CN118903175B

CN118903175B - 小分子药物联用在增强低氧条件下nk细胞的代谢、杀伤能力中的应用

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Publication number: CN118903175B
Application number: CN202411005060.2A
Authority: CN
Inventors: 王毅; 金晶; 颜培栋; 李昀佳
Original assignee: University of Science and Technology of China USTC
Current assignee: University of Science and Technology of China USTC
Priority date: 2024-07-25
Filing date: 2024-07-25
Publication date: 2025-09-16
Anticipated expiration: 2044-07-25
Also published as: CN118903175A

Abstract

本发明公开了一种小分子药物联用组合物在增强低氧条件下NK细胞的代谢、杀伤能力中的应用，所述联用组合物包含和厚朴酚和烟酰胺核苷，本发明首次发现和厚朴酚和烟酰胺核苷联合对NK细胞低氧条件下调节具有协同效果，能够显著增强NK细胞在低氧条件下的代谢和杀伤能力，进而为肿瘤的治疗提供了新的药物联用策略。

Description

小分子药物联用在增强低氧条件下NK细胞的代谢、杀伤能力中的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种小分子药物联用组合物，以及该小分子药物联用组合物在增强低氧条件下NK细胞的代谢、杀伤能力中的应用。

背景技术

自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)是一种先天免疫细胞，在肿瘤监测中起着至关重要的作用。NK细胞抗肿瘤活性受损与低氧的肿瘤微环境(Tumor micro-environment，TME)以及其中的肿瘤衍生代谢物(如乳酸)有关。已有研究表明来自肿瘤的低氧微环境通过损害NK细胞的效应功能和促进黑色素瘤、胰腺癌、结直肠肝转移。此外，低氧TME通过诱导肝癌肿瘤内NK细胞的线粒体断裂来改变NK细胞的代谢，从而抑制其抗肿瘤活性。通过已有的研究可知，自然杀伤细胞(NK)在癌症免疫监视中起着至关重要的作用，但目前尚未有报道通过小分子药物靶向低氧环境增强NK细胞代谢，加强其有效监测肿瘤的能力。

因此，本发明致力于阐明一种能够调节NK细胞对低氧环境适应能力、增强NK细胞的代谢和杀伤能力、提高体内和体外抗肿瘤活性的小分子药物联用组合物。

发明内容

有鉴于此，本发明的首要目的在于提供一种小分子药物联用组合物，通过将小分子药物和厚朴酚和和厚朴酚和烟酰胺核苷两种小分子药物联用增强NK细胞对低氧环境的适应能力，增强NK细胞在低氧条件下的代谢和杀伤能力，进而提高其抑制肿瘤细胞生长，促进肿瘤细胞凋亡的效果，提高其对肿瘤细胞在体内外的杀伤作用，为肿瘤的治疗提供新的策略。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明首先提供了一种用于增强低氧条件下NK细胞的代谢和/或杀伤能力的小分子药物联用组合物，其包括和厚朴酚和烟酰胺核苷。

