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CN118995699A - 一种植物根肿菌响应启动子及其应用 - Google Patents

一种植物根肿菌响应启动子及其应用 Download PDF

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CN118995699A
CN118995699A CN202310577587.1A CN202310577587A CN118995699A CN 118995699 A CN118995699 A CN 118995699A CN 202310577587 A CN202310577587 A CN 202310577587A CN 118995699 A CN118995699 A CN 118995699A
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dna molecule
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est
rcr1
promoter
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周俭民
王伟
张文静
董晓静
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Original Assignee
Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
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Abstract

本发明公开了一种植物根肿菌响应启动子及其应用。所述植物根肿菌响应启动子为如下A1)或A2)：A1)序列表序列3所示的DNA分子；A2)与A1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有启动子功能的DNA分子。通过实验证明：本发明公开的启动子包含响应根肿菌侵染的重要元件，是一个根肿菌响应启动子，该启动子对其介导根肿菌的抗性非常重要，具有重要的应用价值。

Description

一种植物根肿菌响应启动子及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种植物根肿菌响应启动子及其应用。
背景技术
油菜等十字花科植物是重要的油料来源，但近年来由根肿菌引起的十字花科油料作物的病害已对其产量和品质产生了严重影响。在过去的研究中，很多植物抗病(Resistance，R)基因被鉴定出来，其中大多数属于NLR基因，NLR基因含有一个核苷酸结合位点和一个亮氨酸富集序列，在植物免疫过程，特别是在ETI免疫反应中起着重要作用。此外，在水稻和辣椒中还鉴定出了另外一类R基因，它们编码的蛋白能够直接杀死被病原菌感染的植物细胞，进而达到对病原菌的抗性，这类被称为执行者(Executor，E)R基因。虽然NLR和Executor R蛋白都能激活植物免疫，但是其激活方式截然不同。NLR蛋白通常处于自抑制状态，只有识别了病原菌的效应蛋白后，才会转换为激活状态行使功能。Executor R基因是在转录水平上调控其活性，在正常条件下，Executor R基因处于沉默状态；而病原菌入侵时，其效应蛋白与Executor R基因的启动子结合，诱导其表达，激发植物抗病性。
启动子是一段位于结构基因5’端上游区的DNA序列，能与RNA聚合酶等转录相关蛋白准确结合，并具有转录起始的特异性，是基因表达调控的重要组成元件，控制基因表达的起始时间和表达程度。植物基因启动子中包含多种重要的顺式作用元件，在转录水平上参与调控下游相应基因表达，使基因具有时空表达特异性，因此对启动子的分离和功能分析是植物基因工程研究的重要内容。
发明内容
本发明的目的是提供一种植物根肿菌响应启动子及其应用。
第一方面，本发明要求保护一种DNA分子，所述DNA分子为如下A1)或A2)：
A1)序列表序列3所示的DNA分子；
