CN119056579A - 液体处理器的尖端中的珠子操作方法及装置 - Google Patents

Abstract

本发明涉及可通过施加静电场、磁场或电磁场来精确、快速且容易操作珠子的装置及方法。该方法尤其对执行存在于流体的珠子与残留悬浮液之间的分离有用，从而使液体处理用尖端中的收集及纯化效率最大化。

Description

液体处理器的尖端中的珠子操作方法及装置

技术领域

本发明涉及化学、生物及生化工序或反应的自动化领域。更加具体地，本发明公开从液体处理系统的尖端或孔(orifice)中分离磁性粒子及非磁性粒子的装置及方法。

背景技术

微粒及纳米粒子的使用在生物传感用、医学治疗中的药物传递变形、抗体及蛋白质的生物分离纯化及筛选等医疗及生物学应用等诸多技术应用中受到很大的关注。

通常，在本申请中，将可在外力的影响下选择性地输送一个以上特定成分的数埃到数毫米的标签、条形码、分子信标、海绵或粒子规定为“珠子”。

尤其，磁分离技术正在成为DNA测序的核心部分。实际上，磁分离技术不仅是比较低廉且可扩展的优秀的方法，而且与类似方法相比提供许多优点，例如对样本施加极少的机械应力，具有高回收效率以及纯化样本等。

磁珠因粒子外部表面的适当涂层而用作蛋白质、细胞、抗体、抗原及核酸的载体。实际上，为了结合和捕获目标靶分析物，磁珠需要涂敷有与上述靶特异结合的配体。配体类型的选择将完全依靠需要捕获的靶分子。

上述珠子的中心芯具有磁性，并且起到响应于外部磁场的作用。由于金属氧化物通常比纯金属的氧化更加稳定，因而优选。上述珠子可根据上述磁芯的大小具有单畴或多畴结构。珠子的大小主要对矫顽力产生影响，珠子越小，则矫顽力越小。尤其，5～15nm左右的纳米粒子具有超顺磁性，相反，微粒具有强磁性。

上述珠子的磁性及物理特性根据需要使用磁性粒子的用途来选择。纳米粒子具有当磁场被去除时不出现残留磁力的优点，并且，因磁力过于小而由粘性力占支配地位，这表示上述粒子的分离和移动更加困难。

通常，磁性分离可通过与磁极的结合非常弱的珠子(顺磁性)、对磁化的灵敏度高的珠子(强磁性)、相对于被施加的磁场朝向180度方向磁化(抗磁性)的珠子或表现出超顺磁性行为的强磁性纳米粒子来进行。

对于磁珠分离，第一步骤为使上述样本结合在上述珠子的外部涂层。含有上述靶分析物的溶液被分配到磁珠缓冲液中。通常，为了提高磁珠与分析物之间的结合效率而进行液体混合。

根据以下式通过施加可产生力量的外部磁场来使珠子移动，由此实现上述分析物的分离。

若仔细观察上述式，则可知磁力依靠磁场的梯度和珠子的磁矩。

若施加磁场，则上述磁珠被磁化并开始形成沿着磁场梯度方向移动的簇。根据上述珠子的定量和尺寸、磁场梯度的强度及上述溶液的粘度，在规定时间之后，上述磁珠在依靠上述磁场线的受限区域中被颗粒化。

此时，通过从残留溶液分离上述珠子来实现上述样本的分离。通常，排出残留溶液或将上述磁珠簇移动到其他容器中。

接着，为了从上述磁珠分离分析物，在溶液中浸渍上述磁珠。为了优化从上述珠子收集上述样本，可能需要使珠子再悬浮，这表示克服磁珠之间的分离力。最终，上述磁珠为了收集此时的含有靶分析物的上清液而再次分离。

上述磁珠分离的效率主要依靠在工序结束时收集到的起始样本的量(收集效率)及分离技术中所要去除的多余物质的存在(纯化效率)。

发明内容

本发明涉及精确、快速且易于使用的用于操作珠子的装置及方法。该方法特别适用于进行珠子与流体中所存在的残留上清液之间的分离，并使液体处理用尖端中的收集及纯化效率极大化。

液体处理用尖端通常用作可在流体与液体处理系统(“液体处理器”或“移液管”)之间进行去除或永久接口。在特定实施方式中，上述尖端可表示含有由液体处理器吸入并分配的流体的结构要素。在本公开中，上述尖端包括通常用于液体处理及生物学或化学反应领域的其他微孔板、管、针、注射器、真空采血器、过滤器、容器、毛细管及流体通道。尖端可被视为一次性使用时(通常用于防止污染)的一次性尖端，多次重复使用时的永久尖端。

