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CN118994126A - 一种萘酰亚胺类荧光传感器分子及其制备方法和应用、检测肝素或鱼精蛋白的方法 - Google Patents

一种萘酰亚胺类荧光传感器分子及其制备方法和应用、检测肝素或鱼精蛋白的方法 Download PDF

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CN118994126A
CN118994126A CN202410966760.1A CN202410966760A CN118994126A CN 118994126 A CN118994126 A CN 118994126A CN 202410966760 A CN202410966760 A CN 202410966760A CN 118994126 A CN118994126 A CN 118994126A
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heparin
fluorescence
protamine
solution
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曹俭
李雅楠
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Shanghai University of Engineering Science
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Shanghai University of Engineering Science
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Abstract

本发明涉及荧光检测传感器领域，提供了一种新型的萘酰亚胺类荧光传感器分子，通过含吡啶基的萘酰亚胺‑香豆素荧光结构骨架与苄卤成盐的反应制备。这种传感器分子可用于肝素和鱼精蛋白的快速准确检测。本发明的荧光传感器分子具有快速响应、专一选择性强、灵敏度高、低检测限、稳定性好、检测过程简便等优点，在制备肝素的检测产品或是鱼精蛋白的检测产品方面具有良好应用前景，在用于人血清白蛋白、血清和尿液中的肝素和鱼精蛋白的检测方面都具有较强的应用价值。

Description

一种萘酰亚胺类荧光传感器分子及其制备方法和应用、检测 肝素或鱼精蛋白的方法
技术领域
本发明涉及荧光检测领域，具体涉及一种萘酰亚胺类荧光传感器分子，其制备方法和在检测肝素方面的应用，同时该荧光传感器分子可在结合肝素后用于鱼精蛋白的检测。
背景技术
肝素(Heparin，Hep)是糖胺聚糖(GAG)的主要成分之一，由1-4个连接的吡喃糖基葡糖醛酸和2-氨基-2-脱氧葡萄糖残基组成。作为一种带负电荷、线性、高度硫酸化的复合多糖，肝素能与阳离子蛋白结合，并参与细胞生长、粘附、细胞增殖、炎症和凝血等许多生理过程。在医学治疗中，Hep通常被用作抗凝药物，通过高结合亲和力灭活抗凝血酶等凝血因子，但过量服用Hep可导致出血或血小板减少等并发症。在疾病的鉴别诊断中，GAGs可覆盖尿路的移行上皮细胞，使细胞免受病原体和致癌物质的粘附。尽管Hep存在于细胞外基质或细胞表面，但尿液中排出的Hep主要由GAG分解产生，其含量与膀胱肿瘤、感染和其他疾病的发生有关。鉴于上述临床应用，无论是在手术或抗凝过程中使用的剂量，还是在肿瘤和感染等疾病的诊断方面，Hep的检测都至关重要。
鱼精蛋白(Protamine，PRTM)是一种带正电荷的强碱性蛋白，在生物医学中，通常可以通过静电吸附与带负电荷的肝素结合，用作肝素过量时的拮抗剂。这使得对于肝素和鱼精蛋白的可逆性检测也十分重要。
在众多检测Hep的方法中，活化部分凝血活酶时间(aPTT)、活化凝血时间(ACT)和电化学检测法是较为常见的方法，但这些方法存在许多不足：成本高、需要集中实验室设备的支持，而且仅适用于高剂量的Hep。与传统检测技术相比，小分子荧光传感器检测法因其操作简单、反应速度快、选择性好、灵敏度高等优点而备受关注。然而，目前报道的荧光传感器在设计上仍不可避免地存在一些局限性，如检测限低、激发和发射波长短等，因此在传感器的设计策略上仍面临着困难。
综上所述，开发用于肝素检测的具有长发射波长、选择性好、灵敏度高的荧光传感器仍然是一个挑战。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种新型的萘酰亚胺类荧光传感器分子，可用于肝素(Hep)和/或鱼精蛋白的快速准确检测。