A2)与A1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有启动子功能的DNA分子。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的DNA分子的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明提供的DNA分子的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要具有启动子功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的DNA分子的核苷酸序列具有75％或更高，80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
第二方面，本发明要求保护与上述DNA分子相关的生物材料，所述生物材料为下述B1)至B4)中的任一种：
B1)含有上述DNA分子的表达盒；
B2)含有上述DNA分子的重组载体、或含有B1)所述表达盒的重组载体；
B3)含有上述DNA分子的重组微生物、或含有B1)所述表达盒的重组微生物、或含有B2)所述重组载体的重组微生物；
B4)含有上述DNA分子的转基因植物细胞系、或含有B1)所述表达盒的转基因植物细胞系。
上述生物材料中，所述表达盒(5’至3’)可包括启动子区(由所述DNA分子组成)、转录起始区、目的基因区、转录终止区和任选的翻译终止区。所述启动子区和目的基因区对宿主细胞而言可为天然的/类似的，或者，所述启动子区和目的基因区相互之间可为天然的/类似的，或者，所述启动子区和/或目的基因区对宿主而言或者其相互之间为异源的。“异源的”指序列为源自外来物种的序列，或，如果来自相同物种，则通过刻意的人为干预在组分和/或基因组位点方面对天然形式进行了实质性修饰。任选含有的转录终止区可与转录起始区同源，与可操作地连接的目的基因区同源，与宿主同源；或；目的基因区、宿主为外源或异源。
所述表达盒还可包括5’引导序列。5’引导序列可增强翻译。
在制备表达盒时，可应用衔接头或联结子连接DNA片段、或、可涉及其它操作以提供适当的限制酶切位点、去除多余的DNA、去除限制酶切位点等。为达到这一目的，可进行体外突变、引物修复、限制性酶切、退火、重新替换，例如转换和颠换。
所述表达盒还可包括用于筛选已转化细胞的选择性标记基因。选择性标记基因可用于筛选已转化细胞或组织。标记基因包括编码抗生素抗性的基因。其它选择性标记包括表型标记例如荧光蛋白。以上列出的选择性标记不具有限制性。本发明可使用任何选择性标记基因。
上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。
在本发明的一个具体实施例中，所述重组载体为pRCR1Est::GUS。所述pRCR1Est::GUS为将序列3所示的DNA分子连入至pCAMBIA1300-GUS载体的HindIII和XbaI酶切位点间后得到的载体。
在本发明的另一个具体实施例中，所述重组载体为pRCR1Est::nls-3*mVenus。所述pRCR1Est::nls-3*mVenus为将序列3所示的DNA分子连入至pGREEN-nls-3*mVenus载体的HindIII和EcoRI酶切位点间后得到的载体。
在本发明的又一个具体实施例中，所述重组载体为pRCR1Est::RCRLer。所述pRCR1Est::RCRLer为将序列5所示的DNA分子连入至pGREEN载体的SalI和XbalI酶切位点间后得到的载体。
上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。所述细菌可为农杆菌(如农杆菌GV3101)。
上述生物材料中，所述转基因植物细胞系均不包括繁殖材料。所述转基因植物理解为不仅包含将所述DNA分子转化受体植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖所述DNA分子，也可用常规育种技术将所述DNA分子转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
第三方面，本发明要求保护上述DNA分子或生物材料的新用途。
本发明要求保护上述DNA分子在作为启动子或根肿菌响应启动子中的应用。
本发明要求保护上述DNA分子或生物材料在启动目的基因表达或提高目的基因表达量中的应用。
本发明要求保护上述DNA分子或生物材料在制备转基因植物或植物育种中的应用。
上述任一所述应用中，所述制备转基因植物或所述植物育种的目的为培育抗病植物品种(如抗根肿病植物品种)。
第四方面，本发明要求保护一种目的基因的表达方法，所述方法为如下C1)-C4)中任一种：
C1)包括如下步骤：以上述DNA分子作为启动子或根肿菌响应启动子来启动目的基因的表达；