液体处理器为可分批选定量的试剂、样本或其他流体的手工配件或自动系统。液体处理器包括在液体处理及生物学或化学反应领域中通常所使用的其他手动移液管、注射器、泵、阀、工作台、毛细管、微流体通道及液体分配器。

在本申请中，液体处理器包括可吸入及分配样本的装置(称之为移液器)以及以规定量从储存室中分配特定等份(aliquot)的流体的装置(称之为分配器)。由此，本申请中公开如下在移液器与分配器之间的特定等级的液体处理器，即，可进行从通过相同的尖端在上述尖端收集样本到对一个以上的流体的冲洗，可在移液器与分配器之间切换工作方式，并且被称为分配器。

在本申请中，将分离定义为可使珠子在流体内均匀内分散或使珠子聚集在流体内部或外部的特定位置的对珠子进行的工序。

因此，在本发明的一实施方式中，提供在液体处理器的尖端内分离珠子的方法。上述方法包括可向引起分离的珠子施加力量的静电、电力学、电磁、声音、机械、重力、核、磁或热源。一旦形成珠簇，则可通过从尖端仅排出残留流体来实现分离。

在本发明的再一实施方式中，在从尖端自身排出流体的期间内，向珠簇施加外力，使得珠簇停留在上述尖端的内部。

在本发明的另一实施方式中，将尖端设计为在排出流体的期间内无法使珠簇脱离上述尖端。

在本发明的还有一实施方式中，一旦珠子被颗粒化，则流体以受控的流速排出，以防止发生剪切力大于珠簇的聚集力的流体动态湍流。

在本发明的又一实施方式中，可通过液体处理器的作用及同时、依次、独立或配位中的一个外力进行移动来分离形成流体的珠子。上述分离可在液体处理器或与通常的吸入或分配装置相连接的容器内发生。上述连接可以为永久性的或可以解除，可借助电磁、声音、热量、重力或磁力等外力通过机械接触或非接触来实现。

在本发明的又一实施方式中，含有样本的珠子在分配器的尖端内被吸入之后分离，切换到上述分配器的分配器模式可以进行珠子的清洗步骤或洗脱或染色。

在本发明的又一实施方式中，珠子通过负责珠子颗粒化的外力的变化来移动。这种变化可简单地通过尖端相对于外力场的位移或外力场的变化来实现。

在本发明的又一实施方式中，尖端被珠子及不同流体的层来填充。通过使上述珠子从流体向其他流体移动，来在上述尖端内实现一个以上物质的混合或浓度变化。

在本发明的又一实施方式中，附设流体、油、凝胶或溶液的追加层，以使在层之间的扩散最小化，这应在上述珠子因流体的密度、极性、混溶性及其他化学及物理特性的差异而从流体溶液分离的期间内经过。

在本发明的又一实施方式中，尖端可以预先加载可以为磁性或非磁性的珠子。空间分离通过可使流体渗透但无法使珠子渗透的膜来实现。

在本发明的又一实施方式中，为了排出或不排出样本溶液，或利用新的流体填充尖端并使珠簇再悬浮，在尖端内部发生流体动态湍流。

在本发明的又一实施方式中，清洗作用直接在尖端内部进行，以去除珠簇中多余物质的残留物。

在本发明的又一实施方式中，洗脱步骤在尖端内部进行，以允许去除附着于珠子的分析物。

在本发明的又一实施方式中，珠子在尖端内部干燥，以去除用于珠子的清洗或洗脱的洗脱液、溶剂或任意种类的流体。上述干燥可通过流体的移动或尖端外部或内部环境的温度变化来实现。

