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CN118914559A - 蛋白组合物及其在诊断领域的应用 - Google Patents

蛋白组合物及其在诊断领域的应用 Download PDF

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CN118914559A
CN118914559A CN202410912508.2A CN202410912508A CN118914559A CN 118914559 A CN118914559 A CN 118914559A CN 202410912508 A CN202410912508 A CN 202410912508A CN 118914559 A CN118914559 A CN 118914559A
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CN
China
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lung cancer
protein composition
ddx53
mmrn2
mknk1
Prior art date
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Pending
Application number
CN202410912508.2A
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温颖声
杨安力
季奥
伊格纳西奥·皮诺
胡少晖
李宇欣
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Jiaxing Xinyuan Biotechnology Co ltd
Nanjing Xinyuan Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Cdi Laboratory Co ltd
Jiaxing Xinyuan Biotechnology Co ltd
Nanjing Xinyuan Biotechnology Co ltd
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Abstract

本申请公开了蛋白组合物及其在诊断领域的应用，属于生物医药技术领域。该蛋白组合物包括本申请新筛选的抗原蛋白DDX53、MMRN2，以及抗原蛋白MKNK1、FGF12、PIP4K2C、NME3、CTAG1A、HYLS1、TIA1、SSBP4和ENO2中的任意一种或多种进行组合，将其组合并将其用于检测抗体并进行肺癌早期诊断，其敏感性为68～84％，特异性为90～100％，提高了肺癌早期诊断的敏感性和特异性。

Description

蛋白组合物及其在诊断领域的应用
本发明专利申请是针对申请号为202311526662.8的分案申请，原申请的申请日为：2023-11-15，发明创造名称为：蛋白组合物及其在诊断领域的应用。
技术领域
本申请属于生物医药技术领域，具体涉及蛋白组合物及其在诊断领域的应用。
背景技术
蛋白质是生命的物质基础，是构成细胞的基本有机物，是生命活动的主要承担者。在人体中，蛋白质种类多达上万种。蛋白质具有多种重要的生物学功能，包括结构功能、酶催化作用、激素调节作用、免疫功能、运输作用和储能作用等。鉴于蛋白质的多种生物学功能，自然界存在的或者人工合成的蛋白质可以作为生物标记物用于多种疾病的早期诊断、可以作为抗体进行多种疾病的治疗等。
早在上世纪60年代，Robert W.Baldwin就已经证实在癌症发展的早期，人体免疫系统可以产生自身抗体。由于自身抗体的产生是免疫系统对肿瘤相关抗原的体液免疫反应，因此血清中自身抗体的水平远比常规的抗原水平高。并且，由于抗原-抗体反应的高特异性和高敏感性，即使在血清中有大量白蛋白干扰的情况下，自身抗体也较其它标志物更易准确检测到。换言之，肿瘤自身抗体比相应肿瘤抗原更容易被检测到。因此，通过检测自身抗体进行肺癌早期诊断具有更加广阔的前景。
肺癌是我国及全球范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一。肺癌的预后与其发展阶段紧密相关，局限性肺癌五年存活率为53％，而在出现转移的情况下五年存活率仅为4％。因此肺癌的早期筛查与早期诊断已成为延长患者生存期、挽救患者生命的关键，肺癌的早期发现和及时防治能显著提高患者的存活率和生活质量。
在相关技术中，如Chapman等使用酶联免疫法比较了采用6个抗原蛋白(p53、NY-ESO-1、CAGE、GBU4-5、Annexin I和SOX2)和7个抗原蛋白(p53、NY-ESO-1、CAGE、GBU4-5、SOX2、HuD和MAGE A4)来检测肺癌患者和健康对照组血清中相应自身抗体的含量，结果显示采用6个自身抗体联合检测得到的敏感性和特异性分别为39％和89％，而采用7个自身抗体联合检测的敏感性和特异性分别为41％和91％。又如公开号为CN103869086A的中国发明专利记载了一种血清自身抗体检测试剂盒，该试剂盒包括选自p53、Annexin1、CAGE、NY-ESO-1、HuD、Cyclin D、PGP9.5、GBU4-5、MDM2、GAGE7、XAGE1b、SOX2、MAGE A1和MAGE A4等14种抗原蛋白中的五种或以上的组合的抗原蛋白，但是其发现GBU4-5、SOX2、HuD、Cyclin D、NY-ESO-1、Annexin1、MAGE A1和XAGE1b相对应的抗体在中国正常人和肺癌患者中几乎没有区别，不适于在中国人中用作早期或辅助诊断的生物标志物，这样的差距有可能是由于检测人种的不同造成的差异，并具体公开了12种组合及其对应的敏感性和特异性，包括4～7个抗原蛋白的组合，其敏感性为27.5％～62.5％，特异性为74.5％～92.7％。当选取4个抗原蛋白(p53、NY-ESO-1、P62、CAGE)时，其敏感性为27.5％，特异性为87.3％，因此并未采用4个抗原蛋白的技术方案。