能够毒害其所传送到的神经元和其他细胞。梭菌毒素是已知的最强毒素之一。例如，肉毒杆菌神经毒素对小鼠具有0.5-5ng/kg的半数致死量(LD₅₀)，这取决于血清型。破伤风毒素和肉毒杆菌毒素都通过抑制受影响的神经元的功能，特别是神经递质的释放而起作用。虽然肉毒杆菌毒素作用于神经肌肉接头并抑制外周神经系统中的胆碱能传递，但破伤风毒素作用于中枢神经系统。

在自然界中，梭菌神经毒素(包括BoNT/A)被合成为单链多肽，其在翻译后通过蛋白水解切割事件进行修饰，以形成通过二硫键连接在一起的两条多肽链。切割发生在特定切割位点，通常称为活化位点(例如活化环)，其位于提供链间二硫键的半胱氨酸残基之间。正是这种双链形式是毒素的活性形式。这两条链称为重链(H链)，其分子量约为100kDa；和轻链(L链)，其分子量约为50kDa。H链包含N末端易位组分(H_N结构域)和C末端靶向组分(H_C结构域)。切割位点位于L链和易位结构域组分之间。在H_C结构域与其靶神经元结合并且结合的毒素通过内体内化进入细胞之后，H_N结构域使L链易位穿过内体膜并进入胞质溶胶，以及L链提供蛋白酶功能(也称为非细胞毒性蛋白酶)。

非细胞毒性蛋白酶通过蛋白水解切割被称为SNARE蛋白的细胞内转运蛋白(例如SNAP-25、VAMP或Syntaxin)起作用-参见Gerald K(2002)“Cell and Molecular Biology”(第4版)，John Wiley&Sons，Inc，优选SNAP-25。首字母缩略词SNARE来源于术语可溶性NSF附着受体(Soluble NSF Attachment Receptor)，其中NSF是指N-乙基马来酰亚胺敏感因子(N-ethylmaleimide-Sensitive Factor)。SNARE蛋白是细胞内囊泡融合所必需的，因此也是通过囊泡转运从细胞分泌分子所必需的。蛋白酶功能是锌依赖性内肽酶活性，并表现出对SNARE蛋白的高底物特异性。因此，一旦递送至所需的靶细胞，非细胞毒性蛋白酶能够抑制从靶细胞的细胞分泌。梭菌神经毒素的L链蛋白酶是切割SNARE蛋白的非细胞毒性蛋白酶。

本文所用的术语“H_C结构域”是指神经毒素重链的功能上不同的区域，其分子量约为50kDa，能够使神经毒素与位于靶细胞表面的受体结合。H_C结构域由两个结构不同的亚结构域组成，“H_CN亚结构域”(H_C结构域的N末端部分)和“H_CC亚结构域”(H_C结构域的C末端部分)，其各自具有约25kDa的分子量。

本文所用的术语“LH_N结构域”指缺乏H_C结构域的神经毒素，并且由内肽酶结构域(“L链”或“轻链”)和负责将内肽酶易位到细胞质中的结构域(重链的H_N结构域)组成。

鉴于SNARE蛋白的普遍存在的性质，梭菌神经毒素如肉毒杆菌毒素已经成功地用于广泛的治疗中。

有关肉毒杆菌(Clostridium botulinum)和破伤风梭菌(C.tetani)中毒素产生的遗传基础的更多详细信息，请参见Henderson等人，(1997)The Clostridia:MolecularBiology and Pathogenesis,Academic press。

如上所述，梭菌神经毒素由两条多肽链形成：重链(H链)，其分子量为约100kDa；和轻链(L链)，其分子量为约50kDa。H链包含C末端靶向组分(受体结合结构域或H_C结构域)和N末端易位组分(H_N结构域)。

下面更详细地描述梭菌神经毒素结构域。

轻链参考序列的示例包括：

A型肉毒杆菌神经毒素：氨基酸残基1-448

B型肉毒杆菌神经毒素：氨基酸残基1-440

上述确定的参考序列应该被认为是指导，因为根据亚血清型可能发生轻微的变化。举例来说，US2007/0166332(通过引用将其全文并入本文)引用了略微不同的梭菌序列：

A型肉毒杆菌神经毒素：氨基酸残基M1-K448

B型肉毒杆菌神经毒素：氨基酸残基M1-K441

易位结构域是梭菌神经毒素的H链的片段，大约相当于H链的氨基末端一半，或者是对应于完整H链中的该片段的结构域。

参考易位结构域的示例包括：

A型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(449-871)

B型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(441-858)

上述确定的参考序列应该被认为是指导，因为根据亚血清型可能发生轻微的变化。举例来说，US2007/0166332(通过引用并入本文)引用了略微不同的梭菌序列：

A型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(A449-K871)

B型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(A442-S858)

在本发明的上下文中，包含易位结构域的多种BoNT/A H_N区可用于本发明的方面。来自BoNT/A重链的H_N区长度约为410-430个氨基酸，并包含易位结构域。研究表明，来自梭菌神经毒素重链的H_N区的全长对于易位结构域的易位活性不是必需的。因此，该实施方案的方面可以包括BoNT/A H_N区，其包含长度为例如至少350个氨基酸、至少375个氨基酸、至少400个氨基酸或至少425个氨基酸的易位结构域。该实施方案的其他方面可以包括BoNT/AH_N区，其包含长度为例如至多350个氨基酸、至多375个氨基酸、至多400个氨基酸或至多425个氨基酸的易位结构域。

术语H_N涵盖天然存在的BoNT/A H_N部分，以及具有非天然存在的氨基酸序列和/或合成氨基酸残基的修饰的BoNT/A H_N部分。优选地，所述修饰的BoNT/A H_N部分仍然表现出上述易位功能。

梭菌神经毒素受体结合结构域(H_C)参考序列的示例包括：

BoNT/A-N872-L1296

BoNT/B-E859-E1291

梭菌神经毒素(例如BoNT)的～50kDa H_C结构域包含两个不同的结构特征，称为H_CC和H_CN结构域，通常每个为～25kDa。参与受体结合的氨基酸残基被认为主要位于H_CC结构域中。天然梭菌神经毒素的H_C结构域可包含约400-440个氨基酸残基。这一事实由以下出版物证实，每份出版物均通过引用全文并入本文：Umland TC(1997)Nat.Struct.Biol.4:788-792；Herreros J(2000)Biochem.J.347:199-204；Halpern J(1993)J.Biol.Chem.268:15,第11188-11192页；Rummel A(2007)PNAS104:359-364；Lacey DB(1998)Nat.Struct.Biol.5:898-902；Knapp(1998)Am.Cryst.Assoc.Abstract Papers 25:90；Swaminathan和Eswaramoorthy(2000)Nat.Struct.Biol.7:1751-1759；以及Rummel A(2004)Mol.Microbiol.51(3),631-643。

(参考)H_CN结构域的示例包括：

A型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(872-1110)

B型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(859-1097)

上述序列位置可能根据血清型/亚型略有不同，(参考)H_CN结构域的其他示例包括：

A型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(874-1110)

B型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(861-1097)

(参考)H_CC结构域的示例包括：

A型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(Y1111-L1296)

B型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(Y1098-E1291)

WO 2017/191315 A1(其通过引用并入本文)教导了修饰的BoNT/As以及制备和制造它们的方法。因此，用于本发明的包含肉毒杆菌神经毒素A(BoNT/A)轻链和易位结构域(BoNT/A H_N)和BoNT/B受体结合结构域(H_C结构域)的修饰的BoNT/A可以是WO 2017/191315A1中教导的一种。

如本文所用，术语“修饰的BoNT/A”或“嵌合神经毒素”是指包含(优选由其组成)来自第一种梭菌神经毒素血清型的梭菌神经毒素轻链和易位结构域(H_N结构域)以及来自第二种不同梭菌神经毒素血清型的受体结合结构域(H_C结构域)的神经毒素。具体地，用于本发明的修饰的BoNT/A包含肉毒杆菌神经毒素A(BoNT/A)轻链和易位结构域(H_N结构域)和BoNT/B受体结合结构域(H_C结构域)。修饰的BoNT/A的BoNT/A LH_N结构域与BoNT/B H_C结构域共价连接。本发明的修饰的BoNT/A可以被称为嵌合肉毒杆菌神经毒素。所述修饰的BoNT/A在本文中也称为“BoNT/AB”、“mrBoNT/AB”或“BoNT/AB嵌合体”。

L链和H_N结构域(任选地包括完全或部分活化环，例如当修饰的BoNT/A为单链形式时为完全活化环，而当为双链形式时为切割的/部分活化环)可统称为LH_N结构域。因此LH_N结构域不进一步包含H_C结构域。

修饰的BoNT/A可基本上由肉毒杆菌神经毒素A(BoNT/A)轻链和易位结构域(H_N结构域)和BoNT/B受体结合结构域(H_C结构域)组成。

如本文所用，术语“基本上由……组成”是指例如当施用于个体时，修饰的BoNT/A不进一步包含一个或多个赋予多肽额外功能的氨基酸残基。换句话说，“基本上由”肉毒杆菌神经毒素A(BoNT/A)轻链和易位结构域(H_N结构域)以及BoNT/B受体结合结构域(H_C结构域)“组成”的多肽还可以包含一个或多个氨基酸残基(与肉毒杆菌神经毒素A(BoNT/A)轻链和易位结构域(H_N结构域)以及BoNT/B受体结合结构域(H_C结构域)的氨基酸残基相似)，但所述一个或多个另外的氨基酸残基不赋予多肽额外的功能，例如当施用于个体时。另外的功能可以包括酶活性、结合活性和/或任何生理活性。

修饰的BoNT/A可包含除任何梭菌神经毒素序列之外的非梭菌神经毒素序列，只要非梭菌神经毒素序列不破坏修饰的BoNT/A实现其治疗效果的能力即可。优选地，非梭菌神经毒素序列不是具有催化活性(例如酶活性)的序列。在一个实施方案中，本发明的修饰的BoNT/A不包含非梭菌催化活性结构域。在一个实施方案中，修饰的BoNT/A不包含另外的催化活性结构域。在一个实施方案中，非梭菌序列不是与细胞受体结合的序列。换句话说，在一个实施方案中，非梭菌序列不是细胞受体的配体。细胞受体可以是蛋白质细胞受体，如整合膜蛋白。细胞受体的示例可以在IUPHAR药理学数据库指南(IUPHAR Guide toPharmacology Database)2019.4版中找到，网址为https://www.guidetopharmacology.org/download.jsp#db_reports。非梭菌神经毒素序列可以包括有助于纯化的标签，例如His标签。在一个实施方案中，本发明的修饰的BoNT/A不包含标记或用于添加标记的位点，例如分选酶受体或供体位点。

优选地，修饰的BoNT/A可由肉毒杆菌神经毒素A(BoNT/A)轻链和易位结构域(H_N结构域)和BoNT/B受体结合结构域(H_C结构域)组成。

修饰的BoNT/A包含轻链，该轻链能够表现出非细胞毒性蛋白酶活性并且能够在靶神经元的胞质溶胶中切割SNARE蛋白。

可以使用基于细胞的和体内的试验来确定包含L链和功能性细胞结合和易位结构域的梭菌神经毒素是否具有非细胞毒性蛋白酶活性。诸如趾外展评分(Digit AbductionScore)(DAS)试验、背根神经节(DRG)试验、脊髓神经元(SCN)试验和小鼠膈神经偏侧膈(PNHD)试验等试验是本领域的常规试验。用于确定非细胞毒性蛋白酶活性的合适试验可以是Aoki KR,Toxicon 39:1815-1820；2001或Donald等人(2018),Pharmacol Res Perspect,e00446,1-14中描述的试验，其通过引用并入本文。

当施用于个体时，修饰的BoNT/A优选为其活性双链形式，其中轻链和重链通过二硫键连接在一起。当BoNT/A(例如修饰的BoNT/A)在本文中通过多肽序列(SEQ ID NO)的方式定义时，序列(SEQ ID NO)的L链部分可以构成双链梭菌神经毒素(例如双链修饰的BoNT/A)的第一链，并且H_N和H_C结构域一起可以构成双链梭菌神经毒素(例如双链修饰的BoNT/A)的第二链，其中第一链和第二链通过二硫键连接在一起。本领域技术人员将理解，蛋白酶可在梭菌神经毒素(例如，修饰的BoNT/A)的活化环内的一个或多个位置处切割，优选在活化环内的两个位置处切割。当切割发生在活化环内的一个以上位置(优选两个位置)时，双链梭菌神经毒素序列(例如双链修饰的BoNT/A)中可能不存在该序列的C端L链部分的小片段。鉴于此，双链梭菌神经毒素(例如双链修饰的BoNT/A)的序列可能与相应的单链梭菌神经毒素(例如单链修饰的BoNT/A)的序列略有不同。所述小片段可以是1-15个氨基酸。具体地，在一个实施方案中，当使用Lys-C将单链修饰的BoNT/A转化为双链修饰的BoNT/A时，所述不存在的序列的C末端L链部分的小片段可以是SEQ ID NO:9或10。

最优选地，用于本发明的修饰的BoNT/A可包含BoNT/A轻链和易位结构域(BoNT/ALH_N结构域)和BoNT/B H_C结构域。BoNT/A LH_N结构域与BoNT/B H_C结构域共价连接。所述修饰的BoNT/A在本文中也称为“BoNT/AB”或“BoNT/AB嵌合体”。

LH_N结构域的C末端氨基酸残基可以对应于分隔BoNT/A的LH_N和H_C结构域的3₁₀螺旋的第一个氨基酸残基，并且H_C结构域的N末端氨基酸残基可以对应于BoNT/B中分隔LH_N和H_C结构域的3₁₀螺旋的第二个氨基酸残基。

(未修饰的)BoNT/A多肽序列的示例如SEQ ID NO:2所示。

BoNT/B多肽序列的示例如SEQ ID NO:8所示(UniProt登录号B1INP5)。

本文提及的“分隔BoNT/A的LHN和H_C结构域的3₁₀螺旋的第一个氨基酸残基”是指分隔LH_N和H_C结构域的3₁₀螺旋的N末端残基。

本文提及的“分隔BoNT/B的LH_N和H_C结构域的3₁₀螺旋的第二个氨基酸残基”是指分隔LH_N和H_C结构域的3₁₀螺旋的N末端残基之后的氨基酸残基。

“3₁₀螺旋”是在蛋白质和多肽中发现的一种类型的二级结构，还有α螺旋、β折叠和回折(reverse turn)。3₁₀螺旋中的氨基酸以右旋螺旋结构排列，其中每个完整的圈(turn)由三个残基和十个原子实现，这些原子将它们之间的分子内氢键分开。每个氨基酸对应于螺旋中的120°转角(即螺旋每个圈有三个残基)，以及沿螺旋轴平移并且在通过氢键形成的环中具有10个原子。最重要的是，氨基酸的N-H基团与比该氨基酸靠前三个残基的氨基酸的C＝O基团形成氢键；这种重复的i+3→i氢键定义为3₁₀螺旋。3₁₀螺旋是本领域技术人员熟悉的结构生物学中的标准概念。

这种3₁₀螺旋对应于形成实际螺旋的四个残基和两个帽(或过渡)残基，这四个残基的每一端都有一个帽残基。本文所用的术语“分隔LH_N和H_C结构域的3₁₀螺旋”由那6个残基组成。

通过进行结构分析和序列比对，鉴定了分隔LH_N和H_C结构域的3₁₀螺旋。这种3₁₀螺旋在其N末端(即在LH_N结构域的C末端部分)被α螺旋包围，在其C末端(即在H_C结构域的N末端部分)被β链包围。3₁₀螺旋的第一个(N末端)残基(帽或过渡残基)也对应于该α螺旋的C末端残基。

分隔LH_N和H_C结构域的3₁₀螺旋可以例如由公开可用的肉毒杆菌神经毒素的晶体结构确定，例如分别针对肉毒杆菌神经毒素A1和B1的3BTA(http://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do？structureId＝3BTA)和1EPW(http://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do？structureId＝1EPW)。

公开可用的计算机建模和比对工具也可用于确定其他神经毒素中分隔LH_N和H_C结构域的3₁₀螺旋的位置，例如同源建模服务器LOOPP(学习、观察和输出蛋白质模式(Learning,Observing and Outputting Protein Patterns)，http://loopp.org)、PHYRE(蛋白质同源/模拟识别引擎(Protein Homology/analogY Recognition Engine)，http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/)和Rosetta(https://www.rosettacommons.org/)、蛋白质叠加服务器SuperPose(http://wishart.biology.ualberta.ca/superpose/)、比对程序Clustal OmegA(http://www.clustal.org/omega/)以及分子和细胞生物学家的互联网资源(http://molbiol-tools.ca/)上列出的许多其他工具/服务。特别地，“H_N/H_CN”连接处周围的区域在结构上可以是高度保守的，这使得它成为叠加不同血清型的理想区域。

例如，下列方法可用于确定其他神经毒素中这种3₁₀螺旋的序列：

1.结构同源建模工具LOOP(http://loopp.org)可用于基于BoNT/A1晶体结构(3BTA.pdb)获得其他BoNT血清型的预测结构；

2.由此获得的结构(pdb)文件可被编辑为以仅包括H_CN结构域的N末端及其之前的约80个残基(其为H_N结构域的一部分)，从而保留结构上高度保守的“H_N/H_CN”区域；

3.蛋白质叠加服务器SuperPose(http://wishart.biology.ualberta.ca/superpose/)可以用于将每种血清型叠加到3BTA.pdb结构上；

4.检查重叠的pdb文件以定位BoNT/A1的H_C结构域的起始处的3₁₀螺旋，然后可以鉴定其他血清型中的相应残基。

5.其他的BoNT血清型序列可以与Clustal Omega进行比对，以检查相应的残基是否正确。

通过该方法测定的LH_N，H_C和3₁₀螺旋结构域的示例如下所示：

使用结构分析和序列比对，发现分隔LH_N和H_C结构域的3₁₀螺旋后面的β链是所有肉毒杆菌神经毒素和破伤风神经毒素中的保守结构，并且当从分隔LH_N和H_C结构域的3₁₀螺旋的第一个残基开始时，所述β链从第8个残基开始(例如，BoNT/A1的残基879)。

BoNT/AB嵌合体可包含与来自BoNT/B的H_C结构域共价连接的来自BoNT/A的LH_N结构域，

·其中LH_N结构域的C末端氨基酸残基对应于位于BoNT/A的H_C结构域起始端(N末端)的β链N末端的第八个氨基酸残基，并且

其中所述H_C结构域的N末端氨基酸残基对应于位于BoNT/B的H_C结构域的起始端始(N末端)的β链N末端的第七个氨基酸残基。·

·其中LH_N结构域的C末端氨基酸残基对应于位于BoNT/A的LH_N结构域终止端(C末端)的α螺旋的C末端氨基酸残基，并且

其中H_C结构域的N末端氨基酸残基对应于位于BoNT/B的LH_N结构域终止端(C末端)的α螺旋的C末端氨基酸残基的C末端紧邻氨基酸残基。

·BoNT/AB嵌合体设计过程的基本原理是尽量确保二级结构不受影响，从而最大限度地减少对三级结构和每个结构域功能的任何改变。不希望受理论束缚，假设通过不破坏BoNT/AB嵌合体中3₁₀螺旋的四个中心氨基酸残基，确保嵌合神经毒素的最佳构象，从而允许嵌合神经毒素发挥其作用，以发挥他们的全部功能。

