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CN119136825A - 一种用于治疗脑损伤的基因工程药物及其制备方法 - Google Patents

一种用于治疗脑损伤的基因工程药物及其制备方法 Download PDF

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CN119136825A
CN119136825A CN202280095180.9A CN202280095180A CN119136825A CN 119136825 A CN119136825 A CN 119136825A CN 202280095180 A CN202280095180 A CN 202280095180A CN 119136825 A CN119136825 A CN 119136825A
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China
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brain injury
preparation
acp5
injury
metalloprotease
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CN202280095180.9A
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林俊
高诚
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Abstract

提供了一种用于治疗脑损伤的基因工程药物及其制备方法，具体按照如下操作步骤：S1：生物酶取样，抽取混合；S2：基因转接，培育母细胞；S3：初步分离，入体实验。脑损伤常会导致脑水肿、神经细胞死亡以及神经炎症等多种病理改变，而这些病理改变往往是同时进行。因此，目前针对这些复杂的病理过程只是对症治疗，通过检测损伤后主要死亡相关蛋白，尤其是caspase‑8，以及代表性炎症因子后发现所述基因工程药物可以阻断脑损伤后神经细胞死亡的发生，同时能够有效抑制炎症反应，也因此能有效抑制脑损伤引起的神经元退行性改变以及脑水肿的形成。