进一步方案，所述小分子药物联用组合物为单一的复方制剂或两种单独的单方制剂的组合。

进一步方案，所述复方制剂为含有和厚朴酚和烟酰胺核苷；

所述单方制剂为含有和厚朴酚和含有烟酰胺核苷的单方制剂的组合。

进一步方案，所述小分子药物联用组合物中，和厚朴酚和烟酰胺核苷的的浓度比例为(0.01～1mM)：(0.1～10mM)。

本发明进一步提供了一种药物，含有前文所述的小分子药物联用组合物。

所述药物具有如下任意一种或两种以上的功效：

a：增强低氧条件下NK细胞的代谢能力和/或杀伤能力；

b：抑制肿瘤细胞的生长；

c：促进肿瘤细胞的凋亡。

进一步方案，所述药物还包括药学上任意可接受的辅料和/或载体。

本发明进一步提供了一种体外非治疗目的的增强低氧条件下NK细胞的代谢和/或杀伤能力的方法，包括以下步骤：

采用前文所述的小分子药物联用组合物或者前文所述的药物体外处理NK细胞。

进一步方案，所述和厚朴酚和烟酰胺核苷可同时、顺序或间隔施药。

本发明进一步提供了一种NK细胞，采用前文所述的方法处理得到。

进一步方案，所述NK细胞为CAR-NK细胞。

本发明进一步提供了如以下任意一种或两种以上的应用，所述应用包括：

a：和厚朴酚和烟酰胺核苷联合在制备用于增强低氧条件下NK细胞的代谢能力和/或杀伤能力的药物中的应用；

b：和厚朴酚和烟酰胺核苷联合在制备用于治疗肿瘤的药物中的应用；

c：和厚朴酚在制备用于提高烟酰胺核苷治疗肿瘤效果的药物中的应用。

进一步方案，所述和厚朴酚和烟酰胺核苷的浓度比例为(0.01～1mM)：(0.1～10mM)。

本发明的有益效果：

本发明中利用和厚朴酚和烟酰胺核苷两种小分子药物联用增强NK细胞对低氧环境的适应，提高了NK细胞在低氧条件下的代谢和杀伤能力，进而提高抑制肿瘤细胞生长，促进肿瘤细胞凋亡的效果。

本发明中提供的小分子药物联用组合物可进行通过靶向低氧调控来增强NK细胞为基础的癌症治疗，进而为肿瘤的临床治疗提供新的策略。

附图说明

图1为实施例1中AML患者骨髓NK细胞杀伤能力受损流式实验结果，其中，a图为Annexin V⁺K562细胞百分比的流式分析图；b图为Annexin V⁺K562细胞百分比的统计图；c图为Granzyme B⁺NK细胞、CD107a⁺NK细胞、IFN-γ⁺NK细胞在AML复发和非复发患者骨髓中纯化的总NK细胞中百分比的流式分析图；d图为Granzyme B⁺NK细胞、CD107a⁺NK细胞、IFN-γ⁺NK细胞在AML复发和非复发患者骨髓中纯化的总NK细胞中百分比的统计图；e图为NKG2D、CD38和CD69在AML患者骨髓分离纯化的NK细胞上的表达的流式分析图；f图为NKG2D、CD38和CD69在AML患者骨髓分离纯化的NK细胞上的平均荧光强度MFI的统计图。

图2为实施例2中体外处理后骨髓NK(BMNK)细胞杀伤功能流式实验结果，其中，a图为Annexin V⁺原发AML母细胞百分比的流式分析图和统计图；b图为Granzyme B⁺NK细胞在AML复发患者总BMNK细胞中百分比的流式分析图和统计图；c图为CD107a⁺NK细胞在AML复发患者总BMNK细胞中百分比的流式分析图和统计图；d图为IFN-γ⁺NK在AML复发患者总BMNK细胞中百分比的流式分析图和统计图；e图为NKG2D、CD38和CD160在AML复发患者BMNK细胞上的表达的流式分析图和平均荧光强度MFI的统计图；f图为Annexin V⁺K562细胞百分比的流式分析图和统计图；g图为Granzyme B在AML复发患者BMNK细胞上的表达的流式分析图和平均荧光强度MFI的统计图；h图为CD107a⁺NK细胞和IFN-γ⁺NK细胞在AML复发患者总BMNK细胞中百分比的流式分析图和统计图；i图为NKG2D、CD38和CD160在AML复发患者BMNK细胞上的表达的流式分析图和平均荧光强度MFI的统计图。

图3为实施例3中体外处理后NK92MI细胞杀伤功能流式实验结果，其中，a图为Annexin V⁺原发AML母细胞百分比的流式分析图和统计图；CD107a⁺NK细胞和IFN-γ⁺NK细胞在总NK92MI细胞中百分比的流式分析图和统计图；b图为Granzyme B、NKG2D和CD160在NK92MI细胞上的表达的流式分析图和平均荧光强度MFI的统计图；c图为Annexin V⁺K562母细胞百分比的流式分析图和统计图；CD107a⁺NK细胞和IFN-γ⁺NK细胞在总NK92MI细胞中百分比的流式分析图和统计图；d图为Granzyme B、NKG2D和CD160在NK92MI细胞上的表达的流式分析图和平均荧光强度MFI的统计图。