事实上，令人惊讶地，仅保留BoNT/A的3₁₀螺旋的第一个氨基酸残基和BoNT/B的310螺旋之前的第二个氨基酸残基，不仅允许产生可溶性和功能性BoNT/AB嵌合体，而且进一步导致相对于其他BoNT/AB嵌合体改善的特性，特别是增加的效力、增加的安全比和/或更长的作用持续时间(以及当与未修饰的BoNT/A[例如SEQ ID NO:2，例如双链形式的SEQ IDNO:2]相比时增加的安全比和/或作用持续时间)。

BoNT/A轻链、BoNT/A易位结构域和/或BoNT/B H_C结构域可以是修饰的BoNT/A轻链、BoNT/A易位结构域和/或BoNT/B H_C结构域或其衍生物，包括但不限于下文描述的那些。修饰的BoNT/A轻链、BoNT/A易位结构域和/或BoNT/B H_C结构域或衍生物可以含有与BoNT/A轻链、BoNT/A易位结构域和/或BoNT/B H_C结构域的天然(未修饰的)形式相比已经修饰的一个或多个氨基酸，或者可以含有一个或多个在BoNT/A轻链、BoNT/A易位结构域和/或BoNT/BH_C结构域的天然(未修饰的)形式中不存在的插入氨基酸。例如，相对于天然的(未修饰的)BoNT/A轻链、BoNT/A易位结构域和/或BoNT/B H_C结构域序列，修饰的BoNT/A轻链、BoNT/A易位结构域和/或BoNT/B H_C结构域可以在一个或多个结构域中具有修饰的氨基酸序列。这样的修饰可以修饰其功能方面，例如生物活性或持久性。因此，在一个实施方案中，BoNT/A轻链、BoNT/A易位结构域和/或BoNT/B H_C结构域是修饰的BoNT/A轻链、BoNT/A易位结构域和/或BoNT/B H_C结构域，或修饰的BoNT/A轻链、BoNT/A易位结构域和/或BoNT/B H_C结构域的衍生物。

修饰的BoNT/B H_C结构域可具有一个或多个改变与靶神经细胞结合的修饰，例如当与天然(未修饰的)BoNT/B H_C结构域相比时，提供更高或更低亲和力的结合。BoNT/B H_C结构域中的此类修饰可包括修饰H_C结构域的神经节苷脂结合位点或蛋白质(例如突触结合蛋白)结合位点中的残基，所述修饰改变与靶神经细胞的神经节苷脂受体和/或蛋白质受体的结合。此类修饰的神经毒素的示例描述于WO 2006/027207和WO 2006/114308中，两者均通过引用整体并入本文。

修饰的轻链可以在其氨基酸序列中具有一处或多处修饰，例如底物结合或催化结构域中的修饰，其可以改变或修饰被修饰的轻链的SNARE蛋白特异性，优选地条件是所述修饰不使所述轻链催化失活。此类修饰的神经毒素的示例描述于WO 2010/120766和US2011/0318385中，两者均通过引用整体并入本文。

来自BoNT/A的LH_N结构域可对应于SEQ ID NO:2的氨基酸残基1至872，或与其具有至少70％序列同一性的多肽序列。来自BoNT/A的LH_N结构域可对应于SEQ ID NO:2的氨基酸残基1至872，或与其具有至少80％、90％或95％序列同一性的多肽序列。优选地，来自BoNT/A的LH_N结构域对应于SEQ ID NO:2的氨基酸残基1至872。

来自BoNT/B的H_C结构域可对应于SEQ ID NO:8的氨基酸残基860至1291，或与其具有至少70％序列同一性的多肽序列。来自BoNT/B的H_C结构域可对应于SEQ ID NO:8的氨基酸残基860至1291，或与其具有至少80％、90％或95％序列同一性的多肽序列。优选地，来自BoNT/B的H_C结构域对应于SEQ ID NO:8的氨基酸残基860至1291。

优选地，BoNT/AB嵌合体包含BoNT/A1 LH_N结构域和BoNT/B1 H_C结构域。更优选地，LH_N结构域对应于BoNT/A1(SEQ ID NO:2)的氨基酸残基1至872，并且H_C结构域对应于BoNT/B1(SEQ ID NO:8)的氨基酸残基860至1291。

最优选地，与天然BoNT/B序列相比，BoNT/B H_C结构域还包含H_CC亚结构域中的至少一个氨基酸残基取代、插入、插入/缺失(indel)或缺失，其具有增加BoNT/B神经毒素对人Syt II的结合亲和力的作用。BoNT/B H_CC亚结构域中合适的氨基酸残基取代、插入、插入/缺失(indel)或缺失已经公开于WO 2013/180799和WO 2016/154534(均通过引用并入本文)。

BoNT/B H_CC亚结构域中合适的氨基酸残基取代、插入、插入/缺失(indel)或缺失可以包括选自以下的取代突变：V1118M、Y1183M、E1191M、E1191I、E1191Q、E1191T、S1199Y、S1199F、S1199L、S1201V、E1191C、E1191V、E1191L、E1191Y、S1199W、S1199E、S1199H、W1178Y、W1178Q、W1178A、W1178S、Y1183C、Y1183P及其组合。

BoNT/B H_CC亚结构域中合适的氨基酸残基取代、插入、插入/缺失(indel)或缺失还可包括选自由以下的两个取代突变的组合：E1191M和S1199L，E1191M和S1199Y，E1191M和S1199F，E1191Q和S1199L，E1191Q和S1199Y，E1191Q和S1199F，E1191M和S1199W，E1191M和W1178Q，E1191C和S1199W，E1191C和S1199Y，E1191C和W1178Q，E1191Q和S1199W，E1191V和S1199W，E1191V和S1199Y，或E1191V和W1178Q。

BoNT/B H_CC亚结构域中合适的氨基酸残基取代、插入、插入/缺失(indel)或缺失也可包括三种取代突变的组合，其为E1191M、S1199W和W1178Q。

优选地，BoNT/B H_CC亚结构域中的氨基酸残基取代、插入/缺失或缺失包括两个取代突变的组合，所述突变是E1191M和S1199Y。此类修饰存在于修饰的BoNT/A SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6中。E1191M可对应于SEQ ID NO:6的位置1204，并且S1199Y可对应于位置1212。因此，SEQ ID NO:6可包括1204M和1212Y。

所述修饰可以是与如SEQ ID NO:8所示的未修饰的BoNT/B相比时的修饰，其中氨基酸残基编号通过与SEQ ID NO:8的比对来确定。由于SEQ ID NO:8(以及与本文所述的修饰的BoNT/A多肽相对应的SEQ ID NO)的位置1处是否存在甲硫氨酸残基是任选的，因此本领域技术人员在确定氨基酸残基编号时会考虑甲硫氨酸残基的存在/不存在。例如，当SEQID NO:8包括甲硫氨酸时，位置编号将如上定义(例如E1191将是SEQ ID NO:8的E1191)。或者，当SEQ ID NO:8中不存在甲硫氨酸时，氨基酸残基编号应修改为-1(例如E1191将是SEQID NO:8的E1190)。因此，修饰的BoNT/A的多肽序列的起始甲硫氨酸氨基酸残基可以是任选的或不存在的。当本文所述的其他多肽序列的位置1处的甲硫氨酸存在/不存在时，类似的考虑也适用，本领域技术人员使用本领域常规技术容易确定正确的氨基酸残基编号。

用于本发明的修饰的BoNT/A可包含与选自SEQ ID NO:3-7的多肽序列具有至少70％序列同一性的多肽序列。例如，与选自SEQ ID NO:3-7的多肽序列具有至少80％、90％、95％或99.9％序列同一性的多肽序列。优选地，用于本发明的修饰的BoNT/A可包含选自SEQID NO:3-7的多肽序列(更优选由其组成)。

优选修饰的BoNT/A包含与SEQ ID NO:6具有至少70％序列同一性的多肽序列。例如，与SEQ ID NO:6具有至少80％、90％、95％或99.9％序列同一性的多肽序列。最优选地，用于本发明的修饰的BoNT/A可以包括SEQ ID NO:6(更优选地由其组成)。

本文所用的术语“缺失”是指去除多肽的一个或多个氨基酸残基，而不在缺失位点置换一个或多个氨基酸残基。因此，当从具有x个氨基酸残基的多肽序列中缺失一个氨基酸残基时(例如)，所得多肽具有x-1个氨基酸残基。

本文所用的术语“插入/缺失(indel)”是指缺失多肽的一个或多个氨基酸残基，并在缺失位点插入与缺失的氨基酸残基数目相比不同数量的氨基酸残基(更多或更少的氨基酸残基)。因此，对于其中从具有x个氨基酸残基的多肽序列中缺失两个氨基酸残基的插入/缺失(indel)(例如)，所得多肽具有x-1个氨基酸残基或x+≥1个氨基酸残基。插入和缺失可以以任何顺序，依次或同时进行。

本文所用的术语“取代”是指在相同位点用相同数量的氨基酸残基替换一个或多个氨基酸残基。因此，对于具有x个氨基酸残基的多肽序列的取代(例如)，所得多肽也具有x个氨基酸残基。优选地，取代是在单个氨基酸位置的取代。

本文所用的术语“插入”是指在插入位点添加多肽的一个或多个氨基酸残基而不缺失多肽的一个或多个氨基酸残基。因此，当一个氨基酸残基被插入到具有x个氨基酸残基的多肽序列中时(例如)，所得多肽具有x+1个氨基酸残基。

通过取代、插入或缺失氨基酸残基来修饰蛋白质的方法是本领域已知的。举例来说，可以通过修饰编码BoNT/A(例如编码未修饰的BoNT/A)的DNA序列来引入氨基酸修饰。这可以使用标准分子克隆技术来实现，例如通过定点诱变，其中使用编码所需氨基酸的DNA的短链(寡核苷酸)利用聚合酶来替换原始编码序列，或通过使用各种酶(例如连接酶和限制性内切核酸酶)插入/缺失基因的部分。或者，可以化学合成的修饰的基因序列。通常，修饰可通过修饰编码天然梭菌神经毒素(或其部分)的核酸来进行，使得由该核酸编码的修饰的BoNT/A(或其部分)包含所述修饰。或者，可以合成编码包含修饰的修饰的BoNT/A(或其部分)的核酸。

当本文所述的修饰的BoNT/A的多肽序列包含标签(例如用于纯化的标签，诸如His标签)时，所述标签是任选的。优选地，在使用本发明的修饰的BoNT/A之前除去所述标签。

如上所述，本文所述的修饰BoNT/A具有增加的组织保留特性，这也提供了增加的效力和/或作用持续时间，并且可以允许增加剂量而没有任何额外的负面作用。可以定义这些有利性质的一种方式是根据修饰的BoNT/A的安全比来定义。在这点上，梭菌毒素的不期望的作用(由毒素从施用部位扩散导致)可以通过在相关动物模型(例如小鼠，其中在施用七天内检测体重的损失)中测量体重损失百分比而实验性地评估。相反，可通过趾外展评分(DAS)试验(肌肉麻痹的测量)来实验性地评估梭菌毒素的期望的中靶效应(on-targeteffects)。DAS试验法可以通过将在明胶磷酸盐缓冲液中配制的20μl神经毒素注射到小鼠腓肠肌/比目鱼肌复合体中进行，然后使用Aoki的方法评估趾外展评分(Aoki KR,Toxicon39:1815-1820；2001)。在DAS试验中，将小鼠尾部短暂悬挂，以引发特征性的惊跳反应(startle response)，其中小鼠伸展其后肢并外展其后趾。注射神经毒素后，按五分量表对不同程度的趾外展进行评分(0＝正常至4＝趾外展和腿伸展的最大程度减少)。

然后神经毒素的安全比可以表示为体重下降10％所需的毒素量(在小鼠施用后头七天内的峰值效应下测量)与DAS评分为2所需的神经毒素量之间的比率。因此，高安全比评分是理想的，表明神经毒素能够有效地麻痹目标肌肉而几乎没有不期望的脱靶效应。本发明的修饰的BoNT/A的安全比高于同等的未修饰的(天然)BoNT/A的安全比。

高安全比在治疗中特别有利，因为它代表治疗指数的增加。换句话说，这意味着与备选的梭菌神经毒素治疗剂相比可以使用减少的剂量和/或可以使用增加的剂量而没有任何额外的(例如有害的)作用。有害作用可包括全身毒性和/或不期望的向邻近肌肉的扩散。使用更高剂量的神经毒素而没有额外作用的可能性是特别有利的，因为更高剂量通常导致神经毒素作用的持续时间更长。

修饰的BoNT/A的效力可以表示为当施用于小鼠腓肠肌/比目鱼肌复合体时，导致给定DAS评分的神经毒素的最小剂量，例如DAS评分为2(ED₅₀剂量)或DAS评分为4。修饰的BoNT/A的效力也可以表示为在测量神经毒素对SNARE切割的细胞试验中的EC₅₀剂量，例如在测量由修饰的BoNT/A对SNAP25切割的细胞试验中的EC₅₀剂量。

修饰的BoNT/A的作用持续时间可以表示为在向小鼠腓肠肌/比目鱼肌复合体施用给定剂量的神经毒素(例如导致DAS评分为4的神经毒素的最小剂量)后恢复DAS评分为0所需的时间。

因此，在一个实施方案中，本发明的修饰的BoNT/A具有大于7的安全比(例如至少8、9、10、15、20、25、30、35、40、45或50)，其中安全比计算如下：-10％体重变化所需的毒素剂量(pg/小鼠)除以DAS ED₅₀(pg/小鼠)[ED₅₀＝产生DAS评分为2所需的剂量]。例如，修饰的BoNT/A可具有至少8、9、10、15、20、25、30、35、40、45或50的安全比。

在一个实施方案中，本发明的修饰的BoNT/A具有至少10的安全比。在一个实施方案中，本发明的修饰的BoNT/A具有至少15的安全比。

优选地，修饰的BoNT/A具有至少10(例如安全比为10)，更优选至少12或13(例如14-15)的安全比。

修饰的BoNT/A可具有大于7至最多50的安全比，例如8-45、10-20或12-15。

在使用中，本发明的修饰的BoNT/A是双链形式。

用于本发明的修饰的BoNT/A可包含与选自SEQ ID NO:3-7的多肽序列具有至少70％序列同一性的多肽序列。例如，与选自SEQ ID NO:3-7的多肽序列具有至少80％、90％、95％或99.9％序列同一性的多肽序列。优选地，用于本发明的修饰的BoNT/A可包含选自SEQID NO:3-7的多肽序列(更优选由其组成)。在所述修饰的BoNT/A中，优选SEQ ID NO:6。

因此，优选修饰的BoNT/A包含与SEQ ID NO:6具有至少70％序列同一性的多肽序列。更优选地，与SEQ ID NO:6具有至少80％、90％、95％或99.9％序列同一性的多肽序列。最优选地，用于本发明的修饰的BoNT/A可以包括SEQ ID NO:6(更优选地由其组成)。

本发明的双链修饰的BoNT/A可包含与SEQ ID NO:3-7中任一项具有至少70％、80％、90％、95％、99.9％或100％序列同一性的多肽序列的L链部分，其构成双链修饰的BoNT/A的第一链，并且可以包含与SEQ ID NO:3-7中的任一项具有至少70％、80％、90％、95％、99.9％或100％序列同一性的多肽序列的H_N和H_C结构域，其一起构成双链修饰的BoNT/A的第二链，其中第一链和第二链通过二硫键连接在一起。

其中切割发生在修饰的BoNT/A的活化环内的一个以上位置(优选两个位置)处，所述修饰的BoNT/A包含与SEQ ID NO：3-7中任一项具有至少70％、80％、90％、95％、99.9％或100％序列同一性的多肽序列，与SEQ ID NO:3-7中任一项具有至少70％、80％、90％、95％、99.9％或100％序列同一性的序列的C末端L链部分的小片段可能不存在于所述双链修饰的BoNT/A中。鉴于此，双链修饰的BoNT/A的序列(例如包含与SEQ ID NO:3-7中任一项具有至少70％、80％、90％、95％、99.9％或100％序列同一性的多肽序列)可以与相应的单链修饰的BoNT/A略有不同，所述单链修饰的BoNT/A包含与SEQ ID NO:3-7中任一项具有至少70％、80％、90％、95％、99.9％或100％序列同一性的多肽序列。所述小片段可以是1-15个氨基酸。特别地，在一个实施方案中，当使用Lys-C将单链修饰的BoNT/A转化为双链梭菌神经毒素时，所述不存在的序列的C末端L链部分的小片段可以是SEQ ID NO:9或10。

优选地，本发明的双链修饰的BoNT/A可包含与SEQ ID NO:6具有至少70％、80％、90％、95％、99.9％或100％序列同一性的多肽序列的L链部分，其构成双链修饰的BoNT/A的第一链，并且可以包含与SEQ ID NO:6具有至少70％、80％、90％、95％、99.9％或100％序列同一性的多肽序列的H_N和H_C结构域，其一起构成双链修饰的BoNT/A的第二链，其中第一链和第二链通过二硫键连接在一起。

其中切割发生在修饰的BoNT/A的活化环内的一个以上位置(优选两个位置)处，所述修饰的BoNT/A包含与SEQ ID NO:6具有至少70％、80％、90％、95％、99.9％或100％序列同一性的多肽序列，与SEQ ID NO:6具有至少70％、80％、90％、95％、99.9％或100％序列同一性的序列的C末端L链部分的小片段可能不存在于所述双链修饰的BoNT/A中。鉴于此，双链修饰的BoNT/A的序列(例如包含与SEQ ID NO:6具有至少70％、80％、90％、95％、99.9％或100％序列同一性的多肽序列)可以与相应的单链嵌合梭菌神经毒素略有不同，所述单链修饰的BoNT/A包含与SEQ ID NO:6具有至少70％、80％、90％、95％、99.9％或100％序列同一性的多肽序列。所述小片段可以是1-15个氨基酸。具体地，在一个实施方案中，当使用Lys-C将单链修饰的BoNT/A转化为双链修饰的BoNT/A时，所述不存在的序列的C末端L链部分的小片段可以是SEQ ID NO:9或10。

在特别优选的实施方案中，双链修饰的BoNT/A包含轻链和重链(或由轻链和重链组成)，所述轻链包含与SEQ ID NO:11或12(优选SEQ ID NO:11)具有至少70％、80％、90％、95％或99.9％序列同一性的多肽序列，所述重链包含与SEQ ID NO:13具有至少70％、80％、90％、95％或99.9％序列同一性的多肽序列，其中所述轻链和重链通过二硫键连接在一起。更优选地，双链修饰的BoNT/A包含轻链和重链(或由轻链和重链组成)，所述轻链包含SEQID NO:11或12(优选SEQ ID NO:11)，所述重链包含SEQ ID NO:13，其中所述轻链和重链通过二硫键连接在一起。甚至更优选地，双链修饰的BoNT/A包含轻链和重链(或由轻链和重链组成)，所述轻链具有SEQ ID NO:11，所述重链具有SEQ ID NO:13，其中所述轻链和重链通过二硫键连接在一起。二硫键优选由SEQ ID NO:11或12的半胱氨酸残基429与SEQ ID NO:13的半胱氨酸残基6形成和/或位于其之间。

