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CN118843692A - 具有共表达的shRNA和逻辑门系统的免疫细胞 - Google Patents

具有共表达的shRNA和逻辑门系统的免疫细胞 Download PDF

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CN118843692A
CN118843692A CN202280074497.4A CN202280074497A CN118843692A CN 118843692 A CN118843692 A CN 118843692A CN 202280074497 A CN202280074497 A CN 202280074497A CN 118843692 A CN118843692 A CN 118843692A
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CN202280074497.4A
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J·威廉姆斯
M·阮
姚安之
S·桑特罗
A·库珀
J·加格农
A·利特曼
O·坎
N·贝兹曼
K·哈里斯
H·K·马利克·乔杜里
N·艾伦
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Arsenal Biosciences Inc
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Abstract

本文提供了编码结合ALPG/P的嵌合启动受体、结合MSLN的嵌合抗原受体以及靶向FAS、PTPN2和/或TOX的shRNA的重组核酸。还提供了结合ALPG/P的嵌合启动受体、结合MSLN的嵌合抗原受体以及靶向FAS、PTPN2和/或TOX的shRNA的系统，表达此类蛋白质和shRNA的细胞，以及它们的使用方法。

Description

具有共表达的shRNA和逻辑门系统的免疫细胞
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年10月14日提交的美国临时申请第63/255,887号、2021年10月14日提交的美国临时申请第63/255,889号、2021年10月14日提交的美国临时申请第63/255,891号和2022年1月26日提交的美国临时申请第63/303,422号的优先权和权益，所述申请各自据此以引用的方式并入。
序列表
本申请含有已通过EFS网提交并且据此以引用的方式整体并入的序列表。所述ASCII拷贝于20XX年某月XX日创建，名称为XXXXXUS_sequencelisting.xml，并且大小是X,XXX,XXX字节。
背景技术
癌症是一种以细胞不受控制的生长为特征的疾病。已经尝试了许多治疗癌症的方法，包括药物和放射疗法。最近的癌症治疗试图利用人体自身的免疫细胞来攻击癌细胞。一种有前景的方法是使用从患者身上提取的T细胞，并通过对T细胞进行基因工程化来产生嵌合抗原受体或CAR，这种受体蛋白赋予T细胞新的靶向特定蛋白质的能力。这些受体是嵌合的，因为它们将抗原结合与T细胞激活功能结合到单个受体中。
使用CAR-T细胞的免疫疗法是很有前景的，因为修饰的T细胞有可能识别癌细胞，以便更有效地靶向和摧毁它们。
在利用CAR对T细胞进行工程化后，将所得CAR-T细胞引入患者体内以攻击肿瘤细胞。CAR-T细胞可以源自患者自身血液中的T细胞(自体)或来自另一健康供体的T细胞(同种异体)。CAR-T细胞一旦注入患者体内，它们就会与细胞上的靶向抗原接触。CAR-T细胞与抗原结合并被激活。抗原结合后，CAR T细胞可以呈指数增殖，启始肿瘤细胞因子的产生以及靶肿瘤细胞的杀伤。
然而，基于CAR T细胞的免疫疗法仍然存在一些问题和局限性。一些CAR T细胞可能与表达低水平靶抗原的正常细胞接合，导致脱靶毒性。然而，基于CAR T细胞的免疫疗法仍然存在一些局限性。此外，CAR-T细胞可能缺乏外周存活，可能具有降低的扩增和效应功能，容易受到抑制和耗竭，并且可能不会导致记忆T细胞持久性。因此，需要另外的靶向内在途径的疗法以及例如减少脱靶毒性的疗法来解决这些障碍。
发明内容
在一方面，本文提供了一种或多种重组核酸，其中所述一种或多种重组核酸编码：包含启动受体的第一嵌合多肽；包含嵌合抗原受体(CAR)的第二嵌合多肽；和至少一个长度为至少15个核苷酸的核酸序列，其中所述至少一个核酸序列包含以下一项或多项：(1)第一核酸序列，所述与第一核酸序列包含SEQ ID NO:39所示序列的编码人Fas细胞表面死亡受体(FAS)的mRNA的核苷酸1126至1364互补，(2)第二核酸序列，所述第二核酸序列与包含SEQID NO:40所示序列的编码人非受体型蛋白酪氨酸磷酸酶2(PTPN2)的mRNA的核苷酸518至559互补；和(3)第三核酸序列，所述第三核酸序列与包含SEQ ID NO:41所示序列的编码人胸腺细胞选择相关高迁移率族盒(TOX)的mRNA的核苷酸1294至2141互补。
在一些实施方案中，启动受体包含特异性地结合至生殖细胞碱性磷酸酶(ALPG/P)的第一细胞外抗原结合结构域。
在一些实施方案中，第一细胞外抗原结合结构域包含可变重(VH)链序列和可变轻(VL)链序列，所述可变重(VH)链序列包含三个重链CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述可变轻(VL)链序列包含三个轻链CDR序列CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中：CDR-H1包含SEQID NO:1所示的序列，CDR-H2包含SEQ ID NO:2所示的序列，CDR-H3包含SEQ ID NO:3所示的序列，CDR-L1包含SEQ ID NO:4所示的序列，CDR-L2包含SEQ ID NO:5所示的序列，并且CDR-L3包含SEQ ID NO:6所示的序列。
在一些实施方案中，CAR包含特异性地结合至间皮素(MSLN)的第二细胞外抗原结合结构域，并且其中所述第二细胞外抗原结合结构域包含可变重(VH)链序列，所述可变重(VH)链序列包含三个重链CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中：CDR-H1包含SEQ ID NO:14所示的序列，CDR-H2包含SEQ ID NO:15所示的序列，并且CDR-H3包含SEQ ID NO:16所示的序列。
在一些实施方案中，所述至少一个核酸序列包含以下各项：(1)第一核酸序列，所述第一核酸序列与包含SEQ ID NO:39所示序列的编码人FAS的mRNA的核苷酸1126至1364互补；和(2)第二核酸序列，所述第二核酸序列与包含SEQ ID NO:40所示序列的编码人PTPN2的mRNA的核苷酸518至559互补。
在一些实施方案中，CAR包含特异性地结合至间皮素(MSLN)的第二细胞外抗原结合结构域。
在一些实施方案中，第二细胞外抗原结合结构域包含可变重(VH)链序列，所述可变重(VH)链序列包含三个重链CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中：CDR-H1包含SEQ IDNO:14所示的序列，CDR-H2包含SEQ ID NO:15所示的序列，并且CDR-H3包含SEQ ID NO:16所示的序列。
在一些实施方案中，第二细胞外抗原结合结构域包含单结构域抗体，所述单结构域抗体包含可变重(VHH)链序列，所述可变重(VHH)链序列包含三个重链CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中：CDR-H1包含SEQ ID NO:10所示的序列，CDR-H2包含SEQ ID NO:11所示的序列，并且CDR-H3包含SEQ ID NO:12所示的序列。
在一方面，本文提供了一种或多种重组核酸，其中所述一种或多种重组核酸编码：包含启动受体的第一嵌合多肽，所述启动受体包含特异性地结合胎盘/生殖细胞碱性磷酸酶(ALPG/P)的第一细胞外抗原结合结构域，其中所述第一细胞外抗原结合结构域包含可变重(VH)链序列和可变轻(VL)链序列，所述可变重(VH)链序列包含三个重链CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述可变轻(VL)链序列包含三个轻链CDR序列CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中：CDR-H1包含SEQ ID NO:1所示的序列，CDR-H2包含SEQ ID NO:2所示的序列，CDR-H3包含SEQ ID NO:3所示的序列，CDR-L1包含SEQ ID NO:4所示的序列，CDR-L2包含SEQ ID NO:5所示的序列，并且CDR-L3包含SEQ ID NO:6所示的序列；包含嵌合抗原受体(CAR)的第二嵌合多肽；第一核酸序列，所述第一核酸序列与包含SEQ ID NO:39所示序列的编码人FAS的mRNA的核苷酸1126至1364互补；和第二核酸序列，所述第二核酸序列与包含SEQ ID NO:40所示序列的编码人PTPN2的mRNA的核苷酸518至559互补，或者与包含SEQ ID NO:41所示序列的编码人TOX的mRNA的核苷酸1294至2141互补。
在一些实施方案中，第一细胞外抗原结合结构域VH链序列包含SEQ ID NO:7所示的序列。
在一些实施方案中，第一细胞外抗原结合结构域VL链序列包含SEQ ID NO:8所示的序列。
在一些实施方案中，第一细胞外抗原结合结构域包含SEQ ID NO:9所示的序列。
在一些实施方案中，CAR包含特异性地结合至间皮素(MSLN)的第二细胞外抗原结合结构域。
在一些实施方案中，第二细胞外抗原结合结构域包含可变重(VH)链序列，所述可变重(VH)链序列包含三个重链CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中：CDR-H1包含SEQ IDNO:14所示的序列，CDR-H2包含SEQ ID NO:15所示的序列，并且CDR-H3包含SEQ ID NO:16所示的序列。
在一些实施方案中，第二细胞外抗原结合结构域VH包含如SEQ ID NO:17所示的序列。
在一些实施方案中，第二细胞外抗原结合结构域包含单结构域抗体，所述单结构域抗体包含可变重(VHH)链序列，所述可变重(VHH)链序列包含三个重链CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中：CDR-H1包含SEQ ID NO:10所示的序列，CDR-H2包含SEQ ID NO:11所示的序列，并且CDR-H3包含SEQ ID NO:12所示的序列。
在一些实施方案中，第二细胞外抗原结合结构域VHH链序列包含SEQ ID NO:13所示的序列。
在一些实施方案中，第二核酸序列与包含SEQ ID NO:40所示序列的编码人PTPN2的mRNA的核苷酸518至559互补。
在一些实施方案中，重组核酸包含选自由SEQ ID NO:168、167或166所示序列组成的组的序列。
在一些实施方案中，第二核酸序列与包含SEQ ID NO:41所示序列的编码人TOX的mRNA的核苷酸1294至2141互补。
在一方面，本文提供了重组核酸，所述重组核酸包含长度为至少15个核苷酸的核酸序列，所述核酸序列与包含SEQ ID NO:39所示序列的编码人FAS的mRNA的核苷酸1126至1364互补。
在一方面，本文提供了重组核酸，所述重组核酸包含长度为至少15个核苷酸的核酸序列，所述核酸序列与包含SEQ ID NO:40所示序列的编码人非受体型蛋白酪氨酸磷酸酶2(PTPN2)的mRNA的核苷酸518至559互补。
在一方面，本文提供了重组核酸，所述重组核酸包含长度为至少15个核苷酸的核酸序列，所述核酸序列与包含SEQ ID NO:41所示序列的编码人胸腺细胞选择相关高迁移率族盒(TOX)的mRNA的核苷酸1294至2141互补。
在一方面，本文提供了一种或多种重组核酸，所述重组核酸包含长度为至少15个核苷酸的第一核酸序列，所述第一核酸序列与包含SEQ ID NO:39所示序列的编码人FAS的mRNA的核苷酸1126至1364互补；和长度为至少15个核苷酸的第二核酸序列，所述第二核酸序列与包含SEQ ID NO:40所示序列的编码人PTPN2的mRNA的核苷酸518至559互补。
在一方面，本文提供了一种或多种重组核酸，所述重组核酸包含长度为至少15个核苷酸的第一核酸，所述第一核酸与包含SEQ ID NO:39所示序列的编码人FAS的mRNA的核苷酸1126至1364互补；和长度为至少15个核苷酸的第二核酸，所述第二核酸与包含SEQ IDNO:41所示序列的编码人TOX的mRNA的核苷酸1294至2141互补。
在一些实施方案中，第一、第二和第三核酸序列的长度为至少16个、17个、18个、19个、20个、21个或22个核苷酸。
在一些实施方案中，第一、第二和第三核酸序列是短发夹RNA(shRNA)、小干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)或反义寡核苷酸。
在一些实施方案中，第一、第二和第三核酸序列是shRNA。
在一些实施方案中，第一核酸序列包含选自由SEQ ID NO:42-71所示序列组成的组的序列。
在一些实施方案中，第一核酸序列包含SEQ ID NO:49所示的序列。
在一些实施方案中，与不包含核酸的对照细胞相比，所述第一核酸将免疫细胞中FAS的表达降低至少50％、55％、60％、65％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。
在一些实施方案中，第二核酸序列包含选自由SEQ ID NO:72-97所示序列组成的组的序列。
在一些实施方案中，第二核酸序列包含SEQ ID NO:82所示的序列。
在一些实施方案中，第一核酸序列包含选自由SEQ ID NO:42至71所示序列组成的组的序列；并且第二核酸序列包含选自由SEQ ID NO:72至97所示序列组成的组的序列。
在一些实施方案中，第一核酸序列包含SEQ ID NO:49所示的序列，并且第二核酸序列包含SEQ ID NO:82所示的序列。
在一些实施方案中，与不包含核酸的对照细胞相比，所述第二核酸将免疫细胞中PTPN2的表达降低至少50％、55％、60％、65％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。
在一些实施方案中，第二核酸序列包含选自由SEQ ID NO:98-125所示序列组成的组的序列。
在一些实施方案中，第二核酸序列包含SEQ ID NO:99或104所示的序列。
在一些实施方案中，第一核酸序列包含选自由SEQ ID NO:42至71所示序列组成的组的序列；并且第二核酸序列包含选自由SEQ ID NO:98至125所示序列组成的组的序列。
在一些实施方案中，第一核酸序列包含SEQ ID NO:49所示的序列，并且第二核酸序列包含SEQ ID NO:SEQ ID NO:99或104所示的序列。
在一些实施方案中，与不包含核酸的对照细胞相比，所述第二核酸将免疫细胞中TOX的表达降低至少50％、55％、60％、65％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。
在一方面，本文提供了一种或多种重组核酸，其中所述一种或多种重组核酸编码：包含启动受体的第一嵌合多肽；包含嵌合抗原受体(CAR)的第二嵌合多肽，所述嵌合抗原受体包含特异性地结合至间皮素(MSLN)的细胞外抗原结合结构域，其中所述细胞外抗原结合结构域包含单结构域抗体，所述单结构域抗体包含可变重(VHH)链序列，所述可变重(VHH)链序列包含三个重链CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中：CDR-H1包含SEQ ID NO:10所示的序列，CDR-H2包含SEQ ID NO:11所示的序列，并且CDR-H3包含SEQ ID NO:12所示的序列；和长度为至少15个核苷酸的第一核酸序列，其中所述第一核酸序列与包含SEQ ID NO:39所示序列的编码人FAS的mRNA的核苷酸1126至1364互补；和第二核酸序列，其中所述第二核酸序列与包含SEQ ID NO:40所示序列的编码人PTPN2的mRNA的核苷酸518至559互补，或者与包含SEQ ID NO:41所示序列的编码人TOX的mRNA的核苷酸1294至2141互补。
在一些实施方案中，VHH链序列包含SEQ ID NO:13所示的序列。
在一方面，本文提供了一种或多种重组核酸，其中所述一种或多种重组核酸编码：包含启动受体的第一嵌合多肽；包含嵌合抗原受体(CAR)的第二嵌合多肽，所述嵌合抗原受体包含特异性地结合至间皮素(MSLN)的细胞外抗原结合结构域，其中所述第二细胞外抗原结合结构域包含可变重(VH)链序列，所述可变重(VH)链序列包含三个重链CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中：CDR-H1包含SEQ ID NO:14所示的序列，CDR-H2包含SEQ ID NO:15所示的序列，并且CDR-H3包含SEQ ID NO:16所示的序列；和长度为至少15个核苷酸的第一核酸序列，其中所述第一核酸序列与包含SEQ ID NO:39所示序列的编码人FAS的mRNA的核苷酸1126至1364互补；和第二核酸序列，其中所述第二核酸序列与包含SEQ ID NO:40所示序列的编码人PTPN2的mRNA的核苷酸518至559互补，或者与包含SEQ ID NO:41所示序列的编码人TOX的mRNA的核苷酸1294至2141互补。
在一些实施方案中，VH包含如SEQ ID NO:17所示的序列。
在一方面，本文提供了一种或多种重组核酸，其中所述一种或多种重组核酸编码：包含启动受体的第一嵌合多肽，所述启动受体包含特异性地结合至生殖细胞碱性磷酸酶(ALPG/P)的第一细胞外抗原结合结构域；和包含CAR的第二嵌合多肽，所述CAR包含特异性地结合至间皮素(MSLN)的第二细胞外抗原结合结构域；和长度为至少15个核苷酸的第一核酸序列，其中所述第一核酸序列与包含SEQ ID NO:39所示序列的编码人FAS的mRNA的核苷酸1126至1364互补；和第二核酸序列核酸序列，其中所述第二核酸序列与包含SEQ ID NO:40所示序列的编码人PTPN2的mRNA的核苷酸518至559互补，或者与包含SEQ ID NO:41所示序列的编码人TOX的mRNA的核苷酸1294至2141互补。
在一些实施方案中，第二核酸序列与包含SEQ ID NO:40所示序列的编码人PTPN2的mRNA的核苷酸518至559互补。
在一些实施方案中，重组核酸包含选自由SEQ ID NO:168、167或166所示序列组成的组的序列。
在一些实施方案中，第二核酸序列与包含SEQ ID NO:41所示序列的编码人TOX的mRNA的核苷酸1294至2141互补。
在一些实施方案中，第一和第二核酸序列的长度为至少16个、17个、18个、19个、20个、21个或22个核苷酸。
在一些实施方案中，第一和第二核酸是短发夹RNA(shRNA)、小干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)或反义寡核苷酸。
在一些实施方案中，第一和第二核酸是shRNA。
在一些实施方案中，第一核酸序列包含选自由SEQ ID NO:42-71所示序列组成的组的序列。
在一些实施方案中，第一核酸序列包含SEQ ID NO:49所示的序列。
在一些实施方案中，与不包含核酸的对照细胞相比，所述第一核酸将免疫细胞中FAS的表达降低至少50％、55％、60％、65％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。
在一些实施方案中，第二核酸序列包含选自由SEQ ID NO:72-97所示序列组成的组的序列。
在一些实施方案中，第二核酸序列包含SEQ ID NO:82所示的序列。
在一些实施方案中，与不包含核酸的对照细胞相比，所述第二核酸将免疫细胞中PTPN2的表达降低至少50％、55％、60％、65％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。
在一些实施方案中，第二核酸序列包含选自由SEQ ID NO:98-125所示序列组成的组的序列。
在一些实施方案中，第二核酸序列包含SEQ ID NO:99或104所示的序列。
在一些实施方案中，与不包含核酸的对照细胞相比，所述第二核酸将免疫细胞中TOX的表达降低至少50％、55％、60％、65％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。
在一些实施方案中，启动受体从N末端至C末端包含第一细胞外抗原结合结构域；包含一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点的第一跨膜结构域；和包含人或人源化转录效应物的细胞内结构域，其中ALPG/P与第一细胞外抗原结合结构域的结合导致在所述一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点处的裂解。
在一些实施方案中，启动受体还包含定位于第一细胞外抗原结合结构域与第一跨膜结构域之间的第一铰链结构域。
在一些实施方案中，第一铰链结构域包含CD8α或截短的CD8α铰链结构域。
在一些实施方案中，第一铰链包含如SEQ ID NO:18所示的序列。
在一些实施方案中，第一跨膜结构域包含Notch1跨膜结构域。
在一些实施方案中，第一跨膜结构域包含如SEQ ID NO:19所示的序列。
在一些实施方案中，细胞内结构域包含HNF1a/p65结构域或Gal4/VP64结构域。
在一些实施方案中，细胞内结构域包含SEQ ID NO:23所示的序列。
在一些实施方案中，启动受体还包含在第一跨膜结构域与细胞内结构域之间的终止转移序列。
在一些实施方案中，终止转移序列包含如SEQ ID NO:20所示的序列。
在一些实施方案中，启动受体包含如SEQ ID NO:24所示的序列。
在一些实施方案中，CAR从N末端到C末端包含第二细胞外抗原结合结构域；第二跨膜结构域；细胞内共刺激结构域；和细胞内激活结构域。
在一些实施方案中，第二细胞外抗原结合结构域特异性地结合至间皮素(MSLN)，其中所述第二细胞外抗原结合结构域包含单结构域抗体，所述单结构域抗体包含可变重(VHH)链序列，所述可变重(VHH)链序列包含三个重链CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中：CDR-H1包含SEQ ID NO:10所示的序列，CDR-H2包含SEQ ID NO:11所示的序列，并且CDR-H3包含SEQ ID NO:12所示的序列。
在一些实施方案中，VHH链序列包含SEQ ID NO:13所示的序列。
在一些实施方案中，第二细胞外抗原结合结构域特异性地结合至间皮素(MSLN)，其中所述细胞外抗原结合结构域包含可变重(VH)链序列，所述可变重(VH)链序列包含三个重链CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中：CDR-H1包含SEQ ID NO:14所示的序列，CDR-H2包含SEQ ID NO:15所示的序列，并且CDR-H3包含SEQ ID NO:16所示的序列。
在一些实施方案中，VH链序列包含SEQ ID NO:17所示的序列。
在一些实施方案中，CAR包含第二铰链结构域。
在一些实施方案中，第二铰链结构域包含CD8α或截短的CD8α铰链结构域。
在一些实施方案中，第二跨膜结构域包含CD8α跨膜结构域。
在一些实施方案中，细胞内共刺激结构域包含4-1BB结构域。
在一些实施方案中，细胞内激活结构域包含CD3ζ结构域。
在一些实施方案中，CAR包含如SEQ ID NO:30或31所示的序列。
在一些实施方案中，如果单个靶细胞表达ALPG/P和MSLN每一者，则启动受体和CAR能够结合至所述靶细胞。
在一些实施方案中，靶细胞是人细胞。
在一些实施方案中，靶细胞是癌细胞。
在一些实施方案中，癌细胞是固体癌细胞或液体癌细胞。
在一些实施方案中，癌细胞是卵巢癌、输卵管癌、原发性腹膜癌、子宫癌、间皮瘤、宫颈癌或胰腺癌。
在一些实施方案中，重组核酸包含两个或更多个核酸片段。
在一些实施方案中，重组核酸还包含可操作地连接至编码CAR的核苷酸序列的诱导型启动子。
在一些实施方案中，重组核酸还包含可操作地连接至编码启动受体的核苷酸序列的第一组成型启动子。
在一些实施方案中，重组核酸还包含可操作地连接至编码所述嵌合抗原受体的核苷酸序列的诱导型启动子和可操作地连接至编码所述启动受体的核苷酸序列的组成型启动子。
在一些实施方案中，重组核酸还包含可操作地连接至编码与人FAS互补的第一核酸的核苷酸序列的第二组成型启动子。
在一些实施方案中，重组核酸还包含可操作地连接至编码与人PTPN2或TOX互补的第二核酸的核苷酸序列的第二组成型启动子。
在一些实施方案中，重组核酸还包含可操作地连接至编码与人FAS互补的第一核酸或与人PTPN2或TOX互补的第二核酸的核苷酸序列的第二组成型启动子。
在一些实施方案中，重组核酸在5’至3’方向上包含：第一组成型启动子；编码启动受体的核苷酸序列；第二组成型启动子；编码与人FAS、人PTPN2或人TOX互补的第一核酸的核苷酸序列；诱导型启动子；和编码嵌合抗原受体的核苷酸序列。
在一些实施方案中，重组核酸在5’至3’方向上包含：第一组成型启动子；编码启动受体的核苷酸序列；第二组成型启动子；编码与人FAS互补的第一核酸的核苷酸序列；编码与人PTPN2或TOX互补的第二第一核酸的核苷酸序列；诱导型启动子；和编码嵌合抗原受体的核苷酸序列。
在一些实施方案中，重组核酸在5’至3’方向上包含：诱导型启动子；编码嵌合抗原受体的核苷酸序列；第二组成型启动子；编码与人FAS互补的第一核酸的核苷酸序列；编码与人PTPN2或TOX互补的第二第一核酸的核苷酸序列；第一组成型启动子；和编码启动受体的核苷酸序列。