图4为实施例5中在白血病小鼠异种移植模型中研究HKL和NR联用对白血病细胞影响的实验结果，其中，a图为实验流程示意图；b图为AML负荷的生物发光成像；c图为AML负荷量化为总通量的平均值(p/s)。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是旨在于限制本发明。

本发明第一方面提供了一种小分子药物联用组合物，所述小分子药物联用组合物包括和厚朴酚和烟酰胺核苷。

进一步的，所述小分子药物联用组合物为单一的复方制剂或两种单独的单方制剂的组合。

进一步的，所述复方制剂为含有和厚朴酚和烟酰胺核苷的复方制剂。

进一步的，所述单方制剂的组合为含有和厚朴酚的单方制剂和含有烟酰胺核苷的单方制剂的组合。

进一步的，所述小分子药物联用组合物中，和厚朴酚和烟酰胺核苷的的浓度比例为(0.01～1mM)：(0.1～10mM)。

在本发明中，所述和厚朴酚(Honokiol，HKL)是一种具有生物活性的双酚类植物化学物质，可靶向多种信号分子，具有有效的抗氧化、抗炎、抗血管生成和抗癌活性。HKL已经被证明能抑制胶质母细胞瘤(GBM)细胞的生长并诱导细胞凋亡，抑制乳腺癌细胞的生长。HKL能通过清除HCC细胞周期蛋白受到的低氧和乳酸的影响，在体内外模型中，有效抑制HCC的进展。

在本发明中，烟酰胺核苷(Nicotinamide Riboside，NR)是一种内源性分子，其是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的前体，具有可溶性和口服生物可利用性，能够增加体内NAD+的水平。而NAD+在细胞代谢、能量产生、DNA修复和基因表达中起着重要作用。已有研究表明，烟酰胺核苷可能有助于提高线粒体健康状态、刺激线粒体功能和诱导产生新的线粒体，还可以增强干细胞的线粒体功能。

目前尚无任何将和厚朴酚和烟酰胺核苷联合用于靶向NK细胞低氧环境适应能力的研究报道。

在本发明中，所述的低氧是指O₂浓度不超过10％，优选的，在0.1％～10％；优选的，所述的低氧是指O₂浓度在5％。

在本发明中，所述的小分子药物联用组合物为单一的复方制剂或者两种单独的单方制剂的组合。

具体的说，对于复方制剂是指具有两种以上的活性药物成分制成的制剂，例如本发明中小分子药物联用组合物为复方制剂时，可代表其同时包含和厚朴酚和烟酰胺核苷。

对于单方制剂是指具有单一活性药物成分制成的制剂，例如本发明中小分子药物联用组合物为单方制剂的组合时，可代表其为分别包含和厚朴酚的单方制剂和包含烟酰胺核苷的单方制剂的组合。

此外，需要说明的是，当为两种单方制剂的组合时，这两种单方制剂的施用方式没有特别的限定，可以为同时施用或依次施用。当施用方式为依次施用时，施用方式包括：先施用含和厚朴酚的单方制剂、再施用含烟酰胺核苷的单方制剂；或者先施用含烟酰胺核苷的单方制剂、再施用含和厚朴酚的单方制剂。

本发明第二方面提供了一种药物，所述药物中含有前文中所述的小分子药物联用组合物。

所述药物具有如下任意一种或两种以上的功效：

a：增强低氧条件下NK细胞的代谢能力和/或杀伤能力；

b：抑制肿瘤细胞的生长；

c：促进肿瘤细胞的凋亡。

在本发明中，所述药物的治疗肿瘤的效果的实现主要是由于小分子药物联用组合物增强了NK细胞对低氧环境的适应，提高了NK细胞在低氧条件下的代谢和杀伤能力，进而能够抑制肿瘤细胞的生长，促进肿瘤细胞的凋亡，最终发挥治疗肿瘤的效果。

