CN118974559A - 用于复杂分子量化的稳定同位素标记内部校准物 - Google Patents

Abstract

本文提供了针对用于在质谱分析中使用以量化样品中的靶标分析物的稳定同位素标记内部校准物的方法和系统。本公开更具体地涉及质谱分析，其中单一样品包括至少三种同位素标记内部校准物和该靶标分析物。本文所述的方法和系统允许适应在靶标分析物量化中使用同位素标记内部校准物而引起的同位素干扰。因此，在生成校准曲线时，在本技术中利用了较少量(例如，较低浓度)的同位素标记内部校准物以量化靶标分析物。

Description

用于复杂分子量化的稳定同位素标记内部校准物

相关申请

本申请要求2022年3月7日提交的美国临时申请63/317,249号的优先权。前述申请的全部内容据此以引用方式并入本文。

技术领域

本技术整体涉及同位素标记内部校准物及其用于通过质谱法量化样品中的一种或多种靶标分析物的用途。本公开更具体地涉及质谱分析，其中单一样品包含至少三种同位素标记内部校准物和靶标分析物。本公开还涉及同位素标记内部校准物，该内部校准物可模拟靶标分析物，使得所述内部校准物的物理化学性质中的至少一种物理化学性质与靶标分析物的对应物理化学性质基本上相同或相似，不同之处在于所述内部校准物的质量比靶标分析物的质量大至少6个质量单位(amu)。

背景技术

质谱法(MS)在包括生命科学在内的广泛领域和应用中已经变得非常有价值。质谱法用于样品的详细质量组成分析，阐明了从小分子到非常大的蛋白质的样品成分的质荷比。特别是，液相色谱-质谱法(LC-MS)最近已被用于药物和生物学活性化合物的量化，这主要是因为LC/MS/MS赋予的高选择性、灵敏度、速度和简单性。

在定量MS分析中实施内部校准物是常用的程序。内部校准物旨在校正稀释、蒸发、降解、回收、吸附、衍生化和仪器参数(诸如进样体积)中的可变性，同时通过建立校准曲线实现分析物量化。由于稳定同位素标记(SIL)校准物与分析物相似的物理化学特性，因此使用SIL校准物具有最小化质量检测器波动的额外优点。其他优点包括相同的优化GC-MS或LC-MS条件、相似的洗脱模式和由于质量差异而改进的选择性。

使用SIL校准物的当前方法涉及分离来自各种同位素的贡献，这些同位素通常在具有单位质量分辨率的常规MS系统上给出部分重叠的质谱峰。所使用的经验方法要么忽略来自相邻同位素峰的贡献，要么高估来自相邻同位素峰的贡献，导致主要同位素峰的误差和弱同位素峰的大偏差，甚至完全忽略较弱的峰。

发明内容

本技术提供用于通过质谱法量化样品中的一种或多种分析物的化合物、组合物、试剂盒和方法，而不依赖于常规校准及其相关的缺点和劣势。

稳定同位素标记(SIL)校准物是分析物中的几个原子被它们的稳定同位素诸如2H(D，氘)、13C、15N或17O替代的化合物。本领域中的当前方法需要具有至少8个至12个稳定同位素标记校准物，因为当前方法涉及将各种SIL校准物的贡献彼此分离以避免显著的同位素干扰。本公开的目的是消除或减轻先前方法和系统的至少一个缺点。具体地，本技术利用校准物的信号贡献(例如，m/z强度)之间的同位素干扰来发挥其优势。举例说明，本文所公开的方法将SIL校准物的重叠信号贡献加在一起，使得获得校准曲线所需的SIL校准物的实际浓度(掺入样品中的SIL校准物的浓度)与如果忽略重叠信号贡献所需的浓度相比降低。因此，使用本技术的方法的益处中的一个益处是通过减少获得校准曲线所需的校准物的实际量而降低定量MS分析的成本。

在本公开的方法中适应SIL校准物的信号之间的任何同位素干扰以量化分析物。本文所提供的SIL校准物的设计也为适应校准物浓度值分配中SIL校准物之间的干扰铺平了道路。

在一个方面，本文提供了一种用于通过质谱法量化样品中的靶标分析物的量的组合物，该组合物包含：已知量的至少三种校准物，其中至少三种校准物的质量彼此相差至少1个质量单位，并且已知量的至少三种校准物内具有最低质量的校准物的质量比靶标分析物大至少6个质量单位。在一些实施方案中，至少三种校准物的质量彼此相差1个质量单位。在一些实施方案中，已知量的至少三种校准物在它们通过质谱法断裂时具有至少一个重叠m/z峰。

本公开提供了包括至少三种校准物和靶标分析物的单一样品，其中至少三种校准物的质量相差至少1个(或2个、3个、4个、5个......)质量单位。在一些实施方案中，至少三种校准物内具有最低质量的SIL校准物的质量比靶标分析物大至少6个质量单位。在一个实施方案中，校准物的质量彼此相差1个质量单位(例如，质量为M的第一校准物、质量为M+1的第二校准物、质量为M+2的第三校准物、质量为M+3的第四校准物......)。在一些实施方案中，第一校准物的质量比靶标分析物(例如，质量为M-6的靶标分析物、质量为M的第一校准物)大至少6个质量单位。在一些实施方案中，已知量的至少三种校准物在它们通过质谱法断裂时具有至少一个重叠m/z峰。

在一些实施方案中，本公开提供MS分析，其中存在包含第一已知量的第一校准物、第二已知量的第二校准物、第三已知量的第三校准物、第四已知量的第四校准物和靶标分析物的单一样品。每种校准物和靶标分析物通过质谱法在单一样品内各自是能够区分的。这避免了对外部校准的需要。因此，通过使用内部校准，有可能通过对一个样品进行单次分析来量化分析物，使得每次分析都产生结果，从而提高生产率并降低每个样品的成本。

在一些实施方案中，样品包含四种SIL校准物(诸如第一内部校准物、第二内部校准物、第三内部校准物、或第四内部校准物)和分析物。在一些实施方案中，第一校准物的质量比分析物大至少6个质量单位，第二校准物的质量比分析物大至少7个质量单位，第三校准物的质量比分析物大至少8个质量单位，并且第四校准物的质量比分析物大9个质量单位。

在一些实施方案中，靶标分析物选自包含免疫抑制剂药物的组。

在一些实施方案中，靶标分析物选自他克莫司、雷帕霉素、西罗莫司、依维莫司和环孢菌素A。

因此，在一个方面，本技术提供了校准物化合物，当量化样品中的靶标分析物的量时，这些校准物化合物可用作内部校准物。内部校准物包括在化学组成、结构和物理化学性质上与分析物相似，但基于内部校准物和分析物在质谱仪中的行为与分析物是能够区分的化合物。例如，本文所提供的校准物基于质量和/或断裂图上的差异与分析物是能够区分的。校准物与靶标分析物之间的质量上的差异源于校准物中相对于分析物的不同同位素的存在。

使用质量彼此相隔至少1个质量单位的SIL校准物的优点是来自重叠SIL校准物峰的贡献是恒定且可预测的。预测来自重叠SIL校准物的贡献允许将浓度值分配给校准物，这允许减少获得校准曲线所需的校准物的量。因此，本公开的实施方案中的至少一些实施方案的优点中的一个优点是通过减少获得校准曲线所需的校准物的量来降低定量MS分析的成本。

本公开的实施方案中的至少一些实施方案的另一个优点是校准校准物与靶标分析物存在于完全相同的基质中。因此，每个样品都具有自身的完美基质匹配的校准校准物，从而减少或消除基质效应。本公开的另一个优点是与常规测定相比成本降低，具有多重检测能力，并且与常规方法相比具有缩短得到结果的时间以及提高通量的潜力。

并非所有这些方面或优点都必须通过任何特定实施方案实现。因此，可以实现或优化本文所教导的一个优点或一组优点的方式来执行各种实施方案，而不必实现本文所教导或建议的其他方面或优点。

附图说明

图1例示了根据本公开的多个实施方案的示例性分析物。作为大环内酯类免疫抑制剂药物的他克莫司和西罗莫司是链霉菌属物种的天然产物。

图2示出了等摩尔浓度的他克莫司和用六个[¹³C₆]同位素原子标记的[¹³C₆]-他克莫司的质谱。质谱上的Y轴是相对强度。C₄₄H₆₅NO₁₀和C₃₈ ¹³C₆H₆₅NO₁₀分别表示他克莫司和用六个[¹³C₆]同位素原子标记的他克莫司。

