CN119039303A

CN119039303A - 一种螺环化合物

Info

Publication number: CN119039303A
Application number: CN202411321261.3A
Authority: CN
Inventors: 徐佳婧; 陈浩; 吴亚闯; 高丙全; 魏海阳; 胡永韩; 乐美杰; 强静
Original assignee: Shanghai Xinnuo Life Sustaining Pharmaceutical Co ltd
Current assignee: Shanghai Xinnuo Life Sustaining Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2024-09-20
Filing date: 2024-09-20
Publication date: 2024-11-29

Abstract

本发明公开了一种如式(I)所示的螺环化合物、其用途及含其的药物组合物。该类化合物对WRN有较强的抑制作用，从而具有抑制相关的癌细胞的作用。

Description

一种螺环化合物

技术领域

本发明涉及一种螺环化合物、其用途及含其的药物组合物。

背景技术

在癌症的进展过程中，经常会发生DNA错配修复功能的缺失，如10％-30％的结直肠癌、子宫内膜癌、卵巢癌与胃癌等存在该种情况。由于DNA错配修复功能的缺失，癌细胞突变负担变高，在DNA的重复序列区域经常会发生删除或插入，该种现象被称为微卫星的不稳定性。尽管对微卫星高度不稳定(MSI-H)癌症治疗取得了进展，且帕博利珠单抗(pembrolizumab,PD-1抗体)作为一线治疗，要比化疗针对微卫星高度不稳定/DNA错配修复功能缺失(MSI-H/dMMR)晚期结直肠癌病人表现出更长的生存进展期，使得pembrolizumab被批准用于MSI-H/dMMR癌症的一线治疗，但临床上结直肠癌与其他MSI-H的适应症仍有需求。

通过对多个细胞系进行大规模功能基因组学的筛查，包括诺华(Novartis)对来自于Cancer Cell Line Encyclopedia(CCLE)细胞库的398株细胞系分析(McDonald E.R.etal.,Project DRIVE:A Compendium of Cancer Dependencies and Synthetic LethalRelationships Uncovered by Large-Scale,Deep RNAi Screening.Cell170(3):577-592(2017))，发现WRN(Werner syndrome protein)对于DNA错配功能缺失而产生微卫星高度不稳定(MSI-H)的细胞系是生存所必需依赖的(Behan,F.M.et al.Prioritization ofcancer therapeutic targets using CRISPR-Cas9 screens.Nature568,511-516(2019)；Chan,E.M.et al.WRN helicase is a synthetic lethal target in microsatelliteunstable cancers.Nature 568,551-556(2019)；Kategaya,L.,Perumal,S.K.,Hager,J.H.&Belmont,L.D.Werner syndrome helicase is required for the survival ofcancer cells with microsatellite instability.iScience 13,488-497(2019)；Lieb,S.etal.Werner syndrome helicase is a selective vulnerability ofmicrosatellite instability-high tumor cells.Elife 8,e43333(2019))。WRN与MSI-H存在合成致死关系，在DNA错配修复功能缺失的癌细胞中，WRN的缺失会抑制细胞增殖，激活多个DNA损伤的生物标记物，诱导细胞分裂停歇及细胞凋亡，但对于DNA错配修复功能完整的癌细胞，WRN的缺失不会导致这种结果。这些发现说明WRN提供了MSI-H癌细胞赖以生存的DNA修复和维护功能。最近，MSI-H细胞依赖WRN的机制被研究清楚：两个核苷酸TA的重复序列只在MSI-H细胞中不稳定，能够进行大规模扩增，进而形成非典型的DNA的二级结构，需要WRN进行解旋(Van Wietmarschen,N.et al.Repeat expansions confer WRN dependencyin microsatellite-unstable cancers.Nature 586,292-298,200.)。在缺少WRN(或者WRN解旋功能被抑制)的情况下，MSI-H细胞中扩增的TA重复序列会被核酸酶切开，导致染色体的断裂。因此，对于DNA错配功能缺失的癌细胞，抑制WRN的解旋酶功能是个具有吸引力的治疗策略。