C2)包括如下步骤：将上述DNA分子插入到目的基因或增强子的上游，以此来启动目的基因的表达；
C3)包括如下步骤：将目的基因插入上述表达盒中的上述DNA分子的下游，由所述DNA分子启动所述目的基因的表达；
C4)包括如下步骤：将目的基因插入上述重组载体中的上述DNA分子的下游，由所述DNA分子启动所述目的基因的表达。
上述任一所述目的基因的表达可为在植物中启动目的基因的表达，也可为在根肿菌侵染条件下启动目的基因的表达，还可为在根肿菌侵染条件下提高目的基因的表达量。
上述任一所述目的基因可为植物内源基因(如RCR1Est基因或RCR1Ler基因)，也可为外源基因(如GUS基因或mVENUS基因)。所述RCR1Est基因的核苷酸序列如序列1所示。所述RCR1Ler基因的核苷酸序列如序列2所示。
上述任一所述根肿菌可为根肿菌4号生理小种。
上述任一所述根肿菌侵染的方法可为将根肿菌液浇灌植物根部。在本发明的一个具体实施例中，所述根肿菌液浓度可为1.0×107个/mL。
上述任一所述植物可为双子叶植物或单子叶植物。
进一步的，所述双子叶植物可为十字花科植物。
更进一步的，所述十字花科植物可为拟南芥或油菜。
在本发明的具体实施例中，所述拟南芥为拟南芥生态型Col-0或Ler或Est-1。
本发明提供了一种DNA分子，该DNA分子包含响应根肿菌侵染的重要元件，是一个根肿菌响应启动子，该DNA分子对其介导根肿菌的抗性非常重要，具有重要的应用价值。
附图说明
图1为感病材料Ler与抗病材料Est-1对根肿菌的抗性分析及根肿菌抗性基因RCR1单倍型的比较分析。图A为感病材料Ler与抗病材料Est-1接种根肿菌21天后的植株发病症状。图B为感病材料Ler与抗病材料Est-1接种根肿菌21天后的植株发病率及病情指数。图C为感病材料Ler与抗病材料Est-1接种根肿菌21天后的根肿菌生物量(n≥12)。图D为感病材料Ler和抗病材料Est-1中RCR1单倍型的比较。红色箭头，编码区；蓝色矩形，UTR区；粉红色和绿色的线代表RCR1Est和RCR1Ler启动子中的差异区域。图E为瞬时表达RCR1Ler和RCR1Est均可诱导烟草细胞死亡。
图2为RCR1Est启动子包含了响应根肿菌侵染的重要元件。图A为接种根肿菌11天后检测RCR1在感病材料Ler与抗病材料Est-1地下部分的表达水平。图B为接种根肿菌11天后利用4-MUG荧光测定法测定pRCR1Ler::GUS及pRCR1Est::GUS转基因植株地下部分中GUS的活性。图C为接种根肿菌11天后pRCR1Est::nls-3*mVenus转基因植株根中的荧光蛋白表达情况。pRCR1Ler::GUS及pRCR1Est::GUS分别代表在Col-0背景下用RCR1Ler或RCR1Est启动子驱动GUS表达的转基因植物。pRCR1Est::nls-3*mVenus代表在Col-0背景下用RCR1Est启动子驱动NLS-3*mVenus表达的转基因植物。
图3为RCR1Est启动子是RCR1介导对根肿菌的抗性所必需的。图A为Col-0和pRCR1Est::RCR1Ler转基因植株接种根肿菌21天后的病症。图B为Col-0和pRCR1Est::RCR1Ler转基因植株接种根肿菌21天后的发病率和病情指数。图C为Col-0和pRCR1Est::RCR1Ler转基因植株接种根肿菌21天后的根肿菌相对生物量(n≥12)。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的pER8载体记载于文献“Zuo,J.et al.Technical advance:anestrogen receptor-based transactivator XVE mediates highly inducible geneexpression in transgenic plants.Plant J.24,265-273(2000).”中，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的pGREEN-nls-3*mVenus载体记载于文献“Zhou,F.et al.Co-incidence of damage and microbial patterns controls localized immuneresponses in roots.Cell 180,440-453(2020).”