图3示出了等摩尔浓度的他克莫司和用六个[¹³C₆]同位素原子、用七个[¹³C₆]同位素原子、八个[¹³C₆]同位素原子和九个[¹³C₆]同位素原子标记的四种[¹³C₆]-他克莫司校准物(SIL)的质谱。质谱上的Y轴是相对强度。C₄₄H₆₅NO₁₀、C₃₈ ¹³C₆H₆₅NO₁₀、C₃₇ ¹³C₇H₆₅NO₁₀、C₃₆ ¹³C₈H₆₅NO₁₀、C₃₅ ¹³C₉H₆₅NO₁₀、C₃₈ ¹³C₆H₆₅NO₁₀分别表示他克莫司，用六个、七个、八个和九个[¹³C₆]同位素原子标记的他克莫司。

图4示出了他克莫司的质谱和用六个[¹³C₆]同位素原子、用七个[¹³C₆]同位素原子、用八个[¹³C₆]同位素原子和用九个[¹³C₆]同位素原子标记的所有四种[¹³C₆]-他克莫司校准物(SIL)的总和强度。质谱上的Y轴是相对强度。

图5A和图5B示出了断裂后他克莫司铵加合物同位素计算值(1ng/mL至40ng/mL，七种校准物，＜2％干扰)。图5A示出了针对七种[¹³C₆]-他克莫司校准物(SIL)的断裂后铵加合物同位素计算值，这七种他克莫司校准物用三个[¹³C₆]同位素原子、用四个[¹³C₆]同位素原子、用五个[¹³C₆]同位素原子、用六个[¹³C₆]同位素原子、用七个[¹³C₆]同位素原子、用八个[¹³C₆]同位素原子以及用九个[¹³C₆]同位素原子标记，这七种他克莫司的对应浓度分别为1ng/mL、1ng/mL、1ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、15ng/mL和40ng/mL。他克莫司浓度为40ng/mL。图5B示出了针对七种[¹³C₆]-他克莫司校准物(SIL)的断裂后铵加合物同位素计算值，这七种他克莫司校准物用三个[¹³C₆]同位素原子、用四个[¹³C₆]同位素原子、用五个[¹³C₆]同位素原子、用六个[¹³C₆]同位素原子、用七个[¹³C₆]同位素原子、用八个[¹³C₆]同位素原子以及用九个[¹³C₆]同位素原子标记，这七种他克莫司的对应浓度分别为1ng/mL、1ng/mL、1ng/mL、10ng/mL、10ng/mL、30ng/mL和30ng/mL。他克莫司浓度为30ng/mL。

图6A和图6B示出了断裂前他克莫司铵加合物同位素计算值(1ng/mL至40ng/mL，七种校准物，＜2％干扰)。图6A示出了针对十三种[¹³C₆]-他克莫司校准物(SIL)的断裂前铵加合物同位素计算值，这十三种他克莫司校准物用三个[¹³C₆]同位素原子、用四个[¹³C₆]同位素原子、用五个[¹³C₆]同位素原子、用六个[¹³C₆]同位素原子、用七个[¹³C₆]同位素原子、用八个[¹³C₆]同位素原子、用九个[¹³C₆]同位素原子、用十个[¹³C₆]同位素原子、用十一个[¹³C₆]同位素原子、用十二个[¹³C₆]同位素原子、用十三个[¹³C₆]同位素原子、用十四个[¹³C₆]以及用十五个[¹³C₆]同位素原子标记，这十三种他克莫司校准物的对应浓度分别为1ng/mL、1ng/mL、1ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、5ng/mL、5ng/mL、15ng/mL、15ng/mL、15ng/mL、40ng/mL、40ng/mL和40ng/mL。他克莫司浓度为40ng/mL。图6B示出了针对七种[¹³C₆]-他克莫司校准物(SIL)的断裂前铵加合物同位素计算值，这七种他克莫司校准物用三个[¹³C₆]同位素原子、用四个[¹³C₆]同位素原子、用五个[¹³C₆]同位素原子、用六个[¹³C₆]同位素原子、用七个[¹³C₆]同位素原子、用八个[¹³C₆]同位素原子、用九个[¹³C₆]同位素原子、用十个[¹³C₆]同位素原子以及用十一个[¹³C₆]同位素原子标记，这七种他克莫司校准物的对应浓度分别为1ng/mL、1ng/mL、1ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、15ng/mL、40ng/mL、未知、未知。他克莫司浓度为40ng/mL。

图7示出了用3个至12个以及15个[¹³C₆]同位素原子标记的[¹³C₆]-他克莫司校准物(SIL)的相对浓度，其中同位素干扰不超过2％。

根据以下详细描述和权利要求，本技术的其他特征和优点将是显而易见，的。

具体实施方式

对于量化样品中的靶标分析物，通常需要首先建立校准曲线，该校准曲线表示从所使用的特定分析方法获得的分析信号(例如，MS质谱或质量色谱图中的峰面积或峰高)与靶标分析物的量之间的关系。因此，在样品分析之前，必须测定一系列校准校准物(例如，六种不同浓度的分离的靶标分析物)的分析信号，并且该校准必须定期地(例如，每天)进行。然而，这个过程降低了生产率，增加了每个样品的成本，而且使得仅仅一个样品的分析效率低下。

当化合物被引入到离子源中时，分子总数中只有一部分分子被电离。该部分(或电离效率)在很大程度上取决于化合物的化学结构，但是另外，由于难以控制或几乎不可能控制的几个参数，诸如离子源的温度和压力，该部分可能在日常操作期间会发生变化。因此，内部校准物被认为在采用MS检测的定量测定中是必不可少的，因为仪器变化在很大程度上是无关紧要的，因为它们只影响绝对响应，而不影响比率。

使用MS的定量检测由于基质成分(例如，血浆或尿液成分)的影响而进一步复杂化。当分析物被引入到离子源中时，它将与同时引入到源中的其他化合物竞争电离。基质组分因降低分析物信号而臭名昭著，即所谓的离子抑制，尤其是在基于电喷雾电离(ESI)的MS检测中。由基质组分引起的离子抑制的程度在基质之间可能有很大差别。遗憾的是，由基质组分引起的离子抑制的程度也取决于分析物的化学结构。这意味着，如果分析物和内部校准物在结构上不够相似，则分析物和内部校准物检测器响应的比率可能由于不同程度的离子抑制而变化，从而影响量化。因此，定量生物分析LC/MS测定中的内部校准物是分析物的结构类似物或稳定同位素标记(SIL)类似物。SIL内部校准物是分析物中的几个原子被它们的稳定同位素诸如₂H(D，氘)、₁₃C、₁₅N或₁₇O替代的化合物。当前技术水平需要具有至少8个至12个稳定同位素标记的校准物以避免显著的同位素干扰。在一些情况下，当分析物是大的复杂分子时，例如某些微生物的天然产物，例如，他克莫司、雷帕霉素、依维莫司(图1)，将需要具有多至12个至15个稳定同位素标记的校准物。因此，生产所需的标记校准物将非常昂贵、耗时，并且可能无法通过有机合成化学来制造。本公开的目的是消除或减轻先前方法和系统的至少一个缺点。

本公开的组合物和试剂盒允许适应在经由校准物浓度值分配进行的靶标分析物量化中使用同位素标记内部校准物而引起的同位素干扰。这导致将使用较少量的同位素标记内部校准物。

定义

术语″同位素″涉及具有相同数量的质子但不同数量的中子的核素(即，它们具有相同的原子序数并且因此是相同的化学元素)。相同化学元素的不同同位素通常具有基本相同的化学特性，因此在化学和/或生物体系中表现基本上相同。因此，例如，他克莫司的同位素标记类似物包含在化学组成和结构上与他克莫司基本上相同的化合物，不同之处在于他克莫司的至少一个原子被其同位素取代。

同位素涉及具有相同数量的质子但不同数量的中子的核素(即，它们具有相同的原子序数并且因此是相同的化学元素)。相同化学元素的不同同位素通常具有基本相同的化学特性，因此在化学和/或生物体系中表现基本上相同。因此，对应靶标分析物的同位素标记类似物包括在化学组成和结构上与靶标分析物基上本相同的化合物，不同之处在于靶标分析物的至少一个原子被其同位素取代。