附图说明

图1示出可使用液体处理器或移液管尖端来分离磁珠的形状的简要场景。

图2示出在液体处理器的尖端内部分离磁珠的简要场景。

图3的(a)部分及图3的(b)部分示出以在尖端排出流体的期间内维持珠簇的方式优化的尖端的设计例。

图4示出尖端内部中珠簇的位移。上述簇从位于尖端内部的流体取出。

图5示出液体处理器的尖端内部中的清洗步骤。

图6示出预先加载于尖端内部的珠子和使用膜来分离珠子的状态。

图7示出从移液管尖端去除清洗缓冲液的残留物的简要场景。

图8为示出在收集珠子的期间内进行动态扫描的简要场景。

图9示出对于珠子的收集及尽可能优化的磁结构尽可能优化的磁场分布的图表。

图10示出对于使用与珠簇相接触来使液体移动的气隙的简图。

图11示出可在移液管尖端内部反复收集珠子的简要场景。

图12示出在通过本公开的装置来纯化的PCR生成物中完全去除引物污染物质的状态。

图13示出在通过本公开的装置来洗涤的最终PCR生成物中没有珠子污染的状态。

图14示出根据本公开来进行的样本回收效率。

图15示出本公开的磁分离的工作流程。

具体实施方式

本发明除了涉及上述多种用途之外，还涉及珠子的操作。为了例示的目的，附图及说明通常涉及用于处理在液体处理器的移液管尖端中磁珠的操作的解决方案的装置及方法。但是，本发明中所公开的方案在分离的领域中可同样适用于更为一般的实施方式。

对液体处理器尖端中磁珠的位移及颗粒化的一般描述

图1示出使用液体处理器来分离磁珠和液体溶液的通常所使用的实例。珠子101在容器102的底部被颗粒化，移液管尖端103吸入不含样本的液体104。为了维持高收集效率及纯化效率，移液管尖端的位置非常重要。若上述移液管尖端在进行吸入时过于靠近磁珠簇，则含有样本的珠子的一部分可能被移液管尖端吸入，因而导致收集效率的下降。若上述移液管尖端未充分靠近上述珠簇，则多余物质未从样本适当地分离，因而导致纯化效率的下降。

磁珠的操作可利用均质或非均质磁场来实现。接着，能够以簇的形态分离特定数量的珠子来使珠子在在液体处理器的尖端内部及外部移动。图2示出可在液体处理器的尖端操作磁珠的方法及装置。在图2a中，样本及磁珠201容纳于容器202中。为了优化通过液体处理器203的尖端的液体吸入而可以优化上述容器。在初始阶段，如图2的(b)部分及图2的(c)部分所示，上述尖端浸渍于样本，上述流体被液体处理器吸入，从而部分或完全填充上述尖端。然后，如图2的(d)部分所示，通过永磁铁、电磁铁或任意磁场源204向由上述尖端含有的液体施加磁力。在上述磁力的影响下，上述磁珠开始沿着磁场移动，从而生成含有分析物的簇205。此时，如图2的(e)部分所示，只有流体从上述尖端排出。

在一实施方式中，当从尖端排出流体时，珠簇通过外部磁场实现颗粒化，并维持停止状态。

在再一实施方式中，尖端的形状、尺寸、材料或其他化学或物理特可以适于在分离后分配多余的流体时防止珠簇的排出。在此情况下，可向珠簇施加或不施加磁场。图3的(a)部分示出设计成具有珠簇303用捕集器302的尖端301的例，相反，图3的(b)部分示出具有孔305的尖端304，其中，上述孔305设计成阻断簇珠子306从尖端排出，但允许上述流体从上述尖端进出。

在另一实施方式中，在不使用或使用外力的情况下适当地设计或选择珠子，使得它们的矫顽力及聚集力大于通过从尖端排出流体来生成的湍流。

对于具有多层流体的液体处理器尖端中的磁珠的位移及颗粒化的一般描述

在本发明的一实施方式中，通过液体处理器的作用及外力从流体取出珠簇。在图4中，连续图像示出磁力源401与尖端402之间的相对位移如何使尖端内部的簇珠403移动。通过这种移动，可从流体404完全移出上述珠簇。在此情况下，通过从上述尖端排出流体来生成的湍流不会对上述珠簇的位置和原来的形状(状态)产生影响。

在再一实施方式中，在吸入含有珠子或分析物的溶液之前，规定量的一个以上的流体、凝胶或溶液被吸入到尖端内部。为了使在从流体溶液分离时珠子所要经过的势垒最小化，可根据目的来选择上述层。

在另一实施方式中，通过精确控制可由液体处理器吸入或分配的体积量，可以在吸入上述珠子之前、之后或期间内在尖端追加或去除由流体、凝胶或溶液制成的层。

在还有一实施方式中，气垫在特定流体的吸入之前或之后附设于尖端。这种气垫的目的在于在尖端的连续流体层之间尽可能使扩散、混合或污染最小化。

对于在液体处理器尖端中珠子的清洗步骤的一般描述

为了提高分离的纯化效率，可以执行一次或多次清洗步骤，以去除在排出流体之后仍然存在的多余物质或流体。图5示出可用于在尖端清洗磁珠的方法及装置。在图5的(a)部分中，示出液体处理器的尖端501，含有预先颗粒化的珠子502的簇。图5的(b)部分示出在吸入时进入尖端的清洗缓冲液503，上述珠簇浸渍于清洗缓冲液中。