本发明还提供了能够延长发射波长、选择性良好、灵敏度高、稳定性好、定性定量检测，并且检测方法简便。
在荧光传感器的结构设计中，本发明采用了将4-溴-1,8-萘酰亚胺荧光团与刚性结构哌嗪结合构成光诱导电子转移(PET)机制的精选结构，再通过与另一种荧光团结合构建高效共振能量转移(FRET)机制来规避因激发/发射波长相对较短导致传感器不适宜在生物组织中应用的缺陷，得到新型的荧光传感器。
本发明第一个方案为：一种萘酰亚胺类荧光传感器分子，具有式(Ⅰ)所示的结构，
其中X选自F、Cl、Br或I。优选的，X选自Br或I。
式(Ⅰ)所示的荧光传感器的制备方法为，由式(Ⅱ)所示化合物与式(Ⅲ)所示化合物反应而得到荧光传感器分子。
其中X选自F、Cl、Br或I。优选的，X选自Br或I。
式(Ⅰ)所示荧光传感器的化学名称为1-苄基-4-(1,3-二氧代-6-(4-(2-氧代-2H-色烯-3-羰基)哌嗪-1-基)-1H-苯并[de]异喹啉-2(3H)-基)吡啶-1-卤化鎓。在本发明中也命名为“Nap-Co-T1”。
其中，当X为Br时，式(Ⅰ)所示荧光传感器的化学名称为1-苄基-4-(1,3-二氧代-6-(4-(2-氧代-2H-色烯-3-羰基)哌嗪-1-基)-1H-苯并[de]异喹啉-2(3H)-基)吡啶-1-溴化鎓，在本发明中也命名为“Nap-Co-T2”；当X为I时，式(Ⅰ)所示荧光传感器的化学名称为1-苄基-4-(1,3-二氧代-6-(4-(2-氧代-2H-色烯-3-羰基)哌嗪-1-基)-1H-苯并[de]异喹啉-2(3H)-基)吡啶-1-碘化鎓，在本发明中也命名为“Nap-Co-T1-b”。
式(Ⅱ)所示化合物的化学名称为6-(4-(2-氧代-2H-色烯-3-羰基)哌嗪-1-基)-2-(吡啶-4-基)-1H-苯并[de]异喹啉-1,3(2H)-二酮，在本发明中也命名为“Nap-Co”。
式(Ⅲ)所示化合物为苄基卤代烃，在本发明中也命名为“Hmb”。其中，当X为Br时，式(Ⅲ)所示化合物的化学名称为溴化苄，在本发明中也命名为“Hmb-Br”；当X为I时，式(Ⅲ)所示化合物的化学名称为苄基碘，在本发明中也命名为“Hmb-I”。
上述荧光传感器Nap-Co-T1的制备方法中：
优选的，式(Ⅱ)所示化合物(Nap-TPA)与式(Ⅲ)所示化合物(Hmb)的摩尔比为1∶2～1∶5。
优选的，反应在惰性气体保护下，在乙腈溶剂中进行。
优选的，所述反应在回流条件下进行。
在进一步优选方案中，以4-溴-1,8-萘二甲酸酐为起始原料可制备得到化合物Nap-p，包括以下步骤：(a)4-溴-1,8-萘二甲酸酐与4-氨基吡啶反应得到化合物Nap-b；(b)化合物Nap-b与哌嗪反应得到化合物Nap-p。
化合物Nap-b的化学名称为6-溴-2-(4-吡啶基)-1H-苯并[de]异喹啉-1,3(2H)-二酮。
化合物Nap-p的化学名称为6-(哌嗪-1-基)-2-(吡啶-4-基)-1H-苯并[de]异喹啉-1,3(2H)-二酮。
上述化合物Nap-b的制备方法中：
优选的，步骤(a)4-溴-1，8-萘二甲酸酐与4-氨基吡啶的摩尔比为1∶1～1∶3，回流反应。
优选的，步骤(b)Nap-b与哌嗪的摩尔比至少为1∶1，并在乙二醇单甲醚中进行回流反应。
上述化合物Nap-Co的制备方法中：
优选的，化合物Nap-p和香豆素-3-羧酸比为1∶1～1∶2。
优选的，反应在缩合剂EDCI、酰化催化剂或活化剂DMAP的存在下进行。
优选的，反应温度为0-5℃，反应时间为3-4小时。
本发明制备的荧光传感器Nap-Co-T1、中间体Nap-Co均通过核磁共振氢谱、核磁共振碳谱和高分辨质谱(HR-MS)进行了结构确证，证明具有式(I)、(II)结构。
研究表明：405nm激发条件下，单独Nap-Co-T1溶液仅有微弱的荧光发射；当Nap-Co-T1溶液中加入肝素后，在565nm处的荧光发射强度明显增强，并且荧光响应时间仅5s，响应之后至少30min内都可以保持高强度的荧光发射；而当Nap-Co-T1溶液中加入透明质酸钠、硫酸软骨素、牛血清白蛋白、三磷酸腺苷、硫酸鱼精蛋白、刀豆蛋白A、半胱氨酸、各种离子等其他物质后，所得溶液体系与单独Nap-Co-T1溶液的荧光发射强度相比没有明显变化。因此，Nap-Co-T1可以作为荧光传感器用于肝素的检测或用于制备肝素的检测产品，具有荧光专一的选择性、快速响应、信号强、干扰小、结果准确、稳定性好的优点。
本发明还提供一种用于检测肝素和鱼精蛋白的试剂、试纸或者试剂盒，其中含有荧光传感器Nap-Co-T1。
本发明还提供一种肝素的可视化的荧光检测方法，包括以下步骤：将荧光传感器Nap-Co-T1与待测样品充分接触，在可见光照射下，如果观察到明亮的黄色荧光发射，则表明待测样品中含有肝素。
