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CN118903442A - 基于PP7 RNA茎环结构的高效VLP载体及其用于递送mRNA - Google Patents

基于PP7 RNA茎环结构的高效VLP载体及其用于递送mRNA Download PDF

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CN118903442A
CN118903442A CN202410971896.1A CN202410971896A CN118903442A CN 118903442 A CN118903442 A CN 118903442A CN 202410971896 A CN202410971896 A CN 202410971896A CN 118903442 A CN118903442 A CN 118903442A
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刘杨
王海峰
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Shanghai Bailian Biomedical Technology Co ltd
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Abstract

本发明属于基因工程领域，具体涉及基于PP7RNA茎环结构的高效VLP载体及其用于递送mRNA。本发明将Cas9蛋白mRNA和茎环结构PP7RNA融合后，通过PP7RNA与VLP内核中的PCP特异性结合，将Cas9蛋白mRNA导入VLP内核；同时将针对特定基因的gRNA克隆至慢病毒穿梭质粒，最终组装出携带有Cas9mRNA和gRNA的类似慢病毒结构的VLP。VLP将Cas9mRNA和gRNA递送至靶细胞的胞质中，通过翻译cas9蛋白，在靶细胞内发挥出CRISPR‑Cas9系统的“瞬时”基因编辑效果。

Description

基于PP7 RNA茎环结构的高效VLP载体及其用于递送mRNA
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及基于PP7 RNA茎环结构的高效VLP载体及其用于递送mRNA。
背景技术
VLP(virus like particle)技术来源于慢病毒系统，可利用病毒的高亲嗜性特性实现有效的细胞内递送，递送对象可为核酸、蛋白质或者核糖核蛋白(RNP)等。但是病毒在递送核酸时，多数以DNA形式递送，且慢病毒所递送的DNA存在基因组随机插入的情况，因此在递送CRISPR/Cas9系统时，Cas9蛋白基因在体内存在时间较久，持续翻译成Cas9蛋白，会导致较大机率的“脱靶”效应(与原设计的基因剪切效应无关的基因剪切)。在实际临床应用中，可将Cas9以mRNA或蛋白的形式瞬时递送到人体中，以达到治疗目的同时大幅降低脱靶效应。
mRNA递送对于疫苗开发、基因治疗等领域至关重要，在生物医学领域具有广泛的应用前景，但其在实际应用中仍面临一些限制：(1)mRNA的稳定性问题，mRNA是一种非常不稳定的分子，容易被细胞内的核酸酶降解。(2)递送载体的选择，选择合适的递送载体对于mRNA递送至关重要。目前常用的递送载体包括脂质纳米粒子(LNPs)、聚合物纳米粒子等。这些载体需要具备良好的生物相容性、低免疫原性和高效的递送效率。然而，现有的递送载体在这些方面仍存在不足，如LNPs可能引起免疫反应，聚合物纳米粒子可能难以穿透细胞膜等。(3)靶向递送，mRNA递送需要实现精准靶向，即将mRNA递送到特定的细胞或组织中。然而，目前的递送系统往往难以实现这一目标，导致mRNA在递送过程中可能被非靶细胞摄取，降低治疗效果并增加副作用风险。因此，为了在体内发挥作用，mRNA需要安全、有效和稳定的递送系统，以保护mRNA免受降解，并允许其被细胞摄取以及在细胞内释放。同时，其安全性、有效性和递送效率等方面的挑战也需要进一步研究和解决。
PP7噬菌体衣壳蛋白(PP7 coat protein,PCP)是噬菌体PP7的重要组成部分，它在噬菌体的结构和功能中扮演着关键角色，具有保护核酸、参与感染过程、作为展示平台等多种功能。PCP是一种小型的蛋白质，能够特异性地识别并结合某些茎环RNA分子(PP7 RNA)。
现有技术中并未公开基于PP7 RNA茎环结构的高效VLP载体及其用于递送mRNA的研究。
发明内容
为了解决上述问题，本发明将噬菌体衣壳蛋白和茎环结构进行组合，获得特异性结合和递送效率很高的PCP-PP7 RNA组合，提高VLP载体的mRNA递送效率和CRISPR-Cas9编辑效率。
一方面，本发明提供了PP7 RNA茎环结构在制备递送RNA中的用途，所述的用途包括但不限于：
(1)在实现基因编辑和基因治疗药物中的用途；
(2)在携带表达肿瘤抗原和病毒抗原的RNA用于制备疫苗中的用途；
(3)在表达细胞重编程因子用于制造多能干细胞中的用途；
(4)在表达细胞重编程因子用于改造细胞功能中的用途；
(5)在递送嵌合抗原受体RNA用于制备细胞免疫治疗药物中的用途。
具体地，所述的RNA包括但不限于：mRNA、gRNA、siRNA、miRNA、ASO、rRNA或多种非编码RNA。
进一步具体地，所述的RNA可以是mRNA或gRNA。