癌症仍需要新的处理和治疗方法，尤其是微卫星高度不稳定(MSI-H)或DNA错配修复功能缺失(dMMR)的癌症，包括结直肠癌、胃癌、子宫内膜癌或卵巢癌。

发明内容

本发明提供了如下式(I)的化合物或其药学上可接受的盐：

其中，R₁为H或C_1-3烷基；R₂为OH或-NH-(CO)-C_1-3烷基。

在一个更优选的方案中，R₁为H或甲基；R₂为OH或-NH-(CO)-CH₃。

本发明所述的化合物或其药学上可接受的盐可为如下任一化合物：

本发明还提供了如上所示的化合物或其药学上可接受的盐在制备WRN抑制剂中的用途。该用途包括治疗结直肠癌、胃癌、子宫内膜癌或卵巢癌的用途。

本发明还提供了一种药物组合物，其包含如上所示的化合物或其药学上可接受的盐、以及药学上可接受的载体。

如本文所述，术语“药学上可接受的盐”是指本发明的化合物的药学上可接受的有机或无机盐。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例1EVO32781

第1步：

向反应瓶中加入3-羧基苯磺酸钠(326.87mg,1.46mmol)，N,N-二甲基甲酰胺(6mL)，HATU(655.24mg,1.72mmol)，N,N-二异丙基乙胺(513.97mg,3.98mmol,692.68μL)，2-BOC-2,7-二氮杂-螺[4.4]壬烷(300.00mg,1.33mmol)，反应液氩气保护下室温搅拌3小时。LC-MS表明有产物生成，原料反应完全。反应液加入水(1mL)淬灭。剩余物直接经反相柱(水(含0.1％甲酸)/乙腈体系)纯化，浓缩得黄色泡状固体EVO32781-A1(500.00mg,收率91.89％)。LCMS(ESI)m/z＝409.1[M-H]^-。

第2步：

向反应瓶中加入EVO32781-A1(500.00mg,1.22mmol)，二氯甲烷(6mL)，三氟乙酸(2.98g,26.14mmol,2mL)，反应液室温搅拌2小时。LC-MS表明有产物生成，原料反应完全。反应液减压浓缩，残余物加入二氯甲烷(20mL)，再次浓缩，此操作反复三次，得黄色油状物EVO32781-A2(400.00mg,)，产物不经过进一步分离直接用于下一步。LCMS(ESI)m/z＝409.1[M-H]^-。

第3步：

向反应瓶中加入EVO32781-A2(400.00mg,粗品)，二氯甲烷(5mL)，N,N-二异丙基乙胺(832.83mg,6.44mmol,1.12mL)，冰水浴下滴加丙烯酰氯(128.31mg,1.42mmol)的二氯甲烷(1mL)溶液，反应液室温搅拌2小时。LC-MS表明有产物生成，原料反应完全。反应液直接通过制备型高效液相色谱纯化得到淡黄色固体EVO32781(5.00mg,收率1.06％)。LCMS(ESI)m/z＝363.3[M-H]^-。¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆)δ7.79-7.62(m,2H),7.54-7.35(m,2H),6.65-6.44(m,1H),6.19-6.03(m,1H),5.71-5.57(m,1H),3.71-3.50(m,4H),3.42-3.24(m,4H),2.11-1.75(m,4H)。

实施例2EVO32853

第1步：

室温下，向单口瓶中依次加入EVO32845-A0(2.5g,10.91mmol)，苄硫醇(1.63g,13.10mmol)，Pd₂(dba)₃(699mg,0.76mmol)，XantPhos(947mg,1.64mmol)，DIPEA(4.23g,32.74mmol)和1,4-dioxane(25mL)。反应体系用氩气置换3次后，加热到100℃搅拌过夜。反应结束后，冷却到室温，过滤，滤饼用DCM洗涤。滤液浓缩得粗品，用中压正相过柱纯化(PE/EA＝0-6％)得EVO32845-A1(2.5g)淡黄色油状物。LCMS(ESI)m/z＝273.2[M+H]⁺。

