CN119120399A - 一种细胞色素p450单加氧酶及其在合成手性叔醇中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种细胞色素P450单加氧酶及其在合成手性叔醇中的应用，涉及酶工程技术领域，其技术方案要点是：在所述细胞色素P450单加氧酶的催化下，催化外消旋底物形成手性的叔醇。本发明提供的细胞色素P450单加氧酶在外消旋叔碳底物制备手性叔醇的应用中表现出优异的催化效率和高选择性；其反应收率最高可达45％，产物的光学纯度最高可达99％ee，具有极高的立体选择性，这些特性使得该催化体系能够显著提高产物的纯度并降低副产物，在医药和精细化工领域具有重要应用。

Description

一种细胞色素P450单加氧酶及其在合成手性叔醇中的应用

技术领域

本发明涉及酶工程技术领域，更具体地说，它涉及一种细胞色素P450单加氧酶及其在合成手性叔醇中的应用。

背景技术

手性叔醇是一类重要的化合物，广泛存在于多种药物和生物活性天然产物中，同时它们也是合成中的多功能砌块。许多化学家和医药工作者报道了其合成方法策略，通常通过外消旋叔醇的动力学拆分和对酮的不对称亲核加成来制备手性叔醇。此外，还可以通过仲醇的直接升级来合成。然而，所有这些方法都需要在相应的C-H键上进行预氧化以形成醇或酮前体。因此，对于目标C-H键没有预氧官能团化的底物，直接进行C-H羟基化是构建手性叔醇的理想且直接的策略。C-H键非常常见，其键能高且极性小，这些因素使得C-H键具备很强的惰性。在温和条件下断裂C-H键是有机合成中最具挑战性的一类反应，因此这种手性叔醇的合成方法尚未得到充分发展。近年来，高度选择性的酶促羟基化在这一领域中显示出前景，成为一个有希望的解决方案。

生物催化剂通常具有高度的化学、区域和立体选择性，能够在温和条件下进行无毒催化反应。氧化酶和还原酶在不对称催化中表现出色，能够生成伯醇和仲醇。然而，由于叔醇的叔碳结构，酮还原酶无法合成手性叔醇。具有优异C-H键羟化性能的P450酶则提供了一种可行的手性叔醇合成方案。细胞色素P450单加氧酶(P450)是一种含血红素的酶超家族，在生物体内次生代谢物的生物合成或外源性物质的代谢中发挥重要作用。P450通常作为单加氧酶，在常压下利用分子氧作为更环保的氧化剂，并在催化过程中表现出惊人的区域和立体选择性。P450酶是研究最广泛的加氧酶，已有报道显示P450酶可催化超过40种不同类型的反应。

目前，关于P450酶合成叔醇的文献主要限于一些具有单一结构底物的天然产物基因合成簇，如25-羟基维生素D3和mycinamicinV，而外消旋叔碳底物的羟基化未被广泛研究。要实现这种反应，需要克服叔碳的三个非氢原子基团引起的空间位阻效应，并实现外消旋底物内的单结构动力学拆分。张入月等人报道了使用P450PL2及其突变体通过C-H羟化反应合成手性叔醇的方法。然而，该方法仅限于实验室规模，且存在羟化酶活力低和产物浓度不高等问题，不适合工业化生产手性叔醇。

因此，筛选活力高，且能在较短时间内获得较高产物浓度的细胞色素P450单加氧酶，以满足工业化生产手性叔醇的需求具有非常重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种细胞色素P450单加氧酶及其在合成手性叔醇中的应用，以解决现有技术中生物催化制备手性叔醇的反应中，酶活力偏低、步骤繁琐和产物浓度不够高等问题。

本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种细胞色素P450单加氧酶，所述细胞色素P450单加氧酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述细胞色素P450单加氧酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的另一目的是提供一种如上述的细胞色素P450单加氧酶在合成手性叔醇中的应用，具体包括：在缓冲液中，在所述细胞色素P450单加氧酶的催化下，催化外消旋底物形成手性的叔醇。

进一步地，所述的缓冲液为磷酸盐浓度为0.05mol/L的磷酸盐缓冲液。

进一步地，所述外消旋底物的浓度为1～50mmol/L。

进一步地，所述细胞色素P450单加氧酶的用量为1～5kU/L。

进一步地，所述的细胞色素P450单加氧酶的添加形式为含有细胞色素P450单加氧酶的重组整细胞、粗酶液或冻干细胞。

本发明的又一目的是提供一种含有上述细胞色素P450单加氧酶的蛋白重组菌细胞。

本发明的还一目的是提供一种携带编码上述细胞色素P450单加氧酶的基因的载体。

本发明的再一目的是提供一种表达上述细胞色素P450单加氧酶的重组菌。

通过采用上述技术方案，本发明通过采用本发明提供的技术方案，细胞色素P450单加氧酶作为催化剂，反应的收率最高可达到45％，意味着在反应过程中大部分底物能被成功转化为目标产物，产物的光学纯度最高可达到99％ee(对映体过量)，这表明产物中几乎全为一种手性形式，具有极高的立体选择性，对手性药物和其他手性化合物的制备尤为重要；