在各种实施方案中，靶标分析物的至少一个原子是丰度最大的天然存在的同位素，并且校准物的取代同位素是丰度较低的同位素。例如，靶标分析物可包括具有¹H(¹²C、¹⁴N、¹⁶O或⁸⁰Se)的位置，并且校准物可以将处于该位置的原子取代为²H(分别为¹³C、¹⁵N、¹⁷O、¹⁸O、³³S、³⁶S和⁷⁴Se)。同位素的天然丰度可以小于49％(例如，小于所有存在的同位素的总量的40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％或0.01％)。同位素标记类似物可使用稳定同位素。

原子的稳定同位素可以是非放射性的或放射性的。如果稳定同位素是放射性的，则其半衰期太长而无法进行测量，诸如半衰期比宇宙年龄长，例如，半衰期为13.75×10⁹年或更长。稳定同位素包括但不限于：²H、⁶Li、¹¹B、¹³C、¹⁵N、¹⁷O、¹⁸O、²⁵Mg、²⁶Mg、²⁹Si、³⁰Si、³³S、³⁴S、³⁶S、³⁷Cl、⁴¹K、⁴²Ca、⁴³Ca、⁴⁴Ca、⁴⁶Ca、⁴⁸Ca、⁴⁶Ti、⁴⁷Ti、⁴⁹Ti、⁵⁰Ti、⁵⁰V、⁵⁰Cr、⁵³Cr、⁵⁴Cr、⁵⁴Fe、⁵⁷Fe、⁵⁸Fe、⁶⁰Ni、⁶¹Ni、⁶²Ni、⁶⁴Ni、⁶⁵Cu、⁶⁶Zn、⁶⁷Zn、⁶⁸Zn、⁷⁰Zn、⁷¹Ga、⁷³Ge、⁷⁶Ge、⁷⁴Se、⁷⁶Se、⁷⁷Se、⁷⁸Se、⁸²Se、⁸¹Br、⁸⁴Sr、⁹⁶Zr、⁹⁴Mo、⁹⁷Mo、¹⁰⁰Mo、⁹⁸Ru、¹⁰²Pd、¹⁰⁶Cd、¹⁰⁸Cd、¹¹³In、¹¹²Sn、¹¹²Sn、¹¹⁴Sn、¹¹⁵Sn、¹²⁰Te、¹²³Te、¹³⁰Ba、¹³²Ba、¹³⁸La、¹³⁶Ce、¹³⁸Sn、¹⁴⁸Nd、¹⁵⁰Nd、¹⁴⁴Sm、¹⁵²Gd、¹⁵⁴Gd、¹⁵⁶Dy、¹⁵⁸Dy、¹⁶²Er、¹⁶⁴Er、¹⁶⁸Yb、¹⁷⁰Yb、¹⁷⁶Lu、¹⁷⁴Hf、^180mlTa、¹⁸⁰W、¹⁸⁴Os、¹⁸⁷Os、¹⁹⁰Pt、¹⁹²Pt、¹⁹⁶Hg和²⁰⁴Pb。优选的稳定同位素的示例包括²H、¹¹B、¹³C、¹⁵N、¹⁷O、¹⁸O、³³S、³⁴S、³⁶S、⁷⁴Se、⁷⁶Se、⁷⁷Se、⁷⁸Se和⁸²Se。

同位素标记类似物可以用同位素取代一个至n个原子，其中n是靶标分析物分子中原子的数量。在各种实施方案中，同位素标记类似物可包括1个、2个、3个、......、n个取代，其然后可以形成一组内部校准物。例如，第一校准物可以是具有六个取代的类似物，第二校准物可以是具有七个取代的类似物，第三校准物可以是具有八个取代的类似物，依此类推。同位素标记类似物可以改变一个或多个质量单位(例如，在类似物之间进行多于一个取代的情况下和/或在同位素与最常见的天然存在的同位素相差多于一个质量单位的情况下)。相对于处于取代位置的原子，给定类似物可以是同位素纯的。

术语″同位素纯的″可以指化合物(诸如靶标分析物)中所含的给定类型的原子(例如，高丰度同位素，诸如¹H)的至少95％已用相同元素的另一种优选丰度较低的同位素(例如，²H)替代。例如，给定类型的原子的至少96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、99.91％、99.92％、99.93％、99.94％、99.95％、99.96％、99.97％、99.98％或99.99％以上的原子可以用相同元素的另一种优选丰度较低的同位素替代。

术语″同位素体″是指化学结构仅在其同位素组成上与本公开的特定化合物不同的物质。

术语″校准物″是指用作校准物或对照的化合物、材料或组合物，其通常构建允许确定给定样品中的靶标分析物的未知浓度或量的校准曲线。校准物可用于标准化或校准仪器，例如，MS或实验室程序，例如，提取、色谱洗脱。

术语″未标记校准物″是指不具有被人类替代的任何同位素原子的校准物化合物。

在一些实施方案中，未标记校准物可以指靶标分析物。在一些实施方案中，未标记校准物可以指具有与靶标分析物的物理化学性质相似的物理化学性质的化合物。

如本文所用，术语″稳定同位素标记校准物″是指同位素标记校准物，该同位素标记校准物具有足以允许其制造的稳定性并且其在足够的时间段内维持校准物的完整性以用于本文详述的目的。

″D″是指氘。

″¹³C″是指碳13。

″¹⁵N″是指氮15。

″¹⁸O″是指氧18。

″用碳13替代″是指一个或多个碳原子用对应数量的碳13原子替代。

″用氮15替代″是指一个或多个氮原子用对应数量的氮15原子替代。

″用氧18替代″是指一个或多个氧原子用对应数量的氧18原子替代。

分析物

继上述发明内容之后，分析物或靶标分析物可基本上包含可以在质谱仪中检测到的任何受关注的分子。在临床化学、医学、兽医学、法医化学、药物学、食品行业、工作安全和环境污染中的一者或多者中，靶标分析物可能是受关注的。一般来讲，靶标分析物是包含至少1个碳原子，诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个以上碳原子的有机分子。靶标分析物可包括多至1,000个、100个、90个、80个、70个、60个、50个、45个、40个、35个、30个、25个、20个或15个碳原子。分析物还可包含无机分析物(例如，磷化合物、硅化合物、无机聚合物等)。

在各种实施方案中，特别受关注的靶标分析物包含类固醇(优选类固醇激素或性激素，诸如睾酮、皮质醇、雌酮、雌二醇、17-OH-孕酮或醛固酮)；免疫抑制剂药物(诸如环孢菌素A、他克莫司、西罗莫司、依维莫司、或霉酚酸)；甲状腺标记物(诸如促甲状腺激素(TSH)、甲状腺球蛋白、三碘甲状腺氨酸(T3)、游离T3、甲状腺素(T4)、游离T4、或铁蛋白)；维生素或其代谢物(诸如25-羟基形式、1，25-二羟基形式或24，25-二羟基形式的维生素D2或维生素D3)；，心脏标记物(诸如肌钙蛋白或脑利钠肽)；甲胎蛋白；载脂蛋白或滥用药物(诸如氢吗啡酮、其他阿片类药物或治疗药物)。

样品

一般来讲，样品是包含至少一种靶标分析物(例如，上文所公开的类别或种类的分析物，连同基质)的组合物。样品可包含固体、液体、气体、混合物、材料(例如，中间稠度的物质，诸如提取物、细胞、组织、生物体)或它们的组合。在各种实施方案中，样品是生物体样品、环境样品、食品样品、合成样品、提取物(例如，通过分离技术获得)或它们的组合。

生物体样品可包括来源于个体身体的任何样品。在这种情况下，个体可以为动物，例如哺乳动物，例如人。其他示例个体包括小鼠、大鼠、豚鼠、兔子、猫、狗、山羊、绵羊、猪、牛、或马。个体可以为患者，例如患有疾病或怀疑患有疾病的个体。生物体样品可以为例如出于科学或医学测试的目的，诸如用于研究或诊断疾病(例如，通过检测和/或鉴定病原体或生物标记物的存在)而采集的体液或组织。生物体样品可还包括细胞，例如单个生物体样品的病原体或细胞(例如，肿瘤细胞)。此类生物体样品可通过已知的方法获得，包括组织活检(例如，钻取活组织检查)，以及通过采集血液、支气管抽吸、痰液、尿液、粪便或其他体液获得。示例性生物体样品包括体液(例如，房水和玻璃体液)、全血、血浆、血清、脐带血(具体地讲，通过经皮脐带血取样(PUBS)获得的血液)、脑脊液(CSF)、唾液、羊水、母乳、分泌物、脓水、尿液、粪便、胎粪、皮肤、指甲、毛发、脐、胃内容物、胎盘、骨髓、外周血淋巴细胞(PBL)、和实体器官组织提取物。