在一些实施方案中，编码启动受体的核苷酸序列包含SEQ ID NO:36所示的序列。
在一些实施方案中，编码嵌合抗原受体的核苷酸序列包含SEQ ID NO:37或38所示的序列。
在一些实施方案中，重组核酸在一些实施方案中，重组核酸还包含与宿主细胞染色体中的插入位点互补的5'同源定向修复臂和3'同源定向修复臂。
在一些实施方案中，重组核酸还包含编码自切除2A肽(P2A)的核苷酸序列。
在一些实施方案中，P2A处于编码嵌合抗原受体的核苷酸序列的3’端。
在一些实施方案中，P2A处于编码启动受体的核苷酸序列的3’端。
在一些实施方案中，重组核酸还包含土拨鼠肝炎病毒翻译后调控元件(WPRE)。
在一些实施方案中，WPRE处于编码嵌合抗原受体的核苷酸序列的3’端和编码启动受体的核苷酸序列的5’端，或者其中所述WPRE处于编码启动受体的核苷酸序列的3’端和编码嵌合抗原受体的核苷酸序列的5’端。
在一些实施方案中，重组核酸还包含SV40多聚A元件。
在一些实施方案中，将核酸并入表达盒或表达载体中。
在一些实施方案中，表达载体是非病毒载体。
在一方面，本文提供了包含本文公开的重组核酸的表达载体。
在一些实施方案中，重组核酸的5'端和3'端包含与原代细胞基因组中插入位点侧翼的基因组序列同源的核苷酸序列。
在一些实施方案中，插入位点位于T细胞受体α恒定(TRAC)基因座或基因组安全港(GSH)基因座。
在一些实施方案中，GHS基因座是GS94基因座。
在一方面，本文提供了免疫细胞，所述免疫细胞包含：至少一种本文公开的重组核酸；和/或本文公开的载体。
在一些实施方案中，所述免疫细胞是原代人免疫细胞。
在一些实施方案中，原代人免疫细胞是自体免疫细胞。
在一些实施方案中，所述原代免疫细胞是自然杀伤(NK)细胞、T细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、原代T细胞或T细胞祖细胞。
在一些实施方案中，所述原代免疫细胞是原代T细胞。
在一些实施方案中，所述原代免疫细胞是原代人T细胞。
在一些实施方案中，所述原代免疫细胞是无病毒的。
在一些实施方案中，免疫细胞是自体免疫细胞。
在一些实施方案中，免疫细胞是同种异体免疫细胞。
在一方面，本文提供了包含至少一种重组核酸的原代免疫细胞，所述重组核酸包含：启动受体，所述启动受体包含特异性地结合至ALPG/P的第一细胞外抗原结合结构域；嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包含特异性地结合至MSLN的第二细胞外抗原结合结构域；长度为至少15个核苷酸的第一核酸序列，其中所述第一核酸序列与包含SEQ ID NO:39所示序列的编码人FAS的mRNA的核苷酸1126至1364互补；和长度为至少15个核苷酸的第二核酸序列，其中所述第二核酸序列与包含SEQ ID NO:40所示序列的编码人PTPN2的mRNA的核苷酸518至559互补，或者与包含SEQ ID NO:41所示序列的编码人TOX的mRNA的核苷酸1294至2141互补；其中所述重组核酸插入原代免疫细胞的基因组的靶区中，并且其中所述原代免疫细胞不包含用于将重组核酸引入原代免疫细胞中的病毒载体。
在一方面，本文提供了原代免疫细胞，所述原代免疫细胞包含至少一种重组核酸，所述重组核酸包含：包含SEQ ID NO:49所示序列的第一核酸；和包含SEQ ID NO:82所示序列的第二核酸，所述重组核酸插入所述原代免疫细胞的基因组的靶区中，并且其中所述原代免疫细胞不包含用于将所述重组核酸引入所述原代免疫细胞中的病毒载体。
在一方面，本文提供了原代免疫细胞，所述原代免疫细胞包含至少一种重组核酸，所述重组核酸包含：包含SEQ ID NO:49所示序列的第一核酸；和包含SEQ ID NO:SEQ IDNO:99或104所示序列的第二核酸，所述重组核酸插入所述原代免疫细胞的基因组的靶区中，并且其中所述原代免疫细胞不包含用于将所述重组核酸引入所述原代免疫细胞中的病毒载体。
在一方面，本文提供了包含核糖核蛋白(RNP)-重组核酸复合物的活的无病毒的原代细胞，其中所述RNP包含核酸酶结构域和指导RNA，并且其中所述重组核酸编码：启动受体，所述启动受体包含特异性地结合至ALPG/P的第一细胞外抗原结合结构域；嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包含特异性地结合至MSLN的第二细胞外抗原结合结构域；长度为至少15个核苷酸的第一核酸序列，其中所述第一核酸序列与包含SEQ ID NO:39所示序列的编码人FAS的mRNA的核苷酸1126至1364互补；和长度为至少15个核苷酸的第二核酸序列，其中所述第二核酸序列与包含SEQ ID NO:40所示序列的编码人PTPN2的mRNA的核苷酸518至559互补，或者与包含SEQ ID NO:41所示序列的编码人TOX的mRNA的核苷酸1294至2141互补；并且其中所述重组核酸的5’端和3’端包含与所述原代细胞的基因组中的插入位点侧翼的基因组序列同源的核苷酸序列。
在一方面，本文提供了活的无病毒的原代细胞，所述活的无病毒的原代细胞包含核糖核蛋白复合物(RNP)-重组核酸复合物，其中所述RNP包含核酸酶结构域和指导RNA，其中重组核酸包含：包含SEQ ID NO:49所示序列的第一核酸；和包含SEQ ID NO:82所示序列的第二核酸，并且其中所述重组核酸的5’端和3’端包含与所述原代细胞的基因组中的插入位点侧翼的基因组序列同源的核苷酸序列。
在一方面，本文提供了活的无病毒的原代细胞，所述活的无病毒的原代细胞包含核糖核蛋白复合物(RNP)-重组核酸复合物，其中所述RNP包含核酸酶结构域和指导RNA，其中重组核酸包含：包含SEQ ID NO:49所示序列的第一核酸；和包含SEQ ID NO:SEQ ID NO:99或104所示序列的第二核酸，并且其中所述重组核酸的5’端和3’端包含与所述原代细胞的基因组中的插入位点侧翼的基因组序列同源的核苷酸序列。
在一些实施方案中，细胞包含选自由SEQ ID NO:168、167或166所示序列组成的组的序列。
在一些实施方案中，与不包含第一核酸的对照细胞相比，所述第一核酸将免疫细胞中FAS的表达降低至少50％、55％、60％、65％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。
在一些实施方案中，与不包含第一核酸的对照细胞相比，免疫细胞中FAS的表达降低至少50％、55％、60％、65％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。
在一些实施方案中，与不包含第二核酸的对照细胞相比，所述第二核酸将免疫细胞中PTPN2的表达降低至少50％、55％、60％、65％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。
在一些实施方案中，与不包含第二核酸的对照细胞相比，免疫细胞中PTPN2的表达降低至少50％、55％、60％、65％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。
在一些实施方案中，与不包含第二核酸的对照细胞相比，所述第二核酸将免疫细胞中TOX的表达降低至少50％、55％、60％、65％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。
在一些实施方案中，与不包含第二核酸的对照细胞相比，免疫细胞中TOX的表达降低至少50％、55％、60％、65％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。
在一些实施方案中，通过核酸测定或蛋白质测定来确定FAS、PTPN2和/或TOX的表达。
在一些实施方案中，核酸测定包括聚合酶链式反应(PCR)、定量PCR(qPCR)、RT-qPCR、微阵列、基因阵列或RNAseq中的至少一者。
在一些实施方案中，蛋白质测定包括免疫印迹、荧光激活细胞分选、流式细胞术、磁激活细胞分选或基于亲和力的细胞分离中的至少一者。
在一方面，本文提供了包含多个本文所公开的免疫细胞的细胞群体。
在一方面，本文提供了药物组合物，所述药物组合物包含本文公开的免疫细胞或本文公开的细胞群体，以及药学上可接受的赋形剂。
在一方面，本文提供了药物组合物，所述药物组合物包含本文公开的重组核酸或本文公开的载体，以及药学上可接受的赋形剂。
在一方面，本文提供了编辑免疫细胞的方法，所述方法包括：提供核糖核蛋白(RNP)-重组核酸复合物，其中所述RNP包含核酸酶结构域和指导RNA，其中所述重组核酸包含本文公开的重组核酸，并且其中所述重组核酸的5'端和3'端包含与免疫细胞基因组中插入位点侧翼的基因组序列同源的核苷酸序列；以非病毒方式将RNP-重组核酸复合物引入免疫细胞中，其中所述指导RNA与原代免疫细胞基因组的靶区特异性地杂交，并且其中核酸酶结构域使靶区裂解以产生在免疫细胞基因组中的插入位点；以及通过将如本文所公开的重组核酸插入免疫细胞基因组中的插入位点中来编辑免疫细胞。
在一些实施方案中，以非病毒方式引入包括电穿孔。
在一些实施方案中，所述核酸酶结构域包含CRISPR相关核酸内切酶(Cas)，任选地是Cas9核酸酶。
在一些实施方案中，所述细胞的基因组的所述靶区是T细胞受体α恒定(TRAC)基因座或基因组安全港(GSH)基因座。
在一些实施方案中，GSH基因座是GS94基因座。
在一些实施方案中，重组核酸是双链重组核酸或单链重组核酸。
在一些实施方案中，重组核酸是线状重组核酸或环状重组核酸，任选地其中所述环状重组核酸是质粒。
在一些实施方案中，所述免疫细胞是原代人免疫细胞。
在一些实施方案中，免疫细胞是同种异体免疫细胞。
在一些实施方案中，免疫细胞是自体免疫细胞。
在一些实施方案中，所述免疫细胞是自然杀伤(NK)细胞、T细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、原代T细胞或T细胞祖细胞。
在一些实施方案中，免疫细胞是原代T细胞。
在一些实施方案中，免疫细胞是原代人T细胞。
在一些实施方案中，免疫细胞是无病毒的。
在一些实施方案中，所述方法还包括从患者获得免疫细胞以及在体外引入重组核酸。
在一方面，本文提供了治疗受试者的疾病的方法，所述方法包括向受试者施用如本文所公开的免疫细胞或如本文所公开的药物组合物。
在一些实施方案中，所述疾病是癌症。
在一些实施方案中，癌症是实体癌或液体癌。
在一些实施方案中，癌症是卵巢癌、输卵管癌、原发性腹膜癌、子宫癌、间皮瘤、宫颈癌或胰腺癌。
在一些实施方案中，施用免疫细胞增强受试者的免疫应答。
在一些实施方案中，增强的免疫应答是适应性免疫应答。
在一些实施方案中，增强的免疫应答是先天免疫应答。
在一些实施方案中，增强的免疫应答是增加的至少一种细胞因子或趋化因子的表达。
在一些实施方案中，所述至少一种细胞因子或趋化因子是IL-2或IFNγ。
在一些实施方案中，所述方法还包括与免疫细胞同时或在免疫细胞之后向所述受试者施用免疫疗法。
在一方面，本文提供了抑制受试者中的靶细胞的方法，所述方法包括向受试者施用本文公开的免疫细胞，其中所述免疫细胞抑制靶细胞。
在一些实施方案中，靶细胞表达ALPG/P和MSLN。
在一些实施方案中，靶细胞是癌细胞。
在一方面，本文提供了诱导免疫细胞中嵌合抗原受体与启动受体的表达的方法，所述方法包括：获得包含本文公开的重组核酸的免疫细胞和/或本文公开的载体；以及使免疫细胞与表达ALPG/P和MSLN的靶细胞接触，其中启动受体与靶细胞上的ALPG/P的结合诱导启动受体的激活和嵌合抗原受体的表达。
在一方面，本文提供了调节免疫细胞的活性的方法，所述方法包括：获得包含本文公开的重组核酸的免疫细胞和/或本文公开的载体；以及使免疫细胞与表达ALPG/P和MSLN的靶细胞接触，其中启动受体与靶细胞上的ALPG/P的结合诱导启动受体的激活和嵌合抗原受体的表达，并且其中嵌合抗原受体与靶细胞上的MSLN的结合调节免疫细胞的活性。
在一些实施方案中，免疫细胞活性的调节包括增强免疫应答。
在一些实施方案中，增强的免疫应答是适应性免疫应答。
在一些实施方案中，增强的免疫应答是先天免疫应答。
在一些实施方案中，免疫细胞活性是增加的至少一种细胞因子或趋化因子的表达。
在一些实施方案中，所述至少一种细胞因子或趋化因子是IL-2或IFNγ。
在一些实施方案中，与不包含第一核酸的对照细胞相比，免疫细胞中FAS的表达降低至少50％、55％、60％、65％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。
在一些实施方案中，与不包含第二核酸的对照细胞相比，免疫细胞中PTPN2的表达降低至少50％、55％、60％、65％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。
在一些实施方案中，与不包含第二核酸的对照细胞相比，免疫细胞中TOX的表达降低至少50％、55％、60％、65％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。
在一些实施方案中，通过核酸测定或蛋白质测定来确定免疫细胞中FAS、PTPN2和/或TOX的表达。
在一些实施方案中，核酸测定包括聚合酶链式反应(PCR)、定量PCR(qPCR)、RT-qPCR、微阵列、基因阵列或RNAseq中的至少一者。
在一些实施方案中，蛋白质测定包括免疫印迹、荧光激活细胞分选、流式细胞术、磁激活细胞分选或基于亲和力的细胞分离中的至少一者。
附图说明
参考以下描述和附图将更好地理解本发明的这些和其他特征、方面和优点，在附图中：
图1显示了T细胞激活测定的逻辑门表达的示意图。
图2提供了流式细胞术数据，显示表达两个逻辑门(LG1和LG3)的T细胞在不存在启动抗原刺激以及存在T细胞激活刺激的情况下表现出启动受体表达，但CAR表达极少。
图3A显示从阴性对照仅RNP T细胞中未观察到细胞毒性。图3B显示了表达逻辑门的T细胞针对单抗原阳性K562-ALPG细胞的极少活性。图3C显示表达逻辑门的T细胞没有针对单抗原阳性K562-MSLN的活性。图3D显示了表达逻辑门的T细胞的肿瘤特异性活性。
图4显示，相对于逻辑门3T细胞，逻辑门1T细胞表现出更快速和更完全的K562-ALPG/MSLN靶细胞杀伤。
图5A显示了与K562细胞系一起孵育后表达逻辑门的T细胞(LG1和LG3)、表达CAR的T细胞或阴性对照细胞的细胞因子产生。图5B显示了与K562MSLN细胞系一起孵育后表达逻辑门的T细胞(LG1和LG3)、表达CAR的T细胞或阴性对照细胞的细胞因子产生。图5C显示了与K562 ALPG细胞系一起孵育后表达逻辑门的T细胞(LG1和LG3)、表达CAR的T细胞或阴性对照细胞的细胞因子产生。图5D显示了与K562 ALPG/MSLN细胞系一起孵育后表达逻辑门的T细胞(LG1和LG3)、表达CAR的T细胞或阴性对照细胞的细胞因子产生。
图6A显示了AsPC-1细胞、K562 ALPG/MSLN细胞和K562-EFG细胞中的ALPG表达。图6B显示了AsPC-1细胞和原发性卵巢癌肿瘤中的ALPG IHC染色。
图7A显示了AsPC-1细胞、K562 ALPG/MSLN细胞和K562-EFG细胞中的MSLN表达。图7B显示了AsPC-1细胞和原发性卵巢癌肿瘤中的ALPG IHC染色。
图8A显示了K562ALPG低和高表达细胞中的ALPG表达。图8B显示了K562ALPG低和高表达细胞、AsPC-1细胞和K562-EFG细胞中的ALPG表达。图8C显示了与K562ALPG低和高表达细胞一起孵育之前和之后工程化T细胞上的启动受体和CAR表达。
图9A显示了SKOV3-EFG细胞、K562 ALPG/MSLN细胞和K562 EFG细胞中的ALPG表达。图9B显示了SKOV3-WT细胞、K562 ALPG/MSLN细胞和K562EFG细胞中的MSLN表达。图9C显示了表达指示LG或CAR的T细胞与SKOV3-EFG细胞一起孵育后的IL-2细胞因子产生。图9D显示了表达指示LG或CAR的T细胞与SKOV3-EFG细胞一起孵育后的IFNγ细胞因子产生。
图10A显示了卵巢癌样本上的ALPG表达。图10B显示了卵巢癌样本上的MSLN表达。图10C显示了在与表达指示逻辑门或CAR的T细胞一起孵育的ALPG阴性细胞的百分比增加下靶细胞杀伤百分比的剂量测定。
图11A显示了在CA125存在下表达逻辑门的T细胞或表达CAR的T细胞与靶细胞一起孵育后的IL-2细胞因子产生。图11B显示了在MSLN存在下表达逻辑门的T细胞或表达CAR的T细胞与靶细胞一起孵育后的IL-2细胞因子产生。
图12A显示了K562双侧腹部模型中在用组成型CAR治疗后模拟健康间皮内层的K562MSLN肿瘤的肿瘤体积。图12B显示了用组成型CAR治疗后模拟中靶肿瘤的K562ALPG/MSLN肿瘤的肿瘤体积。图12C显示了用逻辑门1T细胞治疗后K562MSLN肿瘤的肿瘤体积。图12D显示了用逻辑门1T细胞治疗后K562ALPG/MSLN肿瘤的肿瘤体积。图12E显示了用逻辑门3T细胞治疗后K562MSLN肿瘤的肿瘤体积。图12F显示了在用逻辑门3T细胞治疗后K562ALPG/MSLN肿瘤的肿瘤体积。在每幅图中，较低的线显示用指示T细胞治疗后的肿瘤体积，较高的线显示用对照T细胞治疗后的肿瘤体积。
图13A显示了用低剂量的指示工程化T细胞治疗后MSTO模型中的肿瘤体积。图13B显示了用中等“应激”剂量的指示工程化T细胞治疗后的肿瘤体积。图13A显示了用高剂量的指示工程化T细胞治疗后的肿瘤体积。图13D显示了用指示T细胞治疗后血液样本中的T细胞扩增。
图14A显示了用对照T细胞治疗后在外周血中发现的T细胞的流式分析。图14B显示了用中等剂量的表达CAR 1的T细胞治疗后在外周血中发现的T细胞的流式分析。图14C显示了用中等剂量的表达LG1的T细胞治疗后在外周血中发现的T细胞的流式分析。图14D显示了用高剂量的表达LG1的T细胞、表达CAR的T细胞或阴性对照细胞治疗后在外周血中发现的T细胞的流式分析。
图15A显示了9天扩增后具有指示shRNA的经编辑的细胞的百分比。图15B显示了9天扩增后具有指示shRNA的经编辑的细胞的总数。
图16显示了组合使用时两种指示基因的靶基因敲低。
图17A显示，靶向FAS、PTPN2和TOX的shRNA模块在静息条件下编辑后在至少7周内提供稳定的FAS敲低。图17B显示，在编辑后6天FAS、PTPN2和NR4A1蛋白水平也显著降低。
图18显示，T细胞中的靶基因敲低在整个慢性刺激过程中得以维持。
图19A显示shRNA在细胞中有强烈的FAS敲低。图19B显示，在用抗FAS激活抗体处理24小时后，如以仅具有对照shRNA的T细胞作归一化，具有FAS敲低的T细胞保留超过80％的活力。
图20显示，用组合shRNA模块工程化的T细胞没有表现出转化风险增加的证据。
图21显示，在用表达靶抗原的K562细胞系进行的48小时荧光素酶测定中，用组合shRNA模块工程化的T细胞没有表现出细胞毒活性降低的证据。
图22显示，在用表达靶抗原的MSTO细胞系进行的48小时incucyte测定中，用shRNA敲低模块工程化的T细胞没有表现出细胞毒活性降低的证据。
图23显示了在shRNA敲低指示靶标后慢性抗原刺激期间T细胞的累积扩增。
图24A显示，用靶向PTPN2的shRNA模块工程化的T细胞在慢性抗原刺激后表现出细胞周期特征。图24B显示，用靶向PTPN2的shRNA模块工程化的T细胞在慢性抗原刺激后表现出细胞周期特征。
图25显示了在shRNA敲低指示靶标后T细胞中的干扰素γ表达。
图26A显示，用靶向PTPN2的shRNA模块工程化的T细胞在慢性抗原刺激后保留了效应物特征。图26B显示，用靶向PTPN2的shRNA模块工程化的T细胞在慢性抗原刺激后保留了效应物特征。
图27显示了在shRNA敲低指示靶标后工程化T细胞群体中CD4或CD8％T细胞的百分比，以及T效应细胞(Te)、T效应记忆细胞(Tem)、T中央记忆细胞(Tcm)或记忆干T细胞(Tscm)细胞的相对量。
图28A显示了用指示CAR T细胞或对照T细胞治疗后小鼠的肿瘤生长。图28B显示了用指示CAR T细胞或对照T细胞治疗后外周血中的T细胞扩增。
图29显示了用指示量的CAR T细胞或对照T细胞治疗后小鼠的肿瘤生长后肿瘤体积。
图30A显示了用shRNA敲低指示靶标的T细胞治疗后经编辑的CD8 T细胞群体中T细胞类型的定量。图30B显示了用shRNA敲低指示靶标的T细胞治疗后小鼠肿瘤或脾脏中经编辑的T细胞的数量。
图31显示了用shRNA敲低指示靶标的T细胞治疗后的小鼠体重。
图32显示了与表达逻辑门和FAS/PTPN2 shRNA的T细胞一起孵育后表达MSLN或ALPG和MSLN的靶细胞的溶解。
图33显示了与单独表达ALPG/MSLN逻辑门的对照细胞相比，表达ALPG/MSLN逻辑门和FAS/PTPN2 shRNA的T细胞中的相对FAS表达。
图34A显示了与单独表达ALPG/MSLN逻辑门的对照T细胞相比，用来自表达ALPG/MSLN逻辑门和FAS/PTPN2 shRNA的供体二的T细胞治疗后的体内肿瘤体积。图34B显示了与单独表达ALPG/MSLN逻辑门的对照T细胞相比，用来自表达ALPG/MSLN逻辑门和FAS/PTPN2shRNA的供体三的T细胞治疗后的体内肿瘤体积。
图35A显示了与对照T细胞(RNP)相比，用来自表达ALPG/MSLN逻辑门和FAS/PTPN2或FAS/TOX shRNA的供体二的T细胞治疗后的体内肿瘤体积。图35B显示了与对照T细胞(RNP)相比，用来自表达ALPG/MSLN逻辑门和FAS/PTPN2或FAS/TOX shRNA的供体三的T细胞治疗后的体内肿瘤体积。
图36A显示了shRNA敲低后的FAS mRNA水平。图36B显示了shRNA敲低后的PTPN2mRNA水平。图36C显示了shRNA敲低后的TOX mRNA水平。图36D显示了shRNA敲低后的ZC3H12AmRNA水平。
图37显示了shRNA敲低后的FAS蛋白水平。
图38显示，敲除FAS改善了细胞增殖和效应功能。
图39A提供了敲低系统的图解和示例性shRNA-CAR双构建体的图解。图39B显示了使用shRNA对FAS和另外靶标的稳健双重敲低(>50％)。
图40A提供了示例性对照和shFAS系统的图解。图40B显示，FAS敲低提供了>2倍改善的免于FAS介导的细胞凋亡的保护。
图41显示，在系统性NALM6模型中，FAS和其他基因的双重敲低增强了CAR T细胞(CD19-41BBZ敲入TRAC基因座中)的体内功效。
图42A提供了示例性全shRNA和逻辑门构建体的示意图。图42B显示，对于每个构建体观察到相似的转基因敲入效率。图42C显示，由于暴露于ALPG+靶细胞时逻辑门对门CAR表达的功能，表达PrimeR的T细胞具有极少的CAR表达。图42D显示了所有工程化T细胞的KI+群体(或慢病毒转导的群体)以及RNP和未转导(UNT)细胞的大量T细胞群体的CD4/CD8组成。
图43显示了LG1和FAS/PTPN2 shRNA回路的记忆表型分型。
图44A显示了shRNA对FAS的敲低。图44B显示了shRNA对PTPN2的敲低。
图45显示，AB-1013、AB-1014和AB-1015诱导ALPG依赖性CAR表达。
图46显示，AB-1013、AB-1014和AB-1015杀伤启动抗原异质性靶细胞群体。
图47A显示，仅CAR T细胞抑制K526MSLN肿瘤细胞的生长。图47B显示，仅CAR T细胞抑制K526MSLN/ALPG肿瘤细胞的生长。图47C显示，AB-1013、AB-1014和AB-1015shRNA+逻辑门回路T细胞未抑制K526MSLN肿瘤细胞的生长。图47D显示，AB-1013、AB-1014和AB-1015shRNA+逻辑门回路T细胞抑制K526MSLN/ALGP肿瘤细胞的生长。
图48显示，仅表达LG1(AB-X逻辑门)的细胞表现出比SS1-CAR更好的肿瘤控制以及与TC-210等同的肿瘤控制。
图49显示，与LG1 T细胞相比，三种shRNA+LG1回路T细胞(AB-1013、AB-1014和AB-1015)在连续刺激测定中显示出改善的T细胞扩增和肿瘤控制(例如，较少的肿瘤扩大)。
图50A显示，表达组成型抗MSLN CAR的T细胞杀伤K562MSLN和K562ALPG/MSLN细胞两者，而shRNA+逻辑门T细胞(AB-1013、AB-1014和AB-1015)的细胞毒性仅对双抗原K562ALPG/MSLN细胞具有特异性。图50B显示，逻辑门/shRNA回路T细胞的IFNγ产生仅限于具有双抗原K562ALPG/MSLN靶细胞的样本。图50B显示，逻辑门/shRNA回路T细胞的IFNγ产生仅限于具有双抗原K562ALPG/MSLN靶细胞的样本。
图51显示，与AB-1013和AB-1014相比，AB-1015与K562MSLN细胞中ALPG非依赖性杀伤活性的适度增加以及IFNγ表达的增加相关。
图52显示，所有三种shRNA+逻辑门回路T细胞均诱导靶标杀伤。
图53显示，在用三种shRNA+LG1回路(AB-1013、AB-1014或AB-1015)编辑的T细胞中未观察到细胞转化。
图54A显示，MSLN CAR T细胞未识别SLC2A9+细胞(THP-1细胞)。图54B显示，MSLNCAR T细胞未识别K562阴性对照细胞。图54C显示，MSLN CAR T细胞确实与表达MSLN的阳性对照细胞结合。图54D显示，MSLN CAR T细胞未识别GP2+细胞。
图55显示，未观察到MSLN CAR细胞针对A498细胞或H1975细胞的多反应性的证据。
图56A显示了植入后5天小鼠组的随机化。图56B显示，AB-1015T细胞在体内卵巢癌模型中减小肿瘤体积。图56C显示了AB-1015T细胞治疗后肿瘤植入后的小鼠体重。AB-1015T细胞治疗未导致体重减轻。
具体实施方式
定义
除非另外规定，否则权利要求和说明书中所用的术语是如下文所陈述加以定义。
如本文所用，术语“基因”是指遗传的基本单位，由沿染色体排列的DNA区段组成，其编码特定蛋白质或蛋白质区段。基因通常包括启动子、5'非翻译区、一个或多个编码序列(外显子)、任选的内含子和3'非翻译区。基因还可包含终止子、增强子和/或沉默子。
如本文所用，术语“基因座”是指基因或遗传标志物所在的染色体上特定的、固定的物理位置。
术语“安全港基因座”是指基因或遗传元件可以在不破坏相邻基因的表达或调控的情况下被并入的基因座。这些安全港基因座也称为安全港位点(SHS)或基因组安全港(GSH)位点。如本文所用，安全港基因座是指“整合位点”或“敲入位点”，在该位点上可以插入编码如本文所定义的转基因的序列。在一些实施方案中，插入发生伴随着位于整合位点的序列的置换。在一些实施方案中，插入发生不伴随位于整合位点的序列的置换。设想的整合位点的实例提供于表D中。
