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CN118962116A - 一种用于无背景均相检测的纳米荧光晶近红外光供体和受体对及其实施方法 - Google Patents

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CN118962116A CN202411003718.6A CN202411003718A CN118962116A CN 118962116 A CN118962116 A CN 118962116A CN 202411003718 A CN202411003718 A CN 202411003718A CN 118962116 A CN118962116 A CN 118962116A
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rare earth
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nalnf
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fret
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冀天星
魏嵬
马菲菲
李艳涛
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Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University
Original Assignee
Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University
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Abstract

本发明公开了一种用于无背景均相检测的稀土氟化物纳米荧光晶近红外光供体和受体对，并基于该供体和受体对构建了可用于高灵敏均相检测的稀土基近红外荧光FRET传感器，所述FRET传感器包括探针1和探针2，所述探针1为Nd3+与Yb3+共掺杂的稀土氟化物纳米晶，所述探针2为Yb3+掺杂的稀土氟化物纳米晶，可极大提高近红外FRET传感器的FRET效率，并极大地提升其光化学稳定性及抗干扰能力。同时，本发明还构建了可用于小分子指标吗啡(MOP)、蛋白类指标人绒毛膜促性腺激素(β‑HCG)和病毒颗粒类指标腺病毒(AdV)等检测的近红外FRET传感器，实现了对尿液、粪便和全血等复杂样本中指标的高灵敏均相检测。

Description

一种用于无背景均相检测的纳米荧光晶近红外光供体和受体 对及其实施方法
技术领域
本发明属于分析与体外检测技术领域，具体涉及一种用于无背景均相检测的纳米荧光晶近红外光供体和受体对及其实施方法。
背景技术
基于荧光共振能量转移(FRET)技术的均相检测是一种利用供受体之间存在的FRET现象来测定生物靶标的含量和不同分子之间相互作用的检测技术。FRET是一种在两种荧光分子间所进行的非辐射能量传输的过程，其中一个荧光分子通过非辐射的相互作用将能量传递给另一个荧光分子，从而导致第二个荧光分子发射荧光信号。以FRET技术为基础的均相检测具有操作简单、无需复杂仪器、无需复杂洗脱过程、检测速度快、适用范围广、灵敏度高等优点。近年来，这一技术已成为备受关注的热点领域，并受到广泛的研究和应用关注。尽管对该技术的研究取得了一定的进展，但现有基于FRET的均相检测方法仍存在较大的痛点问题：待检测样本的颜色、浑浊度仍严重干扰均相检测的精准性和灵敏度。因此，如何克服待检测样本颜色和浑浊度对均相检测精准性和灵敏度的干扰是迫切需要解决的问题。
FRET现象指在距离非常接近的分子之间(<10nm)进行非辐射的能量传递，因此选择适合的供体和受体对于实现快速且高灵敏度的均相检测极其重要性。对于供体而言，选择逐渐从传统的荧光蛋白、有机小分子染料扩展至无机纳米颗粒，目前稀土掺杂的纳米颗粒(LnNPs)作为一种新兴的供体材料。稀土掺杂的纳米颗粒的激发光源可以为紫外、可见到近红外等多个光谱区间，发射光也包括了紫外、可见到近红外等多个光谱区间，具有多谱带发射、发射峰宽窄、荧光寿命长的优点，可以根据需求对供体进行多种设计。而且具有优异的光、化学稳定性及抗干扰能力，是一类优异的荧光探针。稀土掺杂的下转换纳米颗粒(DCNPs)相比于传统的供体材料，其激发与发射的近红外光具有更低的背景荧光和散射干扰，因此可以在较为复杂的生物样本(如尿液、唾液、粪便等)中构建更加灵敏的传感器，DCNPs是更加理想的供体材料。
受体材料在选择上要尽可能与供体材料进行匹配才能够有较高的FRET效率，除此之外要考虑受体材料的光、化学稳定性以及其发射光谱与供体材料的发射串扰，才能够使得构建的近红外FRET传感器具有优异的性能。所以选择一个合适的稀土掺杂的受体材料，并对目前存在的各种生物靶标的检测需求十分重要。
在供受体进行FRET过程中，供体和受体之间的距离、光谱重叠程度是影响效率的主要因素。所以可以通过缩短供体和受体之间的距离和提高供受体的光谱重叠面积来提升FRET效率。然而，DCNP颗粒一般为10～50nm，受体只会与分布在较为贴近表面的供体发光中心进行作用，未进行相互作用的发光中心会进行独立发光，导致FRET效率很低。同时部分的稀土发光中心在近红外区域的发光比较容易被水猝灭，这就需要寻求一种相对来说不受水影响的稀土元素。因此选择合适的RENPs作为近红外FRET体系的供体材料，在复杂样品中对生物标志物进行均相检测至关重要。另外，对于受体来说尽可能需求一种与供体发光光谱重叠面积较大的材料，从而有效的提高FRET效率。