Description

一种用于治疗脑损伤的基因工程药物及其制备方法
本申请要求2022年3月1日提交中国专利局、申请号为2022101940447、发明名称为“一种用于治疗脑损伤的基因工程药物及其制备方法”的发明专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种用于治疗脑损伤的基因工程药物及其制备方法。
背景技术
脑损伤是指各种因素导致的脑组织中神经胶质细胞(包括神经元和胶质细胞)的破坏和死亡，进而导致神经功能障碍的发生。由于神经元的不可再生性，脑损伤常是各种神经精神疾病和神经退行性疾病的高危因素；同时，脑损伤具有高发生率，高致死率和高致残率，严重影响病人的生活质量，给社会造成巨大的负担。在美国，每年约有260万例脑损伤患者。根据脑损伤的病因不同，可将脑损伤分为创伤性脑损伤和获得性脑损伤。由于脑损伤的严重程度差异较大，并且不同区域的脑损伤可引起不同的症状，比如局灶性脑损伤常引起包括运动、感觉、言语、视觉、听觉等异常的相关症状，而弥散性脑损伤则常影响记忆、睡眠或导致意识模糊和昏迷等，因此，现阶段对于脑损伤病人的治疗尚无明确、统一的方法。
目前对于脑损伤的治疗主要是对症治疗：头痛可给予镇痛药，但 不宜用麻醉药或吗啡类药品，以免成瘾，如左旋千金藤立定、肠溶阿司匹林、萘普生、布洛芬等；头晕可给予苯海拉明、叁氯叔丁醇等；自主神经功能失调可给予谷维素、异丙嗪、γ-氨酪酸(γ-氨基丁酸)、哌甲酯(哌醋甲酯)、阿托品(硫酸阿托品)、东莨菪碱等；兴奋病人可给予奋乃静、地西泮(安定)、奥沙西泮(去甲羟基安定)等；抑郁病人可给予谷氨酸、γ-氨酪酸。
本发明以脑损伤中的脑外伤(但不局限于脑外伤)为例，从脑外伤后神经细胞死亡，炎症，运动功能、学习和记忆能力以及自主探索能力等方面阐述该发明所发挥的作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种木质素在酚醛树脂模塑料，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种用于治疗脑损伤的基因工程药物及其制备方法，具体按照如下操作步骤：
S1：生物酶取样，抽取混合
(a)从哺乳生物抽取表达的糖基化单体金属蛋白酶；
(b)使用混合比例在1:2-1:3的还原液中，将上述的糖基化单体金属蛋白酶激活活性，使其活性达到最佳，并使用蛋白水裂解；
S2：基因转接，培育母细胞
将978bp的编码序列克隆到含有SP146启动子的载体pAAV9中以产生作为表达框架的pAAV9 SP146:ACP5；
S3：初步分离，入体实验
(a)常规包被在含有80-100mg/L Amp的LB板中操作转染产物，构建的质粒经测序确认并扩增生产；
(b)转染产物在0-8℃下10000-25000rpm离心10-30分钟，获上清和沉淀：上清进入色谱分离纯化程序；
(c)采取病毒，体外实验
通过将重组腺相关病毒(rAAV)病毒注入小白鼠体内，并将上述合成的糖基化单体金属蛋白酶注入；
(d)将小白鼠生物体态特征记录。
作为优选的，所述病毒的编码序列为：
Gene ID:54
acid phosphatase 5；tartrate resistant(ACP5)；also known as HPAP；TRAP；TRACP5a；TRACP5b；TrATPase。
本发明的技术效果和优点：
本发明中，脑损伤常会导致脑水肿、神经细胞死亡以及神经炎症等多种病理改变，而这些病理改变往往是同时进行。因此，目前针对这些复杂的病理过程只是对症治疗。通过检测损伤后主要死亡相关蛋白(尤其是caspase-8)以及代表性炎症因子后发现本发明可以阻断脑损伤后神经细胞死亡的发生，同时能够有效抑制炎症反应。基于此，本发明也因此能有效抑制脑损伤引起的神经元退行性改变以及脑水肿的形成。
附图标记
图1为本发明中的基于环形片段；
图2为本发明中的基因片段图像；
图3为本发明中的Wire-grip实验结果图；
图4为本发明中的Escapegoat latency实验结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种用于治疗脑损伤的基因工程药物及其制备方法，具体按照如下操作步骤：
S1：生物酶取样，抽取混合
(a)从哺乳生物抽取表达的糖基化单体金属蛋白酶；
(b)使用混合比例在1:3的还原液中，将上述的糖基化单体金属蛋白酶激活活性，使其活性达到最佳，并使用蛋白水裂解；
S2：基因转接，培育母细胞
将978bp的编码序列克隆到含有SP146启动子的载体pAAV9中以产生作为表达框架的pAAV9 SP146:ACP5；
S3：初步分离，入体实验
(a)常规包被在含有100mg/L Amp的LB板中操作转染产物，构建的质粒经测序确认并扩增生产；
(b)转染产物在8℃下25000rpm离心30分钟，获上清和沉淀：上清进入色谱分离纯化程序；
(c)采取病毒，体外实验
通过将重组腺相关病毒(rAAV)病毒注入小白鼠体内，并将上述合成的糖基化单体金属蛋白酶注入，所述病毒的编码序列为：
Gene ID:54
acid phosphatase 5；tartrate resistant(ACP5)；also known as HPAP；TRAP；TRACP5a；TRACP5b；TrATPase；
(d)将小白鼠生物体态特征记录。
实施例二
一种用于治疗脑损伤的基因工程药物及其制备方法，具体按照如下操作步骤：
S1：生物酶取样，抽取混合
(a)从哺乳生物抽取表达的糖基化单体金属蛋白酶；
(b)使用混合比例在1:2的还原液中，将上述的糖基化单体金属蛋白酶激活活性，使其活性达到最佳，并使用蛋白水裂解；
S2：基因转接，培育母细胞
将978bp的编码序列克隆到含有SP146启动子的载体pAAV9中以产生作为表达框架的pAAV9 SP146:ACP5；
S3：初步分离，入体实验
(a)常规包被在含有80mg/L Amp的LB板中操作转染产物，构建的质粒经测序确认并扩增生产；
(b)转染产物在0℃下10000rpm离心10分钟，获上清和沉淀：上清进入色谱分离纯化程序；