环境样品可包括来源于环境诸如自然环境(例如，海洋、土壤、空气和植物)或人造环境(例如，运河、隧道、建筑物)的任何样品。此类环境样品可用于发现、监测、研究、控制、减轻和避免环境污染。示例性环境样品包括水(例如，饮用水、河水、地面水、地下水、生活饮用水、污水、废液、废水、或沥出液)、土壤、空气、沉积物、生物群(例如，土壤生物群)、植物群、动物群(例如，鱼类)和地块(例如，挖掘的材料)。

食品样品可包括源自食品(包括饮料)的任何样品。此类食品样品可用于各种目的，包括例如：(1)检查食品是否安全；(2)在食品被食用时检查食品是否含有有害污染物(保留的样品)或食品是否不含有有害污染物；(3)检查食品是否仅含有允许的添加剂(例如，合规性)；(4)检查其是否含有标准水平的强制性成分(例如，食品标签上的声明是否正确)；或(5)分析食品中所含的营养物质的量。示例性食品样品包括动物、植物或合成来源的可食用产品(例如，奶、面包、蛋、或肉)、谷类、饮料以及它们的部分，诸如保留样品。食品样品还可包括水果、蔬菜、豆类、坚果、油料籽实、油料果实、谷物、茶、咖啡、草药浸剂、可可、啤酒花、草药、香料、含糖植物、肉、脂肪、肾脏、肝肾脏、内脏、奶、蛋、蜂蜜、鱼、和饮料。

合成样品可包括源自工业过程的任何样品。工业过程可以是生物工业过程(例如，使用含有遗传学信息并能够在生物系统中自我复制或被复制的生物材料的过程，诸如使用转染细胞的发酵过程)或非生物工业过程(例如，化合物诸如药物的化学合成或降解)。合成样品可用于检查并监测工业过程的进展，确定期望产物的收率，以及/或者测量副产物和/或起始物质的量。

校准物

在一个实施方案中，本技术的校准物可用作稳定同位素标记(SIL)校准物。

在另一个实施方案中，本文所公开的校准物可以在用于量化样品中的靶标分析物的某些MS方法中用作内部校准物。

在一些实施方案中，本文所公开的校准物是内部校准物。在一些实施方案中，本技术的内部校准物是稳定同位素标记(SIL)内部校准物。

内部校准物包含在化学组成(例如，经验式)、结构(例如，原子排列和键合)和/或物理化学性质方面与分析物相似，但通过在质谱仪中的行为与靶标分析物是能够区分的化合物。本文所公开的示例性校准物具有与分析物相同的基础结构，但在它们的分子量方面略微不同。组成和/或质量上的差异可能是由于原子用所述原子的对应同位素替代(例如，氢用氘替代，碳用碳13替代等)。

例如，由于两种化合物的质量差异，这两种化合物(例如，内部校准物和分析物)可以通过质谱仪彼此区分。在化合物是同位素类似物的情况下，两种化合物(例如，内部校准物和分析物)的质量可以相差至少1个(或2个、3个、4个、5个、......)质量单位。质量上的差异可以小于一个质量单位，也可以是大于一的非整数质量单位。根据仪器分辨率和/或期望的分辨率截止值，质量上的差异可以是+0.1、0.01、0.001、0.0001、0.0001质量单位的差异。这两种化合物之间的质量上的差异可源于不同同位素(例如，两种化合物中的一种化合物的低丰度同位素对两种化合物中另一种化合物的高丰度同位素)和/或不同化学部分的存在。

由于两种化合物的断裂图上的差异，这两种化合物(例如，第一内部校准物和分析物)也可以通过质谱仪彼此区分。化合物的断裂图与质谱仪中由该化合物生成的化合物特异性的碎片组(例如，产物/子离子)有关。两种或更多种化合物(例如，校准物和对应分析物、两种校准物等)可以在MS分析期间基本上以相同方式断裂，从而生成化学组成和结构相似的碎片。然而，在一些实施方案中，由一种化合物(例如，校准物)生成的碎片可与由另一种化合物(例如，分析物)生成的对应结构相似的碎片的不同之处在于质量上的差异能够由所使用的仪器(或通过预定的截止值)分辨。

本文所公开的校准物可模拟靶标分析物，使得内部校准物的物理化学性质中的至少一个物理化学性质与靶标分析物的对应物理化学性质基本上相同。物理化学性质可包括描述化合物的物理和/或化学状态的任何能够测量的性质。例如，物理化学性质包括但不限于尺寸、质量、吸光度、辐射、电荷、电势、等电点(pi)、流速(例如，保留时间)、磁场、自旋、溶解度、粘度、对其他物质(例如，抗体、酶)的反应性或亲和性、毒性、给定环境中的化学稳定性、在另一种化学物质的存在下在某些物理条件下经历一组特定转化(例如，分子解离、化学组合、氧化还原反应)的能力、极性、和疏水性/亲水性。因此，本文所公开的校准物与样品溶液中的靶标分析物均匀混合在一起。

在各种实施方案中，通过在质谱分析之前通常用于处理样品的一种或多种技术，本文所公开的校准物和靶标分析物实际上是彼此不能区分的。例如，根据溶解度(在溶剂中，例如，水或有机溶剂或溶剂混合物中)、保留时间(在分离技术中，诸如液相色谱)、亲和力(例如，对特异于所述靶标分析物的抗体的亲和力)、解离常数、反应性和/或对酶(例如，水解酶、转移酶)的特异性，本文所公开的校准物和靶标分析物可能是不能区分的。例如，本技术的校准物可以在与靶标分析物相同的保留时间通过色谱柱洗脱。

同位素涉及具有相同数量的质子但不同数量的中子的核素(即，它们具有相同的原子序数并且因此是相同的化学元素)。相同化学元素的不同同位素通常具有基本相同的化学特性，因此在化学和/或生物体系中表现基本上相同。因此，靶标分析物的同位素标记类似物包括在化学组成和结构上与靶标分析物基上本相同的化合物，不同之处在于靶标分析物的至少一个原子被其同位素取代。

应当认识到，在合成的化合物中存在天然同位素丰度的一些变化，这取决于在合成中使用的化学材料的来源。因此，靶标分析物的制剂将固有地含有少量的同位素体。尽管存在这种变化，但天然丰度的稳定氢、碳、氮和氧同位素的浓度与本公开化合物的稳定同位素取代程度相比是小且无关紧要的。(参见，例如，Wada，E等人，″Natural abundance ofcarbon，nitrogen，and hydrogen isotope ratios in biogenic substances″，Seikagaku，1994，66：15；Gannes，LZ等人，″Natural abundance variations in stableisotopes and their potential uses in animal physiological ecology″，CompBiochem Physiol Mol Integr Physiol，1998，119：725)。

同位素标记类似物可以用同位素替代一个至″n″个原子，其中″n″是靶标分析物中的原子的数量。在各种实施方案中，同位素标记类似物可包括1个、2个、3个、......、n个同位素替代，其然后可以形成一组内部校准物。优选地，每种内部校准物含有至少6个同位素。最优选地，每种内部校准物含有至少6个碳13原子。同位素标记类似物可以改变一个或多个质量单位(例如，在类似物之间进行多于一个取代的情况下和/或在同位素与最常见的天然存在的同位素相差多于一个质量单位的情况下)。

内部校准物可以例如根据以下总体方案来选择：(a)使给定靶标分析物在质谱仪中断裂以获得其断裂图；(b)选择所述断裂图的特定碎片；(c)根据步骤(b)中选择的碎片设计同位素标记碎片，该碎片与步骤(b)中选择的碎片的不同之处在于能够分辨的质量上的差异，并且与步骤(a)中获得的断裂图的其他碎片和离子是能够区分的；(d)设计同位素标记内部校准物，该同位素标记内部校准物将在质谱仪中产生步骤(c)中设计的所述同位素标记碎片；以及(e)制备所述同位素标记内部校准物。