又如公开号为WO2018187228A1、WO2020069637A1和US20220003768A1的发明专利，记载了本申请人早期的研究成果，包括ETHE1、p53、CTAG1A、C1QTNF1、TEX264、CLDN2、NSG1和HRas 8种抗原蛋白中的3～5种抗原蛋白的组合，进一步利用IgA筛选了28种抗原蛋白与上述8种抗原蛋白组合，并对其中任意2～6种抗原蛋白的组合进行评估，公开了200种组合的结果，其中67种组合物辨别能力为高，67种为中等，其余为低。又如公开号为CN116482365A的中国发明专利记载了用于检测血清抗体的蛋白组合物及其应用，包括XAGE1A、RBPJ、CEACAM5、NSG1、TP53、DDHYLS1、NUDT14、PGK1、KRT19、MAGEC2和SULT2B1共计11个抗原蛋白，将其任意两种或多种组合，当组合蛋白的数量为2时，选用XAGE1A和CEACAM5两种蛋白效果最好(敏感性为45.45％，特异性为100％，平均值为72.73％)；当组合蛋白的数量为3时，选用XAGE1A、CEACAM5和RBPJ三种蛋白效果最好(敏感性为59.10％，特异性为94.74％，平均值为76.91％)；当选用全部11个蛋白时，其敏感性为86.36％，特异性为84.21％，平均值为85.29％。
由此可见，抗原蛋白的选择，包括抗原蛋白种类和抗原蛋白数量，显著影响了肺癌早期诊断的敏感性和特异性。是否有其余更加适用的抗原蛋白？新的抗原蛋白组合是否具有临床意义？新的抗原蛋白组合是否能够提高肺癌早期诊断的敏感性和特异性？随着我国肿瘤发病率的逐年攀升，对高敏感性的、高通量的、可推广使用的自身抗体的检测方法成为业界急需解决的一个问题。
发明内容
1.要解决的问题
本申请针对现有技术中基于肺癌自身抗体的肺癌早期诊断方法的敏感性和特异性需要进一步提高的问题，在前期研究的基础上，进一步筛选了肺癌相关抗原，并将筛选的肺癌相关抗原进行组合，并将其用于检测肺癌抗体，进一步用于肺癌的早期诊断。
2.技术方案
为了解决上述问题，本申请所采用的技术方案如下：
本申请提供了蛋白组合物在制备用于肺癌早期诊断产品中的应用，该产品包含蛋白组合物，该蛋白组合物包括抗原蛋白DDX53和MMRN2，还包括抗原蛋白MKNK1、FGF12、PIP4K2C、NME3、CTAG1A、HYLS1、TIA1、SSBP4和ENO2中的任意一种或多种，该诊断产品利用蛋白组合物检测血清中肺癌自身IgG抗体，从而用于肺癌早期诊断。
进一步地，上述蛋白组合物包括抗原蛋白DDX53和MMRN2，还包括抗原蛋白MKNK1、FGF12、PIP4K2C、NME3、CTAG1A、HYLS1、TIA1、SSBP4和ENO2中的任意一种。
进一步地，上述蛋白组合物包括抗原蛋白DDX53、MMRN2和MKNK1。
进一步地，上述蛋白组合物包括抗原蛋白DDX53、MMRN2和FGF12。
进一步地，上述蛋白组合物包括抗原蛋白DDX53、MMRN2和PIP4K2C。
进一步地，上述蛋白组合物包括抗原蛋白DDX53、MMRN2和NME3。
进一步地，上述蛋白组合物包括抗原蛋白DDX53、MMRN2和CTAG1A。
进一步地，上述蛋白组合物包括抗原蛋白DDX53、MMRN2和HYLS1。
进一步地，上述蛋白组合物包括抗原蛋白DDX53、MMRN2和TIA1。
进一步地，上述蛋白组合物包括抗原蛋白DDX53、MMRN2和SSBP4。
进一步地，上述蛋白组合物包括抗原蛋白DDX53、MMRN2和ENO2。
进一步地，上述蛋白组合物包括抗原蛋白DDX53、MMRN2和MKNK1，还包括抗原蛋白FGF12、PIP4K2C、NME3、CTAG1A、HYLS1、TIA1、SSBP4和ENO2中的任意一种或多种。
进一步地，上述蛋白组合物包括抗原蛋白DDX53、MMRN2和MKNK1，还包括抗原蛋白FGF12、PIP4K2C、NME3、CTAG1A、HYLS1、TIA1、SSBP4和ENO2中的任意一种。
进一步地，上述蛋白组合物包括抗原蛋白DDX53、MMRN2、MKNK1和FGF12。
进一步地，上述蛋白组合物包括抗原蛋白DDX53、MMRN2、MKNK1和CTAG1A。
进一步地，上述蛋白组合物包括抗原蛋白DDX53、MMRN2、MKNK1和HYLS1。
进一步地，上述蛋白组合物包括抗原蛋白DDX53、MMRN2、MKNK1和SSBP4。
进一步地，上述蛋白组合物包括抗原蛋白DDX53、MMRN2、MKNK1和TIA1。
进一步地，上述蛋白组合物包括抗原蛋白DDX53、MMRN2、MKNK1和PIP4K2C。
进一步地，上述蛋白组合物包括抗原蛋白DDX53、MMRN2、MKNK1和NME3。
进一步地，上述蛋白组合物包括抗原蛋白DDX53、MMRN2、MKNK1和ENO2。
进一步地，上述蛋白组合物包括抗原蛋白DDX53、MMRN2、MKNK1和FGF12，还包括抗原蛋白PIP4K2C、NME3、CTAG1A、HYLS1、TIA1、SSBP4和ENO2中的任意一种或多种。
进一步地，上述蛋白组合物包括抗原蛋白DDX53、MMRN2、MKNK1和FGF12，还包括抗原蛋白PIP4K2C、NME3、CTAG1A、HYLS1、TIA1、SSBP4和ENO2中的任意一种。
进一步地，上述蛋白组合物包括抗原蛋白DDX53、MMRN2、MKNK1、FGF12和HYLS1。
进一步地，上述蛋白组合物包括抗原蛋白DDX53、MMRN2、MKNK1、FGF12和CTAG1A。
进一步地，上述蛋白组合物包括抗原蛋白DDX53、MMRN2、MKNK1、FGF12和TIA1。
进一步地，上述蛋白组合物包括抗原蛋白DDX53、MMRN2、MKNK1、FGF12和SSBP4。
进一步地，上述蛋白组合物包括抗原蛋白DDX53、MMRN2、MKNK1、FGF12和NME3。
进一步地，上述蛋白组合物包括抗原蛋白DDX53、MMRN2、MKNK1、FGF12和PIP4K2C。
进一步地，上述蛋白组合物包括抗原蛋白DDX53、MMRN2、MKNK1、FGF12和ENO2。
进一步地，上述蛋白组合物包括抗原蛋白DDX53、MMRN2、MKNK1、FGF12和HYLS1，还包括抗原蛋白PIP4K2C、NME3、CTAG1A、TIA1、SSBP4和ENO2中的任意一种或多种。
进一步地，上述蛋白组合物包括抗原蛋白DDX53、MMRN2、MKNK1、FGF12和HYLS1，还包括抗原蛋白PIP4K2C、NME3、CTAG1A、TIA1、SSBP4和ENO2中的任意一种。