如本文所用，术语“插入物”是指整合(插入)到靶基因座或安全港位点处的核苷酸序列。插入物可用于指使用例如同源定向修复(HDR)CRISPR/Cas9基因组编辑或本领域普通技术人员已知的将核苷酸序列插入基因组区域中的其他方法被并入靶基因座或安全港位点的基因或遗传元件。
术语“插入”是指操纵核苷酸序列以引入非天然序列。这是例如通过使用限制酶和连接酶来完成的，由此可以通过以下方式将通常编码目标基因的目标DNA序列并入另一核酸分子中：用适当的限制酶消化这两个分子以便产生相容的重叠，然后使用连接酶将这些分子接合在一起。本领域的技术人员非常熟悉此类操纵，实例可见于Sambrook等人(Sambrook、Fritsch和Maniatis,“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”,2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,1989)，其据此以引用的方式整体并入，包括任何附图、图形和表格。
“CRISPR/Cas”系统是指一类广泛用于防御外来核酸的细菌系统。CRISPR/Cas系统广泛存在于真细菌和古细菌生物体中。CRISPR/Cas系统包括I型、II型和III型亚型。野生型II型CRISPR/Cas系统利用RNA介导的核酸酶Cas9与指导和激活性RNA的复合物来识别和裂解外来核酸。具有指导RNA和激活性RNA两者的活性的指导RNA在本领域中也是已知的。在一些情况下，这种双重活性指导RNA被称为小指导RNA(sgRNA)。
Cas9同系物存在于多种真细菌中，包括但不限于以下分类群的细菌：放线菌门(Actinobacteria)、产水菌门(Aquificae)、拟杆菌门-绿菌门(Bacteroidetes-Chlorobi)、衣原体-疣微菌门(Chlamydiae-Verrucomicrobia)、绿弯菌门(Chlroflexi)、蓝藻门(Cyanobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、螺旋体门(Spirochaetes)和热袍菌门(Thermotogae)。示例性的Cas9蛋白是化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9蛋白。另外的Cas9蛋白及其同系物描述于例如Chylinksi等人,RNA Biol.2013年5月1日；10(5):726-737；Nat.Rev.Microbiol.2011年6月；9(6):467-477；Hou等人,Proc Natl Acad Sci U S A.2013年9月24日；110(39):15644-9；Sampson等人,Nature.2013年5月9日；497(7448):254-7；以及Jinek等人,Science.2012年8月17日；337(6096):816-21。可以优化Cas9核酸酶结构域以提高宿主细胞中的活性或增强稳定性。
如本文所用，术语“Cas9”是指RNA介导的核酸酶(例如，细菌或古细菌来源的，或源自它们的)。示例性的RNA介导的核酸酶包括上述Cas9蛋白及其同系物，并且包括但不限于CPF1(参见，例如，Zetsche等人,Cell,第163卷,第3期,p759-771,2015年10月22日)。类似地，如本文所用，术语“Cas9核糖核蛋白”复合物等是指Cas9蛋白与crRNA(例如，指导RNA或小指导RNA)之间的复合物、Cas9蛋白与反式激活性crRNA(tracrRNA)之间的复合物、Cas9蛋白与小指导RNA之间的复合物或它们的组合(例如，含有Cas9蛋白、tracrRNA和crRNA指导RNA的复合物)。
如本文所用，短语“免疫细胞”包括可以产生免疫细胞的所有细胞类型，包括造血细胞，诸如造血干细胞、多能干细胞和诱导性多能干细胞(iPSC)。在一些实施方案中，免疫细胞是B细胞、巨噬细胞、自然杀伤(NK)细胞、诱导型多能干细胞(iPSC)、人多能干细胞(HSPC)、T细胞或T细胞祖细胞或树突细胞。在一些实施方案中，细胞是先天免疫细胞。
如本文所用，在原代细胞或原代干细胞的上下文中的术语“原代”是指尚未转化或永生化的细胞。此类原代细胞可以经过培养、继代培养或传代有限次数(例如，培养0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20次)。在一些情况下，原代细胞适应体外培养条件。在一些情况下，原代细胞从生物体、系统、器官或组织中分离出来，任选地经分选和利用，例如不经培养或继代培养而直接使用。在一些情况下，原代细胞经刺激、激活或分化。例如，可以通过接触(例如，培养时存在)CD3、CD28激动剂、IL-2、IFN-γ或它们的组合来激活原代T细胞。
如本文所用，术语“T淋巴细胞”和“T细胞”可互换使用，并且是指在胸腺中已完成成熟并识别体内某些外来抗原的细胞。这些术语还指在免疫系统中具有各种作用，包括其他免疫细胞的激活和失活的主要白细胞类型。T细胞可以是任何T细胞，诸如培养的T细胞，例如原代T细胞，或源自培养的T细胞系的T细胞，例如Jurkat、SupT1等，或获自哺乳动物的T细胞。T细胞包括但不限于幼稚T细胞、刺激T细胞、原代T细胞(例如，未培养的)、培养的T细胞、永生化T细胞、辅助性T细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞、调节性T细胞、自然杀伤T细胞、它们的组合或它们的亚群。T细胞可以是CD3+细胞。T细胞可以是CD4+、CD8+或CD4+和CD8+。T细胞可以是任何类型的T细胞、CD4+/CD8+双阳性T细胞、CD4+辅助性T细胞(例如Th1和Th2细胞)、CD8+T细胞(例如细胞毒性T细胞)，外周(包括但不限于)血单核细胞(PBMC)、外周血白细胞(PBL)、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)、记忆T细胞、幼稚T细胞、调节性T细胞、γδT细胞等。其可以是任何发育阶段的任何T细胞。其他类型的辅助性T细胞包括Th3(Treg)细胞、Th17细胞、Th9细胞或Tfh细胞。其他类型的记忆T细胞包括诸如中央记忆T细胞(Tcm细胞)、效应记忆T细胞(Tem细胞和TEMRA细胞)的细胞。T细胞还可以指代基因修饰的T细胞，诸如经修饰以表达T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)的T细胞。T细胞也可以从干细胞或祖细胞分化而来。
“CD4+T细胞”是指在其表面上表达CD4并与细胞免疫应答相关的T细胞亚群。CD4+T细胞的特征在于刺激后分泌特性，可包括分泌细胞因子，诸如IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4和IL-10。“CD4”是一种55kD的糖蛋白，最初被定义为T淋巴细胞上的分化抗原，但也存在于包括单核细胞/巨噬细胞在内的其他细胞上。CD4抗原是免疫球蛋白超家族的成员，并被认为是MHC(主要组织相容性复合物)II类限制性免疫应答中的关联识别元件。在T淋巴细胞上，CD4抗原限定了辅助/诱导子亚群。
“CD8+T细胞”是指在其表面上表达CD8的T细胞亚群，受MHC I类限制，并作为细胞毒性T细胞发挥作用。“CD8”分子是存在于胸腺细胞以及细胞毒性和抑制性T淋巴细胞上的分化抗原。CD8抗原是免疫球蛋白超家族的成员，并且是主要组织相容性复合物I类限制性相互作用中的关联识别元件。
如本文所用，短语“造血干细胞”是指一种可以产生血细胞的干细胞。造血干细胞可以产生骨髓或淋巴谱系或其组合的细胞。造血干细胞主要存在于骨髓中，但是它们可以从外周血或其部分中分离出来。各种细胞表面标志物可用于鉴定、分选或纯化造血干细胞。在一些情况下，造血干细胞被鉴定为c-kit+和lin-。在一些情况下，人造血干细胞被鉴定为CD34+、CD59+、Thy1/CD90+、CD38lo/-、C-kit/CD117+、lin-。在一些情况下，人造血干细胞被鉴定为CD34-、CD59+、Thy1/CD90+、CD38lo/-、C-kit/CD117+、lin-。在一些情况下，人造血干细胞被鉴定为CD133+、CD59+、Thy1/CD90+、CD38lo/-、C-kit/CD117+、lin-。在一些情况下，小鼠造血干细胞被鉴定为CD34lo/-、SCA-1+、Thy1+/lo、CD38+、C-kit+、lin-。在一些情况下，造血干细胞为CD150+CD48-CD244-。
如本文所用，短语“造血细胞”是指源自造血干细胞的细胞。造血细胞可通过从生物体、系统、器官或组织(例如，血液或其部分)中分离而获得或提供。或者，可以分离造血干细胞并通过分化干细胞来获得或提供造血细胞。造血细胞包括分化成其他细胞类型潜能有限的细胞。此类造血细胞包括但不限于多能祖细胞、谱系限制性祖细胞、普通骨髓祖细胞、粒细胞-巨噬细胞祖细胞或巨核细胞-红系细胞祖细胞。造血细胞包括淋巴和骨髓谱系的细胞，诸如淋巴细胞、红细胞、粒细胞、单核细胞和血小板。
如本文所用，术语“构建体”是指分子(包括大分子或多核苷酸)的复合物。
如本文所用，术语“整合”是指将构建体的一个或多个核苷酸稳定插入细胞基因组中，即，共价连接至细胞染色体DNA中的核酸序列的过程。其也可以指整合位点处的核苷酸缺失。在插入位点处存在缺失的情况下，“整合”还可包括用一个或多个插入的核苷酸取代缺失的内源序列或核苷酸。
如本文所用，术语“外源”是指已引入宿主细胞中且不是该细胞原生的分子或活性。例如，可以通过将编码核酸引入宿主遗传物质中，如通过整合到宿主染色体中，或作为非染色体遗传物质诸如质粒，来引入分子。因此，当与编码核酸的表达结合使用时，该术语是指将编码核酸以可表达的形式引入细胞中。术语“内源”是指在自然、未经编辑的条件下存在于宿主细胞中的分子或活性。类似地，当与编码核酸的表达结合使用时，该术语是指包含在细胞内而不是外源性地引入的编码核酸。
术语“异源”指非侧翼序列原生的核酸或多肽序列或结构域，例如，其中未发现异源序列天然偶联至在一端或两端出现的核酸或多肽序列。
术语“同源”指侧翼序列原生的核酸或多肽序列或结构域，例如，其中发现同源序列天然偶联至在一端或两端出现的核酸或多肽序列。
如本文所用，“多核苷酸供体构建体”是指遗传地插入多核苷酸中并且对该多核苷酸而言是外源的核苷酸序列(例如DNA序列)。多核苷酸供体构建体被转录成RNA并任选地被翻译成多肽。多核苷酸供体构建体可包括原核序列、来自真核mRNA的cDNA、来自真核(例如，哺乳动物)DNA的基因组DNA序列，和合成DNA序列。例如，多核苷酸供体构建体可以是miRNA、shRNA、天然多肽(即，天然存在的多肽)或其片段，或变体多肽(例如，与天然多肽具有小于100％序列同一性的天然多肽)或其片段。
如本文所用，术语“互补的”或“互补性”是指核苷酸或核酸之间的特定碱基配对。互补核苷酸一般是A和T(或A和U)以及G和C。本文所述的指导RNA可以包含序列，例如与细胞中的基因组序列完美互补或实质上互补(例如，具有1-4个错配)的DNA靶向序列。
术语“编码”是指蛋白质编码序列或非蛋白质编码序列。非蛋白质编码序列包括但不限于短发夹RNA(shRNA)、小干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)或反义寡核苷酸。
如本文所用，术语“转基因”是指已自然转移或通过多种基因工程化技术中的任何一种从一种生物体转移到另一种生物体的多核苷酸。其任选地被翻译成多肽。其任选地被翻译成重组蛋白。“重组蛋白”是一种由基因编码的蛋白质——重组DNA——已在支持基因表达和信使RNA翻译的系统中克隆(参见表达系统)。重组蛋白可以是治疗剂，例如治疗本文公开的疾病或病症的蛋白质。如所用，转基因可以指代编码多肽的多核苷酸。
术语“蛋白质”、“多肽”和“肽”在本文中可互换使用。
如本文所用，术语“可操作地连接”或“操作性地连接”是指核酸序列与单个核酸片段结合，使得一种功能受另一种功能影响。例如，如果启动子能够影响编码序列或功能性RNA的表达(即，编码序列或功能性RNA在启动子的转录控制下)，则启动子与其可操作地连接。编码序列可以在有义和反义方向上可操作地连接至控制序列。
如本文所用，术语“发育细胞状态”是指，例如，细胞所处的非活性、活性表达、分化、衰老等状态。发育细胞状态还可以指处于前体状态的细胞(例如，T细胞前体)。
如所用，术语“编码”是指编码目标蛋白质或多肽的核酸序列。核酸序列可以是DNA分子或RNA分子。在优选实施方案中，分子是DNA分子。在其他优选实施方案中，分子是RNA分子。当作为RNA分子存在时，其将包含引导宿主细胞的核糖体开始翻译的序列(例如，起始密码子，ATG)和引导核糖体结束翻译的序列(例如，终止密码子)。在起始密码子与终止密码子之间是开放阅读框(ORF)。此类术语是本领域普通技术人员已知的。
如本文所用，术语“受试者”是指哺乳动物受试者。示例性受试者包括人、猴子、狗、猫、小鼠、大鼠、牛、马、骆驼、山羊、兔子、猪和绵羊。在某些实施方案中，受试者为人。在一些实施方案中，受试者患有可用本文提供的工程化细胞或其群体治疗的疾病或疾患。在一些方面，疾病或疾患为癌症。
如本文所用，术语“启动子”是指能够控制编码序列或功能性RNA的表达的核苷酸序列(例如DNA序列)。启动子序列由近端和更远端的上游元件组成，后者元件通常称为增强子。启动子可以完整地源自天然基因，可以由来自天然存在的不同启动子的不同元件组成，并且/或者可包含合成的DNA区段。如本文所设想的，启动子对于目标细胞而言可以是内源的或者对于目标细胞而言是外源的。本领域技术人员理解不同的启动子可以在不同的组织或细胞类型中，或在不同的发育阶段，或响应于不同的环境条件诱导基因表达。如本领域已知的，可以根据启动子的强度和/或启动子具有活性的条件来选择启动子，例如，组成型启动子、强启动子、弱启动子、诱导型/抑制型启动子、组织特异性或发育调控启动子、细胞周期依赖性启动子等。
启动子可以是诱导型启动子(例如，热休克启动子、四环素调控启动子、类固醇调控启动子、金属调控启动子、雌激素受体调控启动子等)。启动子可以是组成型启动子(例如，CMV启动子、UBC启动子)。在一些实施方案中，启动子可以是空间限制和/或时间限制的启动子(例如，组织特异性启动子、细胞类型特异性启动子等)。参见例如美国公布20180127786，其公开内容以引用的方式整体并入本文。
如本文所设想的，基因编辑可以涉及基因(或核苷酸序列)敲入或敲除。如本文所用，术语“敲入”是指将DNA序列或其片段添加到基因组中。此类待敲入的DNA序列可包括一个或多个完整基因，可包括与基因或前述基因的任何部分或片段相关的调控序列。例如，可将编码重组蛋白的多核苷酸供体构建体插入携带突变基因的细胞的基因组中。在一些实施方案中，敲入策略涉及用提供的序列取代现有序列，例如用野生型拷贝取代突变等位基因。另一方面，术语“敲除”是指基因或基因表达的消除。例如，可以通过缺失或添加导致阅读框破坏的核苷酸序列来敲除基因。再如，可通过用不相关的(例如，非编码的)序列置换基因的一部分来敲除基因。
如本文所用，术语“非同源末端接合”或NHEJ是指DNA链的切割或切口末端直接接合而不需要同源模板核酸的细胞过程。NHEJ可以导致修复位点处一个或多个核苷酸的添加、缺失、取代或它们的组合。
如本文所用，术语“同源定向修复”或HDR是指通过从同源模板核酸聚合来修复DNA链的切割或缺口末端的细胞过程。因此，原始序列被模板的序列置换。同源模板核酸可以由基因组中其他位置的同源序列(姐妹染色单体、同源染色体，或相同或不同染色体上的重复区域)提供。或者，可以引入外源模板核酸以获得靶位点处特定HDR诱导的序列的变化。通过这种方式，可以在切割位点引入特定的突变。
如本文所用，单链DNA模板或双链DNA模板是指可被细胞用作HDR的模板的DNA寡核苷酸。一般来说，单链DNA模板或双链DNA模板具有至少一个与靶位点同源的区域。在一些情况下，单链DNA模板或双链DNA模板具有两个同源区域，位于包含待插入靶切割位点处的异源序列的区域的两侧。
术语“载体”和“质粒”可互换使用，并且如本文所用是指可用于将遗传物质引入细胞中的多核苷酸媒介物。载体可以是线状的或环状的。载体可以整合到宿主细胞的靶基因组中或者在宿主细胞中独立复制。载体可以包含例如复制起点、多克隆位点和/或选择性标志物。表达载体通常包含表达盒。载体和质粒包括但不限于整合载体、原核质粒、真核质粒、植物合成染色体、附加体、粘粒和人工染色体。
如本文所用，在引入核酸或包含核酸的复合物例如RNP-DNA模板复合物的上下文中的短语“引入”是指核酸序列或RNP-DNA模板复合物从细胞外到细胞内的易位。在一些情况下，引入是指核酸或复合物从细胞外到细胞核内的易位。设想了这种易位的各种方法，包括但不限于电穿孔、与纳米线或纳米管接触、受体介导的内化、通过细胞穿透肽的易位、脂质体介导的易位等。
如本文所用，术语“表达盒”是以重组或合成方式产生的多核苷酸构建体，其包含可操作地连接至所选多核苷酸以促进该所选多核苷酸在宿主细胞中的表达的调控序列。例如，调控序列可以促进所选多核苷酸在宿主细胞中的转录，或所选多核苷酸在宿主细胞中的转录和翻译。表达盒可以例如整合到宿主细胞的基因组中或存在于表达载体中。
如本文所用，短语“有需要的受试者”是指表现出和/或被诊断具有如本文所述的疾病或病症的一种或多种症状或体征的受试者。
“化学治疗剂”是指可用于治疗癌症的化学化合物。化学治疗剂包括用于调节、减少、阻断或抑制可促进癌症生长的激素的影响的“抗激素剂”或“内分泌治疗剂”。
术语“组合物”是指含有例如本文所设想的工程化细胞或蛋白质的混合物。在一些实施方案中，组合物可含有另外的组分，诸如佐剂、稳定剂、赋形剂等。术语“组合物”或“药物组合物”是指呈允许包含在其中的活性成分的生物活性对治疗受试者有效的形式的制剂，并且在药物组合物中提供的量中，其不含有对受试者具有不可接受的毒性的其它组分。
术语“原位”是指在活细胞中发生的与活生物体分开生长的过程，例如，在组织培养物中生长。
术语“体内”是指在活生物体中发生的过程。
如本文所用，术语“离体”一般包括在活组织中或活组织上进行的实验或测量，优选地是在生物体外的人工环境中，优选地是与自然条件的差异极小。
如本文所用，术语“哺乳动物”包括人和非人，并且包括但不限于人、非人灵长类动物、犬科动物、猫科动物、鼠类、牛、马和猪。
在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中，术语“同一性”百分比是指当针对最大对应而进行比较和比对时具有指定百分比的为相同的核苷酸或氨基酸残基的两个或更多个序列或子序列，如使用下文描述的序列比较算法之一(例如，BLASTP和BLASTN或其他技术人员可用的算法)或通过视觉检查来测量。根据应用，“同一性”百分比可以存在于所比较的序列的区上，例如，存在于功能性结构域上，或者可替代地存在于待比较的两个序列的全长上。
对于序列比较，通常一个序列充当与测试序列进行比较的参考序列。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机中，指定子序列坐标(如果需要的话)，并且指定序列算法程序参数。然后序列比较算法基于指定的程序参数计算一个或多个测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
例如，用于比较的最佳序列比对可以通过Smith&Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源性算法；通过Needleman&Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源性比对算法；通过Pearson&Lipman,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)的相似性搜索方法；通过这些算法的计算机化实施(Wisconsin Genetics Software Package,GeneticsComputer Group,575Science Dr.,Madison,Wis.中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)；或通过目视检查(一般参见Ausubel等人,下文)来进行。
适用于确定序列同一性和序列相似性百分比的算法的一个实例是Altschul等人,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)中描述的BLAST算法。用于进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得。
术语“足够的量”意指足以产生所需效果的量，例如足以调节细胞内蛋白质聚集的量。
术语“治疗有效量”是有效改善疾病症状的量。
术语“改善”是指在治疗疾病状态(例如，癌症疾病状态)时的任何治疗方面有益的结果，疾病状态的严重性或进展减轻、缓解或治愈。
如本文所用，术语“有效量”是指化合物(例如，本文所述的组合物、本文所述的细胞)足以实现有益或所需结果的量。有效量可以按一次或多次施用、应用或剂量施用，并且不意图限于特定的制剂或施用途径。
如本文所用，术语“治疗”包括导致疾患、疾病、病症等的改善或改善其症状的任何作用，例如减轻、减少、调节、改善或消除。
术语“调节(modulate/modulation)”是指降低或抑制，或替代地，激活或增加所叙述变量。
术语“增加”和“激活”是指所叙述变量增加10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％，增加至2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍或更大。
术语“降低”和“抑制”是指所叙述变量降低10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％，降低至1/2、1/3、1/4、1/5、1/10、1/20、1/50、1/100，或降低更多。
必须注意的是，除非上下文另外明确规定，否则如说明书和随附权利要求中所用，单数形式“一个/种(a/an)”和“所述(the)”包括复数个指示物。
逻辑门系统
如本文所用，“逻辑门”、“回路”、“回路受体”、“系统”或“系统受体”是指包含启动受体和嵌合抗原受体的两部分蛋白质表达系统。该系统可以在插入细胞中的至少一个核酸上编码，其中启动受体在细胞中表达。当启动受体与其靶抗原结合时，启动受体的细胞内结构域从跨膜结构域裂解。然后，细胞内结构域能够易位至细胞核中，在细胞核中诱导嵌合抗原受体的表达。
在一方面，本文提供了包含结合至ALPG/P的启动受体和结合至MSLN的嵌合抗原受体的系统，其中启动受体的细胞内结构域的转录因子能够诱导CAR的表达。此类系统可替代地称为“逻辑门”或“回路”。在一些方面，该系统由插入免疫细胞中的核酸转基因编码。该系统可以在包含两个转基因的单个核酸插入物或片段上编码，或者可以在单独编码系统转基因的两个核酸上编码。系统的启动受体和CAR可以以任何顺序放置在单个核酸上。例如，启动受体可以在5'端并且CAR可以在3'端，或者CAR可以在5'端并且启动受体可以在3'端。
第一组成型启动子可以可操作地连接至编码启动受体的核苷酸序列。诱导型启动子还可以可操作地连接至编码CAR的核苷酸序列。第二组成型启动子可以可操作地连接至第一核酸，所述第一核酸与包含SEQ ID NO:39所示序列的编码人FAS的mRNA互补。第三组成型启动子可以可操作地连接至第二核酸，所述第二核酸与包含SEQ ID NO:40所示序列的编码人PTPN2的mRNA或包含SEQ ID NO:41所示序列的编码人TOX的mRNA互补。
在一些实施方案中，当系统在包含两个转基因和一个或多个核酸的单个重组核酸插入物或片段上编码时，重组核酸插入物可以在5'至3'方向上包含：第一组成型启动子；编码启动受体的核苷酸序列；第二组成型启动子；编码与人FAS mRNA、人PTPN2 mRNA或人TOXmRNA互补的第一核酸的核苷酸序列；诱导型启动子；和编码嵌合抗原受体的核苷酸序列。
在一些实施方案中，当系统在包含两个转基因和一个或多个核酸的单个重组核酸插入物或片段上编码时，重组核酸插入物可以在5'至3'方向上包含：第一组成型启动子；编码启动受体的核苷酸序列；编码与人FAS mRNA、人PTPN2 mRNA或人TOX mRNA互补的第一核酸的核苷酸序列；诱导型启动子；和编码嵌合抗原受体的核苷酸序列。
在一些实施方案中，当系统在包含两个转基因和一个或多个核酸的单个重组核酸插入物或片段上编码时，重组核酸插入物可以在5'至3'方向上包含：第一组成型启动子；编码启动受体的核苷酸序列；编码与人FAS mRNA、人PTPN2 mRNA或人TOX mRNA互补的第一核酸的核苷酸序列；编码与人FAS mRNA、人PTPN2 mRNA或人TOX mRNA互补的第二核酸的核苷酸序列；诱导型启动子；和编码嵌合抗原受体的核苷酸序列。
在一些实施方案中，当系统在包含两个转基因和一个或多个核酸的单个重组核酸插入物或片段上编码时，重组核酸插入物可以在5'至3'方向上包含：诱导型启动子；和编码嵌合抗原受体的核苷酸序列；第二组成型启动子；编码与人FAS mRNA、人PTPN2 mRNA或人TOX mRNA互补的第一核酸的核苷酸序列；和第一组成型启动子；编码启动受体的核苷酸序列。
在一些实施方案中，当系统在包含两个转基因和一个或多个核酸的单个重组核酸插入物或片段上编码时，重组核酸插入物可以在5'至3'方向上包含：诱导型启动子；和编码嵌合抗原受体的核苷酸序列；第一组成型启动子；编码与人FAS mRNA、人PTPN2 mRNA或人TOX mRNA互补的第一核酸的核苷酸序列；编码启动受体的核苷酸序列。
在一些实施方案中，当系统在包含两个转基因和一个或多个核酸的单个重组核酸插入物或片段上编码时，重组核酸插入物可以在5'至3'方向上包含：诱导型启动子；和编码嵌合抗原受体的核苷酸序列；第一组成型启动子；编码与人FAS mRNA、人PTPN2 mRNA或人TOX mRNA互补的第一核酸的核苷酸序列；编码与人FAS mRNA、人PTPN2 mRNA或人TOX mRNA互补的第二核酸的核苷酸序列；编码启动受体的核苷酸序列。