内部校准物优选含有足够数量的稳定同位素标记以使用质谱仪让它们区别于靶标分析物。一般来讲，由于分子中低水平的天然存在的同位素的存在，靶标分析物具有特征性同位素分布。在存在于靶标分析物的元素中，碳具有碳13(¹³C)形式的丰度最大的同位素，其占所有天然存在的碳原子的大约1％。靶标分析物分子中碳原子的存在导致一个或多个¹³C原子的随机出现，每个原子都引起分子的质量增加大约1道尔顿。靶标分析物中一个或多个13C原子的这种随机出现创建了靶标分析物的天然存在的同位素干扰内部校准物的可能性。

在一些实施方案中，至少三种校准物内具有最低质量的SIL校准物的质量比靶标分析物大至少6个质量单位。在一个实施方案中，校准物的质量彼此相差1个质量单位(例如，质量为M的第一校准物、质量为M+1的第二校准物、质量为M+2的第三校准物、质量为M+3的第四校准物......)。在一些实施方案中，第一校准物的质量比靶标分析物(例如，质量为M-6的靶标分析物、质量为M的第一校准物)大至少6个质量单位。在一些实施方案中，已知量的至少三种校准物在它们通过质谱法断裂时具有至少一个重叠m/z峰。

使用质量彼此相隔至少1个质量单位的SIL校准物的益处是来自重叠SIL校准物峰的贡献是恒定且可预测的。预测来自重叠SIL校准物的贡献允许将浓度值分配给校准物，这又允许减少获得校准曲线所需的校准物的量。因此，本公开的实施方案中的至少一些实施方案的优点中的一个优点是通过减少获得校准曲线所需的校准物的量来降低定量MS分析的成本。

组合物和试剂盒

继上述发明内容之后，根据本技术的组合物可包含第一已知量的第一校准物和第二已知量的第二校准物，其中第一已知量和第二已知量不同，并且其中第一校准物、第二校准物和靶标分析物通过质谱法在单一样品中各自是能够区分的。根据本技术的试剂盒可包括本技术的组合物中的任何一种或多种组合物连同用于实施本文所公开的方法和/或使用本文所公开的装置的说明书(和/或其他/附加工具)。

为了量化靶标分析物，组合物需要至少两种对应于靶标分析物的内部校准物。然而，在某些情况下，包括对应于靶标分析物的多于两种内部校准物可能是有利的(例如，以增加精确度和/或准确度、以减少信号噪声和/或干扰或以扩大测量范围)。因此，一组内部校准物可包括2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个以及多至任意数量的用于靶标分析物的内部校准物(例如，理论最大值可以通过可以针对给定靶标分析物设计并使用的校准物的最大数量确定，例如，可被稳定同位素取代并将在靶标分析物、其他内部校准物和样品基质的情况下产生可用信号的位置的数量)。该组中的每种内部校准物应当通过MS与彼此和靶标分析物是能够区分的。

为了量化靶标分析物，组合物还需要内部校准物中的至少两种内部校准物以不同的量/浓度存在。在各种实施方案中，每种内部校准物的量不同。然而，某些实施方案可包括基本上相同量/浓度的内部校准物中的两种或更多种内部校准物(例如，只要内部校准物中的至少两种内部校准物以不同的量/浓度存在即可)。例如，第三内部校准物的量不必不同于第一内部校准物的第一量和第二内部校准物的第二量(例如，第三内部校准物的量可与第一内部校准物的第一量或第二内部校准物的第二量相同；然而，第三内部校准物的量不可与第一内部校准物和第二内部校准物两者都相同)。

可选择两种或更多种内部校准物的量以促进靶标分析物的量化。例如，可选择内部校准物的量以在分析物的特定分析范围内提供准确度和精确度(例如，在已知特定靶标分析物在预定窗口内变化的情况下)。在另一个示例中，可选择内部校准物的量以在仪器的分析范围内提供最大灵活性(例如，在预计靶标分析物变化广泛或具有不同性质的多种分析物将被分析的情况下)。

在各种实施方案中，两种或更多种内部校准物涵盖待分析样品中的靶标分析物的一部分或基本上整个分析范围。分析范围可描述可以收集有意义数据的范围(例如，在预先确定的统计参数内)。分析范围可以通过质谱仪中内部校准物或靶标分析物的检测限和/或样品中的靶标分析物的预计量来限定。

因此，一种或多种内部校准物的量可以在样品中的靶标分析物的预计量左右(例如，样品中的靶标分析物的预计量的......、50％、......、95％、96％、97％、98％、99％、100％、101％、102％、103％、104％、105％、......、150％、......)。如果预计样品中的靶标分析物的量以数量级变化，则一种或多种内部校准物的量可以是例如样品中的靶标分析物的预计量的......、1％、......、10％、......、100％、......、1000％、......、10,000％。

一种或多种内部校准物的量可以在仪器中内部校准物的分析范围的下限左右/高于该分析范围的下限(例如，仪器中内部校准物的分析范围的下限的......、95％、96％、97％、98％、99％、100％、101％、102％、103％、104％、105％、......、1000％、......、10,000％)。相似地，一种或多种内部校准物的量可以在仪器中内部校准物的分析范围的上限左右/低于该分析范围的上限(例如，仪器中内部校准物的分析范围的上限的0.1％、......、1％、......、95％、96％、97％、98％、99％、100％、101％、102％、103％、104％、105％、......)。

任何两种内部校准物(例如，以最高和最低量存在的内部校准物)的相对量可以由比率限定，例如：1.1、1.15、1.20、1.25、1.3、1.4、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1,000、10,000、100,000、1,000,000、或更高。在包括三种或更多种内部校准物的实施方案中，内部校准物的量之间的差异可以是线性的(例如，2x、3x、4x、......)、指数的(例如，101x、102x、103x、......)、随机的或它们的组合或变型。

本技术还涵盖用于量化单一样品中多于一种靶标分析物的组合物。例如，用于量化靶标分析物和附加靶标分析物(即，单一样品中的两种总分析物)的组合物可包括(i)第一已知量的第一校准物和第二已知量的第二校准物，其中第一已知量和第二已知量不同；以及(ii)第三已知量的第三校准物和第四已知量的第四校准物，其中第三已知量和第四已知量不同，并且其中第一校准物、第二校准物、第三校准物、第四校准物、靶标分析物和附加靶标分析物通过质谱法在单一样品中各自是能够区分的。如果组合物适于量化第二附加靶标(即，单一样品中的三种总分析物)，则其还可包括第五已知量的第五校准物和第六已知量的第六校准物，其中第五已知量和第六已知量不同，并且其中第一校准物、第二校准物、第三校准物、第四校准物、第五校准物、第六校准物、靶标分析物、附加靶标分析物和第二附加靶标分析物通过质谱法在单一样品中各自是能够区分的。

用于量化多种分析物(例如，2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、......总分析物)的另外的组合物可以例如通过组合可能存在于单一样品中的用于每种靶标分析物的两种或更多种内部校准物来产生。如上所述，用于每种靶标分析物的两种内部校准物应当以不同的量存在。此外，在各种实施方案中，靶标分析物和内部校准物通过质谱法在单一样品中应全部是能够区分的。不同靶标分析物可各自独立地具有不同数量的对应内部校准物。不同内部校准物可基本上由不同稳定同位素类似物、类似物、衍生物、代谢物、靶标分析物的相关化合物或它们的组合组成。

本技术的组合物可包含干制剂和液体制剂(例如，溶液、乳液、悬浮液等)。制剂可通过与内部校准物(例如，其可能与干燥不相容或在液体中不稳定)或样品(例如，可能需要液体来促进混合，并且可能需要为水性或有机或离-子子-/pH平衡以与样品相容)的相容性的要求来确定。

液体制剂可包含各种无机或有机溶剂或它们的混合物，它们与内部校准物、样品和MS分析相容。在一些实施方案中，选择与制备、萃取或分离(例如，色谱流动相和介质)相容的溶剂。示例溶剂包含水、乙腈、脂族醇(例如，甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇)、六氟丙酮以及它们的组合。溶剂可包含添加剂，诸如缓冲盐(例如，醋酸铵)、无机酸或有机酸(例如，甲酸、三氟醋酸、正磷酸、七氟丁酸)、和/或无机碱或有机碱(例如，NH₃)。