本发明还提供一种肝素的荧光检测方法，包括以下步骤：以400～450nm为激发波长，检测含荧光传感器分子Nap-Co-T1的待测样品混合物在500～600nm处的荧光发射强度。
本发明还提供了一种检测鱼精蛋白的试剂，为荧光传感器分子Nap-Co-T1和肝素形成的复合物。复合物的制备方法为将肝素和荧光传感器分子Nap-Co-T1混合。肝素与荧光传感器分子Nap-Co-T1的用量比为1-10g:1mmol，优选为1-5g:1mmol,在本发明的一个优选方案中，为3g:1mmol。
本发明还提供一种鱼精蛋白的可视化的荧光检测方法，包括以下步骤：将荧光传感器Nap-Co-T1与肝素形成的复合物并与待测样品充分接触，在可见光照射下，如果对比观察到明亮的黄色荧光猝灭，则表明待测样品中含有鱼精蛋白。
本发明还提供一种鱼精蛋白的荧光检测方法，包括以下步骤：以400～450nm为激发波长，检测含荧光传感器Nap-Co-T1与肝素结合形成的复合物与待测样品混合物在500～600nm处的荧光发射强度。
优选的，荧光传感器Nap-Co-T1的工作浓度为0.2×10-6mol/L～5×10-6mol/L。
优选的，通过肝素浓度与荧光发射强度的线性相关进行定量检测；更优选的，所述定量检测以405nm为激发波长，检测565nm处的荧光发射强度。
优选的，荧光传感器Nap-Co-T1与肝素结合形成的复合物的工作浓度为0.2×10- 6mol/L～5×10-6mol/L。
优选的，通过鱼精蛋白浓度与荧光发射强度的线性相关进行定量检测；更优选的，所述定量检测以405nm为激发波长，检测565nm处的荧光发射强度。
根据荧光传感器Nap-Co-T1识别肝素的线性相关实验，在405nm激发条件下，肝素溶液浓度与565nm处荧光发射强度呈线性相关，线性范围为0-16.5μg/mL，线性方程为y＝6277.6589+6362.0718x，拟合相似度为0.99379，经计算(3σ/k)检出限为0.04μg/mL，这表明荧光传感器Nap-Co-T1具有线性响应、低检测限、高灵敏度的优点，具有较强的应用价值。
根据荧光传感器Nap-Co-T1与肝素结合形成的复合物识别鱼精蛋白的线性相关实验，在405nm激发条件下，鱼精蛋白溶液浓度与565nm处荧光发射强度呈线性相关，线性范围为0-13.5μg/mL，线性方程为y＝83928.48652-6005.80499x，拟合相似度为0.99139，这表明荧光传感器Nap-Co-T1与肝素结合形成的复合物具有线性响应、高灵敏度的优点，具有较强的应用价值。
采用本发明的荧光传感器分子，通过上述方法可以对肝素和鱼精蛋白进行定性和/或定量检测。
本发明的荧光检测方法中，所述待测样品是水体样品或生物样品。所述生物样品包括但不限于人的血清样品、血浆样品、全血样品、尿液样品、组织液样品。
在人血清白蛋白溶液与人工尿液中对肝素的检测实验中，进行了三组实验验证其生物可行性。(1)Hep的加入显著诱导了pH＝4-9范围内的荧光发射强度，说明Nap-Co-T1在生理条件下可用于Hep的检测。(2)在0.05％ HSA溶液中，Nap-Co-T1与Hep复合物的荧光强度随着Hep浓度的增加(0-84μg/mL)逐渐增加，表明该传感器仍能检测到HSA溶液中对Hep的响应。同时，在0-84μg/mL范围内，Hep浓度与荧光发射强度呈良好的线性关系，线性方程为y＝7338.6359+250.96766x，拟合相似度为0.99372。此外，HSA的存在并不影响拮抗剂PRTM对Nap-Co-T1+Hep复合物的作用。在0-120μg/mL范围内，鱼精蛋白浓度与荧光发射强度呈良好的线性关系，线性方程为y＝27555.09466-141.66718x，拟合相似度为0.98435。(3)将2.5％的人工尿液混合在0.05％的HSA溶液中，虽然纯水系统和HSA溶液系统之间的荧光光谱存在差异，但传感器Nap-Co-T1仍能对Hep作出响应，且在Hep浓度为0-111μg/mL的范围内表现出良好的线性关系，线性方程为y＝8873.29233+40.20296x，拟合相似度为0.96369。这样传感器可以避免常见生物检测体系中的干扰，该特性还表明荧光传感器Nap-Co-T1在Hep抗凝治疗和癌症患者尿检中均具有巨大的应用潜力。
本发明合成了新型的荧光增强型传感器Nap-Co-T1，对肝素显示优异的专一选择性，对透明质酸钠、硫酸软骨素、人血清白蛋白、牛血清白蛋白、三磷酸腺苷、硫酸鱼精蛋白、刀豆蛋白A、半胱氨酸、各种离子等其他物质没有明显响应，具有黄色光发射、快速响应(响应时间仅5s)、稳定性好(至少30min内荧光强度稳定)、低检测限(0.04μg/mL)、干扰小、灵敏度高、检测过程简便等优点，在制备肝素、鱼精蛋白的检测产品方面具有较强的实用价值，并且在临床生物检测方面具有较大的应用价值。
