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CN118956606A - 一株产齐墩果酸的工业大麻内生真菌hsdmz07及其应用 - Google Patents

一株产齐墩果酸的工业大麻内生真菌hsdmz07及其应用 Download PDF

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Abstract

一株产齐墩果酸的工业大麻内生真菌HSDMZ07及其应用,涉及微生物领域,该工业大麻内生真菌HSDMZ07为镰孢菌属HSDMZ07,已在中国典型培养物保藏中心保藏,保藏地址为武汉市武汉大学,保藏日期为2024年6月17日,保藏编号为CCTCC NO:M20241243。该工业大麻内生真菌HSDMZ07能够发酵产齐墩果酸,并具有较好的抑细菌活性,对大肠杆菌、肺炎克雷伯菌和粪肠球菌均有一定的抑制作用。本发明用于抑菌及产齐墩果酸。

Description

一株产齐墩果酸的工业大麻内生真菌HSDMZ07及其应用
技术领域
本发明涉及微生物领域,具体涉及一株产齐墩果酸的工业大麻内生真菌HSDMZ07及其应用。
背景技术
齐墩果酸是一种天然五环三萜酸类化合物,因其具有显著的保肝作用,现已广泛应用于肝脏疾病的治疗,是重要的保肝药的生产原料。此外,齐墩果酸还有抗炎、抗氧化、降脂、调节血糖、抑菌、抗病毒、抗肿瘤药等作用。
齐墩果酸以游离体和配糖体存在于多种植物中,其生产方式主要以植物提取法为主,但植物原料中齐墩果酸含量较低,一般含量0.2%~2%,无法满足市场需求。与植物提取法相比,微生物发酵法在生产天然化合物方面有诸多优势,其生产周期短,不消耗植物原料。
发明内容
本发明是要解决现有齐墩果酸的植物提取法产量较低,无法满足市场需求的问题,提供一株产齐墩果酸的工业大麻内生真菌HSDMZ07及其应用。
本发明提供一株产齐墩果酸的工业大麻内生真菌HSDMZ07,它为镰孢菌属(Fusarium sp.)HSDMZ07,已在中国典型培养物保藏中心保藏,保藏地址为武汉市武汉大学,保藏日期为2024年6月17日,保藏编号为CCTCC NO:M 20241243。
本发明工业大麻内生真菌HSDMZ07的菌落中心呈黄色,菌丝密集,呈绒状,基质白色。
将本发明工业大麻内生真菌HSDMZ07的ITS rDNA序列在GenBank中进行Blast同源性比对,然后用MEGA 7软件对工业大麻内生真菌HSDMZ07序列同源性较高的菌株序列进行分析。工业大麻内生真菌HSDMZ07菌株序列与Fusariumincarnatum(OM955964)的相似性达到了100%,因此将HSDMZ07菌株鉴定为镰孢菌属(Fusariumsp.)。
本发明的工业大麻内生真菌HSDMZ07在发酵产齐墩果酸中的应用。
本发明的工业大麻内生真菌HSDMZ07在抑制细菌中的应用。
进一步的,所述细菌为大肠杆菌、肺炎克雷伯菌和粪肠球菌。
本发明的有益效果:
本发明在工业大麻中分离出一株内生真菌HSDMZ07,经鉴定为镰孢菌属(Fusariumsp.)。该菌株可以发酵产齐墩果酸,由于微生物发酵产量较大,副产物较少,污染少,生产周期短,产品分离相对简单,在工业化生产上有广阔应用前景。
本发明的工业大麻内生真菌HSDMZ07具有较好的抑细菌活性,对于大肠杆菌、肺炎克雷伯菌和粪肠球菌具有一定的抑制作用。
附图说明
图1为本发明工业大麻内生真菌HSDMZ07的菌落形态图;
图2为本发明工业大麻内生真菌HSDMZ07的菌丝形态图;
图3为本发明工业大麻内生真菌HSDMZ07的系统发育树;
图4为内生真菌HSDMZ07发酵液中次生代谢产物UPLC-QTOF-MS总离子流图;
图5为内生真菌HSDMZ07发酵液UPLC-QTOF-MS一级质谱图;
图6为内生真菌HSDMZ07发酵液UPLC-QTOF-MS二级质谱图;