中，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的pCAMBIA1300-GUS载体记载于文献“Wang,Y.et al.Vascular-specific expression of Gastrodia antifungal protein gene significantlyenhanced cotton Verticillium wilt resistance.Plant Biotechnol J.181498-1500(2020).”中，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的农杆菌GV3101记载于文献“Liang,XX.et al.Ligand-triggeredde-repression of Arabidopsis heterotrimeric G proteins coupled to immunereceptor kinases.Cell Research 28,529-543(2019).”中，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
实施例1、拟南芥生态型Est-1及Ler对根肿菌抗性分析
1、根肿菌接种
分别以拟南芥生态型Est-1(抗根肿病材料)及拟南芥生态型Ler(感根肿病材料)为实验材料进行根肿菌接种实验。接种前各实验材料均在常规条件(光照10小时，黑暗14小时，温度22℃)下培养，待植物生长约14天时进行根肿菌根侵染实验，具体步骤如下：
1)将采集的含有四川大邑地区根肿菌(经鉴定为4号生理小种)的植物根块用刀片切成小块，加水，继而在组织破碎仪中打破，得到含有菌液和破碎组织的混合物。
2)用8层纱布过滤步骤1)获得的含有菌液和破碎组织的混合物，得到较为干净的根肿菌液。
3)用血球计数板测量步骤2)获得的根肿菌液中根肿菌的孢子浓度，并将根肿菌液的浓度稀释到1.0×107个/mL。
4)用灌根法对拟南芥进行接种，即用移液枪吸取1mL步骤3)中获得的稀释后根肿菌液并将其浇灌在拟南芥的根部。
2、病情指数及发病率的统计
接种根肿菌21天后利用根肿菌的分级系统统计发病率和病情指数。拟南芥根肿菌的分级系统统计标准如下：0级，拟南芥的根部没有受到侵染，根系结构完整；1级，侧根上有很小的瘤，主根没有受到影响；2级，侧根主根上都出现肿块，但还有部分根系结构完整，没有受到影响；3级，主根和侧根都受到侵染；4级，拟南芥的侧根和根毛完全受到损伤，只留有一个膨大的主根呈棒状。发病率的计算公式＝(发病植株数/总接菌植株数)×100％。
3、根肿菌相对生物量的分析
接种根肿菌21天后，收集各个材料的地下部分，利用CTAB法提取地下部的总DNA，并利用实时荧光定量PCR的方法检测不同材料中的拟南芥持家基因At-Actin及根肿菌持家基因Pb-Actin的表达情况，引物序列具体如下：
Actin-RT-F：5’-AACTCTCCCGCTATGTATGTCG-3’；
Actin-RT-R：5’-AACCCTCGTAGATTGGCACA-3’；
Pb-Actin-RT-F：5’-CACCGACTACCTGATGAA-3’；
Pb-Actin-RT-R：5’-CAGCTTCTCCTTGATGT-3’。
接种根肿菌21天后植株的发病症状、发病率及病情指数、根肿菌的生物量如图1A-C所示，结果表明：接菌21天后，抗病材料Est-1的根部发育基本正常，仅有少量植株表现出轻微症状；而感病材料Ler的根部形成纺锤状肿瘤。此外，感病材料Ler中根肿菌的生物量是抗性材料的近100倍。
从NCBI数据库中获取感病材料Ler和抗病材料Est-1中的RCR1基因组序列及启动子区域并利用DNAMAN比对分析发现，与RCR1Est相比，RCR1Ler启动子区域有大约700bp的缺失且在RCR1的编码区有1个氨基酸的突变，即由缬氨酸突变为异亮氨酸(图2D)。
4、在烟草中检测细胞程序性死亡
检测RCR1Ler及RCR1Est-1触发细胞程序性死亡的能力。具体步骤如下：
1)分别提取拟南芥生态型Est-1及Ler的DNA，利用RCR1-per8-F及RCR1-per8-R进行PCR扩增，分别获取两个生态型中RCR1的编码序列RCR1Est及RCR1Ler，其核苷酸序列分别如序列1和序列2所示。然后用限制性内切酶SalI和Csp45I双酶切pER8载体，并用in-Funion同源重组技术分别将RCR1的编码序列RCR1Est及RCR1Ler连入至pER8载体的SalI和Csp45I酶切位点间，分别得到雌激素诱导载体pER8-RCR1Est及pER8-RCR1Ler。最后分别将pER8-RCR1Est及pER8-RCR1Ler导入农杆菌GV3101中，并挑取阳性单克隆载体。引物序列如下：