附图说明
图1为荧光传感器Nap-Co-T1的荧光选择性图，横坐标为波长(nm)，纵坐标为荧光强度(a.u.)。
图2为荧光传感器Nap-Co-T1对肝素的响应时间图，横坐标为时间(s)，纵坐标为荧光强度(a.u.)。
图3为荧光传感器Nap-Co-T1识别肝素的荧光滴定图，横坐标为波长(nm)，纵坐标为荧光强度(a.u.)。
图4为荧光传感器Nap-Co-T1识别肝素(Hep)的线性相关图，横坐标为Hep溶液浓度(μg/mL)，纵坐标为荧光强度(a.u.)。
图5为荧光传感器Nap-Co-T1对肝素的响应效果图，横坐标为波长(nm)，纵坐标为荧光强度(a.u.)。从上到下的曲线分别为加入了Hep的Nap-Co-T1(Nap-Co-T1+Hep)和未加入Hep的Nap-Co-T1(Nap-Co-T1)
图6为参比荧光传感器Nap-TPA-T2对肝素的响应效果图，横坐标为波长(nm)，纵坐标为荧光强度(a.u.)。。从上到下的曲线分别为加入了Hep的Nap-Co-T2(Nap-Co-T2+Hep)和未加入Hep的Nap-Co-T2(Nap-Co-T2)。
图7为荧光传感器Nap-Co-T1识别肝素的机理图。
图8为荧光传感器Nap-Co-T1与肝素复合物识别鱼精蛋白的荧光滴定图，横坐标为波长(nm)，纵坐标为荧光强度(a.u.)。
图9为荧光传感器Nap-Co-T1与肝素复合物识别鱼精蛋白的线性相关图，横坐标为鱼精蛋白浓度(μg/mL)，纵坐标为荧光强度(a.u.)。
图10为在生理pH范围内Nap-Co-T1检测Hep的可行性测试，横坐标为pH值，纵坐标为荧光强度(a.u.)。
图11为Nap-Co-T1在0.05％的HSA溶液中识别不同浓度的Hep的滴定图，横坐标为波长(nm)，纵坐标为荧光强度(a.u.)。以及Nap-Co-T1在0.05％的HSA溶液中识别不同浓度的Hep的线性相关图，横坐标为Hep溶液浓度(μg/mL)，纵坐标为荧光强度(a.u.)。
图12为Nap-Co-T1与肝素的复合物在0.05％的HSA溶液中识别不同浓度的PRTM的滴定图，横坐标为波长(nm)，纵坐标为荧光强度(a.u.)。以及Nap-Co-T1与肝素复合物在0.05％的HSA溶液中识别不同浓度的PRTM的线性相关图，横坐标为PRTM溶液浓度(μg/mL)，纵坐标为荧光强度(a.u.)。
图13为Nap-Co-T1在含有人工尿液的0.05％ HSA中识别不同浓度Hep的滴定图，横坐标为波长(nm)，纵坐标为荧光强度(a.u.)。以及Nap-Co-T1在含有人工尿液的0.05％的HSA中识别不同浓度的Hep的线性相关图，横坐标为Hep溶液浓度(μg/mL)，纵坐标为荧光强度(a.u.)。
图14为Nap-Co的核磁共振氢谱(1H NMR)。
图15为Nap-Co的核磁共振碳谱(13C NMR)。
图16为Nap-Co的高分辨质谱(HR-MS)。
图17为Nap-Co-T1的核磁共振氢谱(1H NMR)。
图18为Nap-Co-T1的核磁共振碳谱(13C NMR)。
图19为Nap-Co-T1的高分辨质谱(HR-MS)。
图20为Nap-TPA的核磁共振氢谱(1H NMR)。
图21为Nap-TPA的核磁共振碳谱(13C NMR)。
图22为Nap-TPA的高分辨质谱(HR-MS)。
图23为Nap-TPA-T2的核磁共振氢谱(1H NMR)。
图24为Nap-TPA-T2的核磁共振碳谱(13C NMR)。
图25为Nap-TPA-T2的高分辨质谱(HR-MS)。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请权利要求书所限定的范围。
检测设备的型号：荧光光谱仪(英国爱丁堡FS-5)，紫外-可见光谱仪(美国瓦里安Cary-300)，核磁共振波谱仪(德国Bruker advancedⅡ(400M Hz))，高分辨质谱仪(日本岛津LCMS-IT-TOF)。
实施例1化合物Nap-Co-T1、Nap-Co-T2的制备及结构确证
合成路线如下：
一、萘酰亚胺-香豆素荧光结构的制备
4-溴-1,8-萘二甲酸酐(1.24mmol)与4-氨基吡啶(1.31mmol)加入到加入到50mL反应瓶中，用甲苯溶解，在110℃下搅拌过夜。反应结束后旋转蒸发去除溶剂，得到化合物Nap-b。