在一实施方式中，当进行清洗步骤时，珠子维持颗粒化，清洗缓冲液简单地被吸入一次或多次并被分配。

在另一实施方式中，如图5的(c)部分所示，为了提高可捕集到珠簇内部的多余物质的去除效率而再悬浮，簇504的珠子分散于流体505内并从尖端表面分离。在此情况下，如图5的(d)部分所示，需要重新生成珠簇506，含有多余物质507的清洗缓冲液从尖端排出(图5的(e)部分)。

对于在液体处理器尖端中对具有预先加载的缓冲液的珠子的清洗步骤的一般描述

在一实施方式中，清洗缓冲液能够以准备好在流体排出后使用的流体层的形态预先加载(例如，预吸入)于尖端内部。

在另一实施方式中，将分配器切换到分配模式，从而清洗及洗脱缓冲液通过尖端进行冲洗。

对于在液体处理器尖端中对珠子的干燥的一般描述

在一实施方式中，为了去除任何可能污染分析物的残留清洗缓冲液或多余物质，对珠子进行干燥。

在再一实施方式中，加热含有珠子的尖端，以提高珠子的干燥。在另一实施方式中，通过尖端冲洗气体，以排出液体。根据适用条件，上述气体可以为冷气、暖气、热气或室温。

对于在尖端内部磁珠再悬浮的一般描述

在一实施方式中，磁珠的再悬浮通过因进出液体处理器的尖端的流体而发生的湍流来进行。可以优化上述流体流速以提高剪切力的效果并超过珠簇的聚集力。

在再一实施方式中，尖端适当地设计成提高并增加因在尖端内部移动的流体而发生的剪切力的效果。

在另一实施方式中，为了使珠子再悬浮，直接向尖端或珠簇施加外部磁力、声音、电磁、机械或热力。

对于在尖端内部洗脱珠子的一般描述

在本发明的一实施方式中，通过吸入所需洗脱缓冲液来在尖端内部直接执行对与珠子相结合的分析物的洗脱，上述洗脱缓冲液需要润湿珠子。

在另一实施方式中，在使珠子与洗脱缓冲液相接触之后执行珠簇的再悬浮。上述珠子的再悬浮可以发生在液体处理器的尖端内部或其他容器的内部。

对于使用预先加载的尖端的珠子分离的一般描述

在本发明的再一实施方式中，如图6的(a)部分所示，尖端可以预先加载可以为磁性或非磁性的珠子。上述尖端含有对于样本溶液602具有渗透性但对于珠子603无渗透性的膜601。图6的(b)部分示出在吸入样本溶液之后的尖端。分析物在具有选择性的膜的上端与珠子相结合。为了从残留流体溶液606分离含有上述样本605的珠子，液体处理器简单地从上述尖端排出流体。上述膜选择性地生成对珠子的屏障，相反，上述溶液可从上述尖端排出。

为了从珠子收集上述样本，需要对起到从珠子分离分析物作用的溶液进行吸入。当连续分配时，由于膜对分析物具有渗透性，因而除了珠子之外的分析物从尖端排出。

对于进出磁场的最佳轨迹的一般描述

通常，通过作用于珠子的外力的变化来实现珠子的移动。例如，这种力量的变化可通过激活电磁铁来实现。

在其他实例中，施加于珠子的力量的变化通过使尖端位移的简单的工序来实现。尖端到外部静电场的轨迹可能对上述珠子在流体内被收集和分配的方式产生影响。

在本发明的一实施方式中，对进出磁场的轨迹进行了优化，以防止珠簇的非定域化或珠子的多余的再悬浮。接近磁力源的轨迹被设计成遵循磁场线。类似地，为了防止珠簇的扰动，脱离轨迹被设计成遵循磁场线或沿直角方向移动。

例如，在上述珠子通过外力对抗尖端壁来处于推出簇的静止状况的情况下，虽然上述外力的强度发生变化，但尖端以维持相同方向的方式进行移动，这可有利于尖端壁的聚集体的持续，但外力通过变更方向从壁推出珠子的移动可有利于再悬浮。并且，场快速收敛的区域有利于簇的聚集，相反，发散区域可有利于簇的再悬浮。