RCR1-per8-F：5’-ACACGCTGAAGCTAGTCGACATGGAGACTGTCTCCGCCG-3’；
RCR1-per8-R：5’-TGGTCTTTGTAGTCTTCGAATTAAACTGGTGGTAACTGAG-3’。
2)分别挑取携带pER8-RCR1Est及pER8-RCR1Ler载体的农杆菌单菌落并将其置于LB培养基中，28℃、220rpm培养过夜，4000rpm离心10分钟，收集菌体。将获得的菌体用水洗两次，然后用无菌水将菌体稀释至OD＝1。
3)分别将OD＝1的携带pER8-RCR1Est-1和pER8-RCR1Ler载体的农杆菌注射于本氏烟的背面，24小时后，再注射4μM的雌激素，48小时后在紫外灯下观察细胞死亡情况。
结果表明，RCR1Est及RCR1Ler均能在烟草中触发细胞程序性死亡。
实施例2、RCR1Est启动子包含响应根肿菌侵染的重要元件
一、根肿菌强烈诱导RCR1Est在拟南芥地下部的表达
按照实施例1中的方法对感病材料Ler与抗病材料Est-1接种根肿菌，接种11天后分别收取感病材料Ler与抗病材料Est-1的地下部分，利用实时荧光定量PCR的方法检测感病材料Ler与抗病材料Est-1中RCR1的表达水平。引物序列如下：
Actin-RT-F：5’-AACTCTCCCGCTATGTATGTCG-3’；
Actin-RT-R：5’-AACCCTCGTAGATTGGCACA-3’；
RCR1-RT-F：5’-GTGAACCGGTGAAGTTCACGAC-3’；
RCR1-RT-R：5’-GAGGTGGACAGGCACTGGGT-3’。
结果显示：根肿菌能激活RCR1在抗性材料Est-1地下部的表达，而在感病材料Ler中则不能(图2A)。
二、RCR1Est及RCR1Ler启动子活性分析
为了验证抗性材料Est-1和感病材料Ler在接种根肿菌后RCR1表达的差异是否是由于两种材料中RCR1启动子不同所导致，进一步分析了接种和未接种根肿菌条件下RCR1Est及RCR1Ler启动子的活性。具体步骤如下：
1、RCR1Est及RCR1Ler启动子片段的获得
分别提取感病材料Ler与抗病材料Est-1的DNA，采用引物RCR1-PF和引物RCR1-PR进行PCR扩增，分别扩增得到大小为3727bp和3036bp的PCR产物，其核苷酸序列分别如序列3和序列4所示，分别命名为pRCR1Est及pRCR1Ler。引物序列如下：
RCR1-PF：5’-CGACGGCCAGTGCCAAGCTTAGCCACACAAACTCCCATCT-3’；RCR1-PR：5’-GCGCGCCTCGAGATCCTCTAGAAATTTGTATCTTTGCAGTTTT-3’。
2、RCR1启动子驱动GUS植物双元表达载体的获得
用限制性内切酶HindIII和XbaI双酶切pCAMBIA1300-GUS载体，回收，得到pCAMBIA1300载体骨架。然后用in-Funion同源重组技术，将pCAMBIA1300载体骨架分别和步骤1获得的PCR产物进行反应，分别得到重组表达载体pRCR1Est::GUS及pRCR1Ler::GUS，并对其进行测序。
测序结果表明：重组表达载体pRCR1Est::GUS为将序列3所示的DNA分子连入至pCAMBIA1300-GUS载体的HindIII和XbaI酶切位点间后得到的载体。
重组表达载体pRCR1Ler::GUS为将序列4所示的DNA分子连入至pCAMBIA1300-GUS载体的HindIII和XbaI酶切位点间后得到的载体。
3、转基因拟南芥的获得
1)携带pRCR1Est::GUS及pRCR1Ler::GUS农杆菌的获得
分别将步骤2获得的重组表达载体pRCR1Est::GUS及pRCR1Ler::GUS利用电击转化的方法导入农杆菌GV3101中，然后将转化后的菌株涂抹于含有卡那霉素和庆大霉素的LB固体培养皿上，28℃培养36小时，筛选阳性单克隆菌株。
2)转化
利用根癌农杆菌介导的拟南芥转化方法，分别将步骤1)获得的携带pRCR1Est::GUS的农杆菌和携带pRCR1Ler::GUS的农杆菌转入拟南芥生态型Col-0，具体步骤如下：
Ⅰ.拟南芥转化受体的制备：选取处于花期的拟南芥，将已经开放的花朵摘取，剩余拟南芥花苞作为农杆菌侵染的受体。