取化合物Nap-p(312mg、0.87mmol)和香豆素-3-羧酸(162.9mg、0.85mmol)1-乙基-3(3-二甲基丙基氨基)碳二亚胺(EDCI)(488.4mg、2.55mmol)和4-二甲基酰胺吡啶(DMAP)(42.84mg、0.35mmol)加入到50mL反应瓶中。使用二氯甲烷溶解反应物，在0-5℃下搅拌4h。反应结束后旋转蒸发溶剂，产物经硅胶柱层析纯化得到对应的荧光结构，命名为Nap-Co。
二、荧光传感器Nap-Co-T1的制备
(1)4-溴-1,8-萘二甲酸酐(1.385g，5mmol)、4-氨基吡啶(1.410g，15mmol)，加入10mL的甲苯作为溶剂在100mL反应瓶中。该反应在氮气保护下油浴加热到110℃。等待回流温度稳定后，将反应留过夜，在反应溶液中观察到大量的红褐色物质，并附着在反应烧瓶的壁上。反应结束后，用无水乙醇过滤重结晶得到固体为6-溴-2-(4-吡啶基)-1H-苯并[de]异喹啉-1,3(2H)-二酮(命名为Nap-b)。
(2)Nap-b(1.327g，3.75mmol)、哌嗪(0.969g，10.9mmol)加入50mL反应瓶中，取15mL乙二醇单甲醚作为反应溶剂，在配有磁力搅拌器的油浴中以氮气保护下加热至110℃，回流时间为8小时。观察溶液变为橙棕色，反应结束后，大部分溶剂在80℃条件下减压蒸发后，将产物溶解在二氯甲烷中，多次萃取，将有机层混合，用旋转蒸发器浓缩，经过硅胶柱层析纯化得到6-(哌嗪-1-基)-2-(吡啶-4-基)-1H-苯并[de]异喹啉-1,3(2H)-二酮(命名为Nap-p)。
(3)将Nap-Co(100mg，0.19mmol)和溴化苄(0.1mL，约0.84mmol)加入到50mL的反应瓶中，加入乙腈作为溶剂。在磁搅拌油浴中氮气保护下60℃回流6h。反应结束后，反应溶剂被旋转蒸发，得到油状产物。油状产物采用少量的二氯甲烷溶解，并将溶液滴入大量石油醚中析出明黄色沉淀，过滤沉淀。滤饼用无水醚洗涤三次，获得纯净的传感器Nap-Co-T1-a(X-为Br-)。
参照上述方法，用等摩尔量的碘化苄代替溴化苄，制备得到Nap-Co-T1-b。三、参比荧光传感器Nap-TPA-T2的制备
(1)称取三苯胺(2.08g，8.46mmol)放入装有搅拌器的100mL双颈反应瓶中，加入12mL DMF使三苯胺完全溶解。反应瓶密封并用氮气保护。在通风橱中，用注射器取1.2mLPOCl3，在0℃的冰浴环境下逐滴加入反应瓶中。此时，溶液由无色变为浅黄色。30分钟后，将反应物从冰浴中移出，在油浴中逐渐加热至80℃，持续8小时。原料完全反应后，在0℃下加入适量冰水使沉淀析出，用氢氧化钠将溶液pH值调至中性，过滤得到粗产品。滤饼中得到的淡黄色粗品通过柱层析纯化，得到淡黄色固体纯净物，命名为TPA-CHO。
(2)称取TPA-CHO(600mg,2.2mmol)放入100mL反应瓶中，溶解于丙酮和水的混合物中(混合比为4:1)，在反应瓶中加入搅拌器，在氮气保护下油浴升温至60℃，将KMnO4(1.596g,10.1mmol)分三次加入反应液中，反应时间为4h，期间用薄层色谱法(TLC)监测结果。反应完成后，旋转蒸发反应溶液中的丙酮，用水过滤除去KMnO4，滤饼为黑色。然后用盐酸酸化滤液，析出白色絮状沉淀，静置过滤，干燥滤饼，得到产品，命名为TPA-COOH。
(3)萘酰亚胺-三苯胺荧光结构的制备：
Nap-p(338mg、0.94mmol)、TPA-COOH(276.54mg、0.95mmol)、1-乙基-3(3-二甲基丙基丙胺)碳二亚胺(EDCI)(529.1mg、6.5mmol)和4-二甲基亚胺吡啶(DMAP)(46.41mg、6.5mmol)加入到50mL反应瓶中。使用DMF溶解反应物，在0-5℃下搅拌，粗产物在反应结束时加入水析出沉淀，过滤沉淀，产物经硅胶柱层析纯化得到对应的荧光结构，命名为Nap-TPA。
(4)参比传感器Nap-TPA-T2的制备：
将Nap-TPA(150mg，0.24mmol)和溴化苄基(0.35mL)置于一个50mL的反应小瓶中。加入乙腈作为溶剂，在氮气保护下回流6h。在反应结束后，溶剂被旋转蒸发成油性产物。粗产物经硅胶柱层析纯化，由于结构中存在电子，可以在洗脱液中滴入少量三乙胺，得到参比传感器Nap-TPA-T2。
以参比传感器Nap-TPA-T2作为对照例进行后续实验。
四、化合物的结构确证
通过核磁共振氢谱(1H NMR)、核磁共振碳谱(13C NMR)和高分辨质谱(HR-MS)对上述方法制得的Nap-Co、Nap-TPA、Nap-Co-T1和Nap-TPA-T2进行了结构确证，如图14-25。
Nap-Co，531.1661(计算值：531.1668)；Nap-Co-T1，621.2130(计算值：621.2133)；Nap-TPA，630.2494(计算值：630.2505)；Nap-TPA-T2，720.2961(计算值：720.2970)