优选地，所述的RNA可以是mRNA。
具体地，所述的PP7 RNA茎环结构的数量为5-8。
优选地，所述的PP7 RNA茎环结构的数量为6-7。
进一步优选地，所述的PP7 RNA茎环结构的数量为6。
又一方面，本发明提供了一种慢病毒样颗粒，所述的慢病毒样颗粒包括PP7RNA茎环结构。
具体地，所述的慢病毒样颗粒的包装质粒可以包括pCMV-Cas9-PP7 RNA质粒、pLV-egfp-U3-sp.gRNA质粒、PMDlg/pRRE-D64V、PCP-PH-Gag-Pol-D64V、PMD.2G和pRSV-REV；
所述的pCMV-Cas9-PP7 RNA质粒上PP7 RNA的数量可以是5-8；
所述的pLV-egfp-U3-sp.gRNA质粒上的gRNA序列为：SEQ ID NO.3；
所述的PMDlg/pRRE-D64V质粒pol区域的Integrase基因的64位氨基酸D突变为V；
所述的PCP-PH-Gag-Pol-D64V质粒上PCP-Gag-Pol基因序列为SEQ ID NO.2。
优选地，所述的PP7 RNA的数量可以是6-7。
进一步优选地，所述的PP7 RNA的数量为6。
具体地，所述的pCMV-Cas9-PP7 RNA质粒上Cas9-6×PP7 RNA基因序列SEQ IDNO.1。
又一方面，本发明提供了一种慢病毒样颗粒的制备方法，所述的制备方法包括以下步骤：
S1、质粒构建；
S2、转染和感染细胞；
S3、去除残留质粒；
S4、VLP浓缩。
具体地，所述的质粒包括pCMV-Cas9-PP7 RNA质粒、pLV-egfp-U3-sp.gRNA质粒、PMDlg/pRRE-D64V、PCP-PH-Gag-Pol-D64V、PMD.2G和pRSV-REV；
进一步具体地，所述的pCMV-Cas9-PP7 RNA质粒上PP7 RNA的数量可以是5-8；
优选地，所述的PP7 RNA的数量可以是6-7。
进一步优选地，所述的PP7 RNA的数量为6。
更进一步优选地，所述的pCMV-Cas9-PP7 RNA质粒上Cas9-6×PP7 RNA基因序列SEQ ID NO.1。
进一步具体地，所述的pLV-egfp-U3-sp.gRNA质粒上的gRNA序列为：SEQ ID NO.3。
进一步具体地，所述的PMDlg/pRRE-D64V质粒pol区域的Integrase基因的64位的天冬氨酸突变为缬氨酸。
进一步具体地，所述的PCP-PH-Gag-Pol-D64V质粒上PCP-Gag-Pol基因序列为SEQID NO.2。
又一方面，本发明提供了前述的慢病毒样颗粒在制备递送RNA中的用途，所述的用途包括但不限于：
(1)在实现基因编辑和基因治疗药物中的用途；
(2)在携带表达肿瘤抗原和病毒抗原的RNA用于制备疫苗中的用途；
(3)在表达细胞重编程因子用于制造多能干细胞中的用途；
(4)在表达细胞重编程因子用于改造细胞功能中的用途；
(5)在递送嵌合抗原受体RNA用于制备细胞免疫治疗药物中的用途。
具体地，所述的RNA包括mRNA、gRNA、siRNA、miRNA、ASO、rRNA或多种非编码RNA。
进一步具体地，所述的RNA可以是mRNA或gRNA。
优选地，所述的RNA可以是mRNA。
本发明所取得的技术效果：
(1)在相同VLP感染剂量的条件下，PCP和PP7 RNA组合的编辑效率显著高于MS2C和Stem loop的组合。
(2)本发明的技术方案大大降低了传统慢病毒递送的“脱靶效应”的风险。
(3)本发明的技术方案提高了现有VLP载体的递送效率低的弊端，开发了一种相对更高效瞬时表达的递送载体。
附图说明
图1为去除残留质粒效果检测。
图2为感染96h荧光观察。
图3为VLP-PCP-PP7 RNA组流式检测结果图。
图4为VLP-MS2C-Stem loop组流式检测结果图。
图5为NC组流式检测结果图。
图6为T7E1分析三个组AAVS1编辑效率；*P<0.05。
图7为VLP-PCP-PP7 RNA组AAVS1基因编辑效率。
图8为VLP-MS2C-Stem loop组AAVS1基因编辑效率。
图9为VLP-PCP-PP7 RNA和VLP-MS2C-Stem loop组AAVS1基因编辑效率差异显著性分析；**P<0.01。
图10为VLP-PCP-PP7 RNA和VLP-MS2C-Stem loop组感染细胞不同时间段Cas9蛋白表达检测。
图11为pLV-egfp-U3-sp.gRNA质粒的图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
1.1质粒构建
(1)pCMV-Cas9-6×PP7 RNA质粒
将pCMV-GFP质粒(厂家：淼灵质粒平台，货号：P20780)中的GFP到poly(A)之间的序列替换为ATG+cas9序列+TAA+6×PP7 RNA序列。分两步进行，首先插入Cas9序列，然后插入6×PP7 RNA序列，获得pCMV-Cas9-6×PP7 RNA质粒。
pCMV-Cas9-6×PP7 RNA质粒上Cas9-6×PP7 RNA基因序列(SEQ ID NO.1)：