在本发明中，所述的肿瘤包括各种类型的恶性肿瘤和良性肿瘤，其中，所述恶性肿瘤包括但不限于肺癌、乳腺癌、大肠癌、肝癌、脑癌、骨癌、食管癌、胃癌、鼻咽癌、甲状腺癌、胰腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌、宫颈癌、肾细胞癌、结直肠癌、前列腺癌、膀胱癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、黑色素瘤、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤等；所述良性肿瘤包括但不限于乳腺纤维瘤、囊肿、脂肪瘤、胆囊息肉、结节等。

进一步的，可以理解的是，本发明中所述的药物还包括药学上任意可接受的辅料和/或载体。

在本发明的一些具体的实施案例中，所述的药学上任意可接受的辅料和/或载体包括但不限于稀释剂、粘合剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂、填充剂、崩解剂中的至少一种。

其中，在本发明的一些具体的实施案例中，对于稀释剂例如可以是乳糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、淀粉、水等，但并不限于此。对于粘合剂例如可以是淀粉、预胶化淀粉、糊精、麦芽糖糊精、蔗糖、阿拉伯胶、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、聚乙烯醇、聚乙二醇、聚乙烯比咯烷酮、海藻酸及海藻酸盐、黄原胶、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素等，但并不限于此。对于表面活性剂例如可以是：聚氧化乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、十二烷基硫酸钠、硬脂酸单甘油酯、十六烷醇等，但并不限于此。对于吸附载体例如可以是淀粉、乳糖、斑脱土、硅胶、高岭土、皂粘土等。对于润滑剂例如可以是硬脂酸锌、单硬脂酸甘油酯、聚乙二醇、滑石粉、硬脂酸钙和镁、聚乙二醇、硼酸粉末、氢化植物油、硬脂富马酸钠、聚氧乙烯单硬脂酸酯、单月桂蔗糖酸酯、月桂醇硫酸钠、月桂醇硫酸镁、十二烷基硫酸镁等，但并不限于此。对于填充剂例如可以是甘露醇、木糖醇、山梨醇、麦芽糖、赤藓糖、微晶纤维素、聚合糖、偶合糖、葡萄糖、乳糖、蔗糖、糊精、淀粉、海藻酸钠、海带多糖粉末、琼脂粉末、碳酸钙、碳酸氢钠等，但并不限于此。对于崩解剂例如可以是交联乙烯吡咯烷酮、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基甲基、交联羧甲基纤维素钠、大豆多糖等。

此外，在本发明中，所述的辅料和/或载体还可以是稳定剂、缓冲剂、等渗剂、pH调节剂或螯合剂中的至少一种。

具体辅料和/或载体的选择可以根据所述药物的剂型进行，具体选择时，以能够与所述活性物质相适应，或者能够有效提高药物中所含活性成分的稳定性和溶解性，或者能够改变所述活性物质的释放速率和吸收速率，进而保证或增强活性成分的给药效果。在本发明中，所述药物的剂型没有特别的限定，可以采用本领域中已知的任意有利于给药的剂型，例如可以是：水溶液注射剂、粉针剂、丸剂、散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂等。在本发明的一些具体的实施案例中，优选为粉剂。本文中所述的有利于给药是指能够提高治疗效果或者提高生物利用度或者降低毒副作用或者提高患者的适应性等。