综上可见，设计一个完全基于稀土纳米探针的近红外FRET传感器，并构建光化学稳定性更高、抗干扰能力更强、适用范围更广泛的近红外FRET传感器，对于在复杂生物样品中实现生命标志物的高灵敏均相检测至关重要。
发明内容
针对现有的基于FRET的均相检测方法存在的光、化学稳定性差，灵敏度低，背景干扰等问题，本发明提供了一种完全由稀土纳米探针组成的纳米荧光晶近红外光供体和受体对，并基于此构建了可用于高灵敏均相检测的近红外荧光共振能量转移(FRET)传感器，实现了尿液、粪便、全血、胸腹水、污水和食品安全检测样本等复杂样本的高灵敏均相检测，具有操作简单，检测时间较短，可以实现无背景检测等优点。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
本发明第一方面提供了一种基于稀土离子掺杂纳米晶的近红外光FRET生物传感器，所述近红外光FRET生物传感器包括标记有抗体或抗原的探针1和标记有抗体或抗原的探针2，所述抗体和抗原为能发生特异性结合反应的抗原抗体对；所述探针1为Nd3+与Yb3+共掺杂的稀土氟化物纳米晶，具体为核壳结构的NaLnF4@NaLnF4:Ndx％/Yby％，其中x＝40，y＝10；所述探针2为Yb3+掺杂的稀土氟化物纳米晶，具体为NaLnF4:Ybx％，其中x＝100。
本发明第二方面提供了第一方面所述的基于稀土离子掺杂纳米晶的近红外光FRET生物传感器的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、制备Nd3+与Yb3+共掺杂的稀土氟化物纳米晶：
S11、采用S11-1或S11-2的方法制备惰性核NaLnF4：
S11-1、将稀土醋酸盐、油酸(OA)和1-十八烯(ODE)混合均匀，在惰性气氛下加热至第一温度，反应45±15min，冷却后加入溶解有氢氧化钠(NaOH)和氟化铵(NH4F)的甲醇溶液，在惰性气氛下加热至第二温度，待体系中的甲醇、氧气和水完全除去后，再次加热至第三温度，反应75±15min，冷却后离心收集产物，并用乙醇清洗1-3次，于分散剂中进行分散，得到的NaLnF4纳米粒子；
S11-2、将三氟醋酸稀土盐、三氟醋酸钠、OA和ODE混合均匀，在惰性气氛下加热至第一温度，反应20±15min，在惰性气氛下加热至第二温度，反应45±15min，冷却后离心收集产物，并用乙醇清洗1-3次，于分散剂中进行分散，得到的NaLnF4纳米粒子；
S12、采用S12-1或S12-2的方法制备核壳结构NaLnF4@NaLnF4:Ndx％/Yby％纳米晶：
S12-1、将稀土醋酸盐、OA和ODE混合均匀，在惰性气氛下加热至第一温度，反应45±15min，冷却后加入溶解有NaOH和NH4F的甲醇溶液与S11中合成的NaLnF4纳米粒子，在惰性气氛下加热至第二温度，待体系中的甲醇、氧气和水完全除去后，再次加热至第三温度，反应75±15min，冷却后离心收集产物，并用乙醇清洗1-3次，于分散剂中进行分散，得到NaLnF4@NaLnF4:Ndx％/Yby％纳米粒子；
S12-2、将三氟醋酸稀土盐、三氟醋酸钠、OA和ODE混合均匀，在惰性气氛下加热至第一温度，反应20±15min，冷却后加入溶解有NaOH，NH4F的甲醇溶液与S3中合成的NaLnF4纳米粒子，在惰性气氛下加热至第二温度，反应45±15min，冷却后离心收集产物，并用乙醇清洗1-3次，于分散剂中进行分散，得到所述NaLnF4@NaLnF4:Ndx％/Yby％；
S2、合成Yb3+掺杂的稀土氟化物纳米晶：
将稀土醋酸盐、OA、ODE和油胺(OM)混合均匀，在惰性气氛下加热至第一温度，反应45±15min，冷却后加入溶解有NaOH和NH4F的甲醇溶液，在惰性气氛下加热至第二温度，待体系中的甲醇、氧气和水完全除去后，再次加热至第三温度，反应45±15min，冷却后离心收集产物，并用乙醇清洗2-3次，于分散剂中进行分散，得到NaLnF4:Ybx％粒子；
S3、对步骤S1的Nd3+与Yb3+共掺杂的稀土氟化物纳米晶标记抗体或抗原，即得标记有抗体或抗原的探针1；
S4、对步骤S2的Yb3+掺杂的稀土氟化物纳米晶标记抗体或抗原，即得标记有抗体或抗原的探针2。
优选地，S11-1中，稀土元素为钇(Y)，所述惰性气为氮气，第一温度为155±15℃，第二温度为120±20℃，第三温度为300±20℃，分散剂为环己烷，所述稀土醋酸盐、油酸和1-十八烯的用量为0.25～1.0mmol:5～10mL:10～20mL；S11-2中，稀土元素为钇(Y)，所述惰性气为氮气，第一温度为120±20℃，第二温度为300±20℃，分散剂为环己烷，所述稀土醋酸盐、油酸和1-十八烯的用量为0.25～1.0mmol:5～10mL:10～20mL。
优选地，S12-1中，稀土元素为钇(Y)、钕(Nd)或镱(Yb)，所述惰性气为氮气，第一温度为155±15℃，第二温度为120±20℃，第三温度为300±20℃，分散剂为环己烷，所述稀土元素的醋酸盐、油酸和1-十八烯的用量为0.25～1.0mmol:5～10mL:10～20mL；S12-2中，稀土元素为钇(Y)、钕(Nd)或镱(Yb)，所述惰性气为氮气，第一温度为120±20℃，第二温度为300±20℃，分散剂为环己烷；所述稀土元素的醋酸盐、油酸和1-十八烯的用量为0.25～1.0mmol:5～10mL:10～20mL。