实施例2荧光传感器分子Nap-Co-T1的选择性
用DMSO配制1×10-3mol/L的Nap-Co-T1-a溶液。
用去离子水配置1.5mg/mL的肝素(Hep)溶液。
用去离子水分别配置1.5mg/mL的其他物质溶液，其他物质选自硫酸软骨素A钠盐(Chs)、透明质酸钠(HA)、磷酸腺苷(ATP)、人血清白蛋白(HSA)、牛血清蛋白(BSA)、刀豆蛋白A(Con A)、溶菌酶(Lys)、L-半胱氨酸(Cys)、L-天冬氨酸(Asp)、谷胱甘肽(GSH)硫酸鱼精蛋白(PRTM)、Cl-、Br-、H2PO4 -和CO3 2-。
在每个比色皿中加入2mL水和10μL上述Nap-Co-T1-a溶液，之后分别加入上述的肝素溶液、其他物质溶液20μL，用荧光光谱仪考察了传感器Nap-Co-T1对肝素和其他物质的选择性，在405nm激发条件下，检测565nm处的荧光发射强度。结果如图1所示，单独的传感器Nap-Co-T1溶液(Blank)在565nm处有微弱的荧光发射强度，当加入肝素后，在565nm处的荧光发射强度明显增强，但是加入其它物质后，所得溶液体系的荧光发射强度与单独传感器溶液的荧光发射强度相比没有明显变化。
以上实验结果表明，荧光传感器Nap-Co-T1对肝素具有较好的荧光专一选择性，而对人血清白蛋白、牛血清白蛋白、硫酸软骨素、透明质酸钠、三磷酸腺苷、硫酸鱼精蛋白、刀豆蛋白A、半胱氨酸、各种阴离子等其他物质没有明显响应。
实施例3荧光传感器Nap-Co-T1对肝素的响应时间
用DMSO配制1×10-3mol/L的Nap-Co-T1-a溶液。
用去离子水配置1.5mg/mL的肝素溶液。
在比色皿中加入2mL去离子水、10μL上述Nap-Co-T1-a溶液和20μL上述肝素溶液,用荧光光谱仪考察荧光传感器Nap-Co-T1-a对肝素的响应时间，激发波长405nm，检测565nm处的荧光发射强度。
结果如图2所示，Nap-Co-T1可以在5s内对肝素响应，产生明显的荧光，而且强度可以维持30min以上。这证明荧光传感器Nap-Co-T1对肝素能够快速响应，实现快速检测。因而，荧光传感器Nap-Co-T1适合用于制备肝素的检测产品，例如试剂、试纸或试剂盒，响应快速准确，信号强。
实施例4荧光传感器Nap-Co-T1识别肝素的荧光滴定图和线性相关图
用DMSO配制1×10-3mol/L的Nap-Co-T1-a溶液。
用去离子水配置1.5mg/mL的肝素溶液。
把2mL水和10μL上述Nap-Co-T1-a溶液分别加入到11个干净的荧光比色皿中，在每个比色皿中逐渐加入上述肝素溶液的体积分别为0μL、2μL、4μL、6μL、8μL、10μL、12μL、14μL、16μL、18μL、20μL和22μL。以405nm为激发波长，在荧光光谱仪上测定每个样品的荧光发射强度。
以荧光发射波长为横坐标、荧光发射强度为纵坐标，得到荧光传感器Nap-Co-T1识别肝素的荧光滴定图(图3)。结果显示：随着比色皿中肝素溶液的浓度逐渐增加到16.5μg/mL，传感器Nap-Co-T1的荧光发射强度随之增加；并且，在不同的肝素溶液浓度下，荧光发射曲线的主峰都基本位于565nm处。
以肝素溶液浓度为横坐标、565nm荧光发射强度为纵坐标，得到荧光传感器Nap-Co-T1识别肝素的线性相关图(图4)。如图显示，肝素溶液浓度与荧光发射强度呈线性相关，线性范围为0-16.5μg/mL，线性方程为y＝6277.6589+6362.0718x，拟合相似度为0.99379，经计算(3σ/k)，荧光传感器Nap-Co-T1对肝素的检出限为0.04μg/mL，这表明传感器具有线性响应、低检测限、高灵敏度的优点，具有较强的应用价值。
实施例5Nap-Co-T1和Nap-TPA-T2对肝素的响应效果
用DMSO分别配制1×10-3mol/L的Nap-Co-T1-a和Nap-TPA-T2的溶液。
用去离子水配置1.5mg/mL的肝素溶液。
分别取上述Nap-Co-T1和Nap-TPA-T2的溶液各10μL加入到干净的荧光比色皿中，再分别加入2mL水和20μL上述肝素溶液。以405nm为激发波长，在荧光光谱仪上测定荧光发射强度，以波长为横坐标、荧光强度为纵坐标，得到Nap-Co-T1和Nap-TPA-T2对肝素的响应效果图，如图5、图6。结果显示，在加入Hep前后，Nap-Co-T1在500-650nm波长下的的荧光强度有极为明显增强，而Nap-TPA-T2的荧光强度变化不大。
用Nap-Co-T1-b代替实施例3-5的Nap-Co-T1-a，即Br-替换为I-，效果相似。
实施例6机理探讨
利用参比荧光传感器Nap-TPA-T2来探讨本发明荧光传感器Nap-Co-T1的检测机理。