在优选的实施方案中，本发明的修饰的BoNT/A不包含除所述轻链和重链之外的治疗剂或诊断剂(例如核酸、蛋白质、肽或小分子治疗剂或诊断剂)。例如，在一个实施方案中，所述修饰的BoNT/A可能不包含共价或非共价结合的治疗剂或诊断剂。因此，本发明的修饰的BoNT/A优选不作为其他治疗剂或诊断剂的递送溶媒。

在实施方案中，本文所述的修饰的BoNT/A具有用于纯化的标签(例如His标签)和/或接头，所述标签和/或接头是任选的。

修饰的BoNT/A可不含存在于天然存在的梭菌神经毒素复合物中的复合蛋白。这种复合蛋白的示例包括神经毒素相关蛋白(NAP)和无毒非血凝素成分(NTNH)。然而，优选修饰的BoNT/A是重组修饰的BoNT/A。

本发明的修饰的BoNT/A可以使用重组核酸技术生产。因此，在一个实施方案中，修饰的BoNT/A(如本文所述)是重组修饰的BoNT/A。

在一个实施方案中，提供了包含编码修饰的BoNT/A的核酸序列的核酸(例如DNA)。在一个实施方案中，所述核酸序列被制备为包含启动子和终止子的DNA载体的一部分。所述核酸序列可选自本文所述的任何核酸序列。

在一个优选的实施方案中，所述载体具有选自以下的启动子：

启动子诱导剂典型诱导条件

Tac(杂合) IPTG 0.2mM(0.05-2.0mM)

AraBAD L-阿拉伯糖 0.2％(0.002-0.4％)

T7-lac操纵子 IPTG 0.2mM(0.05-2.0mM)

在另外优选的实施方案中，所述载体具有选自以下的启动子：

启动子诱导剂典型诱导条件

Tac(杂合) IPTG 0.2mM(0.05-2.0mM)

AraBAD L-阿拉伯糖 0.2％(0.002-0.4％)

T7-lac操纵子 IPTG 0.2mM(0.05-2.0mM)

T5-lac操纵子 IPTG 0.2mM(0.05-2.0mM)

所述核酸分子可以使用本领域已知的任何合适的方法来制备。因此，可以使用化学合成技术制备所述核酸分子。或者，可以使用分子生物学技术制备本发明的核酸分子。

本发明的DNA构建体优选在计算机上设计，然后通过常规DNA合成技术合成。

根据要采用的最终宿主细胞(例如大肠杆菌)表达系统，任选地修改上述核酸序列信息以用于密码子偏好。

术语“核苷酸序列”和“核酸”在本文中同义使用。优选地，核苷酸序列是DNA序列。

本发明的修饰的BoNT/A可以作为单链或作为双链存在。然而，优选修饰的BoNT/A作为双链存在，其中L链通过二硫键与H链(或其组分，例如H_N结构域)连接。

具有轻链和重链的单链修饰的BoNT/A的产生可以使用包括以下步骤的方法来实现：在表达宿主中表达编码修饰的BoNT/A的核酸，裂解宿主细胞以提供含有单链修饰的BoNT/A的宿主细胞匀浆，并分离单链修饰的BoNT/A。本文所述的单链修饰的BoNT/A可以使用以下方法进行蛋白水解加工，所述方法包括使单链修饰的BoNT/A与蛋白酶(例如Lys-C)接触，所述蛋白酶水解修饰的BoNT/A的活化环中的肽键，从而将单链修饰的BoNT/A转化为相应的双链修饰的BoNT/A(例如其中轻链和重链通过二硫键连接在一起)。双链修饰的BoNT/A优选可通过这种方法获得。

因此，本发明中使用的修饰的BoNT/A优选是由单链BoNT/A产生的双链修饰的BoNT/A，其中单链BoNT/A包含本文所述的多肽序列或由本文所述的多肽序列组成。例如，优选地，本发明中使用的修饰的BoNT/A是由包含与SEQ ID NO:6具有至少70％(例如至少80％、90％、95％或99.9％)序列同一性的多肽序列的多肽产生的双链修饰的BoNT/A。最优选地，用于本发明的修饰的BoNT/A是由包含SEQ ID NO:6(甚至更优选由其组成)的多肽产生的双链修饰的BoNT/A。因此，在一些实施方案中，修饰的BoNT/A是双链修饰的BoNT/A，其中轻链(L链)通过二硫键连接至重链(H链)，所述修饰的BoNT/A可通过以下方法获得，该方法包括将单链修饰的BoNT/A与水解其活化环中的肽键的蛋白酶接触，从而将单链修饰的BoNT/A转化为相应的双链修饰的BoNT/A。因此，在一些实施方案中，修饰的BoNT/A是双链修饰的BoNT/A，其中轻链(L链)通过二硫键连接至重链(H链)，所述修饰的BoNT/A可通过以下方法获得，该方法包括将包含SEQ ID NO:6的修饰的BoNT/A与水解其活化环中的肽键的蛋白酶接触，从而将单链修饰的BoNT/A转化为相应的双链修饰的BoNT/A。在一些实施方案中，修饰的BoNT/A是双链修饰的BoNT/A，其中L链通过二硫键连接至H链，所述修饰的BoNT/A可通过以下方法获得，该方法包括将由SEQ ID NO:6组成的修饰的BoNT/A与水解其活化环中的肽键的蛋白酶接触，从而将单链修饰的BoNT/A转化为相应的双链修饰的BoNT/A。

用于切割活化环的蛋白酶优选是Lys-C。用于切割活化环以产生双链梭菌神经毒素的合适的蛋白酶和方法教导于WO 2014/080206、WO2014/079495和EP2677029A2，其通过引用并入本文。Lys-C可以切割其中存在的一个或多个赖氨酸残基的活化环C-末端。当Lys-C不止一次地切割该活化环时，技术人员将理解，当与本文所示的SEQ ID NO相比时，双链修饰的BoNT/A的活化环的小肽可能不存在。

本文所用的术语“可获得的(obtainable)”还涵盖术语“获得的(obtained)”。在一个实施方案中，术语“可获得的(obtainable)”是指获得的。

本文所用的术语“一个或多个”可以指至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个。在一个实施方案中，其中“一个或多个”位于列表之前，“一个或多个”可能表示列表的所有成员。类似地，本文使用的术语“至少一个”可以指至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个。在一个实施方案中，其中“至少一个”位于列表之前，“至少一个”可能表示列表的所有成员。

本文所用的术语“病症(disorder)”还涵盖“疾病”。在一个实施方案中，所述病症是疾病。

本发明的修饰的BoNT/A可以以任何合适的方式配制以施用给个体，例如作为药物组合物的一部分。这种药物组合物可包含本发明的修饰BoNT/A和药学上可接受的载体、赋形剂、佐剂、推进剂和/或盐。

适合于注射的组合物可以是溶液、悬浮液或乳液，或干粉的形式，其在使用前溶解或悬浮在合适的溶媒中。

流体剂型通常利用修饰BoNT/A和无热原的无菌溶媒制备。根据所用的溶媒和浓度，修饰的BoNT/A可以溶解或悬浮在溶媒中。在制备溶液时，可将修饰的BoNT/A溶解在溶媒中，必要时通过加入氯化钠使溶液等渗，并使用无菌技术通过无菌过滤器过滤进行灭菌，然后填充到合适的无菌小瓶或安瓿中并密封。或者，如果溶液稳定性足够，可通过高压灭菌对密封容器中的溶液进行灭菌。有利地，可以将添加剂例如缓冲剂、增溶剂、稳定剂、防腐剂或杀菌剂、悬浮剂或乳化剂和/或局部麻醉剂溶解在溶媒中。

通过在无菌区域使用无菌技术将预灭菌的成分填充到无菌容器中，可以制备干粉，以在使用前溶解或悬浮在合适的溶媒中。或者，可以在无菌区域使用无菌技术将成分溶解到合适的容器中。然后将产物冷冻干燥并将容器无菌密封。

适于本文所述施用途径的肠胃外悬浮液以基本上相同的方式制备，除了将无菌组分悬浮在无菌溶媒中而不是溶解，并且灭菌不能通过过滤完成。这些组分可以以无菌状态分离，或者可以在分离后例如通过γ辐射进行灭菌。

有利地，组合物中包含悬浮剂例如聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone)以促进组分的均匀分布。

在一方面，本发明提供了(例如用于治疗成人肢体痉挛)修饰的肉毒杆菌神经毒素A(BoNT/A)的单位剂型，所述单位剂型包含：

a.大于707单位的修饰的BoNT/A，其中1单位是对应于小鼠中计算的半数致死量(LD₅₀)的修饰的BoNT/A的量；或

b.大于17,000pg的修饰的BoNT/A；以及

c.任选地药学上可接受的载体、赋形剂、佐剂和/或盐，

优选单位剂型的修饰的BoNT/A包含与SEQ ID NO:6具有至少70％序列同一性的多肽序列。例如，与SEQ ID NO:6具有至少80％、90％、95％或99.9％序列同一性的多肽序列。最优选地，修饰的BoNT/A可以包含SEQ ID NO:6(更优选由其组成)。

单位剂型可以包含大于707单位的修饰的BoNT/A。所述范围的上限可以是1664、1650、1600、1550、1500、1450、1400、1350、1300、1250、1150、1100、1050、1000、950、900、850、800或750单位的修饰的BoNT/A，优选上限是1500单位。所述范围的下限可以是725、750、775、800、825、850、875、900、925、950、975、1000、1025、1050、1075、1100、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600或1650单位的修饰的BoNT/A，优选下限是725单位、949单位或1,381单位。优选地，单位剂型包含大于707单位至最多1664单位的修饰的BoNT/A，例如大于707单位至最多1,498单位或832单位至1622单位。单位剂型可以包含915至1581单位，优选949至1581单位或1414至1581单位的修饰的BoNT/A。单位剂型可包含998至1,498单位或1,040至1,498单位的修饰的BoNT/A。在优选的实施方案中，单位剂型包含998、1,040、1,248或1,498单位的修饰的BoNT/A。在更优选的实施方案中，单位剂型包含1,248或1,498单位(例如1,498单位)的修饰的BoNT/A。

更优选的是单位剂型包含1,248单位至1,664单位，例如1,456单位至1,539单位的修饰的BoNT/A。更优选地，单位剂型包含1,498单位的修饰的BoNT/A。

甚至更优选的是单位剂型包含832单位至1,248单位，例如998单位至1,082单位的修饰的BoNT/A。最优选地，单位剂型包含1,040单位的修饰的BoNT/A。

单位剂型可包含大于17,000pg的修饰的BoNT/A。所述范围的上限可以是40,000、39,000、38,000、37,000、36,000、35,000、30,000、25,000、24,000、22,000、20,000或18,000pg的修饰的BoNT/A，优选上限是38,000pg。所述范围的下限可以是17,500、18,000、20,000、22,000、24,000、25,000、26,000、27,000、28,000、29,000、30,000、35,000、36,000、37,000、38,000或39,000pg修饰的BoNT/A，优选下限是17,500pg、22,753pg、22,790pg或33,1818pg。优选地，单位剂型包含大于17,000pg至最多40,000pg，例如大于17,000pg至最多36,000pg，或20,000pg至39,000pg的修饰的BoNT/A。单位剂型可包含22,000至38,000pg，优选23,000至38,000pg，或34,000至38,000pg的修饰的BoNT/A。单位剂型可包含24,000至36,000pg或25,000至36,000pg的修饰的BoNT/A。在优选的实施方案中，单位剂型包含24,000、25,000、30,000或36,000pg修饰的BoNT/A。在更优选的实施方案中，单位剂型包含30,000或36,000pg(例如36,000pg)修饰的BoNT/A。

更优选的是单位剂型包含30,000pg至40,000pg，例如35,000pg至37,000pg的修饰的BoNT/A。更优选地，该单位剂量剂型包含36,000pg修饰的BoNT/A。

甚至更优选的是单位剂型包含20,000pg至30,000pg，例如24,000pg至26,000pg的修饰的BoNT/A。最优选地，该单位剂型包含25,000pg的修饰的BoNT/A。

上述单位剂型可适合于治疗成年个体。

一方面，本发明提供了上述单位剂型用于治疗成人肢体痉挛。还提供了用于治疗成人肢体痉挛的相应方法，及其在制造用于治疗成人肢体痉挛的药物中的用途。该治疗优选按照本文描述的治疗进行。

如前所述，儿科应用的单位剂量可能比上面指出的要少50％或更少。在一些实施方案中，单位剂量通常为治疗成人肢体痉挛时使用的70％或更少(例如67％或更少)。

在另一方面，本发明提供了用于治疗小儿个体(例如用于治疗小儿肢体痉挛)的修饰的肉毒杆菌神经毒素A(BoNT/A)的单位剂型，所述单位剂型包含：

a.大于353.5单位的修饰的BoNT/A，其中1单位是对应于小鼠中计算的半数致死量(LD₅₀)的修饰的BoNT/A的量；或

b.大于8,500pg的修饰的BoNT/A；以及

c.任选的药学上可接受的载体、赋形剂、佐剂和/或盐，

用于治疗小儿个体的单位剂型可包含大于353.5单位的修饰的BoNT/A。所述范围的上限可以是832、825、800、775、750、725、700、675、650、625、600、575、550、525、500、475、450或425单位的修饰的BoNT/A，优选上限是749、750或790单位。所述范围的下限可以是364、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825或830单位的修饰的BoNT/A，优选下限是364单位、416单位、474.5单位、475单位、690单位或690.5单位。优选地，单位剂型包含353.5单位至832单位的修饰的BoNT/A，例如大于353.5单位至最多749单位或416单位至811单位。用于治疗小儿肢体痉挛的修饰的BoNT/A的单位剂量可以包含457.5单位至749单位、458单位至790单位、或458单位至791单位，优选474.5单位至749单位、707单位至749单位、475单位至790单位、475单位至791单位、707单位至790单位、或707单位至791单位。在优选的实施方案中，单位剂型包含499、520、624或749单位的修饰的BoNT/A。在更优选的实施方案中，单位剂型包含624或749单位(例如749单位)的修饰的BoNT/A。

更优选用于治疗小儿肢体痉挛的单位剂型包含624单位至832单位，例如728单位至770单位的修饰的BoNT/A。更优选地，用于治疗小儿肢体痉挛的单位剂型包含749单位的修饰的BoNT/A。

甚至更优选用于治疗小儿肢体痉挛的单位剂型包含416单位至624单位，例如499单位至541单位的修饰的BoNT/A。最优选地，用于治疗小儿肢体痉挛的单位剂型包含520单位的修饰的BoNT/A。

用于治疗小儿个体的单位剂型可包含大于8,500pg的修饰的BoNT/A。所述范围的上限可以是20,000、19,500、19,000、18,500、18,000、17,500、15,000、12,500、12,000、11,000、10,000或9,000pg的修饰的BoNT/A，优选上限是19,000pg。所述范围的下限可以是8,750、9,000、10,000、11,000、12,000、12,500、13,000、13,500、14,000、14,500、15,000、17,500、18,000、18,500、19,000或19,500pg修饰的BoNT/A，优选下限是8,750pg、11,376pg、11,377pg、11,395pg、11,400pg、16,590pg或16,591pg。优选地，单位剂型包含大于8,500pg至最多20,000pg，例如大于8,500pg至最多18,000pg，或10,000至19,500修饰的BoNT/A。单位剂型可包含11,000至19,000pg，优选11,500pg至19,000pg，或17,000至19,000pg修饰的BoNT/A。单位剂型可包含12,000pg至18,000pg或12,500pg至18,000pg的修饰BoNT/A。单位剂型可以包含12,500pg至20,000pg的修饰的BoNT/A。在优选的实施方案中，单位剂型包含12,000、12,500、15,000或18,000pg修饰的BoNT/A。在更优选的实施方案中，单位剂型包含15,000或18,000pg(例如18,000pg)修饰的BoNT/A。

更优选用于治疗小儿肢体痉挛的单位剂型包含15,000pg至20,000pg，例如17,500至18,500pg的修饰的BoNT/A。更优选地，用于治疗小儿肢体痉挛的单位剂型包含18,000pg的修饰的BoNT/A。

甚至更优选用于治疗小儿肢体痉挛的单位剂型包含10,000pg至15,000pg，例如12,000pg至13,000pg的修饰的BoNT/A。更优选地，用于治疗小儿肢体痉挛的单位剂型包含12,500pg的修饰的BoNT/A。

一方面，本发明提供了上述单位剂型用于治疗小儿肢体痉挛。还提供了用于治疗小儿肢体痉挛的相应方法，及其在制造用于治疗小儿肢体痉挛的药物中的用途。该治疗优选按照本文描述的治疗进行。

存在于单位剂型中的修饰BoNT/A优选为双链形式。因此，所述修饰的BoNT/A优选为本文所述(和/或如本文所述产生的)的双链修饰的BoNT/A。

单位剂型优选以干粉形式提供。

在另一方面，本发明提供了一种试剂盒，其包含：

a.根据本发明的单位剂型；和

b.用于治疗肢体痉挛中的使用说明书；和

c.任选的稀释剂。

在一方面，本发明提供了修饰的肉毒杆菌神经毒素A(BoNT/A)，其用于治疗成人肢体痉挛，其中修饰的BoNT/A通过肌内注射施用至个体的多块受影响的肌肉，

其中该修饰的BoNT/A以10,000pg至20,000pg(例如14,000pg至16,000pg，优选15,000pg)的修饰的BoNT/A单位剂量的方式施用至多块受影响的肌肉，

其中所述多块受影响的肌肉选自：

第二组，包括：肱三头肌(长头)、肩胛下肌、胸肌(例如，胸大肌)、背阔肌、肱二头肌、肱肌、比目鱼肌、胫骨后肌、肱桡肌、大圆肌、髂腰肌、大收肌、腘绳肌(例如，股二头肌、半膜肌和/或半腱肌)、股直肌和腓肠肌，

优选地，其中所述多块受影响的肌肉中的至少一个选自：大收肌、腘绳肌(例如股二头肌、半膜肌和/或半腱肌)和股直肌；以及

其中在受影响的第一组肌肉处施用单个单位剂量和/或在受影响的第二组肌肉处施用多个单位剂量，并且其中在治疗期间施用的总剂量最多300,000pg(例如最多240,000pg，优选最多225,000pg)，并且

在一方面，本发明提供了一种治疗成人肢体痉挛的方法，该方法包括通过肌内注射将修饰的肉毒杆菌神经毒素(BoNT/A)施用至个体的多块受影响的肌肉，

其中所述多块受影响的肌肉选自：

在一方面，本发明提供了修饰的肉毒杆菌神经毒素(BoNT/A)在制造用于治疗成人肢体痉挛的药物中的用途，其中修饰的BoNT/A通过肌内注射施用至个体的多块受影响的肌肉，

其中所述多块受影响的肌肉选自：

在上述方面中，优选地，单位剂量为15,000pg，并且总剂量为最多225,000pg(例如，总剂量可以是225,000pg)。

其中所述修饰的BoNT/A以416单位至832单位(例如582单位至666单位，优选624单位)修饰的BoNT/A的单位剂量的方式施用至多块受影响的肌肉，并且其中1单位是对应于小鼠中计算的半数致死量(LD₅₀)的修饰的BoNT/A的量，

其中所述多块受影响的肌肉选自：

其中在受影响的第一组肌肉处施用单个单位剂量和/或在受影响的第二组肌肉处施用多个单位剂量，并且其中在治疗期间施用的总剂量最多12,480单位(例如最多9,990单位，优选最多9,360单位)，并且