在一些实施方案中，当系统在包含两个转基因和一个或多个核酸的单个重组核酸插入物或片段上编码时，重组核酸插入物可以在5'至3'方向上包含：第一组成型启动子；编码启动受体的核苷酸序列；第二组成型启动子；编码与人FAS mRNA互补的第一核酸的核苷酸序列；编码与人PTPN2 mRNA或TOX mRNA互补的第二核酸的核苷酸序列；诱导型启动子；和编码嵌合抗原受体的核苷酸序列。
在另一个实施方案中，重组核酸插入物可以在5'至3'方向上包含：第一组成型启动子；编码启动受体的核苷酸序列；第二组成型启动子；编码与人PTPN2 mRNA或TOX mRNA互补的第二第一核酸的核苷酸序列；编码与人FAS mRNA互补的第一核酸的核苷酸序列；诱导型启动子；和编码嵌合抗原受体的核苷酸序列。
在另一个实施方案中，重组核酸插入物可以在5'至3'方向上包含：诱导型启动子；编码嵌合抗原受体的核苷酸序列；第二组成型启动子；编码与人FAS mRNA互补的第一核酸的核苷酸序列；编码与人PTPN2 mRNA或TOX mRNA互补的第二第一核酸的核苷酸序列；第二组成型启动子；编码启动受体的核苷酸序列。
在另一个实施方案中，重组核酸插入物可以在5'至3'方向上包含：诱导型启动子；编码嵌合抗原受体的核苷酸序列；第二组成型启动子；编码与人PTPN2 mRNA或TOX mRNA互补的第二第一核酸的核苷酸序列；编码与人FAS mRNA互补的第一核酸的核苷酸序列；第二组成型启动子；编码启动受体的核苷酸序列。
在一些实施方案中，重组核酸包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO 166、167、168、169、170或171。在一些实施方案中，重组核酸包含如SEQ ID NO:166所示的序列。在一些实施方案中，重组核酸包含如SEQ ID NO:167所示的序列。在一些实施方案中，重组核酸包含如SEQ ID NO:168所示的序列。在一些实施方案中，重组核酸包含如SEQ ID NO:169所示的序列。在一些实施方案中，重组核酸包含如SEQ ID NO:170所示的序列。在一些实施方案中，重组核酸包含如SEQ ID NO:171所示的序列。
启动受体
本文提供了启动受体，其包含特异性地结合以下的细胞外抗原结合结构域：胎盘/生殖细胞碱性磷酸酶(ALPG/P)；ALPP：NCBI Entrez基因：250，UniProtKB/Swiss-Prot：P05187；ALPG：NCBI Entrez基因：251，UniProtKB/Swiss-Prot：P10696)。在一些实施方案中，启动受体包含特异性地结合胎盘碱性磷酸酶(ALPP)的细胞外抗原结合结构域。在一些实施方案中，启动受体包含特异性地结合生殖细胞碱性磷酸酶(ALPG)的细胞外抗原结合结构域。如本文所用，“胎盘/生殖细胞碱性磷酸酶(ALPG/P)”是指胎盘碱性磷酸酶(ALPP)和生殖细胞碱性磷酸酶(ALPG)两者。特异性地结合ALPG/P的抗原结合结构域能够特异性地结合ALPG和/或ALPP。
在一些实施方案中，启动受体包含如SEQ ID NO:24所示的序列。在一些实施方案中，启动受体包含如SEQ ID NO:25所示的序列。
在本公开的某些方面，启动受体是基于Notch蛋白的合成受体。天然Notch受体与同源配体(诸如来自Delta蛋白家族的配体)的结合会导致膜内蛋白水解，从而使Notch蛋白的细胞内片段裂解。该细胞内片段是转录调节因子，仅在从Notch上裂解下来后才起作用。裂解可通过ADAM金属蛋白酶和γ分泌酶复合物的顺序蛋白水解而发生。该细胞内片段进入细胞核并激活细胞-细胞信号传导基因。与天然Notch蛋白相比，合成Notch启动受体用导致编码所选蛋白质(诸如CAR)的基因在细胞内片段从启动受体释放时被转录的片段取代天然Notch细胞内片段。
Notch受体具有模块化结构域组织。Notch受体的胞外域由一系列负责配体结合的N末端表皮生长因子(EGF)样重复序列组成。在合成的Notch受体或启动受体中，Notch配体结合结构域被结合所选靶配体或抗原的配体结合结构域置换。EGF重复序列之后是三个LIN-12/Notch重复序列(LNR)模块，这些模块是Notch受体所特有的，被广泛报道参与防止受体过早激活。Notchl的异源二聚化(HD)结构域经弗林蛋白酶裂解而分开，使得其N末端部分终止细胞外亚基，而其C末端半部分构成跨膜亚基的起点。在细胞外区域之后，受体具有跨膜区段和细胞内结构域(ICD)，细胞内结构域包括转录调节因子。
多种形式的启动受体可用于如本文所述的方法、细胞和核酸。设想用于本文的方法和细胞中的一类启动受体包含异源细胞外配体结合结构域、与包括NRR的Notch受体具有实质序列同一性的连接多肽、TMD和ICD。“Fn Notch”受体包含异源细胞外配体结合结构域、与Robo受体(诸如哺乳动物Robol、Robo2、Robo3或Robo4)具有实质序列同一性的连接多肽，随后是1、2或3个纤连蛋白重复序列(“Fn”)、TMD和ICD。“Mini Notch”受体包含异源细胞外配体结合结构域、与Notch受体(缺乏NRR)具有实质序列同一性的连接多肽、TMD和ICD。“Minimal Linker Notch”受体包含异源细胞外配体结合结构域、与Notch受体(例如，合成(GGS)n多肽序列)缺乏实质序列同一性的连接多肽、TMD和ICD。“铰链Notch”受体包含异源细胞外配体结合结构域、包含寡聚化结构域(即，促进与合成受体和/或现有宿主受体的二聚化、三聚化或更高级多聚化的结构域)的铰链序列、TMD和ICD。所有这些受体类别都是合成的、重组的，并且不天然存在。在一些实施方案中，本文公开的非天然存在的受体结合靶细胞表面展示的配体，其触发受体的蛋白水解裂解以及调节细胞中的定制转录程序的转录调节因子的释放。在一些实施方案中，启动受体不包括Notch受体的LIN-12-Notch重复序列(LNR)和/或异源二聚化结构域(HD)。
启动受体细胞外结构域
本文公开的启动受体包含特异性地结合以下的细胞外结构域：胎盘/生殖细胞碱性磷酸酶(ALPG/P；ALPP：NCBI Entrez基因：250，UniProtKB/Swiss-Prot：P05187；ALPG：NCBI Entrez基因：251，UniProtKB/Swiss-Prot：P10696)。在一些实施方案中，细胞外结构域包括受体的配体结合部分。在一些实施方案中，细胞外结构域包括结合至一种或多种靶抗原的抗原结合部分。在一些实施方案中，抗原结合部分包括抗体或其功能性抗原结合片段的一个或多个抗原结合决定簇。在一些实施方案中，抗原结合部分选自抗体、纳米抗体、双抗体、三抗体或微型抗体、F(ab')2片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)和单结构域抗体(sdAb)或其功能性片段。在一些实施方案中，抗原结合部分包含scFv。抗原结合部分可以包括天然存在的氨基酸序列或者可经工程化、设计或修饰以提供所需的和/或改进的特性，例如增加的结合亲和力。
关于抗体与靶分子的结合，术语“结合”、“特异性地结合”、“特异性地结合至”、“特异性地结合至”、“特异于”、“选择性地结合”和“选择性针对”特定抗原(例如，多肽靶标)或特定抗原上的表位是指与非特异性或非选择性相互作用(例如，与非靶分子)具有可测量差异的结合。例如，“选择性地结合”或“特异性地结合”抗原的抗体是以高亲和力结合抗原并且不显著结合其他无关抗原的抗原结合部分。例如，可以通过测量与靶分子的结合并将其同与非靶分子的结合进行比较来测量特异性结合。特异性结合还可通过与模拟在靶标分子上识别的表位的对照分子的竞争来测定。在这种情况下，如果抗体与靶分子的结合被对照分子竞争性抑制，则指示特异性结合。在一些实施方案中，细胞外抗原结合结构域特异性地结合至生殖细胞型碱性磷酸酶(ALPG)。在一些实施方案中，细胞外结构域包括结合至胎盘碱性磷酸酶(ALPP)的抗原结合部分。
“亲和力”是指分子(例如，抗体)的单一结合位点与它的结合配偶体(例如，抗原或表位)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外指示，否则如本文所用，“亲和力”是指反映结合对的成员(例如抗体和抗原或表位)之间的1:1相互作用的固有结合亲和力。分子X对它的配偶体Y的亲和力可由解离平衡常数(KD)表示。以下更详细描述促成解离平衡常数的动力学分量。亲和力可以通过本领域中已知的常用方法来测量，所述方法包括但不限于表面等离子体共振(SPR)技术(例如，)或生物层干涉测量术(例如，)。
如本文所用的术语“高变区”或“HVR”是指抗体可变结构域的在序列方面高度可变和/或形成结构确定的环(“高变环”)的区域中的每一者。通常，天然四链抗体包含六个HVR；三个在VH中(H1、H2、H3)，并且三个在VL中(L1、L2、L3)。HVR通常包含来自高变环和/或来自互补决定区(CDR)的氨基酸残基，所述互补决定区具有最高序列可变性和/或涉及于抗原识别中。除VH中的CDR1之外，CDR通常包含形成高变环的氨基酸残基。高变区(HVR)也被称为“互补决定区”(CDR)，并且这些术语关于可变区的形成抗原结合区的部分在本文中可互换使用。这个特定区域已由Kabat等人,U.S.Dept.of Health and Human Services,Sequences of Proteins of Immunological Interest(1983)以及由Chothia等人,J MolBiol 196:901-917(1987)描述，其中当相对于彼此加以比较时，定义包括氨基酸残基的重叠或子组。然而，将任一定义应用来指代抗体或其变体的CDR意图在如本文所定义和所用的所述术语的范围内。涵盖特定CDR的确切残基数目将视CDR的序列和大小而变化。鉴于抗体的可变区氨基酸序列，本领域技术人员可以常规方式确定哪些残基构成特定CDR。
CDR的氨基酸序列边界可由本领域技术人员使用许多已知编号方案中的任一者来确定，所述编号方案包括由Kabat等人(上文)(“Kabat”编号方案)；Al-Lazikani等人,1997,J.Mol.Biol.,273:927-948(“Chothia”编号方案)；MacCallum等人,1996,J.Mol.Biol.262:732-745(“Contact”编号方案)；Lefranc等人,Dev.Comp.Immunol.,2003,27:55-77(“IMGT”编号方案)；以及Honegge和Plückthun,J.Mol.Biol.,2001,309:657-70(“AHo”编号方案)描述的那些；所述文献中的每一者以引用的方式整体并入本文。
表A提供如通过Kabat流程和Chothia流程鉴定的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的位置。对于CDR-H1，提供了使用Kabat编号方案与Chothia编号方案两者的残基编号。
CDR可例如使用抗体编号软件诸如可在bioinf.org.uk/abs/abnum/处获得，并且描述于以引用的方式整体并入本文的Abhinandan和Martin,Immunology,2008,45:3832-3839中的Abnum加以指定。
表A.CDR中的根据Kabat编号方案和Chothia编号方案的残基。
CDR Kabat Chothia
L1 L24-L34 L24-L34
L2 L50-L56 L50-L56
L3 L89-L97 L89-L97
H1(Kabat编号) H31-H35B H26-H32或H34*
H1(Chothia编号) H31-H35 H26-H32
H2 H50-H65 H52-H56
H3 H95-H102 H95-H102
*当使用Kabat编号惯例加以编号时，视CDR的长度而定，CDR-H1的C末端在H32与H34之间变化。
当提及抗体重链恒定区中的残基时，通常使用“EU编号方案”(例如如Kabat等人(上文)中所报道)。除非另有说明，否则EU编号方案用于提及本文所述的抗体重链恒定区中的残基。
表A1.示例性保守性取代
原始 示例性取代 特定示例性取代
Ala(A) Val、Leu、Ile Val
Arg(R) Lys、Gln、Asn Lys
Asn(N) Gln、His、Asp、Lys、Arg Gln
Asp(D) Glu、Asn Glu
Cys(C) Ser、Ala Ser
Gln(Q) Asn、Glu Asn
Glu(E) Asp、Gln Asp
Gly(G) Ala Ala
His(H) Asn、Gln、Lys、Arg Arg
Ile(I) Leu、Val、Met、Ala、Phe Leu
Leu(L) Norleucine、Ile、Val、Met、Ala Ile
Lys(K) Arg、Gln、Asn Arg
Met(M) Leu、Phe、Ile Leu
Phe(F) Leu、Val、Ile、Ala、Tyr Tyr
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Ser Ser
Trp(W) Tyr、Phe Tyr
Tyr(Y) Trp、Phe、Thr、Ser Phe
Val(V) Ile、Leu、Met、Phe、Ala Leu
如本文所用，术语“单链”是指包含由肽键线状连接的氨基酸单体的分子。在一特定所述实施方案中，在单链Fab分子中，Fab轻链的C末端连接于Fab重链的N末端。如本文更详细所述，scFv具有轻链的可变结构域(VL)从它的C末端由多肽链连接于重链的可变结构域(VH)的N末端。或者，scFv包含其中VH的C末端由多肽链连接于VL的N末端的多肽链。
“Fab片段”(也被称为抗原结合片段)含有轻链的恒定结构域(CL)和重链的第一恒定结构域(CH1)以及分别在轻链和重链上的可变结构域VL和VH。可变结构域包含抗原结合中涉及的互补决定环(CDR，也被称为高变区)。Fab′片段与Fab片段由于在重链CH1结构域的羧基末端添加有少许残基而不同，所述残基包括一个或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸。
“F(ab’)2”片段含有两个在铰链区附近由二硫键接合的Fab’片段。F(ab’)2片段可例如通过重组方法或通过胃蛋白酶消化完整抗体来产生。F(ab’)片段可例如通过用β-巯基乙醇处理来解离。
“Fv”片段包含一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的非共价连接二聚体。
“单链Fv”或“scFv”包括抗体的VH结构域和VL结构域，其中这些结构域存在于单一多肽链中。在一个实施方案中，Fv多肽还包含在VH结构域与VL结构域之间的使得scFv能够形成为抗原结合所需的结构的多肽接头。对于scFv的综述，参见Pluckthun,ThePharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编,Springer-Verlag,New York,第269-315页(1994)。HER2抗体scFv片段描述于WO93/16185；美国专利第5,571,894号；和美国专利第5,587,458号中。
术语“单结构域抗体”或“sdAb”是指其中抗体的一个可变结构域在不存在另一可变结构域下特异性地结合至抗原的分子。单结构域抗体及其片段描述于Arabi Ghahroudi等人,FEBS Letters,1998,414:521-526以及Muylde rmans等人,Trends inBiochem.Sci.,2001,26:230-245中，其各自以引用的方式整体并入。单结构域抗体也被称为sdAb或纳米抗体。Sdab十分稳定，并且易于作为融合配偶体与抗体的Fc链一起表达(Harmsen MM,De Haard HJ(2007)."Properties,production,and applications ofcamelid single-domai n antibody fragments".Appl.Microbiol Biotechnol.77(1):13-22)。
启动受体CDR、VH、VL结构域
在一些方面，启动受体细胞外抗原结合结构域包含可变重(VH)链序列和可变轻(VL)链序列，所述可变重(VH)链序列包含三个重链CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述可变轻(VL)链序列包含三个轻链CDR序列CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中：CDR-H1包含SEQID NO:1所示的序列，CDR-H2包含SEQ ID NO:2所示的序列，CDR-H3包含SEQ ID NO:3所示的序列，CDR-L1包含SEQ ID NO:4所示的序列，CDR-L2包含SEQ ID NO:5所示的序列，并且CDR-L3包含SEQ ID NO:6所示的序列。在一些实施方案中，VH链序列包含SEQ ID NO:7所示的序列。在一些实施方案中，VL包含SEQ ID NO:8所示的序列。在一些实施方案中，细胞外结构域包含SEQ ID NO:9所示的序列。
在一些实施方案中，启动受体细胞外抗原结合结构域CDR-H3与SEQ ID NO:3的CDR-H3具有至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性，CDR-H2与SEQ ID NO:2的CDR-H2具有至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性，CDR-H1与SEQ ID NO:1的CDR-H1具有至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性，CDR-L3与SEQ ID NO:6的CDR-L3具有至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性，CDR-L2与SEQ ID NO:5的CDR-L2具有至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性，并且CDR-L1与SEQ ID NO:4的CDR-L1具有至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性。在一些实施方案中，CDR-H3是具有多达1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个氨基酸取代的SEQ ID NO:3的CDR-H3；CDR-H2是具有多达1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个氨基酸取代的SEQ ID NO:2的CDR-H2；CDR-H1是具有多达1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代的SEQ ID NO:1的CDR-H1；CDR-L3是具有多达1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代的SEQ ID NO:6的CDR-L3；CDR-L2是具有多达1个、2个、3个或4个氨基酸取代的SEQ ID NO:5的CDR-L2；并且CDR-L1是具有多达1个、2个、3个、4个、5个或6个氨基酸取代的SEQ ID NO:4的CDR-L1。
在一些实施方案中，本文提供的启动受体细胞外抗原结合结构域包含如SEQ IDNO:7所示的VH结构域的一个至三个CDR。在一些实施方案中，本文提供的抗原结合结构域包含如SEQ ID NO:7所示的VH结构域的两个至三个CDR。在一些实施方案中，本文提供的抗原结合结构域包含如SEQ ID NO:7所示的vh结构域的三个CDR。在一些方面，CDR为Kabat CDR。在一些方面，CDR为Chothia CDR。在一些方面，CDR为AbM CDR。在一些方面，CDR为ContactCDR。在一些方面，CDR为IMGT CDR。
在一些实施方案中，本文提供的启动受体细胞外抗原结合结构域包含与SEQ IDNO:7所示VH序列具有至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％同一性的VH序列。在一些实施方案中，本文提供的抗原结合结构域包含具有多达1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个氨基酸取代的SEQ ID NO:7所提供的VH序列。在一些方面，氨基酸取代是保守性氨基酸取代。在一些实施方案中，本段中描述的抗原结合结构域在本文中称为“变体”。在一些实施方案中，此类变体例如通过亲和力成熟、定点诱变、随机诱变或本领域中已知或本文所述的任何其他方法来由本文提供的序列获得。在一些实施方案中，此类变体不由本文提供的序列获得，并且可例如根据本文提供的用于获得抗体或抗原结合结构域的方法来重新分离。
在一些实施方案中，本文提供的启动受体细胞外抗原结合结构域包含如SEQ IDNO:8所示的VL结构域的一个至三个CDR。在一些实施方案中，本文提供的抗原结合结构域包含如SEQ ID NO:8所示的VL结构域的两个至三个CDR。在一些实施方案中，本文提供的抗原结合结构域包含如SEQ ID NO:8所示的VL结构域的三个CDR。在一些方面，CDR为Kabat CDR。在一些方面，CDR为Chothia CDR。在一些方面，CDR为AbM CDR。在一些方面，CDR为ContactCDR。在一些方面，CDR为IMGT CDR。
在一些实施方案中，本文提供的启动受体细胞外抗原结合结构域包含与SEQ IDNO:8所示VL序列具有至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％同一性的VL序列。在一些实施方案中，本文提供的抗原结合结构域包含具有多达1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个氨基酸取代的SEQ ID NO:8所提供的VL序列。在一些方面，氨基酸取代是保守性氨基酸取代。在一些实施方案中，本段中描述的抗体在本文中称为“变体”。在一些实施方案中，此类变体例如通过亲和力成熟、定点诱变、随机诱变或本领域中已知或本文所述的任何其他方法来由本文提供的序列获得。在一些实施方案中，此类变体不由本文提供的序列获得，并且可例如根据本文提供的用于获得抗体或抗原结合结构域的方法来重新分离。
表B提供了根据指示编号方案的例示性ALPG/P抗原结合结构域的VH和VL的CDR序列。
跨膜结构域
如上文所述，启动受体包括包含一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点的跨膜结构域(TMD)。
在一些实施方案中，TMD包含Notch1跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域包含如SEQ ID NO:19所示的序列。
一般来说，适用于本文公开的嵌合受体的TMD可以是1型跨膜受体的包括至少一个γ分泌酶裂解位点的任何跨膜结构域。γ分泌酶复合物及其底物蛋白(包括淀粉样前体蛋白(APP)和Notch)的结构和功能的详细描述可以例如在Zhang等人最近在Frontiers CellNeurosci(2014)中发表的一篇综述中找到。来自1型跨膜受体的非限制性适合TMD包括来自CLSTN1、CLSTN2、APLP1、APLP2、LRP8、APP、BTC、TGBR3、SPN、CD44、CSF1R、CXCL16、CX3CL1、DCC、DLL1、DSG2、DAG1、CDH1、EPCAM、EPHA4、EPHB2、EFNB1、EFNB2、ErbB4、GHR、HLA-A和IFNAR2的TMD，其中TMD包括至少一个γ分泌酶裂解位点。适用于本文所述的组合物和方法的另外TMD包括但不限于来自1型跨膜受体IL1R1、IL1R2、IL6R、INSR、ERN1、ERN2、JAG2、KCNE1、KCNE2、KCNE3、KCNE4、KL、CHL1、PTPRF、SCN1B、SCN3B、NPR3、NGFR、PLXDC2、PAM、AGER、ROBOl、SORCS3、SORCS1、SORL1、SDC1、SDC2、SPN、TYR、TYRP1、DCT、YASN、FLT1、CDH5、PKHD1、NECTINl、PCDHGC3、NRG1、LRP1B、CDH2、NRG2、PTPRK、SCN2B、Nradd和PTPRM的跨膜结构域。在一些实施方案中，本公开的嵌合多肽或Notch受体的TMD是源自钙同线蛋白(calsyntenin)家族成员(诸如alcadeinα和alcadeinγ)的TMD的TMD。在一些实施方案中，本发明的嵌合多肽或Notch受体的TMD是已知用于Notch受体的TMD。在一些实施方案中，本发明的嵌合多肽或Notch受体的TMD是源自不同Notch受体的TMD。例如，在基于人Notchl的Mini Notch中，Notchl TMD可以用Notch2TMD、Notch3 TMD、Notch4 TMD或来自非人动物(诸如斑马鱼、黑腹果蝇、非洲爪蟾或原鸡)的Notch TMD取代。
在一些实施方案中，启动受体包含Notch裂解位点，诸如S2或S3。适用于本文公开的组合物和方法的另外蛋白水解裂解位点包括但不限于ADAM10、选自以下的MMP的金属蛋白酶裂解位点：胶原酶1、2和3(MMP-1、-8和-13)、明胶酶A和B(MMP-2和-9)、溶基质素1、2和3(MMP-3、-10和-11)、基质溶解素(MMP-7)和膜金属蛋白酶(MT1-MMP和MT2-MMP)。适合蛋白酶裂解位点的另一实例是纤溶酶原激活物裂解位点，例如尿激酶纤溶酶原激活物(uPA)或组织纤溶酶原激活物(tPA)裂解位点。适合蛋白酶裂解位点的另一实例是催乳素裂解位点。uPA和tPA的裂解序列的具体实例包括包含Yal-Gly-Arg的序列。可包含在蛋白水解可裂解接头中的蛋白酶裂解位点的另一实例是烟草蚀刻病毒(TEV)蛋白酶裂解位点，例如Glu-Asn-Leu-Tyr-Thr-Gln-Ser(SEQ ID NO:188)，其中蛋白酶在谷氨酰胺与丝氨酸之间裂解。可包含在蛋白水解可裂解接头中的蛋白酶裂解位点的另一实例是肠激酶裂解位点，例如Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(SEQ ID NO:189)，其中裂解发生在赖氨酸残基之后。可包含在蛋白水解可裂解接头中的蛋白酶裂解位点的另一实例是凝血酶裂解位点，例如Leu-Val-Pro-Arg(SEQ ID NO:190)。包含蛋白酶裂解位点的另外的适合接头包括可被以下蛋白酶裂解的序列：PreScissionTM蛋白酶(包含人鼻病毒3C蛋白酶和谷胱甘肽-S-转移酶的融合蛋白)、凝血酶、组织蛋白酶B、爱泼斯坦-巴尔病毒蛋白酶、MMP-3(溶基质素)、MMP-7(基质溶解素)、MMP-9；类嗜热菌蛋白酶MMP、基质金属蛋白酶2(MMP-2)、组织蛋白酶L；组织蛋白酶D、基质金属蛋白酶1(MMP-1)、尿激酶型纤溶酶原激活物、膜1型基质金属蛋白酶(MT-MMP)、溶基质素3(或MMP-11)、嗜热溶素、成纤维细胞胶原酶和溶基质素1、基质金属蛋白酶13(胶原酶3)、组织型纤溶酶原激活物(tPA)、人前列腺特异性抗原、激肽释放酶(hK3)、中性粒细胞弹性蛋白酶和钙蛋白酶(钙激活中性蛋白酶)。非表达受体的宿主细胞原生的蛋白酶(例如，TEV)可用作进一步的调控机制，其中受体的激活减少，直至蛋白酶被表达或以其他方式提供。另外，蛋白酶可能与肿瘤相关或与疾病相关(表达程度显著高于正常组织中的程度)，并充当独立的调控机制。例如，一些基质金属蛋白酶在某些癌症类型中高度表达。