进一步地，上述蛋白组合物包括抗原蛋白DDX53、MMRN2、MKNK1、FGF12、HYLS1和CTAG1A。
进一步地，上述蛋白组合物包括抗原蛋白DDX53、MMRN2、MKNK1、FGF12、HYLS1和SSBP4。
进一步地，上述蛋白组合物包括抗原蛋白DDX53、MMRN2、MKNK1、FGF12、HYLS1和TIA1。
进一步地，上述蛋白组合物包括抗原蛋白DDX53、MMRN2、MKNK1、FGF12、HYLS1和NME3。
进一步地，上述蛋白组合物包括抗原蛋白DDX53、MMRN2、MKNK1、FGF12、HYLS1和PIP4K2C。
进一步地，上述蛋白组合物包括抗原蛋白DDX53、MMRN2、MKNK1、FGF12、HYLS1和ENO2。
进一步地，上述蛋白组合物包括抗原蛋白DDX53、MMRN2、MKNK1、FGF12、HYLS1和CTAG1A，还包括抗原蛋白PIP4K2C、NME3、TIA1、SSBP4和ENO2中的任意一种或多种。
进一步地，上述蛋白组合物包括抗原蛋白DDX53、MMRN2、MKNK1、FGF12、HYLS1和CTAG1A，还包括抗原蛋白PIP4K2C、NME3、TIA1、SSBP4和ENO2中的任意一种。
进一步地，上述蛋白组合物包括抗原蛋白DDX53、MMRN2、MKNK1、FGF12、HYLS1、CTAG1A和SSBP4。
进一步地，上述蛋白组合物包括抗原蛋白DDX53、MMRN2、MKNK1、FGF12、HYLS1、CTAG1A和TIA1。
进一步地，上述蛋白组合物包括抗原蛋白DDX53、MMRN2、MKNK1、FGF12、HYLS1、CTAG1A和NME3。
进一步地，上述蛋白组合物包括抗原蛋白DDX53、MMRN2、MKNK1、FGF12、HYLS1、CTAG1A和PIP4K2C。
进一步地，上述蛋白组合物包括抗原蛋白DDX53、MMRN2、MKNK1、FGF12、HYLS1、CTAG1A和ENO2。
进一步地，上述蛋白组合物包括抗原蛋白DDX53、MMRN2、MKNK1、FGF12、HYLS1、CTAG1A和SSBP4，还包括抗原蛋白PIP4K2C、NME3、TIA1和ENO2中的任意一种或多种。
进一步地，上述蛋白组合物包括抗原蛋白DDX53、MMRN2、MKNK1、FGF12、HYLS1、CTAG1A和SSBP4，还包括抗原蛋白PIP4K2C、NME3、TIA1和ENO2中的任意一种。
进一步地，上述蛋白组合物包括抗原蛋白DDX53、MMRN2、MKNK1、FGF12、HYLS1、CTAG1A、SSBP4和TIA1。
进一步地，上述蛋白组合物包括抗原蛋白DDX53、MMRN2、MKNK1、FGF12、HYLS1、CTAG1A、SSBP4和NME3。
进一步地，上述蛋白组合物包括抗原蛋白DDX53、MMRN2、MKNK1、FGF12、HYLS1、CTAG1A、SSBP4和PIP4K2C。
进一步地，上述蛋白组合物包括抗原蛋白DDX53、MMRN2、MKNK1、FGF12、HYLS1、CTAG1A、SSBP4和ENO2。
进一步地，上述蛋白组合物包括抗原蛋白DDX53、MMRN2、MKNK1、FGF12、HYLS1、CTAG1A、SSBP4和TIA1，还包括抗原蛋白PIP4K2C、NME3和ENO2中的任意一种或多种。
进一步地，上述蛋白组合物包括抗原蛋白DDX53、MMRN2、MKNK1、FGF12、HYLS1、CTAG1A、SSBP4和TIA1，还包括抗原蛋白PIP4K2C、NME3和ENO2中的任意一种。
进一步地，上述蛋白组合物包括抗原蛋白DDX53、MMRN2、MKNK1、FGF12、HYLS1、CTAG1A、SSBP4、TIA1和NME3。
进一步地，上述蛋白组合物包括抗原蛋白DDX53、MMRN2、MKNK1、FGF12、HYLS1、CTAG1A、SSBP4、TIA1和PIP4K2C。
进一步地，上述蛋白组合物包括抗原蛋白DDX53、MMRN2、MKNK1、FGF12、HYLS1、CTAG1A、SSBP4、TIA1和ENO2。
进一步地，上述蛋白组合物包括抗原蛋白DDX53、MMRN2、MKNK1、FGF12、HYLS1、CTAG1A、SSBP4、TIA1和NME3，还包括抗原蛋白PIP4K2C和/或ENO2。
进一步地，上述蛋白组合物包括抗原蛋白DDX53、MMRN2、MKNK1、FGF12、HYLS1、CTAG1A、SSBP4、TIA1、NME3和PIP4K2C。
进一步地，上述蛋白组合物包括抗原蛋白DDX53、MMRN2、MKNK1、FGF12、HYLS1、CTAG1A、SSBP4、TIA1、NME3和ENO2。
进一步地，上述蛋白组合物包括抗原蛋白DDX53、MMRN2、MKNK1、FGF12、HYLS1、CTAG1A、SSBP4、TIA1、NME3、PIP4K2C和ENO2。
进一步地，上述抗原蛋白DDX53是包括具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的多肽，或是包括具有与序列SEQ ID NO:1有至少80％同源性且具有相同或基本相同功能的多肽，或是具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸而形成的具有相同或基本相同功能的多肽，MSHWAPEWKRAEANPRDLGASWDVRGSRGSGWSGPFGHQGPRAAGSREPPLCFKIKNNMVGVVIGYSGSKIKDLQHSTNTKIQIINGESEAKVRIFGNREMKAKAKAAIETLIRKQESYNSESSVDNAASQTPIGRNLGRNDIVGEAEPLSNWDRIRAAVVECEKRKWADLPPVKKNFYIESKATSCMSEMQVINWRKENFNITCDDLKSGEKRLIPKPTCRFKDAFQQYPDLLKSIIRVGILKPTPIQSQAWPIILQGIDLIVVAQTGTGKTLSYLMPGFIHLDSQPISREQRNGPGMLVLTPTRELALHVEAECSKYSYKGLKSICIYGGRNRNGQIEDISKGVDIIIATPGRLNDLQMNNSVNLRSITYLVIDEADKMLDMEFEPQIRKILLDVRPRQTVMTSATWPDTVRQLALSYLKDPMIVYVGNLNLVAVNTVKQNIIVTTEKEKRALTQEFVENMSPNDKVIMFVSQKHIADDLSSDFNIQGISAESLHGNSEQSDQERAVEDFKSGNIKILITTDIVSRGLDLNDVTHVYNYDFPRNIDVYVHRVGYIGRTGKTGTSVTLITQRDSKMAGELIKILDRANQSVPEDLVVMAEQYKLNQQKRHRETRSREPGQRRKEFYFLS(SEQ ID NO:1)。