其中所述多块受影响的肌肉选自：

在上述方面，优选地，单位剂量为624单位，并且总剂量为最多9,360单位(例如，总剂量可为9,360单位)。

在一方面，本发明提供了修饰的肉毒杆菌神经毒素A(BoNT/A)，其用于治疗小儿肢体痉挛，其中修饰的BoNT/A通过肌内注射施用至个体的多块受影响的肌肉，

其中该修饰的BoNT/A以5,000pg至10,000pg(例如7,000pg至8,000pg，优选7,500pg)的修饰的BoNT/A单位剂量的方式施用至多块受影响的肌肉，

其中所述多块受影响的肌肉选自：

其中在受影响的第一组肌肉处施用单个单位剂量和/或在受影响的第二组肌肉处施用多个单位剂量，并且其中在治疗期间施用的总剂量最多150,000pg(例如最多120,000pg，优选最多112,500pg)，并且

在一方面，本发明提供了一种治疗小儿肢体痉挛的方法，该方法包括通过肌内注射将修饰的肉毒杆菌神经毒素(BoNT/A)施用至个体的多块受影响的肌肉，

其中所述多块受影响的肌肉选自：

其中在受影响的第一组肌肉处施用单个单位剂量和/或在受影响的第二组肌肉处施用多个单位剂量，并且其中在治疗期间施用的总剂量最多150,000pg(例如最多120,000pg，优选最多112,500pg)，并且其中所述修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域，以及BoNT/B受体结合结构域(H_C结构域)。

在一方面，本发明提供了修饰的肉毒杆菌神经毒素(BoNT/A)在制造用于治疗小儿肢体痉挛的药物中的用途，其中修饰的BoNT/A通过肌内注射施用至个体的多块受影响的肌肉，

其中所述多块受影响的肌肉选自：

在上述方面中，优选地，单位剂量为7,500pg，并且总剂量为最多112,500pg(例如，总剂量可以是112,500pg)。

其中所述修饰的BoNT/A以208单位至416单位(例如291单位至333单位，优选312单位)修饰的BoNT/A的单位剂量的方式施用至多块受影响的肌肉，并且其中1单位是对应于小鼠中计算的半数致死量(LD₅₀)的修饰的BoNT/A的量，

其中所述多块受影响的肌肉选自：

其中在受影响的第一组肌肉处施用单个单位剂量和/或在受影响的第二组肌肉处施用多个单位剂量，并且其中在治疗期间施用的总剂量最多6,240单位(例如最多4,995单位，优选最多4,680单位)，并且

其中所述多块受影响的肌肉选自：

在上述方面，优选地，单位剂量为312单位，并且总剂量为最多4,680单位(例如，总剂量可为4,680单位)。

在上述任一方面中，肢体痉挛的治疗持续时间可比未修饰的BoNT/A(例如SEQ IDNO:2[例如双链形式的SEQ ID NO:2])的治疗持续时间更长。

与本发明的各种治疗用途相关的实施方案旨在同等地应用于本发明的方法、组合物(例如单位剂型)和试剂盒，反之亦然。

序列同源性

可以使用多种序列比对方法中的任一种来确定百分比同一性，包括但不限于全局方法，局部方法和混合方法，例如区段方法。确定百分比同一性的方案是本领域技术人员能力范围内的常规程序。全局方法将序列从分子的开始到末端进行比对，并通过将单个残基对的分数相加并施加空位罚分来确定最佳比对。非限制性方法包括，例如CLUSTAL W，参见例如Julie D.Thompson等人，CLUSTAL W:Improving the Sensitivity of ProgressiveMultiple Sequence Alignment Through Sequence Weighting,Position-Specific GapPenalties和Weight Matrix Choice,22(22)Nucleic Acids Research 4673-4680(1994)；和迭代细化，参见，例如，Osamu Gotoh,Significant Improvement in Accuracy ofMultiple Protein。Sequence Alignments by Iterative Refinement as Assessed byReference to Structural Alignments,264(4)J.MoI.Biol.823-838(1996)。局部方法通过鉴定所有输入序列共有的一个或多个保守基序来比对序列。非限制性方法包括，例如，Match-box，参见例如，Eric Depiereux和Ernest Feytmans,Match-Box:A FundamentallyNew Algorithm for the Simultaneous Alignment of Several Protein Sequences,8(5)CABIOS 501 -509(1992)；吉布斯采样，参见例如C.E.Lawrence等人,Detecting SubtleSequence Signals:A Gibbs Sampling Strategy for Multiple Alignment,262(5131)Science 208-214(1993)；Align-M，参见例如，Ivo Van WaIIe等人,Align-M-A NewAlgorithm for Multiple Alignment of Highly Divergent Sequences,20(9)Bioinformatics:1428-1435(2004)。

因此，通过常规方法确定序列同一性百分比。参见例如，Altschul等人,Bull.Math.Bio.48:603-16,1986和Henikoff and Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915-19,1992。简言之，如下所示，使用空位开放罚分10、空位延伸罚分1以及Henikoff和Henikoff的“blosum 62”评分矩阵(同上)比对两个氨基酸序列以优化比对分数(氨基酸由标准单字母代码表示)；优选地，该方法用于将序列与本文的主题序列(例如SEQ ID NO:2)进行比对，以定义本文所述的氨基酸位置编号。

两个或更多个核酸或氨基酸序列之间的“序列同一性百分比”是序列共享的相同位置的数量的函数。因此，同一性％可计算为相同核苷酸/氨基酸的数目除以核苷酸/氨基酸的总数，再乘以100。序列同一性％的计算还可以考虑需要引入以优化两个或更多个序列的比对的空位的数量，以及每个空位的长度。可以使用本领域技术人员熟悉的特定数学算法如BLAST进行序列比较和确定两个或多个序列之间的百分比同一性。

用于确定序列同一性的比对评分

然后百分比同一性计算如下：

基本上同源的多肽的特征在于具有一个或多个氨基酸取代、缺失或添加。这些变化优选是不重要的，即保守氨基酸取代(参见下文)和不显著影响多肽的折叠或活性的其他取代；小的缺失，通常为1至约30个氨基酸；和小的氨基末端或羧基末端延伸，例如氨基末端甲硫氨酸残基，至多约20-25个残基的小接头肽，或亲和标签。

保守氨基酸取代

碱性：精氨酸

赖氨酸

组氨酸

酸性：谷氨酸

天冬氨酸

极性：谷氨酰胺

天冬酰胺

疏水性：亮氨酸

异亮氨酸

缬氨酸

芳香族：苯丙氨酸

色氨酸

酪氨酸

小的：甘氨酸

丙氨酸

丝氨酸

苏氨酸

甲硫氨酸

除了20种标准氨基酸外，非标准氨基酸(如4-羟基脯氨酸，6-N-甲基赖氨酸，2-氨基异丁酸，异缬氨酸和α-甲基丝氨酸)可取代本发明多肽的氨基酸残基。有限数量的非保守氨基酸，未被遗传密码编码的氨基酸和非天然氨基酸可以取代多肽氨基酸残基。本发明的多肽还可以包含非天然存在的氨基酸残基。

非天然存在的氨基酸包括但不限于反式3-甲基脯氨酸、2,4-甲酰脯-氨酸(2,4-methano-proline)、顺式4-羟基脯氨酸、反式4-羟基脯氨酸、N-甲基甘氨酸、别苏氨酸、甲基苏氨酸、羟乙基半胱氨酸、羟乙基高半胱氨酸、硝基谷氨酰胺、高谷氨酰胺、哌可酸、叔亮氨酸、正缬氨酸、2-氮杂苯丙氨酸、3-氮杂苯丙氨酸、4-氮杂苯丙氨酸和4-氟苯丙氨酸。本领域已知几种将非天然存在的氨基酸残基掺入蛋白质的方法。例如，可使用体外系统，其中使用化学氨基酰化抑制型tRNA来抑制无义突变。合成氨基酸和氨酰化tRNA的方法是本领域已知的。含有无义突变的质粒的转录和翻译是在无细胞系统中进行的，所述无细胞系统包含大肠杆菌S30提取物和市售酶和其他试剂。通过色谱法纯化蛋白质。参见例如Robertson等人,J.Am.Chem.Soc.113:2722,1991；Ellman等人,Methods Enzymol.202:301,1991；Chung等人,Science 259:806-9,1993；以及Chung等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:10145-9,1993)。在第二种方法中，通过显微注射突变的mRNA和化学氨基酰化的抑制型tRNA在非洲爪蟾卵母细胞中进行翻译(Turcatti等人,J.Biol.Chem.271:19991-8,1996)。在第三种方法中，在不存在待置换的天然氨基酸(例如苯丙氨酸)和存在期望的非天然存在的氨基酸(例如2-氮杂苯丙氨酸、3-氮杂苯丙氨酸、4-氮杂苯丙氨酸或4-氟苯丙氨酸)的情况下培养大肠杆菌细胞。非天然存在的氨基酸代替其天然对应物掺入多肽中。参见Koide等人,Biochem.33:7470-6,1994。天然存在的氨基酸残基可以通过体外化学修饰转化为非天然存在的种类。化学修饰可与定点诱变组合以进一步扩大取代的范围(Wynn and Richards,Protein Sci.2:395-403,1993)。

有限数量的非保守氨基酸、未被遗传密码编码的氨基酸、非天然存在的氨基酸和非天然氨基酸可取代本发明多肽的氨基酸残基。

本发明的多肽中的必需氨基酸可以根据本领域已知的方法鉴定，例如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham and Wells,Science 244:1081-5,1989)。生物相互作用的位点还可以通过结构的物理分析来确定，如通过诸如核磁共振、结晶学、电子衍射或光亲和标记的技术，结合推定的接触位点氨基酸的突变来确定。参见例如de Vos等人,Science 255:306-12,1992；Smith等人,J.Mol.Biol.224:899-904,1992；Wlodaver等人,FEBS Lett.309:59-64,1992。必需氨基酸的同一性也可以通过与本发明的多肽的相关组分(例如易位或蛋白酶组分)的同源性分析来推断。

可以使用已知的诱变和筛选方法进行多种氨基酸取代，并进行测试，例如Reidhaar-Olson and Sauer(Science 241:53-7,1988)或Bowie and Sauer(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:2152-6,1989)公开的那些方法。简而言之，这些作者公开了用于同时随机化多肽中的两个或多个位置，选择功能性多肽，然后对诱变的多肽测序以确定每个位置上允许的取代谱的方法。可使用的其他方法包括噬菌体展示(例如，Lowman等人,Biochem.30:10832-7,1991；Ladner等人,U.S.Patent No.5,223,409；Huse,WIPOPublication WO 92/06204)和区域定点突变(Derbyshire等人，Gene 46:145,1986；Ner etal.,DNA 7:127,1988)。

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。Singleton等人,DICTIONARY OF MICROBIOLOGY ANDMOLECULAR BIOLOGY,第20版,John Wiley and Sons,New York(1994)；和Hale&Marham,THEHARPER COLLINSDICTIONARY OF BIOLOGY,Harper Perennial,NY(1991)为本领域技术人员提供了本公开中使用的许多术语的通用词典。

本公开不限于本文公开的示例性方法和材料，并且与本文描述的那些类似或等同的任何方法和材料可用于实践或测试本公开的实施方案。数值范围包括定义该范围的数字。除非另有说明，否则任何核酸序列以5'至3’方向从左到右书写；氨基酸序列分别以氨基到羧基的方向从左到右书写。

本文提供的标题不是对本发明的各个方面或实施方案的限制。

本文使用氨基酸的名称，三字母缩写或单字母缩写来指代氨基酸。本文所用的术语“蛋白质”包括蛋白质、多肽和肽。如本文所用，术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白质”同义。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“肽”同义。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“酶”同义。术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换使用。在本公开和权利要求中，可以使用氨基酸残基的常规单字母和三字母代码。符合IUPACIUB生物化学命名联合委员会(JCBN)定义的氨基酸的3字母代码。还应当理解，由于遗传密码的简并性，多肽可以由一个以上的核苷酸序列编码。

在整个说明书中可以出现术语的其他定义。在更详细地描述示范性实施方案之前，应当了解，本发明不限于所描述的特定实施方案，且因此可变化。还应理解，本文所用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，且不希望为限制性的，因为本发明的范围将仅由所附权利要求书界定。

在提供数值范围的情况下，应当理解，除非上下文另外明确指出，否则在该范围的上限与下限之间的每一中间值(至下限单位的十分之一)也被具体公开。任何规定值或规定范围内的中间值与该规定范围内的任何其他规定值或中间值之间的每个较小范围涵盖在本公开内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在该范围内，并且每个范围也涵盖在本公开内，其中包括在较小范围内的上下限之一、均不包括、或包括二者，以所述范围内的任何明确排除的限为准。当所述范围包括一个或两个界限时，排除这些所包括的界限中的一个或两个的范围也包括在本公开中。

必须注意，除非上下文明确地另外指明，本说明书和所附权利要求中所用的单数形式“一种(a、an)”和“该(the)”包括复数指代物。因此，例如，提及“肉毒杆菌神经毒素A”包括多个这样的候选药剂，并且提及“肉毒杆菌神经毒素A”包括提及一种或多种梭菌神经毒素和本领域技术人员已知的其等同物，等等。

本文所讨论的出版物仅提供它们在本申请的申请日之前的公开内容。本文中的任何内容都不应被解释为承认这些出版物构成所附权利要求的现有技术。

附图说明

现在将参考以下附图和实施例，仅通过实施例的方式描述本发明的实施方案。

图1显示了五种最常见的涉及上臂关节的上肢痉挛临床模式。

图2显示FDA批准的用于治疗成人痉挛的的剂量。

图3显示了纯化的重组BoNT/AB嵌合体1、2和3A的SDS-PAGE(分别为SEQ ID NO:3、4和5)。泳道标记为“Maker”(分子量标记)、“-DTT”(氧化的BoNT/AB嵌合体样品)和“+DTT”(还原的BoNT/AB嵌合体样品)。

图4显示了通过重组BoNT/AB嵌合体1、2和3A(分别为转化为双链形式的SEQ IDNO:3、4和5)在大鼠脊髓神经元中切割SNAP-25。在37℃下，在具有10％ CO₂的湿润气氛中，将培养的大鼠原代脊髓神经元(SCN)暴露于各种浓度的重组BoNT/AB嵌合体1、2或3A，持续24小时。然后用补充有DTT和苯佐酶(Benzonase)的1×NuPAGE缓冲液裂解细胞。将样品转移到微量离心管中，在加热块上以90℃加热5分钟，并储存在-20℃下，然后通过蛋白质印迹分析SNAP-25切割。使用多克隆抗体(Sigma#S9684)检测SNAP-25，所述多克隆抗体检测SNAP-25的全长和切割形式。使用抗兔HRP(Sigma#A6154)作为二抗。

图5显示了小鼠趾外展评分试验。在短暂全身麻醉下，对小鼠一侧后肢的腓肠肌-比目鱼肌复合体肌肉进行注射；使用趾外展评分(DAS)以0-4的量表测量肌肉无力程度。确定每种剂量的DAS最大值并针对剂量的作图，将数据拟合至4参数逻辑方程(logisticequation)，确定导致DAS 4的ED₅₀和剂量(DAS 4剂量)值。

图6显示了纯化的重组BoNT/AB嵌合体3B和3C(分别为SEQ ID NO:6和7)的SDS-PAGE。泳道标记为“Maker”(分子量标记)、“-DTT”(氧化的BoNT/AB嵌合体样品)和“+DTT”(还原的BoNT/AB嵌合体样品)。

图7显示了未修饰的BoNT/A和BoNT/AB嵌合体3B和3C(分别为SEQ ID NO:2、6和7)在人诱导多能干细胞衍生的外周神经元(PERI.4U–Axiogenesis，德国)中对SNAP-25的切割。在37℃下，在含有5％ CO₂的湿润CO₂气氛中，将PERI.4U细胞暴露于各种浓度的重组BoNT/A或BoNT/AB嵌合体3B或3C，持续24小时。然后用补充有DTT和苯佐酶(Benzonase)的1×NuPAGE缓冲液裂解细胞。将样品转移到微量离心管中，在加热块上以90℃加热5分钟，并储存在-20℃下，然后通过蛋白质印迹分析SNAP-25切割。使用多克隆抗体(Sigma#S9684)检测SNAP-25，所述多克隆抗体检测SNAP-25的全长和切割形式。使用抗兔HRP(Sigma#A6154)作为二抗。

图8显示了在小鼠趾外展评分试验中随时间推移的肌无力的持续时间。在短暂全身麻醉下，对小鼠一侧后肢的腓肠肌-比目鱼肌复合体肌肉进行注射；使用趾外展评分(DAS)以0-4的量表测量肌肉无力程度。对注射最低剂量(在注射的前四天引起DAS为4)的组动物进行监测，直到肌肉无力完全恢复至DAS 0(未观察到肌肉无力)。

序列表

当在下列SEQ ID NO中的任一项中指示起始Met氨基酸残基或相应的起始密码子时，所述残基/密码子是任选的。

SEQ ID NO:1(未修饰的BoNT/A的核苷酸序列)

ATGCCATTCGTCAACAAGCAATTCAACTACAAAGACCCAGTCAACGGCGTCGACATCGCATACATCAAGATTCCGAACGC

CGGTCAAATGCAGCCGGTTAAGGCTTTTAAGATCCACAACAAGATTTGGGTTATCCCGGAGCGTGACACCTTCACGAACC

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TTTAACGGTCAGAATACGGAAATCAACAACATGAATTTCACGAAGTTGAAGAACTTCACGGGTCTGTTCGAGTTCTATAA

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ATCACCAGCGATACGAATATTGAAGCAGCGGAAGAGAATATCAGCCTGGATCTGATCCAGCAGTACTATCTGACCTTTAA