在一些实施方案中，TMD内的氨基酸取代包括TMD的“GV”基序内的一个或多个取代。在一些实施方案中，此类取代中的至少一种包括对丙氨酸的取代。另外的序列和取代描述于WO2021061872中，其据此以引用的方式整体并入。
细胞内结构域
在一些实施方案中，启动受体包含来自或源自转录调节因子和/或DNA结合结构域的一个或多个细胞内结构域。在一些实施方案中，细胞内结构域包含HNF1a/p65结构域或Gal4/VP64结构域。在一些实施方案中，细胞内结构域包含如SEQ ID NO:23所示的序列。
转录调节因子激活或抑制同源启动子的转录。转录激活因子通常在转录启动子附近与其结合并募集RNA聚合酶以直接启始转录。转录抑制因子与转录启动子结合并在空间上阻碍RNA聚合酶的转录起始。其他转录调节因子根据其结合位置和细胞条件充当激活因子或抑制因子。因此，如本文所用，“转录激活结构域”是指与转录控制元件和/或转录调节蛋白(即，转录因子、RNA聚合酶等)相互作用以增加和/或激活一个或多个基因的转录的转录因子的结构域。转录激活结构域的非限制性实例包括：单纯疱疹病毒VP16激活结构域、VP64(其为VP16的四聚体衍生物)、HIV TAT、NFkB p65激活结构域、p53激活结构域1和2、CREB(cAMP应答元件结合蛋白)激活结构域、E2A激活结构域、NFAT(活化T细胞核因子)激活结构域、酵母Gal4、酵母GCN4、酵母HAP1、MLL、RTG3、GLN3、OAF1、PIP2、PDR1、PDR3、PHO4、LEU3糖皮质激素受体转录激活结构域、B细胞POU同源结构域蛋白Oct2、植物Ap2或本领域技术人员或普通技术人员已知的任何其他结构域。在一些实施方案中，转录调节因子选自Gal4-VP16、Gal4-VP64、tetR-VP64、ZFHD1-YP64、Gal4-KRAB和HAP1-VP16。在一些实施方案中，转录调节因子是Gal4-VP64。转录激活结构域可以包含野生型或天然存在的序列，或者它可以是原始转录激活结构域的修饰、突变或衍生型式，具有所需的增加和/或激活一个或多个基因的转录的能力。在一些实施方案中，转录调节因子还可包括核定位信号。
在一些实施方案中，启动受体包含一个或多个细胞内“DNA结合结构域”(或“DB结构域”)。此类“DNA结合结构域”是指结合特定DNA序列元件的序列特异性DNA结合结构域。因此，如本文所用，“序列特异性DNA结合结构域”是指具有选择性地结合具有特定预定序列的DNA的能力的蛋白质结构域部分。序列特异性DNA结合结构域可以包含野生型或天然存在的序列，或者它可以是原始结构域的具有结合所需序列的所需能力的修饰、突变或衍生型式。在一些实施方案中，序列特异性DNA结合结构域经工程化以结合所需序列。可用于本文所述的合成蛋白质中的具有序列特异性DNA结合结构域的蛋白质的非限制性实例包括HNF1a、Gal4、GCN4、反向四环素受体、THY1、SYN1、NSE/RU5′、AGRP、CALB2、CAMK2A、CCK、CHAT、DLX6A、EMX1、锌指蛋白或其结构域、CRISPR/Cas蛋白，诸如Cas9、Cas3、Cas4、Cas5、Cas5e(orCasD)、Cash、Cas6e、Cas6f、Cas7、Cas8a1、Cas8a2、Cas8b、Cas8c、Cas10、Cas10d、CasF、CasG、CasH、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1(or CasA)、Cse2(or CasB)、Cse3(或CasE)、Cse4(or CasC)、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csz1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4，和Cu196，以及TALES。
在使用CRISPR/Cas样蛋白的那些实施方案中，CRISPR/Cas样蛋白可以是野生型CRISPR/Cas蛋白、修饰的CRISPR/Cas蛋白，或野生型或修饰的CRISPR/Cas蛋白的片段。CRISPR/Cas样蛋白可经修饰以增加核酸结合亲和力和/或特异性，改变酶活性，并且/或者改变蛋白质的另一特性。例如，CRISPR/Cas样蛋白的核酸酶(即，DNase、RNase)结构域可以被修饰、缺失或失活。或者，CRISPR/Cas样蛋白可被截短以去除对本文所述系统的功能而言不是必需的结构域。例如，用作DNA结合蛋白或其结构域的CRISPR酶可以相对于相应的野生型酶发生突变，使得突变的CRISPR或其结构域缺乏裂解含有DNA结合结构域靶位点的核酸序列的能力。例如，D10A突变可以与H840A、N854A或N863A突变中的一个或多个组合以产生实质上缺乏所有DNA裂解活性的Cas9酶。
近膜结构域
ECD和TMD，或TMD和ICD，可以用连接多肽诸如近膜结构域彼此连接。“SynNotch”或合成Notch受体包含异源细胞外配体结合结构域、与Notch受体JMD(包括NRR)具有实质序列同一性的连接多肽、TMD和ICD。“Fn Notch”受体包含异源细胞外配体结合结构域、与Robo受体(诸如哺乳动物Robol、Robo2、Robo3或Robo4)具有实质序列同一性的连接多肽，随后是1、2或3个纤连蛋白重复序列(“Fn”)、TMD和ICD。“Mini Notch”受体包含异源细胞外配体结合结构域、与Notch受体JMD(但缺乏NRR(LIN-12-Notch重复序列(LNR)模块))具有实质序列同一性的连接多肽、TMD和ICD。“Minimal Linker Notch”受体包含异源细胞外配体结合结构域、与Notch受体(例如但不限于，具有合成(GGS)n多肽序列)缺乏实质序列同一性的连接多肽、TMD和ICD。“Hinge Notch”受体包含异源细胞外配体结合结构域、包含寡聚化结构域(即，促进与合成受体和/或现有宿主受体的二聚化、三聚化或更高级多聚化的结构域)的铰链序列、TMD和ICD。
在一些实施方案中，启动受体包含介于细胞外结构域与跨膜结构域之间的近膜结构域(JMD)肽。在一些实施方案中，启动受体包含介于跨膜结构域与细胞内结构域之间的近膜结构域(JMD)肽。在一些实施方案中，JMD肽包含LWF基序。LWF基序在受体构建体中的用途描述于美国专利第10,858,443号中，该专利据此以引用的方式整体并入。在一些实施方案中，JMD肽与Notchl、Notch2、Notch3和/或Notch4的JMD具有实质序列同一性。在一些实施方案中，JMD肽与Notchl、Notch2、Notch3和/或Notch4 JMD具有实质序列同一性，但不包括Notch受体的LIN-12-Notch重复序列(LNR)和/或异源二聚化结构域(HD)。在一些实施方案中，JMD肽与Notchl、Notch2、Notch3和/或Notch4 JMD不具有实质序列同一性。在一些实施方案中，JMD肽包括促进受体的二聚体、三聚体或更高级组合的形成的寡聚化结构域。此类JMD肽描述于WO2021061872中，其据此以引用的方式整体并入。
在Mini Notch受体中，连接多肽源自NRR和HD结构域缺失后的Notch JMD序列。Notch JMD序列可以是来自Notchl、Notch2、Notch3或Notch4的序列，并且可以源自非人同系物，诸如来自果蝇属、原鸡属、鱼丹属等的那些。剩余的Notch序列的4至50个氨基酸残基可用作多肽接头。在一些实施方案中，改变接头多肽序列的长度和氨基酸组成以改变ECD和TMD相对于彼此的方向和/或接近度，从而实现嵌合多肽的所需活性，诸如诱导配体或不存在配体时的信号转导水平。
在Minimal Linker Notch受体中，连接多肽与Notch JMD序列(包括来自Notchl、Notch2、Notch3或Notch4的Notch JMD序列，或其非人同系物)不具有实质序列同一性。4至50个氨基酸残基可用作多肽接头。在一些实施方案中，改变接头多肽序列的长度和氨基酸组成以改变ECD和TMD相对于彼此的方向和/或接近度，从而实现本公开的嵌合多肽的所需活性。Minimal Linker序列可以被设计为包括或省略蛋白酶裂解位点，并且可以包括或省略糖基化位点或用于其他类型的翻译后修饰的位点。在一些实施方案中，Minimal Linker不包含蛋白酶裂解位点或糖基化位点。
在一些实施方案中，启动受体还包含铰链。可用于启动受体中的铰链接头可以包括含有一个或多个通过分子间二硫键键合促进嵌合多肽的寡聚体形成的多肽基序的寡聚化结构域(例如，铰链结构域)。在这些情形下，在本文公开的嵌合受体内，铰链结构域一般包括设置于ECD与TMD之间的柔性多肽连接区。因此，铰链结构域提供了ECD与TMD之间的柔性，并且还提供了供两个或更多个嵌合多肽单体之间的分子间二硫键键合以形成寡聚复合物的位点。在一些实施方案中，铰链结构域包括促进本文公开的嵌合多肽的二聚体形成的基序。在一些实施方案中，铰链结构域包括促进本文公开的嵌合多肽的三聚体形成的基序(例如，源自OX40的铰链结构域)。适用于本公开的组合物和方法的铰链多肽序列可以是天然存在的铰链多肽序列(例如，来自天然存在的免疫球蛋白的那些序列)或者可以经工程化、设计或修饰以提供所需的和/或改进的特性，例如，调节转录。适合铰链多肽序列包括但不限于源自IgA、IgD和IgG亚类的那些，诸如IgGl铰链结构域、IgG2铰链结构域、IgG3铰链结构域和IgG4铰链结构域，或它们的功能性变体。在一些实施方案中，铰链多肽序列含有一个或多个CXXC基序。在一些实施方案中，铰链多肽序列含有一个或多个CPPC基序(SEQ ID NO:191)。
铰链多肽序列还可源自CD8α铰链结构域、CD28铰链结构域、CD152铰链结构域、PD-1铰链结构域、CTLA4铰链结构域、OX40铰链结构域，以及它们的功能性变体。在一些实施方案中，铰链结构域包括源自CD8α铰链结构域或其功能性变体的铰链多肽序列。在一些实施方案中，铰链结构域包括源自CD28铰链结构域或其功能性变体的铰链多肽序列。在一些实施方案中，铰链结构域包括源自OX40铰链结构域或其功能性变体的铰链多肽序列。在一些实施方案中，铰链结构域包括源自IgG4铰链结构域或其功能性变体的铰链多肽序列。
Fn Notch连接多肽源自Robol JMD，其含有纤连蛋白重复序列(Fn)结构域，在Fn重复序列与TMD之间有短多肽序列。Fn Notch连接多肽不含Notch负调控区(NRR)或Notch HD结构域。Fn连接多肽可以含有1、2、3、4或5个Fn重复序列。在一些实施方案中，嵌合受体包含具有约1至约5个Fn重复序列、约1至约3个Fn重复序列或约2至约3个Fn重复序列的Fn连接多肽。Fn重复序列与TMD之间的短多肽序列可以为约2至约30个氨基酸残基。在一些实施方案中，短多肽序列可以介于任何序列的约5与约20个氨基酸之间。在一些实施方案中，短多肽序列可以介于任何序列的约5与约20个天然存在的氨基酸之间。在一些实施方案中，短多肽序列可以介于任何序列的约5与约20个氨基酸之间但不具有超过一个脯氨酸。在一些实施方案中，短多肽序列可以介于约5与约20个氨基酸之间，并且约50％或更多的氨基酸是甘氨酸。在一些实施方案中，短多肽序列可以介于约5与约20个氨基酸之间，其中氨基酸选自甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸和丙氨酸。在一些实施方案中，可以改变Fn连接多肽序列的长度和氨基酸组成以改变ECD和TMD相对于彼此的方向和/或接近度，从而实现本公开的嵌合多肽的所需活性。
终止转移序列
在一些实施方案中，启动受体还包含在跨膜结构域与细胞内结构域之间的终止转移序列(STS)。STS包含带电荷的疏脂序列。不受任何理论的束缚，STS用作膜锚，并且被认为阻止细胞内结构域进入质膜。STS结构域在启动受体中的用途描述于WO2021061872中，其据此以引用的方式整体并入。非限制性示例性STS序列包括APLP1、APLP2、APP、TGBR3、CSF1R、CXCL16、CX3CL1、DAG1、DCC、DNER、DSG2、CDH1、GHR、HLA-A、IFNAR2、IGF1R、IL1R1、ERN2、KCNE1、KCNE2、CHL1、LRPl、LRP2、LRP18、PTPRF、SCN1B、SCN3B、NPR3、NGFR、PLXDC2、PAM、AGER、ROBOl、SORCS3、SORCS1、SORL1、SDC1、SDC2、SPN、TYR、TYRP1、DCT、VASN、FLT1、CDH5、PKTFD1、NECTINl、KL、IL6R、EFNB1、CD44、CLSTN1、LRP8、PCDHGC3、NRG1、LRP1B、JAG2、EFNB2、DLL1、CLSTN2、EPCAM、ErbB4、KCNE3、CDH2、NRG2、PTPRK、BTC、EPHA4、IL1R2、KCNE4、SCN2B、Nradd、PTPRM、Notchl、Notch2、Notch3和Notch4 STS序列。在一些实施方案中，STS与跨膜域异源。在一些实施方案中，STS与跨膜域同源。STS序列描述于WO2021061872中，其据此以引用的方式整体并入。
在一些实施方案中，终止转移序列包含如SEQ ID NO:20所示的序列。
ALPG/P抗体和抗原结合片段
在一些方面，本文提供了胎盘/生殖细胞碱性磷酸酶(ALPG/P)抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，ALPG/P抗原结合部分选自抗体、纳米抗体、双抗体、三抗体或微型抗体、F(ab')2片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)和单结构域抗体(sdAb)或其功能性片段。在一些实施方案中，抗原结合部分包含scFv。抗原结合部分可以包括天然存在的氨基酸序列或者可经工程化、设计或修饰以提供所需的和/或改进的特性，例如增加的结合亲和力。
在一方面，本文提供了结合至胎盘/生殖细胞碱性磷酸酶(ALPG/P)的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含：包含三个重链CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的可变重(VH)链序列，其中：CDR-H1包含如SEQ ID NO:1、173、174、175或176所示的序列，CDR-H2包含如SEQ ID NO:2、177、178、179或180所示的序列，并且CDR-H3包含如SEQ ID NO:3、181或182所示的序列；和包含三个轻链CDR序列CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的可变轻(VL)链序列，其中：CDR-L1包含如SEQ ID NO:4、183或184所示的序列，CDR-L2包含如SEQ ID NO:5、185或186所示的序列，并且CDR-L3包含如SEQ ID NO:6或187所示的序列。
在一些实施方案中，ALPG/P抗体或抗原结合片段包含可变重(VH)链序列和可变轻(VL)链序列，所述可变重(VH)链序列包含三个重链CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述可变轻(VL)链序列包含三个轻链CDR序列CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一些实施方案中，VH链序列包含SEQ ID NO:7所示的序列。在一些实施方案中，VL链序列包含SEQ ID NO:8所示的序列。
在一些实施方案中，ALPG/P抗体或抗原结合片段CDR-H3与SEQ ID NO:3、181或182的CDR-H3具有至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性；CDR-H2与SEQ ID NO:2、177、178、179或180的CDR-H2具有至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性；CDR-H1与SEQ ID NO:1、173、174、175或176的CDR-H1具有至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性。在一些实施方案中，CDR-H3是具有多达1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个氨基酸取代的SEQ ID NO:3、181或182的CDR-H3；CDR-H2是具有多达1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个氨基酸取代的SEQ ID NO:2、177、178、179或180的CDR-H2；并且CDR-H1是具有多达1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代的SEQ ID NO:1、173、174、175或176的CDR-H1。
在一些实施方案中，ALPG/P抗体或抗原结合片段CDR-L3与SEQ ID NO:6或187的CDR-L3具有至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性；CDR-L2与SEQ ID NO:5、185或186的CDR-L2具有至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性；CDR-L1与SEQ IDNO:4、183或184的CDR-L1具有至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性。在一些实施方案中，CDR-L3是具有多达1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个氨基酸取代的SEQ IDNO:6或187的CDR-L3；CDR-L2是具有多达1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个氨基酸取代的SEQ ID NO:5、185或186的CDR-L2；并且CDR-L1是具有多达1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代的SEQ ID NO:4、183或184的CDR-L1。
在一些实施方案中，本文提供的ALPG/P抗体或抗原结合片段包含如SEQ ID NO:7所示的VH结构域的一个至三个CDR。在一些实施方案中，本文提供的抗原结合结构域包含如SEQ ID NO:7所示VH结构域的的两个至三个CDR。在一些实施方案中，本文提供的抗原结合结构域包含如SEQ ID NO:7所示的VH结构域的三个CDR。在一些实施方案中，本文提供的ALPG/P抗体或抗原结合片段包含如SEQ ID NO:8所示的VL结构域的一个至三个CDR。在一些实施方案中，本文提供的抗原结合结构域包含如SEQ ID NO:8所示的VL结构域的两个至三个CDR。在一些实施方案中，本文提供的抗原结合结构域包含如SEQ ID NO:8所示的VL结构域的三个CDR。在一些方面，CDR为Kabat CDR。在一些方面，CDR为Chothia CDR。在一些方面，CDR为AbM CDR。在一些方面，CDR为Contact CDR。在一些方面，CDR为IMGT CDR。
在一些实施方案中，本文提供的ALPG/P抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO:7所示VH序列具有至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％同一性的VH序列。在一些实施方案中，本文提供的抗原结合结构域包含具有多达1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个氨基酸取代的SEQ ID NO:7所提供的VH序列。在一些实施方案中，本文提供的ALPG/P抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO:8所示VL序列具有至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％同一性的VL序列。在一些实施方案中，本文提供的ALPG/P抗原结合结构域包含具有多达1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个氨基酸取代的SEQ IDNO:8所提供的VL序列。在一些方面，氨基酸取代是保守性氨基酸取代。在一些实施方案中，本段中描述的抗原结合结构域在本文中称为“变体”。在一些实施方案中，此类变体例如通过亲和力成熟、定点诱变、随机诱变或本领域中已知或本文所述的任何其他方法来由本文提供的序列获得。在一些实施方案中，此类变体不由本文提供的序列获得，并且可例如根据本文提供的用于获得抗体或抗原结合结构域的方法来重新分离。
在一些实施方案中，ALPG/P抗体或抗原结合片段包含重链可变(VH)区，其中全组VH CDR 1、2和3(组合)与SEQ ID NO:7的CDR 1、2和3具有至少80％(诸如，例如80％、85％、90％、95％、至少85％、至少90％、至少95％)序列同一性。在一些实施方案中，ALPG/P抗体或抗原结合片段包含重链可变(VH)区，其中全组VH CDR 1、2和3(组合)与SEQ ID NO:7的CDR1、2和3具有至少85％(诸如，例如85％、90％、95％、至少90％、至少95％)序列同一性。在一些实施方案中，ALPG/P抗体或抗原结合片段包含重链可变区(VH)区，其中全组VH CDR 1、2和3(组合)与SEQ ID NO:7的CDR 1、2和3具有至少90％(诸如，例如90％、95％、至少95％)序列同一性。在一些实施方案中，ALPG/P抗体或抗原结合片段包含重链可变(VH)区，其中全组VH CDR 1、2和3(组合)与SEQ ID NO:7的CDR 1、2和3具有至少95％序列同一性。
在一些实施方案中，ALPG/P抗体或抗原结合片段包含轻链可变(VL)区，其中全组VL CDR 1、2和3(组合)与SEQ ID NO:8的CDR 1、2和3具有至少80％(诸如，例如80％、85％、90％、95％、至少85％、至少90％、至少95％)序列同一性。在一些实施方案中，ALPG/P抗体或抗原结合片段包含轻链可变(VL)区，其中全组VL CDR 1、2和3(组合)与SEQ ID NO:8的CDR1、2和3具有至少85％(诸如，例如85％、90％、95％、至少90％、至少95％)序列同一性。在一些实施方案中，ALPG/P抗体或抗原结合片段包含轻链可变(VL)区，其中全组VL CDR 1、2和3(组合)与SEQ ID NO:8的CDR 1、2和3具有至少90％(诸如，例如90％、95％、至少95％)序列同一性。在一些实施方案中，ALPG/P抗体或抗原结合片段包含轻链可变(VL)区，其中全组VLCDR 1、2和3(组合)与SEQ ID NO:8的CDR 1、2和3具有至少95％序列同一性。
在一些实施方案中，ALPG/P抗体或抗原结合片段包含重链可变(VH)区，其中全组VH CDR 1、2和3(组合)与SEQ ID NO:7的CDR 1、2和3具有至少80％(诸如，例如80％、85％、90％、95％、至少85％、至少90％、至少95％)序列同一性。在一些实施方案中，ALPG/P抗体或抗原结合片段包含轻链可变(VL)区，其中全组VL CDR 1、2和3(组合)与SEQ ID NO:8的CDR1、2和3具有至少80％(诸如，例如80％、85％、90％、95％、至少85％、至少90％、至少95％)序列同一性。
在一些实施方案中，ALPG/P抗体或抗原结合片段包含重链可变(VH)区，所述重链可变(VH)区包含：
(i)VH互补决定区一(CDR1)，其包含相对于SEQ ID NO:1、173、174、175或176具有至多两个(例如，一个、两个、零个)氨基酸修饰的序列；
(ii)VH CDR2，其包含相对于SEQ ID NO:2、177、178、179或180具有至多两个(例如，一个、两个、零个)氨基酸修饰的序列；
(iii)VH CDR3，其包含相对于SEQ ID NO:3、181或182具有至多两个(例如，一个、两个、零个)氨基酸修饰的序列；
(iv)VL CDR1，其包含相对于SEQ ID NO:4、183或184具有至多两个(例如，一个、两个、零个)氨基酸修饰的序列；
(v)VL CDR2，其包含相对于SEQ ID NO:5、185或186具有至多两个(例如，一个、两个、零个)氨基酸修饰的序列；和
(vi)VL CDR3，其包含相对于SEQ ID NO:6或187具有至多两个(例如，一个、两个、零个)氨基酸修饰的序列。
在一些实施方案中，每个氨基酸修饰(如果有的话)是保守性氨基酸取代。在一些实施方案中，每个氨基酸修饰(如果有的话)是表A1中列出的保守性氨基酸取代。