本发明第三方面提供了一种体外非治疗目的的增强低氧条件下NK细胞的代谢和/或杀伤能力的方法。

进一步的，所述方法包括如下步骤：

本发明第四方面提供了一种NK细胞，采用前文所述的体外处理方法得到。

通过上述处理方法，可获得具有优异的低氧适应能力，在低氧条件下也具有高代谢和杀伤效果的NK细胞，进而发挥更好的杀伤肿瘤细胞的效果。

在本发明中，所述的NK细胞包括但不限于NK92细胞、NK-92MI细胞、KHYG-1细胞、YT细胞、CIML-NK细胞、NKG细胞、NKL细胞、NK-YS细胞、SNK-6细胞、IMC-1细胞、PB-NK细胞、iPSC-NK细胞、UCB-NK细胞或CAR-NK细胞，优选的，所述NK细胞为NK-92MI细胞或CAR-NK细胞。

对于NK细胞为CAR-NK细胞时，可提供一种CAR-NK细胞改良治疗方法为肿瘤患者提供新的治疗方案，即在向肿瘤患者体内传输CAR-NK细胞之前，采用前文所述的小分子药物联用组合物或者前文所述的药物预处理CAR-NK细胞，随后再传输到肿瘤患者体内，以提高肿瘤的治疗效果。

进一步的，在本发明中，所述和厚朴酚和烟酰胺核苷可同时、顺序或间隔施药。

在本发明中，通过实验验证所述和厚朴酚和烟酰胺核苷的浓度比例为(0.01～1mM)：(0.1～10mM)，处理时间为18h-30h。两者联合用药具有协同增效效果，能够显著增强NK细胞低氧条件下的代谢和杀伤能力，进而更好的抑制肿瘤细胞的生长，促进肿瘤细胞的凋亡。在本发明的一些优选的实施案例中，所述和厚朴酚和烟酰胺核苷的浓度分别为0.1mM和1mM，优选的处理时间为24h。

本发明还提供了一种CAR-NK细胞治疗改良方法，在体外采用HKL和NR联合处理CAR-NK细胞后，将处理后的CAR-NK细胞传输到患者体内以达到提高治疗肿瘤效果的目的。

下面通过具体实施例对本发明进行说明，需要说明的是，下面的具体实施例仅仅是用于说明的目的，而不以任何方式限制本发明的范围，另外，如无特别说明，未具体记载条件或者步骤的方法均为常规方法，所采用的试剂和材料均可从商业途径获得。

实施例1AML复发患者骨髓NK细胞杀伤能力受损

1、实验材料

急性髓系白血病(AML)患者骨髓NK细胞来自于骨髓单个核细胞(BMMCs)，其中，BMMCs是从接受过实验室检测的AML患者的残留骨髓样本通过Ficoll密度梯度法分离出来的。这些患者包括同种异体造血干细胞移植后早期复发的患者和未早期复发的患者，早期复发被定义为同种异体移植后完全缓解后6个月内的复发。体内实验中使用的NK细胞是从健康供体血液中纯化的：NK细胞由磁活化细胞分选器(MACS)试剂盒(Miltenyi Biotec,Cat.#130-092-657纯化)。每次检测NK细胞纯度均＞93％。所有使用的人体样本均经伦理委员会批准(2021-N(H)-120；合肥，中国)，并获得所有患者的书面知情同意。

K562细胞购自Shanghai Cell Bank(Chinese Academy of Sciences，Shanghai，China)。

2、实验方法

骨髓NK细胞分为复发AML患者和非复发AML患者，将其分别与K562靶细胞按照如下步骤进行共培养：

将骨髓NK细胞(2×10⁶个/mL)和K562靶细胞(4×10⁵个/mL)接种于完全RPMI 1640培养基(Thermo Fisher Scientific，11875119)中，置于37℃，5％ CO₂培养箱中共培养4h。

按照抗体说明书将共培养后的细胞使用流式抗体标记后，采用流式细胞术对NK细胞的杀伤功能进行检测。

3、实验结果

流式细胞结果参见图1，复发的AML患者相较于未复发的AML患者，Annexin V⁺(7-AAD，Cat#559925，RRID：AB_2869266；APC-Annexin V，Cat#550474，RRID：AB_2868885)K562细胞的百分比显著降低(图1a和图1b)。此外，CD107a⁺(Cat#560664，RRID：AB_396135)、Granzyme B⁺(Cat#563389，RRID：AB_2738175)和IFN-γ⁺(Cat#506504，RRID：AB_315437)的NK细胞的比例在复发的AML患者中都表现出明显的降低(图1c和图1d)。这说明，NK细胞对肿瘤的效应功能在复发的AML患者中受损。