进一步地，上述抗原蛋白MMRN2是包括具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的多肽，或是包括具有与序列SEQ ID NO:2有至少80％同源性且具有相同或基本相同功能的多肽，或是具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸而形成的具有相同或基本相同功能的多肽，MILSLLFSLGGPLGWGLLGAWAQASSTSLSDLQSSRTPGVWKAEAEDTGKDPVGRNWCPYPMSKLVTLLALCKTEKFLIHSQQPCPQGAPDCQKVKVMYRMAHKPVYQVKQKVLTSLAWRCCPGYTGPNCEHHDSMAIPEPADPGDSHQEPQDGPVSFKPGHLAAVINEVEVQQEQQEHLLGDLQNDVHRVADSLPGLWKALPGNLTAAVMEANQTGHEFPDRSLEQVLLPHVDTFLQVHFSPIWRSFNQSLHSLTQAIRNLSLDVEANRQAISRVQDSAVARADFQELGAKFEAKVQENTQRVGQLRQDVEDRLHAQHFTLHRSISELQADVDTKLKRLHKAQEAPGTNGSLVLATPGAGARPEPDSLQARLGQLQRNLSELHMTTARREEELQYTLEDMRATLTRHVDEIKELYSESDETFDQISKVERQVEELQVNHTALRELRVILMEKSLIMEENKEEVERQLLELNLTLQHLQGGHADLIKYVKDCNCQKLYLDLDVIREGQRDATRALEETQVSLDERRQLDGSSLQALQNAVDAVSLAVDAHKAEGERARAATSRLRSQVQALDDEVGALKAAAAEARHEVRQLHSAFAALLEDALRHEAVLAALFGEEVLEEMSEQTPGPLPLSYEQIRVALQDAASGLQEQALGWDELAARVTALEQASEPPRPAEHLEPSHDAGREEAATTALAGLARELQSLSNDVKNVGRCCEAEAGAGAASLNASLDGLHNALFATQRSLEQHQRLFHSLFGNFQGLMEANVSLDLGKLQTMLSRKGKKQQKDLEAPRKRDKKEAEPLVDIRVTGPVPGALGAALWEAGSPVAFYASFSEGTAALQTVKFNTTYINIGSSYFPEHGYFRAPERGVYLFAVSVEFGPGPGTGQLVFGGHHRTPVCTTGQGSGSTATVFAMAELQKGERVWFELTQGSITKRSLSGTAFGGFLMFKT(SEQ IDNO:2)。
进一步地，上述抗原蛋白MKNK1是包括具有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的多肽，或是包括具有与序列SEQ ID NO:3有至少80％同源性且具有相同或基本相同功能的多肽，或是具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸而形成的具有相同或基本相同功能的多肽，MVSSQKLEKPIEMGSSEPLPIADGDRRRKKKRRGRATDSLPGKFEDMYKLTSELLGEGAYAKVQGAVSLQNGKEYAVKIIEKQAGHSRSRVFREVETLYQCQGNKNILELIEFFEDDTRFYLVFEKLQGGSILAHIQKQKHFNEREASRVVRDVAAALDFLHTKDKVSLCHLGWSAMAPSGLTAAPTSLGSSDPPTSASQVAGTTGIAHRDLKPENILCESPEKVSPVKICDFDLGSGMKLNNSCTPITTPELTTPCGSAEYMAPEVVEVFTDQATFYDKRCD LWSLGVVLYIMLSGYPPFVGHCGADCGWDRGEVCRVCQNKLFESIQEGKYEFPDKDWAHISSEAKDLISKLLVRDAKQRLSAAQVLQHPWVQGQAPEKGLPTPQVLQRNSSTMDLTLFAAEAIALNRQLSQHEENELAEEPEALADGLCSMKLSPPCKSRLARRRALAQAGRGEDRSPPTAL(SEQ ID NO:3)。
进一步地，上述抗原蛋白FGF12是包括具有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的多肽，或是包括具有与序列SEQ ID NO:4有至少80％同源性且具有相同或基本相同功能的多肽，或是具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸而形成的具有相同或基本相同功能的多肽，MESKEPQLKGIVTRLFSQQGYFLQMHPDGTIDGTKDENSDYTLFNLIPVGLRVVAIQGVKASLYVAMNGE GYLYSSDVFTPECKFKESVFENYYVIYSSTLYRQQESGRAWFLGLNKEGQIMKGNRVKKTKPSSHFVPKPI EVCMYREQSLHEIGEKQGRSRKSSGTPTMNGGKVVNQDST(SEQ ID NO:4)。