第2步：

在0℃下，将EVO32845-A1(1.5g,5.51mmol)溶于CH₃CN/H₂O/HOAc(20mL，200/5/2.5)中，再加入二氯海因(1.63g,8.26mmol)。反应体系在0℃搅拌1小时。反应体系浓缩得粗品EVO32845-A2(1.7g)淡黄色固体。

LCMS(ESI)m/z＝229.2[M-H]^-。

第3步：

在0℃下，将EVO32845-A2(1.7g,6.84mmol)溶于THF(20mL)中，再加入氨水(10mL)。反应体系在0℃下继续搅拌1-2小时。反应体系加水稀释，用乙酸乙酯萃取2次。有机相合并后，浓缩得粗品，用PE/EA(5/1)打浆后，过滤，滤饼干燥得EVO32845-A3(1g)白色固体。LCMS(ESI)m/z＝230.2

[M+H]⁺。

第4步：

在0℃下，将EVO32845-A3(1g,4.36mmol)和TEA(1.32g,13.09mmol)溶于THF(15mL)中，再加入乙酰氯(514mg,6.54mmol)。反应体系在室温下搅拌过夜。反应结束后，直接浓缩得粗品，用中压正相过柱纯化(DCM/10％MeOH＝0-15％)得EVO32845-A4(0.8g)淡黄色固体。

LCMS(ESI)m/z＝270.3[M-H]^-。

第5步：

室温下，将EVO32845-A4(150mg,0.55mmol)溶于THF(6mL)和H₂O(2mL)中，再加入LiOH.H2O(70mg,1.66mmol)。反应体系在室温下搅拌过夜。反应体系用HCl(1M)调pH＝3-5，浓缩得粗品EVO32845-A5(160mg)淡黄色固体。LCMS(ESI)m/z＝256.1[M-H]^-。

第6步：

室温下，将EVO32845-A5(80mg,0.31mmol)溶于DMF(3mL)中，再加入HATU(177mg,0.47mmol)。反应体系在室温下搅拌5-10分钟后，再加入EVO32853-A0(70mg,0.31mmol)的DMF(1mL)溶液和TEA(94mg,0.93mmol)。反应体系在室温下继续搅拌1小时。反应体系直接用中压反相过柱纯化(0.1％ HCOOH in H₂O/CH₃CN＝5％-65％)后，冻干得EVO32853-A1(100mg)白色固体。LCMS(ESI)m/z＝464.4[M-H]^-。

第7步：

室温下，将EVO32853-A1(100mg,0.21mmol)溶于DCM(5mL)中，再加入TFA(2mL)。反应体系在室温下搅拌1小时。反应体系浓缩得粗品EVO32853-A2(100mg)淡黄色油状物。LCMS(ESI)m/z＝366.3[M+H]⁺。

第8步：

在0℃下，将EVO32853-A2(100mg,0.27mmol)和TEA(111mg,1.09mmol)溶于THF(5mL)中，再加入丙烯酰氯(37mg,0.41mmol)。反应体系在室温下搅拌3-4小时。反应体系浓缩后，用prep-HPLC制备(酸性制备)后，得不纯粗品，再用prep-TLC(DCM/MeOH＝15/1)纯化后，冻干得EVO32853(14mg,收率：12.20％)白色固体。LCMS(ESI)m/z＝420.2[M+H]⁺。HPLC：97.6％。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ7.70-7.61(m,2H),7.45-7.38(m,1H),6.62-6.48(m,1H),6.17-6.05(m,1H),5.69-5.60(m,1H),3.68-3.37(m,8H),2.36(d,J＝4.0Hz,3H),2.04-1.78(m,4H),1.70-1.68(m,3H)。