进一步的，请继续参阅图1，复发的AML患者相较于未复发的AML患者，其NK细胞上CD38、NKG2D(Cat#562365，RRID：AB_11153309)和CD69(Cat#555531，RRID：AB_395916)的表达水平也显著下调(图1e和图1f)。

综合上述结果可知，处于低氧的骨髓微环境中的NK细胞，其功能受到抑制。

实施例2小分子药物联用增强BMNK细胞对低氧环境的适应能力并提高NK细胞杀伤功能

本实施例中利用和厚朴酚和烟酰胺核苷联合处理复发性AML患者的NK细胞，进而证明联合处理可显著增强NK细胞的活化，逆转复发性AML患者中NK细胞抗白血病功能的损伤。

1、实验材料

AML复发患者的NK细胞和K562细胞以及采用的流式抗体均同实施例1。

和厚朴酚，HKL(Yuanye，Cat#B20498)。

烟酰胺核苷，NR(TargetMol，Cat#T13795)。

2、实验方法

将复发性AML患者的骨髓NK细胞(2×10⁶个/mL)接种于完全RPMI1640培养基(Thermo Fisher Scientific，11875119)，分以下3组进行加药处理：

(1)单独使用NR组，NR的剂量为1mM；

(2)HKL和NR联合使用组，HKL的剂量为100μm，NR的剂量为1mM；

(3)对照组，不使用HKL和NR，即为不加药的复发性AML患者的骨髓NK细胞。

加药后在37℃，5％ CO₂条件下培养，使药物作用24h。然后将各实验组细胞(2×10⁶个/mL)分别和靶细胞(4×10⁵个/mL，原发AML母细胞或K562细胞)接种于完全RPMI 1640培养基(Thermo Fisher Scientific，11875119)中，置于37℃，5％ CO₂培养箱中共培养4h。对各实验组共培养后的细胞使用流式抗体标记后，采用流式细胞术对NK细胞杀伤功能进行检测。

3、实验结果

流式细胞结果请参见图2。可以看出，经过HKL和NR联合处理，Annexin V⁺的原发AML细胞、K562细胞的比例均显著升高(图2a和图2f)。CD107a⁺、Granzyme B⁺和IFN-γ⁺的BMNK细胞的比例在经过HKL和NR联合处理后均显著增加(图2b～2d和图2g～2h)；并且BMNK细胞中的CD38、NKG2D和CD160(Cat#341208，RRID:AB_2561435)的表达水平显著上调(图2e和图2i)。

以上结果表明，复发AML患者的BMNK细胞对原发AML母细胞和AML细胞系的效应功能在NR和HKL联合治疗后得到显著改善。具体来说，用NR和HKL联合进行体外治疗可以恢复从这些AML患者中分离的NK细胞的脱颗粒和细胞因子分泌能力。此外，这种联合处理显著增强了NK细胞的活化。

实施例3小分子药物联用增强NK92MI对低氧环境的适应能力并提高NK细胞杀伤功能

1、实验材料

经STR分析验证的NK92MI细胞来自Cellcook生物技术公司(广州，中国)。细胞在Alpha MEM培养基(Cellcook，Cat：CM2003)中培养，培养基中添加12.5％马血清(Cellcook，Cat：CM1001)、12.5％胎牛血清(Gibco，Cat：10099)、0.2mM肌醇、0.1mM硫醇和0.02mM叶酸。细胞保存在37℃，5％ CO₂的加湿培养箱中。