(c)采取病毒，体外实验
通过将重组腺相关病毒(rAAV)病毒注入小白鼠体内，并将上述合成的糖基化单体金属蛋白酶注入，所述病毒的编码序列为：
Gene ID:54
acid phosphatase 5；tartrate resistant(ACP5)；also known as HPAP；TRAP；TRACP5a；TRACP5b；TrATPase；
(d)将小白鼠生物体态特征记录。
实施例三
一种用于治疗脑损伤的基因工程药物及其制备方法，具体按照如下操作步骤：
S1：生物酶取样，抽取混合
(a)从哺乳生物抽取表达的糖基化单体金属蛋白酶；
(b)使用混合比例在1:2.5的还原液中，将上述的糖基化单体金属蛋白酶激活活性，使其活性达到最佳，并使用蛋白水裂解；
S2：基因转接，培育母细胞
将978bp的编码序列克隆到含有SP146启动子的载体pAAV9中以产生作为表达框架的pAAV9 SP146:ACP5；
S3：初步分离，入体实验
(a)常规包被在含有85mg/L Amp的LB板中操作转染产物，构建的质粒经测序确认并扩增生产；
(b)转染产物在5℃下23000rpm离心27分钟，获上清和沉淀：上清进入色谱分离纯化程序；
(c)采取病毒，体外实验
通过将重组腺相关病毒(rAAV)病毒注入小白鼠体内，并将上述合成的糖基化单体金属蛋白酶注入，所述病毒的编码序列为：
Gene ID:54
acid phosphatase 5；tartrate resistant(ACP5)；also known as HPAP；TRAP；TRACP5a；TRACP5b；TrATPase；
(d)将小白鼠生物体态特征记录。
抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP或TRAPase)，也称为ACP5，是一种在哺乳动物中表达的糖基化单体金属蛋白酶。它的分子量约为35kDa，具有碱性等电点(7.6–9.5)，在酸性条件下具有最佳活性。TRAP被合成为潜在的酶原，并通过蛋白水解裂解和还原激活。它与其他哺乳动物酸性磷酸酶的不同之处在于其对酒石酸盐的抑制作用及其分子量。
哺乳动物TRAP由一个基因编码，该基因位于人类的19号染色体(19p13.2–13.3)和小鼠的9号染色体上。正如蛋白质测序所预期的那样，TRAPDNA在整个哺乳动物纲中高度保守。人、鼠和猪的TRAP基因都包含5个外显子，并且在外显子2的开头具有ATG密码子，外显子1是非编码的。在外显子1启动子中，有三个不同的“组织特异 性”启动子：1A、1B和1C。这将允许严格控制TRAP表达。从该基因转录的是具有969-975bp开放阅读框(ORF)的1.5kbmRNA，编码323-325个氨基酸的蛋白质。在大鼠中，ORF的长度为981bp，编码327个氨基酸的蛋白质。TRAP被翻译为单个多肽。TRAP基因转录受小眼相关转录因子的调控。
重组腺相关病毒(rAAV)免疫原性极低、安全性高、宿主细胞范围广(对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力)、扩散能力强、体内表达基因时间长等，rAAV被视为最有前途的基因研究和基因治疗载体之一。重组腺相关病毒假型9，包装基因组关键结构如下：人工合成巨噬细胞特异启动子SP146驱动人ACP5基因。
病毒相关质粒：pAAV9-SP146-ACP5。
构建方法：ACP5的CDS序列由Genescript(中国苏州)合成。Infusion系统按照说明手册(Clontech)用于构建载体。载体框架和插入序列以1/1的比例混合在总体积5μL中，并以相同体积加入GeneArt TM无缝连接酶混合物，用吸管充分混合。将试管在50℃孵育完成连接，热激转染Stable3感受态细胞(E.coli)。将978bp的编码序列克隆到含有SP146启动子的载体pAAV9中以产生作为表达框架的pAAV9SP146:ACP5。常规包被在含有100mg/LAmp的LB板中操作转染产物。构建的质粒经测序确认并扩增生产。病毒生产由Genescript(中国苏州)完成，下游AAV使用AAVpro纯化试剂盒(TakaraBioUSA)纯化。
实验数据：
针对本产品或方法所取得的效果(优点)进行数据上的进一步证明。
小鼠模型：定量皮质打击器(Controlled cortical impact,CCI)是常见的用于建立啮齿类动物创伤性脑损伤(Traumatic brain injury,TBI)模型的仪器，该动物模型是公认的模拟脑损伤的模型之一。以雄性、6-8周龄的C57BL6/J小鼠为研究对象，使用CCI仪器，调整打击深度为1mm，建立小鼠TBI模型。在损伤后，通过对侧侧脑室注射的方式，分别给与2μl体积的AAV-ACP5和AAV-NC(阴性对照)治疗，在损伤后1d(1dpi)检测损伤侧脑组织中细胞死亡相关蛋白，以及炎症相关蛋白的变化；损伤后1d–20d检测相关行为学的改变。
结果：
如图2-4所示
通过免疫印迹检测损伤侧脑组织中半胱天冬氨酸酶家族的蛋白变化：经过AAV-ACP5治疗后，小鼠损伤侧脑组织中半胱天冬氨酸酶家族的蛋白表达含量明显降低，即AAV-ACP5治疗可以减轻脑外伤引起的神经细胞死亡；
通过免疫印迹检测损伤侧脑组织中炎症因子的蛋白变化：经过AAV-ACP5治疗后，小鼠损伤侧脑组织中炎症因子表达水平明显降低，即AAV-ACP5治疗可以减轻脑外伤引起的脑组织中的神经炎症。
通过相关行为学检测小鼠TBI后运动功能和学习、记忆能力的变化：经过AAV-ACP5治疗后的小鼠明显表现出更强的运动能力，更好的学习和记忆能力，即AAV-ACP5治疗可以促进TBI后运动功能，学习、记忆能力的恢复。
本发明中，脑损伤常会导致脑水肿、神经细胞死亡以及神经炎症等多种病理改变，而这些病理改变往往是同时进行。因此，目前针对这些复杂的病理过程只是对症治疗。通过检测损伤后主要死亡相关蛋白(尤其是caspase-8)以及代表性炎症因子后发现本发明可以阻断脑损伤后神经细胞死亡的发生，同时能够有效抑制炎症反应。基于此，本发明也因此能有效抑制脑损伤引起的神经元退行性改变以及脑水肿的形成。