生物效果实施例

WRN截断体的蛋白表达与纯化

构建表达载体：

1.合成编码WRN(N517-Q1093)的cDNA序列(Genscript Biotech

Corporation)，使得N末端带有8xHis tag-Strep-TEV cleavage site，构建

到pFastBac1载体(YouBio，货号)，插入位点为BamHI与EcoRI，得

到pFastBac1-8His-Strep-TEV-WRN(N517-Q1093)重组质粒；

2.取50μL DH10Bac感受态细胞(biomed，#BC112-01)冰上缓慢融化，加1μLpFastBac1-8His-Strep-TEV-WRN(N517-Q1093)重组质粒，冰上孵育30分钟后，42℃水浴45秒，在冰上孵育2分钟；

3.加入450μL SOC培养基(2％ Tryptone(OXOID，#LP0042)、0.5％ Yeast Extract(OXIOD，#LP0021)、0.58％ NaCl(Hushi，#10019360)、0.019％ KCl(Hushi，1002792168398)、0.203％ MgCl₂·6H₂O(Hushi，10012828)、0.246％MgSO₄·7H₂O(Hushi，10013016)、0.36％ Glucose(Biodee，#DE0149-500g))，置水平摇床中220rmp 37℃4h；

4.SOC培养基10倍稀释细胞液，然后取50uL涂布琼脂糖平板(取1％Tryptone、0.5％ Yeast Extract、1％ NaCl、1.5％ Agar(BioFroxx，

#8211GR500)、50μg/mL Kanamycin(Solarbio，#K8020-5g)、7μg/mL Gentamycin(Solarbio，G8170-1g)、10μg/mL Tetracycline(Solarbio，#T8180-5g)、40μg/mL X-gal(Solarbio，#8050-1g)和40μg/ml IPTG(lnalco，#1758-1400))，37℃，避光生长48h；

5.挑2个单克隆菌落分别放置于5mL SOC培养基中，37℃250rpm过夜培养；

重组Bacmid的提取：

1.取1.5mL菌落培养液于EP管(Axygen，#MCT-200-C-S)中，13300rpm离心1分钟；

2.去上清，用质粒提取试剂盒(Qiagen#DP103-03)提取重组Bacmid，实验步骤参考试剂盒说明书将离心后上清转移到新管，加入750μL isopropanol(Greagent，#G75885B)，轻轻混匀几次，冰上放置10分钟；

3.13,300rmp离心15分钟；

4.去掉上清，加入500μL 70％乙醇(Greagent，货号1101143)，将EP管反复翻转8次，清洗沉淀部分，13,300rmp离心5分钟；

5.去掉上清，在超净工作台无菌环境中，加入500μL经过高压灭菌的70％乙醇；

6.重复步骤8和步骤9；

7.尽可能去掉多余的上清，13,300rmp离心2分钟；

8.将沉淀风干5分钟，加入40μL经过高压灭菌的TE buffer溶解；

9.Nanodrop测定重组Bacmid浓度；

昆虫细胞转染：

1.Sf-900TMII SFM media(Gibco#10902088)稀释Sf9细胞(Gibco，#11496015)至1×10⁶cells/mL，取3mL至25mL培养瓶中；

2.取15μg重组Bacmid，加入100μL Grace’s Insect Medium(Gibco，#11605094)，再加入7μL X-treme transfection reagent(Roche#6366236001)，室温孵育15-20分钟