CTTCGACAATGAACCGGAGAACATTAGCATTGAGAATCTGAGCAGCGACATTATCGGTCAGCTGGAACTGATGCCGAATA

TCGAACGTTTCCCGAACGGCAAAAAGTACGAGCTGGACAAGTACACTATGTTCCATTACCTGCGTGCACAGGAGTTTGAA

CACGGTAAAAGCCGTATCGCGCTGACCAACAGCGTTAACGAGGCCCTGCTGAACCCGAGCCGTGTCTATACCTTCTTCAG

CAGCGACTATGTTAAGAAAGTGAACAAAGCCACTGAGGCCGCGATGTTCCTGGGCTGGGTGGAACAGCTGGTATATGACT

TCACGGACGAGACGAGCGAAGTGAGCACTACCGACAAAATTGCTGATATTACCATCATTATCCCGTATATTGGTCCGGCA

CTGAACATTGGCAACATGCTGTACAAAGACGATTTTGTGGGTGCCCTGATCTTCTCCGGTGCCGTGATTCTGCTGGAGTT

CATTCCGGAGATTGCGATCCCGGTGTTGGGTACCTTCGCGCTGGTGTCCTACATCGCGAATAAGGTTCTGACGGTTCAGA

CCATCGATAACGCGCTGTCGAAACGTAATGAAAAATGGGACGAGGTTTACAAATACATTGTTACGAATTGGCTGGCGAAA

GTCAATACCCAGATCGACCTGATCCGTAAGAAAATGAAAGAGGCGCTGGAGAATCAGGCGGAGGCCACCAAAGCAATTAT

CAACTACCAATACAACCAGTACACGGAAGAAGAGAAGAATAACATTAACTTCAATATCGATGATTTGAGCAGCAAGCTGA

ATGAATCTATCAACAAAGCGATGATCAATATCAACAAGTTTTTGAATCAGTGTAGCGTTTCGTACCTGATGAATAGCATG

ATTCCGTATGGCGTCAAACGTCTGGAGGACTTCGACGCCAGCCTGAAAGATGCGTTGCTGAAATACATTTACGACAATCG

TGGTACGCTGATTGGCCAAGTTGACCGCTTGAAAGACAAAGTTAACAATACCCTGAGCACCGACATCCCATTTCAACTGA

GCAAGTATGTTGATAATCAACGTCTGTTGAGCACTTTCACCGAGTATATCAAAAACATCATCAATACTAGCATTCTGAAC

CTGCGTTACGAGAGCAATCATCTGATTGATCTGAGCCGTTATGCAAGCAAGATCAACATCGGTAGCAAGGTCAATTTTGA

CCCGATCGATAAGAACCAGATCCAGCTGTTTAATCTGGAATCGAGCAAAATTGAGGTTATCCTGAAAAACGCCATTGTCT

ACAACTCCATGTACGAGAATTTCTCCACCAGCTTCTGGATTCGCATCCCGAAATACTTCAACAGCATTAGCCTGAACAAC

GAGTATACTATCATCAACTGTATGGAGAACAACAGCGGTTGGAAGGTGTCTCTGAACTATGGTGAGATCATTTGGACCTT

GCAGGACACCCAAGAGATCAAGCAGCGCGTCGTGTTCAAGTACTCTCAAATGATCAACATTTCCGATTACATTAATCGTT

GGATCTTCGTGACCATTACGAATAACCGTCTGAATAACAGCAAGATTTACATCAATGGTCGCTTGATCGATCAGAAACCG

ATTAGCAACCTGGGTAATATCCACGCAAGCAACAACATTATGTTCAAATTGGACGGTTGCCGCGATACCCATCGTTATAT

CTGGATCAAGTATTTCAACCTGTTTGATAAAGAACTGAATGAGAAGGAGATCAAAGATTTGTATGACAACCAATCTAACA

GCGGCATTTTGAAGGACTTCTGGGGCGATTATCTGCAATACGATAAGCCGTACTATATGCTGAACCTGTATGATCCGAAC

AAATATGTGGATGTCAATAATGTGGGTATTCGTGGTTACATGTATTTGAAGGGTCCGCGTGGCAGCGTTATGACGACCAA

CATTTACCTGAACTCTAGCCTGTACCGTGGTACGAAATTCATCATTAAGAAATATGCCAGCGGCAACAAAGATAACATTG

TGCGTAATAACGATCGTGTCTACATCAACGTGGTCGTGAAGAATAAAGAGTACCGTCTGGCGACCAACGCTTCGCAGGCG

GGTGTTGAGAAAATTCTGAGCGCGTTGGAGATCCCTGATGTCGGTAATCTGAGCCAAGTCGTGGTTATGAAGAGCAAGAA

CGACCAGGGTATCACTAACAAGTGCAAGATGAACCTGCAAGACAACAATGGTAACGACATCGGCTTTATTGGTTTCCACC

AGTTCAACAATATTGCTAAACTGGTAGCGAGCAATTGGTACAATCGTCAGATTGAGCGCAGCAGCCGTACTTTGGGCTGT

AGCTGGGAGTTTATCCCGGTCGATGATGGTTGGGGCGAACGTCCGCTG

SEQ ID NO:2(未修饰的BoNT/A的多肽序列)

MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLST

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SEQ ID NO: 3(修饰的BoNT/A“嵌合体1”的多肽序列)

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PPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGG

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SEQ ID NO: 4(修饰的BoNT/A“嵌合体2”的多肽序列)

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SEQ ID NO:5(修饰的BoNT/A“嵌合体3A”的多肽序列)

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PPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGG

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SEQ ID NO:6(修饰的BoNT/A“嵌合体3B”的多肽序列)

IPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNILNNIILN

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KRKPYNLKLGCNWQFIPKDEGWTE

SEQ ID NO:7(修饰的BoNT/A“嵌合体3C”的多肽序列)

MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLN

PPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGG

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SEQ ID NO:8(BoNT/B的多肽序列)

MPVTINNFNYNDPIDNNNIIMMEPPFARGTGRYYKAFKITDRIWIIPERYTFGYKPEDFN

KSSGIFNRDVCEYYDPDYLNTNDKKNIFLQTMIKLFNRIKSKPLGEKLLEMIINGIPYLG

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KWYLKEVKRKPYNLKLGCNWQFIPKDEGWTE

SEQIDNO:9-C末端L链片段

TKSLDKGYNK

SEQ ID NO:10-C末端L链片段2

SLDKGYNK

SEQ ID NO:11-双链L链1

PFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTD

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SEQ ID NO:12-双链L链2

NGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTK

SEQ ID NO:13-双链H链

ALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQL

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GLIGIHRFYESGIVFEEYKDYFCISKWYLKEVKRKPYNLKLGCNWQFIPKDEGWTE

实施例

实施例1

BoNT/AB嵌合体的克隆、表达和纯化

使用标准分子生物学技术从编码亲本血清型分子的DNA和适当的寡核苷酸构建BoNT/AB嵌合构建体1、2、3A、3B和3C(分别为SEQ ID NO:3至7)的核苷酸序列。然后将它们克隆到带有或不带有C末端His₁₀-标签的pJ401表达载体中，并转化到BLR(DE3)大肠杆菌细胞中，用于过表达。这些细胞在37℃和225RPM振荡下在2L带挡板锥形瓶中生长，其中含有1L修饰的Terrific Broth(mTB)，并补充了适当的抗生素。一旦A₆₀₀达到＞0.5，将培养箱温度降至16℃，然后在一小时后，用1mM IPTG在225RPM振荡下诱导20小时，以表达重组的BoNT/AB构建体。

收获的细胞通过超声破碎裂解，并通过在4℃下以4500RPM离心1小时来澄清，然后在硫酸铵中提取重组BoNT/AB嵌合分子，并通过标准快速蛋白液相色谱(FPLC)技术进行纯化。这包括使用疏水相互作用树脂进行捕获，并使用阴离子交换树脂用于中间纯化步骤。然后用内切蛋白酶Lys-C对部分纯化的分子进行蛋白水解切割，产生活性双链。用第二疏水相互作用树脂进一步纯化以获得最终的BoNT/AB嵌合体。

对于带有十组氨酸标签(H₁₀)的BoNT/AB嵌合分子(嵌合体1、2、3A)，捕获步骤采用固定化镍树脂代替疏水相互作用树脂。

每种嵌合体的序列如表1所示。

表1–嵌合BoNT/AB构建体

实施例2

BoNT/AB嵌合体1、2和3A的比较

如实施例1所述纯化具有C末端His₁₀标签和E1191M/S1199Y双突变的BoNT/AB嵌合体1、2和3A(图3)，并测试功能活性。

大鼠脊髓神经元SNAP-25切割试验

制备大鼠脊髓神经元(SCN)的原代培养物，并在96孔组织培养板中培养3周(如在以下文献中所述：Masuyer等人，2011,J.Struct.Biol.Structure and activity of afunctional derivative of Clostridium botulinum neurotoxin B；以及在以下文献中所述：Chaddock等人，2002,Protein Expr.Purif.Expression and purification ofcatalytically active,non-toxic endopeptidase derivatives of Clostridiumbotulinum toxin type A)。在SCN补料培养基中制备BoNT/AB的系列稀释液。收集来自待处理孔的生长培养基并过滤(0.2μm过滤器)。将125μL过滤的培养基加回到每个测试孔中。然后将125μL稀释的毒素加到板中(一式三份)。将处理的细胞在37℃，10％ CO₂中孵育24±1小时)。

使用SNAP-25切割试验分析BoNT活性

处理后，去除BoNT并将细胞用PBS(Gibco，英国)中洗涤一次。将细胞在补充有0.1M二硫苏糖醇(DTT)和250单位/mL苯佐酶(Benzonase)(Sigma)的1×NuPAGE裂解缓冲液(LifeTechnologies)中裂解。通过SDS-PAGE分离裂解物蛋白，并转移到硝酸纤维素膜上。用SNAP-25特异性一抗(Sigma#S9684)探针检测膜，该抗体识别未切割的SNAP-25以及被BoNT/A内肽酶切割的SNAP-25。所用的二抗是HRP偶联的抗兔IgG(Sigma#A6154)。通过增强的化学发光检测条带，并使用pXi6 Access(Synoptics，英国)成像。使用GeneTools软件(Syngene，剑桥，英国)测定条带强度，并计算在各BoNT浓度下SNAP-25切割的百分比。将数据拟合至4参数逻辑方程，并使用GraphPad Prism第6版(GraphPad)计算pEC₅₀。

下表2提供了在大鼠SCN SNAP-25切割试验中测定的嵌合体1、2和3A的pEC₅₀值。这些结果表明，三种BoNT/AB嵌合体保留了进入大鼠脊髓神经元并切割其靶底物的能力。然而，在该试验中，嵌合体3A比嵌合体1和2更有效(也参见图4)。

	pEC₅₀±SEM
		嵌合体1	12.42±0.04
嵌合体2	12.57±0.01
		嵌合体3A	12.89±0.04

表2.pEC₅₀值。

趾外展评分(DAS)试验

在DAS试验中测量BoNT/AB嵌合体1、2和3A的活性的方法是基于小鼠经尾巴短暂悬挂时的惊跳反应趾伸展反射。这种反射被评为趾外展评分(DAS)，在将BoNT注射到后爪的腓肠肌-比目鱼肌中后，这种反射受到抑制。将小鼠的尾巴短暂地悬挂以引起特征性的惊跳反应，动物会伸展后肢并外展后趾。(Aoki等人,1999,Eur.J.Neurol.；6(增刊4)S3-S10)。

注射当天，小鼠在诱导室中接受含3％异氟烷的氧气麻醉。每只小鼠在右后爪腓肠肌-比目鱼肌接受BoNT/AB嵌合体或溶媒(含0.2％明胶的磷酸盐缓冲液)的肌内注射。

注射神经毒素后，对不同程度的趾外展进行评分，量表为0至4，其中0＝正常，4＝趾外展和腿部伸展最大程度减少。通过非线性调整分析，使用每种剂量的最大效应的平均值确定ED₅₀。所用的数学模型是4参数逻辑模型。

在给药后第一天每2小时进行一次DAS；此后每天进行3次，持续4天。

图5显示了嵌合体1、2和3A(分别为转化为双链形式的SEQ ID NO:3、4和5)的拟合曲线。嵌合体3A曲线向左移动，这意味着与嵌合体1和2相比，较低剂量的嵌合体3A实现了类似的DAS反应，因此表明在小鼠DAS试验中，嵌合体3A比其他嵌合体更有效；另见下表(表3)，其提供了每个嵌合体的计算ED₅₀值和导致DAS 4(最高分数)的剂量。

下表3提供了未修饰的重组BoNT/A1(rBoNT/A1–转化为双链形式的SEQ ID NO:2)和嵌合体1、2和3A在小鼠DAS试验中测定的ED₅₀和DAS 4剂量。这些结果表明，在三种嵌合体中，嵌合体3A在诱导肌肉无力方面具有最高的体内效力。图5和表3中所示的研究是在从Charles River实验室获得的小鼠中进行的。

表3.ED₅₀值。

实施例3

BoNT/AB嵌合体3B、3C与未修饰的BoNT/A1的比较

如实施例1所述纯化未标记的BoNT/AB嵌合体3B和3C(分别存在和不存在E1191M/S1199Y双突变)(SEQ ID NO:6和7)(图6)，并且使用未修饰的BoNT/A(转化为双链形式的SEQID NO:2)作为参考测试功能活性。

人多能干细胞SNAP-25切割试验

冷冻保存的PERI.4U细胞购自Axiogenesis(德国科隆)。按照制造商的推荐进行细胞的解冻和铺板。简言之，将含有细胞的冷冻管在37℃水浴中解冻2分钟。轻轻重悬后，将细胞转移至50mL管中。用制造商提供的1mL解冻培养基清洗冷冻管，然后将培养基逐滴转移到50mL管中的细胞悬浮液中，然后再将2mL解冻培养基逐滴添加到50mL管中。然后使用血细胞计数器计数细胞。此后，将另外6mL解冻培养基添加到细胞悬浮液中。在室温下以260×g(例如1,100RPM)离心6分钟，获得细胞沉淀。然后将细胞重悬于制造商提供的完全培养基中。将细胞以50,000至150,000细胞/cm²的密度接种在涂有聚L-鸟氨酸和层粘连蛋白的细胞培养板上。细胞在37℃、湿润的CO₂气氛下培养，培养期间每2-3天彻底更换培养基。

对于毒素处理，在培养基中制备BoNT的连续稀释液。收集待处理孔中的培养基并过滤(0.2μm过滤器)。将125μL过滤的培养基加回到每个测试孔中。然后将125μL稀释的毒素加到板中(一式三份)。处理的细胞在37℃，10％ CO₂中培养48±1小时)。

使用SNAP-25切割试验分析BoNT活性

处理后，去除BoNT并将细胞用PBS(Gibco，英国)洗涤一次。将细胞在补充有0.1M二硫苏糖醇(DTT)和250单位/mL苯佐酶(Benzonase)(Sigma)的1×NuPAGE裂解缓冲液(LifeTechnologies)中裂解。通过SDS-PAGE分离裂解物蛋白，并转移到硝酸纤维素膜上。用SNAP-25特异性一抗(Sigma#S9684)探针检测膜，该抗体识别未切割的SNAP-25以及被BoNT/A内肽酶切割的SNAP-25。所用的二抗是HRP偶联的抗兔IgG(Sigma#A6154)。通过增强的化学发光检测条带，并使用pXi6 Access(Synoptics，英国)成像。使用GeneTools软件(Syngene，Cambridge，英国)测定条带强度，并计算在各BoNT浓度下SNAP-25切割的百分比。将数据拟合至4参数逻辑方程，并使用GraphPad Prism第6版(GraphPad)计算pEC₅₀。

图7显示，嵌合体3B和3C在诱导性人多能干细胞中切割SNAP-25时表现出比rBoNT/A1更强的效力，但前者明显更强。这可以通过双突变来解释，这种突变增加了嵌合体3B对这些细胞中存在的人类突触结合蛋白II蛋白受体的亲和力(图7、表4)。

	pEC₅₀±SEM
		rBoNT/A1	10.21±0.05
嵌合体3B	12.38±0.06
		嵌合体3C	10.72±0.08

表4.pEC₅₀值。

趾外展评分(DAS)试验–安全比

在DAS试验中测量BoNT活性的方法是基于小鼠经尾巴短暂悬挂时的惊跳反应趾伸展反射。这种反射被评为趾外展评分(DAS)，并在将BoNT施用到后爪的腓肠肌-比目鱼肌中后，这种反射受到抑制。将小鼠的尾巴短暂地悬挂以引起特征性的惊跳反应，动物会伸展后肢并外展后趾。(Aoki等人,1999,Eur.J.Neurol.；6(增刊4)S3-S10)。

注射当天，小鼠在诱导室中接受含3％异氟烷的氧气麻醉。每只小鼠在右后爪腓肠肌-比目鱼肌中接受BoNT或溶媒(含0.2％明胶的磷酸盐缓冲液)的肌内注射。

给药后第一天每2小时进行一次DAS；此后所有剂量的DAS每天进行3次，持续4天。注射溶媒和注射前四天诱导DAS为4的最低剂量组的动物随后进行监测，直到肌肉无力完全恢复至DAS为0(未观察到肌肉无力)。

为了计算安全比，所有动物在注射毒素前一天(D0)称重，此后在整个研究期间每天称重一次。每天计算每个剂量组的平均体重、其标准偏差和标准误差平均值。为了获得BoNT的安全比(-10％ΔBW/ED₅₀)，将研究期间任何时间剂量组的平均体重低于同一剂量组D0时平均体重的10％的剂量除以所研究的BoNT的ED₅₀。致死剂量定义为该剂量组中一只或多只动物死亡的剂量。

图8显示了未修饰的BoNT/A、嵌合体3B和嵌合体3C(转化为双链形式的SEQ ID NO:2、6和7)在小鼠趾外展评分试验中肌肉无力持续时间随时间的变化，表明嵌合体的作用持续时间更长。

下表5提供了在小鼠DAS试验中测定的rBoNT/A1和嵌合体3B和3C的ED₅₀和DAS 4剂量。该表还提供了直至肌无力完全恢复至DAS 0(未观察到肌无力)的DAS 4剂量的总作用持续时间。此外，该表还显示了小鼠致死剂量和安全比(-10％ΔBW/ED₅₀)，如上文所定义。与rBoNT/A1相比，嵌合体3B和3C的作用持续时间更长、安全比更好、致死剂量更高。图8和表5中所示的研究是在从Janvier实验室获得的小鼠中进行的。

表5.BoNT/AB嵌合体的DAS和安全比。

实施例4

BoNT/AB嵌合体(转化为双链形式的SEQ ID NO:6)的进一步表征

转化成双链形式的BoNT/AB嵌合体SEQ ID NO:6在小鼠LD₅₀试验中测试，得到1.202ng/kg的结果。因此，在该试验中，1单位的SEQ ID NO:6对应于24.04pg。

另外，在大鼠DAS试验中测试所述BoNT/AB嵌合体以确定与相比的作用持续时间。结果列于下表6中：

表6.作用持续时间。

总之，BoNT/AB的作用持续时间比高得多。

实施例5

用于治疗肢体痉挛的修饰的BoNT/A(转化为双链形式的SEQ ID NO:6)的单位剂量计算

考虑到临床前药理学数据，已经计算出了用于在人体内施用修饰的BoNT/A的合适的单位剂量范围(UD)。

对于SEQ ID NO:6，计算的DAS ED₅₀是13pg/kg。ED₅₀被认为是最小的药理学活性剂量，其比在相同动物物种中4ng/kg的未观察到的副作用水平(NOAEL)低约300倍。在大鼠中13pg/kg的SEQ ID NO:6的ED₅₀对应于对于60kg体重的人的0.8ng剂量。

因此，选择单位剂量的下限为1000pg。选择单位剂量的上限为16,000pg，其低于换算成60kg体重的人剂量的来自两种非临床安全物种(大鼠和猴)的4ng/kg的NOAEL。

考虑到改善的安全性，将治疗肢体痉挛的最大总剂量设定为240,000pg，其源自转化为60kg体重的人剂量的两种非临床安全物种(大鼠和猴)的4ng/kg的NOAEL。

有利的是，在达到最大剂量之前，修饰的BoNT/A(SEQ ID NO:6)可以在治疗肢体痉挛时注射到更多的肌肉中。这是一项重大且有利的发现，可改进肢体痉挛的治疗，同时为临床医生提供更广泛的治疗选择。第一次，它还提供了能够治疗额外的大肌肉的选择，例如肩部的肌肉，同时还在最大剂量内治疗肘部、前臂和/或手腕。