Claims (2)

  1. 一种用于治疗脑损伤的基因工程药物及其制备方法，其特征在于：具体按照如下操作步骤：
    S1：生物酶取样，抽取混合
    (a)从哺乳生物抽取表达的糖基化单体金属蛋白酶；
    (b)使用混合比例在1:2-1:3的还原液中，将上述的糖基化单体金属蛋白酶激活活性，使其活性达到最佳，并使用蛋白水裂解；
    S2：基因转接，培育母细胞
    将978 bp的编码序列克隆到含有SP146启动子的载体pAAV9中以产生作为表达框架的pAAV9 SP146:ACP5；
    S3：初步分离，入体实验
    (a)常规包被在含有80-100mg/L Amp的LB板中操作转染产物，构建的质粒经测序确认并扩增生产；
    (b)转染产物在0-8℃下10000-25000rpm离心10-30分钟，获上清和沉淀：上清进入色谱分离纯化程序；
    (c)采取病毒，体外实验
    通过将重组腺相关病毒(rAAV)病毒注入小白鼠体内，并将上述合成的糖基化单体金属蛋白酶注入；
    (d)将小白鼠生物体态特征记录。
  2. 根据权利要求1所述的一种用于治疗脑损伤的基因工程药物及其制备方法，其特征在于：所述病毒的编码序列为：
    Gene ID:54
    acid phosphatase 5；tartrate resistant(ACP5)；also known as HPAP；TRAP；TRACP5a；TRACP5b；TrATPase。
CN202280095180.9A 2022-03-01 2022-03-11 一种用于治疗脑损伤的基因工程药物及其制备方法 Pending CN119136825A (zh)

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