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CN118979011A - 人多能干细胞单细胞的建系方法 - Google Patents

人多能干细胞单细胞的建系方法 Download PDF

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CN118979011A
CN118979011A CN202411473228.2A CN202411473228A CN118979011A CN 118979011 A CN118979011 A CN 118979011A CN 202411473228 A CN202411473228 A CN 202411473228A CN 118979011 A CN118979011 A CN 118979011A
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cell
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张云
景思佳
顾佳斌
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Hangzhou Ruipu Chenchuang Technology Co ltd
Original Assignee
Hangzhou Ruipu Chenchuang Technology Co ltd
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Abstract

本申请涉及一种适合多能干细胞（PSC）单细胞建系的方法，所述方法的特征在于建系培养基、单细胞获取方式和单细胞生长培养基的使用，所述建系培养基包含ROCK抑制剂、MEK抑制剂和GSK3抑制剂，所述单细胞获取方式为有限稀释法，所述单细胞生长培养基包含CloneR2。本申请还涉及所述方法使用的培养基，所述培养基在维持多能干细胞单细胞的干性和促进多能干细胞单细胞增殖上具有优势。

Description

人多能干细胞单细胞的建系方法
技术领域
本申请涉及生物医药领域，具体的涉及一种人多能干细胞（PSC）的建系方法。
背景技术
近年来，干细胞研究已经发展成为一个具有广阔前景的领域，推动了干细胞在再生医学领域的基础转化和临床进步。尤其是以人胚胎干细胞（human embryonic stemcell, hESC）和人诱导多能干细胞（human induced pluripotent stem cell, hiPSC）为例的多能干细胞（PSC），在再生医学和移植医学、疾病建模、药物发现筛选和人类发育生物学等方面具有重要意义。但若应用于生产目前仍有许多问题有待解决，首要的是改进干细胞建系方法。
hESC是首先得到研究和应用的干细胞。hESC通过从发育至囊胚阶段的胚胎中分离获得。经典的胚胎干细胞建系方法首先是酶解去除透明带或利用机械法直接分离囊胚的透明带，采用免疫外科学的方法，使用动物血清使滋养层溶解，将分离的内细胞团（innercell mass, ICM）放置在小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblast, MEF）上培养，最终得到hESC。为了克服与hESC相关的伦理和免疫原性挑战，hiPSC已成为一种有前景的替代品。目前已有的建系方法如下：（1）通过四种或三种转录因子的逆转录病毒转导进行hiPSC建系;（2）利用仙台病毒、游离质粒、RNA、小分子化合物等非整合重编程方法创建不携带外源性重编程因子的hiPSC细胞系。
hESC和hiPSC的建系基本都基于含异种成分血清的培养条件，通过机械分离法得到细胞团，最后接种至饲养层细胞上建系。而对于临床转化，多能干细胞的建立和维持应尽可能在无异种成分及无饲养层的培养条件下进行。越来越多的研究开始探索稳定的无血清无饲养层条件下的建系方法。另一方面，根据国际人用药品注册技术协调会(ICH)指导原则，生产用细胞系必须是来源于单个细胞，因此单细胞建系也是干细胞系开发中不可或缺的一个环节。但单细胞建系存在瓶颈。hiPSC对各种环境因素敏感，如渗透压、pH值、营养有效性、机械应力等；最重要的是，在单细胞建系过程中，由于细胞-细胞和细胞-细胞外基质（extracellular matrix, ECM）相互作用丧失和上述因素的共同影响，会导致单细胞存活率显著降低以及干性丧失，大大增加了建系难度。因此，在无血清、无饲养层条件下进行hiPSC的单细胞建系，是否能够维持hiPSC长期体外生长而不改变其特性，且在长期培养过程中是否存在更高的产生异常核型hiPSC的风险尚不明确。
可见，本领域仍然需要开发一种在无血清、无饲养层条件下进行的人多能干细胞的单细胞建系方法，并且该建系方法需要能够满足单细胞存活、单克隆源性验证、干性维持及保持遗传稳定性等多方面的要求。
发明内容
本发明的发明人通过研究发现，在人多能干细胞的单细胞建系方法中使用特定成分的培养基结合获得单细胞的特定手段，能够获得具有理想性质的人多能干细胞单克隆细胞系，由此完成了本发明。在此基础上，发明人还发现通过本发明的方法获得的人多能干细胞单克隆细胞系特别适合用于胰岛β细胞的分化，这体现在分化后的胰岛细胞中胰岛β细胞占比最高。
第一方面，本申请提供一种建立多能干细胞(PSC)的单克隆细胞系的方法，所述方法包括建系培养基和/或单细胞生长培养基的使用。所述建系培养基和/或单细胞生长培养基在单克隆建系过程中起到了维持干性和增殖能力的作用。
在具体的实施方式中，所述方法包含所述建系培养基的使用，所述建系培养基包含ROCK抑制剂、MEK抑制剂和GSK3抑制剂。在进一步的实施方式中，所述方法还包含CloneR2的使用。
在具体的实施方式中，所述方法还包含所述单细胞生长培养基的使用，所述单细胞生长培养基包含CloneR2。
在具体的实施方式中，所述建系培养基中的ROCK抑制剂为Y-27632。在具体的实施方式中，所述MEK抑制剂为PD0325901。在具体的实施方式中，所述GSK3抑制剂为CHIR-99021。
在进一步的实施方式中，所述建系培养基还包含人调蛋白、生长因子和抗氧化剂。
在具体的实施方式中，所述人调蛋白为重组人调蛋白β1。在具体的实施方式中，所述生长因子为成纤维细胞生长因子2 (FGF2)。在具体的实施方式中，所述抗氧化剂为维C磷酸酯钠。
在优选的实施方式中，所述多能干细胞为诱导多能干细胞（iPSC），更优选为人iPSC。
在某些实施方式中，所述方法包含在取得多能干细胞的单细胞前，将多能干细胞在建系培养基中培养。在优选的实施方式中，将接触10-12天。经建系培养基处理过后的多能干细胞在用于单克隆分选时在维持干性和增殖能力方面具有优势。
在某些实施方式中，所述方法包括：
(1) 从经过建系培养基培养的多能干细胞培养物取得多能干细胞的单细胞；
(2) 将步骤(1)取得的所述多能干细胞的单细胞在单细胞生长培养基中培养，以形成多能干细胞的单克隆；
(3) 将步骤(2)获得的多能干细胞的单克隆在完全培养基中培养。
在某些实施方式中，在所述步骤(1)中，多能干细胞的单细胞通过有限稀释法取得。在优选的实施方案中，将经过建系培养基培养的多能干细胞培养物稀释至2-200个细胞/mL，优选为5-120个细胞/mL。
在进一步的实施方式中，在步骤(2)中，将挑取的所述多能干细胞的单细胞在单细胞生长培养基中培养3-5天，优选为4天。
在进一步的实施方式中，在步骤(3)中，将所述多能干细胞的单克隆在所述完全培养基中培养至建系终点。
第二方面，本申请提供使用第一方面的方法建立的多能干细胞(PSC)的单克隆细胞系制备下游细胞的用途。在优选的实施方式中，所述细胞为胰岛细胞，优选胰岛β细胞。
在某些实施方式中，所述分化方法包括将所述多能干细胞的单克隆细胞系与分化诱导剂接触的步骤，其包括如下六个阶段：
(1) 将细胞与第一阶段分化诱导剂组合物接触；
(2) 将细胞与第二阶段分化诱导剂组合物接触；
(3) 将细胞与第三阶段分化诱导剂组合物接触；
(4) 将细胞与第四阶段分化诱导剂组合物接触；
(5) 将细胞与第五阶段分化诱导剂组合物接触；和
(6) 将细胞与第六阶段分化诱导剂组合物接触。
第一阶段分化诱导剂组合物包含如下小分子化合物或由如下小分子化合物组成：TGF-β激活剂，GSK-3α/β抑制剂，PI3K抑制剂，ROCK抑制剂。更具体地，第一阶段分化诱导剂组合物由如下小分子化合物组成：激活素A；CHIR-99021；PI-103；Y-27632。更具体地，第一阶段分化诱导剂组合物由如下各组的小分子化合物组成：
（S1D1）激活素A；CHIR-99021；PI-103；Y-27632；
（S1D2-D4）激活素A。
第二阶段分化诱导剂组合物包含如下小分子化合物或由如下小分子化合物组成：ALK5抑制剂；Wnt通路抑制剂；角质细胞生长因子。更具体地，第二阶段分化诱导剂组合物由如下小分子化合物组成：SB431542；WntC59；KGF。
第三阶段分化诱导剂组合物包含如下小分子化合物或由如下小分子化合物组成：BMP I 型受体抑制剂；视黄酸；Smo拮抗剂；Wnt通路抑制剂。更具体地，第三阶段分化诱导剂组合物由如下小分子化合物组成：LDN-193189；RA；Sant1；WntC59。
第四阶段分化诱导剂组合物包含如下小分子化合物或由如下小分子化合物组成：sirtuins抑制剂；生长因子；PKC激活剂；Smo拮抗剂；ROCK抑制剂。更具体地，第四阶段分化诱导剂组合物由如下小分子化合物组成：尼克酰胺；人表皮生长因子；TPB；Sant1；Y-27632。更具体地，第四阶段分化诱导剂组合物有如下各组的小分子化合物组成：
（S4D1）尼克酰胺；人表皮生长因子；TPB；Sant1；Y-27632；
（S4D2-D6）尼克酰胺；人表皮生长因子；TPB；Sant1；
第五阶段分化诱导剂组合物包含如下小分子化合物或由如下小分子化合物组成：BMP 信号抑制剂；抗凝剂；甲状腺激素；TGFβR-1/ALK5抑制剂；ROCK抑制剂；Wnt通路抑制剂；γ- 分泌酶抑制剂；多信号通路激活剂。更具体地，第五阶段分化诱导剂组合物由如下小分子化合物组成：LDN-193189；肝素钠；三碘甲状腺原氨酸；ALK5抑制剂II；Y-27632；WntC59；XXI；ISX9。