优选地，S2中，稀土元素为镱(Yb)，所述惰性气为氮气，第一温度为155±15℃，第二温度为120±20℃，第三温度为300±15℃，分散剂为环己烷，稀土醋酸盐、油酸、1-十八烯和油胺的比例为0.25～1.0mmol:1～5mL:2～10mL:1～5mL。
优选地，步骤S3对Nd3+与Yb3+共掺杂的稀土氟化物纳米晶标记抗体或抗原的方法为：使用步骤S1合成的Nd3+与Yb3+共掺杂稀土氟化物纳米晶表面有一层OA配体，使用配体交换法等将纳米晶表面包裹羧基聚合物，然后与活化剂混合，反应，离心，得到的沉淀物分散于缓冲液A，用缓冲液A洗涤1-3次后，向缓冲溶液中加入抗体或抗原，混匀之后加入含1％牛血清蛋白(BSA)的缓冲液B继续反应，反应结束后离心、洗涤即得标记有抗体的稀土掺杂发光纳米晶的溶液；
优选地，步骤S4对Yb3+掺杂的稀土氟化物纳米晶标记抗体或抗原的方法为：对使用步骤S2合成的Yb3+掺杂稀土氟化物纳米晶，使用配体交换法等将纳米晶表面包裹羧基聚合物，然后与活化剂混合，反应，离心，得到的沉淀物分散于缓冲液A，用缓冲液A洗涤1-3次后向缓冲溶液中加入抗体或抗原，混匀之后加入含2％BSA的缓冲液B继续反应，反应结束后离心、洗涤，并重新分散到缓冲液C中，即得标记有抗原的稀土掺杂发光纳米晶的溶液。
更优选地，S3、S4中，所述缓冲液A为2-吗啉乙磺酸(MES)溶液，浓度为0.10mol/L，pH值为6.0；所述缓冲液B为甘氨酸缓冲液，pH值为8.0；所述缓冲液C为氨基丁三醇(Tris)缓冲液，pH值为7.4。
更优选地，S3、S4中，所述抗体包括腺病毒(AdV)抗体1、VD抗体、MOP抗体(AbMOP)、乙酰胆碱抗体或促人绒毛性腺激素(β-HCG)抗体1等；所述抗原包括腺病毒(AdV)抗原2、VD类抗原、MOP抗原(AgMOP)、乙酰胆碱抗原或促人绒毛性腺激素(β-HCG)抗体2等。
理论上，能发生特异性结合反应的抗原抗体、互作蛋白对，或者与待测抗原都可以作用的双抗体对皆可：如供体连接的抗体可以为VD抗体、MOP抗体(AbMOP)、乙酰胆碱抗体等，受体连接抗原可以为VD类抗原、MOP抗原(AgMOP)、乙酰胆碱抗原等；同时供体连接的抗体也可以是腺病毒(AdV)抗体1、登革热抗体1等，受体连接的抗原也可以为腺病毒(AdV)抗原2、登革热抗原2等。
更优选地，步骤S3、S4中，所述与活化剂混合(即活化步骤)为：将探针1或探针2分散到MES溶液中，再加入EDC【1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐的MES溶液】和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺的MES溶液)，其中，EDC和NHS的浓度均为10mg/mL，体积比为3:5。
更优选地，步骤S3、S4中，与活化剂反应后的离心步骤为在10,500rpm转速下，离心15～25min。
本发明第三方面提供了第一方面所述的基于稀土离子掺杂纳米晶的近红外光FRET生物传感器在均相检测中的应用，检测的指标包括小分子类指标(如吗啡，MOP)、蛋白类指标(如，人绒毛膜促性腺激素，β-HCG)或病毒颗粒类指标(如，腺病毒，AdV)。
利用本发明的近红外FRET传感器可实现小分子类指标(如吗啡MOP和VD)、蛋白类指标(如，人绒毛膜促性腺激素，β-HCG)和病毒颗粒类指标(如，腺病毒，AdV)的无背景干扰均相检测，利用近红外FRET传感器实现了尿液、粪便、全血、胸腹水、污水和食品安全检测样本等复杂样本中指标的高灵敏高精准均相检测。
优选地，检测方法包括以下步骤：
S1、将Tris缓冲液、标记有抗体或抗原的探针1和检测样本充分反应后，测定供体纳米晶的近红外光发射强度，记为I0；
S2、加入标记有抗体或抗原的探针2，适当孵育确保充分反应后，测定供体纳米晶的近红外光发射强度，记为I；
S3：测定近红外FRET传感器的检测限，拟合近红外FRET传感器的工作曲线；
S4：判断【I/I0】与检测限的大小关系，可测定出待检测样本中检测靶标的含量。
优选地，步骤S3中检测限的测定方法如下：采用步骤S1、S2的方法测定不同浓度的检测标准靶标，重复三次实验，计算均值和标准偏差，建立标准曲线，其中，检测限＝空白样品均值+3×空白样本的标准差，所述空白样品为检测指标浓度为0的样品。
优选地，步骤S2中的孵育条件为37℃下孵育1～10min；步骤S1中标记有抗体的探针1溶液、步骤S2中标记有抗原的探针2溶液的浓度均为0.5～10mg/mL。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明公开了一种用于无背景均相检测的稀土氟化物纳米荧光晶近红外光供体和受体对，并基于该供体和受体对构建了可用于高灵敏均相检测的稀土基近红外荧光FRET传感器，所述FRET传感器的探针系统包括探针1和探针2，所述探针1为Nd3+与Yb3+共掺杂的稀土氟化物纳米晶，所述探针2为Yb3+掺杂的稀土氟化物纳米晶。本发明通过对探针1的结构设计和将探针2设计为稀土氟化物纳米晶等措施极大地提高近红外FRET传感器的FRET效率，并极大地提升了近红外FRET传感器的光化学稳定性及抗干扰能力。同时，本发明还构建了可用于小分子指标吗啡(MOP)、蛋白类指标人绒毛膜促性腺激素(β-HCG)和病毒颗粒类指标腺病毒(AdV)等检测的近红外FRET传感器，实现了对尿液、粪便和全血等复杂样本中指标的高灵敏均相检测。该方法具有操作简单，检测时间较短，可以实现无背景检测，还具有快速、特异性、高选择性、高灵敏度和高通量等优势。本发明具有以下几个方面的优点：