进一步地，上述抗原蛋白PIP4K2C是包括具有如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的多肽，或是包括具有与序列SEQ ID NO:5有至少80％同源性且具有相同或基本相同功能的多肽，或是具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸而形成的具有相同或基本相同功能的多肽，MASSSVPPATVSAATAGPGPGFGFASKTKKKHFVQQKVKVFRAADPLVGVFLWGVAHSINELSQVPPPVMLLPDDFKASSKIKVNNHLFHRENLPSHFKFKEYCPQVFRNLRDRFGIDDQDYLVSLTRNPPSESEGSDGRFLISYDRTLVIKEVSSEDIADMHSNLSNYHQYIVKCHGNTLLPQFLGMYRVSVDNEDSYMLVMRNMFSHRLPVHRKYDLKGSLVSREASDKEKVKELPTLRDMDFLNKNQKVYIGEEEKKIFLEKLKRDVEFLVQLKIMDYSLLLGIHDIIRGSEPEEEAPVREDESEVDGDCSLTGPPALVGSYGTSPEGIGGYIHSHRPLGPGEFESFIDVYAIRSAEGAPQKEVYFMGLIDILTQYDAKKKAAHAAKTVKHGAGAEISTVHPEQYAKRFLDFITNIFA(SEQ ID NO:5)。
进一步地，上述抗原蛋白NME3是包括具有如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的多肽，或是包括具有与序列SEQ ID NO:6有至少80％同源性且具有相同或基本相同功能的多肽，或是具有SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸而形成的具有相同或基本相同功能的多肽，MICLVLTIFANLFPAACTGAHERTFLAVKPDGVQRRLVGEIVRRFERKGFKLVALKLVQASEELLREHYAEL RERPFYGRLVKYMASGPVVAMVWQGLDVVRTSRALIGATNPADAPPGTIRGDFCIEVGKNLIHGSDSVES ARREIALWFRADELLCWEDSAGHWLYE(SEQ ID NO:6)。
进一步地，上述抗原蛋白CTAG1A是包括具有如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的多肽，或是包括具有与序列SEQ ID NO:7有至少80％同源性且具有相同或基本相同功能的多肽，或是具有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸而形成的具有相同或基本相同功能的多肽，MQAEGRGTGGSTGDADGPGGPGIPDGPGGNAGGPGEAGATGGRGPRGAGAARASGPGGGAPRGPHGG AASGLNGCCRCGARGPESRLLEFYLAMPFATPMEAELARRSLAQDAPPLPVPGVLLKEFTVSGNILTIRLT AADHRQLQLSISSCLQQLSLLMWITQCFLPVFLAQPPSGQRR(SEQ ID NO:7)。
进一步地，上述抗原蛋白HYLS1是包括具有如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的多肽，或是包括具有与序列SEQ ID NO:8有至少80％同源性且具有相同或基本相同功能的多肽，或是具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸而形成的具有相同或基本相同功能的多肽，MDPEERMLAAATAFTHIRAGQGEGDVRREAQSIQYDPYSKASVAPGKRPALPVQLQYPHVESNVPSETVSEASQRLRKPVMKRKVLRRKPDGEVLVTDESIISESESGTENDQDLWDLRQRLMNVQFQEDKESSFDVSQKFNLPHEYQGISQDQLICSLQREGMGSPAYEQDLIVASRPKSFILPKLDQLSRNRGKTDRVARYFEYKRDWDSIRLPGEDHRKELRWGVREQMLCRAEPQSKPQHIYVPNNYLVPTEKKRSALRWGVRCDLANGVIPRKLPFPLSPS(SEQ ID NO:8)。
进一步地，上述抗原蛋白TIA1是包括具有如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的多肽，或是包括具有与序列SEQ ID NO:9有至少80％同源性且具有相同或基本相同功能的多肽，或是具有SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸而形成的具有相同或基本相同功能的多肽，MEDEMPKTLYVGNLSRDVTEALILQLFSQIGPCKNCKMIMDTAGNDPYCFVEFHEHRHAAAALAAMNGRKIMGKEVKVNWATTPSSQKKDTSSSTVVSTQRSQDHFHVFVGDLSPEITTEDIKAAFAPFGRISDARVVKDMATGKSKGYGFVSFFNKWDANAIQQMGGQWLGGRQIRTNWATRKPPAPKSTYECRCIGEEKEMWNFGEKYARF(SEQ ID NO:9)。
进一步地，上述抗原蛋白SSBP4是包括具有如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的多肽，或是包括具有与序列SEQ ID NO:10有至少80％同源性且具有相同或基本相同功能的多肽，或是具有SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸而形成的具有相同或基本相同功能的多肽，MYAKGGKGSAVPSDSQAREKLALYVYEYLLHIGAQKSAQTFLSEIRWEKNITLGEPPGFLHSWWCVFWDLYCAAPDRREACEHSGEAKAFQDYSAAAAPSPVMGSMAPGDTMAAGSMAAGFFQGPPGSQPSPHNPNAPMMGPHGQPFMSPRFPGGPRPTLRMPSQPPAGLPGSQPLLPGAMEPSPRAQGHPSMGGPMQRVTPPRGMASVGPQSYGGGMRPPPNSLAGPGLPAMNMGPGVRGPWASPSGNSIPYSSSSPGSYTGPPGGGGPPGTPIMPSPGDSTNSSENMYTIMNPIGQGAGRANFPLGPGPEGPMAAMSAMEPHHVNGSLGSGDMDGLPKSSPGAVAGLSNAPGTPRDDGEMAAAGTFLHPFPSESYSPGMTMSV(SEQ ID NO:10)。