对于最佳去除清洗缓冲液的残留物的一般描述

通常，洗脱步骤之前的磁珠应该没有清洗缓冲液。实际上，清洗缓冲液的小污染也可能妨碍对分析物的后续分析。若仅通过干燥上述磁珠的工序则可能并不充分，尤其可能是相对长的工序。为了在珠子分离工序后确保未受污染的分析物，在洗脱步骤之前去除移液管尖端内部和外部的缓冲液残留物。

在图7中，连续图像示出移液管尖端701如何从存在于尖端内部703及尖端表面外部704的清洗缓冲液的残留物洗涤珠子702。通过预先吸入规定体积的擦拭流体706来去除存在于上述移液管尖端内部及外部的清洗缓冲液残留物。

通常，以在尖端内部使擦拭流体的柱高度小于珠子被颗粒化的高度的方式选择体积量。

即便如此，尤其在确认到珠子与擦拭流体之间的惰性的情况下，可使用任何量的擦拭流体体积。可通过从移液管尖端707吹扫擦拭流体来去除清洗缓冲液。

在一实例中，移液管尖端为了从尖端的外部表面去除清洗缓冲液的残留物而浸渍于擦拭流体705中。在再一实例中，可通过使移液管尖端在溶液中移动来优化清洗缓冲液残留物的去除。在另一实例中，尖端浸渍于擦拭流体中，通过引起搅拌器、混合器、超声波粉碎机、振荡器或移液管尖端周围流体的湍流或层流的任意装置来优化清洗缓冲液残留物的去除。

对于保管含有珠簇的移液管尖端的一般描述

在再一实例中，将含有颗粒化珠子的尖端从移液管去除并为了分析物的后续或并行处理而储存于适当的支架(rack)。含有尖端的支架可具有固定或可变的磁场，以维持珠子的颗粒化。

在另一实例中，含有颗粒化的珠子且被储存的尖端在清洗步骤之后经过干燥清洗缓冲液的工序。上述珠子的干燥可通过流体的移动、尖端外部或内部环境的温度变化或电磁照射来实现。

对于用于防止样本之间的交叉污染的珠子的移动的一般描述

通常，磁力取决于与磁铁的距离。因此，为了使收集效率极大化，移液管尖端应尽可能靠近磁铁。但是若即便如此也需要防止样本之间的交叉污染，则磁铁与尖端之间可能无法接触。通常，在吸入和分配时，尖端的一部分浸渍于含有分析物的流体中，这可取决于吸入的液体量。因此，浸渍于溶液的尖端部分的外部表面可以搬运可能污染磁铁表面的液体残留物。若上述尖端为了使收集效率而与磁铁相接触，则可能发生样本之间的交叉污染。若上述磁铁在液体处理操作时仅与未浸渍于液体的尖端的一部分相接触，则存在可防止样本之间的交叉污染的简单的解决方案。

在一实例中，为了不引起污染问题且使收集效率极大化，颗粒化的珠子通过使用外部磁场来沿着移液管尖端进行扫集，以在不浸渍于液体的状态安全地到达可与磁铁相接触的尖端的一部分。

其他实例中，含有珠子的液体被吸入到移液管尖端内部，以到达在液体处理操作时不浸渍于液体的尖端的位置。连续性地，珠子的颗粒化在尖端内部的相同的位置发生。

其他实例中，为了去除任何可能存在的污染，对以与移液管相接触的方式配置的磁铁的表面进行洗涤。

珠子收集过程中对移液管尖端的动态扫描的一般描述

其他实例中，移液管尖端对于磁铁位置的动态扫描来执行珠子的收集。实际上，作为磁珠之间的协作的相互作用用于提高在整个尖端对它们的收集。在图8中，连续图像示出移液管尖端801对于磁铁802的动态扫描，上述磁铁802通过使用珠簇803来收集作为在样本溶液内部残留且流动的珠子804。

对于优化的磁场梯度的一般描述

在其他实例中，设计磁场的梯度的目的在于，通过利用磁场的不同分布的组合来优化磁珠的收集效率。尤其，为了在小区域集中珠子，可使用磁场分布中的一个或组合，以生成小型簇，相反，磁场分布中的一个或组合可用于收集存在于整个移液管尖端的珠子，并在总磁场梯度最大的区域中使它们移动。