(1)本发明的探针1，Nd3+与Yb3+共掺杂稀土氟化物纳米晶——NaYF4@NaYF4:Ndx％/Yby％，该结构可以将供体稀土材料的发光中心集中在发光层上。因为FRET效率与供受体距离的六次方成反比，本发明的结构能够极大的缩短发光中心与受体猝灭剂之间的距离，大大提高FRET效率。而且得益于Nd3+与Yb3+的高效的能量传递与Nd3+对于808nm高效吸收，能够极大增强Yb3+的发光强度。本发明的一大优点在于该探针兼顾了供体荧光强度与FRET效率。
(2)探针2为Yb3+掺杂稀土氟化物纳米晶——NaLnF4:Ybx％，使用与探针1具有极大的光谱重叠，高效能量吸收的Yb3+作为稀土氟化物纳米晶的掺杂元素。由于其具有更小的体积、更高的比表面积、拥有的空间位阻效应更小，在构成FRET系统时可以获得更高的效率。更为重要的是，受体Yb3+在高掺杂时，不但可以增强受体材料的吸收能力提升FRET效率，同时又可以因为能量迁移作用尽可能的减弱了受体的发射或者不发射，避免了与供体Yb3+的光谱串扰。
(3)由探针1和探针2构成的完全由稀土纳米粒子组成的可用于高灵敏均相检测的近红外FRET传感器。使用NaYF4@NaYF4:Ndx％/Yby％做供体，在808nm激发下，发射980nm的光为近红外二区(NIR-II)，生物组织基本不吸收该区域的发光，可以实现各种环境、各种靶标的检测。
(4)使用该方法构建的近红外FRET传感器检测各种环境的多种生物标志物，具有快速、特异性、方便性、高选择性和高通量的特点，可用于小分子类指标(如MOP、VD)、蛋白类指标(如，β-HCG)、病毒颗粒类指标(如，AdV)等多种不同类型的靶标检测。对于MOP检测，检测限为0.96ng/mL；对于VD检测，检测限为0.48ng/mL；对于β-HCG检测，检测限为0.36U/L；对于AdV检测，检测限为1.4×104Vp/mL。针对于存在的上述结果说明了该FRET传感器不仅表现灵敏度高的特点，且可以实现高通量快速定量检测靶标物质。
附图说明
图1(a)为NaYF4@NaYF4:Ndx％/Yby％(即NaYF4@NaYF4:Nd40％/Yb10％)的代表性透射电镜图；(b)为α-NaYbF4(即立方相NaYbF4)的代表性透射电镜图；(c)为NaYF4@NaYF4:Ndx％/Yby％和NaLnF4:Ybx％(即α-NaYbF4)代表性X射线衍射图谱。
图2(a)为β-Y@Y:Nd40％/Yb10％(即六方相NaYF4@NaYF4:Nd40％/Yb10％)归一化激发光谱与发射光谱以及α-Yb受体(即立方相NaYbF4)的归一化吸收光谱图；(b)为Y@Y:Nd/Yb(即NaYF4@NaYF4:Nd40％/Yb10％)归一化发射光谱以及α-Yb20％(即NaYF4:20％Yb)和α-Yb100％(α-NaYbF4)的归一化吸收光谱图；(c)为α-NaYF4:20％Yb和α-NaYbF4的归一化发射谱图。
图3(a)为NaYF4@NaYF4:Nd/Yb单独存在时、NaYF4@NaYF4:Nd/Yb和NaYbF4按照1:1的比例同时存在时的光谱图；(b)为抗原抗体构建好FRET生物传感器后拍摄的透射电镜图。
图4(a)为MOP或VD检测过程(竞争法)示意图；(b)为β-HCG或AdV检测过程(双抗体夹心法)示意图。
图5(a)为使用近红外FRET传感器检测标准品的标准曲线图，以【I/I0】与MOP的浓度建立标准曲线及本传感器的检测限；(b)为使用近红外FRET传感器检测标准品的标准曲线图，以【I/I0】与VD的浓度建立标准曲线及本传感器的检测限；(c)为使用近红外FRET传感器检测标准品的标准曲线图，以【I/I0】与β-HCG的浓度建立标准曲线及本传感器的检测限；(d)为使用近红外FRET传感器检测标准品的标准曲线图，以【I/I0】与AdV的浓度建立标准曲线及本传感器的检测限。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到。
实施例1近红外发光的NaYF4@NaYF4:Nd40％/Yb10％供体纳米颗粒和NaYbF4受体纳米颗粒的制备
1、NaYF4@NaYF4:Nd40％/Yb10％供体纳米颗粒的制备
(1)制备惰性核NaYF4
NaYF4的第1个典型合成方法：将1mmolYAc3·4H2O，7.5mLOA，15.0mLODE逐次加入到100mL的三颈烧瓶中，并且进行剧烈搅拌。整个反应体系在氮气保护下加热至160℃反应45min后，冷却至室温。接下来，在反应体系中加入含有2.5mmolNaOH和4.0mmolNH4F的10mL甲醇溶液。然后，将整个反应体系提升至120℃反应20min，以彻底去除反应体系中的水、甲醇和氧气。随后，在氮气保护下加热至300℃并继续反应60min。最终，将反应体系冷却至室温，通过离心(8,000rpm，4min)收集所得产物，并用无水乙醇清洗1-3次，之后分散在10mL环己烷中。
NaYF4的第2个典型合成方法：将1mmol的Y(CF3COO)3、1mmol的CF3COONa、10mLOA、10mLODE逐次加入到100mL的三颈烧瓶中，并且进行剧烈搅拌。整个反应体系在氮气保护下加热至120℃反应15min。以彻底去除反应体系中的水和氧气。随后，在氮气保护下加热至300℃并继续反应30min。最终，将反应体系冷却至室温，通过离心(8,000rpm，4min)收集所得产物，并用乙醇清洗1-3次。然后在10mL环己烷中进行分散。