图7为内生真菌HSDMZ07乙酸乙酯萃取部位HPLC图谱。
具体实施方式
下面对本发明的实施例做详细说明,以下实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施,给出了详细的实施方案和具体的操作过程,但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1:
本实施例的工业大麻内生真菌HSDMZ07为镰孢菌属(Fusarium sp.)HSDMZ07,已在中国典型培养物保藏中心保藏,保藏地址为武汉市武汉大学,保藏日期为2024年6月17日,保藏编号为CCTCC NO:M 20241243。
本实施例工业大麻内生真菌HSDMZ07的获取方法为:
取工业大麻(Cannabis sativa L.)叶(龙麻5号,采自黑龙江省农科院绥化分院科技创新农场),表面消毒,消毒程序:将种子在75%酒精中浸泡30s,无菌水洗,再置于次氯酸钠中漂洗5min,无菌水洗,接着用75%酒精浸泡30s,最后再用无菌水洗。
用无菌手术刀将消毒后的实验材料切开,切成边长5mm正方形小块,置于PDA培养基中,于28℃恒温培养5~7d。
取消毒程序最后一次水洗液,涂布接种于PDA培养基中。并将消毒后不切块的实验材料置于PDA培养基上,滚动一圈后取出,同内生真菌分离培养基共同培养,作为对照。
马铃薯固体培养基(PDA)制法:称取新鲜去皮的马铃薯块200g放置于沸水中,保持沸腾30min,过滤,向滤液中加入配方中葡萄糖20g、琼脂粉20g,待其完全溶解后,以水将培养基总体积补至1L,pH自然,分装、灭菌(121℃,0.1MPa,30min),放冷备用。
从工业大麻叶中分离得到内生真菌HSDMZ07,阴性对照平板和阴性对照液培养基内均无任何菌长出,多次重复均如此,从而证明所分到的菌是工业大麻内生真菌。
实施例2:工业大麻内生真菌HSDMZ07的鉴定
采用菌落及孢子形态学观察及ITS序列分析法进行菌株鉴定。
工业大麻内生真菌HSDMZ07的菌落形态图如图1所示,菌丝形态图如图2所示。工业大麻内生真菌HSDMZ07的菌落中心呈黄色,菌丝密集,呈绒状,基质白色。
将本发明工业大麻内生真菌HSDMZ07的ITS rDNA序列(549bp)在GenBank中进行Blast同源性比对,然后用MEGA 7软件构建工业大麻内生真菌HSDMZ07的系统发育树,如图3所示。HSDMZ07菌株序列与Fusariumincarnatum(OM955964)的相似性达到了100%,因此将HSDMZ07菌株鉴定为镰孢菌属(Fusarium sp.)。
工业大麻内生真菌HSDMZ07的ITS rDNA序列如下:
TCCGTAGGGTGAACCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCCTGTGAACATACCTATAC
GTTGCCTCGGCGGATCAGCCCGCGCCCCGTAACAAGGGACGGCCCGCCCGAGGACCCCTAAACTCTGTTTTTAGTGG
AACTTCTGAGTAAAACAAACAAATAAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGC
AGCAAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAG
TATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCTCAGCTTGGTGTTGGGACTCGCGGTAACCCG
CGTTCCCCAAATCGATTGGCGGTCACGTCGAGCTTCCATAGCGTAGTAATCATACACCTCGTTACTGGTAATCGTCG
CGGCCACGCCGTAAAACCCCAACTTCTGAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATC
AATAAGCCGGAGGAA。
实施例3:工业大麻内生真菌HSDMZ07发酵液次生代谢产物分析
1、供试品溶液的制备
取已活化内生真菌HSDMZ07,在无菌条件下挑取菌丝接种于50mL PDB培养基中,于28℃、120r/min条件下摇床振荡培养3d,制成1×107CFU/mL的种子液;将种子液以20%(v/v)的接种量转接至3L灭菌后的PDB培养基中,28℃、120r/min摇床培养14d,滤取发酵液,于50℃条件下减压浓缩,将浓缩后的发酵液以乙酸乙酯萃取3次(3×100mL),合并萃取液,50℃低温浓缩至干,用1mL甲醇溶解,作为供试品溶液,备用。
2、工业大麻叶提取液的制备
精确称取工业大麻叶5g,粉碎,各按1:50的料液比加入95%的乙醇,超声提取(50℃,3×250mL),过滤,合并提取液,50℃减压浓缩至100mL后,用乙酸乙酯萃取(3×100mL),得萃取液。合并乙酸乙酯萃取液,减压浓缩至干,1mL色谱甲醇溶解,备用。
3、对照品溶液的制备
精密称取齐墩果酸对照品0.5mg,置于1mL离心管中,加入1mL色谱甲醇溶解,制成对照品溶液备用。
取PDB培养液300mL于50℃条件下减压浓缩,将浓缩后的PDB培养液以乙酸乙酯萃取3次(3×100mL),合并萃取液,50℃低温浓缩至干,用1mL甲醇溶解后作为空白对照液,备用。
4、UPLC-QTOF-MS法分析HSDMZ07发酵液次生代谢产物
采用UPLC-QTOF-MS法,对供试品进行分析,分析条件如下:
液相条件:色谱柱为Waters BEH C18柱(2.1×100mm,1.7μm);柱温:35℃;进样量:10μL。
质谱条件:采用正离子喷雾电离模式(ESI),离子喷雾电压:5000V(正离子模式);温度:500℃;离子源气体压力:50psi;窗帘气流量:35L/min;去聚电位:80V;碰撞能量:35eV;碰撞能量扩散(CES):±15eV。质谱仪在全扫描TOF-MS模式下以100~1000的m/z范围和MS/MS(50~1000)模式操作。
根据高分辨质谱提供的精确相对分子质量和碎片离子信息,结合UPLC-MS/MS检测平台和自建数据库以及相关文献报道对HSDMZ07发酵液次生代谢产物进行分析。
5、HPLC法分析HSDMZ07发酵液次生代谢产物
色谱柱:Venusil XBP-C18柱(4.6mm×250mm,5μm,USA)流动相:甲醇-水-冰醋酸(90∶10∶0.2);流速:1mL·min-1;柱温:25℃;检测波长:245nm;进样量:10μL。
6、内生真菌HSDMZ07发酵液次生代谢产物分析结果
内生真菌HSDMZ07发酵液中次生代谢产物UPLC-QTOF-MS法分析结果如图4-图6所示。图4为HSDMZ07发酵液UPLC-QTOF-MS总离子流图,图5为HSDMZ07发酵液UPLC-QTOF-MS一级质谱图,图6为HSDMZ07发酵液UPLC-QTOF-MS二级质谱图。可以分析出,在内生真菌HSDMZ07发酵液中检测到正电离产生准分子离[M+1]+:m/z457.34,齐墩果酸分子量M:456.7,C30H48O3
在UPLC-QTOF-MS法分析结果基础上,采用HPLC分析内生真菌HSDMZ07发酵液,结果见图7,图7中A为HSDMZ07乙酸乙酯提取样品,B为齐墩果酸对照品,C为PDB空白对照。由图7可知,在工业大麻内生真菌HSDMZ07发酵液乙酸乙酯萃取部位中,存在与齐墩果酸对照品保留时间相同的色谱峰,且阴性(空白PDB培养基)无干扰,说明在乙酸乙酯萃取部位中存在齐墩果酸。
实施例4:内生真菌HSDMZ07抑菌活性分析
1、内生真菌HSDMZ07活化:取内生真菌HSDMZ07,于无菌条件下接种至含有PDA培养基的试面上,28℃恒温培养3d,备用。