（S5D1-D3）LDN-193189；肝素钠；三碘甲状腺原氨酸；ALK5抑制剂II；Y-27632；WntC59；XXI；ISX9；
（S5D4-D6）LDN-193189；肝素钠；三碘甲状腺原氨酸；ALK5抑制剂II；Y-27632；WntC59；XXI；
第六阶段分化诱导剂组合物包含如下小分子化合物或由如下小分子化合物组成：TGFβR-1/ALK5抑制剂；抗凝剂；甲状腺激素；Axl抑制剂；ROS抑制剂。更具体地，第六阶段分化诱导剂组合物由如下小分子化合物组成：ALK5抑制剂II；肝素钠；三碘甲状腺原氨酸；R428；乙酰半胱氨酸；硫酸锌。
第三方面，本申请提供用于第一方面所述的建系方法的培养基组合物，其包含建系培养基和单细胞生长培养基。
在具体的实施方式中，所述建系培养基包含ROCK抑制剂、MEK抑制剂和GSK3抑制剂。
在具体的实施方式中，所述建系培养基中的ROCK抑制剂为Y-27632。在具体的实施方式中，所述MEK抑制剂为PD0325901。在具体的实施方式中，所述GSK3抑制剂为CHIR-99021。
在具体的实施方式中，所述单细胞生长培养基包含CloneR2。
在进一步的实施方式中，所述建系培养基还包含人调蛋白、生长因子和抗氧化剂。
在具体的实施方式中，所述人调蛋白为重组人调蛋白β1。在具体的实施方式中，所述生长因子为成纤维细胞生长因子2 (FGF2)。在具体的实施方式中，所述抗氧化剂为维C磷酸酯钠。
通过在单克隆多能干细胞建系中引入上述建系培养基和单细胞生长培养基，本发明获得的单克隆多能干细胞具有如下的优势：（1）单细胞存活率高，单克隆形成效率最高达25%，当接种密度为每孔0.5个细胞时，孔内有且仅有单克隆出现；（2）单克隆多能干细胞核型正常，具有遗传稳定性；（3）干性稳定，干性抗体分析结果表明单细胞挑传建系获得的单克隆人多能干细胞系具有良好的干性维持能力；（4）能够有效对接下游分化，分化测试结果证明经此单细胞挑传方法获得的多能干细胞系可以有效对接胰岛分化。用本申请保护的单克隆建系方法和/或培养基既能有效的克服细胞团来源的多能干细胞的固有劣势（如不符合ICH指导原则），也能够达到获得适用于生产的单克隆多能干细胞的目的，为进一步获得适用于生产的多能干细胞提供了种子细胞来源，更为后续工艺开发、临床前和临床工作奠定基础。
本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本申请的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本申请的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本申请的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地，本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。
附图说明
本申请所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本申请所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明如下：
图1显示的是本申请所述建立iPSC的单克隆细胞系的方法中标记的第0天单细胞图像，标尺为200 μm。
图2显示的是本申请所述建立iPSC的单克隆细胞系的方法中经标记、追踪后得到的单克隆图像，标尺为200 μm。
图3显示的是通过本申请所述建立iPSC的单克隆细胞系的方法获得的iPSC单克隆细胞系和对照组的核型图。
图4-图9显示的是流式细胞术分析本发明的iPSC的单克隆细胞系和对照组干性的结果。图4显示的是染Nanog抗体的结果；图5显示的是染OCT4抗体的结果；图6显示的是染SOX-2抗体的结果；图7显示的是染SSEA抗体的结果；图8显示的是染Tra-1-60抗体的结果；图9显示的是染Tra-1-81抗体的结果。其中，空白代表一抗和二抗都不染，对照代表二抗单染的结果，实验代表一抗、二抗都染的结果，对应抗体的阳性率的计算方式为（阳性率实验-阳性率空白）-（阳性率对照-阳性率空白）。
图10显示的是在使用本发明保护的包含CloneR2的单细胞生长培养基以及使用包含Y-27632的单细胞生长培养基在单克隆形成效率方面的对比。
图11显示的是不同单细胞分离方法对本发明单克隆形成效率的影响。
图12显示的是经过不同成分的建系培养基培养后，第一批次iPSC的增殖状态示意图。
图13显示的是经过不同成分的建系培养基培养后，第一批次iPSC中每孔长出的克隆数统计图。
图14-图15显示的是流式细胞术分析经过不同成分的建系培养基培养后的第一批次iPSC单克隆细胞的干性结果。图14显示的是染OCT4抗体的结果；图15显示的是流式细胞术上机之前统计的不同组的每孔细胞总数。
图16显示的是经过不同成分的建系培养基培养后，第二批次iPSC的增殖状态示意图。
图17-图18显示的是流式细胞术分析经过不同成分的建系培养基培养后的第二批次iPSC单克隆细胞的干性结果。图17显示的是染OCT4抗体的结果；图18显示的是流式细胞术上机之前统计的不同组的每孔细胞总数。
图19显示的是单细胞生长培养基的不同成分对本发明单克隆形成效率的影响。
图20-图21显示的是在将本发明的单克隆人多能干细胞系用于后续胰岛诱导分化之后，通过流式细胞术分析分化效率的结果。图20显示的是胰岛分化S1阶段的分化效率，其中，SOX17和FOXA2代表定向内胚层的标记；图21显示的是胰岛分化S6阶段的分化效率，其中，ARX和GCG双阳性为胰岛α细胞的标记，SST和HHEX双阳性为胰岛δ细胞的标记，NKX6.1和Cpep双阳性为胰岛β细胞的标记。
图22显示的是建立单克隆人多能干细胞系的文字流程图。
图23显示的是建立单克隆人多能干细胞系的图片流程图，标尺为200 μm。
通过本申请所述建立iPSC的单克隆细胞系的方法获得的iPSC单克隆细胞系为图中所示ZF2301-63#-P5和ZF2301-67#-P5；对照组是细胞团来源的iPSC，为ZF2301-26#-P5和ZF2301-27#-P5。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。
术语定义
除非本申请另有定义，本申请中使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非语境另有要求，单数术语应包括复数，且复数术语应包括单数。通常，本申请所述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸是本领域技术人员所公认的概念。
在本申请中，术语“多能干细胞”通常是指具有无限增殖能力和多胚层分化能力的细胞。与成体干细胞单一胚层的分化能力不同，所述多能干细胞具有分化成外胚层、中胚层、内胚层细胞的能力。具体而言，所述多能干细胞可以包括胚胎干细胞（ESC）和诱导多能干细胞（iPSC），两者在功能和结构上高度相似，只是在来源上存在区别。
在本申请中，术语“诱导多能干细胞”或者“iPSC”是指通过遗传修饰(geneticmodification)和/或非整合(integration-free)重编程方法和/或小分子混合物(smallmolecule cocktail)处理非多能性细胞如体细胞而获得的多能干细胞。
术语“非多能性细胞(non-pluripotent cell)”指通常情况下不具有多能性的细胞。非多能性细胞包括分化的细胞，如体细胞（例如皮肤细胞、成纤维细胞、血细胞、免疫细胞、尿液细胞、激素分泌细胞、肾上腺髓质细胞、乳腺细胞、中枢神经系统(CNS)细胞、胶质细胞、周围神经系统(PNS)细胞、肌肉细胞、造血细胞、骨细胞、肝细胞、脂肪细胞、肾细胞、肺脏细胞、软骨细胞等）；或部分分化的细胞，如不具有多能性的各类祖细胞，或能够分化为特定细胞类型的专能干细胞，或具有多种分化潜能但分化谱不够广泛的成体干细胞（如间充质干细胞）。非多能性细胞的定义与细胞是否具有分裂能力无关。
术语“重编程”在本发明的上下文中指将不具有多能性的细胞转化成具有多能性的细胞的过程。“重编程”可以通过将一些转录因子（比如，山中四因子）转导进细胞内完成，也可以通过小分子化合物处理细胞完成，也可以同时使用转录因子和小分子化合物处理细胞完成。
术语“化学重编程”在本发明的上下文中指仅使用化学分子处理细胞，而不借助遗传工程（比如转录因子的表达或敲低/敲除）手段的重编程过程。
本发明的重编程的细胞在没有特别说明的情况下均为哺乳动物细胞，例如人细胞。
术语“小分子化合物”在本发明的上下文中指分子量小于2000道尔顿，优选小于1000道尔顿的化合物。
在本申请中，术语“化学诱导多能干细胞”或者“CiPSC”是指通过化学重编程获得的诱导多能干细胞。
在本申请中，术语“单克隆”是指源自于同一个细胞分裂形成的细胞团。术语“单细胞”是指前述单克隆的分裂起点，其形态即为单个细胞。具体来说，所述单细胞可以分散在稀释倍数足够的细胞液中，该细胞液还存在其他细胞；也可以是存在于小培养体系中（比如48孔板，96孔板或者384孔板中的某一个孔），该体系中不存在其他细胞。
在本申请中，术语“建系培养基”和“单细胞生长培养基”可以是指本申请保护的建立多能干细胞单克隆细胞系的方法中使用的包含特定成分的“建系培养基”、“单细胞生长培养基”，也可以是指在所述方法中的建系阶段、单细胞生长阶段使用到的成分不特定的培养基。所述“建系培养基”、“单细胞生长培养基”的具体指代，可以通过上下文来进行判断。在本申请中，术语“有限稀释法”是一种常用的获取单细胞的方法。主要是通过将高浓度细胞液梯度稀释或直接稀释以获得极低浓度的细胞液，并将极低浓度的细胞液接种于培养液使其增殖产生单克隆细胞系。
在本申请中，术语“建系终点”是指单克隆iPSC的培养终点。单克隆iPSC在培养终点应具有一定规模（比如细胞数量至少达到103数量级甚至更高）且具有稳定增殖能力。