进一步地，上述抗原蛋白ENO2是包括具有如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的多肽，或是包括具有与序列SEQ ID NO:11有至少80％同源性且具有相同或基本相同功能的多肽，或是具有SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸而形成的具有相同或基本相同功能的多肽，MSIEKIWAREILDSRGNPTVEVDLYTAKGLFRAAVPSGASTGIYEALELRDGDKQRYLGKGVLKAVDHINSTIAPALISSGLSVVEQEKLDNLMLELDGTENKSKFGANAILGVSLAVCKAGAAERELPLYRHIAQLAGNSDLILPVPAFNVINGGSHAGNKLAMQEFMILPVGAESFRDAMRLGAEVYHTLKGVIKDKYGKDATNVGDEGGFAPNILENSEALELVKEAIDKAGYTEKIVIGMDVAASEFYRDGKYDLDFKSPTDPSRYITGDQLGALYQDFVRDYPVVSIEDPFDQDDWAAWSKFTANVGIQIVGDDLTVTNPKRIERAVEEKACNCLLLKVNQIGSVTEAIQACKLAQENGWGVMVSHRSGETEDTFIADLVVGLCTGQIKTGAPCRSERLAKYNQLMRIEEELGDEARFAGHNFRNPSVL(SEQ ID NO:11)。
进一步地，上述至少80％同源性包括具有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性。
进一步地，上述抗原蛋白表达于酵母细胞中，并经过纯化获得。
本申请还提供了上述抗原蛋白的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)采用Gateway高通量克隆技术，将抗原蛋白的全长cDNA克隆到酵母表达载体pEGH-A中，构建GST融合蛋白的酵母表达质粒；
(2)将酵母表达质粒转化到大肠杆菌细胞中，进行质粒扩增和纯化；对纯化的质粒进行酶切和DNA测序验证，选取正确的质粒转化到酵母细胞中；
(3)挑取转化好的酵母克隆，接种于SC-Ura/Glucose液体培养基中，30℃振荡培养20～24小时；转接至SC-Ura/Raffinose(棉子糖)液体培养基中，30℃振荡培养过夜；第二天测OD600吸光度值大于1.0时，加入半乳糖至终浓度为2％，继续振荡培养过夜；离心收集酵母细胞，用无菌水洗2次；
(4)加入裂解液和镍珠，振荡破碎细胞后，离心回收上清；在上清中加入Glutathione Sepharose 4B beads，混匀，4℃摇动1小时；离心收集beads，用洗液I和洗液II各清洗3次；加入洗脱液，短暂震荡将beads重悬，4℃摇动1小时；离心，取上清，即获得抗原蛋白。
进一步地，上述抗原蛋白的制备方法中，裂解液的成分包括：50mM Tris,pH 7.5，100mM NaCl，1mMEGTA，10％ Glycerol，0.1％ TritonX-100，0.1％beta-mercaptoethanol(BME)，1mM PMSF(200mM in isopropanol)，50μM LLnL(50mM in DMSO)，1μM MG-132(50mMin DMSO)，Roche Protease inhibitor tablets(without EDTA)1in 50ml。
进一步地，上述抗原蛋白的制备方法中，洗液I成分包括：50mM Tris,pH 7.5，500mM NaCl，1mM EGTA，10％ Glycerol，0.1％ TritonX-100，0.1％beta-mercaptoethanol(BME)，1mM PMSF。
进一步地，上述抗原蛋白的制备方法中，洗液II成分包括：50mM HEPES pH 7.5，100mM NaCl，1mM EGTA，10％ Glycerol，0.1％beta-mercaptoethanol(BME)，1mM PMSF。
进一步地，上述抗原蛋白的制备方法中，洗脱液成分包括：50mM HEPES pH 8.0，100mM NaCl，30％Glycerol，40mM Glutathione(Reduced form)，0.03％ TritonX-100。
本申请还提供了一种固相载体，该载体包被有上述任一所述的蛋白组合物。
本申请还提供了上述蛋白组合物在制备用于肺癌早期诊断试剂盒中的应用，该试剂盒包含上述任一项的蛋白组合物，用于检测受试者血清中肺癌自身IgG抗体，从而用于肺癌早期诊断。
本申请还提供了一种用于肺癌早期诊断的试剂盒，该试剂盒包含上述任一的蛋白组合物，该试剂盒可以利用蛋白组合物检测受试者血清中肺癌自身IgG抗体，从而用于肺癌早期诊断。
进一步地，上述试剂盒所用的信号检测方法包括可见光显色法、化学发光法、荧光发光法。
进一步地，上述试剂盒还包括显色剂、血清稀释缓冲液、洗液和终止液。
本申请还提供了上述一种用于肺癌早期诊断的试剂盒在肺癌早期诊断中的应用。
进一步地，上述应用包括如下步骤：
S1：获取受试者血清样本；
S2：使用试剂盒检测受试者血清样本中自身抗体的表达水平；
S3：将检测的血清样本中自身抗体的表达水平与预设值比较，如大于预设值，则判断患有肺癌。
本申请还提供了一种用于肺癌早期诊断的设备，该设备包括：
样本获取模块，用于获取受试者血清样本；
样本检测模块，包括上述任一用于肺癌早期诊断的试剂盒，用于检测受试者血清样本中自身抗体的表达水平；
数据处理及结果输出模块：将样本检测模块检测的受试者血清样本中自身抗体的表达水平与预设值比较，大于预设值则输出患有肺癌的结果，其他则输出未患肺癌的结果。
3.有益效果
本申请与现有技术相比，其有益效果在于：
本申请提供的蛋白组合物及其在诊断领域的应用，其中抗原蛋白其中抗原蛋白DDX53、MMRN2、MKNK1、FGF12、NME3、HYLS1、TIA1、和ENO2均为本申请新筛选的抗原蛋白，其中DDX53和MMRN2两个抗原蛋白的组合，用于检测抗体并进行肺癌早期诊断，其敏感性为58％，特异性为100％，能以较少的抗原蛋白达到相似或更优的效果。与抗原蛋白MKNK1、FGF12、PIP4K2C、NME3、CTAG1A、HYLS1、TIA1、SSBP4和ENO2中的任意一种或多种组合，其敏感性与特异性的平均值(Discriminative ability)为79％～88％，提高了肺癌早期诊断的敏感性和特异性。