(2)在惰性核上包裹发光壳，合成纳米颗粒NaYF4@NaYF4:Nd40％/Yb10％
核壳结构的第1个合成过程：使用步骤(1)中的惰性核颗粒作为种子，合成核壳结构的NaYF4@NaYF4:Nd40％/Yb10％。具体操作步骤为：0.75mmolLnAc3(Ln＝Y、Nd、Yb,三者物质量占比分别为50％、40％、10％)，7.5mLOA，15.0mLODE逐次加入到100mL的三颈烧瓶中，并且进行剧烈搅拌。整个反应体系在氮气保护下加热至160℃反应45min后，冷却至室温。接下来，在反应体系中加入含有2.0mmolNaOH和3.0mmolNH4F的10mL甲醇溶液。然后，将整个反应体系提升至120℃反应20min，以彻底去除反应体系中的水、甲醇和氧气。随后，在氮气保护下加热至300℃并继续反应60min。最终，将反应体系冷却至室温，通过离心(8,000rpm，4min)收集所得产物，并用乙醇清洗1-3次。然后在10mL环己烷中进行分散。
核壳结构的第2个合成过程：使用步骤(1)中的惰性核颗粒作为种子，合成核壳结构的NaYF4@NaYF4:Nd40％/Yb10％。具体操作步骤为：将0.75mmol的Ln(CF3COO)3(Ln＝Y、Nd、Yb,三者物质量占比分别为50％、40％、10％)、CF3COONa(0.102g)、OA(10mL)和ODE(10mL)和制备好的NaYF4的5mL环己烷溶液混合。将反应体系加热到120℃，加热10min，以便从反应体系中完全去除水和氧气。最终，在氮气保护下，将反应温度提高到300℃，反应30min。冷却至室温后，离心(8,000rpm,4min)收集。最后，将制备好的NaYF4@NaYF4:Nd40％/Yb10％分散在5mL环己烷中，以供进一步使用。
2、NaYbF4受体(即NaLnF4:Ybx％，其中x＝100；或者α-NaYbF4)纳米颗粒的制备
制备NaYbF4纳米颗粒的步骤如下：将1mmol的YbAc3·4H2O、7.1mL ODE、3.5mL OA和3.9mL OM加入100mL的三颈烧瓶。在氮气的保护下，将反应加热到160℃，剧烈搅拌30min。当反应体系冷却到室温时，在反应体系中加入含有2.5mmol NaOH和4.0mmol NH4F的10mL甲醇溶液。整个反应被升温到120℃，并保持20min，以去除反应体系中的水和空气。然后将反应加热到300℃，在氮气保护下反应30min。然后，向反应体系中加入乙醇以充分沉淀，离心(7,500rpm，5分钟)收集所得产物，并用乙醇清洗1-3次，最后在10mL环己烷中分散，备用。
本实施例制备的NaYF4@NaYF4:Nd40％/Yb10％核壳结构纳米晶和NaYbF4纳米颗粒进行了电镜表征。透射电镜结果如图1a、1b所示，表明纳米颗粒单分散且具有均匀的尺寸分布。其中，NaYF4@NaYF4:Nd5％大小约为29.1nm，NaYbF4大小约为10.5nm。本实验制备的NaYF4@NaYF4:Nd40％/Yb10％和NaYbF4进行了X-射线衍射分析。如图1c所示的XRD衍射谱图表明NaYF4@NaYF4:Nd40％/Yb10％纳米晶为六方相晶体结构，NaYbF4为立方相晶体结构。
Yb3+掺杂浓度(10％)的受体纳米晶的归一化吸收光谱和供体材料的发射光谱如图2a所示，由于其具有更小的体积、更高的比表面积、拥有的空间位阻效应更小，在构成FRET系统时可以获得更高的效率。更为重要的是，受体Yb3+在高掺杂(100％)时，不但可以增强受体材料的吸收能力，提升FRET效率，同时又可以因为能量迁移作用尽可能的减弱受体的发射或者不发射，如图2b，c所示，从而避免与供体Yb3+的光谱串扰，这是本发明的一大创新。实施例2NaYF4@NaYF4:Nd40％/Yb10％供体纳米颗粒和NaYbF4受体纳米颗在制备近红外FRET传感器中的应用
(1)本实施例提供一种自动的近红外FRET传感器，包括标记有抗体的Nd3+与Yb3+共掺杂稀土氟化物纳米晶和标记有抗原的Yb3+稀土掺杂发光纳米晶；其中，抗体和抗原为能发生特异性结合反应的抗原抗体对。本发明中，理论上能发生特异性结合反应的抗原抗体对，或者与待测抗原都可以作用的双抗体对皆可：如供体连接的抗体可以为VD抗体、MOP抗体(AbMOP)、乙酰胆碱抗体1、促人绒毛性腺激素(β-HCG)抗体1等，受体连接的抗原可以为VD类抗原、MOP抗原(AgMOP)等；同时供体连接的抗体也可为乙酰胆碱抗体1、促人绒毛性腺激素(β-HCG)类抗体1、腺病毒(AdV)抗体1、登革热抗体1等，受体连接的抗原也可以为乙酰胆碱抗体2、促人绒毛性腺激素(β-HCG)类抗体2、腺病毒(AdV)抗原2、登革热抗原2等。本发明中以AbMOP和AgMOP、AbAdV1和AbAdV2、Abβ-HCG1和Abβ-HCG2、AbVD和AgVD(购自商业化公司，如亿百新生物、菲鹏生物股份有限公司等)四种不同互作方式的抗原抗体对或双抗体对为例。