干制剂可通过各种常规干燥技术制备，诸如风干、真空干燥、喷雾干燥、转鼓式干燥、介电干燥、冷冻干燥(例如，冻干)、超临界干燥或它们的组合。干制剂包括基本上不含液体，例如溶剂(例如，水)的制剂。在各种实施方案中，干组合物可被量化为具有小于10％w/w的液体(例如，小于9％w/w的液体、小于8％w/w的液体、小于7％w/w的液体、小于6％w/w的液体、小于5％w/w的液体、小于4％w/w的液体、小于3％w/w的液体、小于2％w/w的液体、小于1％w/w的液体、小于0.5％w/w的液体、或小于0.1％w/w的液体)。

根据本技术的组合物可包含一种或多种附加物质，例如，改善组合物的稳定性、改善或促进样品的加工和/或允许、改善或促进靶标分析物的分析的物质。此类附加物质包括抗微生物剂(例如，抗生素、叠氮化物)、抗氧化剂、还原剂、pH调节剂(例如，无机和/或有机酸、碱或缓冲剂)、螯合剂(例如，EDTA)、洗涤剂、离液剂、蛋白酶抑制剂(例如，如果要避免样品中的肽/蛋白质的降解)、DNA酶抑制剂(例如，如果要避免样品中的DNA的降解)、RNA酶抑制剂(例如，如果要避免样品中RNA的降解)、珠粒(例如，破坏细胞膜的珠粒或具有离子交换、磁性、尺寸排阻和/或分配性质的珠粒)、蛋白酶(例如，如果需要样品中肽/蛋白质的降解)、DNA酶(例如，如果需要样品中DNA的降解)、RNA酶(例如，如果需要样品中RNA的降解)和溶剂(例如，如果组合物是液体制剂的形式)。

在一些实施方案中，组合物(例如，用于商业试剂盒的组合物)包括质控(QC)材料，例如，含有已知量的靶标分析物的干制剂或液体制剂，该靶标分析物单独存在或与对所述靶标分析物特异的一组内部校准物中的一种或多种内部校准物组合存在。在各种实施方案中，在基质中对QC进行测量。试剂盒可包括作为QC的纯分析物供使用者提供他们自己的空白基质，或者另选地，试剂盒可包括一个或多个空白基质，该空白基质被预先掺入或可根据所需用途选择添加到试剂盒中提供的纯QC材料。

例如，试剂盒可包括用于每组内部校准物/靶标分析物的QC材料。组合物可包含例如单一混合物中的内部校准物和QC材料。试剂盒可包括例如内部校准物的一种或多种混合物以及一种或多种对应QC材料。

根据本技术的组合物可被容纳在限定至少一个样品容器的样品架中。样品架可以是能够密封的(例如，能够密封的小瓶、能够密封的管，诸如即用型管、能够密封的微量滴定板，诸如6孔板、24孔板、或96孔板等)。许多样品容器(诸如小瓶、管、和板)在本领域中是已知的。

在各种实施方案中，根据本技术的组合物可被容纳在具有一个或多个隔室的样品架中。在一个示例中，样品架的一个或多个隔室容纳量足以分析每个隔室的一个样品(例如，包括一种或多种靶标分析物)的内部校准物(即，如上所述的一组或多组内部校准物)。

在一些实施方案中，样品架限定大量样品容器，每个容器容纳或接收相同的组合物(即，用于每种靶标分析物的两种或更多种内部校准物的组)，从而促进针对共同分析面板分析多个样品。另选地，样品架可限定大量样品容器，每个样品容器容纳或接收不同组合物(即，用于每种靶标分析物的两种或更多种内部校准物的不同组)，从而促进针对多个分析面板分析单一样品。

在另一个实施方案中，组合物被容纳在容纳量和比例足以分析多个样品的内部校准物(例如，一组或多组内部校准物)的一个隔室(诸如能够密封的管或小瓶)中。内部校准物可以是干制剂的形式，其可以通过添加溶剂被复原成液体制剂。可将复原后的液体制剂以相等的等分试样添加到待分析的多个样品中的每个样品中，从而确保每个样品包括相同品质和量的内部校准物。

根据本技术的组合物可被容纳在即用型反应管中，例如，可以直接用于样品处理或分析的预先等分的反应管。预先等分的反应管可容纳量和比例足以分析一个或多个样品的内部校准物。例如，反应管可容纳3组内部校准物，其中每组容纳4种内部校准物，并且每组内部校准物内的内部校准物的量彼此不同。该管可以被牢固地封闭(例如，通过螺帽、卡扣帽、或穿刺帽)。示例管的体积可在小于1mL、1mL至15mL、或1mL至2mL(例如，1.5mL)范围内。一般来讲，样品容器的体积可以根据待处理/分析的样品的性质和量来选择。

根据本技术的试剂盒可包括本文所述的组合物中的任何一种或多种组合物连同用于实施本技术的方法和/或采用本技术的装置的说明书(和/或其他/附加工具)。下文依次讨论此类方法和装置。

方法

本技术的特征在于用于通过质谱法量化靶标分析物的方法。该方法包括获得来自单一样品的质谱仪信号，该质谱仪信号包括第一校准物信号、包括第二校准物信号并且可能包括靶标分析物信号，该单一样品包含第一已知量的第一校准物、包含第二已知量的第二校准物并且可能包含靶标分析物。第一已知量和第二已知量不同，并且第一校准物、第二校准物和靶标分析物在单一样品中各自是能够区分的(例如，通过质谱法)。该方法还包括使用第一校准物信号、第二校准物信号和靶标分析物信号量化单一样品中的靶标分析物。

在一个方面，本文提供了一种通过质谱法量化靶标分析物的方法，该方法包括：通过在包含靶标分析物的单一样品中添加已知量的至少三种校准物(例如，3种、4种、5种或6种)来制备单一样品，其中至少三种校准物的质量彼此相差至少1个质量单位，并且在至少三种校准物内具有最低质量的校准物的质量比靶标分析物大至少6个质量单位，其中至少三种校准物各自是靶标分析物的不同稳定同位素类似物，其中靶标分析物是未标记的，其中由用于靶标分析物的至少三种校准物限定的量范围涵盖样品中的靶标分析物的预计分析范围，并且其中每种校准物的量线性地不同；使用包括至少三种校准物信号和靶标分析物信号的质谱仪从单一样品生成质谱仪信号；获得校准曲线，其中该校准曲线是使用至少三种校准物信号和彼此重叠的至少三种校准物信号的至少一些部分校准物信号获得的；以及使用校准曲线和靶标分析物信号量化靶标分析物。

如上文在校准物和分析物的性质和选择的上下文中所讨论的，方法可采用用于给定分析物的多于两种校准物。例如，使用三种校准物的方法可包括从质谱仪信号获得来自单一样品的第三校准物信号，该单一样品还包含第三已知量的第三校准物，其中(i)第一已知量、第二已知量和第三已知量不同；(ii)第一校准物、第二校准物、第三校准物和靶标分析物在单一样品中各自是能够区分的；以及(iii)量化靶标分析物包括使用第三校准物。使用四种校准物的方法还可包括从质谱仪信号获得来自单一样品的第四校准物信号，该单一样品还包含第四已知量的第四校准物，其中(i)第一已知量、第二已知量、第三已知量和第四已知量不同；(ii)第一校准物、第二校准物、第三校准物、第四校准物和靶标分析物在单一样品中各自是能够区分的；以及(iii)量化靶标分析物包括使用第四校准物。

附加校准物可能用于增加靶标分析物量化的精确度和/或准确度。在预计基质效应使校准物信号模糊或扭曲的情况下，也可以使用附加校准物，从而确保即使校准物信号存在任何问题，也可以确定准确的校准曲线(或公式)。此类附加校准物的浓度通常与用于给定靶标分析物的其他校准物的浓度不同。然而，在一些实施方案中，此类附加校准物可与另一种校准物处于相同或基本上相同的浓度，只要用于给定靶标分析物的两种校准物以不同的量存在即可。