图9中示出可沿着移液管尖端的垂直轴优化的磁场的梯度。

对于在移液管尖端内部对珠子进行再悬浮及混合的一般描述

通常，通过在容器与移液管尖端之间反复移动液体及磁性材料的混合物来在移液管尖端的外部执行磁珠的再悬浮及混合。即便如此，这种方法可能引起珠子的损失或对外部因素的污染。尤其，在自动液体处理器的情况下，根据容器内部的移液管尖端的位置，容器的机械结构以及用于制造容器的材料的特性(例如，亲水性)，无法吸入少量的液体。为了使珠子的损失及污染最小化，使磁珠再悬浮并在移液管尖端内部直接混合。

在一实例中，通过动态施加引起珠簇的剪切的外部磁场来执行珠子的再悬浮。在再一实例中，通过动态施加在液体内部引起珠子的移动的外部磁场来执行结合缓冲液、清洗缓冲液及洗脱缓冲液与珠子的混合。

在另一实例中，上述外部磁力分布被设计成在使移液管尖端内部的珠子再悬浮及混合的期间内利用尖端的内壁。

对于在液体处理器尖端中干燥珠子的一般描述

在又一实施方式中，移液管尖端反复吸入并分配气体以干燥珠子。在此过程中，为了尽可能避免吸入立即含有清洗缓冲液的蒸气或气溶胶的预先排出的气体，移液管进行移动。

对于在上述尖端内部中珠簇与液体之间的混合的一般描述

通常，在洗脱缓冲液中使用的体积可以较小，以在分离过程之后使分析物具有相对高的最终浓度。因此，上述珠簇可在比洗脱缓冲液的液体柱的高度高的移液管尖端内部的垂直位置生成。可行的方法为通过使用位于上述尖端的底部的气隙来使液体垂直移动，以与上述珠簇相接触。

图10中，示出为了使液体与珠子的簇相接触而可使用移液管尖端内部的气隙。存在于移液管尖端1002内部的液体1001的量不足以润湿珠簇1003。通过在上述移液管尖端的底部生成气隙1004，迫使先前吸入的液体朝向珠簇移动。

在另一实施方式中，通过施加外部磁场，迫使珠簇朝向存在于上述尖端的液体移动。

对于珠子分离时使用洗涤剂的一般描述

移液管尖端和存在于珠簇的液体的相对移动扰乱珠子的聚集，从而可能导致特定数量的珠子分离。这种珠子的损失在洗脱步骤中可能导致收集效率的下降或珠子的污染。若使用洗涤剂(例如，Tween-20，Triton X-100)，则可使在排出或吸入液体时发生的流体力学湍流最小化。

对于反复收集珠子的一般描述

磁场饱和及高度局部化的磁场梯度可能受限于磁珠的收集。例如，若珠簇的体积高于适用磁场梯度的区域，则由于液体在尖端内部相对移动的流体力学湍流而可能损失一部分珠子。在一实例中，如图11所示，珠簇的形成工序及从上述液体远离的移动工序反复执行。磁铁1101以靠近含有具有珠子1103的溶液的移液管尖端1102的方式配置。产生第一个珠簇1104，而剩余珠子1105按原样留在溶液中。然后，从液体中去除珠子的簇1106。然后，生成从液体去除的新的珠簇1107，从而反复工序，通过与之前的簇合并来生成新的更大的珠簇1108。

对于用于收集珠子的反馈系统的一般描述

在一实例中，为了在收集时优化并验证效率，生成反馈系统。在磁珠的颗粒化及再悬浮时，传感器相对靠近移液管尖端。

在一实施方式中，传感器为通过成像过程来检测珠簇的生成或再悬浮的基于视觉的系统。在另一实施方式中，为了确认珠子的颗粒化及再悬浮，测定存在于移液管尖端的液体的光学密度。

不仅是特定细胞及器官，而且生物分子(双链及单链DNA、总RNA、mRNA，miRNA、蛋白质)的分离及纯化使得基因及蛋白质的表达研究、克隆、转染、蛋白质-蛋白质的相互作用、免疫学、临床诊断、cDNA文库合成、PCR及实时荧光定量多PCR(qPCR)、桑格及NGS测序等广泛的后续适用变得容易。由于简单性、回收效率及纯度，磁性分离在这生物降解领域中占据位置，并逐渐取代需要广泛的离心分离或真空过滤且无法适用于自动化的传统的液相及固相分离方法。