将5mL HCl(0.1mmol/mL)和5mL无水乙醇加入有OA包覆NaYF4@NaYF4:Nd40％/Yb10％的50mL离心管中，震荡。静置24h后，反应完成，可得到无配体的NaYF4@NaYF4:Nd40％/Yb10％，通过离心收集(10,500rpm，30min)。然后分散于5mL去离子水中。接下来，将10mL聚丙烯酸(PAA，1.0％)水溶液加入50mL烧杯中，接着向烧杯中逐滴加入无配体NaYF4@NaYF4:Nd40％/Yb10％纳米颗粒溶液。在室温搅拌30min后，再通过离心(10,500rpm，15min)收集已经被PAA修饰的，表面富含羧基的NaYF4@NaYF4:Nd40％/Yb10％。随后，用MES溶液(0.05M,PH＝6.0)洗涤三次，以去除体系中多余的PAA分子，然后再分散到5mL的MES溶液中。
取100μL上述新制的NaYF4@NaYF4:Nd40％/Yb10％-PAA溶液放入1.5mL离心管中，并使用MES缓冲液稀释至500μL。向其中加入40μL浓度为10mg/mL的EDC溶液，再向其中加入65μL浓度为10mg/mL的NHS溶液。置于摇盘上反应半小时，加快反应。把活化好的NaYF4@NaYF4:Nd40％/Yb10％-PAA通过离心收集(10,500rpm,15min)，用MES缓冲液洗涤三次，去除多余的EDC和NHS。把AbMOP与活化后的NaYF4@NaYF4:Nd40％/Yb10％-PAA混合在500μL的MES缓冲液中，摇晃混合物使其充分反应。2h后，在1.5mL离心管中加入含有2％BSA的甘氨酸缓冲液500μL，再反应30分钟。最后，通过离心收集(16,000rpm,15min)制备好的NaYF4@NaYF4:Nd40％/Yb10％-AbMOP，用甘氨酸缓冲液洗涤两次，最后将其分散在100μLTris缓冲液(100mM，pH＝7.4)中。
同时，NaYbF4-AgMOP、NaYF4@NaYF4:Nd40％/Yb10％-AbAdV1、NaYbF4-AbAdV2、NaYF4@NaYF4:Nd40％/Yb10％-Abβ-HCG1、NaYbF4-Abβ-HCG2、NaYF4@NaYF4:Nd40％/Yb10％-AbVD、NaYbF4-AgVD的制备过程与NaYF4@NaYF4:Nd40％/Yb10％-AbMOP的制备过程相同，只是分别将供体与受体和抗原与抗体进行替换。
(2)基于FRET原理构建的生物传感器，包括以下步骤：
将NaYF4@NaYF4:Nd40％/Yb10％-AbMOP和NaYbF4-AgMOP按照1：1的比例进行混合，得到本发明近红外FRET传感器的核心FRET体系。当仅有NaYF4@NaYF4:Nd40％/Yb10％-AbMOP时，在808nm激发下有明显Yb3+的950～1100nm的发射光，当有NaYbF4-AgMOP存在时，完成近红外FRET的构建，其Yb3+发射明显降低，如图3a所示。同时对构建的FRET体系拍摄透射电镜，如图3b所示，发现供受体紧密的结合在一起。同样地，将NaYF4@NaYF4:Nd40％/Yb10％-AbAdV1和NaYbF4-AbAdV2按照1：1的比例进行混合，得到本发明近红外FRET传感器的核心FRET体系。当仅有供受体材料aYF4@NaYF4:Nd40％/Yb10％-AbAdV1时，在808nm激发下有明显Yb3+的950～1100nm的发射光，当溶液中出现NaYbF4-AbAdV2时，完成近红外FRET的构建，其Yb3+发射明显降低。此外，NaYF4@NaYF4:Nd40％/Yb10％-Abβ-HCG1和NaYbF4-Abβ-HCG2、NaYF4@NaYF4:Nd40％/Yb10％-AbVD和NaYbF4-AgVD也具有同样的红外FRET现象。
实施例3本发明的近红外FRET的生物传感器用于MOP、VD、β-HCG和AdV检测
(1)新型近红外FRET传感器检测尿液中MOP的操作流程(如图4a所示)：
将160μL Tris-HCl缓冲液和10μL NaYF4@NaYF4:Nd40％/Yb10％-AbMOP(0.5mg/mL)溶液依次加入孔板中。然后将尿液样本20μL加入孔板中，充分震荡。仪器读数记为I0。在孔板中加入10μL NaYbF4-AgMOP(0.5mg/mL)溶液，37℃孵育5min，确保反应完成。仪器(多通路荧光分析仪)读数记为I，用【I/I0】表示测试结果。当【I/I0】大于该体系的检测限时，认为该临床血液样品中含有MOP，【I/I0】值越趋近于1说明样品中MOP含量越高。该仪器易于操作，适用于多种复杂环境的优势。
(2)新型近红外FRET传感器检测全血中维生素D(VD)的操作流程(如图4a所示)：
将160μL Tris-HCl缓冲液和10μL NaYF4@NaYF4:Nd40％/Yb10％-AbVD(0.5mg/mL)溶液依次加入孔板中。然后将全血样本20μL加入孔板中，充分震荡。仪器读数记为I0。在孔板中加入10μL NaYbF4-AgVD(0.5mg/mL)溶液，37℃孵育5min，确保反应完成。仪器(多通路荧光分析仪)读数记为I，用【I/I0】表示测试结果。当【I/I0】大于该体系的检测限时，认为该临床血液样品中含有VD，【I/I0】值越趋近于1说明样品中VD含量越高。该仪器易于操作，适用于多种复杂环境的优势。在复杂样品中均相检测生物标志物有着广阔的应用场景和锦绣的发展前景。
(3)新型近红外FRET传感器检测全血中人绒毛膜促性腺激素(β-HCG)的操作流程(如图4b所示)：