在一些实施方案中，VH CDR1包含相对于SEQ ID NO:1、173、174、175或176具有至多一个氨基酸修饰的序列。在一些实施方案中，VH CDR2包含相对于SEQ ID NO:2、177、178、179或180具有至多一个氨基酸修饰的序列。在一些实施方案中，VH CDR3包含相对于SEQ IDNO:3、181或182具有至多一个氨基酸修饰的序列。在一些实施方案中，VL CDR1包含相对于SEQ ID NO:4、183或184具有至多一个氨基酸修饰的序列。在一些实施方案中，VL CDR2包含相对于SEQ ID NO:5、185或186具有至多一个氨基酸修饰的序列。在一些实施方案中，VLCDR3包含相对于SEQ ID NO:6或187具有至多一个氨基酸修饰的序列。在一些实施方案中，所述至多一个氨基酸修饰是氨基酸取代。在一些实施方案中，所述至多一个氨基酸修饰是保守性氨基酸取代。在一些实施方案中，所述至多一个氨基酸修饰是氨基酸缺失。在一些实施方案中，所述至多一个氨基酸修饰是氨基酸添加。
在一些实施方案中，VH CDR1包含如SEQ ID NO:1所示的序列。在一些实施方案中，VH CDR2包含如SEQ ID NO:2所示的序列。在一些实施方案中，VH CDR3包含如SEQ ID NO:3所示的序列。
在一些实施方案中，VL CDR1包含如SEQ ID NO:4所示的序列。在一些实施方案中，VL CDR2包含如SEQ ID NO:5所示的序列。在一些实施方案中，VL CDR3包含如SEQ ID NO:6所示的序列。
在一些实施方案中，ALPG/P抗体或抗原结合片段包含重链可变(VH)区，所述重链可变(VH)区包含：
(i)VH互补决定区一(CDR1)，其包含SEQ ID NO:1所示的序列；
(ii)VH CDR2，其包含SEQ ID NO:2所示的序列；
(iii)VH CDR3，其包含SEQ ID NO:3所示的序列；
(iv)VL互补决定区一(CDR1)，其包含SEQ ID NO:4所示的序列；
(v)VL CDR2，其包含SEQ ID NO:5所示的序列；和
(ivi)VL CDR3，其包含SEQ ID NO:6所示的序列。
在一些实施方案中，ALPG/P抗体或抗原结合片段包含重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区，所述重链可变(VH)区包含含有SEQ ID NO:1、2和3的序列的VH CDR1、VH CDR2和VHCDR3，所述轻链可变(VL)区包含分别包含SEQ ID NO:4、5和6的序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
在一些实施方案中，ALPG/P抗体或抗原结合片段包含重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区，所述重链可变(VH)区包含SEQ ID NO:7的CDR1、CDR2和CDR3，所述轻链可变(VL)区包含SEQ ID NO:8的CDR1、CDR2和CDR3。
在一些实施方案中，VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3序列存在于人VH框架中。
在一些实施方案中，ALPG/P抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO:7具有至少80％(诸如，例如80％、85％、90％、95％、至少85％、至少90％、至少95％)序列同一性。在一些实施方案中，ALPG/P抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO:7具有至少85％(诸如，例如85％、90％、95％、至少90％、至少95％)序列同一性。在一些实施方案中，ALPG/P抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO:7具有至少90％(诸如，例如90％、95％、至少95％)序列同一性的重链可变(VH)区。在一些实施方案中，ALPG/P抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO:7具有至少95％序列同一性的重链可变(VH)区。
在一些实施方案中，ALPG/P抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO:8具有至少80％(诸如，例如80％、85％、90％、95％、至少85％、至少90％、至少95％)序列同一性的轻链可变(VL)区。在一些实施方案中，ALPG/P抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO:8具有至少85％(诸如，例如85％、90％、95％、至少90％、至少95％)序列同一性的轻链可变(VL)区。在一些实施方案中，ALPG/P抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO:8具有至少90％(诸如，例如90％、95％、至少95％)序列同一性的轻链可变(VL)区。在一些实施方案中，ALPG/P抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO:8具有至少95％序列同一性的轻链可变(VL)区。
在一些实施方案中，ALPG/P抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO:7具有至少80％(诸如，例如80％、85％、90％、95％、至少85％、具有至少90％、至少95％)序列同一性的重链可变(VH)区。在一些实施方案中，ALPG/P抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO:8具有至少80％(诸如，例如80％、85％、90％、95％、至少85％、至少90％、至少95％)序列同一性的轻链可变(VL)区。
在一些实施方案中，ALPG/P抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:7的重链可变(VH)区。在一些实施方案中，ALPG/P抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:8的轻链可变(VL)区。
在一些实施方案中，ALPG/P抗体或抗原结合片段特异性地结合至人ALPG/P。
在一些实施方案中，ALPG/P抗体或抗原结合片段以约10-9M至约10-6M的KD结合至人ALPG/P。在一些实施方案中，ALPG/P抗体或抗原结合片段以≤5x 10-7M的KD结合至人ALPG/P。在一些实施方案中，ALPG/P抗体或抗原结合片段以≤1x 10-7M的KD结合至人ALPG/P。在一些实施方案中，ALPG/P抗体或抗原结合片段以≤5x 10-8M的KD结合至人ALPG/P。在一些实施方案中，ALPG/P抗体或抗原结合片段以≤2x 10-8M的KD结合至人ALPG/P。在一些实施方案中，ALPG/P抗体或抗原结合片段以≤1x 10-8M的KD结合至人ALPG/P。在一些实施方案中，ALPG/P抗体或抗原结合片段以≤1x 10-9M的KD结合至人ALPG/P。
嵌合受体
在一方面，本文提供了结合至间皮素(MSLN)的嵌合受体，所述嵌合受体包含可变重(VH)链序列，所述可变重(VH)链序列包含三个重链CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中：CDR-H1包含SEQ ID NO:14、202、203、204或205所示的序列，CDR-H2包含SEQ ID NO:15、206、207、208或209所示的序列，并且CDR-H3包含SEQ ID NO:16、210或211所示的序列。
在一些实施方案中，MSLN嵌合受体包含可变重(VH)链序列，所述可变重(VH)链序列包含三个重链CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。在一些实施方案中，VH链序列包含SEQID NO:17所示的序列。在一些实施方案中，VH链序列包含SEQ ID NO:17所示的序列。
在一些实施方案中，MSLN嵌合受体CDR-H3与SEQ ID NO:16、210或211的CDR-H3具有至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性；CDR-H2与SEQ ID NO:15、206、207、208或209的CDR-H2具有至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性；CDR-H1与SEQ IDNO:14、202、203、204或205的CDR-H1具有至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性。在一些实施方案中，CDR-H3是具有多达1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个氨基酸取代的SEQ ID NO:16、210或211的CDR-H3；CDR-H2是具有多达1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个氨基酸取代的SEQ ID NO:15、206、207、208或209的CDR-H2；并且CDR-H1是具有多达1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代的SEQ ID NO:14、202、203、204或205的CDR-H1。
在一些实施方案中，本文提供的MSLN嵌合受体包含如SEQ ID NO:17所示的VH结构域的一个至三个CDR。在一些实施方案中，本文提供的MSLN嵌合受体包含如SEQ ID NO:17所示的VH结构域的两个至三个CDR。在一些实施方案中，本文提供的MSLN嵌合受体包含如SEQID NO:17所示的VH结构域的三个CDR。在一些方面，CDR为Kabat CDR。在一些方面，CDR为Chothia CDR。在一些方面，CDR为AbM CDR。在一些方面，CDR为Contact CDR。在一些方面，CDR为IMGT CDR。
在一些实施方案中，本文提供的MSLN嵌合受体包含与SEQ ID NO:17所示的VH序列具有至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％同一性的VH序列。在一些实施方案中，本文提供的MSLN嵌合受体包含具有多达1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个氨基酸取代的SEQ ID NO:17所提供的VH序列。在一些方面，氨基酸取代是保守性氨基酸取代。在一些实施方案中，本段中描述的抗原结合结构域在本文中称为“变体”。在一些实施方案中，此类变体例如通过亲和力成熟、定点诱变、随机诱变或本领域中已知或本文所述的任何其他方法来由本文提供的序列获得。在一些实施方案中，此类变体不由本文提供的序列获得，并且可例如根据本文提供的用于获得抗体或抗原结合结构域的方法来重新分离。
在一些方面，本文提供了结合至间皮素(MSLN)的嵌合受体，所述嵌合受体包含可变重(VHH)链序列，所述可变重(VHH)链序列包含三个重链CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中：CDR-H1包含SEQ ID NO:10所示的序列，CDR-H2包含SEQ ID NO:11所示的序列，并且CDR-H3包含SEQ ID NO:12所示的序列。
在一些方面，MSLN嵌合受体包含可变重(VHH)链序列，所述可变重(VHH)链序列包含三个重链CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。在一些实施方案中，VHH链序列包含SEQ IDNO:13所示的序列。
在一些实施方案中，MSLN嵌合受体CDR-H3与SEQ ID NO:12、200或201的CDR-H3具有至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性；CDR-H2与SEQ ID NO:11、196、197、198或199的CDR-H2具有至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性；CDR-H1与SEQ IDNO:10、192、193、194或195的CDR-H1具有至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性。在一些实施方案中，CDR-H3是具有多达1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个氨基酸取代的SEQ ID NO:12、200或201的CDR-H3；CDR-H2是具有多达1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个氨基酸取代的SEQ ID NO:11、196、197、198或199的CDR-H2；并且CDR-H1是具有多达1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代的SEQ ID NO:10、192、193、194或195的CDR-H1。
在一些实施方案中，本文提供的MSLN嵌合受体包含如SEQ ID NO:13所示的VHH结构域的一个至三个CDR。在一些实施方案中，本文提供的MSLN嵌合受体包含如SEQ ID NO:13所示的VHH结构域的两个至三个CDR。在一些实施方案中，本文提供的抗原结合结构域包含如SEQ ID NO:13所示的VHH结构域的三个CDR。在一些方面，CDR为Kabat CDR。在一些方面，CDR为Chothia CDR。在一些方面，CDR为AbM CDR。在一些方面，CDR为Contact CDR。在一些方面，CDR为IMGT CDR。
在一些实施方案中，本文提供的MSLN嵌合受体包含与SEQ ID NO:13所示的VHH序列具有至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％同一性的VHH序列。在一些实施方案中，本文提供的抗原结合结构域包含具有多达1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个氨基酸取代的SEQ ID NO:13所提供的VHH序列。在一些方面，氨基酸取代是保守性氨基酸取代。在一些实施方案中，本段中描述的抗原结合结构域在本文中称为“变体”。在一些实施方案中，此类变体例如通过亲和力成熟、定点诱变、随机诱变或本领域中已知或本文所述的任何其他方法来由本文提供的序列获得。在一些实施方案中，此类变体不由本文提供的序列获得，并且可例如根据本文提供的用于获得抗体或抗原结合结构域的方法来重新分离。
在一些实施方案中，MSLN嵌合受体包含重链可变(VH)区，其中全组VH CDR 1、2和3(组合)与SEQ ID NO:13或17之一的CDR 1、2和3具有至少80％(诸如，例如80％、85％、90％、95％、至少85％、至少90％、至少95％)序列同一性。在一些实施方案中，MSLN嵌合受体包含重链可变(VH)区，其中全组VH CDR 1、2和3(组合)与SEQ ID NO:13或17之一的CDR 1、2和3具有至少85％(诸如，例如85％、90％、95％、至少90％、至少95％)序列同一性。在一些实施方案中，MSLN嵌合受体包含重链可变(VH)区，其中全组VH CDR 1、2和3(组合)与SEQ ID NO:13或17之一的CDR 1、2和3具有至少90％(诸如，例如90％、95％、至少95％)序列同一性。在一些实施方案中，MSLN嵌合受体包含重链可变(VH)区，其中全组VH CDR 1、2和3(组合)与SEQ ID NO:13或17之一的CDR 1、2和3具有至少95％序列同一性。
在一些实施方案中，MSLN嵌合受体包含重链可变(VH)区，其中全组VH CDR 1、2和3(组合)与SEQ ID NO:13的CDR 1、2和3具有至少80％(诸如，例如80％、85％、90％、95％、至少85％、至少90％、至少95％)序列同一性。在一些实施方案中，MSLN嵌合受体包含重链可变(VH)区，其中全组VH CDR1、2和3(组合)与SEQ ID NO:17的CDR 1、2和3具有至少80％(诸如，例如80％、85％、90％、95％、至少85％、至少90％、至少95％)序列同一性。
在一些实施方案中，MSLN嵌合受体包含重链可变(VH)区，所述重链可变(VH)区包含：
(i)VH互补决定区一(CDR1)，其包含相对于SEQ ID NO:10、192、193、194或195具有至多两个(例如，一个、两个、零个)氨基酸修饰的序列；
(ii)VH CDR2，其包含相对于SEQ ID NO:11、196、197、198或199具有至多两个(例如，一个、两个、零个)氨基酸修饰的序列；和
(iii)VH CDR3，其包含相对于SEQ ID NO:12、200或201具有至多两个(例如，一个、两个、零个)氨基酸修饰的序列。
在一些实施方案中，MSLN嵌合受体包含重链可变(VH)区，所述重链可变(VH)区包含：
(i)VH互补决定区一(CDR1)，其包含相对于SEQ ID NO:14、202、203、204或205具有至多两个(例如，一个、两个、零个)氨基酸修饰的序列；
(ii)VH CDR2，其包含相对于SEQ ID NO:15、206、207、208或209具有至多两个(例如，一个、两个、零个)氨基酸修饰的序列；和
(iii)VH CDR3，其包含相对于SEQ ID NO:16、210或211具有至多两个(例如，一个、两个、零个)氨基酸修饰的序列。
在一些实施方案中，每个氨基酸修饰(如果有的话)是保守性氨基酸取代。在一些实施方案中，每个氨基酸修饰(如果有的话)是表A1中列出的保守性氨基酸取代。
在一些实施方案中，MSLN嵌合受体VH CDR1包含相对于SEQ ID NO:10、192、193、194或195具有至多一个氨基酸修饰的序列。在一些实施方案中，MSLN嵌合受体VH CDR2包含相对于SEQ ID NO:11、196、197、198或199具有至多一个氨基酸修饰的序列。在一些实施方案中，MSLN嵌合受体VH CDR3包含相对于SEQ ID NO:12、200或201具有至多一个氨基酸修饰的序列。在一些实施方案中，MSLN嵌合受体VH CDR1包含相对于SEQ ID NO:14、202、203、204或205具有至多一个氨基酸修饰的序列。在一些实施方案中，MSLN嵌合受体VH CDR2包含相对于SEQ ID NO:15、206、207、208或209具有至多一个氨基酸修饰的序列。在一些实施方案中，MSLN嵌合受体VH CDR3包含相对于SEQ ID NO:16、210或211具有至多一个氨基酸修饰的序列。在一些实施方案中，所述至多一个氨基酸修饰是氨基酸取代。在一些实施方案中，所述至多一个氨基酸修饰是保守性氨基酸取代。在一些实施方案中，所述至多一个氨基酸修饰是氨基酸缺失。在一些实施方案中，所述至多一个氨基酸修饰是氨基酸添加。
在一些实施方案中，MSLN嵌合受体VH CDR1包含如SEQ ID NO:10所示的序列。在一些实施方案中，MSLN嵌合受体VH CDR2包含如SEQ ID NO:11所示的序列。在一些实施方案中，MSLN嵌合受体VH CDR3包含如SEQ ID NO:12所示的序列。
在一些实施方案中，MSLN嵌合受体VH CDR1包含如SEQ ID NO:14所示的序列。在一些实施方案中，MSLN嵌合受体VH CDR2包含如SEQ ID NO:15所示的序列。在一些实施方案中，MSLN嵌合受体VH CDR3包含如SEQ ID NO:16所示的序列。
在一些实施方案中，MSLN嵌合受体包含重链可变(VH)区，所述重链可变(VH)区包含：
(i)VH互补决定区一(CDR1)，其包含SEQ ID NO:10所示的序列；
(ii)VH CDR2，其包含SEQ ID NO:11所示的序列；和
(iii)VH CDR3，其包含SEQ ID NO:12所示的序列。
在一些实施方案中，MSLN嵌合受体包含重链可变(VH)区，所述重链可变(VH)区包含：
(i)VH互补决定区一(CDR1)，其包含SEQ ID NO:14所示的序列；
(ii)VH CDR2，其包含SEQ ID NO:15所示的序列；和
(iii)VH CDR3，其包含SEQ ID NO:16所示的序列。
在一些实施方案中，MSLN嵌合受体包含重链可变(VH)区，所述重链可变(VH)区包含分别包含SEQ ID NO:10、11和12的序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。在一些实施方案中，MSLN嵌合受体包含重链可变(VH)区，所述重链可变(VH)区包含分别包含SEQ ID NO:14、15和16的序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。
在一些实施方案中，MSLN嵌合受体包含重链可变(VH)区，所述重链可变(VH)区包含SEQ ID NO:13或17之一的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，MSLN嵌合受体包含重链可变(VH)区，所述重链可变(VH)区包含SEQ ID NO:13的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，MSLN嵌合受体包含重链可变(VH)区，所述重链可变(VH)区包含SEQ ID NO:17的CDR1、CDR2和CDR3。
在一些实施方案中，VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3序列存在于人VH框架中。
在一些实施方案中，MSLN嵌合受体包含与SEQ ID NO:13或17之一具有至少80％(诸如，例如80％、85％、90％、95％、至少85％、至少90％、至少95％)序列同一性的重链可变(VH)区。在一些实施方案中，MSLN嵌合受体包含与SEQ ID NO:13或17之一具有至少85％(诸如，例如85％、90％、95％、至少90％、至少95％)序列同一性的重链可变(VH)区。在一些实施方案中，MSLN嵌合受体包含与SEQ ID NO:13或17之一具有至少90％(诸如，例如90％、95％、至少95％)序列同一性的重链可变(VH)区。在一些实施方案中，MSLN嵌合受体包含与SEQ IDNO:13或17之一具有至少95％序列同一性的重链可变(VH)区。
在一些实施方案中，MSLN嵌合受体包含与SEQ ID NO:13具有至少80％(诸如，例如80％、85％、90％、95％、至少85％、至少90％、至少95％)序列同一性的重链可变(VH)区。在一些实施方案中，MSLN嵌合受体包含与SEQ ID NO:17具有至少80％(诸如，例如80％、85％、90％、95％、至少85％、至少90％、至少95％)序列同一性的重链可变(VH)区。
在一些实施方案中，MSLN嵌合受体包含SEQ ID NO:13的重链可变(VH)区。在一些实施方案中，MSLN嵌合受体包含SEQ ID NO:17的重链可变(VH)区。
在一些实施方案中，MSLN嵌合受体特异性地结合至人MSLN。
在一些实施方案中，MSLN嵌合受体以约10-9M至约10-6M的KD结合至人MSLN。在一些实施方案中，MSLN嵌合受体以≤5x 10-7M的KD结合至人MSLN。在一些实施方案中，MSLN嵌合受体以≤1x 10-7M的KD结合至人MSLN。在一些实施方案中，MSLN嵌合受体以≤5x 10-8M的KD结合至人MSLN。在一些实施方案中，MSLN嵌合受体以≤2x 10-8M的KD结合至人MSLN。在一些实施方案中，MSLN嵌合受体以≤1x 10-8M的KD结合至人MSLN。在一些实施方案中，MSLN嵌合受体以≤1x 10-9M的KD结合至人MSLN。
在一些实施方案中，MSLN嵌合受体是嵌合抗原受体或启动受体。
嵌合抗原受体
在另一方面，本文提供了包含特异性地结合至间皮素(MSLN；NCBI Entrez基因：10232；UniProtKB/Swiss-Prot：Q13421)的细胞外抗原结合结构域的嵌合抗原受体。重组CAR可以是包含完全人序列(例如，天然人序列)的人CAR。
在一些实施方案中，嵌合抗原受体包括包含抗原结合结构域的细胞外部分。受体(诸如CAR)的抗原识别结构域可以连接至一种或多种细胞内信号传导组分，诸如在CAR的情况下模拟通过抗原受体复合物(诸如TCR复合物)激活的信号传导组分，和/或经由另一细胞表面受体进行信号传导。因此，在一些实施方案中，细胞外结合组分(例如，配体结合或抗原结合结构域)连接至一个或多个跨膜和细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域与细胞外结构域融合。在一个实施方案中，使用天然与受体(例如，CAR)中的结构域之一相缔合的跨膜结构域。在一些情况下，通过氨基酸取代选择或修饰跨膜结构域，以避免此类结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，从而最大限度地减少与受体复合物的其他成员的相互作用。
在一些方面，嵌合抗原受体包括包含本文所述的抗原结合结构域的细胞外部分和细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，抗体或片段包括scFv、VH或单结构域VH抗体并且细胞内结构域含有ITAM。在一些方面，细胞内信号传导结构域包括CD3ζ(CD3)链的ζ链的信号传导结构域。在一些实施方案中，嵌合抗原受体包括连接细胞外结构域和细胞内信号传导结构域的跨膜结构域。
在一些方面，跨膜结构域含有CD8a或CD28的跨膜部分。细胞外结构域和跨膜可以直接或间接连接。在一些实施方案中，细胞外结构域和跨膜通过间隔区，诸如本文所述的任何间隔区连接。在一些实施方案中，嵌合抗原受体含有T细胞共刺激分子的胞内结构域，诸如在跨膜结构域和细胞内信号传导结构域之间。在一些方面，T细胞共刺激分子是CD28或41BB。
嵌合抗原受体CDR、VH、VL结构域
在一些方面，嵌合抗原受体细胞外抗原结合结构域包含MSLN抗体或其抗原结合片段。
在一些方面，嵌合抗原受体细胞外抗原结合结构域包含可变重(VH)链序列，所述可变重(VH)链序列包含三个重链CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。在一些实施方案中，VH链序列包含SEQ ID NO:17所示的序列。