但是，不出所料，几种因素妨碍磁性分离成为主流方法。第一，从384-、96-及24-孔板到小型、中型及大型管的多种容器中收集纯化用样本，具有多种形态和容积容量的所有容器具有从几毫升至几毫升的范围。传统上，各种磁性分离器的区域开发成各种形态和大小，以能够收容不同的容器。对于每种应用购买特定的磁性分离器，从而花费很多费用。第二，良好的回收效率需要仔细的移液技术，以在分离及清洗步骤中防止珠子的损失并在最终洗脱时防止珠子污染，这需要很长时间且无法再现。第三，在最终步骤中，为了珠子的清洁度或确保生物分子的高回收，在通过集中性地反复移液来颗粒化之后实现均匀的磁珠再悬浮。此工作不仅给科学家及技术人员造成了称作重复性劳损症的肌肉骨骼疾病的隐患，而且还大大增加通过手工进行磁性分离协议所需的时间损失。

可通过本公开的自动磁珠分离技术的创新设计来消除所有这些障碍。该平台包括One-Size-Fit-All磁性分离器，在上述One-Size-Fit-All磁性分离器中，由台式移液机器人Andrew对包括液体吸入、样本与珠子的混合、珠子清洗、珠子颗粒化、孵育、干燥及样本洗脱在内的移液管尖端内的所有珠子操作步骤。使用如下参数，上述参数完全独立于用于装样本的容器，可扩展以适用生物应用的所有通常的体积范围，并且可调整和优化，以用于所有协议及适合于各个协议的珠子操作。因此，本公开的装置可以实现84％以上且99％以下的样本回收以及在无污染物质的情况下连续性地实现用于后续应用的准备。

实施例

使用BeadTender进行有效的自动PCR纯化

在用于克隆、转染或桑格测序之前，需要经常纯化PCR生成物，以去除污染物质(未捕获的dNTP、剩余引物、小于100bp的引物二聚体、盐及酶)。本申请中利用BeadTender对使用KAPA HiFi HotStart ReadyMix PCRKit(KAPA)来生成的PCR生成物的纯化效率进行了测试。合并多个反应并分成6个20μL或50μL的样本。由移液机器人Andrew Alliance型1000R在0.2mL的PCR管中处理20μL的样本，为了在1.5mL的微粒离心分离管中分别处理50μL样本，使用了XTips250μL(Biotix)L100及L200移液管。将36μL或90μL的RXN纯磁珠(Omega Biotek)通过Andrew与20μL或50μL的样本进行了混合。珠粒用100μL或150μL的80％EtOH清洗了两次，并用100μL或150μL的水清洗了一次，将纯化的PCR生成物作为6个复制物P1～P6来在10mM Tris缓冲液(pH8)的20μL或50μL中进行了洗脱(均由Andrew自动进行)。

纯化的定性及定量评估表明，BeadTender以优异的收率(表1，图14)有效回收所有无污染物质的样本(图12～13)。在纯化前后，在碎片分析器(FragmentAnalyzer)(AdvancedAnalytical Technologies)中通过毛细管电泳分析了样本的μL。为了进行参照，在所有样本加载了下部凝胶体。在纯化的PCR生成物中的所有20μL及50μL，仅剩下<100bp(引物及引物二聚体)的污染物质。在纯化前后，对于各个样本的μL，使用分光光度计Dropsensel6(Trinean)测定了珠子及其他杂质。

在经过洗涤的样本中未发现珠子污染的迹象。

表1.通过BeadTender进行的样本回收效率

在纯化前后，通过使用HSDNA定量试剂盒(ThermoFischer Scientifics)来用荧光测定仪Qubit测定了1μL的各个样本。在纯化之前，对于合并的PCR的浓度，计算从6个纯化的20μL及50μL样本用复制物(P1～P6)回收的PCR生成物的百分比(表1)。所有样本始终以84％～99％来回收。如图15所示，通过BeadTender的磁性分离的工作流程整体包含在单个移液管尖端内，并且根据应用收容于最少5μL且最大5mL的样本中。上述工序根据使用人员的选择在任一容器中开始，以使样本为了捕获所需的生物分子而与适当的磁珠类型混合(图15的(A)部分)。上述样本-珠子混合物被移液管尖端吸入，并移动到BeadTender的磁铁来对珠子进行了颗粒化(图15的(B)部分)。在从珠子中去除并废弃上清液之后，相同的尖端吸引乙醇并向BeadTender的两个磁铁之间移动来清洗了珠粒(图15的(C)部分)。接着，废弃乙醇，并通过珠粒下面的尖端吸入水来去除乙醇的痕迹，通过移液管拇指(pipette thumb)的周期性的垂直移动干燥了上述尖端内部的颗粒(图15的(D)部分)。然后，洗脱缓冲液在尖端底部被气垫吸引，从而有效覆盖珠粒，通过在BeadTender的两个磁铁之间使尖端移动来实现的颗粒再悬浮，从珠子释放出生物分子(图15的(E)部分)。使经过洗涤的珠子颗粒化，并从含有生物分子的洗脱分离(图15的(F)部分)，最终转移到新的容器(图15的(G)部分)。结束工序通过移液机器人Andrew来执行。使用人员只需提供样本、珠子、清洗缓冲液、洗脱缓冲液的选择以及用于最终纯化的生成物的干净容器即可。