实施例6

使用修饰的BoNT/A(转化为双链形式的SEQ ID NO:6)治疗成人上肢痉挛的给药方案

修饰的BoNT/A以冻干粉形式装在小瓶中，每瓶含36ng修饰的BoNT/A。冻干粉末经过重构。单位剂量(UD)为1000-16,000pg(42-666单位[通过小鼠LD₅₀测量])。

根据以下给药方案通过肌内注射治疗成人上肢痉挛(表7)：

表7.给药方案。

施用的最大总剂量为15×UD。这对应于240,000pg/9,990单位。因此，临床医生能够根据患者的情况定制治疗方案，因为知道可以施用15×UD而不用担心毒性，从而可以治疗患者的其他肌肉(包括肩部)，和/或确保每块肌肉都接受药物有效剂量。

实施例7

使用修饰的BoNT/A(转化为双链形式的SEQ ID NO:6)治疗成人下肢痉挛的给药方案

修饰的BoNT/A以冻干粉形式装在小瓶中，每瓶含36ng修饰的BoNT/A。冻干粉末经过重构。

单位剂量(UD)为1000-16,000pg(42-666单位)。

根据以下给药方案通过肌内注射治疗成人下肢痉挛(表8)：

注射的肌肉	剂量
		腓肠肌(内侧头)	1×UD
腓肠肌(外侧头)	1×UD
		比目鱼肌	3×UD
胫骨后肌	2×UD
		趾长屈肌	1×UD
拇长屈肌	1×或2×UD

表8.给药方案。

施用的最大总剂量为15×UD。这对应于240,000pg/9,990单位。因此，临床医生能够根据患者的情况定制治疗方案，因为知道可以施用15x UD而不用担心毒性，从而可以治疗患者的其他肌肉和/或确保每块肌肉都接受药物有效剂量。

实施例8

修饰的BoNT/A(转化为双链形式的SEQ ID NO:6)在人体中的安全性和有效性

对患有中风或创伤性脑损伤(TBI)后痉挛性偏瘫的18至70岁个体进行了一项综合I/II期多中心、双盲、随机、Dysport和安慰剂对照、剂量递增和剂量探索研究，以评估修饰的BoNT/A(转化为双链形式的SEQ ID NO:6)在治疗成人上肢痉挛方面的安全性和有效性。

这项研究包括对具有握拳模式的成年上肢痉挛的独特患者队列进行人体连续剂量递增。所有参与者均注射在指深屈肌(FDP)和指浅屈肌(FDS)中。对每块肌肉注射单个单位剂量的修饰的BoNT/A、Dysport或安慰剂。对5个队列施用了不同(逐渐增加)量的修饰的BoNT/A(转化为双链形式的SEQ ID NO:6)。对队列1施用2×1,000pg单位剂量的修饰的BoNT/A(即2,000pg最大值)，而对队列5施用2×16,000pg单位剂量的修饰的BoNT/A(即32,000pg最大值)。

结果显示，尽管每块肌肉的剂量极高，但所测试的所有修饰的BoNT/A单位剂量(即最多16,000pg单位剂量)对肌肉麻痹均有效，可安全耐受，并且未观察到副作用。这表明修饰的BoNT/AB不会从注射部位扩散，并突出了修饰的BoNT/AB(转化为双链形式的SEQ IDNO:6)卓越的安全性。基于这些发现，可以确信的是，每块肌肉可以施用更高的单位剂量而不会产生副作用。此外，由于缺乏毒素的全身扩散，可以确信的是，可以施用最多15倍的更高单位剂量而不会产生安全性问题。

因此，已经选择30,000pg和36,000pg的单位剂量(各自施用最多15×)用于成人肢体痉挛的治疗性治疗。因此，在治疗期间施用的总剂量将分别为450,000pg和540,000pg。

实施例9

修饰的BoNT/A以冻干粉形式装在小瓶中，每个小瓶含有36ng修饰的BoNT/A。冻干粉末经过重构。

单位剂量(UD)为30,000pg(1,248单位[通过小鼠LD₅₀测量])或36,000pg(1,498单位[通过小鼠LD₅₀测量])。

根据以下给药方案通过肌内注射治疗成人上肢痉挛(表9)：

表9.给药方案。

施用的最大总剂量为15×UD。这对应于450,000pg/18,719单位或540,000pg/22,463单位。因此，临床医生能够根据患者的情况定制治疗方案，因为知道可以施用15×UD而不用担心毒性，从而可以治疗患者的其他肌肉(包括肩部)和/或确保每块肌肉都接受药物有效剂量。

实施例10

根据以下给药方案通过肌内注射治疗成人下肢痉挛(表10)：

表10.给药方案。

施用的最大总剂量为15×UD。这对应于450,000pg/18,719单位或540,000pg/22,463单位。因此，临床医生能够根据患者的情况定制治疗方案，因为知道可以施用15x UD而不用担心毒性，从而可以治疗患者的其他肌肉和/或确保每块肌肉都接受药物有效剂量。

实施例11

患有成人上肢痉挛的患者的治疗

Bill，53岁，被他的GP诊断患有成人上肢痉挛。修饰的BoNT/A(转化成双链形式SEQID NO:6)通过一个或多个单位剂量(1×单位剂量＝36,000pg)的方式施用至如下所示的下列肌肉：

施用的总剂量为540,000pg修饰的BoNT/A(转化为双链形式的SEQ ID NO:6)。

成人上肢痉挛得到缓解，并且由于修饰的BoNT/A的持续时间长，Bill超过9个月不需要进一步治疗。因此，与施用未修饰的BoNT/A的同等个体相比，Bill接受的注射频率较低(例如每年)。另外，由于修饰的BoNT/A的安全性得到改善，Bill没有表现出任何副作用。

实施例12

对患有中风或创伤性脑损伤(TBI)后痉挛性偏瘫的18至70岁个体进行了一项综合I/II期多中心、双盲、随机、Dysport和安慰剂对照、剂量递增和剂量探索研究，以评估修饰的BoNT/A(SEQ ID NO:6[转化为双链形式]治疗上肢痉挛方面的安全性和有效性。

这项研究包括对具有握拳模式的成年上肢痉挛的独特患者队列进行人体连续剂量递增。所有参与者均注射在指深屈肌(FDP)和指浅屈肌(FDS)中。对每块肌肉注射单个单位剂量的修饰的BoNT/A、Dysport或安慰剂。如下方式向个体施用修饰的BoNT/A(转化为双链形式的SEQ ID NO:6)：向FDP施用15,000pg单位剂量并且向FDS施用15,000pg单位剂量(即总剂量30,000pg)，向FDP施用25,000pg单位剂量并且向FDS施用25,000pg单位剂量(即总剂量50,000pg)，或者向FDP施用36,000pg单位剂量并且向FDS施用36,000pg单位剂量(即总剂量72,000pg)。

结果显示，尽管每块肌肉的剂量极高，但所测试的所有修饰的BoNT/A单位剂量对肌肉麻痹均有效，可安全耐受，并且未观察到副作用(例如25,000pg和36,000pg单位剂量)。这表明修饰的BoNT/AB不会从注射部位扩散，并突出了修饰的BoNT/AB(转化为双链形式的SEQ ID NO:6)卓越的安全性。

由于缺乏毒素的全身扩散，可以确信的是，可以施用最多15倍的更高单位剂量而不会产生安全性问题。因此，已经选择25,000pg和36,000pg的单位剂量(各自施用最多15×)用于成人肢体痉挛的治疗性治疗。因此，在治疗期间施用的总剂量将分别为375,000pg和540,000pg。

实施例13

患有成人下肢痉挛的患者的治疗

Ryan，63岁，被他的GP诊断患有成人下肢痉挛。修饰的BoNT/A(SEQ ID NO:6[转化成双链形式])通过一个或多个单位剂量(1×单位剂量＝25,000pg)的方式施用至如下所示的多块下列肌肉：

最大剂量是15×UD(即375,000pg)的修饰BoNT/A。

痉挛得到缓解，并且由于修饰的BoNT/A的持续时间长，Ryan超过8个月不需要进一步治疗。因此，与施用未修饰的BoNT/A的同等个体相比，Ryan接受的注射频率较低(例如每年)。另外，由于修饰的BoNT/A的安全性得到改善，Ryan没有表现出任何副作用。

实施例14

治疗患有小儿下肢痉挛的患者

Sharon，7岁，被她的GP诊断患有小儿下肢痉挛。修饰的BoNT/A(SEQ ID NO:6[转化成双链形式])通过一个或多个单位剂量(1×单位剂量＝12,500pg)的方式施用至如下所示的多块下列肌肉：

最大剂量是15×UD(即187,500pg)的修饰BoNT/A。

痉挛得到缓解，并且由于修饰的BoNT/A的持续时间长，Sharon超过8个月不需要进一步治疗。因此，与施用未修饰的BoNT/A的同等个体相比，Sharon接受的注射频率较低(例如每年)。另外，由于修饰的BoNT/A的安全性得到改善，Sharon没有表现出任何副作用。

实施例15

治疗患有小儿下肢痉挛的患者

Timmy，8岁，被他的GP诊断患有小儿下肢痉挛。修饰的BoNT/A(SEQ ID NO:6[转化成双链形式])通过一个或多个单位剂量(1×单位剂量＝18,000pg)的方式施用至如下所示的多块下列肌肉：

最大剂量是15×UD(即270,000pg)的修饰BoNT/A。

痉挛得到缓解，并且由于修饰的BoNT/A的持续时间长，Timmy超过9个月不需要进一步治疗。因此，与施用未修饰的BoNT/A的同等个体相比，Timmy接受的注射频率较低(例如每年)。另外，由于修饰的BoNT/A的安全性得到改善，Timmy没有表现出任何副作用。

实施例16

患有成人上肢痉挛的患者的治疗

Larry，21岁，被他的GP诊断患有上肢痉挛。修饰的BoNT/A(SEQ ID NO:6[转化成双链形式])通过一个或多个单位剂量(1×单位剂量＝25,000pg)的方式施用至如下所示的多块下列肌肉：

最大剂量是15×UD(即375,000pg)的修饰BoNT/A。

痉挛得到缓解，并且由于修饰的BoNT/A的持续时间长，Larry超过9个月不需要进一步治疗。因此，与施用未修饰的BoNT/A的同等个体相比，Larry接受的注射频率较低(例如每年)。另外，由于修饰的BoNT/A的安全性得到改善，Larry没有表现出任何副作用。

实施例17

患有成人上肢痉挛的患者的治疗

Loretta，39岁，被她的GP诊断患有上肢痉挛。修饰的BoNT/A(SEQ ID NO:6[转化成双链形式])通过一个或多个单位剂量(1×单位剂量＝36,000pg)的方式施用至如下所示的多块下列肌肉：

最大剂量是15×UD(即540,000pg)的修饰BoNT/A。

痉挛得到缓解，并且由于修饰的BoNT/A的持续时间长，Loretta超过9个月不需要进一步治疗。因此，与施用未修饰的BoNT/A的同等个体相比，Loretta接受的注射频率较低(例如每年)。另外，由于修饰的BoNT/A的安全性得到改善，Loretta没有表现出任何副作用。

实施例18

患有小儿上肢痉挛的患者的治疗

Jack，13岁，被他的GP诊断患有上肢痉挛。修饰的BoNT/A(SEQ ID NO:6[转化成双链形式])通过一个或多个单位剂量(1×单位剂量＝12,500pg)的方式施用至如下所示的多块下列肌肉：

最大剂量是15×UD(即187,500pg)的修饰BoNT/A。

痉挛得到缓解，并且由于修饰的BoNT/A的持续时间长，Jack超过9个月不需要进一步治疗。因此，与施用未修饰的BoNT/A的同等个体相比，Jack接受的注射频率较低(例如每年)。另外，由于修饰的BoNT/A的安全性得到改善，Jack没有表现出任何副作用。

实施例19

患有小儿上肢痉挛的患者的治疗

Julia，11岁，被她的GP诊断患有上肢痉挛。修饰的BoNT/A(SEQ ID NO:6[转化成双链形式])通过一个或多个单位剂量(1×单位剂量＝18,000pg)的方式施用至如下所示的多块下列肌肉：

最大剂量是15×UD(即270,000pg)的修饰BoNT/A。

痉挛得到缓解，并且由于修饰的BoNT/A的持续时间长，Julia超过9个月不需要进一步治疗。因此，与施用未修饰的BoNT/A的同等个体相比，Julia接受的注射频率较低(例如每年)。另外，由于修饰的BoNT/A的安全性得到改善，Julia没有表现出任何副作用。

实施例20

患有成人下肢痉挛的患者的治疗

Clare，57岁，被她的GP诊断患有成人下肢痉挛。修饰的BoNT/A(SEQ ID NO:6[转化成双链形式])通过一个或多个单位剂量(1×单位剂量＝36,000pg)的方式施用至如下所示的多块下列肌肉：

最大剂量是15×UD(即540,000pg)的修饰BoNT/A。

痉挛得到缓解，并且由于修饰的BoNT/A的持续时间长，Clare超过8个月不需要进一步治疗。因此，与施用未修饰的BoNT/A的同等个体相比，Clare接受的注射频率较低(例如每年)。另外，由于修饰的BoNT/A的安全性得到改善，Clare没有表现出任何副作用。

条款

1.一种修饰的BoNT/A，其用于治疗肢体痉挛(成人肢体痉挛)，其中所述修饰的BoNT/A通过肌内注射施用于个体的多块受影响的肌肉，

其中所述多块受影响的肌肉选自：

第一组，包括：指浅屈肌、指深屈肌、桡侧腕屈肌、尺侧腕屈肌、肱桡肌、旋前圆肌、肱二头肌、腓肠肌内侧头、腓肠肌外侧头、趾长屈肌、拇长屈肌(flexor hallucis longus)、腓肠肌、三角肌、肩胛提肌、旋前方肌、拇长屈肌(flexor policis longus)、拇收肌、拇短屈肌(flexor policis brevis)、掌长肌、蚓状肌、拇对掌肌、大收肌、长收肌、短收肌、股薄肌、内侧腘绳肌、外侧腘绳肌、阔筋膜张肌、股直肌、股外侧肌、股内侧肌、股中间肌、臀大肌、胫骨前肌、趾短屈肌、拇长伸肌、拇短屈肌(flexor hallucis brevis)；以及

第二组，包括：肱三头肌(长头)、肩胛下肌、胸肌(例如，胸大肌)、背阔肌、肱二头肌、肱肌、比目鱼肌、胫骨后肌、肱桡肌、大圆肌、髂腰肌和腓肠肌，以及其中在受影响的第一组肌肉处施用单个单位剂量和/或在受影响的第二组肌肉处施用多个单位剂量，并且其中在治疗期间施用的总剂量最多600,000pg，并且其中所述修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域，以及BoNT/B受体结合结构域(H_C结构域)。

2.根据条款1所述使用的修饰的BoNT/A，其中所述肢体痉挛为上肢痉挛。

3.根据条款1或条款2所述使用的修饰的BoNT/A，其中单位剂量为大于17,000pg至最多40,000pg(例如17,001pg至最多40,000pg)的修饰的BoNT/A。

4.根据条款1-3中任一项所述使用的修饰的BoNT/A，其中单位剂量为大于23,000pg至最多38,000pg(例如23,001pg至最多38,000pg)的修饰的BoNT/A。

5.根据条款1-4中任一项所述使用的修饰的BoNT/A，其中单位剂量为大于34,000pg至最多38,000pg(例如34,001pg至最多38,000pg)的修饰的BoNT/A。

6.根据条款1-5中任一项所述使用的修饰的BoNT/A，其中施用的总剂量为250,000pg至600,000pg的修饰的BoNT/A(例如255,000pg至600,000pg)。

7.根据条款1-6中任一项所述使用的修饰的BoNT/A，其中施用的总剂量为大于255,000pg至600,000pg的修饰的BoNT/A。

8.根据条款1-7中任一项所述使用的修饰的BoNT/A，其中施用的总剂量为350,000至600,000pg的修饰的BoNT/A。

9.根据条款1-8中任一项所述使用的修饰的BoNT/A，其中施用的总剂量为500,000至600,000pg的修饰的BoNT/A。

10.一种修饰的BoNT/A，其用于治疗小儿肢体痉挛，其中所述修饰的BoNT/A通过肌内注射施用于个体的多块受影响的肌肉，

其中所述修饰的BoNT/A以大于8,500pg修饰的BoNT/A的单位剂量施用于多块受影响的肌肉，

其中所述多块受影响的肌肉选自：

第二组，包括：肱三头肌(长头)、肩胛下肌、胸肌(例如，胸大肌)、背阔肌、肱二头肌、肱肌、比目鱼肌、胫骨后肌、肱桡肌、大圆肌、髂腰肌和腓肠肌，以及其中在受影响的第一组肌肉处施用单个单位剂量和/或在受影响的第二组肌肉处施用多个单位剂量，并且其中在治疗期间施用的总剂量最多300,000pg，并且其中所述修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域，以及BoNT/B受体结合结构域(H_C结构域)。

11.根据条款10所述使用的修饰的BoNT/A，其中所述小儿肢体痉挛为小儿上肢痉挛。

12.根据条款10或条款11所述使用的修饰的BoNT/A，其中单位剂量为大于8,500pg至最多20,000pg(例如8,501pg至最多20,000pg)的修饰的BoNT/A，优选其中单位剂量为大于8,500pg至最多18,000pg。

13.根据条款10-12中任一项所述使用的修饰的BoNT/A，其中单位剂量为大于11,500pg至最多19,000pg(例如11,501pg至最多19,000pg)的修饰的BoNT/A。

14.根据条款10-13中任一项所述使用的修饰的BoNT/A，其中单位剂量为大于17,000pg至最多19,000pg(例如17,001pg至最多19,000pg)的修饰的BoNT/A。

15.根据条款10-14中任一项所述使用的修饰的BoNT/A，其中施用的总剂量为大于125,000pg至300,000pg(例如127,500pg至300,000pg)的修饰的BoNT/A。

16.根据条款10-15中任一项所述使用的修饰的BoNT/A，其中施用的总剂量为大于127,500pg至300,000pg的修饰的BoNT/A。

17.根据条款10-16中任一项所述使用的修饰的BoNT/A，其中施用的总剂量为175,000至300,000pg的修饰的BoNT/A。

18.根据条款10-17中任一项所述使用的修饰的BoNT/A，其中施用的总剂量为250,000至300,000pg的修饰的BoNT/A。

19.一种修饰的BoNT/A，其用于治疗肢体痉挛(成人肢体痉挛)，其中所述修饰的BoNT/A通过肌内注射施用于个体的多块受影响的肌肉，

其中所述修饰的BoNT/A以大于707单位的修饰的BoNT/A的单位剂量施用于多块受影响的肌肉，并且其中1单位是与小鼠中计算的半数致死量(LD₅₀)相对应的修饰的BoNT/A的量，

其中多块受影响的肌肉选自：

第二组，包括：肱三头肌(长头)、肩胛下肌、胸肌(例如，胸大肌)、背阔肌、肱二头肌、肱肌、比目鱼肌、胫骨后肌、肱桡肌、大圆肌、髂腰肌和腓肠肌，以及其中在受影响的第一组肌肉处施用单个单位剂量和/或在受影响的第二组肌肉处施用多个单位剂量，并且其中在治疗期间施用的总剂量最多24,958单位，并且其中所述修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域，以及BoNT/B受体结合结构域(H_C结构域)。