原发AML母细胞采用同实施例1相同的方式采集自初发AML患者骨髓。

2、实验方法

将NK92MI细胞(2×10⁶个/mL)接种于Alpha MEM培养基中，分以下4个实验组进行加药预处理：

(1)低氧组，NK92MI细胞在37℃、5％ O₂的低氧培养箱中培养24h；

(2)低氧+单独使用NR组，NR的剂量为1mM，NK92MI细胞在37℃、5％ O₂的低氧培养箱中培养24h；

(3)低氧+HKL和NR联合使用组，HKL的剂量为100μm，NR的剂量为1mM，NK92MI细胞在37℃、5％ O₂的低氧培养箱中培养24h；

(4)对照组，不使用HKL和NR且不进行低氧培养，即NK92MI细胞在不加药的AlphaMEM培养基中于37℃、5％ CO₂的培养箱中培养24h。

培养后将各实验组细胞(2×10⁶个/mL)分别和靶细胞(4×10⁵个/mL，原发AML母细胞或K562细胞)接种于Alpha MEM培养基中，置于37℃，5％ CO₂培养箱中共培养4h。对各实验组共培养后的细胞使用流式抗体标记后，采用流式细胞术对NK细胞杀伤功能进行检测。

3、实验结果

流式细胞结果请参见图3。可以看出，相比于低氧组，经过单独NR以及NR和HKL联合处理后，NK细胞对原发AML母细胞以及K562细胞的毒性得到改善，同时表达CD107a⁺和IFN-γ⁺的NK细胞比例增加(图3a和图3c)。此外，经过NR和HKL联合处理后，NK细胞中的颗粒酶B、NKG2D和CD160标记物的表达水平上调(图3b和图3d)。

以上结果表明，NR和HKL联合使用通过增强NK细胞对低氧环境的适应有效地恢复NK细胞的抗白血病活性质。

实施例4烟酰胺核苷和和厚朴酚联用及联合指数

1、实验材料：同实施例2。

2、实验方法：同实施例2。

3、联合指数分析：采用CalcuSyn分析软件计算联合指数(combination index，CI)。联合指数的公式为CI＝D1/DX1+D2/DX2，其中，D1和D2分别分别为联合用药时两药各自的浓度，DX1和DX2分别是联合用药达fa时，单独使用两种药物时靶细胞凋亡率也达到fa时所需要的药物浓度，fa表示一定浓度的两药联合用药达到的靶细胞凋亡率。通过软件输入单药的剂量、药物单用的靶细胞凋亡率、两种药物的具体配比和药物联用时靶细胞凋亡率等信息，利用软件即可计算得到药物的联用指数，CI<1表示两种药物联合处理有协同作用，而CI>1表示两种药物联合处理不存在协同作用。

4、实验结果：

对原发AML母细胞进行烟酰胺核苷和和厚朴酚联合用药指数评估实验，实验结果如表1所示，结果表明烟酰胺核苷和和厚朴酚联合处理对原发AML母细胞凋亡有协同作用(CI＜1)。对K562细胞进行进行联合用药指数评估实验，实验结果如表2所示，结果表明，烟酰胺核苷和和厚朴酚联合处理对K562细胞凋亡有协同作用(CI＜1)。

表1原发AML母细胞烟酰胺核苷和和厚朴酚联合指数评估

表2K562细胞烟酰胺核苷和和厚朴酚联合指数评估

实施例5HKL和NR联用能够明显抑制白血病小鼠异种移植模型中白血病细胞的生长

1、实验材料

6周龄雌性NOD/ShiLtJGpt-Prkdc^em26Cd52IL-2rg^em26Cd22/Gpt(NCG)小鼠，购自GemPharmatech。所有动物均在无特定病原体条件下饲养。所有涉及小鼠的实验均按照《科研动物使用指南》(National Guidelines for Animal Usage in Research)的规定进行，并获得了(USTCACUC2)伦理委员会的批准。