在本申请中，术语“完全培养基”在未指明的情况下，是指不包含任何本申请所特指出来的添加剂的分子的培养基。所述特指出来的添加剂，是指本申请中特别载明的组合物成分，例如“所述单细胞生长培养基包括CloneR2”中“CloneR2”即为特指出来的添加剂。本领域技术人员需要区分本申请笼统说明的添加剂（比如B27、非必需氨基酸等）或者本申请实施例中提到的相关培养基的具体配方。
在本申请中，术语“患者”通常可包括人、非人灵长类动物（例如，猴子）或其他动物，特别是哺乳动物，例如牛、马、猪、绵羊、山羊、狗、猫或啮齿动物，例如小鼠和大鼠。在特别优选的实施方案中，患者是人。
在本申请中，术语“和/或”应当理解为由用于连接的多个要素中的任何一个要素或任意几个要素的组合。
在本申请中，术语“包含”或包括通常是指包括明确指定的特征，但不排除其他要素。
在本申请中，术语“选自”通常是指包括选择的对象以及其所有组合。例如“选自A、B和C”意指包括A、B和C的所有组合，例如，A、B、C、A+B、A+C、B+C、或A+B+C。
在本申请中，术语“约”通常是指在指定数值以上或以下0.5% -10%的范围内变动，例如在指定数值以上或以下0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%、6%、6.5%、7%、7.5%、8%、8.5%、9%、9.5%、或10%的范围内变动。
本领域技术人员应该理解的是，为了方便表述，在本发明的上下文中将作为重编程或分化诱导剂的化合物组合称为“诱导剂组合物”，但这并不意味着它们必须作为一个物理上不可分割的整体使用，而是还涵盖了将它们分开使用的情况。换言之，本发明的诱导剂组合物中包含的每种小分子化合物可以以相互独立的方式存在和使用。例如，作为诱导剂的所述小分子化合物可以存在于多个不同的组合物之中，例如存在于不同阶段的培养基之中，并且每种培养基中存在的诱导剂组合可以有重叠。在使用所述诱导剂组合物的方法中，例如在重编程方法中，可以在相同或不同的时间点使用所述诱导剂组合物中包含的各个小分子化合物，并且每种小分子化合物在体系中存在的时间可以相同也可以不同。以上这些实施方式均涵盖在本发明的范围之内。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域一般技术人员通常理解的相同含义。本文中描述了用于本发明中的方法和材料；也可以使用本领域中已知的其他合适的方法和材料。材料、方法和实施例只是说明性的，而并非限制性的。本文中提到的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目和其他参考文献都以全文引用的方式并入。在存在冲突时，以本发明说明书(包括定义)为准。
发明详述
培养基
一方面，本申请提供一种建立多能干细胞(PSC)的单克隆细胞系的方法。所述方法的特征在于建系培养基和/或单细胞生长培养基的使用。所述建系培养基和/或单细胞生长培养基在单克隆建系过程中起到了维持干性和增殖能力的作用。
在某些实施方式中，所述方法可以包含建系培养基的使用，所述建系培养基可以包含ROCK抑制剂、MEK抑制剂和GSK3抑制剂。在某些实施方式中，所述方法还可以包含CloneR2的使用。
ROCK抑制剂是指抑制或降低细胞内ROCK（Rho相关蛋白激酶）蛋白功能或其信号通路的任何物质，例如小分子、siRNA、miRNA、反义RNA等。ROCK是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，它在细胞的多种生物学过程中发挥着重要作用，包括细胞骨架的重组、细胞形态的维持、细胞增殖、迁移和凋亡等。所述抑制或降低ROCK蛋白功能的方法可以是下调、减少、消除、抑制或降低ROCK基因表达或下调、减少、消除、抑制或降低ROCK蛋白、肽或多肽的活化水平。本申请使用的示例性ROCK抑制剂是Y-27632。除此之外，其他ROCK抑制剂的实例可以包括但不限于H-1152、Y-30141、Wf-536、HA-1077、羟基-HA-1077、GSK269962A和SB-772077-B。
MEK抑制剂是指抑制或降低细胞内MEK（丝裂原活化蛋白激酶激酶，Mitogen-activated protein kinase kinase，MAPKK）蛋白功能或其信号通路的任何物质，例如小分子、siRNA、miRNA、反义RNA等。MEK是丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路中的一个关键激酶，这个信号通路在细胞的生长、分化、存活以及对外界刺激的响应中起着至关重要的作用。所述抑制或降低MEK蛋白功能的方法可以是下调、减少、消除、抑制或降低MEK基因表达或下调、减少、消除、抑制或降低MEK蛋白、肽或多肽的活化水平。本申请使用的示例性MEK抑制剂是PD0325901。除此之外，其他MEK抑制剂的实例可以包括但不限于比美替尼(Binimetinib)、考比替尼(Cobimetinib)、瑞法替尼(Refametinib)、司美替尼(Selumetinib)、曲美替尼(Trametinib)、莫达美替尼(mirdametinib)、AK-733、E6201、CI-1040、ATR-002、SHR7390，NFX-179、吡马西替布(pimasertib)、VS-6766、HL-085、FCN-159、LNP3794、CS3006、AS703988、TQ-B3234和GDC-0623。
GSK3抑制剂是指抑制或降低细胞内GSK3（糖原合成酶激酶3）蛋白功能或其信号通路的任何物质，例如小分子、siRNA、miRNA、反义RNA等。GSK3是一类多功能的丝氨酸/苏氨酸激酶，在多种细胞过程中发挥作用，包括细胞信号传导、代谢调节、细胞周期控制、细胞分化、凋亡以及发育等。所述抑制或降低GSK3蛋白功能的方法可以是下调、减少、消除、抑制或降低GSK3基因表达或下调、减少、消除、抑制或降低GSK3蛋白、肽或多肽的活化水平。本申请使用的示例性GSK3抑制剂是CHIR-99021。除此之外，其他GSK3抑制剂的实例可以包括但不限于SB-216763、SB-415286、Tideglusib（NP-12）和6-溴诱导硫脲嘧啶（6-BIO）。
CloneR2是一种培养基的补充剂，具体作用为补充细胞培养所必须的营养物质和支持细胞生长。所述CloneR2可以是购买得到的商用试剂，也可以是自行配制的溶液。
在具体的实施方式中，所述CloneR2可以存在于所述方法的任意阶段包含的任意培养基中。
例如，所述CloneR2可以存在于所述建系培养基中。
又例如，所述方法可以包含单细胞培养基的使用，所述单细胞生长培养基可以包含CloneR2。
在具体的实施方式中，所述建系培养基中的ROCK抑制剂可以是Y-27632。在具体的实施方式中，MEK抑制剂可以是PD0325901。在具体的实施方式中，GSK3抑制剂可以是CHIR-99021。
在进一步的实施方式中，所述建系培养基还可以包含人调蛋白、生长因子和抗氧化剂。
在具体的实施方式中，所述人调蛋白可以是重组人调蛋白β1。在具体的实施方式中，所述生长因子可以是成纤维细胞生长因子2 (FGF2)。在具体的实施方式中，所述抗氧化剂可以是维C磷酸酯钠。
如本领域技术人员所知，GSK3抑制剂通常可以激活Wnt通路，反之，Wnt激活剂也可以作为GSK3抑制剂在本发明中被使用。
优选地，所述CloneR2的工作浓度为0.1×-10×，更优选0.5×-5×，还更优选1×。
优选地，所述ROCK抑制剂如Y-27632的工作浓度为1-100μM，更优选5-50μM，还更优选10μM。
优选地，所述MEK抑制剂如PD0325901的工作浓度为0.1-10μM，更优选0.3-2.5μM，还更优选0.5μM。
优选地，所述GSK3抑制剂如CHIR-99021的工作浓度为0.1-10μM，更优选0.5-5μM，还更优选1μM。
优选地，所述人调蛋白如重组人调蛋白β1的工作浓度为1-100 ng/mL，更优选5-50ng/mL，还更优选20 ng/mL。
优选地，所述生长因子如成纤维细胞生长因子2 (FGF2)的工作浓度为10-1000ng/mL，更优选50-500 ng/mL，还更优选100 ng/mL。
优选地，所述抗氧化剂如维C磷酸酯钠的工作浓度为10-1000 μg/mL，更优选30-250μg/mL，还更优选50μg/mL。
如本领域技术人员所通知，除了前述选择外，建系培养基基于大类还可以有多种选择，所述大类具体是指培养基的第一个层次，比如基于靶点的ROCK抑制剂、MEK抑制剂、GSK3抑制剂和基于蛋白分类概念的人调蛋白和生长因子以及基于功能分类的抗氧化剂。关于建系培养基的具体选择，此处不再赘述。
在某些实施方式中，所述方法可以包含在取得多能干细胞的单细胞前，将多能干细胞在建系培养基中培养。在优选的实施方式中，可以接触10-12天。所述10-12天具体可以是约10天，可以是约11天，也可以是约12天，也可以是其中任何一个非整数节点。经建系培养基处理过后的多能干细胞在用于单克隆分选时在维持干性和增殖能力方面具有优势。
在某些实施方式中，所述方法可以包含：
(1) 取得多能干细胞的单细胞；
(2) 将步骤(1)取得的所述多能干细胞的单细胞在单细胞生长培养基中培养，以形成多能干细胞的单克隆；
(3) 将步骤(2)获得的多能干细胞的单克隆在完全培养基中培养。
在某些实施方式中，在所述步骤(1)中，多能干细胞的单细胞可以通过有限稀释法取得。其可以包括对多能干细胞细胞团的物理分离和/或生物酶消化，具体步骤如下：
(a) 将重编程后的细胞分成多个细胞团块，细胞团块在离心管中消化；
(b) 使用细胞筛网过滤经过步骤(a)处理的细胞；和
(c) 将经过步骤(b)处理的细胞稀释至2-200个细胞/mL，优选为5-120个细胞/mL，更优选5-20个细胞/mL，还更优选5个细胞/mL。
所述重编程后的细胞可以是经过建系培养基培养的多能干细胞。所述经过建系培养基培养的多能干细胞可以存在于对应的多能干细胞培养物中。
所述消化可以是通过与生物酶完成的。所述生物酶可以是Accutase。所述生物酶可以是领域内常用的商业化生物酶（例如thermo的Accutase）。
在进一步的实施方式中，在步骤(2)中，将挑取的所述多能干细胞的单细胞在单细胞生长培养基中培养3-5天，所述3-5天具体可以是约3天，可以是约4天，可以是约5天，也可以是其中任何一个非整数节点，优选为4天。