gacaagaagtacagcatcggcctggacatcggcaccaactctgtgggctgggccgtgatcaccgacgagtacaaggtgcccagcaagaaattcaaggtgctgggcaacaccgaccggcacagcatcaagaagaacctgatcggagccctgctgttcgacagcggcgaaacagccgaggccacccggctgaagagaaccgccagaagaagatacaccagacggaagaaccggatctgctatctgcaagagatcttcagcaacgagatggccaaggtggacgacagcttcttccacagactggaagagtccttcctggtggaagaggataagaagcacgagcggcaccccatcttcggcaacatcgtggacgaggtggcctaccacgagaagtaccccaccatctaccacctgagaaagaaactggtggacagcaccgacaaggccgacctgcggctgatctatctggccctggcccacatgatcaagttccggggccacttcctgatcgagggcgacctgaaccccgacaacagcgacgtggacaagctgttcatccagctggtgcagacctacaaccagctgttcgaggaaaaccccatcaacgccagcggcgtggacgccaaggccatcctgtctgccagactgagcaagagcagacggctggaaaatctgatcgcccagctgcccggcgagaagaagaatggcctgttcggaaacctgattgccctgagcctgggcctgacccccaacttcaagagcaacttcgacctggccgaggatgccaaactgcagctgagcaaggacacctacgacgacgacctggacaacctgctggcccagatcggcgaccagtacgccgacctgtttctggccgccaagaacctgtccgacgccatcctgctgagcgacatcctgagagtgaacaccgagatcaccaaggcccccctgagcgcctctatgatcaagagatacgacgagcaccaccaggacctgaccctgctgaaagctctcgtgcggcagcagctgcctgagaagtacaaagagattttcttcgaccagagcaagaacggctacgccggctacattgacggcggagccagccaggaagagttctacaagttcatcaagcccatcctggaaaagatggacggcaccgaggaactgctcgtgaagctgaacagagaggacctgctgcggaagcagcggaccttcgacaacggcagcatcccccaccagatccacctgggagagctgcacgccattctgcggcggcaggaagatttttacccattcctgaaggacaaccgggaaaagatcgagaagatcctgaccttccgcatcccctactacgtgggccctctggccaggggaaacagcagattcgcctggatgaccagaaagagcgaggaaaccatcaccccctggaacttcgaggaagtggtggacaagggcgcttccgcccagagcttcatcgagcggatgaccaacttcgataagaacctgcccaacgagaaggtgctgcccaagcacagcctgctgtacgagtacttcaccgtgtataacgagctgaccaaagtgaaatacgtgaccgagggaatgagaaagcccgccttcctgagcggcgagcagaaaaaggccatcgtggacctgctgttcaagaccaaccggaaagtgaccgtgaagcagctgaaagaggactacttcaagaaaatcgagtgcttcgactccgtggaaatctccggcgtggaagatcggttcaacgcctccctgggcacataccacgatctgctgaaaattatcaaggacaaggacttcctggacaatgaggaaaacgaggacattctggaagatatcgtgctgaccctgacactgtttgaggacagagagatgatcgaggaacggctgaaaacctatgcccacctgttcgacgacaaagtgatgaagcagctgaagcggcggagatacaccggctggggcaggctgagccggaagctgatcaacggcatccgggacaagcagtccggcaagacaatcctggatttcctgaagtccgacggcttcgccaacagaaacttcatgcagctgatccacgacgacagcctgacctttaaagaggacatccagaaagcccaggtgtccggccagggcgatagcctgcacgagcacattgccaatctggccggcagccccgccattaagaagggcatcctgcagacagtgaaggtggtggacgagctcgtgaaagtgatgggccggcacaagcccgagaacatcgtgatcgaaatggccagagagaaccagaccacccagaagggacagaagaacagccgcgagagaatgaagcggatcgaagagggcatcaaagagctgggcagccagatcctgaaagaacaccccgtggaaaacacccagctgcagaacgagaagctgtacctgtactacctgcagaatgggcgggatatgtacgtggaccaggaactggacatcaaccggctgtccgactacgatgtggaccatatcgtgcctcagagctttctgaaggacgactccatcgacaacaaggtgctgaccagaagcgacaagaaccggggcaagagcgacaacgtgccctccgaagaggtcgtgaagaagatgaagaactactggcggcagctgctgaacgccaagctgattacccagagaaagttcgacaatctgaccaaggccgagagaggcggcctgagcgaactggataaggccggcttcatcaagagacagctggtggaaacccggcagatcacaaagcacgtggcacagatcctggactcccggatgaacactaagtacgacgagaatgacaagctgatccgggaagtgaaagtgatcaccctgaagtccaagctggtgtccgatttccggaaggatttccagttttacaaagtgcgcgagatcaacaactaccaccacgcccacgacgcctacctgaacgccgtcgtgggaaccgccctgatcaaaaagtaccctaagctggaaagcgagttcgtgtacggcgactacaaggtgtacgacgtgcggaagatgatcgccaagagcgagcaggaaatcggcaaggctaccgccaagtacttcttctacagcaacatcatgaactttttcaagaccgagattaccctggccaacggcgagatccggaagcggcctctgatcgagacaaacggcgaaaccggggagatcgtgtgggataagggccgggattttgccaccgtgcggaaagtgctgagcatgccccaagtgaatatcgtgaaaaagaccgaggtgcagacaggcggcttcagcaaagagtctatcctgcccaagaggaacagcgataagctgatcgccagaaagaaggactgggaccctaagaagtacggcggcttcgacagccccaccgtggcctattctgtgctggtggtggccaaagtggaaaagggcaagtccaagaaactgaagagtgtgaaagagctgctggggatcaccatcatggaaagaagcagcttcgagaagaatcccatcgactttctggaagccaagggctacaaagaagtgaaaaaggacctgatcatcaagctgcctaagtactccctgttcgagctggaaaacggccggaagagaatgctggcctctgccggcgaactgcagaagggaaacgaactggccctgccctccaaatatgtgaacttcctgtacctggccagccactatgagaagctgaagggctcccccgaggataatgagcagaaacagctgtttgtggaacagcacaagcactacctggacgagatcatcgagcagatcagcgagttctccaagagagtgatcctggccgacgctaatctggacaaagtgctgtccgcctacaacaagcaccgggataagcccatcagagagcaggccgagaatatcatccacctgtttaccctgaccaatctgggagcccctgccgccttcaagtactttgacaccaccatcgaccggaagaggtacaccagcaccaaagaggtgctggacgccaccctgatccaccagagcatcaccggcctgtacgagacacggatcgacctgtctcagctgggaggcgactaaaccggtcttgcagcacattaaggagtttatatggaaacccttactgcaggtcgactctagaaataaggagtttatatggaaacccttactgcagtattcccgggttcattagatcctaaggtacctaattgcctagaaataaggagtttatatggaaacccttactgcaggtcgactctagaaataaggagtttatatggaaacccttactgcagtattcccgggttcattagatcctaaggtacctaattgcctagaaataaggagtttatatggaaacccttactgcaggtcgactctagaaataaggagtttatatggaaaccctta。
(2)pLV-egfp-U3-sp.gRNA质粒
向第三代慢病毒包装系统中的穿梭质粒中插入EGFP序列。向U3 region of 3'LTR中插入序列U6 promoter序列，得到pLV-egfp质粒。然后将AAVS1 gRNA-F(SEQ ID NO.4：CACCGGGGCCACTAGGGACAGGAT)和AAVS1 gRNA-R(SEQ ID NO.5：AAACATCCTGTCCCTAGTGGCCCC)进行退火操作，得到一条AAVS1 gRNA双链，再用Aar I酶(厂家：ThermoFisher Scientific，货号：ER1581)对pLV-egfp质粒进行酶切，将AAVS1 gRNA双链克隆至pLV-egfp质粒，得到pLV-egfp-U3-AAVS1-sp.gRNA质粒。AAVS1 gRNA序列为(SEQ ID NO.3)：GGGGCCACTAGGGACAGGAT。