2、内生真菌HSDMZ07发酵液制备:取已活化内生真菌HSDMZ07,在无菌条件下挑取菌丝接种于50mL PDB培养基中,于28℃、120r/min条件下摇床振荡培养3d,制成1×107CFU/mL的种子液;将种子液以20%(v/v)的接种量转接至3L灭菌后的PDB培养基中,28℃、120r/min摇床培养14d,滤取发酵液。
3、供试品溶液的制备:取内生真菌HSDMZ07发酵液于50℃条件下减压浓缩至50mL后,加甲醇50mL,超声提取3次,得提取液,减压浓缩至干,加甲醇10mL溶解后,作为供试品溶液备用。取适量链霉素和制霉素粉末,分别加入甲醇适量溶解,制成200μg/mL阳性对照液,备用。
4、含受试菌株平板的制备:
取已活化供试细菌:大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、金黄色葡萄球菌(StapHlococcus aureus)、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、单增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacterbaummanii)、粪肠球菌(Enterococcus facalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium),接种于NA试管斜面中,37℃培养1d;取已活化供试真菌白假丝酵母(Candida albicans),接种于PDA试管斜面中,28℃培养3d,备用。上述供试菌株购于黑龙江省微生物研究所。
分别取上述活化后的受试菌株,加入适量无菌水,震摇,使各菌株稀释为1×107CFU/mL的菌悬液,倒入各自相应的培养基中,并分装到放有牛津杯的无菌平板,待其凝固后,取出牛津杯,备用。
5、抑菌活性分析:
向上述制备好的含菌平板的两孔中精密加入150μL供试品溶液、阳性对照液、阴性对照液。将含有细菌的平板恒温培养(37℃,1d)后测量抑菌圈直径(n=3);将含有真菌的平板恒温培养(28℃,3d)后测量抑菌圈直径(n=3)。
内生真菌HSDMZ07的抑菌活性见表1。从表1结果可以看出,工业大麻内生真菌HSDMZ07对大肠杆菌、肺炎克雷伯菌和粪肠球菌均有一定的抑制作用。
表1工业大麻内生真菌HSDMZ07发酵液抑菌活性结果
表1中A:大肠杆菌;B:枯草芽孢杆菌;C:金黄色葡萄球菌;D:短小芽孢杆菌;E:铜绿假单孢菌;F:单增李斯特菌;G:肺炎克雷伯菌;H:鲍曼不动杆菌;I:屎肠球菌;J:粪肠球菌;K:白假丝酵母;Str:链霉素;Nys:制霉素。

Claims (4)

1.一株产齐墩果酸的工业大麻内生真菌HSDMZ07,其特征在于,该工业大麻内生真菌HSDMZ07为镰孢菌属(Fusarium sp.)HSDMZ07,已在中国典型培养物保藏中心保藏,保藏地址为武汉市武汉大学,保藏日期为2024年6月17日,保藏编号为CCTCC NO:M20241243。
2.如权利要求1所述的工业大麻内生真菌HSDMZ07在发酵产齐墩果酸中的应用。
3.如权利要求1所述的工业大麻内生真菌HSDMZ07在抑制细菌中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述细菌为大肠杆菌、肺炎克雷伯菌和粪肠球菌。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN118813419A (zh) * 2024-07-11 2024-10-22 哈尔滨师范大学 一株同时产3种黄酮成分的大麻内生真菌hsdm12及其应用
CN118813419B (zh) * 2024-07-11 2025-07-11 哈尔滨师范大学 一株同时产3种黄酮成分的大麻内生真菌hsdm12及其应用

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