在一些实施方案中，嵌合抗原受体细胞外抗原结合结构域CDR-H3与SEQ ID NO:16的CDR-H3具有至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性，CDR-H2与SEQ ID NO:15的CDR-H2具有至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性，CDR-H1与SEQ ID NO:14的CDR-H1具有至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性。在一些实施方案中，CDR-H3是具有多达1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个氨基酸取代的SEQ ID NO:16的CDR-H3；CDR-H2是具有多达1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个氨基酸取代的SEQ ID NO:15的CDR-H2；并且CDR-H1是具有多达1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代的SEQ ID NO:14的CDR-H1。
在一些实施方案中，本文提供的嵌合抗原受体细胞外抗原结合结构域包含如SEQID NO:17所示的VH结构域的一个至三个CDR。在一些实施方案中，本文提供的抗原结合结构域包含如SEQ ID NO:17所示的VH结构域的两个至三个CDR。在一些实施方案中，本文提供的抗原结合结构域包含如SEQ ID NO:17所示的VH结构域的三个CDR。在一些方面，CDR为KabatCDR。在一些方面，CDR为Chothia CDR。在一些方面，CDR为AbM CDR。在一些方面，CDR为Contact CDR。在一些方面，CDR为IMGT CDR。
在一些实施方案中，本文提供的嵌合抗原受体细胞外抗原结合结构域包含与SEQID NO:17所示的VH序列具有至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％同一性的VH序列。在一些实施方案中，本文提供的抗原结合结构域包含具有多达1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个氨基酸取代的SEQ ID NO:17所提供的VH序列。在一些方面，氨基酸取代是保守性氨基酸取代。在一些实施方案中，本段中描述的抗原结合结构域在本文中称为“变体”。在一些实施方案中，此类变体例如通过亲和力成熟、定点诱变、随机诱变或本领域中已知或本文所述的任何其他方法来由本文提供的序列获得。在一些实施方案中，此类变体不由本文提供的序列获得，并且可例如根据本文提供的用于获得抗体或抗原结合结构域的方法来重新分离。
在一些方面，嵌合抗原受体细胞外抗原结合结构域包含单个抗体可变重(VHH)链序列，所述抗体可变重(VHH)链序列包含三个重链CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。在一些实施方案中，VHH链序列包含SEQ ID NO:13所示的序列。
在一些实施方案中，嵌合抗原受体细胞外抗原结合结构域CDR-H3与SEQ ID NO:12的CDR-H3具有至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性，CDR-H2与SEQ ID NO:11的CDR-H2具有至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性，CDR-H1与SEQ ID NO:10的CDR-H1具有至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性。在一些实施方案中，CDR-H3是具有多达1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个氨基酸取代的SEQ ID NO:12的CDR-H3；CDR-H2是具有多达1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个氨基酸取代的SEQ ID NO:11的CDR-H2；并且CDR-H1是具有多达1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代的SEQ ID NO:10的CDR-H1。
在一些实施方案中，本文提供的嵌合抗原受体细胞外抗原结合结构域包含如SEQID NO:13所示的VHH结构域的一个至三个CDR。在一些实施方案中，本文提供的抗原结合结构域包含如SEQ ID NO:13所示的VHH结构域的两个至三个CDR。在一些实施方案中，本文提供的抗原结合结构域包含如SEQ ID NO:13所示的VHH结构域的三个CDR。在一些方面，CDR为Kabat CDR。在一些方面，CDR为Chothia CDR。在一些方面，CDR为AbM CDR。在一些方面，CDR为Contact CDR。在一些方面，CDR为IMGT CDR。
在一些实施方案中，本文提供的嵌合抗原受体细胞外抗原结合结构域包含与SEQID NO:13所示的VHH序列具有至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％同一性的VHH序列。在一些实施方案中，本文提供的抗原结合结构域包含具有多达1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个氨基酸取代的SEQ ID NO:13所提供的VHH序列。在一些方面，氨基酸取代是保守性氨基酸取代。在一些实施方案中，本段中描述的抗原结合结构域在本文中称为“变体”。在一些实施方案中，此类变体例如通过亲和力成熟、定点诱变、随机诱变或本领域中已知或本文所述的任何其他方法来由本文提供的序列获得。在一些实施方案中，此类变体不由本文提供的序列获得，并且可例如根据本文提供的用于获得抗体或抗原结合结构域的方法来重新分离。
表C提供了根据指示编号方案的SEQ ID NO:13的VHH和SEQ ID NO:17的VHH的例示性MSLN抗原结合结构域CDR序列。
CAR跨膜结构域
在一些实施方案中，跨膜结构域源自天然来源或合成来源。在来源是天然的情况下，在一些方面结构域源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。跨膜区包括源自(即，至少包含以下的跨膜区)T细胞受体的α、β或ζ链，CD28，CD3ε，CD45，CD4，CD5，CDS，CD9，CD16，CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD 134，CD137和/或CD154的跨膜区。或者，在一些实施方案中，跨膜结构域是合成的。在一些方面，合成的跨膜结构域主要包含疏水性残基，诸如亮氨酸和缬氨酸。在一些方面，苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体将存在于合成的跨膜结构域的每一端。在一些实施方案中，连接是通过接头、间隔区和/或跨膜结构域完成的。
在一些实施方案中，受体(例如，CAR)的跨膜结构域是人CD28或其变体的跨膜结构域，例如人CD28(登录号：P10747.1)的27个氨基酸的跨膜结构域。
在一些实施方案中，CAR包含CD8a TMD。在一些实施方案中，CD8aTMD包含SEQ IDNO:27所示的序列。
CAR铰链
在一些实施方案中，CAR还包括间隔区，间隔区可以是或包括免疫球蛋白恒定区或其变体或修饰型式的至少一部分，诸如铰链区(例如，CD8a铰链、IgG4铰链区)，和/或CH1/CL和/或Fc区。在一些实施方案中，恒定区或部分属于人IgG，诸如IgG4或IgG1。在一些方面，恒定区的部分用作抗原识别组分(例如，scFv)与跨膜结构域之间的间隔区。与不存在间隔区的情况相比，间隔区的长度可增加细胞在抗原结合后的应答性。在一些实例中，间隔区的长度为或约为12个氨基酸，或者长度不超过12个氨基酸。示例性间隔区包括具有至少约10至229个氨基酸、约10至200个氨基酸、约10至175个氨基酸、约10至150个氨基酸、约10至125个氨基酸、约10至100个氨基酸、约10至75个氨基酸、约10至50个氨基酸、约10至40个氨基酸、约10至30个氨基酸、约10至20个氨基酸，或约10至15个氨基酸(并且包括任何所列范围的端点之间的任何整数)的那些。在一些实施方案中，间隔区具有约12个或更少的氨基酸、约119个或更少的氨基酸，或约229个或更少的氨基酸。示例性间隔区包括CD8a铰链、单独的IgG4铰链、连接至CH2和CH3结构域的IgG4铰链，或连接至CH3结构域的IgG4铰链。示例性间隔区包括但不限于Hudecek等人(2013)Clin.Cancer Res.,19:3153或国际专利申请公布第WO2014031687号中描述的间隔区。在一些实施方案中，CAR铰链包括CD8a铰链。在一些实施方案中，CD8a铰链包含SEQ ID NO:26所示的序列。
在细胞内信号传导结构域中，有通过天然抗原受体模拟或近似信号、通过这种受体与共刺激受体的组合模拟或近似信号和/或通过单独的共刺激受体模拟或近似信号的那些。在一些实施方案中，存在短的寡肽或多肽接头，例如长度为2与10个氨基酸之间的接头，诸如含有甘氨酸和丝氨酸的接头，例如甘氨酸-丝氨酸双联体，并且所述接头在受体的跨膜结构域与细胞质信号传导结构域之间形成连接。
CAR细胞内结构域
在一些实施方案中，在连结CAR后，受体的细胞质结构域或细胞内信号传导结构域激活免疫细胞(例如，经工程化以表达受体的T细胞)的至少一种正常效应功能或应答。例如，在一些情形下，受体诱导T细胞的功能，诸如细胞溶解活性或T辅助细胞活性，诸如分泌细胞因子或其他因子。在一些实施方案中，例如，如果抗原受体组分或共刺激分子的细胞内信号传导结构域的截短部分转导效应功能信号，则使用其替代完整的免疫刺激链。在一些实施方案中，一个或多个细胞内信号传导结构域包括T细胞受体(TCR)的细胞质序列，并且在一些方面还包括在自然环境中与所述受体协同作用以在抗原受体接合后启始信号转导的共受体的细胞质序列，和/或此类分子的任何衍生物或变体，和/或具有相同功能能力的任何合成序列。
在一些方面，受体包括调控TCR复合物的初级激活的初级细胞质信号传导序列。以刺激方式起作用的初级细胞质信号传导序列可含有信号传导基序，该基序称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM。含有初级细胞质信号传导序列的ITAM的实例包括源自TCR或CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CDS、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。在一些实施方案中，CAR中的细胞质信号传导分子含有细胞质信号传导结构域、其部分或源自CD3ζ的序列。
在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含人CD3ζ刺激性信号传导结构域或其功能性变体，诸如人CD3ζ(登录号：P20963.2)的同种型3的112AA细胞质结构域或如美国专利第7,446,190号或美国专利第8,911,993号中描述的CD3ζ信号传导结构域。
受体，例如CAR，可以包括至少一种细胞内信号传导组分。在一些实施方案中，受体包括TCR复合物的细胞内组分，诸如介导T细胞激活和细胞毒性的TCR CD3链，例如CD3ζ链。因此，在一些方面，细胞外结构域连接至一个或多个细胞信号传导模块。在一些实施方案中，细胞信号传导模块包括CD3跨膜结构域、CD3细胞内信号传导结构域和/或其他CD跨膜结构域。在一些实施方案中，受体，例如CAR，还包括一种或多种另外分子(诸如Fc受体γ、CD8、CD4、CD25或CD16)的一部分。例如，在一些方面，CAR包括在CD3ζ或Fc受体γ与CD8、CD4、CD25或CD16之间的嵌合分子。在一些实施方案中，CAR包含CD3ζ激活结构域，所述CD3ζ激活结构域包含SEQ ID NO:29所示的序列。
在一些实施方案中，细胞内结构域包含41BB或其功能性变体或部分的细胞内共刺激信号传导结构域，诸如人4-1BB(登录号Q07011.1)或其功能性变体或部分的42个氨基酸的细胞质结构域。
在一些实施方案中，受体在细胞质部分包含一个或多个，例如两个或更多个共刺激结构域和激活结构域，例如初级激活结构域。示例性受体包括CD3ζ、CD28和4-1BB的细胞内组分。在一些实施方案中，嵌合抗原受体含有T细胞共刺激分子的细胞内结构域。在一些方面，T细胞共刺激分子是4-1BB。
在一些实施方案中，受体包括共刺激受体(诸如CD28、4-1BB、OX40、DAP10和ICOS)的信号传导结构域和/或跨膜部分。在一些方面，同一受体包括激活性组分和共刺激组分两者。
在某些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含连接至CD3(例如，CD3ζ)细胞内结构域的CD8a跨膜和信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含连接至CD3ζ细胞内结构域的4-1BB(CD137，TNFRSF9)共刺激结构域。在一些实施方案中，CAR包含4-1BB共刺激结构域。在一些实施方案中，4-1BB共刺激结构域包含SEQ ID NO:28所示的序列。
在一些实施方案中，CAR包含如SEQ ID NO:30、31、32或33所示的序列。在一些实施方案中，CAR包含如SEQ ID NO:30所示的序列。
在一些实施方案中，CAR或其他抗原受体还包括标志物，诸如细胞表面标志物，其可用于确认细胞的转导或工程化以表达受体，诸如细胞表面受体的截短型式，诸如截短的EGFR(tEGFR)。在一些方面，标志物包括CD34、神经生长因子受体(NGFR)或表皮生长因子受体(例如，tEGFR)的全部或部分(例如，截短形式)。在一些实施方案中，编码标志物的核酸可操作地连接至编码接头序列(诸如可裂解的接头序列或核糖体跳跃序列例如T2A)的多核苷酸。参见WO2014031687。在一些实施方案中，引入编码由T2A核糖体开关分隔开的CAR和EGFRt的构建体可以表达来自同一构建体的两种蛋白质，使得EGFRt可以用作检测表达这种构建体的细胞的标志物。在一些实施方案中，标志物和任选的接头序列可以是如公布的专利公布第WO2014031687号中所公开的任何标志物和接头序列。例如，标志物可以是截短的EGFR(tEGFR)，其任选地连接至接头序列，诸如T2A核糖体跳跃序列。
在一些实施方案中，标志物是分子，例如细胞表面蛋白，非天然存在于T细胞上或非天然存在于T细胞表面上，或其部分。
在一些实施方案中，分子是非自身分子，例如非自身蛋白质，即不被细胞将过继转移到其中的宿主的免疫系统识别为“自身”的分子。
在一些实施方案中，标志物不提供治疗功能和/或不产生别的作用，除了用作基因工程化的标志物，例如，用于选择成功工程化的细胞。在其他实施方案中，标志物可以是治疗性分子或以其他方式发挥某些所需作用的分子，诸如在体内遇到的细胞的配体，诸如增强和/或阻抑细胞在过继转移和遇到配体后的应答的共刺激或免疫检查点分子。
CAR可包含一个或修饰的合成氨基酸来代替一个或多个天然存在的氨基酸。示例性的修饰的氨基酸包括但不限于氨基环己烷羧酸、正亮氨酸、α-氨基正癸酸、高丝氨酸、S-乙酰氨基甲基半胱氨酸、反式-3-羟脯氨酸和反式-4-羟脯氨酸、4-氨基苯丙氨酸、4-硝基苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、4-羧基苯丙氨酸、(3-苯基丝氨酸(3-羟基苯丙氨酸、苯基甘氨酸、α-萘基丙氨酸、环己基丙氨酸、环己基甘氨酸、二氢吲哚-2-羧酸、1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸、氨基丙二酸、氨基丙二酸单酰胺、N'-苄基-N'-甲基-赖氨酸、N',N'-二苄基-赖氨酸、6-羟赖氨酸、鸟氨酸、α-氨基环戊烷羧酸、α-氨基环己烷羧酸、α-氨基环庚烷羧酸、α-(2-氨基-2-降冰片烷)-羧酸、α,γ-二氨基丁酸、α,γ-二氨基丙酸、高苯丙氨酸和α-叔丁基甘氨酸。
例如，在一些实施方案中，CAR包括抗体或其片段，包括本文所述的单链抗体(sdAb，例如仅含有VH区)、VH结构域和scFv；间隔区，诸如CD8a铰链；CD8a跨膜结构域；4-1BB细胞内信号传导结构域；和CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR包括抗体或片段，包括本文所述的sdAb和scFv；间隔区，诸如CD8a铰链；CD8a跨膜结构域；4-1BB细胞内信号传导结构域；和CD3ζ信号传导结构域。
MSLN抗体和抗原结合片段
在一些方面，本文提供MSLN抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，MSLN抗原结合部分选自抗体、纳米抗体、双抗体、三抗体或微型抗体、F(ab')2片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)和单结构域抗体(sdAb)或其功能性片段。在一些实施方案中，抗原结合部分包含scFv。抗原结合部分可以包括天然存在的氨基酸序列或者可经工程化、设计或修饰以提供所需的和/或改进的特性，例如增加的结合亲和力。
在一些方面，本文提供了结合至间皮素(MSLN)的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含单结构域抗体，所述单结构域抗体包含可变重(VHH)链序列，所述可变重(VHH)链序列包含三个重链CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中：CDR-H1包含SEQ ID NO:10所示的序列，CDR-H2包含SEQ ID NO:11所示的序列，并且CDR-H3包含SEQ ID NO:12所示的序列。
在一些方面，MSLN抗体或抗原结合片段包含单结构域抗体可变重(VHH)链序列，所述单结构域抗体可变重(VHH)链序列包含三个重链CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。在一些实施方案中，VHH链序列包含SEQ ID NO:13所示的序列。
在一些实施方案中，MSLN抗体或抗原结合片段CDR-H3与SEQ ID NO:12、200或201的CDR-H3具有至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性；CDR-H2与SEQ ID NO:11、196、197、198或199的CDR-H2具有至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性；CDR-H1与SEQ ID NO:10、192、193、194或195的CDR-H1具有至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性。在一些实施方案中，CDR-H3是具有多达1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个氨基酸取代的SEQ ID NO:12、200或201的CDR-H3；CDR-H2是具有多达1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个氨基酸取代的SEQ ID NO:11、196、197、198或199的CDR-H2；并且CDR-H1是具有多达1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代的SEQ ID NO:10、192、193、194或195的CDR-H1。
在一些实施方案中，本文提供的MSLN抗体或抗原结合片段包含如SEQ ID NO:13所示的VHH结构域的一个至三个CDR。在一些实施方案中，本文提供的抗原结合结构域包含如SEQ ID NO:13所示的VHH结构域的两个至三个CDR。在一些实施方案中，本文提供的抗原结合结构域包含如SEQ ID NO:13所示的VHH结构域的三个CDR。在一些方面，CDR为Kabat CDR。在一些方面，CDR为Chothia CDR。在一些方面，CDR为AbM CDR。在一些方面，CDR为ContactCDR。在一些方面，CDR为IMGT CDR。
在一些实施方案中，本文提供的MSLN抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO:13所示的VHH序列具有至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％同一性的VHH序列。在一些实施方案中，本文提供的抗原结合结构域包含具有多达1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个氨基酸取代的SEQ ID NO:13所提供的VHH序列。在一些方面，氨基酸取代是保守性氨基酸取代。在一些实施方案中，本段中描述的抗原结合结构域在本文中称为“变体”。在一些实施方案中，此类变体例如通过亲和力成熟、定点诱变、随机诱变或本领域中已知或本文所述的任何其他方法来由本文提供的序列获得。在一些实施方案中，此类变体不由本文提供的序列获得，并且可例如根据本文提供的用于获得抗体或抗原结合结构域的方法来重新分离。
在一些实施方案中，MSLN抗体或抗原结合片段包含重链可变(VH)区，其中全组VHCDR 1、2和3(组合)与SEQ ID NO:13的CDR 1、2和3具有至少80％(诸如，例如80％、85％、90％、95％、至少85％、至少90％、至少95％)序列同一性。在一些实施方案中，MSLN抗体或抗原结合片段包含重链可变(VH)区，其中全组VH CDR 1、2和3(组合)与SEQ ID NO:13的CDR1、2和3具有至少85％(诸如，例如85％、90％、95％、至少90％、至少95％)序列同一性。在一些实施方案中，MSLN抗体或抗原结合片段包含重链可变(VH)区，其中全组VH CDR 1、2和3(组合)与SEQ ID NO:13的CDR 1、2和3具有至少90％(诸如。例如90％、95％、至少95％)序列同一性。在一些实施方案中，MSLN抗体或抗原结合片段包含重链可变(VH)区，其中全组VHCDR 1、2和3(组合)与SEQ ID NO:13的CDR 1、2和3具有至少95％序列同一性。
在一些实施方案中，MSLN抗体或抗原结合片段包含重链可变(VH)区，所述重链可变(VH)区包含：
(i)VH互补决定区一(CDR1)，其包含相对于SEQ ID NO:10、192、193、194或195具有至多两个(例如，一个、两个、零个)氨基酸修饰的序列；
(ii)VH CDR2，其包含相对于SEQ ID NO:11、196、197、198或199具有至多两个(例如，一个、两个、零个)氨基酸修饰的序列；和
(iii)VH CDR3，其包含相对于SEQ ID NO:12、200或201具有至多两个(例如，一个、两个、零个)氨基酸修饰的序列。
在一些实施方案中，每个氨基酸修饰(如果有的话)是保守性氨基酸取代。在一些实施方案中，每个氨基酸修饰(如果有的话)是表A1中列出的保守性氨基酸取代。
在一些实施方案中，VH CDR1包含相对于SEQ ID NO:10、192、193、194或195具有至多一个氨基酸修饰的序列。在一些实施方案中，VH CDR2包含相对于SEQ ID NO:11、196、197、198或199具有至多一个氨基酸修饰的序列。在一些实施方案中，VH CDR3包含相对于SEQ ID NO:12、200或201具有至多一个氨基酸修饰的序列。在一些实施方案中，所述至多一个氨基酸修饰是氨基酸取代。在一些实施方案中，所述至多一个氨基酸修饰是保守性氨基酸取代。在一些实施方案中，所述至多一个氨基酸修饰是氨基酸缺失。在一些实施方案中，所述至多一个氨基酸修饰是氨基酸添加。
在一些实施方案中，VH CDR1包含如SEQ ID NO:10所示的序列。在一些实施方案中，VH CDR2包含如SEQ ID NO:11所示的序列。在一些实施方案中，VH CDR3包含如SEQ IDNO:12所示的序列。
在一些实施方案中，MSLN抗体或抗原结合片段包含重链可变(VH)区，所述重链可变(VH)区包含：
(i)VH互补决定区一(CDR1)，其包含SEQ ID NO:10所示的序列；
(ii)VH CDR2，其包含SEQ ID NO:11所示的序列；和
(iii)VH CDR3，其包含SEQ ID NO:12所示的序列。
在一些实施方案中，MSLN抗体或抗原结合片段包含重链可变(VH)区，所述重链可变(VH)区包含分别包含SEQ ID NO:10、11和12的序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。
在一些实施方案中，MSLN抗体或抗原结合片段包含重链可变(VH)区，所述重链可变(VH)区包含SEQ ID NO:13的CDR1、CDR2和CDR3。
在一些实施方案中，VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3序列存在于人VH框架中。
在一些实施方案中，MSLN抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO:13具有至少80％(诸如，例如80％、85％、90％、95％、至少85％、至少90％、至少95％)序列同一性的重链可变(VH)区。在一些实施方案中，MSLN抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO:13具有至少85％(诸如，例如85％、90％、95％、至少90％、至少95％)序列同一性的重链可变(VH)区。在一些实施方案中，MSLN抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO:13具有至少90％(诸如，例如90％、95％、至少95％)序列同一性的重链可变(VH)区。在一些实施方案中，MSLN抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO:13具有至少95％序列同一性的重链可变(VH)区。