II.农杆菌的培养：从农杆菌储液中取少量菌液，于LB固体培养基(含有卡那霉素50mg/L，庆大霉素50mg/L)上划线培养，28℃避光培养12小时。挑取少许菌体接于2mL LB液体培养基中(含有相应抗生素)，28℃培养12小时，之后将2mL LB液体培养基转接于300mLLB液体培养基(含有相应抗生素)，培养约10小时左右，4000rpm离心，收集菌液，并用5％的蔗糖溶液稀释到OD约0.9，并按照万分之一七的比例，加入表面活性剂(silwet L-77)，以备转化之用。
III.农杆菌侵染拟南芥花苞：将稀释好的菌液置于圆柱型的玻璃瓶中，将只含有花苞的拟南芥倒扣在菌液中4-5分钟，之后将植株横放，避光24小时之后，竖直生长。
IV.抗性植株的筛选：将转基因植株收到的种子均匀铺在含有25mg/L潮霉素(hygromycin B)以及50mg/L羧苄青霉素的1/2MS培养基上筛选，10天左右选取生长正常的小苗，移到温室中培养。
Ⅴ.阳性植株的鉴定：待植株在培养室生长10天后，选取1-2片叶片，用CTAB方法提取总DNA，利用引物hyg-F和引物hyg-R扩增基因组中的DNA片段，确定阳性植物引物序列如下：
hyg-F：AAGCCTGAACTCACCGCGA；
hyg-R：GTTTCCACTATCGGCGAGTAC。
4、启动子活性分析
按照实施例1中的方法分别对携带pRCR1Est::GUS或pRCR1Ler::GUS的T2代转基因植株接种根肿菌，11天后分别收取地下部分，采用4-MUG荧光测定法利用GUS基因定量检测试剂盒(Coolaber)检测不同植物材料中GUS的活性。同时以未接种根肿菌组植株作为对照组(对照组接种与实验组中根肿菌液等量的水)。
结果表明：与未接种根肿菌的对照组相比，根肿菌侵染能显著提高pRCR1Est::GUS转基因材料中GUS的活性，而pRCR1Ler::GUS转基因植株中GUS的活性并不受根肿菌影响(图2B)。说明pRCR1Est启动子中含有响应根肿菌的元件。
三、pRCR1Est::nls-3*mVenus转基因材料的获得及荧光观察
为了验证pRCR1Est启动子是一个根肿菌响应启动子，本发明又构建了pRCR1Est启动子驱动的带有核定位信号的mVENUS绿色荧光蛋白的表达载体，并观察了其表达模式。具体步骤如下：
1、pRCR1Est::nls-3*mVenus转基因材料的获得及荧光观察
1)提取拟南芥生态型Est-1的DNA，采用引物RCR1-VF和引物RCR1-VR进行PCR扩增，扩增得到大小为3727bp的pRCR1Est启动子，其核苷酸序列如序列3所示。引物序列如下：
RCR1-VF：5’-TCGAGGTCGACGGTATCGATAAGCTTAGCCAGACAAACTCCCATCT-3’
RCR1-VR：5’-TTCCTCTTCTTCTTTGGCATGAATTCAATTTGTATCTTTGCAGTT-3’。
2)用限制性内切酶HindIII和EcoRI双酶切pGREEN-nls-3*mVenus载体，回收，得到pGREEN-nls-3*mVenus载体骨架。然后用in-Funion同源重组技术，将pGREEN-nls-3*mVenus载体骨架和步骤1)获得的PCR产物(大小为3727bp的pRCR1Est启动子)进行反应，得到重组表达载体pRCR1Est::nls-3*mVenus，并对其进行测序。
测序结果表明：重组表达载体pRCR1Est::nls-3*mVenus为将序列3所示的DNA分子连入至pGREEN-nls-3*mVenus载体的HindIII和EcoRI酶切位点间后得到的载体。
3)按照步骤二中的方法制备转基因植株。
2、pRCR1Est::nls-3*mVenus转基因植株的荧光观察
按照实施例1中的方法对携带pRCR1Est::nls-3*mVenus的T2代转基因植株接种根肿菌，11天后收取分别收取地下部分，利用50μg/mL的碘化丙啶(popidium iodide，PI)染色10分钟后，水洗5分钟，至于荧光共聚焦显微镜观察并拍照(TIRF3&Axioimager.Z2，ZEISS)。同时以未接种根肿菌组植株作为对照组(对照组接种与实验组中根肿菌液等量的水)。
结果表明：与未接种根肿菌的对照组相比，根肿菌侵染能显著诱导绿色荧光蛋白mVENUS的表达(图2C)，进一步说明RCR1Est启动子中含有响应根肿菌的元件。
综合实施例1和实施例2可以看出，感病材料Ler含有有功能的RCR1Ler蛋白，但是由于其启动子发生缺失突变，丢失了响应根肿菌的元件，导致根肿菌侵染不能激活感病材料Ler中的RCR1Ler高表达，因此使感病材料Ler表现出对根肿菌高度敏感的表型。说明pRCR1Est启动子对其介导根肿菌的抗性非常重要。
实施例3、RCR1Est启动子是RCR1介导对根肿菌的抗性所必需的一、转基因材料的获得