在进一步的实施方式中，在步骤(3)中，将所述多能干细胞的单克隆在所述完全培养基中培养至建系终点。所述完全培养基可以是不包含CloneR2的单细胞生长培养基。
在优选的实施方式中，所述多能干细胞可以是诱导多能干细胞（iPSC），优选人iPSC。在进一步实施方式中，所述建立诱导多能干细胞(iPSC)的单克隆细胞系的方法可以包含如下步骤：
(1) 非多能性细胞经过重编程诱导成iPSC；
(2) 将经过步骤(1)处理的细胞在前述建系培养基中培养，优选接触10-12天；
(3) 从经过步骤(2)处理的细胞中取得单细胞；
(4) 将经过步骤(3)处理的细胞在单细胞生长培养基中培养；和
(5) 将经过步骤(4)处理的细胞在完全培养基中培养，优选培养至建系终点。
在某些实施方式中，所述培养基的类型可以视具体的细胞状态来决定，使用的培养基可以是培养细胞的常用培养基（例如，最低必需培养基(MEM)、Dulbecco氏改良的Eagle培养基(DMEM)、RPMI1640培养基和F12培养基），可以是任何适用于多能干细胞的培养基（例如，NutriStem®hPSC XF培养基、TeSRTM培养基、TeSRTM 2培养基、TeSRTM-E8TM培养基、TeSRTM-AOF培养基、CTSTM Essential 8培养基），优选为DMEM或TeSRTM-AOF培养基。考虑到后续细胞的治疗性应用，无血清、无异源动物成分、成分确定的培养基是优选的。
在更具体的实施方式中，在步骤(4)中，所述单细胞培养基可以是包含CloneR2的所述培养基，所述培养基的实例参考上文；也可以是包含CloneR2的所述建系培养基。
在某些实施方式中，所述培养基可以包含B27、非必需氨基酸等补充成分。
在某些实施方式中，单细胞可以接种于包被基质的培养容器中。所述基质的实例包括但不限于明胶、层粘连蛋白、纤连蛋白、胶原蛋白等。具体地，本发明使用玻连蛋白（Vitronectin XF™）或重组人层黏连蛋白521（Laminin521）进行包被。
如本领域技术人员所通知，从单细胞起源的单克隆多能干细胞细胞系与从细胞团起源的多能干细胞相比，其在单细胞生长过程中存在干性丧失、增殖能力低下、死亡率高和遗传不稳定等风险，但是由于单克隆细胞系在下游分化生产方面的优势（比如安全性高），单克隆多能干细胞的获得具有现实意义。本发明提供了一种新的建立单克隆多能干细胞细胞系的方法，该方法主要是通过改进培养基来完成建立单克隆的目的。经过所述建系培养基和单细胞生长培养基处理的多株单克隆多能干细胞都具有与细胞团来源的多能干细胞相似的干性，并表现出相似的下游分化能力。
重编程方法
在具体的实施方式中，所述多能干细胞可以是诱导多能干细胞（iPSC），优选人iPSC。
在所述建立诱导多能干细胞（iPSC）的单克隆细胞系的方法中，所述iPSC可以是通过转录因子转导进细胞内获得，也可以是通过化学重编程获得。所述化学重编程可以包括将非多能性细胞与重编程诱导剂接触的步骤。
作为重编程的起点，所述非多能性细胞可以是完全分化的细胞，部分分化的细胞或二者混合物。
所述非多能性细胞的实例包括但不限于：皮肤细胞如上皮细胞、成纤维细胞、血液和免疫系统细胞如T淋巴细胞、尿液细胞、激素分泌细胞如胰岛细胞或肾上腺髓质细胞、乳腺细胞、中枢神经系统(CNS)细胞、胶质细胞如星形胶质细胞、周围神经系统(PNS)细胞、肌肉细胞如平滑肌细胞或心肌细胞、造血细胞、骨细胞、肝细胞、脂肪细胞、肾细胞、肺脏细胞、软骨细胞等。所述非多能性细胞可以是多种细胞的混合物。
本发明的非多能性细胞的来源是哺乳动物。所述哺乳动物包括但不限于啮齿类、灵长类、实验动物、宠物、农场动物，例如小鼠、大鼠、兔、犬、猪、猴，最优选人。对于作为细胞来源的哺乳动物的年龄、性别没有限制。优选地，所述哺乳动物是成年哺乳动物。
在本申请具体的实例中，所述重编程的起点为脂肪来源间充质干细胞(ADSC)。所述ADSC为具有多种分化潜能的成体干细胞，但与iPSC相比，ADSC仍存在许多不能分化的方向，比如胰岛细胞以及许多种上皮细胞。所述ADSC可以是人源的，也可以是非人源的（比如猴源，小鼠源，大鼠源，家兔源）。优选地，所述ADSC为人源。
在将通过本发明的诱导剂组合物或方法获得的iPSC用于治疗性目的时，例如将所述iPSC或其衍生物如分化产物用于移植时，优选使用来自健康供者的细胞作为起始细胞。在可选的实施方案中，可以使用HLA类型与待治疗受试者相同或基本上相同的个体的细胞作为起始细胞。判断两个个体的HLA类型是否匹配达到一定程度从而使其可分别作为移植中的供体和受体的方法是本领域已知的。
在进行本发明的方法之前，可以将所述非多能性细胞维持在合适的培养基中。培养基的类型视使用的具体细胞类型来决定。可以使用的培养基的实例包括但不限于：含有约5%到约20%胎牛血清的最低必需培养基(MEM)、Dulbecco氏改良的Eagle培养基(DMEM)、RPMI1640培养基和F12培养基。
在本发明的方法中，所述非多能性细胞与本发明的重编程诱导剂组合物的接触为体外接触或离体接触。所述接触包括将所述细胞在包含所述重编程诱导剂组合物的培养基中培养。所述培养可以是悬浮培养或贴壁培养。优选为贴壁培养。
在优选的实施方案中，将非多能性细胞与本发明的重编程诱导剂组合物接触的步骤可以进一步分为多个阶段，在每个阶段中将所述细胞与所述重编程诱导剂组合物中的一部分小分子化合物进行接触。
在优选的实施方案中，将所述非多能性细胞与重编程诱导剂接触的步骤可以包括如下三个阶段：
(1) 将细胞与第一阶段重编程诱导剂组合物接触；
(2) 将细胞与第二阶段重编程诱导剂组合物接触；和
(3) 将细胞与第三阶段重编程诱导剂组合物接触。
第一阶段重编程诱导剂组合物可以包含如下小分子化合物或由如下小分子化合物组成：GSK3抑制剂，NAD前体和NAD分解代谢抑制剂，TGF-β-RI/ALK5抑制剂，RAR激动剂，Hedgehog/Smoothened激动剂，JNK抑制剂，组蛋白甲基转移酶抑制剂，JAK抑制剂，MLL抑制剂，AKT抑制剂，组蛋白去甲基化酶，生长因子骨形成蛋白。更具体地，第一阶段重编程诱导剂组合物可以包含如下小分子化合物：CHIR-99021；氯化锂；尼克酰胺；ALK5抑制剂II；芳维甲酸；SAG；JNK-IN-8；EZM0414 TFA；EPZ5676；3-去氮腺嘌呤A；芦可替尼DZNep；VTP50469；AKT激酶抑制剂；维C磷酸酯钠；骨形态发生蛋白4。
第二阶段重编程诱导剂组合物可以包含如下小分子化合物或由如下小分子化合物组成：组蛋白去甲基化酶，组蛋白甲基转移酶抑制剂，生长因子，GSK3抑制剂，TGF-β-RI/ALK5抑制剂，RAR激动剂，Hedgehog/Smoothened激动剂，AKT抑制剂，腺苷激酶抑制剂，JNK抑制剂，CK2抑制剂，DNA甲基转移酶抑制剂，JAK抑制剂，MAPK抑制剂，AMPK抑制剂，CBP/p300抑制剂，MLL抑制剂。更具体地，第二阶段重编程诱导剂组合物可以包含如下小分子化合物：维C磷酸酯钠；EPZ5676；3-去氮腺嘌呤A；成纤维细胞生长因子2；DZNep；FGF2；CHIR-99021；ALK5抑制剂II；芳维甲酸；SAG；AKT激酶抑制剂；5-碘代杀结核菌素；JNK-IN-8；CX4945；5-氮杂胞苷；芦可替尼；达马莫德；Compound C；SGC-CBP30；VTP50469。
第三阶段重编程诱导剂组合物可以包含如下小分子化合物或由如下小分子化合物组成：GSK3抑制剂，MEK抑制剂，ROCK抑制剂，TGFβ抑制剂，组蛋白甲基转移酶抑制剂，组蛋白去甲基化酶，组蛋白去甲基化酶抑制剂，组蛋白去乙酰化酶抑制剂，人调蛋白。更具体地，第三阶段重编程诱导剂组合物可以包含如下小分子化合物：CHIR-99021；PD0325901；Y-27632；SB590885；EPZ5676；3-去氮腺嘌呤A；维C磷酸酯钠；DZNep；盐酸苯环丙胺；丙戊酸；重组人调蛋白β1。更具体地，第三阶段重编程诱导剂组合物可以包含如下各组的小分子化合物：
（3A）CHIR-99021；PD0325901；Y-27632；SB590885；EPZ5676；3-去氮腺嘌呤A；维C磷酸酯钠；3-地氮平霉素A；盐酸苯环丙胺；丙戊酸；重组人调蛋白β1；
（3B）CHIR-99021；PD0325901；Y-27632；SB590885；维C磷酸酯钠；丙戊酸；重组人调蛋白β1；
（3C）CHIR-99021；PD0325901；Y-27632；SB590885；维C磷酸酯钠；重组人调蛋白β1。
在进一步的实施方式中，所述第一阶段重编程诱导剂组合物的处理时间可以是8-10天。
在进一步的实施方式中，所述第二阶段重编程诱导剂组合物的处理时间可以是8-12天。
在进一步的实施方式中，所述第三阶段重编程诱导剂组合物的处理时间可以是10-12天。更进一步地，所述3A的处理时间可以是3-5天，优选4天。所述3B的处理时间可以是3-5天，优选4天。所述3C的处理时间可以是2-4天。
如上所述，所述接触可以在培养基中完成。用于本发明的方法的培养基可以是任何适用于多能干细胞的培养基（例如，NutriStem®hPSC XF培养基、TeSRTM培养基、TeSRTM2培养基、TeSRTM -E8TM培养基、TeSRTM-AOF培养基、CTS TM Essential 8培养基），优选为DMEM或TeSRTM-AOF培养基。考虑到后续细胞的治疗性应用，无血清、无异源动物成分、成分确定的培养基是优选的。
经过前述重编程的细胞培养物中包含iPSC。检测iPSC的定性或者定量方法可以选自碱性磷酸酶检测、免疫荧光染色检测、流式细胞术检测、定量PCR检测。例如，可以通过细胞全能性的标志物来确认iPSCs的成功获得，其中所述标志物包括但不限于Oct-3、Oct-4、SSEA-3、SSEA-4、SOX2、TRA-1-61、TRA-1-81和/或Nanog。还可以通过分化实验来检测iPSCs的功能。
用途
通过本发明方法获得的多能干细胞的单克隆细胞系可以用于多种目的。
在某些实施方式中，可以将所述多能干细胞的单克隆细胞系诱导分化为多种细胞类型、组织或类器官，以用于预定的目的，包括非治疗目的和治疗性目的。
在某些实施方式中，可以将所述多能干细胞的单克隆细胞系配制用于治疗目的，例如进一步分化成为不同的功能细胞后用于移植细胞治疗。