Nap-TPA-T2作为对照，它具有与Nap-Co-T1相同的“供体-连接桥-受体”结构，且同一分子结构中均含有两个荧光团。在染料分子传感器的设计与FRET平台构建的研究中，通过调节不同的荧光团供体受体来得到不同的激发和发射，以及传感器不同结构造成的供体受体间距离的不同，这些都会影响荧光传感器FRET平台的构建，进而影响传感器的特性。两种传感器均采用萘酰亚胺作为FRET结构中的能量受体，选择不同的荧光团香豆素和三苯胺作为能量供体。与三苯胺相比，香豆素在作为能量供体时，不论是在激发和发射光谱的重叠度方面还是供体与受体的距离方面，都能够与萘酰亚胺更好的构建FRET平台。
图7为荧光传感器Nap-Co-T1识别肝素的机理图。机理探讨认为：荧光传感器Nap-Co-T1在溶液中处于自由旋转状态，加入肝素后，吡啶阳离子能够快速识别肝素使传感器并与其结合，同时肝素的加入使溶液粘度增加，传感器旋转受到抑制，进入扭曲的分子内电荷转移态，受激发释放出强烈的荧光，进一步溶液体系释放出荧光信号，荧光显著增强，实现对肝素的检测。
实施例7Nap-Co-T1与肝素形成的复合物对鱼精蛋白的响应
用DMSO分别配制1×10-3mol/L的Nap-Co-T1-a溶液。
用去离子水配置1.5mg/mL的肝素溶液。
用去离子水配置1.5mg/mL的鱼精蛋白溶液。
把2mL水和10μL上述Nap-Co-T1-a溶液和20μL上述肝素溶液分别加入到11个干净的荧光比色皿中，在每个比色皿中逐渐加入上述鱼精蛋白溶液的体积分别为0μL、2μL、4μL、6μL、8μL、10μL、12μL、14μL、16μL、18μL。以405nm为激发波长，在荧光光谱仪上测定每个样品的荧光发射强度。以荧光发射波长为横坐标、荧光发射强度为纵坐标，得到Nap-Co-T1与肝素的复合物和鱼精蛋白的荧光滴定图(图8)。结果显示：随着比色皿中鱼精蛋白溶液的浓度逐渐增加到13.5μg/mL，传感器Nap-Co-T1与肝素复合物的荧光发射强度随之降低。并且，在不同的鱼精蛋白溶液浓度下，荧光发射曲线的主峰都基本位于565nm处。这进一步表明作为拮抗剂的鱼精蛋白对复合物具有荧光猝灭的效果。
以鱼精蛋白溶液浓度为横坐标、565nm荧光发射强度为纵坐标，得到荧光传感器Nap-Co-T1与肝素复合物识别鱼精蛋白的线性相关图(图9)。结果显示，鱼精蛋白溶液浓度与荧光发射强度呈线性相关，线性范围为0-13.5μg/mL，线性方程为y＝83928.48652-6005.80499x，拟合相似度为0.99139，这表明传感器与肝素形成复合物具有线性响应、低检测限、高灵敏度的优点，具有较强的应用价值。
用Nap-Co-T1-b代替Nap-Co-T1-a进行实验，效果相似，对于鱼精蛋白的检测有较好的灵敏度和线性关系。
实施例8荧光传感器Nap-Co-T1在人血清白蛋白溶液与人工尿液中的荧光响应
用DMSO配制1×10-3mol/L的Nap-Co-T1-a溶液。
用去离子水和盐酸溶液与氢氧化钠溶液配置pH＝4-9的去离子水。
用去离子水配置1.5mg/mL的肝素(Hep)水溶液。
用去离子水配置1.5mg/mL的鱼精蛋白(PRTM)水溶液。
用去离子水配置0.05％的人血清白蛋白(HSA)水溶液。
用去离子水配制人工尿液。人工尿液由55mmol/L氯化钠、2.6mmol/L硫酸钙、67mmol/L氯化钾、29.6mmol/L硫酸钠、3.2mmol/L硫酸镁、19.8mmol/L磷酸二氢钠、9.8mmol/L肌酐和310mmol/L尿素组成。
分别取2mL pH＝4-9的去离子水加入到干净的荧光比色皿中，再取10μL上述Nap-Co-T1-a溶液和20μL肝素溶液加入各比色皿中。以405nm为激发波长，在荧光光谱仪上测定荧光发射强度，得到Nap-Co-T1在生理pH范围内对肝素的检测响应效果图(图10)。
将2mL 0.05％HSA溶液和10μL上述Nap-Co-T1-a溶液加入到每个干净的荧光比色皿中。将0μL、8μL、16μL、24μL、32μL、40μL、48μL、56μL、64μL、72μL、80μL、88μL、96μL、104μL、112μL的上述肝素分别加入Nap-Co-T1溶液中，在激发波长405nm条件下，用荧光光谱仪测定565nm处的荧光发射强度，以波长为横坐标、荧光强度强度为纵坐标，得到荧光传感器Nap-Co-T1在0.05％ HSA溶液中对肝素的荧光响应图，肝素溶液浓度与荧光发射强度呈线性相关，线性范围为0-84μg/mL，线性方程为y＝7338.6359+250.96766x，拟合相似度为0.99372(图11)。