附图说明
图1是HuProt芯片代表性扫描图像。
图2是抗原蛋白DDX53在芯片上的反应信号，左侧为肺癌样品，右侧为健康样品。
图3是抗原蛋白CTAG1A的SDA-PAGE凝胶电泳和考马斯亮蓝染色结果。
图4-6是各抗原蛋白在在100例受试者样本的OD值分布。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本申请进一步进行描述。
需要说明的是，本说明书中所引用的如“上”、“下”、“左”、“右”、“中间”等用语，亦仅为便于叙述的明了，而非用以限定可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容下，当亦视为本申请可实施的范畴。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同；本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
如本文所使用，术语“约”用于提供与给定术语、度量或值相关联的灵活性和不精确性。本领域技术人员可以容易地确定具体变量的灵活性程度。
如本文所使用，术语“......中的至少一个”旨在与“......中的一个或多个”同义。例如，“A、B和C中的至少一个”明确包括仅A、仅B、仅C还包括它们各自的组合。
浓度、量和其他数值数据可以在本文中以范围格式呈现。应当理解，这样的范围格式仅是为了方便和简洁而使用，并且应当灵活地解释为不仅包括明确叙述为范围极限的数值，而且还包括涵盖在所述范围内的所有单独的数值或子范围，就如同每个数值和子范围都被明确叙述一样。例如，约1至约4.5的数值范围应当被解释为不仅包括明确叙述的1至约4.5的极限值，而且还包括单独的数字(诸如2、3、4)和子范围(诸如1至3、2至4等)。相同的原理适用于仅叙述一个数值的范围，诸如“小于约4.5”，应当将其解释为包括所有上述的值和范围。此外，无论所描述的范围或特征的广度如何，都应当适用这种解释。
实施例1
本实施例提供肺癌相关抗原的筛选，具体包括如下步骤：
从80名肺癌患者和20名健康个体中收集的100份血清样本分别在HuProt人类蛋白质组芯片上进行了分析。HuProt芯片由CDI Laboratories,Inc.提供。每张HuProt v3.0芯片由20,240种人类全长蛋白质组成，约覆盖人类蛋白质组的80％。肺癌组和健康组在年龄、性别或吸烟史构成上没有任何显著差异。
HuProt芯片首先在室温下与封闭缓冲液(含0.1％(v/v)Tween 20和3％ BSA的PBS)中孵育1小时，然后加入1:1,000稀释的血清样品并在室温孵育1小时。用1×TBST轻轻摇动洗涤3次，每次10分钟。将芯片与3毫升1,000倍稀释的Alexa647标记的山羊抗人IgG抗体(JacksonImmuno，美国)室温下避光孵育1小时。随后，将HuProt芯片用1×TBST洗涤3次，然后用双蒸水冲洗3次。将HuProt芯片甩干，用Genepix 4000B芯片扫描仪(MolecularDevices，美国)扫描，其扫描结果如图1所示，并使用GenePix Pro 6.0软件获取芯片上的抗体信号。
为选择候选抗原蛋白，提取HuProt芯片上给定蛋白质点处的前景信号值(Fij)的中值进行分析。由于每种蛋白质在芯片上有两个重复点，因此取每种蛋白质的Fij的平均值为其信号强度Fp。对100张HuProt芯片上的全部Fp进行分位数归一化，然后进行t检验以鉴定肺癌组和健康组之间有显著差异的抗原蛋白，选择标准为t检验的p值小于0.05，并且肺癌组的平均Fp高于健康组的1.5倍以上。以此方法鉴定出抗原蛋白DDX53、MMRN2、MKNK1、FGF12、NME3、HYLS1、TIA1、和ENO2，其在芯片上的ID如表1所示。抗原蛋白DDX53在芯片上的反应信号如图2所示，左侧为肺癌样品，右侧为健康样品。
此外，发明人还综合了前期的研究，选择了抗原蛋白PIP4K2C、SSBP4和CTAG1A作为肺癌相关抗原蛋白，其中抗原蛋白PIP4K2C、SSBP4、CTAG1A选自69份肺癌样品和30份对照样品在HuProt芯片上的反应结果，选择标准为对肺癌样品的诊断特异性大于89％，敏感性与特异性的平均值(Discriminative ability)大于53％(详见US20220003768A1)。
表1抗原蛋白在芯片上的ID
Clone Id 抗原蛋白
JHU16271 DDX53
JHU16011 MMRN2
JHU00052 MKNK1
JHU00314 FGF12
JHU00059 NME3
JHU01186 HYLS1
JHU01234 TIA1
JHU00604 ENO2
JHU00151 PIP4K2C
JHU06511 SSBP4
JHU17795 CTAG1A
实施例2
本实施例提供实施例1中肺癌相关抗原蛋白的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)采用Gateway高通量克隆技术，将抗原蛋白的全长cDNA克隆到酵母表达载体pEGH-A中，构建GST融合蛋白的酵母表达质粒；
(2)将酵母表达质粒转化到大肠杆菌细胞中，进行质粒扩增和纯化；对纯化的质粒进行酶切和DNA测序验证，选取正确的质粒转化到酵母细胞中；
(3)挑取转化好的酵母克隆，接种于5毫升SC-Ura/Glucose液体培养基中，30℃振荡培养20～24小时；转接1毫升至300毫升SC-Ura/Raffinose(棉子糖)液体培养基中，30℃振荡培养过夜；第二天测OD600吸光度值大于1.0时，加入半乳糖至终浓度为2％，继续振荡培养过夜；离心收集酵母细胞，用无菌水洗2次；