(3)PMDlg/pRRE-D64V质粒改造
将第三代慢病毒包装系统中的pMDLg-pRRE质粒(序列来自于Addgeen(货号：#12251),由金斯瑞生物科技股份有限公司合成)pol区域的Integrase基因的64位氨基酸GAT(D)突变为GTT(V)。
(4)PCP-PH-Gag-Pol-D64V质粒改造
pMS2M-PH-Gag-Pol-D64V质粒购买自淼灵质粒平台，货号：P37491，将质粒中MS2C基因替换为PCP基因。
PCP-PH-Gag-Pol-D64V质粒上PCP-Gag-Pol基因序列(SEQ ID NO.2)：
tccaaaaccatcgttctttcggtcggcgaggctactcgcactctgactgagatccagtccaccgcagaccgtcagatcttcgaagagaaggtcgggcctctggtgggtcggctgcgcctcacggcttcgctccgtcaaaacggagccaagaccgcgtatcgagtcaacctaaaactggatcaggcggacgtcgttgattgctccaccagcgtctgcggcgagcttccgaaagtgcgctacactcaggtatggtcgcacgacgtgacaatcgttgcgaatagcaccgaggcctcgcgcaaatcgttgtacgatttgaccaagtccctcgtcgcgacctcgcaggtcgaagatcttgtcgtcaaccttgtgccgctgggccgtagccagaactatccgattgtgcagtccggactcagatctcgagctcaagcttcgaattctgcagtcgacggtaccgcgggcccgggatccatggactcgggccgggacttcctgaccctgcacggcctacaggatgatgaggatctacaggcgctgctgaagggcagccagctcctgaaggtgaagtccagctcatggaggagagagcgcttctacaagttgcaggaggactgcaagaccatctggcaggagtcccgcaaggtcatgcggaccccggagtcccagctgttctccatcgaggacattcaggaggtgcgaatggggcaccgcacggagggtctggagaagttcgcccgtgatgtgcccgaggaccgctgcttctccattgtcttcaaggaccagcgcaatacactagacctcatcgccccatcgccagctgatgcccagcactgggtgctggggctgcacaagatcatccaccactcaggctccatggaccagcgtcagaagctacagcactggattcactcctgcttgcgaaaagctgacaaaaacaaggacaacaagatgagcttcaaggagctgcagaacttcctgaaggagctcaacatccagcctcgagccgaattcaccctggccgccagggccagcgtgctgagcggcggcgagctggacaggtgggagaagatcaggctgaggcccggcggcaagaagaagtataagctgaagcacatcgtgtgggccagcagggagctggagaggttcgccgtgaaccccggcctgctggagaccagcgagggctgcaggcagatcctgggccagctgcagcccagcctgcagaccggcagcgaggagctgaggagcctgtacaacaccgtggccaccctgtactgcgtgcaccagaggatcgagatcaaggacaccaaggaggccctggacaagatcgaggaggagcagaacaagtccaagaagaaggcccagcaggccgccgccgacaccggccacagcagccaggtgagccagaactaccccatcgtgcagaacatccagggccagatggtgcaccaggccatcagccccaggaccctgaacgcctgggtgaaggtggtggaggagaaggccttcagccccgaggtgatccccatgttcagcgccctgagcgagggagccaccccccaggacctgaacaccatgctgaacaccgtgggcggccaccaggccgccatgcagatgctgaaggagaccatcaacgaggaggccgccgagtgggacagggtgcaccccgtgcacgccggccccatcgcccccggccagatgagggagccccgcggcagcgacatcgccggcaccaccagcaccctgcaggagcagatcggctggatgaccaacaacccccccatccccgtgggcgaaatctacaagaggtggatcatcctgggcctgaacaagatcgtgaggatgtacagccccaccagcatcctggatatcaggcagggccccaaagagcccttcagggactacgtggacaggttctacaagaccctgcgcgccgagcaggccagccaggaggtgaagaactggatgaccgagaccctgctggtgcagaacgccaaccccgactgcaagaccatcctgaaggccctgggacccgccgccaccctggaggagatgatgaccgcctgccagggcgtgggcggccccggccacaaggccagggtgctggccgaggccatgagccaggtgaccaacaccgccaccatcatgatgcagaggggcaacttcaggaaccagaggaagatggtgaagtgcttcaactgcggcaaggagggccacaccgccaggaactgccgcgcccccaggaagaagggctgctggaagtgcggcaaggagggccaccagatgaaggactgcaccgagaggcaggctaattttttagggaagatctggccttcctacaagggaaggccagggaattttcttcagagcagaccagagccaacagccccaccatttcttcagagcagaccagagccaacagccccaccagaagagagcttcaggtctggggtagagacaacaactccccctcagaagcaggagccgatagacaaggaactgtatcctttaacttccctcagatcactctttggcaacgacccctcgtcacaataaagatcggtggccagctgaaggaggccctgctggacaccggcgccgacgacaccgtgctggaggagatgagcctgcccggcaggtggaagcccaagatgatcggcggcatcggcggcttcatcaaggtgaggcagtacgaccagatcctgatcgagatctgcggccacaaggccatcggcaccgtgctggtgggacctacacctgtgaacatcatcggcaggaacctgctgacccagatcggctgcaccctgaacttccccatcagccccatcgagaccgtgcccgtgaagctgaagcccggcatggacggccctaaggtgaagcagtggcccctgaccgaggagaagatcaaggccctggtggagatctgcaccgagatggagaaggagggcaagatcagcaagatcggccccgagaacccctacaacacccccgtgttcgccatcaagaagaaggacagcaccaagtggaggaagctggtggacttcagggagctgaacaagaggacccaggacttctgggaggtgcagctgggcatcccccaccccgccggcctgaagaagaagaagagcgtgaccgtgctggacgtgggcgacgcctacttcagcgtgcccctggacgaggacttcaggaagtataccgccttcaccatccccagcatcaacaacgagacccccggcatccgctaccagtacaacgtgctgccccagggctggaagggcagccccgccatcttccagagcagcatgacaaagatcctggagcccttcaagaagcagaaccccgacatcgtgatctatcagtacatggacgacctgtacgtgggcagcgacctggagatcggccagcacaggaccaagatcgaggagctgaggcagcacctgctgaggtggggcctgaccacccccgacaagaagcaccagaaggagcccccattcctgtggatgggctacgagctgcaccccgacaagtggaccgtgcagcccatcgtgctgcccgagaaggacagctggaccgtgaacgacattcagaagctggtgggcaagctgaactgggccagccagatctaccctggcatcaaggtgaggcagctgtgcaagctgctgaggggcacaaaggctctgaccgaggtgatccccctgaccgaggaggccgagctggagctggccgagaacagggagatcctgaaggagcccgtgcacggcgtgtactacgaccccagcaaggacctgatcgccgagatccagaagcagggccagggccagtggacctaccagatctaccaggagcccttcaagaacctgaagaccggcaagtacgcccgcatgcgcggcgcccacaccaacgacgtgaagcagctgaccgaggccgtgcagaagatcaccaccgagagcatcgtgatctggggcaagactcctaagttcaagctgcccatccagaaggagacctgggagacctggtggaccgagtactggcaggccacctggattcccgagtgggagttcgtgaacacccctcccctggtgaagctgtggtatcagctggagaaggagcccatcgtgggcgccgagaccttctacgtggacggcgccgccaacagggagaccaagctgggcaaggccggctacgtgaccaacaagggccgccagaaggtggtgcccctgaccaacaccaccaaccagaagaccgagctgcaggctatctacctggccctgcaggactcaggcctggaggtgaacatcgtgaccgacagccagtacgccctgggcatcatccaggcccagcccgacaagagcgagagcgagctggtgaaccagatcatcgagcagctgatcaagaaggagaaggtgtacctggcctgggtgcccgcccacaagggcatcggcggcaacgagcaggtggacaagctggtgagcgccggcatcaggaagatcctgttcctggacggcatcgacaaggcccaggacgagcacgagaagtaccacagcaactggagggctatggctagcgacttcaacctgcctcccgtggtggctaaggagatcgtggccagctgcgacaagtgccagctgaagggcgaggccatgcacggccaggtggactgcagccccggcatctggcagctggtttgcacccacctggagggcaaggtgatcctggtggccgtgcacgtggcctccggctacatcgaggccgaggtgatccccgccgagaccggccaggagaccgcctacttcctgctgaagctggccggccgctggcccgtgaagaccatccacaccgacaacggcagcaacttcaccagcgccaccgtgaaggctgcctgctggtgggccggcatcaagcaggagttcggcatcccctacaacccccagtctcagggcgtggtggagagcatgaacaaggagctgaagaagatcatcggccaggtgagggaccaggccgagcacctgaagaccgccgtgcagatggccgtgttcatccacaacttcaagaggaagggcggcatcggcggctacagcgccggcgagaggatcgtggacatcatcgccaccgacatccagaccaaggagctgcagaagcagatcaccaagatccagaacttcagggtgtactacagggacagcaggaaccctctgtggaagggccccgccaagctgctgtggaagggcgagggcgccgtggtgatccaggacaacagcgacatcaaggtggtgcccaggaggaaggccaagatcatcagggactacggcaagcagatggccggcgacgactgcgtggcctccaggcaggacgaggactga。
(5)PMD.2G(序列来自于Addgeen(货号：#12259),由金斯瑞生物科技股份有限公司合成)和pRSV-REV质粒(序列来自于Addgeen(货号：#12253),由金斯瑞生物科技股份有限公司合成)来自于第三代慢病毒质粒。
1.2转染和感染
1)在15cm细胞培养皿中进行细胞铺板，使每孔中加入1.6E5个/cm2HEK-293T细胞，培养24h。
2)24h后，先将15cm孔板中细胞培养液换成30mL 2％ FBSDMEM，置于37℃孵育。
3)按照DNA(总)：PEI(polyplus)的比例为1μg：2μL的比例在15cm细胞培养明中进行转染，转染剂量如下：
质粒名称 每孔质粒转染量(μg)
PMD.2G 7.2
pRSV-REV 5.77
pCMV-Cas9-6×PP7 RNA 25
pLV-egfp-U3-sp.gRNA 25
PCP-PH-Gag-Pol-D64V 12.5
pMDlg/pRRE-D64V 12.5
在转染后6h时更换10％ FBSDMEM，并且在72h时收集上清30mL。
4)去除残留质粒
向上清中加入核酸酶。反应1h之后核酸检测残留质粒去除情况。检测结果如图1所示残留质粒全部去除。
5)VLP浓缩
将去核酸的上清在4℃、25000rpm的条件下离心2h，弃去上清之后加入原上清体积1/50的PBS，过夜溶解重悬，浓缩后体积为600uL。
6)转导滴度检测(流式细胞法)：
提前12h铺板，铺24孔板，每孔的细胞量为1E5。进行感染实验，设置三个组，NC组：细胞加入DMEM；VLP-MS2C-Stem loop组：细胞加入已报道的基于MS2C-Stem loop结构的VLP为对照；VLP-PCP-PP7 RNA组：细胞加入基于PCP-PP7 RNA结构的VLP。感染96h后收集细胞，流式细胞术检测绿色荧光阳性细胞比例，计算转导滴度。
转导滴度计算结果见下表：
分组 转导滴度(绿荧光阳性)
VLP-PCP-PP7 RNA组 7.56E7 TU/mL
VLP-MS2C-Stem loop组 2.299E8 TU/mL
96h绿色荧光观察结果如图2所示。
流式检测结果：
VLP经1000倍稀释，取体积100μL，感染1E5个293T细胞，流式检测显示绿色荧光阳性细胞比例如图3-图5所示。经计算VLP-PCP-PP7 RNA组转导滴度为7.56E7 TU/mL，VLP-MS2C-Stem loop组转导滴度为2.299E8 TU/mL。
7)AAVS1编辑效率检测
将转染后并且浓缩的VLP上清感染293T细胞，感染5d后收集细胞，通过T7E1检测AAVS1基因是否被编辑，扫描灰度，计算编辑效率。检测引物如下表：
引物名称 引物序列 SEQ ID NO.