3.孵育产物转移至含Sf9细胞液的培养瓶中，27℃100rpm培养4天；

收集P0病毒：

4.转染4天后，观察细胞状态，准备收集病毒；

5.首先加入血清(终浓度2％，四季青#11011-8611)，4℃下3200rmp离心5分钟；

6.收集上清4℃保存，记为P0病毒；

P1病毒制备：

7.取1mL P0病毒，加入50mL Sf9细胞培养液(细胞密度1.5-1.8×10⁶ cells/mL)，27℃100rpm培养3天；

8.培养3天后，检测细胞状态，准备收集细胞；

9.加入血清(终浓度2％)，4℃3500rpm离心5分钟；

10.收集上清4℃保存，记为P1病毒；

P2病毒制备：

11.取4mL P1病毒，加入到200mL Sf9细胞培养液中(细胞密度1.5-1.8×10⁶cells/mL)，27℃100rpm培养3天；

12.培养3天后，检测细胞状态，准备收集细胞；

13.加入血清(终浓度2％)，4℃3500rpm离心5分钟；

14.收集上清4℃保存，记为P2病毒。

蛋白表达与纯化：

15.6瓶800mL Sf9细胞培养液(2×10⁶cells/mL)中分别加入12.8mL P2病毒，27℃100rmp培养48h；

16.4℃8000rpm离心10分钟，收集细胞；

17.用800mL细胞裂解缓冲液(50mM Tris-HCl pH 7.5，500mM NaCl，5％glycerol，0.5mM TCEP，1mM PMSF，5mM MgCl2)重悬细胞，加入一片cOmpleteTM蛋白抑制剂(Roche#11697498001)；

18.高压破碎细胞(南京纳通机电制造，型号NT-H3，工作压力650bar)，重复破碎4次，随后4℃16000rmp离心60分钟，收集上清进行亲和层析：

1)过Strep-XT亲和柱(5mL，IBA lifesciences#2-5027-001)，用50mMHEPES pH 7.5，500mM NaCl，5％glycerol，0.5mM TCEP，1mMPMSF，75mM Biotin的缓冲液进行洗脱；

2)洗脱产物加入6His-GST-Thrombin-TEV蛋白酶，4℃过夜酶切；

3)酶切产物过HiTrap Heparin HP(5mL，GE Healthcare#17-0406-01)进行离子交换；

4)过GST柱去除残留的蛋白酶；

5)用HiLoad 16/600Superdex 200pg(GE Healthcare#28-9893-35)进行纯化分子排阻层析，流速1mL/分钟；

19.SDS-PAGE检测蛋白纯度，蛋白纯度需大于99％，蛋白冻存于-80℃，用于后续的酶活测试。

化合物对WRN截断体ATPase酶活的抑制检测

ADP-Glo^TM激酶试剂盒(Promega#V9101)是一种化学发光ADP检测方法，具有通用性强、均匀度好和高通量筛选等优势，可用于检测ADP生成酶(如ATPase)的活性。该检测分两步进行：首先，在激酶反应后，加入ADP-Glo^TM试剂终止激酶反应并消耗剩余的ATP；随后再加入激酶检测试剂，将ADP转化为ATP，并通过荧光素酶/荧光素反应测量新合成的ATP，光度计检测化学发光信号。光信号与ADP的含量正相关，因此可以测定不同浓度的化合物对WRNATPase活性的抑制，从而拟合出浓度-效应曲线，计算化合物的IC50。具体操作步骤如下：

本实验所用缓冲液为25mM HEPES(Gibco#15630-080)，5mM NaCl(Sigma#59222C-100ML)，0.01％ F-127(Sigma#P2443)，1mM MgCl₂(Sigma#M1028-100ML)，1mM TCEP(Sigma#646547)。

1.化合物溶解于DMSO配制成10mM储存液，以3倍梯度稀释待测化合物，共稀释8个浓度点。各取3uL化合物溶液加入1号384孔板(PerkinElmer

#6008280)。最低抑制对照孔(High Control)和无酶对照孔(Low Control)孔分别加入3uL 5％ DMSO；

2.每孔加入6uL 5nM WRN截断体溶液，室温下与化合物孵育10分钟。

3.每孔加入6uL ATP与DNA duplex fork的混合溶液(2.5mM ATP，25nM

DNA)，配制为15uL反应体系，室温下反应60分钟；

4.每孔取5uL反应体系加入含有5uL ADP Glo reagent终止液(ADP-Glo^TM激酶试剂盒)的2号384孔板，室温下孵育50分钟，终止反应；

5.取5uL ADP(ADP-Glo^TM激酶试剂盒)加入含有5uL ADP Glo reagent(ADP-Glo^TM激酶试剂盒)孔中(标准对照孔)；

6.所有孔中加入10uL Kinase Detection Reagent检测液(ADP-Glo^TM激酶试剂盒)，室温下孵育40分钟。用SpectraMaxi3x读取光信号值；