在某些实施方式中，可以将所述多能干细胞的单克隆细胞系用于研究目的。例如，可以使用所述多能干细胞的单克隆细胞系、其子代或分化细胞用于细胞分化、细胞功能的研究，用于药物的有效性、安全性筛选等。
在具体的实施方式中，所述单克隆细胞用于分化胰岛细胞。具体地，分化偏好为胰岛β细胞。
在某些实施方式中，所述多能干细胞的单克隆细胞系分化胰岛细胞包括将所述单克隆细胞系与分化诱导剂接触的步骤，其包括如下六个阶段：
(1) 将细胞与第一阶段分化诱导剂组合物接触；
(2) 将细胞与第二阶段分化诱导剂组合物接触；
(3) 将细胞与第三阶段分化诱导剂组合物接触；
(4) 将细胞与第四阶段分化诱导剂组合物接触；
(5) 将细胞与第五阶段分化诱导剂组合物接触；和
(6) 将细胞与第六阶段分化诱导剂组合物接触。
第一阶段分化诱导剂组合物可以包含如下小分子化合物或由如下小分子化合物组成：TGF-β激活剂，GSK-3α/β抑制剂，PI3K抑制剂，ROCK抑制剂。更具体地，第一阶段分化诱导剂组合物可以包含如下小分子化合物：激活素A；CHIR-99021；PI-103；Y-27632。更具体地，第一阶段分化诱导剂组合物可以包含如下各组的小分子化合物：
（S1D1）激活素A；CHIR-99021；PI-103；Y-27632；
（S1D2-D4）激活素A。
第二阶段分化诱导剂组合物可以包含如下小分子化合物或由如下小分子化合物组成：ALK5抑制剂；Wnt通路抑制剂；生长因子。更具体地，第二阶段分化诱导剂组合物可以包含如下小分子化合物：SB431542；WntC59；角质细胞生长因子。
第三阶段分化诱导剂组合物可以包含如下小分子化合物或由如下小分子化合物组成：BMP I 型受体抑制剂；视黄酸；Smo拮抗剂；Wnt通路抑制剂。更具体地，第三阶段分化诱导剂组合物可以包含如下小分子化合物：LDN-193189；维生素A酸；Sant1；WntC59。
第四阶段分化诱导剂组合物可以包含如下小分子化合物或由如下小分子化合物组成：sirtuins抑制剂；生长因子；PKC激活剂；Smo拮抗剂；ROCK抑制剂。更具体地，第四阶段分化诱导剂组合物可以包含如下小分子化合物：尼克酰胺；表皮细胞生长因子；TPB；Sant1；Y-27632。更具体地，第四阶段分化诱导剂组合物可以包含如下各组的小分子化合物：
（S4D1）尼克酰胺；表皮细胞生长因子；TPB；Sant1；Y-27632；
（S4D2-D6）尼克酰胺；表皮细胞生长因子；TPB；Sant1。
第五阶段分化诱导剂组合物可以包含如下小分子化合物或由如下小分子化合物组成：BMP 信号抑制剂；抗凝剂；甲状腺激素；TGFβR-1/ALK5抑制剂；ROCK抑制剂；Wnt通路抑制剂；γ-分泌酶抑制剂；多信号通路激活剂。更具体地，第五阶段分化诱导剂组合物可以包含如下各组的小分子化合物：
（S5D1-D3）LDN-193189；肝素钠；三碘甲状腺原氨酸；ALK5抑制剂II；Y-27632；WntC59；XXI；ISX9；
（S5D4-D6）LDN-193189；肝素钠；三碘甲状腺原氨酸；ALK5抑制剂II；Y-27632；WntC59；XXI。
第六阶段分化诱导剂组合物可以包含如下小分子化合物或由如下小分子化合物组成：TGFβR-1/ALK5抑制剂；抗凝剂；甲状腺激素；Axl抑制剂；ROS抑制剂。更具体地，第六阶段分化诱导剂组合物可以包含如下小分子化合物：ALK5抑制剂II；肝素钠；三碘甲状腺原氨酸；R428；乙酰半胱氨酸；硫酸锌。
在进一步的实施方式中，所述第一阶段分化诱导剂组合物的处理时间可以是3-5天，优选4天。更进一步地，所述S1D1的处理时间可以是0.5-1.5天，优选1天。所述S1D2的处理时间可以是2-4天，优选3天。
在进一步的实施方式中，所述第二阶段分化诱导剂组合物的处理时间可以是1-3天，优选2天。
在进一步的实施方式中，所述第三阶段分化诱导剂组合物的处理时间可以是3-5天，优选4天。
在进一步的实施方式中，所述第四阶段分化诱导剂组合物的处理时间可以是5-7天，优选6天。更进一步地，所述S4D1的处理时间可以是0.5-1.5天，优选1天。所述S4D2的处理时间可以是4-6天，优选5天。
在进一步的实施方式中，所述第五阶段分化诱导剂组合物的处理时间可以是5-7天，优选6天。更进一步地，所述S5D1的处理时间可以是2-4天，优选3天。所述S5D4的处理时间可以是2-4天，优选3天。
在进一步的实施方式中，所述第六阶段分化诱导剂组合物的处理时间可以是1-3天，优选2天。
不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请发明的各个技术方案，而不用于限制本申请发明的范围。
在下文实施例中多次出现的具体成分，未标明生产商和货号的，以其第一次出现时标明的生产商和货号为准。
实施例
实施例1 重编程非多能性细胞
首先，发明人使用重编程方法从非多能干细胞中获得了诱导多能干细胞（iPSC）。
本实施例使用了培养在无血清无饲养层条件下的脂肪来源间充质干细胞（Adipose-derived Mesenchymal Stem Cell, ADSC）。
将所述ADSC以1×104细胞/孔于12孔板中铺板，并于第二天开始重编程。具体而言，在S1阶段加入包含第一阶段重编程诱导组合物的S1培养基，于37℃、5% CO2、5% O2培养箱中培养8-10天；S1阶段结束后，在S2阶段更换为包含第二阶段重编程诱导组合物的S2培养基，于37℃、5% CO2、21% O2培养箱中培养8-12天；S2阶段结束后，在S3阶段更换为包含第三阶段重编程诱导组合物的S3培养基，于37℃、5% CO2、21% O2培养箱中培养10-12天，其中在S3A培养基中培养4天，在S3B培养基中继续培养4天，最后在S3C培养基中培养2-4天。
以下关于浓度部分，显示为“%”的均指具体物质的体积浓度。
所述S1培养基的组成为：以KnockOut DMEM（Gibco，Cat#10829018）为基础培养基，还包括以下工作浓度成分：1% KnockOut™血清替代物（Gibco，Cat#10828028），2% B-27™添加剂（Gibco，Cat#17504-044），1% GlutaMax（Gibco，Cat#35050079），1% 非必需氨基酸（Gibco，Cat#11140050），50 μg/mL 维C磷酸酯钠（Sigma，Cat#49752），5mM 氯化锂（Sigma-Aldrich，Cat# L4408），1 mM 尼克酰胺（STEMCELL，Cat#07154），5 μM CHIR-99021（selleck，Cat#S1263），10 μM ALK5抑制剂II，2 μM 芳维甲酸（MCE，Cat#HY-15682），0.5 μMSAG（MCE，Cat# HY-12848），2 μM EPZ5676（MCE，Cat# HY-15593），0.2 μM JNK-IN-8（MCE，Cat# HY-13319），0.2 μM EZM0414 TFA（MCE，Cat# HY-136328），0.05 μM 3-去氮腺嘌呤A（MCE，Cat# HY-12186），1 μM 芦可替尼（MCE，Cat# HY-50856），0.5 μM VTP50469（MCE，Cat#HY-114162），1 μM AKT 激酶抑制剂（陶素，Cat# T10276）和20 ng/ml 骨形态发生蛋白4（PeproTech，Cat# AF-120-05ET-500ug），所述浓度均为终浓度。
所述S2培养基的组成为：以KnockOut DMEM（Gibco，Cat#10829018）为基础培养基，还包括以下工作浓度成分：2% B-27™添加剂（Gibco，Cat#17504-044），1% GlutaMax（Gibco，Cat#17504-044），1% 非必需氨基酸（Gibco，Cat#11140050）， 50 μg/mL 维C磷酸酯钠（Sigma，Cat#49752），2 μM EPZ5676（MCE，Cat# HY-15593），0.2 μM 3-去氮腺嘌呤A（MCE，Cat# HY-12186），200 ng/mL 成纤维细胞生长因子2（Origene，Cat#TP750002），5 μM CHIR-99021（selleck，Cat#S1263），10 μM ALK5抑制剂II，2 μM 芳维甲酸（MCE，Cat#HY-15682），0.5 μM SAG（MCE，Cat# HY-12848），0.2 μM AKT 激酶抑制剂（陶素，Cat# T10276），0.5 μM5-碘代杀结核菌素（MCE，Cat# HY-15424），0.5 μM JNK-IN-8（MCE，Cat# HY-13319），1 μMCX4945（MCE，Cat#HY-50855），2 μM 5-氮杂胞苷（MCE，Cat# HY-10586），1 μM 芦可替尼（MCE，Cat# HY-50856），2 μM 达马莫德（MCE，Cat# HY-10320），0.5 μM Compound C（MCE，Cat# HY-13418A），2 μM SGC-CBP30（MCE，Cat# HY-15826）和0.5 μM VTP50469（MCE，Cat#HY-114162），所述浓度均为工作终浓度。
所述S3A培养基的组成为：以KnockOut DMEM（Gibco，Cat#10829018）为基础培养基，还包括以下工作浓度成分：5% KnockOut™ 血清替代物（Gibco，Cat#10828028），2% B-27™添加剂（Gibco，Cat#17504-044），1% GlutaMax（Gibco，Cat#17504-044），1% 非必需氨基酸（Gibco，Cat#11140050），50 μg/mL 维C磷酸酯钠（Sigma，Cat#49752），20 ng/mL重组人调蛋白β1（PeproTech，Cat#100-03），1 μM CHIR-99021（selleck，Cat#S1263），0.5 μMSB590885（Selleck，Cat#S2220），10 μM Y-27632（Selleck，Cat#S1049），1 μM PD0325901（MCE，Cat#HY-10254），10 μM盐酸苯环丙胺（MCE，Cat#HY-17447A），1000 μM丙戊酸（MCE，Cat#HY-10585），0.2 μM 5-氮杂胞苷（MCE，Cat# HY-12186）和2 μM EPZ5676（MCE，Cat# HY-15593），所述浓度均为工作终浓度。