如上文在校准物和分析物的性质和选择的上下文中所讨论的，方法可量化给定样品中的两种或更多种分析物。例如，量化两种分析物(例如，靶标分析物和附加靶标分析物)的方法可包括(i)从质谱仪信号获得来自单一样品的第三校准物信号、第四校准物信号和附加靶标分析物信号，该单一样品包含第三已知量的第三校准物、包含第四已知量的第四校准物并且可能包含附加靶标分析物(其中第三已知量和第四已知量不同，并且其中第一校准物、第二校准物、第三校准物、第四校准物、靶标分析物和附加靶标分析物在单一样品中各自是能够区分的)；以及(ii)使用第三校准物信号、第四校准物信号和附加靶标分析物信号量化单一样品中的附加靶标分析物。量化三种分析物(例如，靶标分析物、附加靶标分析物和第二附加靶标分析物)的方法还可包括(i)从质谱仪信号获得来自单一样品的第五校准物信号、第六校准物信号和第二附加靶标分析物信号，该单一样品包含第五已知量的第五校准物、包含第六已知量的第六校准物并且可能包含第二附加靶标分析物(其中第五已知量和第六已知量不同，并且其中第一校准物、第二校准物、第三校准物、第四校准物、第五校准物、第六校准物、靶标分析物、附加靶标分析物和第二附加靶标分析物在单一样品中各自是能够区分的)；以及(ii)使用第五校准物信号、第六校准物信号和第二附加靶标分析物信号量化单一样品中的第二附加靶标分析物。

用于获得质谱仪信号的不同方法在本领域中是已知的。在各种具体实施中，质谱分析包括电离一种或多种化合物以生成带电分子或分子碎片以及测量它们的质荷比。此类程序可包括以下步骤：将含有一种或多种化合物的混合物装载到MS仪器上以及蒸发一种或多种化合物；电离混合物的组分以形成带电粒子(离子)；在分析器中根据其质荷比电磁分离离子；检测离子(例如，通过定量方法)；以及将离子信号转换为质谱。

质谱仪可以例如在以下模式中的任何模式下进行操作：(1)全扫描，例如，质谱仪检测m/z标度上两个远点(诸如0和10000)之间的所有离子；(2)单离子监测(SIM)或单离子记录(SIR)，例如，质谱仪仅检测具有特定m/z值或位于小质量m/z范围(例如，1个质量单位或2个质量单位的范围)内的离子；(3)多反应监测(MRM)，例如，在具有多个质谱仪单元的质谱仪中，至少两个单元在SIM/SIR模式下进行操作。

在质谱仪中分离和测量离子的强度之后，可例如通过针对所检测离子测量的强度对其质荷比(m/z)作图来创建质谱。根据质谱仪进行操作的模式(全扫描、SIM/SIR、或MRM)，质谱可包括(1)对应于在质谱仪中在m/z尺度上的两个远点之间检测到的所有离子(前体离子和产物离子)的峰；(2)对应于(a)具有特定m/z值或位于非常小m/z范围内的所有离子和任选地(b)源自(a)中指定的离子的所有产物离子的峰；或(3)仅一种或多种所选择的产物/子离子(MRM通道)。

例如，当质谱仪在MRM模式下进行操作时，可以为一组内部校准物和对应靶标分析物创建单个质谱。单个质谱将含有针对每种内部校准物的一个峰，并且如果存在于样品中，则包含针对对应靶标分析物的一个峰。另选地，可以为第一组内部校准物和对应靶标分析物创建多个质谱，其中多个质谱中的每个质谱仅表示内部校准物中的一个内部校准物或对应靶标分析物。可以为每组内部校准物和对应靶标分析物创建此类单个质谱或多个质谱。

使用MRM通道创建的质谱和在峰强度对时间(诸如如果质谱仪耦合到SPE、色谱或电泳设备，则为保留时间)作图的情况下创建的质谱通常被描述为质谱色谱图。因此，如本文所用，术语质谱也可以与质谱色谱图有关(例如，MS在MRM模式下操作)。

接着，确定代表内部校准物中的每种内部校准物和对应靶标分析物的离子的MS信号强度(或相对信号强度)。质谱中离子的信号强度(例如，对应于这些离子的峰的强度)可以诸如通过相对于时间进行特定离子的信号强度的积分根据峰高或峰面积例如根据峰面积来确定。质谱中的离子信号的强度可以被归一化为例如100％，即检测到的最强的离子信号。

可使用第一校准物信号、第二校准物信号和靶标分析物信号对单一样品中的靶标分析物进行量化。该方法包括使用靶标分析物信号和校准曲线或代数方程(即，基于校准物信号)量化靶标分析物。例如，该方法可包括(i)从第一校准物信号和第二校准物信号获得校准曲线；以及(ii)使用校准曲线和靶标分析物信号量化靶标分析物。另选地，该方法可包括使用第一校准物信号、第二校准物信号和靶标分析物信号以代数方法量化靶标分析物。在各种实施方案中(例如，用于给定靶标分析物的两种或更多种校准物、两种或更多种靶标分析物以及它们的组合)，该量化步骤可手动(例如，例如在一次性、研究或开发环境中使用铅笔和纸、计算器或电子表格)或自动(例如，例如在高通量或商业环境中使用编程机器或专门构建的机器)进行。

校准曲线可以通过对数据应用合适的回归算法(例如，高斯最小二乘拟合方法)来获得。合适的回归算法可包括以下步骤：(1)选择数学函数(模型)；(2)根据实验数据拟合函数；以及(3)验证该模型。该函数在整个分析范围内可以是线性的，但并不一定是线性的。在该方法量化多种靶标分析物的情况下，可以对每组内部校准物进行使用对应校准物信号创建校准曲线的步骤，从而为每种对应靶标分析物创建一条不同的校准曲线。

如上文所讨论的，本公开的组合物、试剂盒和方法可用于通过质谱法量化靶标分析物。质谱仪可包括离子源，诸如电喷雾电离(″ESI″)离子源；大气压光电离(″APPI″)离子源；大气压化学电离(″APCI″)离子源；基质辅助激光解吸电离(″MALDI″)离子源；激光解吸电离(″LDI″)离子源；大气压电离(″API″)离子源；硅上解吸电离(″DIOS″)离子源；电子碰撞(″EI″)离子源；化学电离(″CI″)离子源；场电离(″FI″)离子源；场解吸(″FD″)离子源；电感耦合等离子体(″ICP″)离子源；快速原子轰击(″FAB″)离子源；液相二次离子质谱(″LSIMS″)离子源；解吸电喷雾电离(″DESI″)离子源；镍63放射性离子源；大气压基质辅助激光解吸电离离子源；和热喷雾离子源。

质谱仪可包括质量分析器，诸如四极杆质量分析器；2D或线性四极杆质量分析器；3D四极杆质量分析器；2D或线性四极杆离子阱质量分析器；3D四极杆离子阱质量分析器；潘宁阱质量分析器；离子阱质量分析器；磁性扇形质量分析器；离子回旋共振(″ICR″)质量分析器；傅里叶变换离子回旋共振(″FTICR″)质量分析器；静电或轨道阱质量分析器；傅里叶变换静电或轨道阱质量分析器；傅里叶变换质量分析器；飞行时间质量分析器；正交加速飞行时间质量分析器；和线性加速飞行时间质量分析器。质谱仪可包括离子迁移率分析器。

质谱仪可包括电离源，诸如电喷雾电离(″ESI″)离子源；大气压光电离(″APPI″)离子源；大气压化学电离(″APCI″)离子源；基质辅助激光解吸电离(″MALDI″)离子源；激光解吸电离(″LDI″)离子源；大气压电离(″API″)离子源；硅上解吸电离(″DIOS″)离子源；电子碰撞(″EI″)离子源；化学电离(″CI″)离子源；场电离(″FI″)离子源；场解吸(″FD″)离子源；电感耦合等离子体(″ICP″)离子源；快速原子轰击(″FAB″)离子源；液相二次离子质谱(″LSIMS″)离子源；解吸电喷雾电离(″DESI″)离子源；镍63放射性离子源；大气压基质辅助激光解吸电离离子源；和热喷雾离子源。

实施例

除非另有说明，否则所有技术，包括试剂盒和试剂的使用，都是根据制造商的信息、本领域已知的方法或如例如在以下中所描述的进行的：Tietz Text Book of ClinicalChemistry第3版(Burtis，C.A.&Ashwood，M.D.，编辑)W.B.桑德斯公司(W.B.SaundersCompany)，1999；Guidance for Industry.Bioanalytical Method Validation.美国：药物评价和研究中心(USA：Centre for Drug Evaluation and Research)，美国卫生和社会服务部(US Departmentof Health and Social Services)，食品和药物管理局(Food andDrug Administration)，2001；和Sambrook等人，Molecular Cloning：ALaboratoryManual，第二版(1989)冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，纽约冷泉港(Cold Spring Harbor，N.Y.)。下文使用的和在这些参考文献中描述的方法据此全文以引用方式并入。