7.数据分析：化合物孔抑制率(Inhibition％)＝(avg High Control-Cpd well)/(avg High Control-Low Control)*100％，应用GraphPad Prism 9.0软件，使用四参数拟合方程绘制浓度效应曲线并计算IC₅₀值。

化合物对WRN截断体DNA解旋活性的抑制检测

实验原理：分别带有猝灭基团与荧光基团的不完全配对的两段单链DNA片段退火后可形成DNA duplex fork结构，WRN能解旋DNA duplex fork成单链DNA，从而通过荧光信号检测单链DNA水平，评价WRN的解旋酶活性。具体实验步骤如下：

本实验所用缓冲液与ATPase酶活实验的缓冲液配方一致。

1.合成单链DNA片段(SEQ ID NO:1的猝灭单链DNA：

TTTTTTTTTTTTTTTTCGTACCCGATGTGTTCGTTC，SEQ ID NO:2的荧光单链DNA：GAACGAACACATCGGGTACGTTTTTTTT，生工生物工程(上海)股份有限公司合成，HPLC方法纯化)，无酶水(Invitrogen

#10977015)溶解引物至100uM；

2.用500mM NaCl溶液稀释单链DNA片段至20uM(NaCl终浓度50mM)，无酶水补足体积。取等量的单链DNA片段混合(10uM)，放入PCR仪(BIORAD#C1000 Touch)中，程序设置为：95℃5分钟，25℃1分钟(Ramp:0.1℃/s)，4℃30分钟，进行单链DNA退火，得到DNA duplexfork；

3.取20uL 30nM荧光单链DNA片段和20uL 30nM DNA duplex fork分别至384孔板(Corning#4514)中，酶标仪检测荧光信号：激发波长520nm发射波长590nm。根据分别对应的荧光信号计算退火效率：(DNA duplex fork/单链DNA)×100％，退火效率需＞90％；

4.化合物溶解于DMSO配制成10mM储存液，以3倍梯度稀释待测化合物，共稀释10个浓度点(7.5×化合物检测浓度，7.5％ DMSO)；

5.取2uL化合物溶液加入384孔板。最低抑制对照孔(High Control)和无酶对照孔(Low Control)孔分别加入2uL 7.5％ DMSO；

6.每孔加入5uL 6nM WRN截断体溶液，1000rmp离心1分钟，室温下孵育30分钟；

7.每孔加入8uL DNA duplex fork与ATP的混合液(18.75nM DNA，5.63mMATP)，1000rmp离心1分钟后，室温下反应20分钟；

8.每孔加入4uL 1.625％ SDS溶液(Sigma#75746-250G)终止反应；

9.用荧光酶标仪(MD SpectraMax i3x)读取激发波长520nm发射波长590nm的荧光信号强度；

10.数据分析：化合物孔抑制率(Inhibition％)＝(avg High Control-Cpdwell)/(avg High Control-Low Control)*100％，应用GraphPad Prism 9.0软件，使用四参数拟合方程绘制浓度效应曲线并计算IC₅₀值，结果如下：

其中，A表示IC₅₀≤100nM；B表示100nM＜IC₅₀≤1000nM；C表示1000nM＜IC₅₀≤10000nM；“-”表示未测试。

Claims

1.一种如下式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐：

其中，R₁为H或C_1-3烷基；R₂为OH或-NH-(CO)-C_1-3烷基。

2.如权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，R₁为H或甲基。

3.如权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，R₂为OH或-NH-(CO)-CH₃。

4.如权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其为如下任一化合物：

5.一种药物组合物，其特征在于，其包含如权利要求1任一所述的化合物或其药学上可接受的盐、以及药学上可接受的载体。

6.一种如权利要求1-5中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐、药物组合物在制备WRN抑制剂中的用途。

7.如权利要求6所述的用途为治疗结直肠癌、胃癌、子宫内膜癌或卵巢癌的用途。