T7E1-AAVS1 F CCAGACAGCCGCGTCAGA SEQ ID NO.6
T7E1-AAVS1 R CCTGCCGCCTCCTTCAGG SEQ ID NO.7
T7E1编辑效率的检测结果如图6所示，在相同VLP感染剂量的条件下，PCP和PP7RNA组合的编辑效率显著高于MS2C和Stem loop的组合。
将转染后并且浓缩的VLP上清感染293T细胞，感染5d后收集细胞，提取细胞DNA，用T7E1-AAVS1 F引物扩增后进行Sanger测序，然后通过TIDE检测AAVS1基因编辑效率。TIDE检测结果如图7-图9所示，在相同VLP感染剂量的条件下，PCP和PP7 RNA组合的编辑效率显著高于MS2C和Stem loop的组合。
8)Cas9 WB检测
在感染实验前12h，在6孔细胞培养板中进行铺板，每孔细胞量1E6。待细胞贴壁之后，将VLP-PCP-PP7 RNA组和VLP-MS2C-Stem loop组VLP加入至细胞中。感染24h、48h和72h后收集细胞进行WB检测Cas9表达。
检测结果如图10所示，VLP-PCP-PP7 RNA组和VLP-MS2C-Stem loop组的VLP均可在感染后24h和48h检测到Cas9蛋白的表达，在感染后72h检测不到Cas9蛋白的表达，表明Cas9蛋白在72h时会降解，大大降低了传统慢病毒递送的“脱靶效应”的风险。

Claims (10)

1.PP7 RNA茎环结构在制备递送RNA中的用途，所述的用途包括：
(1)在实现基因编辑和基因治疗药物中的用途；
(2)在携带表达肿瘤抗原和病毒抗原的RNA用于制备疫苗中的用途；
(3)在表达细胞重编程因子用于制造多能干细胞中的用途；
(4)在表达细胞重编程因子用于改造细胞功能中的用途；
(5)在递送嵌合抗原受体RNA用于制备细胞免疫治疗药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的RNA包括mRNA、gRNA、siRNA、miRNA、ASO、rRNA或多种非编码RNA。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述的PP7 RNA茎环结构的数量为5-8。
4.一种慢病毒样颗粒，其特征在于，所述的慢病毒样颗粒包括PP7 RNA茎环结构。
5.根据权利要求4所述的慢病毒样颗粒，其特征在于，所述的慢病毒样颗粒的包装质粒包括pCMV-Cas9-PP7 RNA质粒、pLV-egfp-U3-sp.gRNA质粒、PMDlg/pRRE-D64V、PCP-PH-Gag-Pol-D64V、PMD.2G和pRSV-REV；
所述的pCMV-Cas9-PP7 RNA质粒上PP7 RNA的数量为5-8；
所述的pLV-egfp-U3-sp.gRNA质粒上的gRNA序列为：SEQ ID NO.3；
所述的PMDlg/pRRE-D64V质粒pol区域的Integrase基因的64位氨基酸D突变为V；
所述的PCP-PH-Gag-Pol-D64V质粒上PCP-Gag-Pol基因序列为SEQ ID NO.2。
6.根据权利要求5所述的慢病毒样颗粒，其特征在于，所述的PP7 RNA的数量为6-7；优选为6。
7.根据权利要求5所述的慢病毒样颗粒，其特征在于，所述的pCMV-Cas9-PP7 RNA质粒上Cas9-6×PP7 RNA基因序列SEQ ID NO.1。
8.一种慢病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括以下步骤：
S1、质粒构建；
S2、转染和感染细胞；
S3、去除残留质粒；
S4、VLP浓缩；
所述的质粒包括pCMV-Cas9-PP7 RNA质粒、pLV-egfp-U3-sp.gRNA质粒、PMDlg/pRRE-D64V、PCP-PH-Gag-Pol-D64V、PMD.2G和pRSV-REV；
所述的pCMV-Cas9-PP7 RNA质粒上Cas9-6×PP7 RNA基因序列SEQ ID NO.1；
所述的pLV-egfp-U3-sp.gRNA质粒上的gRNA序列为：SEQ ID NO.3；
所述的PMDlg/pRRE-D64V质粒pol区域的Integrase基因的64位的天冬氨酸突变为缬氨酸；
所述的PCP-PH-Gag-Pol-D64V质粒上PCP-Gag-Pol基因序列为SEQ ID NO.2。
9.权利要求4-7任一项所述的慢病毒样颗粒在制备递送RNA中的用途，所述的用途包括：
(1)在实现基因编辑和基因治疗药物中的用途；
(2)在携带表达肿瘤抗原和病毒抗原的RNA用于制备疫苗中的用途；
(3)在表达细胞重编程因子用于制造多能干细胞中的用途；
(4)在表达细胞重编程因子用于改造细胞功能中的用途；
(5)在递送嵌合抗原受体RNA用于制备细胞免疫治疗药物中的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述的RNA包括mRNA、gRNA、siRNA、miRNA、ASO、rRNA或多种非编码RNA。
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