20.根据条款19所述使用的修饰的BoNT/A，其中所述肢体痉挛为上肢痉挛。

21.根据条款19或条款20所述使用的修饰的BoNT/A，其中单位剂量大于707单位至最多1,664单位(例如708单位至最多1,664单位)的修饰的BoNT/A。22.根据条款19-21中任一项所述使用的修饰的BoNT/A，其中单位剂量为大于949单位至最多1,581单位(例如950单位至最多1,581单位)的修饰的BoNT/A。

23.根据条款19-22中任一项所述使用的修饰的BoNT/A，其中单位剂量为大于1,414单位至最多1,581单位(例如1,415单位至最多1,581单位)的修饰的BoNT/A。

24.根据条款19-23中任一项所述使用的修饰的BoNT/A，其中施用的总剂量为大于10,399单位至24,958单位(例如10,607单位至24,958单位)的修饰的BoNT/A。

25.根据条款19-24中任一项所述使用的修饰的BoNT/A，其中施用的总剂量为大于10,607单位至24,958单位的修饰的BoNT/A。

26.根据条款19-25中任一项所述使用的修饰的BoNT/A，其中施用的总剂量为14,559单位至24,958单位的修饰的BoNT/A。

27.根据条款19-26中任一项所述使用的修饰的BoNT/A，其中施用的总剂量为20,799单位至24,958单位的修饰的BoNT/A。

28.一种修饰的BoNT/A，其用于治疗小儿肢体痉挛，其中所述修饰的BoNT/A通过肌内注射施用于个体的多块受影响的肌肉，

其中所述修饰的BoNT/A以大于353.5单位的修饰的BoNT/A的单位剂量施用于多块受影响的肌肉，并且其中1单位是与小鼠中计算的半数致死量(LD₅₀)相对应的修饰的BoNT/A的量，

其中多块受影响的肌肉选自：

第二组，包括：肱三头肌(长头)、肩胛下肌、胸肌(例如，胸大肌)、背阔肌、肱二头肌、肱肌、比目鱼肌、胫骨后肌、肱桡肌、大圆肌、髂腰肌和腓肠肌，以及

其中在受影响的第一组肌肉处施用单个单位剂量和/或在受影响的第二组肌肉处施用多个单位剂量，并且其中在治疗期间施用的总剂量最多12,479单位，并且其中所述修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域，以及BoNT/B受体结合结构域(H_C结构域)。

29.根据条款28所述使用的修饰的BoNT/A，其中所述小儿肢体痉挛为小儿上肢痉挛。

30.根据条款28或条款29所述使用的修饰的BoNT/A，其中单位剂量大于353.5单位至最多832单位(例如354单位至最多832单位)的修饰的BoNT/A，优选其中单位剂量大于353.5单位至最多749单位(例如354单位至最多749单位)。

31.根据条款28-30中任一项所述使用的修饰的BoNT/A，其中单位剂量为大于478单位至最多749单位(例如479单位至最多749单位)的修饰的BoNT/A。

32.根据条款28-31中任一项所述使用的修饰的BoNT/A，其中单位剂量为大于707单位至最多749单位(例如708单位至最多749单位)的修饰的BoNT/A。

33.根据条款28-32中任一项所述使用的修饰的BoNT/A，其中施用的总剂量为大于5,200单位至12,479单位(例如5,304单位至12,479单位)的修饰的BoNT/A。

34.根据条款28-33中任一项所述使用的修饰的BoNT/A，其中施用的总剂量为大于5,304单位至12,479单位的修饰的BoNT/A。

35.根据条款28-34中任一项所述使用的修饰的BoNT/A，其中施用的总剂量为7,280单位至12,479单位的修饰的BoNT/A。

36.根据条款28-35中任一项所述使用的修饰的BoNT/A，其中施用的总剂量为10,400单位至最多12,479单位的修饰的BoNT/A。

37.根据前述条款中任一项所述使用的修饰的BoNT/A，其中修饰的BoNT/A包含与SEQ ID NO:6具有至少70％序列同一性的多肽序列。

38.根据前述条款中任一项所述使用的修饰的BoNT/A，其中修饰的BoNT/A包含SEQID NO:6的多肽序列。

39.根据前述条款中任一项所述使用的修饰的BoNT/A，其中修饰的BoNT/A由SEQID NO:6的多肽序列组成。

40.根据前述条款中任一项所述使用的修饰的BoNT/A，其中修饰的BoNT/A具有大于7的安全比，其中所述安全比计算为：以pg/小鼠测量的-10％体重变化所需的毒素剂量除以以pg/小鼠测量的DAS EC₅₀，其中EC₅₀＝产生DAS评分为2所需的剂量。

41.根据前述条款中任一项所述使用的修饰的BoNT/A，其中所述多块肌肉选自：

第一组，其包含：指浅屈肌、指深屈肌、桡侧腕屈肌、尺侧腕屈肌、肱桡肌、旋前圆肌、三角肌、肩胛提肌、旋前方肌、拇长屈肌、拇收肌、拇短屈肌、掌长肌、蚓状肌、拇对掌肌；和

第二组，其包含：肱三头肌(长头)、肩胛下肌、胸肌(例如，胸大肌)、背阔肌、肱二头肌、肱肌、肱桡肌和大圆肌。

42.一种修饰的BoNT/A的单位剂型，该单位剂型包含：

(a)大于707单位的修饰的BoNT/A，其中1单位是对应于小鼠中计算的半数致死量(LD₅₀)的修饰的BoNT/A的量；或

(b)大于17,000pg的修饰的BoNT/A；以及

(c)任选的药学上可接受的载体、赋形剂、佐剂和/或盐，

43.根据条款42所述的单位剂型，其包含：

(a)大于707单位至最多1,664个单位(例如708单位至最多1,664单位)的修饰的BoNT/A；或

(b)大于17,000pg至最多40,000pg(例如17,001pg至最多40,000pg)的修饰的BoNT/A。

44.一种试剂盒，其包含：

(a)根据条款42或43所述的单位剂型；和

(b)使用其治疗肢体痉挛的说明书；以及

(c)任选的稀释剂。

45.一种修饰的BoNT/A的单位剂型(例如用于治疗成人肢体痉挛)，所述单位剂型包含：

(a)大于353.5单位的修饰的BoNT/A，其中1单位是对应于小鼠中计算的半数致死量(LD₅₀)的修饰的BoNT/A的量；或

(b)大于8,500pg的修饰的BoNT/A；以及

(c)任选的药学上可接受的载体、赋形剂、佐剂和/或盐，

46.根据条款45所述的单位剂型，其包含：

(a)大于353.5单位至最多832单位(例如354单位至最多832单位)的修饰的BoNT/A；或

(b)大于8,500pg至最多20,000pg(例如8,501pg至最多20,000pg)的修饰的BoNT/A。

47.一种试剂盒，其包含：

(a)根据条款45或46所述的单位剂型；和

(b)使用其治疗小儿肢体痉挛的说明书；以及

(c)任选的稀释剂。

上述说明书中提及的所有出版物均通过引用并入本文。在不脱离本发明的范围和精神的情况下，本发明的所述方法和系统的各种修改和变化对于本领域技术人员来说是显而易见的。尽管已经结合特定的优选实施例描述了本发明，但是应当理解，所要求保护的本发明不应当不适当地限于这些特定的实施例。实际上，对于生物化学和生物技术或相关领域的技术人员来说显而易见的用于实施本发明的所述模式的各种修改都在所附权利要求的范围内。

Claims

1.一种修饰的肉毒杆菌神经毒素A(BoNT/A)，其用于治疗肢体痉挛，其中修饰的BoNT/A通过肌内注射施用于个体的多块受影响的肌肉，

其中修饰的BoNT/A以大于17,000pg的修饰的BoNT/A的单位剂量施用于多块受影响的肌肉，其中多块受影响的肌肉选自：

其中在受影响的第一组肌肉处施用单个单位剂量和/或在受影响的第二组肌肉处施用多个单位剂量，并且其中在治疗期间施用的总剂量最多600,000pg，并且其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域，以及BoNT/B受体结合结构域(H_C结构域)。

2.一种用于治疗肢体痉挛的方法，所述方法包括通过肌内注射将修饰的肉毒杆菌神经毒素A(BoNT/A)施用至个体的多块受影响的肌肉，其中所述修饰的BoNT/A以大于17,000pg的修饰的BoNT/A的单位剂量施用于多块受影响的肌肉，其中多块受影响的肌肉选自：

3.一种修饰的肉毒杆菌神经毒素A(BoNT/A)在制造用于治疗肢体痉挛的药物中的用途，其中所述修饰的BoNT/A通过肌内注射施用于个体的多块受影响的肌肉，

其中修饰的BoNT/A以大于17,000pg的修饰的BoNT/A的单位剂量施用于多块受影响的肌肉，

其中多块受影响的肌肉选自：

4.根据前述权利要求中任一项所述使用的修饰的BoNT/A、方法或用途，其中单位剂量为大于17,000pg至最多40,000pg(例如17,001pg至最多40,000pg)的修饰的BoNT/A。

5.根据前述权利要求中任一项所述使用的修饰的BoNT/A、方法或用途，其中单位剂量为20,000pg至30,000pg、优选24,000pg至26,000pg、更优选25,000pg的修饰的BoNT/A。

6.根据权利要求1-4中任一项所述使用的修饰的BoNT/A、方法或用途，其中单位剂量为30,000pg至40,000pg、优选35,000pg至37,000pg、更优选36,000pg的修饰的BoNT/A。

7.根据权利要求1-4中任一项所述使用的修饰的BoNT/A、方法或用途，其中单位剂量为大于23,000pg至最多38,000pg(例如23,001pg至最多38,000pg)的修饰的BoNT/A。

8.根据权利要求1-4或6-7中任一项所述使用的修饰的BoNT/A、方法或用途，其中单位剂量为大于34,000pg至最多38,000pg(例如34,001pg至最多38,000pg)的修饰的BoNT/A。

9.根据前述权利要求中任一项所述使用的修饰的BoNT/A、方法或用途，其中施用的总剂量为250,000pg至600,000pg(例如255,000pg至600,000pg)的修饰的BoNT/A。

10.根据前述权利要求中任一项所述使用的修饰的BoNT/A、方法或用途，其中施用的总剂量为大于255,000pg至600,000pg的修饰的BoNT/A。

11.根据前述权利要求中任一项所述使用的修饰的BoNT/A、方法或用途，其中施用的总剂量为350,000pg至600,000pg修饰的BoNT/A。

12.根据权利要求1-10中任一项所述使用的修饰的BoNT/A、方法或用途，其中施用的总剂量为最多300,000pg至450,000pg、优选最多360,000pg至390,000pg、更优选最多375,000pg的修饰的BoNT/A。

13.根据权利要求1-11中任一项所述使用的修饰的BoNT/A、方法或用途，其中施用的总剂量为最多450,000pg至600,000pg、优选最多525,000pg至555,000pg、更优选最多540,000pg的修饰的BoNT/A。

14.根据权利要求1-11或13中任一项所述使用的修饰的BoNT/A、方法或用途，其中施用的总剂量为500,000至600,000pg的修饰的BoNT/A。

15.一种修饰的肉毒杆菌神经毒素A(BoNT/A)，其用于治疗肢体痉挛，其中修饰的BoNT/A通过肌内注射施用于个体的多块受影响的肌肉，

其中修饰的BoNT/A以大于707单位的修饰的BoNT/A的单位剂量施用于多块受影响的肌肉，并且其中1单位是与小鼠中计算的半数致死量(LD₅₀)相对应的修饰的BoNT/A的量，

其中多块受影响的肌肉选自：

其中在受影响的第一组肌肉处施用单个单位剂量和/或在受影响的第二组肌肉处施用多个单位剂量，并且其中在治疗期间施用的总剂量最多24,958单位，并且其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域，以及BoNT/B受体结合结构域(H_C结构域)。

16.一种用于治疗肢体痉挛的方法，所述方法包括将修饰的肉毒杆菌神经毒素A(BoNT/A)通过肌内注射施用至个体的多块受影响的肌肉，

其中修饰的BoNT/A以大于707单位修饰的BoNT/A的单位剂量施用至多块受影响的肌肉，其中1单位是与小鼠中计算的半数致死量(LD₅₀)相对应的修饰的BoNT/A的量，

其中多块受影响的肌肉选自：

17.一种修饰的肉毒杆菌神经毒素A(BoNT/A)在制造用于治疗肢体痉挛的药物中的用途，其中修饰的BoNT/A通过肌内注射施用于个体的多块受影响的肌肉，其中修饰的BoNT/A以大于707单位的修饰的BoNT/A的单位剂量施用于多块受影响的肌肉，并且其中1单位是与小鼠中计算的半数致死量(LD50)相对应的修饰的BoNT/A的量，

其中多块受影响的肌肉选自：

18.根据权利要求15-17中任一项所述使用的修饰的BoNT/A、方法或用途，其中单位剂量为大于707单位至最多1,664单位(例如708单位至最多1,664单位)的修饰的BoNT/A。

19.根据权利要求15-18中任一项所述使用的修饰的BoNT/A、方法或用途，其中单位剂量为832单位至1,248单位、优选998单位至1,082单位、更优选1,040单位的修饰的BoNT/A。

20.根据权利要求15-18中任一项所述使用的修饰的BoNT/A、方法或用途，其中单位剂量为1,248单位至1,664单位、优选1,456单位至1,539单位、更优选1,498单位的修饰的BoNT/A。

21.根据权利要求15-18中任一项所述使用的修饰的BoNT/A、方法或用途，其中单位剂量为大于949单位至最多1,581单位或大于957单位至最多1,581单位(例如950单位至最多1,581单位或958单位至最多1,581单位)的修饰的BoNT/A。

22.根据权利要求15-18或20-21中任一项所述使用的修饰的BoNT/A、方法或用途，其中单位剂量为大于1,414单位至最多1,581单位(例如1,415单位至最多1,581单位)的修饰的BoNT/A。

23.根据权利要求15-22中任一项所述使用的修饰的BoNT/A、方法或用途，其中施用的总剂量为10,399单位至24,958单位(例如10,607单位至24,958单位)的修饰的BoNT/A。

24.根据权利要求15-23中任一项所述使用的修饰的BoNT/A、方法或用途，其中施用的总剂量为大于10,607单位至24,958单位的修饰的BoNT/A。

25.根据权利要求15-24中任一项所述使用的修饰的BoNT/A、方法或用途，其中施用的总剂量为最多12,479单位至18,719单位、优选最多14,975单位至16,223单位、更优选最多15,599单位的修饰的BoNT/A。

26.根据权利要求12-20中任一项所述使用的修饰的BoNT/A、方法或用途，其中施用的总剂量为14,559单位至24,958单位的修饰的BoNT/A。

27.根据权利要求15-24或26中任一项所述使用的修饰的BoNT/A、方法或用途，其中施用的总剂量为最多18,719单位至24,958单位、优选最多21,839单位至23,087单位、更优选最多22,463单位的修饰的BoNT/A。

28.根据权利要求15-24或26-27中任一项所述使用的修饰的BoNT/A、方法或用途，其中施用的总剂量为20,799单位至24,958单位的修饰的BoNT/A。

29.根据前述权利要求中任一项所述使用的修饰的BoNT/A、方法或用途，其中所述痉挛是成人肢体痉挛，并且所述个体是成人个体。

30.根据前述权利要求中任一项所述使用的修饰的BoNT/A、方法或用途，其中所述肢体痉挛是上肢痉挛。

31.一种用于治疗小儿肢体痉挛的修饰的肉毒杆菌神经毒素A(BoNT/A)，其中修饰的BoNT/A通过肌内注射施用于个体的多块受影响的肌肉，

其中修饰的BoNT/A以大于8,500pg的修饰的BoNT/A的单位剂量施用于多块受影响的肌肉，

其中多块受影响的肌肉选自：

其中在受影响的第一组肌肉处施用单个单位剂量和/或在受影响的第二组肌肉处施用多个单位剂量，并且其中在治疗期间施用的总剂量最多300,000pg，并且其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域，以及BoNT/B受体结合结构域(H_C结构域)。

32.一种用于治疗小儿肢体痉挛的方法，所述方法包括通过肌内注射将修饰的肉毒杆菌神经毒素A(BoNT/A)施用至个体的多块受影响的肌肉，

其中所述修饰的BoNT/A以大于8,500pg的修饰的BoNT/A的单位剂量施用于多块受影响的肌肉，

其中多块受影响的肌肉选自：

33.一种修饰的肉毒杆菌神经毒素A(BoNT/A)在制造用于治疗小儿肢体痉挛的药物中的用途，其中所述修饰的BoNT/A通过肌内注射施用于个体的多块受影响的肌肉，

其中多块受影响的肌肉选自：

34.根据权利要求31-33中任一项所述使用的修饰的BoNT/A、方法或用途，其中单位剂量为大于8,500pg至最多20,000pg(例如8,501pg至最多20,000pg)的修饰的BoNT/A，优选其中单位剂量为大于8,500pg至最多18,000pg。

35.根据权利要求31-34中任一项所述使用的修饰的BoNT/A、方法或用途，其中单位剂量为10,000pg至15,000、优选12,000pg至13,000pg、更优选12,500pg的修饰的BoNT/A。

36.根据权利要求31-34中任一项所述使用的修饰的BoNT/A、方法或用途，其中单位剂量为15,000pg至20,000、优选17,500pg至18,500pg、更优选18,000pg的修饰的BoNT/A。

37.根据权利要求31-34中任一项所述使用的修饰的BoNT/A、方法或用途，其中单位剂量为大于11,500pg至最多19,000pg(例如11,501pg至最多19,000pg)的修饰的BoNT/A。

38.根据权利要求31-34或36-37中任一项所述使用的修饰的BoNT/A、方法或用途，其中单位剂量为大于17,000pg至最多19,000pg(例如17,001pg至最多19,000pg)的修饰的BoNT/A。

39.根据权利要求31-38中任一项所述使用的修饰的BoNT/A、方法或用途，其中施用的总剂量为125,000pg至300,000pg(例如127,500pg至300,000pg)的修饰的BoNT/A。

40.根据权利要求31-39中任一项所述使用的修饰的BoNT/A、方法或用途，其中施用的总剂量为大于127,500pg至300,000pg的修饰的BoNT/A。

41.根据权利要求31-40中任一项所述使用的修饰的BoNT/A、方法或用途，其中施用的总剂量为175,000至300,000pg的修饰的BoNT/A。

42.根据权利要求31-40中任一项所述使用的修饰的BoNT/A、方法或用途，其中施用的总剂量为最多150,000pg至225,000pg、优选最多180,000pg至195,000pg、更优选最多187,500pg的修饰的BoNT/A。

43.根据权利要求31-41中任一项所述使用的修饰的BoNT/A、方法或用途，其中施用的总剂量为最多225,000pg至300,000pg、优选最多262,500pg至277,500pg、更优选最多270,000pg的修饰的BoNT/A。

44.根据权利要求31-41或43中任一项所述使用的修饰的BoNT/A、方法或用途，其中施用的总剂量为250,000至300,000pg的修饰的BoNT/A。

45.一种用于治疗小儿肢体痉挛的修饰的BoNT/A，其中所述修饰的BoNT/A通过肌内注射施用于个体的多块受影响的肌肉，

其中多块受影响的肌肉选自：

其中在受影响的第一组肌肉处施用单个单位剂量和/或在受影响的第二组肌肉处施用多个单位剂量，并且其中在治疗期间施用的总剂量最多12,479单位，并且其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域，以及BoNT/B受体结合结构域(H_C结构域)。