本发明的反应不仅具有高立体选择性，还具有优异的区位选择性，确保反应发生在目标位置而不是产生副产物，这对于复杂分子的合成尤为重要，本发明的底物浓度高，这意味着可以在较高浓度下进行反应，提高了反应效率，减少了溶剂的使用量，降低了成本；本发明的反应条件温和，这不仅有助于保护底物和产物的结构完整性，还降低了能耗，提高了反应的安全性和可操作性；

本发明的催化过程对环境友好，不产生有害副产物，符合绿色化学的原则，有助于减少环境污染，并且操作简便，反应体系易于控制和调节，适合大规模工业生产，减少了对复杂设备和操作的需求，使得本发明所述的细胞色素P450单加氧酶及其基因具有广泛的工业应用前景，可以用于制备高附加值的手性化合物，如药物中间体、农药及其他精细化学品，由于其高效、安全、环保的特点，该技术有望在工业界得到广泛推广和应用。

综上所述，本发明具有以下有益效果：

1.本发明提供的细胞色素P450单加氧酶在外消旋叔碳底物制备手性叔醇的应用中，表现出优异的催化效率，反应的收率最高可达45％，高收率意味着在相同反应条件下，可以获得更多的目标产物，从而提高生产效率，降低生产成本；本发明的产物的光学纯度最高可达99％ee，说明本发明的催化体系具有极高的立体选择性，高光学纯度的手性叔醇在医药和精细化工领域具有重要应用，能够显著提高产物的纯度并降低副产物；

2.本发明反应过程中表现出良好的立体和区位选择性，确保了产物结构的单一性和纯度，高选择性减少了副产物的生成，简化了后续的分离纯化步骤；本发明的反应条件温和，条件易于控制，适合工业化生产，且对设备和操作人员要求较低，有利于大规模应用推广；

3.本发明提供的细胞色素P450单加氧酶可以以重组整细胞、粗酶液或冻干细胞的形式添加，操作简便，易于储存和运输，降低了生产过程中的复杂性和成本；本发明所述的细胞色素P450单加氧酶及其基因具有很好的工业应用开发前景，能够显著提高手性叔醇的工业化生产水平。

附图说明

图1为本发明实施例1中细胞色素P450单加氧酶催化合成手性叔醇产物的合成路径图。

图2为本发明实施例3中反应制备的手性(R)-2-苯基-1,2-丙二醇的液相分析谱图。

图3为本发明实施例4中反应制备的手性(S)-3-羟基-3-苯基丁腈的液相分析谱图。

图4为本发明实施例5中反应制备的手性(R)-1-氯-2-苯基-2-丙醇的液相分析谱图。

具体实施方式

以下结合附图1-4对本发明作进一步详细说明，下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。其中所述室温为本领域常规室温，室温范围是20～40℃。

实施例1：一细胞色素P450单加氧酶重组质粒和重组表达转化体的制备

为了优化SEQ ID NO.2所述的氨基酸序列，使其更加适合在大肠杆菌中表达，我们按大肠杆菌的密码子偏好进行了核苷酸序列的优化，得到优化后的基因核苷酸序列SEQ IDNO.1，将优化后的基因SEQ ID NO.1进行全基因人工合成，并连接至大肠杆菌表达载体pET28a上，构建得到重组表达质粒pET28a-P450，具体步骤如下：

基因优化和合成：根据大肠杆菌的密码子偏好，对SEQ ID NO.2所述的氨基酸序列进行优化，得到核苷酸序列SEQ ID NO.1，通过全基因人工合成方法合成优化后的基因SEQID NO.1；

质粒构建：将合成的SEQ ID NO.1基因片段插入大肠杆菌表达载体pET28a，得到重组表达质粒pET28a-P450；

转化与筛选：将构建好的重组表达质粒pET28a-P450转化至大肠埃希氏菌E.coliBL21(DE3)感受态细胞中，将转化液涂布到含有卡那霉素的LB平板上，在37℃条件下倒置培养过夜，筛选出抗性菌落；

克隆验证：通过菌落PCR对筛选出的菌落进行初步筛选，挑选出阳性克隆，对阳性克隆进行基因测序验证，确认重组质粒pET28a-P450在E.coli BL21(DE3)中的正确插入和表达。

实施例2：细胞色素P450单加氧酶的表达

将实施例1中获得的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-P450，按照以下步骤进行培养和诱导表达：