所述S3B培养基的组成为：以KnockOut DMEM（Gibco，Cat#10829018）为基础培养基，还包括以下工作浓度成分：5% KnockOut™ 血清替代物（Gibco，Cat#10828028），2% B-27™添加剂（Gibco，Cat#17504-044），1% GlutaMax（Gibco，Cat#17504-044），1% 非必需氨基酸（Gibco，Cat#11140050），50 μg/mL 维C磷酸酯钠（Sigma，Cat#49752），20 ng/mL 重组人调蛋白β1（PeproTech，Cat#100-03），1 μM CHIR-99021（selleck，Cat#S1263），0.5 μMSB590885（Selleck，Cat#S2220），10 μM Y-27632（Selleck，Cat#S1049），1 μM PD0325901（MCE，Cat#HY-10254）和500 μM 丙戊酸（MCE，Cat#HY-10585），所述浓度均为工作终浓度。
所述S3C培养基的组成为：以KnockOut DMEM（Gibco，Cat#10829018）为基础培养基，还包括以下工作浓度成分：5% KnockOut™ 血清替代物（Gibco，Cat#10828028），2% B-27™添加剂（Gibco，Cat#17504-044），1% GlutaMax（Gibco，Cat#17504-044），1% 非必需氨基酸（Gibco，Cat#11140050），50 μg/mL 维C磷酸酯钠（Sigma，Cat#49752），20 ng/mL重组人调蛋白β1（PeproTech，Cat#100-03），1 μM CHIR-99021（selleck，Cat#S1263），0.5 μMSB590885（Selleck，Cat#S2220），10 μM Y-27632（Selleck，Cat#S1049）和1 μM PD0325901（MCE，Cat#HY-10254），所述浓度均为工作终浓度。
在S3的培养结束后，出现明显的单层致密、边界清晰的典型早期iPSC克隆形态，确认获得了人多能干细胞。
实施例2 单克隆iPSC建系方法以及不同稀释浓度比较
在获得了iPSC后，将所述iPSC先使用本申请保护的建系培养基进行培养，再对所述iPSC使用不同的有限稀释比例进行单细胞获取，以探究最合适的有限稀释比例。
将实施例1中S3阶段后获得的细胞用建系培养基重悬，并按1:1~1:15传代比例接种到包被有重组人层黏连蛋白521（Laminin521）（stem cell，Cat#200-0117）的六孔板上，于37℃、5% CO2、21% O2培养箱中培养10-12天。
所述建系培养基的组成为：以KnockOut DMEM（Gibco，Cat#10829018）为基础培养基，还包括以下工作浓度成分：2% B-27™添加剂（Gibco，Cat#17504-044），1% GlutaMax（Gibco，Cat#17504-044），1% 非必需氨基酸（Gibco，Cat#11140050），4% KnockOut™ 血清替代物（Gibco，Cat#10828028），50 μg/mL 维C磷酸酯钠（Sigma，Cat#49752），1 μM CHIR-99021（selleck，Cat#S1263），0.5 μM PD0325901（MCE，Cat#HY-10254），10μM Y-27632（Selleck，Cat#S1049），20 ng/mL重组人调蛋白β1（PeproTech，Cat#100-03）和100 ng/mL成纤维细胞生长因子2（Origene，Cat#TP750002），所述浓度均为工作终浓度。
人多能干细胞单细胞挑传建系
①待实施例1中S3阶段后获得的细胞经建系培养基培养完成后，有明显克隆出现，用无菌玻璃针或吸头将克隆分成适当大小的小克隆（一个克隆分成大小较为均一的15-20个小克隆）：
一部分小克隆接种到提前1-4天用玻连蛋白（Vitronectin XF™）或重组人层黏连蛋白521（Laminin521）包被的24孔板上，并使用包含Y-27632的TeSRTM-AOF完全培养基培养1天后，继续在TeSRTM-AOF完全培养基中培养4-6天后得到细胞团来源的iPSC。
另一部分小克隆用移液枪转移到提前备好的离心管中进行后续步骤：
②100-300 g 离心3-5 分钟或沉降后去上清，加入100-600 μL Accutase（thermo，Cat# 00-4555-56）混匀放入培养箱消化15-20分钟。
③镜检看到有大量单细胞脱落后，用移液枪轻轻吹打使单细胞完全脱落，加入等体积单细胞生长培养基重悬，用40 μm细胞筛网过滤细胞重悬液以去除大块细胞，300-500g 离心过滤后的细胞悬液3-5 分钟。
④去上清，加入少量单细胞生长培养基重悬，计数，采用梯度稀释原则，将细胞悬液连续倍数稀释至极低密度5-120个细胞/mL，接种于提前1-4天用玻连蛋白（VitronectinXF™）或重组人层黏连蛋白521（Laminin521）包被的96孔板，每孔加0.1 mL细胞重悬液。在不换液的条件下持续培养4天后，将培养基更换为TeSRTM-AOF完全培养基。接种后当天在镜检条件下对出现单个细胞的孔进行标记，并持续追踪，直至生长成单克隆，继续培养至克隆长到直径大约在1200-1600 μm后再传下一代，获得单克隆iPSC。
所述单细胞生长培养基的组成为：在TeSRTM-AOF（stem cell，Cat#100-0401）完全培养基中加入1×CloneR2（stem cell，Cat#100-0691）。
对获得的单克隆iPSC进行核型分析，核型分析由德佑医学检验实验室有限公司采用G显带标准方案进行。
如图3所示，单克隆iPSC与细胞团来源的iPSC具有相似的核型。如表1所示，在第④步中连续倍数稀释密度为120个细胞/mL，60个细胞/mL，20个细胞/mL，10个细胞/mL的情况下，孔内出现多克隆的比例逐渐下降，当稀释密度为5个细胞/mL时，孔内有且仅有单克隆出现。
表1 有限稀释密度与孔内单克隆比例的关系
注：单克隆比例分母代表接种孔数，分子代表长出单克隆孔数；多克隆比例分母代表接种孔数，分子代表长出多克隆孔数；“/”代表由于细胞量不足，未进行该稀释密度的测试；“无”代表长出单克隆或多克隆的孔数为0。
对获得的单克隆iPSC进行流式分析，如图4-图9所示，Nanog、OCT4、SOX-2、SSEA、Tra-1-60、Tra-1-81是细胞全能性的标志物，单克隆iPSC的干性抗体分析结果与细胞团来源的iPSC相似。
实施例3 单细胞生长培养基添加剂比较
在研究了最合适的有限稀释比例之后，发明人研究了单细胞生长培养基中不同添加剂（CloneR2或Y-27632）对iPSC单细胞生长的影响。
①待实施例1中S3阶段后获得的细胞经建系培养基培养完成后，有明显克隆出现，用无菌玻璃针或吸头将克隆分成适当大小的小克隆，并用移液枪将小克隆转移到提前备好的离心管中，100-300 g 离心3-5 分钟或沉降后去上清，加入100-600 μL Accutase（thermo，Cat# 00-4555-56）混匀放入培养箱消化15-20 分钟。
②镜检看到有大量单细胞脱落后，用移液枪轻轻吹打使单细胞完全脱落，加入等体积单细胞生长培养基重悬，用40 μm细胞筛网过滤细胞重悬液以去除大块细胞，300-500g 离心过滤后的细胞悬液3-5 分钟。
③去上清，加入少量TeSRTM-AOF（stem cell，Cat#100-0401）完全培养基重悬，计数后使用成分不同的培养基进行后续单细胞的分离培养：
1. 用包含Y-27632且不包含CloneR2的TeSRTM-AOF完全培养基将细胞悬液连续倍数稀释至10个细胞/mL，接种于96孔板，每孔加0.1 mL细胞重悬液。
2. 用包含CloneR2的单细胞生长培养基将细胞悬液连续倍数稀释至10个细胞/mL，接种于96孔板，每孔加0.1 mL细胞重悬液。
其中96孔板提前1-4天用玻连蛋白（Vitronectin XF™）或重组人层黏连蛋白521（Laminin521）进行包被。
④在不换液的条件下持续培养4天后，将培养基更换为TeSRTM-AOF完全培养基。接种后当天在镜检条件下对出现单个细胞的孔进行标记，并持续追踪，直至生长成单克隆。
对在两种单细胞生长培养基中获得的单克隆数进行统计，计算单克隆形成效率。并继续培养、传代单克隆，以检测不同单克隆在持续传代后能否保持正常的核型和良好的干性。
如表2和图10所示，使用包含Y-27632的单细胞生长培养基建系的单克隆形成效率为2-10%，而使用包含CloneR2的单细胞生长培养基建系的单克隆形成效率为10-25%。CloneR2的效率提高倍数是2.5-6.5倍。如表3所示，使用包含Y-27632/ CloneR2的单细胞生长培养基建系的单克隆iPSC在持续传代后都表达多能干细胞核心基因，Nanog、OCT4、SSEA4、TRA-1-60、TRA-1-81阳性率均>97%。如表4、表5所示，使用包含Y-27632的单细胞生长培养基建系的单克隆iPSC在持续传代后有2株核型异常，而使用包含CloneR2的单细胞生长培养基建系的单克隆iPSC在持续传代后核型均正常。
表2 单细胞生长培养基中不同添加剂对单克隆形成效率的影响
表3 单细胞生长培养基中不同添加剂对单克隆iPSC干性的影响（%）
表4 单细胞生长培养基中添加Y-27632对单克隆iPSC核型的影响
表5 单细胞生长培养基中添加CloneR2对单克隆iPSC核型的影响
实施例4 单细胞分离方法比较
在研究了不同有限稀释比例和不同的单细胞生长培养基的添加剂后，发明人对不同的单细胞分离方法做了研究，具体研究了有限稀释法和毛细管法对iPSC单细胞生长的影响。