将2mL 0.05％HSA溶液、10μL上述Nap-Co-T1-a溶液和112μL肝素溶液加入到每个干净的荧光比色皿中，形成Nap-Co-T1+Hep复合物。将0μL、20μL、40μL、60μL、80μL、100μL、120μL、140μL、160μL的上述鱼精蛋白溶液分别加入Nap-Co-T1溶液中，在激发波长405nm条件下，用荧光光谱仪测定565nm处的荧光发射强度，以波长为横坐标、荧光强度强度为纵坐标，得到荧光传感器Nap-Co-T1在0.05％ HSA溶液中对Nap-Co-T1+Hep复合物的荧光响应图，鱼精蛋白溶液浓度与荧光发射强度呈线性相关，线性范围为0-120μg/mL，线性方程为y＝27555.09466-141.66718x，拟合相似度为0.98435(图12)。
将1.95mL 0.05％HSA溶液和50μL人工尿液混合，并将10μL上述Nap-Co-T1溶液加入到每个干净的荧光比色皿中。将0μL、8μL、22μL、36μL、50μL、64μL、78μL、92μL、106μL、120μL、134μL、148μL的上述肝素分别加入Nap-Co-T1溶液中，在激发波长405nm条件下，用荧光光谱仪测定565nm处的荧光发射强度，以波长为横坐标、荧光强度为纵坐标，得到荧光传感器Nap-Co-T1在0.05％ HSA溶液与2.5％人工尿液混合溶液中对肝素的荧光响应图，肝素溶液浓度与荧光发射强度呈线性相关，线性范围为0-111μg/mL，线性方程为y＝8873.29233+40.20296x，拟合相似度为0.96369(图13)。
以上结果表明，Nap-Co-T1在Hep抗凝治疗和癌症患者尿检中均具有巨大的应用潜力。
以上实施例2-8是以Nap-Co-T1-a(X＝Br-)为例进行了荧光传感器Nap-Co-T1的相关测试。当采用本发明具有其他配位负离子的荧光传感器Nap-Co-T1进行如实施例2-8的测试时，测试结果与Nap-Co-T1-a的测试结果一致。

Claims (9)

1.一种萘酰亚胺类荧光传感器分子，其特征在于，具有式(Ⅰ)所示的结构，
其中X选自F、Cl、Br或I。
2.权利要求1所述的萘酰亚胺类荧光传感器分子的制备方法，其特征在于，由式(Ⅱ)所示化合物与式(Ⅲ)所示化合物反应而得；
其中X选自F、Cl、Br或I。
3.权利要求1所述的荧光传感器在检测肝素和/或鱼精蛋白方面的应用，或者在制备检测肝素和/或鱼精蛋白的产品方面的应用。
4.一种用于检测肝素和/或鱼精蛋白的试剂、试纸或者试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的萘酰亚胺类荧光传感器分子。
5.一种肝素的可视化的荧光检测方法，包括以下步骤：
将权利要求1所述的荧光传感器与待测样品充分接触，在可见光照射下观察是否产生明黄色荧光，如果观察到明显的明黄色荧光发射，则表明待测样品中含有肝素。
6.一种检测肝素的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：以400～450nm为激发波长，检测权利要求1所述荧光传感器与待测样品的混合物在550～600nm处的荧光发射强度。
7.一种用于检测鱼精蛋白的试剂，其特征在于，为权利要求1所述荧光传感器分子与肝素的复合物。
8.一种鱼精蛋白的可视化荧光检测方法，包括以下步骤：将权利要求7所述的试剂与待测样品混合，在可见光照射下观察是否有荧光猝灭；如果对比观察到明显的荧光猝灭，则表明待测样品中含有鱼精蛋白。
9.一种鱼精蛋白的荧光检测方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求7所述的试剂与待测样品充分接触，以400～450nm为激发波长，检测550～600nm处的荧光发射强度。
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YANAN LI，等: "Design of "Off-On-Off" fluorescence sensors for Heparin detection by precise modulation of molecular structure", 《SPECTROCHIMICA ACTA PART A: MOLECULAR AND BIOMOLECULAR SPECTROSCOPY》, vol. 320, 8 June 2024 (2024-06-08), pages 124630, XP087556785, DOI: 10.1016/j.saa.2024.124630 *

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