将160μL Tris-HCl缓冲液和10μL NaYF4@NaYF4:Nd40％/Yb10％-Abβ-HCG1(0.5mg/mL)溶液依次加入孔板中。然后将全血样本20μL加入孔板中，充分震荡。仪器读数记为I0。在孔板中加入10μL NaYbF4-Abβ-HCG2(0.5mg/mL)溶液，37℃孵育5min，确保反应完成。仪器读数记为I，用【I/I0】表示测试结果。当【I/I0】小于该体系的检测限时，认为该全血样品中含有β-HCG，【I/I0】值越趋近于1说明样品中β-HCG含量越少。该仪器易于操作，适用于多种复杂环境的优势。在复杂样品中均相检测生物标志物有着广阔的应用场景和锦绣的发展前景。
(4)新型近红外FRET传感器检测粪便中腺病毒(AdV)的操作流程(如图4b所示)：
将160μL Tris-HCl缓冲液和10μL NaYF4@NaYF4:Nd40％/Yb10％-AbAdV1(0.5mg/mL)溶液依次加入孔板中。然后将粪便稀释液样本20μL加入孔板中，充分震荡。仪器读数记为I0。在孔板中加入10μL NaYbF4-AbAdV2(0.5mg/mL)溶液，37℃孵育5min，确保反应完成。仪器读数记为I，用【I/I0】表示测试结果。当【I/I0】小于该体系的检测限时，认为该粪便样品中含有AdV，【I/I0】值越趋近于1说明样品中AdV含量越少。该仪器易于操作，适用于多种复杂环境的优势。在复杂样品中均相检测生物标志物有着广阔的应用场景和锦绣的发展前景。
这种新型的近红外FRET传感器具有简单易用、易操作和适用于多种复杂环境的优点，因此在检测生物标志物等方面有着广泛的应用前景。该传感器可以避免传统FRET传感器存在的光谱重叠和受背景干扰等问题，可以使检测结果更加可靠和准确。因此，该仪器的应用前景非常广阔，可以在药物研发、临床诊断、生物分析等领域发挥重要作用。值得注意的是，该近红外FRET传感器不仅可以用于MOP的检测，任何可以特异性阻断抗原抗体之间特异性结合或者能使两种抗体互不影响的同时与抗原共同作用的生命标志物均可用本传感器检测。
(5)新型近红外FRET传感器在尿液中MOP的检测限测定
用近红外FRET传感器检测含某一标准浓度(0、1、2.5、5、7.5、10、25、50、75、100、200ng/mL)的MOP标准品的尿液，所有数据点测量三次。为了获得近红外FRET传感器的标准曲线和检测限，首先要确定空白组的均值和标准差(SD)。利用MOP浓度与发光强度【I/I0】建立标准曲线，另外检测限(LoD)的计算为LoD＝空白均值+3×空白标准差。其结果如图5a所示，使用本发明构建的近红外FRET传感器在尿液中检MOP展示出良好的线性关系，为其他生物靶标的临床样本的检测应用中打下坚实的基础，而且表现出低的检测限，强有力地体现出均相检测的优越性。
(6)新型近红外FRET传感器在全血中VD的检测限测定
用近红外FRET传感器检测含某一标准浓度(0、0.68、1.36、2.04、2.73、3.40、6.80、13.60、20.40ng/mL)的VD的全血样本，所有数据点测量三次。为了获得近红外FRET传感器的标准曲线和检测限，首先要确定空白组的均值和标准差(SD)。利用VD浓度与发光强度【I/I0】建立标准曲线，另外检测限(LoD)的计算为LoD＝空白均值+3×空白标准差。其结果如图5b所示，使用本发明构建的近红外FRET传感器在全血中检测VD展示出良好的线性关系，为其他生物靶标的临床样本的检测应用中打下坚实的基础，而且表现出低的检测限，强有力地体现出均相检测的优越性。
(7)新型近红外FRET传感器在全血中β-HCG的检测限测定
用近红外FRET传感器检测含某一标准浓度(0、0.32、0.64、1.28、2.56、5.12、10、30、90、270、810U/L)的β-HCG的全血样本，所有数据点测量三次。为了获得近红外FRET传感器的标准曲线和检测限，首先要确定空白组的均值和标准差(SD)。利用β-HCG浓度与发光强度【I/I0】建立标准曲线，另外检测限(LoD)的计算为LoD＝空白均值+3×空白标准差。其结果如图5c所示，使用本发明构建的近红外FRET传感器在全血中检测β-HCG展示出良好的线性关系，为其他生物靶标的临床样本的检测应用中打下坚实的基础，而且表现出低的检测限，强有力地体现出均相检测的优越性。
(8)新型近红外FRET传感器在粪便提取液中AdV的检测限测定
用近红外FRET传感器检测含某一标准浓度(0、38.5、385、3.85x103、3.85x104、3.85x105、3.85x106、3.85x107、3.85x108、3.85x109Vp/mL)的AdV的粪便提取液，所有数据点测量三次。为了获得近红外FRET传感器的标准曲线和检测限，首先要确定空白组的均值和标准差(SD)。利用MOP浓度与发光强度【I/I0】建立标准曲线，另外检测限(LoD)的计算为LoD＝空白均值+3×空白标准差。其结果如图5d所示，使用本发明构建的近红外FRET传感器在粪便中检测AdV展示出良好的线性关系，为其他生物靶标的临床样本的检测应用中打下坚实的基础，而且表现出低的检测限，强有力地体现出均相检测的优越性。
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

Claims (7)

1.一种基于稀土离子掺杂纳米晶的近红外光FRET生物传感器，其特征在于，所述近红外光FRET生物传感器包括标记有抗体或抗原的探针1和标记有抗体或抗原的探针2，所述抗体和抗原为能发生特异性结合反应的抗原抗体对；所述探针1为Nd3+与Yb3+共掺杂的稀土氟化物纳米晶，具体为核壳结构的NaLnF4@NaLnF4:Ndx％/Yby％，其中x＝20-60，y＝5-20；所述探针2为Yb3+掺杂的稀土氟化物纳米晶，具体为NaLnF4:Ybx％，其中x＝100。