①待实施例1中S3阶段获得的细胞经建系培养基培养完成后，有明显克隆出现，用无菌玻璃针或吸头将克隆分成适当大小的小克隆，并用移液枪将小克隆转移到提前备好的离心管中，100-300 g 离心3-5 分钟或沉降后去上清，加入100-600 μL Accutase（thermo，Cat# 00-4555-56）混匀放入培养箱消化1-15 分钟。
②镜检看到有大量单细胞脱落后，用移液枪轻轻吹打使单细胞完全脱落，加入等体积单细胞生长培养基重悬，用40 μm细胞筛网过滤细胞重悬液以去除大块细胞，300-500g 离心过滤后的细胞悬液3-5 分钟。
③去上清，加入少量单细胞生长培养基重悬，计数后使用不同方法进行单细胞的分离：
1. 毛细管：将细胞悬液稀释至100个细胞/mL，吸取1 mL于培养皿中，在显微镜下观察，用毛细管吸取一个细胞后加至96孔板中；
2. 有限稀释：采用梯度稀释原则，将细胞悬液连续倍数稀释至极低密度5-20个细胞/mL，接种于96孔板，每孔加0.1 mL细胞重悬液。
其中96孔板提前1-4天用玻连蛋白（Vitronectin XF™）或重组人层黏连蛋白521（Laminin521）进行包被。
④在不换液的条件下持续培养4天后，将培养基更换为TeSRTM-AOF完全培养基。接种后当天在镜检条件下对出现单个细胞的孔进行标记，并持续追踪，直至生长成单克隆。
对两种单细胞分离方法获得的单克隆数进行统计，计算单克隆形成效率。
如表6和图11所示，使用毛细管单细胞分离方法建系的单克隆形成效率为0-4%，而使用有限稀释法建系的单克隆形成效率为4-24%。
表6 不同单细胞分离方法对单克隆形成效率的影响
实施例5 建系培养基小分子配方
接下来，发明人探索建系培养基中ROCK抑制剂、MEK抑制剂和GSK3抑制剂存在与否对细胞增殖的影响，同时也对抗氧化剂的影响做了探索。
将由不同成分的建系培养基（具体见表7）重悬的两个不同重编程批次的iPSC接种到包被有重组人层黏连蛋白521（Laminin521）（stem cell，Cat#200-0117）的24孔板上，于37℃、5% CO2培养箱中培养5-14天。待有明显克隆出现，对不同实验组别拍照记录克隆形态，统计获得的克隆数。
表7 建系培养基小分子配方分组
注：“/”代表不加此小分子，“”代表加此小分子。
对经不同建系培养基培养后的细胞克隆进行流式检测干性标记物OCT4。使用Accutase将7组细胞克隆消化成单细胞，加固定液固定过夜，第二天使用洗涤液清洗，加入一抗过夜孵育，经洗涤液清洗后，加入二抗孵育2 小时，孵育结束后，经洗涤液清洗后即可进行检测。本实验使用流式细胞仪BD Calibur检测，FlowJo软件分析。
第一批次iPSC的增殖状态如图12所示，不加Y-27632的实验组3和不加所有小分子的实验组7均未长出明显克隆；只加Y-27632的实验组6长出的克隆致密但小；不加CHIR-99021的实验组2长出的克隆形态不规则且不致密；不加PD0325901的实验组4长出的克隆较小且克隆中心细胞易死亡；加所有小分子的实验组5长出的克隆大，边缘清晰，单层致密，不加维C磷酸酯钠的实验组1长出的克隆效果较实验组5稍差，但是比其他实验组好。
如图13所示，实验组5长出的克隆数最多，实验组1次之。如图14所示，实验组1、5、6的OCT4+细胞最多。
第二批次iPSC的增殖状态如图16所示，不加所有小分子的实验组7细胞死亡，未长出明显克隆；不加Y-27632的实验组3只长出少量克隆；不加PD0325901的实验组4和只加Y-27632的实验组6长出的克隆不致密，细胞与细胞间接触不紧密；不加维C磷酸酯钠的实验组1、不加CHIR-99021的实验组2和加所有小分子的实验组5长出的克隆致密且多。
如图17和图18所示，实验组5的OCT4+细胞最多。
综合判断，加所有小分子的实验组5和不加维C磷酸酯钠的实验组1效果最好。本领域技术人员可以通过本实施例想到，为了保证所述多能干细胞的干性和增殖能力，在所述建系培养基中同时添加ROCK抑制剂、MEK抑制剂和GSK3抑制剂是必不可少的。
综上，建系培养基的最佳配方为：KnockOut DMEM+ 2% B-27™添加剂+ 1%GlutaMax+1% 非必需氨基酸+ 4% KnockOut™ 血清替代物+20 ng/mL重组人调蛋白β1+100ng/mL成纤维细胞生长因子2+50 μg/mL维C磷酸酯钠+1 μM CHIR-99021+10 μM Y-27632+0.5 μM PD0325901，所述浓度均为工作终浓度。
实施例6 单细胞生长培养基比较
接下来，发明人探索了单细胞培养基中CloneR2存在与否和基底培养基种类对iPSC单细胞生长的影响。
①待实施例1中S3阶段后获得的细胞经建系培养基培养完成后，有明显克隆出现，用无菌玻璃针或吸头将克隆分成适当大小的小克隆，并用移液枪将3个来自不同克隆的小克隆（标记为1#、2#、3#）转移到提前备好的离心管中，100-300 g 离心3-5 分钟或沉降后去上清，加入100-600 μL Accutase（thermo，Cat# 00-4555-56）混匀放入培养箱消化1-15 分钟。
②镜检看到有大量单细胞脱落后，用移液枪轻轻吹打使单细胞完全脱落，加入等体积单细胞生长培养基重悬，用40 μm细胞筛网过滤细胞重悬液以去除大块细胞，300-500g 离心过滤后的细胞悬液3-5 分钟。
③去上清，加入少量TeSRTM-AOF（stem cell，Cat#100-0401）完全培养基重悬，计数后使用成分不同的单细胞生长培养基进行后续单细胞的分离培养：
1. 用包含CloneR2的TeSRTM-AOF完全培养基将细胞悬液连续倍数稀释至10个细胞/mL，接种于96孔板，每孔加0.1 mL细胞重悬液。
2. 用包含CloneR2的建系培养基将细胞悬液连续倍数稀释至10个细胞/mL，接种于96孔板，每孔加0.1 mL细胞重悬液。
3. 用建系培养基将细胞悬液连续倍数稀释至10个细胞/mL，接种于96孔板，每孔加0.1 mL细胞重悬液。
4. 用TeSRTM-AOF完全培养基将细胞悬液连续倍数稀释至10个细胞/mL，接种于96孔板，每孔加0.1 mL细胞重悬液。
其中96孔板提前1-4天用玻连蛋白（Vitronectin XF™）或重组人层黏连蛋白521（Laminin521）进行包被。
所述建系培养基为包含ROCK抑制剂、MEK抑制剂和GSK3抑制剂的建系培养基。
④在不换液的条件下持续培养4天后，将1和4的培养基更换为TeSRTM-AOF完全培养基。2和3的培养基更换不包含CloneR2的建系培养基。接种后当天在镜检条件下对出现单个细胞的孔进行标记，并持续追踪，直至生长成单克隆。
对在四种单细胞生长培养基中获得的单克隆数进行统计。
如图19所示，1#克隆在四种单细胞生长培养基中分别形成的单克隆数分别是1、1、0、0，2#克隆在四种单细胞生长培养基中分别形成的单克隆数分别是3、3、0、0，3#克隆在四种单细胞生长培养基中分别形成的单克隆数分别是6、9、2、0。因此，使用包含CloneR2的TeSRTM-AOF完全培养基或包含CloneR2的建系培养基更能提高单细胞的存活，获得更多单克隆。
实施例7 胰岛分化方案
在进行了上述因素对iPSC单细胞生长的影响后，发明人研究了单克隆iPSC分化下游细胞的用途，所述下游细胞具体是指胰岛细胞。
胰岛分化使用的单克隆iPSC是经包含ROCK抑制剂、MEK抑制剂和GSK3抑制剂的建系培养基培养，采用有限稀释法分离单细胞后使用包含CloneR2的单细胞生长培养基培养得到的单克隆iPSC。
将所述单克隆iPSC以5.5×105细胞/孔于12孔板中铺板，并于第二天开始胰岛分化。具体而言，在S1阶段加入包含第一阶段分化诱导组合物的S1D1培养基，于37℃、5% CO2培养箱中培养1天后，更换为包含第一阶段分化诱导组合物的S1D2培养基，于37℃、5% CO2培养箱中继续培养3天。
S1阶段结束后，在S2阶段更换为包含第二阶段分化诱导组合物的S2培养基，于37℃、5% CO2、培养箱中培养2天。
S2阶段结束后，在S3阶段更换为包含第三阶段分化诱导组合物的S3培养基，于37℃、5% CO2、培养箱中培养4天。
S3阶段结束后进行转板，此时进入S4阶段，每孔加入0.5 mL Accutase，放入培养箱消化约5 分钟，镜检看到有大量细胞脱落后，轻拍12孔板使细胞完全脱落并将此时的细胞悬液转入50 mL离心管，400 g离心3分钟后弃尽上清，用包含第四阶段分化诱导组合物的S4D1培养基重悬细胞后，用40 μm细胞筛网过滤细胞重悬液以去除大块细胞，按1×107细胞/孔的细胞密度接种细胞至AggreWell 400 6-well（Stemcell，Cat#34425）进行成球，并将每孔体积补足至2 mL。将细胞轻拍十字摇匀后于37℃、5% CO2、培养箱中培养1天。次日，平拍AggreWell 400 6-well让大部分成球细胞脱落，将细胞球悬液转移到50 mL离心管中，100 g 离心30 s后弃尽上清， 用包含第四阶段分化诱导组合物的S4D2培养基重悬后将细胞球平均接种到低吸附细胞培养板（Greiner，Cat#657185）中（1个孔的细胞球接种到1个低吸附细胞培养板的孔中），于振荡培养箱中培养1天。次日，在超净台中画圈晃动悬浮培养板，使细胞球聚集在中间，观察细胞球周围起絮情况，轻轻将毛絮吸走，沿着最上层液面吸走一半原培养基后，再加入3 mL S4D2培养基，放入振荡培养箱继续培养4天，期间每两天换一次S4D2培养基。
S4阶段结束后，在S5阶段更换为包含第五阶段分化诱导组合物的S5D1培养基，于振荡培养箱中培养3天，更换为包含第五阶段分化诱导组合物的S5D4培养基，再于振荡培养箱中培养3天。
S5阶段结束后，在S6阶段更换为包含第六阶段分化诱导组合物的S6培养基，于振荡培养箱中培养2天。
所述S1D1培养基的组成为：以MCDB 131（Life Technologies，Cat#10372019）为基础培养基，还包括以下工作浓度成分：1% B-27™添加剂（Gibco，Cat#12587-010）、1%Glutamax（Invitrogen，Cat#C11965500CP）、1% 双抗（Gibco，Cat#15140163）、4.5 mM 葡萄糖（Sigma，Cat#G7528）、100 ng/ml 激活素A（Peprotech，Cat#120-14）、0.25 mM 维C磷酸酯钠（Sigma，Cat#49752）、6 µM CHIR-99021（SelleckChem，Cat#S1263）、50 mM PI103（SelleckChem，Cat#S1038）、10 µM Y-27632（SelleckChem，Cat#S1049），所述浓度均为工作终浓度。