(4)加入裂解液和镍珠，振荡破碎细胞后，离心回收上清；在上清中加入Glutathione Sepharose 4B beads，混匀，4℃摇动1小时；离心收集beads，用洗液I和洗液II各清洗3次；加入洗脱液，短暂震荡将beads重悬，4℃摇动1小时；离心，取上清，分装10微升，其余冻存于-80℃冰箱保存；其中，裂解液的成分包括：50mM Tris,pH 7.5，100mM NaCl，1mMEGTA，10％ Glycerol，0.1％ TritonX-100，0.1％beta-mercaptoethanol(BME)，1mMPMSF(200mM in isopropanol)，50μM LLnL(50mM in DMSO)，1μM MG-132(50mM in DMSO)，Roche Protease inhibitor tablets(without EDTA)1in 50ml；洗液I成分包括：50mMTris,pH 7.5，500mM NaCl，1mM EGTA，10％ Glycerol，0.1％ TritonX-100，0.1％beta-mercaptoethanol(BME)，1mM PMSF；洗液II成分包括：50mM HEPES pH 7.5，100mM NaCl，1mMEGTA，10％ Glycerol，0.1％beta-mercaptoethanol(BME)，1mM PMSF；洗脱液成分包括：50mM HEPES pH 8.0，100mM NaCl，30％ Glycerol，40mM Glutathione(Reduced form)，0.03％ TritonX-100。
(5)对分装的10微升蛋白进行SDA-PAGE凝胶电泳和考马斯亮蓝染色，检测目标蛋白的分子量大小、浓度和纯度。
以抗原蛋白CTAG1A为例，图3为SDA-PAGE凝胶电泳和考马斯亮蓝染色结果(左侧为分子量标尺)，其GST融合蛋白的分子量约为48kD，浓度约为1毫克/毫升，纯度约为95％。利用相同的方法，制备实施例1中的其余蛋白。
实施例3
本实施例提供实施例1中筛选的肺癌相关抗原在肺癌自身抗体检测的应用，包括如下步骤：
S1：获取受试者血清样本，受试者样本来自中山大学附属肿瘤医院，其中健康样本20例(HC1-HC20)，肺癌患者80例(LC1-LC80)；
S2：使用间接ELISA方法检测自身抗体，包括使用ELISA板包被0.1μg的肺癌相关抗原，封闭后加入100倍稀释的受试者血清样本，使用HRP标记抗人IgG作为二抗，清洗、显色后终止反应，并立即用酶标仪检测。具体包括：
(1)使用ELISA包被液稀释抗原至1μg/mL并加100μL包被液于酶标板上，37℃，1h，其中包被液为10mM PBS(PH＝7.4)；
(2)清洗：Elisa清洗液加满酶标板，甩干，重复3次，其中清洗液包括：10mM PBS(PH＝7.4)，4％Tween-20；
(3)封闭：Elisa封闭液200μl/孔，4℃，过夜，其中封闭液包括：10mM PBS(PH＝7.4)，5％BSA，4％Tween-20；
(4)清洗：Elisa清洗液加满酶标板，甩干，重复5次；
(5)添加血清样品：每板预留两个空白对照孔作为本底，其余94孔可检测47份样品，每个样品做二个重复孔；每孔加入100μL稀释100倍的血清样本，37℃，30min，其中样本稀释液包括：10mM PBS(PH＝7.4)，5％BSA；
(6)清洗：Elisa清洗液加满酶标板，甩干，重复5次；
(7)二抗：用Elisa封闭液稀释HRP标记抗人IgG二抗；每孔加入100μL，37℃，30min；
(8)清洗：Elisa清洗液加满酶标板，甩干，重复5次；
(9)显色：显色液A和显色液B1:1混合，现配先用；每孔加入100μL，37℃，5min；
(10)终止：终止液50μl/孔，终止后立刻用酶标仪读数。
结果分析：
100例受试者样本的OD值如图4-6所示，其中HC代表正常人样本，LC代表患者样本，从图4中可以看出，11种抗原蛋白检测到的正常人样本和患者样本体内的肺癌自身抗体存在表达水平的差异。
以正常人样本中最大值或第二高值为CUT-OFF值，当检测的OD值大于CUT-OFF值时，则判断受试者患有肺癌。将上述抗原蛋白进行组合，其不同组合的敏感性及特异性如表2所示。
表2
本申请中，选用4个抗原蛋白(DDX53、MMRN2、FGF12和MKNK1)时，其敏感性为73％，已经高于公开号为CN116482365A的中国发明专利中选用8个蛋白时的敏感性(72.7％)，选用本申请的8个抗原蛋白(DDX53、MMRN2、TIA1、HYLS1、FGF12、MKNK1、SSBP4和CTAG1A)时，其敏感性为81％，提高了11.42％。由此可见，本申请中的蛋白组合物具有更高的敏感性和特异性，有利于提高肺癌早期诊断的准确性。

Claims (5)

1.蛋白组合物在制备用于肺癌早期诊断产品中的应用，其特征在于，所述产品包含蛋白组合物，所述蛋白组合物包括抗原蛋白DDX53、MMRN2，还包括抗原蛋白MKNK1、FGF12、NME3、TIA1和ENO2中的任意一种或多种；所述诊断产品利用所述蛋白组合物检测血清中肺癌自身IgG抗体，从而用于肺癌早期诊断。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述蛋白组合物还包括抗原蛋白PIP4K2C、CTAG1A、HYLS1和SSBP4中的任意一种、两种或三种。
3.蛋白组合物在制备用于肺癌早期诊断试剂盒中的应用，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1或2中任一所述蛋白组合物，所述试剂盒利用蛋白组合物检测受试者血清中肺癌自身IgG抗体，从而用于肺癌早期诊断。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：
S1：获取受试者血清样本；
S2：使用试剂盒检测受试者血清样本中肺癌自身IgG抗体的表达水平；
S3：将检测的血清样本中肺癌自身IgG抗体的表达水平与预设值比较，如大于预设值，则判断患有肺癌。
5.一种用于肺癌早期诊断的设备，其特征在于，所述设备包括：
样本获取模块，用于获取受试者血清样本；
样本检测模块，包括权利要求3中所述的用于肺癌早期诊断试剂盒，用于检测受试者血清样本中肺癌自身IgG抗体的表达水平；
数据处理及结果输出模块：将样本检测模块检测的受试者血清样本中肺癌自身IgG抗体的表达水平与预设值比较，大于预设值则输出患有肺癌的结果，其他则输出未患肺癌的结果。
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