不仅是珠子再悬浮及持续时间，颗粒化时间也可根据珠子类型、样本粘度及缓冲液的离子力和pH完全可在图形软件Andrew Lab中进行调整，向使用人员提供充分的柔韧性及控制，从而可以为了最高样本回收效率及可再现的纯度，可优化任意协议。

根据说明书中考虑引用的参考文献的教导，可以最好地理解本说明书。本说明书中的实施方式提供了本发明实施方式的实例，不应解释为限制本发明的范围。本发明所属技术领域的普通技术人员可以容易认识到，本发明包含许多其他实施方式。发明所属技术领域的普通技术人员可以仅通过通常的实验来认识到或确认与本说明书中所说明的发明的特定实施方式相同的多个等同技术方案，这些等同物应包含在以下所附的发明要求保护范围之内。

Claims (15)

1.一种在液体处理器的尖端内分离珠子的方法，包括：

向尖端吸入含有珠子的液体，其中，珠子中的至少一些具有磁性；

向尖端中的液体的体积的至少一部分施加磁场；

随着时间的变化而改变施加于体积的磁场，其中使用一个或多个磁场分布以将尖端中的磁珠集中在小区域中以形成紧凑的珠簇并将磁珠移动到磁场梯度最大的区域中；

通过变化的场梯度的作用来将磁珠从液体中分离成紧凑的珠簇；以及

在不排出珠子的状态下从尖端分配液体。

2.根据权利要求1所述的方法，还包括：

通过随着时间的变化而改变施加到体积上的磁场，将磁珠重新悬浮在液体内。

3.根据权利要求1所述的方法，其中随着时间的变化而改变施加到体积上的磁场包括尖端相对于产生磁场的磁体的动态扫描，其中紧凑的珠簇在动态扫描期间跟随产生磁场的磁体的移动。

4.根据权利要求1所述的方法，其中一个或多个磁场分布沿所述尖端的垂直轴提供磁场的优化梯度。

5.根据权利要求4所述的方法，还包括：

设计一个或多个磁场分布以将体积中存在的磁珠收集成紧凑的珠簇并将紧凑的珠簇移动到磁场的优化梯度具有其最大值的区域中。

6.根据权利要求4所述的方法，其中一个或多个磁场分布包括在分离期间的多个磁场分布，以便将珠子集中在紧凑的珠簇中。

7.根据权利要求1所述的方法，其中施加磁场是通过至少部分被磁屏蔽包围以引导磁场的磁体来实现的。

8.根据权利要求1所述的方法，其中随着时间的变化而改变施加到体积上的磁场还包括：

将磁场的最大强度引导到体积内的特定垂直位置。

9.一种用于分离悬浮在液体处理器的尖端内的液体中的珠子的装置，包括：

尖端外部的一个或多个磁体，以从液体分离珠子为目的，所述磁铁被配置用于被配置为随着时间的变化向尖端内的液体施加调制和变化的磁场，以便将尖端中存在的磁珠集中在小区域中以形成紧凑的珠簇并在磁场梯度最大的区域中移动磁珠。

10.根据权利要求9所述的装置，其中一个或多个磁体被配置为相对于尖端移动，以相对于提供一个或多个磁场分布的一个或多个磁体的位置对尖端内的液体执行动态扫描。

11.根据权利要求9所述的装置，其中一个或多个磁体包括多个磁体。

12.根据权利要求9所述的装置，其中一个或多个磁场分布包括多个磁场分布。

13.根据权利要求9所述的装置，其中一个或多个磁体各自至少部分地被磁屏蔽包围以引导磁场。

14.根据权利要求9所述的装置，其中一个或多个磁体产生的一个或多个磁场分布沿尖端的垂直轴提供磁场的优化梯度。

15.根据权利要求14所述的装置，其中一个或多个磁场分布被设计为将体积中存在的磁珠收集成紧凑的珠簇并将紧凑的珠簇移动到磁场的优化梯度具有其最大值的区域中。