所述S1D2培养基的组成为：以MCDB 131（Life Technologies，Cat#10372019）为基础培养基，还包括以下工作浓度成分：1% Glutamax（Invitrogen，Cat#C11965500CP）、1% 双抗（Gibco，Cat#15140163）、4.5 mM 葡萄糖（Sigma，Cat#G7528）、50 ng/mL 激活素A（Peprotech，Cat#120-14）、0.25 mM 维C磷酸酯钠（Sigma，Cat#49752），所述浓度均为工作终浓度。
所述S2培养基的组成为：以MCDB 131（Life Technologies，Cat#10372019）为基础培养基，还包括以下工作浓度成分：1%双抗（Gibco，Cat#15140163）、1% Glutamax（Invitrogen，Cat#C11965500CP）、0.5%牛血清白蛋白（Sigma，Cat#A4612）、4.5 mM 葡萄糖（Sigma，Cat#G7528）、0.25 mM 维C磷酸酯钠（Sigma，Cat#49752）、5 µM SB431542（SelleckChem，Cat#S1067）、100 nM WntC59（SelleckChem，Cat#S7037）、50 ng/ml 角质细胞生长因子（Peprotech，Cat#100-19），所述浓度均为工作终浓度。
所述S3培养基的组成为：以DMEM（Gibco，Cat#C11965500CP）为基础培养基，还包括以下工作浓度成分：1% B-27™添加剂（Gibco，Cat#12587-010）、1% 双抗（Gibco，Cat#15140163）、0.1µM LDN（SelleckChem，Cat#S7507）、2 µM 维生素A酸(Sigma，Cat#R2625)、0.25 µM Sant-1（SelleckChem，Cat#S7092）、100 nM WntC59（SelleckChem，Cat#S7037），所述浓度均为工作终浓度。
所述S4D1培养基的组成为：以高糖DMEM（Gibco，Cat#C11965500CP）与B-27™添加剂（Gibco，Cat#12587-010）以100：1比例混合作为基础培养基，还包括以下工作浓度成分：1% 双抗（Gibco，Cat#15140163）、1% Glutamax（Invitrogen，Cat#C11965500CP）、10 mM 尼克酰胺（STEMCELL，Cat#07154），0.25 mM 维C磷酸酯钠（Sigma，Cat#49752），100 ng/mL 表皮细胞生长因子（Peprotech，Cat# AF-100-15），0.2 µM TPB（Santa Cruz，Cat# SC-204424），0.25 µM Sant-1（SelleckChem，Cat#S7092），10 µM Y-27632（SelleckChem，Cat#S1049），所述浓度均为工作终浓度。
所述S4D2培养基的组成为：以高糖DMEM（Gibco，Cat#C11965500CP）与B-27™添加剂（Gibco，Cat#12587-010）以100：1比例混合作为基础培养基，还包括以下工作浓度成分：1%双抗（Gibco，Cat#15140163）、1% Glutamax（Invitrogen，Cat#C11965500CP）、10 mM 尼克酰胺（STEMCELL，Cat#07154），0.25 mM 维C磷酸酯钠（Sigma，Cat#49752），100 ng/mL表皮细胞生长因子（Peprotech，Cat# AF-100-15），0.2 µM TPB（Santa Cruz，Cat# SC-204424），0.25 µM Sant-1（SelleckChem，Cat#S7092），所述浓度均为工作终浓度。
所述S5D1培养基的组成为：以MCDB 131为基础培养基，还包括以下工作浓度成分：1% B-27™添加剂（Gibco，Cat#12587-010）、1%双抗（Gibco，Cat#15140163）、1% Glutamax（Invitrogen，Cat#C11965500CP）、0.25 mM 维C磷酸酯钠（Sigma，Cat#49752）、0.3 μM LDN（SelleckChem，Cat#S7507）、10 µg/mL HS（Sigma，Cat#H3149）、1 μM 三碘甲状腺原氨酸（Sigma，Cat#T2877）、0.1 µM γ-分泌酶抑制剂 XX（Calbiochem，Cat#565789）、10 µM ALK5抑制剂（Selleck，Cat# S7223）、10 µM ISX9（Selleck，Cat#S7914）、10 uM Y-27632（SelleckChem，Cat#S1049）、100 nM WntC59（SelleckChem，Cat#S7037），所述浓度均为工作终浓度。
所述S5D4培养基的组成为：以MCDB 131为基础培养基，还包括以下工作浓度成分：1% B-27™添加剂（Gibco，Cat#12587-010）、1%双抗（Gibco，Cat#15140163）、1% Glutamax（Invitrogen，Cat#C11965500CP）、50 µg/mL维C磷酸酯钠（Sigma，Cat#49752）、0.3 μM LDN（SelleckChem，Cat#S7507）、10 µg/mL HS（Sigma，Cat#H3149）、1 μM 三碘甲状腺原氨酸（Sigma，Cat#T2877）、0.1 µM γ-分泌酶抑制剂 XX（Calbiochem，Cat#565789）、10 µM ALK5抑制剂（Selleck，Cat# S7223）、10 uM Y-27632（SelleckChem，Cat#S1049）、100 nM WntC59（SelleckChem，Cat#S7037），所述浓度均为工作终浓度。
所述S6培养基的组成为：以MCDB131培养基（Life Technologies，Cat#10372019），还包括以下工作浓度成分：1% B-27™添加剂（Gibco，Cat#12587-010）、1% 双抗（Gibco，Cat#15140163）、1% Glutamax（Invitrogen，Cat#C11965500CP）、10 µM ALK5抑制剂（Selleck，Cat# S7223）、10 µg/mL HS（Sigma，Cat#H3149）、1 μM 三碘甲状腺原氨酸（Sigma，Cat#T2877）、0.25 mM 维C磷酸酯钠（Sigma，Cat#49752）， 0.5 µM R428（Selleck，Cat#S2841），2 mM 乙酰半胱氨酸（Sigma，Cat#616-91-1），10 µM 硫酸锌（Sigma，Cat#7446-19-7）。
在S1阶段结束后和S6阶段结束后分别对分化细胞进行流式检测。使用Accutase将人多能干细胞、进行胰岛诱导分化的S1、S6阶段后的细胞消化成单细胞，加固定液固定过夜，第二天使用洗涤液清洗，加入一抗过夜孵育，经洗涤液清洗后，加入二抗孵育2 小时，孵育结束后，经洗涤液清洗后即可进行检测。本实验使用流式细胞仪BD Calibur检测，FlowJo软件分析。
如图20所示，SOX17和FOXA2为定向内胚层的标志物， iPSC在S1阶段后向定向内胚层分化，并且单克隆iPSC在S1阶段后的分化效率与对照组相似。
如图21所示，ARX和GCG为α细胞的标记物，SST和HHEX为δ 细胞的标记物，NKX6.1和Cpep为β细胞的标记物。iPSC在S6阶段后主要向胰岛β细胞分化，并且单克隆iPSC的分化效率与对照组相似。
前述详细说明是以解释和举例的方式提供的，并非要限制所附权利要求的范围。目前本申请所列举的实施方式的多种变化对本领域普通技术人员来说是显而易见的，且保留在所附的权利要求和其等同方式的范围内。

Claims (10)

1.一种建立多能干细胞的单克隆细胞系的方法，其包括建系培养基的使用，所述建系培养基包括ROCK抑制剂、MEK抑制剂和GSK3抑制剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其还包括CloneR2的使用。
3.根据权利要求2所述的方法，其还包括单细胞生长培养基的使用，所述单细胞生长培养基包括所述CloneR2。
4.根据权利要求1所述的方法，所述ROCK抑制剂为Y-27632，所述MEK抑制剂为PD0325901，所述GSK3抑制剂为CHIR-99021。
5.根据权利要求3所述的方法，所述建系培养基还包括人调蛋白、生长因子和抗氧化剂。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，所述多能干细胞为人诱导多能干细胞。
7.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其包括在取得多能干细胞的单细胞前，将多能干细胞在所述建系培养基中贴壁培养10-12天。
8.根据权利要求7所述的方法，其包括：
(1) 从经过建系培养基培养的多能干细胞培养物通过有限稀释法取得多能干细胞的单细胞，所述多能干细胞培养物被稀释至5-120个细胞/mL；
(2) 将步骤(1)获得的多能干细胞的单细胞在单细胞生长培养基中培养3-5天以形成多能干细胞的单克隆；并
(3) 将步骤(2)获得的多能干细胞的单克隆在完全培养基中培养至建系终点。
9.根据权利要求1-8任一项所述的方法获得的多能干细胞单克隆细胞系在分化胰岛细胞的用途。
10.一种用于建立多能干细胞的单克隆细胞系的培养基组合物，其包含：
(1) 建系培养基，所述建系培养基包含ROCK抑制剂、MEK抑制剂和GSK3抑制剂；
(2) 单细胞生长培养基，所述单细胞生长培养基包含CloneR2。
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