种子培养：将重组大肠杆菌接种至含浓度为50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，LB培养基成分为：蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，NaCl 10g/L，pH 7.0，在37℃、250rpm条件下振荡培养过夜，使菌液充分生长；

扩大培养：第二天，将过夜培养的种子液按1％(v/v)的接种量接种到装有100mLLB培养基的500mL三角瓶中，上述LB培养基同样含有卡那霉素50μg/mL，在37℃、250rpm条件下继续振荡培养，直至培养液的OD600值达到0.6左右，这通常需要大约2-3小时；

诱导表达：当OD600值达到0.6时，向培养液中加入终浓度为0.1mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，作为诱导剂，诱导P450单加氧酶的表达，将诱导后的培养体系在25℃、250rpm条件下继续振荡培养12小时，使重组蛋白充分表达；

菌体收集：12小时后，将培养液通过离心机进行离心收集，离心条件设定为4℃、5000rpm，离心时间为10分钟，离心后，弃去上清液，收集沉淀的重组菌细胞，这些细胞中含有表达的P450单加氧酶蛋白；

保存与应用：收集的重组菌细胞可以直接用于后续的生物催化反应，或者根据需要进行进一步处理，如冻干保存或制备粗酶液；

通过上述步骤，可以成功培养和诱导表达含有P450单加氧酶的重组大肠杆菌细胞，为手性叔醇的生物催化合成提供高效的催化剂来源，细胞色素P450单加氧酶催化合成手性叔醇产物的合成路径图如附图1所示。

实施例3：P450单加氧酶重组细胞催化2-苯基-1-丙醇合成手性(R)-2-苯基-1,2-丙二醇，合成路径如下式1所示：

式1：

在一个500mL的三角烧瓶中，加入100mL磷酸盐缓冲液。该缓冲液的浓度为50mM，pH值调整至8.5，以确保适合的反应环境，在该缓冲液中添加重组细胞，细胞干重浓度(cdw)为20g/L，这些重组细胞含有表达的P450单加氧酶，可以催化目标反应；向三角烧瓶中加入终浓度为50mM的2-苯基-1-丙醇，作为反应底物。确保底物均匀分布在缓冲液中，将三角烧瓶放置在30℃的恒温摇床上，设定振荡速度为250rpm。此条件下进行搅拌反应，以确保充足的氧气供应和反应物的均匀混合，反应持续时间设定为24小时，确保底物充分转化为目标产物；

反应结束后，将反应液取出，利用离心机进行离心处理，离心条件设定为4℃、8000rpm，离心时间为10分钟，以沉淀并除去细胞菌体；离心后，弃去沉淀的菌体，收集上清液，准备进行后续的产物提取；将分离得到的上清液用100mL乙酸乙酯进行萃取，每次萃取充分振荡混合后静置分层，进行三次萃取，以确保产物的充分提取，将每次萃取得到的有机相分离后合并到一个容器中；合并的有机相用无水硫酸钠进行干燥，吸附有机相中的水分，静置一段时间以确保充分干燥，干燥后，通过滤纸过滤，将有机相中的无水硫酸钠去除，收集干燥后的滤液；

将过滤得到的滤液通过减压蒸馏进行浓缩，减压蒸馏的目的是去除乙酸乙酯溶剂，浓缩目标产物，浓缩过程中需控制温度和压力，以防止目标产物的降解；最终，通过减压蒸馏得到目标产物(R)-2-苯基-1,2-丙二醇，该产物的产率为47％，光学纯度(对映体过量，ee值)为96％，表示产物具有较高的光学纯度；并通过液相色谱(HPLC)分析验证反应制备的手性(R)-2-苯基-1,2-丙二醇的纯度和组成，其液相分析谱图如附图2所示，液相色谱分析可以确定产物的纯度和光学纯度，确保实验结果的准确性。

实施例4：P450单加氧酶重组细胞催化3-苯基丁腈合成手性(S)-3-羟基-3-苯基丁腈，合成路径如下式2所示：

式2：

在一个500mL的三角烧瓶中，加入100mL磷酸盐缓冲液。该缓冲液的浓度为50mM，pH值调整至8.5，以确保适合的反应环境，在该缓冲液中添加重组细胞，细胞干重浓度(cdw)为20g/L，这些重组细胞含有表达的P450单加氧酶，可以催化目标反应；向三角烧瓶中加入终浓度为50mM的3-苯基丁腈，作为反应底物，确保底物均匀分布在缓冲液中；将三角烧瓶放置在30℃的恒温摇床上，设定振荡速度为250rpm，此条件下进行搅拌反应，以确保充足的氧气供应和反应物的均匀混合，反应持续时间设定为24小时，确保底物充分转化为目标产物；