1、以抗病材料Est-1的DNA为模板，利用引物RCR1-EF和RCR1-ER进行PCR扩增，得到大小为3727bp的pRCR1Est启动子。然后以感病材料Ler的DNA为模板，利用引物RCR1Ler-F和RCR1Ler-R进行PCR扩增，得到大小为5147bp的RCRLer编码序列及UTR区。最后利用重叠PCR获得pRCR1Est-RCRLer PCR产物，其核苷酸序列如序列5所示，所用引物序列如下：
RCR1-EF：5’-GGCCCCCCCTCGAGGTCGACAGCCACACAAACTCCCATCT-3’；
RCR1-ER：5’-ACGGCGGAGACAGTCTCCATAATTTGTATCTTTGCAGTTT-3’；
RCR1Ler-F：5’-GGCCCCCCCTCGAGGTCGACATGGAGACTGTCTCCGCCGT-3’；RCR1Ler-R：5’-CATTAAAGCAGGACTCTAGAAGGAAACTACGTGTTTTAAA-3’。
2、用限制性内切酶SalI和XbalI双酶切pGREEN-nls-3*mVenus载体，回收，得到pGREEN载体骨架。然后用in-Funion同源重组技术，将pGREEN载体骨架和步骤1获得的pRCR1Est-RCRLer PCR产物进行反应，得到重组表达载体pRCR1Est::RCRLer，并对其进行测序。
测序结果表明：重组表达载体pRCR1Est::RCRLer为将序列5所示的DNA分子连入至pGREEN载体的SalI和XbalI酶切位点间后得到的载体。
3、按照实施例2中的方法获得转基因植株。
二、pRCR1Est::RCRLer材料对根肿菌的抗性分析
按照实施例1中的方法对步骤一获得的携带pRCR1Est::RCRLer的T2代转基因植株接种根肿菌，接种21天后观察携带pRCR1Est::RCRLer的转基因植株的发病症状，统计发病率、病情指数并检测根肿菌的生物量。
结果如图3所示，结果显示：接菌21天后，携带pRCR1Est::RCRLer的转基因植株表现出对根肿菌的高度抗性，说明RCR1Est启动子是RCR1介导对根肿菌的抗性所必需的。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (10)

1.一种DNA分子，为如下A1)或A2)：
A1)序列表序列3所示的DNA分子；
A2)与A1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有启动子功能的DNA分子。
2.与权利要求1所述DNA分子相关的生物材料，所述生物材料为下述B1)至B4)中的任一种：
B1)含有权利要求1所述DNA分子的表达盒；
B2)含有权利要求1所述DNA分子的重组载体、或含有B1)所述表达盒的重组载体；
B3)含有权利要求1所述DNA分子的重组微生物、或含有B1)所述表达盒的重组微生物、或含有B2)所述重组载体的重组微生物；
B4)含有权利要求1所述DNA分子的转基因植物细胞系、或含有B1)所述表达盒的转基因植物细胞系。
3.权利要求1所述DNA分子在作为启动子或根肿菌响应启动子中的应用。
4.权利要求1所述DNA分子在启动目的基因表达或提高目的基因表达量中的应用。
5.权利要求2所述的生物材料在启动目的基因表达或提高目的基因表达量中的应用。
6.权利要求1所述DNA分子在制备转基因植物或植物育种中的应用。
7.权利要求2所述的生物材料在制备转基因植物或植物育种中的应用。
8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于：所述植物为双子叶植物或单子叶植物。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述双子叶植物为十字花科植物。
10.一种目的基因的表达方法，为如下C1)-C4)中任一种：
C1)包括如下步骤：以权利要求1所述DNA分子作为启动子或根肿菌响应启动子来启动目的基因的表达；
C2)包括如下步骤：将权利要求1所述DNA分子插入到目的基因或增强子的上游，以此来启动目的基因的表达；
C3)包括如下步骤：将目的基因插入权利要求2所述表达盒中的所述DNA分子的下游，由所述DNA分子启动所述目的基因的表达；
C4)包括如下步骤：将目的基因插入权利要求2所述重组载体中的所述DNA分子的下游，由所述DNA分子启动所述目的基因的表达。
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