HL60细胞购自Shanghai Cell Bank。

IL-2(50000U，Jiangsu Kingsley Pharmaceuticals)。

NK细胞购自妙顺(上海)生物科技有限公司。

2、实验方法(图4a)

a、动物模型构建

将荧光素酶标记的HL60(2.5×10⁴个/g)细胞静脉注射到NCG小鼠体内，通过IVIS光谱成像系统(PerkinElmer)通过生物发光成像监测肿瘤生长情况，确认白血病细胞成功移植。

b、处理NK细胞，将NK细胞(2×10⁶个/mL)接种于完全RPMI1640培养基(ThermoFisher Scientific，11875119)，分以下3个实验组进行处理：

(1)Ctrl组，不使用HKL和NR处理，即NK细胞在不加药的完全RPMI1640培养基中培养24h；

(2)单独使用NR组，NK细胞经过1mM NR预处理24h；

(3)NR和HKL联合使用组，NK细胞经过1mM NR和100μM HKL同时处理24h。

以上实验组均在37℃、5％ CO₂加湿培养箱中培养。

c、小鼠荷瘤后第7天，将步骤b中各实验组处理后的NK细胞(5.0×10⁴个/g)过继转移到小鼠体内(每组5只)，为了支持NK细胞的体内存活，向小鼠腹腔注射IL-2(50000U/只)，每2d注射一次。

d、在指定时间点(7d、14d、28d和35d)分别IVIS光谱成像系统(PerkinElmer)通过生物发光成像监测AML负荷。使用Living image Software(Perkin Elmer)对定量图像数据进行分析。

整个实验过程中，小鼠饲喂条件均为标准的全营养饲喂。

3、实验结果

结果可参见图4，与对照组相比，接受NR和HKL联合处理的NK细胞的小鼠其IL60细胞以及肿瘤的生长得到显著的抑制(图4b和4c)。

以上结果表明，与对照组相比，接受NR以及NR和HKL联合处理的NK细胞的小鼠表现出明显更低的AML负担和更长的生存时间。重要的是，与单独受NR刺激的NK细胞相比，NR和HKL联合刺激的低氧处理的NK细胞表现出肿瘤负荷的显著减少和生存期的延长。这些结果清楚地表明NK细胞通过NR和HKL的协同作用有效地恢复了受损的抗白血病反应。

综合以上实施例结果可知，HKL和NR联合处理能够增强NK细胞对低氧环境的适应能力从而增强NK细胞代谢和杀伤功能，进而增强NK细胞在体内外对肿瘤细胞杀伤。通过低氧靶向NK细胞，促进了白血病细胞凋亡，抑制了白血病的进展。表明靶向NK细胞对低氧环境的适应能够增强NK细胞代谢和杀伤能力，促进AML的治疗。

需要说明的是，本文中以急性髓系白血病作为示例，但并不代表本申请中的小分子药物联用仅适用于急性髓系白血病，本申请中小分子药物联用可增强NK细胞在低氧条件下的代谢和杀伤能力，进而可广泛应用于治疗各种肿瘤，本申请中由于篇幅有限不再具体一一阐述。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种体外非治疗目的的增强低氧条件下NK细胞的代谢和杀伤能力的方法，其特征在于，包括以下步骤：

采用小分子药物联用组合物或者含有所述小分子药物联用组合物的药物体外处理NK细胞；

其中，所述小分子药物联用组合物包括和厚朴酚和烟酰胺核苷，和厚朴酚和烟酰胺核苷的的浓度比例为（0.01~1 mM）：（0.1~10 mM）。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述小分子药物联用组合物为单一的复方制剂或两种单独的单方制剂的组合。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述复方制剂为含有和厚朴酚和烟酰胺核苷的复方制剂；

所述单方制剂的组合为含有和厚朴酚和含有烟酰胺核苷的单方制剂的组合。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述和厚朴酚和烟酰胺核苷可同时、顺序或间隔施药。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述药物还包括药学上任意可接受的辅料和/或载体。

6.一种制备低氧条件下代谢和杀伤能力增强的NK细胞的方法，其特征在于，采用如权利要求1-5任一项所述的方法处理NK细胞。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述NK细胞为CAR-NK细胞。