反应结束后，将反应液取出，利用离心机进行离心处理，离心条件设定为4℃、8000rpm，离心时间为10分钟，以沉淀并除去细胞菌体，离心后，弃去沉淀的菌体，收集上清液，准备进行后续的产物提取；将分离得到的上清液用100mL乙酸乙酯进行萃取，每次萃取充分振荡混合后静置分层，进行三次萃取，以确保产物的充分提取，将每次萃取得到的有机相分离后合并到一个容器中；合并的有机相用无水硫酸钠进行干燥，吸附有机相中的水分，静置一段时间以确保充分干燥，干燥后，通过滤纸过滤，将有机相中的无水硫酸钠去除，收集干燥后的滤液；

将过滤得到的滤液通过减压蒸馏进行浓缩，减压蒸馏的目的是去除乙酸乙酯溶剂，浓缩目标产物，浓缩过程中需控制温度和压力，以防止目标产物的降解；最终，通过减压蒸馏得到目标产物(S)-3-羟基-3-苯基丁腈，该产物的产率为46％，光学纯度(对映体过量，ee值)为99％，表示产物具有极高的光学纯度；本发明通过液相色谱(HPLC)分析验证反应制备的手性(S)-3-羟基-3-苯基丁腈的纯度和组成，其液相分析谱图如附图3所示，液相色谱分析可以确定产物的纯度和光学纯度，确保实验结果的准确性。

实施例5：P450单加氧酶重组细胞催化(1-氯-2-丙基)苯合成手性(R)-1-氯-2-苯基-2-丙醇，合成路径如下式3所示：

式3：

反应准备：在一个500mL的三角烧瓶中，加入100mL磷酸盐缓冲液,该缓冲液的浓度为50mM，pH值调整至8.5，以确保适合的反应环境，在该缓冲液中添加重组细胞，细胞干重浓度(cdw)为20g/L，这些重组细胞含有表达的P450单加氧酶，可以催化目标反应；

底物添加：向三角烧瓶中加入终浓度为50mM的(1-氯-2-丙基)苯，作为反应底物，确保底物均匀分布在缓冲液中；

反应条件设置：将三角烧瓶放置在30℃的恒温摇床上，设定振荡速度为250rpm，此条件下进行搅拌反应，以确保充足的氧气供应和反应物的均匀混合，反应持续时间设定为24小时，确保底物充分转化为目标产物；

反应终止与分离：反应结束后，将反应液取出，利用离心机进行离心处理，离心条件设定为4℃、8000rpm，离心时间为10分钟，以沉淀并除去细胞菌体，离心后，弃去沉淀的菌体，收集上清液，准备进行后续的产物提取；

产物提取：将分离得到的上清液用100mL乙酸乙酯进行萃取，每次萃取充分振荡混合后静置分层，进行三次萃取，以确保产物的充分提取，将每次萃取得到的有机相分离后合并到一个容器中；

有机相处理：合并的有机相用无水硫酸钠进行干燥，吸附有机相中的水分，静置一段时间以确保充分干燥，干燥后，通过滤纸过滤，将有机相中的无水硫酸钠去除，收集干燥后的滤液；

产物浓缩：将过滤得到的滤液通过减压蒸馏进行浓缩，减压蒸馏的目的是去除乙酸乙酯溶剂，浓缩目标产物，浓缩过程中需控制温度和压力，以防止目标产物的降解；

目标产物获取：最终，通过减压蒸馏得到目标产物(R)-1-氯-2-苯基-2-丙醇，该产物的产率为44％，光学纯度(对映体过量，ee值)为94％，表示产物具有较高的光学纯度；

分析与验证：通过液相色谱(HPLC)分析验证反应制备的手性(R)-1-氯-2-苯基-2-丙醇的纯度和组成，其液相分析谱图如附图4所示，液相色谱分析可以确定产物的纯度和光学纯度，确保实验结果的准确性。

本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (9)

1.一种细胞色素P450单加氧酶，其特征是：所述细胞色素P450单加氧酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述细胞色素P450单加氧酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.如权利要求1所述的细胞色素P450单加氧酶在合成手性叔醇中的应用，其特征是：具体包括：在缓冲液中，在所述细胞色素P450单加氧酶的催化下，催化外消旋底物形成手性的叔醇。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征是：所述的缓冲液为磷酸盐浓度为0.05mol/L的磷酸盐缓冲液。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征是：所述外消旋底物的浓度为1～50mmol/L。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征是：所述细胞色素P450单加氧酶的用量为1～5kU/L。

6.根据权利要求2所述应用，其特征是：所述的细胞色素P450单加氧酶的添加形式为含有细胞色素P450单加氧酶的重组整细胞、粗酶液或冻干细胞。

7.一种含有权利要求1所述的细胞色素P450单加氧酶的蛋白重组菌细胞。

8.一种携带如权利要求1所述的编码细胞色素P450单加氧酶的基因的载体。

9.一种表达如权利要求1所述的细胞色素P450单加氧酶的重组菌。