实施例1：一组内部他克莫司校准物的设计中所需的稳定同位素标记的最小数量 的考量

在作为一种大环内酯免疫抑制剂药物的他克莫司(C₄₄H₆₅NO₁₀)中存在的那些元素中，碳具有碳13(¹³C)形式的丰度最大的同位素，其占所有天然存在的碳原子的大约1％。他克莫司分子中十个碳原子的存在为一个或多个¹³C原子的随机出现提供了机会，每个原子都引起分子的质量增加大约1道尔顿。因此，他克莫司具有特征性同位素分布，即具有不同强度的特征性系列峰(图2)。

本技术的内部校准物(例如，至少三种已知量的校准物)含有足够数量的稳定同位素标记(例如，至少六个碳13原子)以使它们区别于靶标分析物(图2)。

内部校准物(即，六种稳定同位素，即，他克莫司的¹³C标记类似物)和分析物可以根据它们的MS特性而彼此区分，使得在单次分析中，可以同时测量对类似物和分析物的响应。这允许构建单独的校准曲线，并根据单一样品的单次分析为每个样品生成结果(图2)。图2示出了为了避免他克莫司与内部校准物之间的任何重叠峰，他克莫司的最少六个碳原子需要被稳定同位素(即，¹³C)替代。图2为确定作为设计一组内部校准物的起始点所需的稳定同位素标记的理论最小数量提供了见解，这些内部校准物可用于量化样品中分析物，例如，大环内酯免疫抑制药物的量。要考虑的因素包括例如(1)分析物的同位素分布、(2)测定的动态范围、和(3)测定结果中的最大可允许误差。

实施例2：在单次分析中使用多种内部校准物对他克莫司的分析

在一些示例中，本技术的内部校准物彼此相差至少1个质量单位。由于一个或多个¹³C原子的随机出现，校准物彼此相差至少1个(或2个、3个、4个、5个、......)质量单位，如图3所示，它们在断裂时可能具有至少一个重叠m/z峰。图3中呈现的样品包括四种SIL校准物(即，第一内部校准物、第二内部校准物、第三内部校准物、或第四内部校准物)，即，用¹³C原子标记的[¹³C₆]-他克莫司和分析物(他克莫司)。第一校准物(+6)的质量比他克莫司大至少6个质量单位，第二校准物(+7)的质量比他克莫司大至少7个质量单位，第三校准物(+8)的质量比他克莫司大至少8个质量单位，并且第四校准物(+9)的质量比他克莫司大9个质量单位的。

本文所公开的用于靶标分析物量化的方法受益于获得校准曲线的校准物的重叠m/z峰。由于本文所公开的方法将SIL校准物的重叠信号贡献加在一起，因此获得校准曲线所需的SIL校准物的实际浓度(掺入样品中的校准物的浓度)降低。换句话讲，由于如图4所示将SIL校准物的重叠信号强度相加在一起，因此处于特定m/z值时实现目标浓度以获得校准曲线所需的每种SIL校准物的实际浓度将更小。因此，与常规SIL校准物方法相比，本文所提出的方法提供使用更少量的校准物的巨大优势。

实施例3：他克莫司铵加合物同位素计算值(1ng/mL至40ng/mL，用(6个、7个、8个和 9个)[¹³C]原子标记的四种SIL校准物，＜2％干扰)

他克莫司在MS/MS中不形成强碎片。因此，使用含有醋酸铵或甲酸铵的流动相对他克莫司进行分析，使得在电喷雾正电离模式下，其可形成铵加合物(m/z 821.5)。断裂导致铵加合物和两个水分子(m/z 821.5>m/z768.5)的损失并给出相对高的信号。图5A和图5B示出了断裂后各种SIL校准物的MS信号(m/z 768.5)；图6A和图6B示出了断裂前各种SIL校准物的MS信号(m/z 821.5)。

图5A和图5B示出了用(6个、7个、8个和9个)[¹³C]原子标记的四种SIL校准物之间的重叠MS信号。图5A还示出了用3个、4个和5个[¹³C]原子标记的校准物；并且图5B还提供了针对用3个、4个和5个[¹³C]原子标记的SIL校准物的MS信号数据。使用本文所提出的方法获得的计算值显示，处于特定m/z值时实现目标浓度以获得校准曲线所需的每种SIL校准物的实际浓度将更小。也就是说，与在不适应校准物之间的重叠信号的方法中使用的每种SIL校准物的量相比，掺入样品中的每种SIL校准物的量将更少。例如，由于其他SIL校准物的信号贡献，需要添加到样品中的第四校准物(+9)的实际浓度是33ng/mL，以便处于特定m/z值时获得40ng/mL的目标(表观)浓度。使用较少量的SIL校准物带来大大降低复杂分子(例如，大环内酯免疫抑制药物)的MS分析成本的优点。图6A和图6B示出了断裂前用(6个、7个、8个和9个)[¹³C]原子标记的四种SIL校准物之间的重叠MS信号。图6A还示出了用3个、4个、5个、10个、11个、12个、13个、14个、15个和16个[¹³C]原子标记的校准物；并且图6B还提供了针对用3个、4个、5个、10个和11个[¹³C]原子标记的SIL校准物的MS信号数据。类似于图5A和图5B，与在不适应校准物之间的重叠信号的方法中使用的每种SIL校准物的量相比，掺入样品中的每种SIL校准物的量将更少。

为了正确地获得校准曲线并定量分析样品中的他克莫司，研究了用(3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个和15个)[¹³C]原子标记的多种SIL校准物的相对浓度。图7示出了当在样品中使用用(6个、7个、8个和9个)[¹³C]原子标记的四种SIL校准物时，与其他校准物相比需要更低浓度的校准物，这为药物的常规分析提供了巨大优势，降低了分析成本。

Claims (7)

1.一种用于通过质谱法量化样品中的靶标分析物的量的组合物，所述组合物包含：

已知量的至少三种校准物，其中至少三种校准物的质量彼此相差至少1个质量单位，并且在所述已知量的至少三种校准物内具有最低质量的所述校准物的质量比所述靶标分析物大至少6个质量单位。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中至少三种校准物的质量彼此相差1个质量单位。

3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述已知量的至少三种校准物在它们通过质谱法断裂时具有至少一个重叠m/z峰。

4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述靶标分析物选自他克莫司、雷帕霉素、西罗莫司、依维莫司、和环孢菌素A。

5.根据权利要求1所述的组合物，其中至少三种校准物各自是所述靶标分析物的不同稳定同位素类似物。

6.一种用于通过质谱法量化样品中的靶标分析物的量的试剂盒，所述试剂盒包括：

(i)根据权利要求1所述的组合物；

(ii)用于进行以下操作的说明书：(a)从单一样品和所述靶标分析物获得质谱仪信号和靶标分析物信号，所述质谱仪信号包括至少三种校准物信号，所述单一样品包含已知量的至少三种校准物；以及(b)使用所述至少三种校准物信号、所述靶标分析物信号和彼此重叠的至少三种校准物信号的至少一些部分校准物信号量化所述单一样品中的靶标分析物的量。

7.一种通过质谱法量化靶标分析物的方法，所述方法包括：

通过在包含所述靶标分析物的单一样品中添加已知量的至少三种校准物来制备单一样品，

其中至少三种校准物的质量彼此相差至少1个质量单位，并且在所述至少三种校准物内具有最低质量的所述校准物的质量比所述靶标分析物大至少6个质量单位，

其中至少三种校准物各自是所述靶标分析物的不同稳定同位素类似物，

其中所述靶标分析物是未标记的，

其中由用于所述靶标分析物的所述至少三种校准物限定的量范围涵盖所述样品中的所述靶标分析物的预计分析范围，并且其中每种校准物的量线性地不同；

使用包括至少三种校准物信号和靶标分析物信号的质谱仪从所述单一样品生成质谱仪信号；

获得校准曲线，其中所述校准曲线是使用所述至少三种校准物信号和彼此重叠的至少三种校准物信号的至少一些部分校准物信号获得的；以及使用所述校准曲线和所述靶标分析物信号量化所述靶标分析物。