2.权利要求1所述的基于稀土离子掺杂纳米晶的近红外光FRET生物传感器的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、制备Nd3+与Yb3+共掺杂的稀土氟化物纳米晶：
S11、采用S11-1或S11-2的方法制备惰性核NaLnF4：
S11-1、将稀土醋酸盐、油酸和1-十八烯混合均匀，在惰性气氛下加热至第一温度，反应45±15min，冷却后加入溶解有氢氧化钠和氟化铵的甲醇溶液，在惰性气氛下加热至第二温度，待体系中的甲醇、氧气和水完全除去后，再次加热至第三温度，反应75±15min，冷却后离心收集产物，并用乙醇清洗1-3次，于分散剂中进行分散，得到的NaLnF4纳米粒子；
S11-2、将三氟醋酸稀土盐、三氟醋酸钠、油酸和1-十八烯混合均匀，在惰性气氛下加热至第一温度，反应20±15min，在惰性气氛下加热至第二温度，反应45±15min，冷却后离心收集产物，并用乙醇清洗1-3次，于分散剂中进行分散，得到的NaLnF4纳米粒子；
S12、采用S12-1或S12-2的方法制备核壳结构NaLnF4@NaLnF4:Ndx％/Yby％纳米晶：
S12-1、将稀土醋酸盐、油酸和1-十八烯混合均匀，在惰性气氛下加热至第一温度，反应45±15min，冷却后加入溶解有氢氧化钠和氟化铵的甲醇溶液与S11中合成的NaLnF4纳米粒子，在惰性气氛下加热至第二温度，待体系中的甲醇、氧气和水完全除去后，再次加热至第三温度，反应75±15min，冷却后离心收集产物，并用乙醇清洗1-3次，于分散剂中进行分散，得到NaLnF4@NaLnF4:Ndx％/Yby％纳米粒子；
S12-2、将三氟醋酸稀土盐、三氟醋酸钠、油酸和1-十八烯混合均匀，在惰性气氛下加热至第一温度，反应20±15min，冷却后加入溶解有氢氧化钠和氟化铵的甲醇溶液与S3中合成的NaLnF4纳米粒子，在惰性气氛下加热至第二温度，反应45±15min，冷却后离心收集产物，并用乙醇清洗1-3次，于分散剂中进行分散，得到所述NaLnF4@NaLnF4:Ndx％/Yby％纳米粒子；
S2、合成Yb3+掺杂的稀土氟化物纳米晶：
将稀土醋酸盐、油酸、1-十八烯和油胺混合均匀，在惰性气氛下加热至第一温度，反应45±15min，冷却后加入溶解有氢氧化钠和氟化铵的甲醇溶液，在惰性气氛下加热至第二温度，待体系中的甲醇、氧气和水完全除去后，再次加热至第三温度，反应45±15min，冷却后离心收集产物，并用乙醇清洗2-3次，于分散剂中进行分散，得到NaLnF4:Ybx％粒子；
S3、对步骤S1的Nd3+与Yb3+共掺杂的稀土氟化物纳米晶标记抗体或抗原，即得标记有抗体或抗原的探针1；
S4、对步骤S2的Yb3+掺杂的稀土氟化物纳米晶标记抗体或抗原，即得标记有抗体或抗原的探针2。
3.根据权利要求2所述的基于稀土离子掺杂纳米晶的近红外光FRET生物传感器的构建方法，其特征在于，S11-1中，稀土元素为钇，所述惰性气为氮气，第一温度为155±15℃，第二温度为120±20℃，第三温度为300±20℃，分散剂为环己烷，所述稀土醋酸盐、油酸和1-十八烯的用量为0.25～1.0mmol:5～10mL:10～20mL；S11-2中，稀土元素为钇，所述惰性气为氮气，第一温度为120±20℃，第二温度为300±20℃，分散剂为环己烷，所述稀土醋酸盐、油酸和1-十八烯的用量为0.25～1.0mmol:5～10mL:10～20mL。
4.根据权利要求2所述的基于稀土离子掺杂纳米晶的近红外光FRET生物传感器的构建方法，其特征在于，S12-1中，稀土元素为钇、钕或镱，所述惰性气为氮气，第一温度为155±15℃，第二温度为120±20℃，第三温度为300±20℃，分散剂为环己烷，所述稀土元素的醋酸盐、油酸和1-十八烯的用量为0.25～1.0mmol:5～10mL:10～20mL；S12-2中，稀土元素为钇、钕或镱，所述惰性气为氮气，第一温度为120±20℃，第二温度为300±20℃，分散剂为环己烷；所述稀土元素的醋酸盐、油酸和1-十八烯的用量为0.25～1.0mmol:5～10mL:10～20mL。
5.根据权利要求2所述的基于稀土离子掺杂纳米晶的近红外光FRET生物传感器的构建方法，其特征在于，S2中，稀土元素为镱，所述惰性气为氮气，第一温度为155±15℃，第二温度为120±20℃，第三温度为300±15℃，分散剂为环己烷，稀土醋酸盐、油酸、1-十八烯和油胺的比例为0.25～1.0mmol:1～5mL:2～10mL:1～5mL。
6.权利要求1所述的基于稀土离子掺杂纳米晶的近红外光FRET生物传感器在均相检测中的应用，其特征在于，检测的指标包括小分子类指标、蛋白类指标或病毒颗粒类指标。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，检测方法包括以下步骤：
S1、将缓冲液、标记有抗体或抗原的探针1和检测样本充分反应后，测定供体纳米晶的近红外光发射强度，记为I0；
S2、加入标记有抗体或抗原的探针2，适当孵育确保充分反应后，测定供体纳米晶的近红外光发射强度，记为I；
S3、含不同浓度靶标待测样本经近红外FRET传感器测定后获得【I/I0】，然后拟合不同浓度待测物的近红外FRET传感器的工作曲线；
S4、根据待测样本的【I/I0】与待测物浓度的关系，则可推断出待测样本中待测物的含量。
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