46.一种用于治疗小儿肢体痉挛的方法，所述方法包括将修饰的肉毒杆菌神经毒素A(BoNT/A)通过肌内注射施用至个体的多块受影响的肌肉，

其中多块受影响的肌肉选自：

47.一种修饰的BoNT/A在制造用于治疗小儿肢体痉挛的药物中的用途，其中修饰的BoNT/A通过肌内注射施用于个体的多块受影响的肌肉，

其中修饰的BoNT/A以大于353.5单位的修饰的BoNT/A的单位剂量施用于多块受影响的肌肉，并且其中1单位是与小鼠中计算的半数致死量(LD50)相对应的修饰的BoNT/A的量，

其中多块受影响的肌肉选自：

48.根据权利要求45-47中任一项所述使用的修饰的BoNT/A、方法或用途，其中单位剂量为大于353.5单位至最多832单位(例如354单位至最多832单位)的修饰的BoNT/A，优选其中单位剂量大于353.5单位至最多749单位(例如354单位至最多749单位)。

49.根据权利要求45-48中任一项所述使用的修饰的BoNT/A、方法或用途，其中单位剂量为416单位至624单位、优选499单位至541单位、更优选520单位的修饰的BoNT/A。

50.根据权利要求45-48中任一项所述使用的修饰的BoNT/A、方法或用途，其中单位剂量为624单位至832单位、优选728单位至770单位、更优选749单位的修饰的BoNT/A。

51.根据权利要求45-48中任一项所述使用的修饰的BoNT/A、方法或用途，其中单位剂量为大于478单位至最多790单位(例如479单位至最多790单位)的修饰的BoNT/A。

52.根据权利要求45-48中任一项所述使用的修饰的BoNT/A、方法或用途，其中单位剂量为大于707单位至最多790单位(例如708单位至最多790单位)的修饰的BoNT/A。

53.根据权利要求45-52中任一项所述使用的修饰的BoNT/A、方法或用途，其中施用的总剂量为5,200单位至12,479单位(例如5,304单位至12,479单位)的修饰的BoNT/A。

54.根据权利要求45-53中任一项所述使用的修饰的BoNT/A、方法或用途，其中施用的总剂量为大于5,304单位至12,479单位的修饰的BoNT/A。

55.根据权利要求45-54中任一项所述使用的修饰的BoNT/A、方法或用途，其中施用的总剂量为最多6,240单位至9,360单位、优选最多7,488单位至8,112单位、更优选最多7,800单位的修饰的BoNT/A。

56.根据权利要求45-54中任一项所述使用的修饰的BoNT/A、方法或用途，其中施用的总剂量为7,280单位至12,479单位的修饰的BoNT/A。

57.根据权利要求45-54或56中任一项所述使用的修饰的BoNT/A、方法或用途，其中施用的总剂量为最多9,360单位至12,479单位、优选最多10,920单位至11,544单位、更优选最多11,232单位的修饰的BoNT/A。

58.根据权利要求45-54或56-57中任一项所述使用的修饰的BoNT/A、方法或用途，其中施用的总剂量为10,399单位至12,479单位的修饰的BoNT/A。

59.根据权利要求31-58中任一项所述使用的修饰的BoNT/A、方法或用途，其中所述小儿肢体痉挛是小儿上肢痉挛。

60.根据前述权利要求中任一项所述使用的修饰的BoNT/A、方法或用途，其中：

第一组受影响的肌肉包括：指浅屈肌、指深屈肌、桡侧腕屈肌、尺侧腕屈肌、肱桡肌、旋前圆肌、肱二头肌、腓肠肌内侧头、腓肠肌外侧头、趾长屈肌、拇长屈肌(flexor hallucislongus)、腓肠肌、三角肌、肩胛提肌、旋前方肌、拇长屈肌(flexor policis longus)、拇收肌、拇短屈肌(flexor policis brevis)、掌长肌、蚓状肌、拇对掌肌、大收肌、长收肌、短收肌、股薄肌、内侧腘绳肌、外侧腘绳肌、阔筋膜张肌、股直肌、股外侧肌、股内侧肌、股中间肌、臀大肌、胫骨前肌、趾短屈肌、拇长伸肌、拇短屈肌(flexor hallucis brevis)；以及

第二组受影响的肌肉包括：肱三头肌(长头)、肩胛下肌、胸肌(例如，胸大肌)、背阔肌、肱二头肌、肱肌、比目鱼肌、胫骨后肌、肱桡肌、大圆肌、髂腰肌和腓肠肌。

61.一种的修饰的肉毒杆菌神经毒素A(BoNT/A)，其用于治疗肢体痉挛(优选成人肢体痉挛)，其中修饰的BoNT/A通过肌内注射施用于个体的多块受影响的肌肉，

其中修饰的BoNT/A以10,000pg至20,000pg(例如14,000pg至16,000pg，优选15,000pg)的修饰的BoNT/A的单位剂量的施用于多块受影响的肌肉，

其中多块受影响的肌肉选自：

第二组，包括：肱三头肌(长头)、肩胛下肌、胸肌(例如，胸大肌)、背阔肌、肱二头肌、肱肌、比目鱼肌、胫骨后肌、肱桡肌、大圆肌、髂腰肌、大收肌、腘绳肌(例如，股二头肌、半膜肌和/或半腱肌)、股直肌和腓肠肌，以及其中在受影响的第一组肌肉处施用单个单位剂量和/或在受影响的第二组肌肉处施用多个单位剂量，并且其中在治疗期间施用的总剂量最多300,000pg(例如最多240,000pg，优选最多225,000pg)，并且

其中修饰的BoNT/A包含BoNT/A轻链和易位结构域，以及BoNT/B受体结合结构域(H_C结构域)。

62.一种用于治疗肢体痉挛(优选成人肢体痉挛)的方法，所述方法包括通过肌内注射将修饰的肉毒杆菌神经毒素A(BoNT/A)施用至个体的多块受影响的肌肉，其中所述修饰的BoNT/A以10,000pg至20,000pg(例如14,000pg至16,000pg，优选15,000pg)的修饰的BoNT/A的单位剂量施用于多块受影响的肌肉，

其中多块受影响的肌肉选自：

63.一种修饰的肉毒杆菌神经毒素A(BoNT/A)在制造用于治疗肢体痉挛(优选成人肢体痉挛)的药物中的用途，其中修饰的BoNT/A通过肌内注射施用于个体的多块受影响的肌肉，

其中多块受影响的肌肉选自：

64.一种修饰的肉毒杆菌神经毒素A(BoNT/A)，其用于治疗肢体痉挛(优选成人肢体痉挛)，其中修饰的BoNT/A通过肌内注射施用至个体的多块受影响的肌肉，其中所述修饰的BoNT/A以416单位至832单位(例如582单位至666单位，优选624单位)的修饰的BoNT/A的单位剂量施用于多块受影响的肌肉，并且其中1单位是与小鼠中计算的半数致死量(LD50)相对应的修饰的BoNT/A的量，

其中多块受影响的肌肉选自：

65.一种用于治疗肢体痉挛(优选成人肢体痉挛)的方法，所述方法包括将修饰的肉毒杆菌神经毒素A(BoNT/A)通过肌内注射施用至个体的多块受影响的肌肉，其中修饰的BoNT/A以416单位至832单位(例如582单位至666单位，优选624单位)的修饰的BoNT/A的单位剂量施用于多块受影响的肌肉，其中1单位是与小鼠中计算的半数致死量(LD₅₀)相对应的修饰的BoNT/A的量，

其中多块受影响的肌肉选自：

第二组，包括：肱三头肌(长头)、肩胛下肌、胸肌(例如，胸大肌)、背阔肌、肱二头肌、肱肌、比目鱼肌、胫骨后肌、肱桡肌、大圆肌、髂腰肌、大收肌、腘绳肌(例如，股二头肌、半膜肌和/或半腱肌)、股直肌和腓肠肌，以及其中在受影响的第一组肌肉处施用单个单位剂量和/或在受影响的第二组肌肉处施用多个单位剂量，并且其中在治疗期间施用的总剂量最多12,480单位(例如最多9,990单位，优选最多9,360单位)，并且

66.一种修饰的肉毒杆菌神经毒素A(BoNT/A)在制造用于治疗肢体痉挛(优选成人肢体痉挛)的药物中的用途，其中修饰的BoNT/A通过肌内注射施用至个体的多块受影响的肌肉，

其中所述修饰的BoNT/A以416单位至832单位(例如582单位至666单位，优选624单位)的修饰的BoNT/A的单位剂量施用于多块受影响的肌肉，并且其中1单位是与小鼠中计算的半数致死量(LD₅₀)相对应的修饰的BoNT/A的量，

其中多块受影响的肌肉选自：

67.一种用于治疗小儿肢体痉挛的修饰的肉毒杆菌神经毒素A(BoNT/A)，其中修饰的BoNT/A通过肌内注射施用于个体的多块受影响的肌肉，

其中修饰的BoNT/A以5,000pg至10,000pg(例如7,000pg至8,000pg，优选7,500pg)的修饰的BoNT/A的单位剂量的施用于多块受影响的肌肉，

其中多块受影响的肌肉选自：

68.一种用于治疗小儿肢体痉挛的方法，所述方法包括通过肌内注射将修饰的肉毒杆菌神经毒素A(BoNT/A)施用至个体的多块受影响的肌肉，

其中所述修饰的BoNT/A以5,000pg至10,000pg(例如7,000pg至8,000pg，优选7,500pg)的修饰的BoNT/A的单位剂量施用于多块受影响的肌肉，其中多块受影响的肌肉选自：

69.一种修饰的肉毒杆菌神经毒素A(BoNT/A)在制造用于治疗小儿肢体痉挛的药物中的用途，其中修饰的BoNT/A通过肌内注射施用于个体的多块受影响的肌肉，

其中多块受影响的肌肉选自：

70.一种修饰的肉毒杆菌神经毒素A(BoNT/A)，其用于治疗小儿肢体痉挛，其中修饰的BoNT/A通过肌内注射施用至个体的多块受影响的肌肉，

其中所述修饰的BoNT/A以208单位至416单位(例如291单位至333单位，优选312单位)的修饰的BoNT/A的单位剂量施用于多块受影响的肌肉，并且其中1单位是与小鼠中计算的半数致死量(LD₅₀)相对应的修饰的BoNT/A的量，

其中多块受影响的肌肉选自：

71.一种用于治疗小儿肢体痉挛的方法，所述方法包括将修饰的肉毒杆菌神经毒素A(BoNT/A)通过肌内注射施用至个体的多块受影响的肌肉，其中修饰的BoNT/A以208单位至416单位(例如291单位至333单位，优选312单位)的修饰的BoNT/A的单位剂量施用于多块受影响的肌肉，其中1单位是与小鼠中计算的半数致死量(LD₅₀)相对应的修饰的BoNT/A的量，

其中多块受影响的肌肉选自：

72.一种修饰的肉毒杆菌神经毒素A(BoNT/A)在制造用于治疗小儿肢体痉挛的药物中的用途，其中修饰的BoNT/A通过肌内注射施用至个体的多块受影响的肌肉，

其中多块受影响的肌肉选自：

73.根据前述权利要求中任一项所述使用、方法或用途的修饰BoNT/A，其中所述痉挛是上肢痉挛，并且其中多块受影响的肌肉选自：

第一组，其包含(优选由以下组成)：指浅屈肌，指深屈肌，桡侧腕屈肌，尺侧腕屈肌，肱桡肌；和

第二组，其包含(优选由以下组成)：肱肌、肱二头肌、肱三头肌(长头)、肩胛下肌、胸肌(例如胸大肌)和背阔肌。

74.根据权利要求73所述使用的修饰的BoNT/A、方法或用途，其中在受影响的第二组肌肉处施用两个单位剂量。

75.根据权利要求1-29、31-58或60-72中任一项所述使用的修饰的BoNT/A、方法或用途，其中多块受影响的肌肉中的至少一个选自：大收肌、腘绳肌(例如，股二头肌、半膜肌和/或半腱肌)和股直肌。

76.根据权利要求1-29、31-58、60-72或75中任一项所述使用的修饰的BoNT/A、方法或用途，其中所述痉挛是下肢痉挛，并且其中多块受影响的肌肉选自：

第一组，其包含(优选由以下组成)：腓肠肌内侧头(内侧腓肠肌)、腓肠肌外侧头(外侧腓肠肌)、胫骨前肌、趾长屈肌、趾短屈肌、拇长屈肌、拇短屈肌、股薄肌、臀大肌；和

第二组，其包含(优选由以下组成)：比目鱼肌、胫骨后肌、股直肌、腘绳肌(例如，股二头肌、半膜肌和/或半腱肌)和大收肌。

77.根据权利要求76所述使用的修饰的BoNT/A、方法或用途，其中当第二组肌肉为：

(a)比目鱼肌，向其施用三个单位剂量；或

(b)后胫骨肌、股直肌、腘绳肌(例如，股二头肌、半膜肌和/或半腱肌)或大收肌，向其施用两个单位剂量。

78.根据前述任一项权利要求所述使用的修饰的BoNT/A、方法或用途，其中在治疗期间施用的单位剂量的总数为最多15个单位剂量。

79.根据前述权利要求中任一项所述使用的修饰的BoNT/A、方法或用途，其中修饰的BoNT/A包含与SEQ ID NO:6具有至少70％序列同一性的多肽序列。

80.根据前述权利要求中任一项所述使用的修饰的BoNT/A、方法或用途，其中修饰的BoNT/A包含SEQ ID NO:6的多肽序列。

81.根据前述权利要求中任一项所述使用的修饰的BoNT/A、方法或用途，其中修饰的BoNT/A由SEQ ID NO:6的多肽序列组成。

82.根据前述权利要求中任一项所述使用的修饰的BoNT/A、方法或用途，其中修饰的BoNT/A具有大于7的安全比，其中所述安全比计算为：以pg/小鼠测量的-10％体重变化所需的毒素剂量除以以pg/小鼠测量的DAS EC₅₀，其中EC₅₀＝产生DAS评分为2所需的剂量。

83.根据前述权利要求中任一项所述使用的修饰的BoNT/A、方法或用途，其中肢体痉挛的治疗持续时间比未修饰的BoNT/A(例如SEQ ID NO:2[例如双链形式的SEQ ID NO:2])的治疗持续时间更长。

84.一种修饰的肉毒杆菌神经毒素A(BoNT/A)的单位剂型(例如用于治疗成人肢体痉挛)，所述单位剂型包含：

(a)大于17,000pg的修饰的BoNT/A；或

(b)大于707单位的修饰的BoNT/A，其中1单位是对应于小鼠中计算的半数致死量(LD₅₀)的修饰的BoNT/A的量；以及

(c)任选的药学上可接受的载体、赋形剂、佐剂和/或盐，

85.根据权利要求84所述的单位剂型，其中所述单位剂型包含20,000pg至30,000pg、优选24,000pg至26,000pg、更优选25,000pg的修饰的BoNT/A。

86.根据权利要求84所述的单位剂型，其中所述单位剂型包含832单位至1,248单位、优选998单位至1,082单位、更优选1,040单位的修饰的BoNT/A。

87.根据权利要求84所述的单位剂型，其中所述单位剂型包含30,000pg至40,000pg、优选35,000pg至37,000pg、更优选36,000pg的修饰的BoNT/A。

88.根据权利要求84所述的单位剂型，其中所述单位剂型包含1,248单位至1,664单位、优选1,456单位至1,539单位、更优选1,498单位的修饰的BoNT/A。

89.一种用于治疗小儿个体(例如用于治疗小儿肢体痉挛)的修饰的肉毒杆菌神经毒素A(BoNT/A)的单位剂型，所述单位剂型包含：

(a)大于8,500pg的修饰的BoNT/A；或

(b)大于353.5单位的修饰的BoNT/A，其中1单位是对应于小鼠中计算的半数致死量(LD₅₀)的修饰的BoNT/A的量；以及

(c)任选的药学上可接受的载体、赋形剂、佐剂和/或盐，

90.根据权利要求89所述的单位剂型，其中所述单位剂型包含10,000pg至15,000pg、优选12,000pg至13,000pg、更优选12,500pg的修饰的BoNT/A。

91.根据权利要求89所述的单位剂型，其中所述单位剂型包含416单位至624单位、优选499单位至541单位、更优选520单位的修饰的BoNT/A。

92.根据权利要求89所述的单位剂型，其中所述单位剂型包含15,000pg至20,000pg、优选17,500pg至18,500pg、更优选18,000pg的修饰的BoNT/A。

93.根据权利要求89所述的单位剂型，其中所述单位剂型包含624单位至832单位、优选728单位至770单位、更优选749单位的修饰的BoNT/A。

94.根据前述权利要求中任一项所述使用的修饰的BoNT/A、方法、用途或单位剂型，其中所述修饰的BoNT/A是双链修饰的BoNT/A，其中L链通过二硫键连接至H链，所述修饰的BoNT/A可由以下方法获得，所述方法包括将包含SEQ ID NO:6(或由其组成)的单链修饰的BoNT/A与水解其活化环中的肽键的蛋白酶接触，从而将单链修饰的BoNT/A转化为相应的双链修饰的BoNT/A。

95.根据前述权利要求中任一项所述使用的修饰的BoNT/A、方法或用途，其中修饰的BoNT/A的多肽序列的起始甲硫氨酸氨基酸残基是任选的。

96.根据前述权利要求中任一项所述使用的修饰的BoNT/A、方法、用途或单位剂型，其中所述修饰的BoNT/A的多肽序列的起始甲硫氨酸氨基酸残基是不存在的。

97.根据前述权利要求中任一项所述使用的修饰的BoNT/A、方法、用途或单位剂型，其中所述BoNT/B H_C结构域包含一个或多个选自以下的取代突变：E1191M；S1199Y；V1118M；Y1183M；E1191I；E1191Q；E1191T；S1199F；S1199L；S1201V及其组合，优选地，其中BoNT/B H_C结构域包含取代突变E1191M和S1199Y。

98.根据前述权利要求中任一项所述使用的修饰的BoNT/A、方法、用途或单位剂型，其中所述修饰的BoNT/A是包含轻链和重链(或由轻链和重链组成)的双链修饰的BoNT/A，所述轻链包含SEQ ID NO:11或12(优选SEQ ID NO:11)，所述重链包含SEQ ID NO:13，其中所述轻链和重链通过二硫键连接在一起。

99.一种试剂盒，其包含：

(a)根据权利要求84-98中任一项所述的单位剂型；和

(b)使用其治疗肢体痉挛的说明书；以及

(c)任选的稀释剂。

100.根据权利要求84-88或94-98中任一项所述的单位剂型，其用于治疗成人肢体痉挛。

101.一种用于治疗成人肢体痉挛的方法，所述方法包括向个体施用根据权利要求84-88或94-98中任一项所述的剂型。

102.根据权利要求84-88或94-98中任一项所述的单位剂型在制造用于治疗成人肢体痉挛的药物中的用途。

103.根据权利要求89-98中任一项所述的单位剂型，其用于治疗小儿肢体痉挛。

104.一种用于治疗小儿肢体痉挛的方法，所述方法包括向个体施用根据权利要求89-98中任一项所述的剂型。

105.根据权利要求89-98中任一项所述的单位剂型在制造用于治疗小儿肢体痉挛的药物中的用途。