在一些实施方案中，MSLN抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO:13具有至少80％(诸如，例如80％、85％、90％、95％、至少85％、至少90％、至少95％)序列同一性的重链可变(VH)区。
在一些实施方案中，MSLN抗体或抗原结合片段特异性地结合至人MSLN。
在一些实施方案中，MSLN抗体或抗原结合片段以约10-9M至约10-6M的KD结合至人MSLN。在一些实施方案中，MSLN抗体或抗原结合片段以≤5x 10-7M的KD结合至人MSLN。在一些实施方案中，MSLN抗体或抗原结合片段以≤1x 10-7M的KD结合至人MSLN。在一些实施方案中，MSLN抗体或抗原结合片段以≤5x 10-8M的KD结合至人MSLN。在一些实施方案中，MSLN抗体或抗原结合片段以≤2x 10-8M的KD结合至人MSLN。在一些实施方案中，MSLN抗体或抗原结合片段以≤1x 10-8M的KD结合至人MSLN。在一些实施方案中，MSLN抗体或抗原结合片段以≤1x 10-9M的KD结合至人MSLN。
在一些实施方案中，MSLN抗体或抗原结合片段是单结构域抗体。
在一些实施方案中，MSLN抗体或抗原结合片段是人单结构域抗体。
在一些实施方案中，MSLN抗体或抗原结合片段是分离的单结构域抗体。在一些实施方案中，MSLN抗体或抗原结合片段是分离的人单结构域抗体。
重组核酸和载体
在一方面，本文提供了重组核酸，其中一种或多种重组核酸编码：包含启动受体的第一嵌合多肽，所述启动受体包含特异性地结合至生殖细胞碱性磷酸酶(ALPG/P)的第一细胞外抗原结合结构域；包含CAR的第二嵌合多肽，所述CAR包含特异性地结合至间皮素(MSLN)的第二细胞外抗原结合结构域；和长度为至少15个核苷酸的核酸序列，其中所述核酸序列选自由以下组成的组：与包含SEQ ID NO:39所示序列的编码人FAS的mRNA的核苷酸1126至1364互补的核酸序列，与包含SEQ ID NO:40所示序列的编码人PTPN2的mRNA的核苷酸518至559互补的核酸序列，和与包含SEQ ID NO:41所示序列的编码人TOX的mRNA的核苷酸1294至2141互补的核酸序列。
在另一方面，本文提供了重组核酸，其中一种或多种重组核酸编码：包含启动受体的第一嵌合多肽，所述启动受体包含特异性地结合胎盘/生殖细胞碱性磷酸酶(ALPG/P)的第一细胞外抗原结合结构域，其中所述第一细胞外抗原结合结构域包含可变重(VH)链序列和可变轻(VL)链序列，所述可变重(VH)链序列包含三个重链CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述可变轻(VL)链序列包含三个轻链CDR序列CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中：CDR-H1包含SEQ ID NO:1所示的序列，CDR-H2包含SEQ ID NO:2所示的序列，CDR-H3包含SEQ ID NO:3所示的序列，CDR-L1包含SEQ ID NO:4所示的序列，CDR-L2包含SEQ ID NO:5所示的序列，并且CDR-L3包含SEQ ID NO:6所示的序列；包含嵌合抗原受体(CAR)的第二嵌合多肽；和长度为至少15个核苷酸的第一核酸序列，其中所述第一核酸序列与包含SEQ ID NO:39所示序列的编码人FAS的mRNA的核苷酸1126至1364互补；和长度为至少15个核苷酸的第二核酸序列，其中所述第二核酸序列与包含SEQ ID NO:40所示序列的编码人PTPN2的mRNA的核苷酸518至559互补，或者与包含SEQ ID NO:41所示序列的编码人TOX的mRNA的核苷酸1294至2141互补。
在另一方面，本文提供了重组核酸，其中一种或多种重组核酸编码：包含启动受体的第一嵌合多肽；包含嵌合抗原受体(CAR)的第二嵌合多肽，所述嵌合抗原受体包含特异性地结合至间皮素(MSLN)的细胞外抗原结合结构域，其中所述细胞外抗原结合结构域包含可变重(VH)链序列，所述可变重(VH)链序列包含三个重链CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中：CDR-H1包含SEQ ID NO:14所示的序列，CDR-H2包含SEQ ID NO:15所示的序列，并且CDR-H3包含SEQ ID NO:16所示的序列；和长度为至少15个核苷酸的第一核酸序列，其中所述第一核酸序列与包含SEQ ID NO:39所示序列的编码人FAS的mRNA的核苷酸1126至1364互补；和长度为至少15个核苷酸的第二核酸序列，其中所述第二核酸序列与包含SEQ ID NO:40所示序列的编码人PTPN2的mRNA的核苷酸518至559互补，或者与包含SEQ ID NO:41所示序列的编码人TOX的mRNA的核苷酸1294至2141互补。
在另一方面，本文提供了重组核酸，其中一种或多种重组核酸编码：包含启动受体的第一嵌合多肽；包含嵌合抗原受体(CAR)的第二嵌合多肽，所述嵌合抗原受体包含特异性地结合至间皮素(MSLN)的细胞外抗原结合结构域，其中所述细胞外抗原结合结构域包含单结构域抗体，所述单结构域抗体包含可变重(VHH)链序列，所述可变重(VHH)链序列包含三个重链CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中：CDR-H1包含SEQ ID NO:10所示的序列，CDR-H2包含SEQ ID NO:11所示的序列，并且CDR-H3包含SEQ ID NO:12所示的序列；和长度为至少15个核苷酸的第一核酸序列，其中所述第一核酸序列与包含SEQ ID NO:39所示序列的编码人FAS的mRNA的核苷酸1126至1364互补；和长度至少15个核苷酸的第二核酸序列，其中所述第二核酸序列与包含SEQ ID NO:40所示序列的编码人PTPN2的mRNA的核苷酸518至559互补，或者与包含SEQ ID NO:41所示序列的编码人TOX的mRNA的核苷酸1294至2141互补。
在一些实施方案中，重组核酸包含选自由SEQ ID NO:156-165所示序列组成的组的序列。
RNA干扰分子
Fas细胞表面死亡受体(FAS)是诱导细胞凋亡的TNF受体超家族成员。非受体型蛋白酪氨酸磷酸酶2(PTPN2)是一种调控干扰素和许多其他信号传导途径的磷酸酶。胸腺细胞选择相关高迁移率族盒(TOX)是调控耗竭T细胞分化的转录因子。
如本文所用，“靶基因”是指细胞中的核酸序列，其中可使用本文所述的重组核酸分子和方法特异性地且有效地调控该序列的表达。在某些实施方案中，靶基因可能牵涉于个体免疫细胞的生长(增殖)、维持(存活)和/或免疫行为。在一些实施方案中，靶基因是FAS。在一些实施方案中，靶基因是PTPN2。在一些实施方案中，靶基因是TOX。在一些实施方案中，使用本文所述的重组核酸分子和方法调控多于一个靶基因。在一些实施方案中，使用本文所述的重组核酸分子和方法调节至少两个靶基因。在一些实施方案中，所述一种或多种重组核酸分子是shRNA。在一些实施方案中，靶基因至少是FAS和PTPN2。在一些实施方案中，靶基因至少是FAS和TOX。
在一些实施方案中，重组核酸包含长度为至少15个核苷酸的核酸序列，所述核酸序列与包含SEQ ID NO:39所示序列的编码人FAS的mRNA的核苷酸1126至1364互补。
在一些实施方案中，重组核酸包含长度为至少15个核苷酸的核酸序列，所述核酸序列与包含SEQ ID NO:40所示序列的编码人非受体型蛋白酪氨酸磷酸酶2(PTPN2)的mRNA的核苷酸518至559互补。
在一些实施方案中，重组核酸包含长度为至少15个核苷酸的核酸序列，所述核酸序列与包含SEQ ID NO:41所示序列的编码人胸腺细胞选择相关高迁移率族盒(TOX)的mRNA的核苷酸1294至2141互补。
在一些实施方案中，重组核酸包含长度为至少15个核苷酸的第一核酸序列，所述第一核酸序列与包含SEQ ID NO:39所示序列的编码人FAS的mRNA的核苷酸1126至1364互补；和长度为至少15个核苷酸的第二核酸序列，所述第二核酸序列与包含SEQ ID NO:40所示序列的编码人非受体型蛋白酪氨酸磷酸酶2(PTPN2)的mRNA的核苷酸518至559互补。
在一些实施方案中，重组核酸包含长度为至少15个核苷酸的第一核酸序列，所述第一核酸序列与包含SEQ ID NO:39所示序列的编码人FAS的mRNA的核苷酸1126至1364互补；和长度为至少15个核苷酸的第二核酸序列，所述第二核酸序列与包含SEQ ID NO:41所示序列的编码人胸腺细胞选择相关高迁移率族盒(TOX)的mRNA的核苷酸1294至2141互补。
在一些实施方案中，重组核酸包含长度为至少15个核苷酸的第一核酸序列，所述第一核酸序列与包含SEQ ID NO:40所示序列的编码人非受体型蛋白酪氨酸磷酸酶2(PTPN2)的mRNA的核苷酸518至559互补；和长度为至少15个核苷酸的第二核酸序列，所述第二核酸序列与包含SEQ ID NO:41所示序列的编码人胸腺细胞选择相关高迁移率族盒(TOX)的mRNA的核苷酸1294至2141互补。
在一些实施方案中，核酸包含选自由SEQ ID NO:42-56所示序列组成的组的序列。在一些实施方案中，核酸包含SEQ ID NO:45所示的序列。在一些实施方案中，与不包含所述核酸的对照细胞相比，所述核酸能够将免疫细胞中FAS的表达降低至少50％、55％、60％、65％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。
在一些实施方案中，核酸包含选自由SEQ ID NO:72-84所示序列组成的组的序列。在一些实施方案中，核酸包含SEQ ID NO:82所示的序列。在一些实施方案中，与不包含所述核酸的对照细胞相比，所述核酸能够将免疫细胞中PTPN2的表达降低至少50％、55％、60％、65％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。
在一些实施方案中，核酸包含选自由SEQ ID NO:98-111所示序列组成的组的序列。在一些实施方案中，核酸包含SEQ ID NO:99或104所示的序列。在一些实施方案中，与不包含所述核酸的对照细胞相比，所述核酸能够将免疫细胞中TOX的表达降低至少50％、55％、60％、65％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。
在一些实施方案中，核酸序列的长度为至少16个、17个、18个、19个、20个、21个或22个核苷酸。
在一些实施方案中，核酸是RNA干扰(RNAi)分子。示例性RNAi分子包括短发夹RNA(shRNA)、小干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)或反义寡核苷酸。在一些实施方案中，核酸是短发夹RNA(shRNA)、小干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)或反义寡核苷酸。在一些实施方案中，核酸是shRNA。
单链发夹核糖核酸(shRNA)是短双链体，其中有义链和反义链通过发夹环连接。它们由茎环结构组成，可以在细胞中从质粒构建体上的RNA聚合酶II或RNA聚合酶III启动子转录。一旦表达，shRNA就会被加工成RNAi种类。从质粒表达shRNA被认为是相对稳定的，因此相比例如使用合成siRNA提供了强大的优势。shRNA表达单位可并入多种质粒、脂质体、病毒载体和其他媒介物中，用于递送和整合至靶细胞中。从质粒表达shRNA可以稳定整合以实现组成型表达。shRNA在细胞核中合成，经过进一步加工并转运至细胞质，然后并入RNA诱导性沉默复合物(RISC)中发挥活性。shRNA被转化为活性siRNA分子(其能够结合、隔离和/或阻止由靶基因编码的mRNA转录物的翻译)。
Argonaute蛋白质家族是RISC的主要组成部分。在Argonaute蛋白质家族中，只有Ago2含有能够从shRNA分子的茎部分裂解并释放随从链(passenger strand)的核酸内切酶活性。Argonaute家族的其余三个成员Ago1、Ago3和Ago4不具有可识别的核酸内切酶活性，也被组装到RISC中，并被认为通过裂解非依赖性方式发挥作用。因此，RISC可以被表征为具有裂解依赖性和裂解非依赖性途径。
RNAi(例如、反义RNA、siRNA、微小RNA、shRNA等)描述于国际公布号WO2018232356A1、WO2019084552A1、WO2019226998A1、WO2020014235A1、WO2020123871A1和WO2020186219A1中，所述公布各自出于所有目的以引用的方式并入本文。
反义寡核苷酸结构和化学修饰描述于国际PCT公布第WO20/132521号中，所述公布据此以引用的方式并入。
dsRNA和shRNA分子以及使用和生产方法描述于美国专利第8,829,264号、美国专利第9,556,431号和美国专利第8,252,526号中，所述专利各自据此以引用的方式并入。
siRNA分子以及使用和生产方法描述于美国专利第7,361,752号和美国专利申请第US20050048647号中，两项专利据此以引用的方式并入。
用于干扰RNA诸如shRNA、siRNA、dsRNA和反义寡核苷酸的另外的方法和组合物是本领域众所周知的，并且进一步描述于美国专利第7,361,752号、美国专利第8,829,264号、美国专利第9,556,431号、美国专利第8,252,526号、国际PCT公布第WO00/44895号、国际PCT公布第WO01/36646号、国际PCT公布第WO99/32619号、国际PCT公布第WO00/01846号、国际PCT公布第WO01/29058号和国际PCT公布第WO00/44914号、国际PCT公布第WO04/030634号中；所述专利各自据此以引用的方式并入。
可用于编码本文所述的RNAi分子(诸如shRNA)的核酸序列(或构建体)可包含启动子，所述启动子直接或间接可操作地连接(或连结)至编码RNAi分子的序列。可基于宿主细胞和所寻求的效果来选择此类启动子。适合启动子的非限制性实例包括组成型和诱导型启动子，诸如EF1α或基于RNA聚合酶II(pol II)的诱导型启动子。适合启动子的非限制性实例还包括四环素诱导型或阻抑型启动子、基于RNA聚合酶I或III的启动子、pol II依赖性病毒启动子(诸如CMV-IE启动子)，以及pol III U6和H1启动子。还可使用噬菌体T7启动子(在这种情况下，应当理解，T7聚合酶也必须存在)。核酸序列不需要局限于使用任何单个启动子，特别是因为核酸序列可包含两个或更多个shRNA(即，效应物的组合)，包括但不限于并入的shRNA分子。每个并入的启动子可控制shRNA分子组分中的一种或任意组合。
在某些实施方案中，启动子可优先在靶细胞中具有活性，例如，可能期望使用免疫细胞特异性启动子在免疫细胞中优先表达至少一个重组核酸。可实现将此类构建体引入宿主细胞中的条件是，重组核酸前体转录物中包含的两个或更多个重组核酸最初驻留在单个初级转录物中，使得随后由内源核糖核酸酶从此类前体转录物中切除单独的RNA分子(例如，各自包含其自身的茎环结构的shRNA)。所得成熟重组核酸(例如，shRNA)随后可诱导细胞中产生的靶基因mRNA转录物的降解和/或翻译阻遏。或者，每个前体茎环结构可以作为单独转录物的一部分产生，在这种情况下，每个重组核酸序列将优选地包括其自己的启动子和转录终止子序列。另外，多个重组核酸前体转录物可驻留在单个初级转录物中。
本文所述的shRNA重组核酸的茎环结构可为约40至100个核苷酸长，或者优选地，约50至75个核苷酸长。茎区的长度可为约15-45个核苷酸(或更长)，或长度为约20-30个核苷酸。在一些实施方案中，茎区的长度为22个核苷酸。在一些实施方案中，茎区的长度为15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、为37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个或45个核苷酸。
茎可包含完全互补的双链体(任何3'尾除外)，然而，茎的任一臂上可存在凸起或内部环。此类凸起和不对称内部环的数量优选地很少(例如，1个、2个或3个)并且大小为约3个核苷酸或更小。末端环部分可包含约4个或更多个核苷酸，但优选不超过约25个。环部分的大小优选为6-15个核苷酸。
如本文所述，shRNA的茎区包含随从链和指导链，其中指导链包含与由一种或多种靶基因编码的靶mRNA转录物互补的序列。优选地，指导链和随从链的G-C含量和匹配度经过精心设计，以便在有或没有核酸内切酶裂解的情况下具有热力学有利的链解旋活性。此外，指导链的特异性优选通过BLAST搜索(www.ncbi.nim.nih.qov/BLAST)来确认。
本发明提供的是，可使用本文所述的方法和重组核酸来调节多个靶基因的表达水平。例如，本发明提供的是第一组重组核酸可被设计为包括被设计为降低第一靶基因的表达水平的序列(指导链)，而第二组重组核酸可被设计为包括被设计为降低第二靶基因的表达水平的序列(指导链)。不同组的重组核酸可被表达并驻留在相同的或单独的初级转录物中。在某些实施方案中，此类多重方法，即，使用本文所述的重组核酸来调节两个或更多个靶基因的表达水平，可对患者具有增强的治疗效果。例如，如果向患者提供表达本文所述的重组核酸分子的细胞来治疗、预防或改善癌症的影响，则可能需要向患者提供两种或更多种类型的被设计用于降低与免疫细胞的激活或阻遏有关的多个基因的表达水平的重组核酸分子。
与不包含重组核酸分子的对照细胞相比，本文所述的重组核酸分子能够将细胞中靶基因的表达降低至少超过约50％。例如，与不包含重组核酸分子的对照细胞相比，重组核酸分子(例如，shRNA)能够将免疫细胞中选自由FAS、PTPN2和TOX组成的组的靶基因的表达降低至少50％、55％、60％、65％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或更多。与不包含重组核酸分子的对照细胞相比，重组核酸分子能够将免疫细胞中选自由FAS、PTPN2和TOX组成的组的靶基因的表达降低至少约50％-100％、50％-99％、50％-95％、50％-90％、50％-85％、50％-80％、50％-75％、50％-70％、50％-65％、50％-60％、50％-55％。在一些实施方案中，与不包含重组核酸分子的对照细胞相比，重组核酸分子能够将免疫细胞中FAS的表达降低至少50％、55％、60％、65％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。在一些实施方案中，与不包含重组核酸分子的对照细胞相比，重组核酸分子能够将免疫细胞中PTPN2的表达降低至少50％、55％、60％、65％、75％、80％，85％、90％、95％或99％。在一些实施方案中，与不包含重组核酸分子的对照细胞相比，重组核酸分子能够将免疫细胞中TOX的表达降低至少50％、55％、60％、65％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。
重组核酸分子可以是化学合成的，或体外转录的，并且还可以包括对磷酸-糖主链或核苷残基的一个或多个修饰。
可以使用本领域中已知的用于将核酸引入细胞中的其他方法，诸如脂质介导的载体转运、化学介导的转运，诸如磷酸钙等。因此，重组核酸分子构建体可以与执行一种或多种以下活性的组分一起引入：增强细胞对RNA的摄取，促进shRNA双链体的退火，稳定退火的shRNA链，或以其他方式增加对靶基因的抑制。
另外的元件
在一些实施方案中，所述一种或多种重组核酸还包含与宿主细胞染色体中的插入位点互补的5'同源定向修复臂和/或3'同源定向修复臂。在一些实施方案中，所述一种或多种重组核酸包含5'同源定向修复臂和3'同源定向修复臂。在一些实施方案中，所述一种或多种重组核酸并入表达盒或表达载体中。在一些实施方案中，表达盒或表达载体还包含在所述一种或多种重组核酸上游的组成型启动子。
在一些实施方案中，启动受体、CAR、第一核酸和第二核酸被并入单个表达盒或单个表达载体中。在一些实施方案中，启动受体、CAR、第一核酸和第二核酸被并入两个或更多个表达盒或表达载体中。在一些实施方案中，一个或多个表达载体是非病毒载体。
一个或多个干扰核酸序列(例如，一个或多个shRNA)可以编码在重组核酸插入物、DNA模板、单个表达盒或也编码启动受体和/或CAR的单个表达载体的内含子区域中。例如，如果DNA模板包括启动子，诸如本文所述的EF1α或诱导型启动子，以驱动CAR或启动受体的表达，则一个或多个核酸序列(例如，shRNA序列)可以在启动子内含子区域中编码。在一些实施方案中，一个或多个核酸序列在重组核酸插入物或DNA模板的至少一个内含子区域中编码。在一些实施方案中，一个或多个核酸序列在重组核酸插入物或DNA模板的至少一个EF1α内含子区域中编码。
在一些实施方案中，本公开考虑了包含编码如本文所述的启动受体和/或CAR的一个或多个转基因的重组核酸DNA模板插入物。在一些实施方案中，DNA模板插入物编码启动受体转基因。在一些实施方案中，DNA模板插入物编码嵌合抗原受体转基因。在一些实施方案中，DNA模板插入物编码与人FAS mRNA序列的至少15个核苷酸互补的第一核酸；和与人PTPN2或TOX mRNA序列的至少15个核苷酸互补的第二核酸。在一些实施方案中，DNA模板插入物包含启动受体转基因和嵌合抗原受体转基因。在一些实施方案中，DNA模板插入物包含启动受体转基因；嵌合抗原受体转基因；与人FAS mRNA序列的至少15个核苷酸互补的第一核酸；和与人PTPN2或TOX mRNA序列的至少15个核苷酸互补的第二核酸。在一些实施方案中，DNA模板插入物包含启动受体转基因；嵌合抗原受体转基因；与人FAS mRNA序列的至少15个核苷酸互补的第一核酸；和与人PTPN2 mRNA序列的至少15个核苷酸互补的第二核酸。
在一些实施方案中，所述一种或多种重组核酸在单个DNA模板插入物上编码。在一些实施方案中，所述一种或多种重组核酸在多个DNA模板插入物上编码。例如，所述一种或多种重组核酸可以在两个、三个或四个DNA模板插入物上编码。
DNA模板插入物还可以包含自裂解肽。自裂解肽的实例包括但不限于自裂解病毒2A肽，例如猪捷申病毒1(P2A)肽、明脉扁刺蛾病毒(T2A)肽、马鼻炎A病毒(E2A)肽或口蹄疫病毒(F2A)肽。自裂解2A肽允许从单个构建体表达多个基因产物。(参见，例如，Chang等人“Cleavage efficient 2A peptides for high level monoclonal antibody expressionin CHO cells,”MAbs 7(2):403-412(2015))。
DNA模板插入物还可以包含WPRE元件。WPRE元件总体上描述于Higashimoto,T.等人,Gene Ther 14,1298-1304(2007)；以及Zufferey,R.等人,JVirol.1999年4月；73(4):2886-92.，两者据此以引用的方式并入。
DNA模板插入物还可以包含SV40多聚A尾。
重组细胞
可以使用例如位点特异性技术将表达启动受体和CAR系统的转基因引入细胞(诸如T细胞)中。通过转基因(例如启动受体和CAR)的位点特异性整合，转基因可以靶向安全性港基因座或TRAC。用于整合到安全港基因座中的位点特异性技术的实例包括但不限于使用核酸酶的同源依赖性工程化和使用Cas9的同源非依赖性靶向插入。
工程化重组细胞可应用于免疫肿瘤学。例如，可以选择启动受体和CAR来靶向不同的特定肿瘤抗原。可以使用此类细胞有效靶向的癌症的实例是血癌或实体癌。在一些实施方案中，免疫细胞疗法可用于治疗实体瘤。
本文提供了修饰的细胞，其中所述细胞经修饰而相对于相应的未修饰的细胞具有降低的FAS基因的表达和/或降低的FAS基因产物的功能，任选地其中所述修饰的细胞是造血细胞。在一些方面，修饰的细胞经进一步修饰而相对于相应的未修饰细胞具有降低的至少一种第二基因的表达和/或降低的至少一种第二基因的产物的功能。
本文还提供了修饰的工程化细胞，其中所述工程化细胞经修饰而相对于相应的未修饰的工程化细胞具有降低的FAS基因的表达和/或降低的FAS基因产物的功能，任选地其中所述修饰的工程化细胞被设计来表达异源免疫受体。在一些方面，修饰的工程化细胞经进一步修饰而相对于相应的未修饰的工程化细胞具有降低的至少一种第二基因的表达和/或降低的至少一种第二基因的产物的功能。
本文还提供了修饰的细胞，其中所述细胞经修饰而具有：(a)降低的FAS基因的表达和/或降低的FAS基因产物的功能；以及(b)降低的至少一种第二基因的表达和/或降低的所述至少一种第二基因的产物的功能；其中每个基因的降低的表达是相对于相应的未修饰的细胞而言的，任选地其中修饰的细胞是造血细胞。
在一些方面，降低表达的修饰包括对细胞的基因组进行基因工程化以破坏FAS基因和任选地所述至少一种第二基因。在一些方面，基因工程化包括核酸酶介导的编辑，任选地其中核酸酶介导的编辑包括CRISPR/Cas9介导的编辑。
在一些方面，降低表达的修饰包括RNAi介导的FAS基因和任选地所述至少一种第二基因的靶向，任选地其中RNAi介导的靶向包括短发夹RNA(shRNA)介导的敲低。在一些方面，RNAi介导的靶向包括工程化细胞以表达能够介导FAS基因和任选地所述至少一种第二基因的敲低的RNA多核苷酸。
在一些方面，修饰的细胞包括造血细胞。在一些方面，造血细胞包括造血干细胞。在一些方面，造血细胞包括免疫细胞。在一些方面，免疫细胞包括适应性免疫细胞、先天免疫细胞、T细胞、NK细胞、巨噬细胞。
在一些方面，修饰的细胞包括工程化细胞。在一些方面，工程化细胞经工程化以表达异源受体。在一些方面，异源受体包括免疫受体。在一些方面，异源免疫受体包括嵌合抗原受体(CAR)、T细胞受体或NK细胞受体。在一些方面，工程化细胞包括T细胞或能够分化成T细胞的细胞，并且其中异源受体插入内源TCR基因座，任选地T细胞受体α(TRAC)基因座中。在一些方面，异源受体包含一个或多个抗原结合结构域，任选地其中一个或多个抗原结合结构域能够结合至肿瘤抗原或与癌症相关的抗原。
在一些方面，FAS基因或其表达产物的表达和/或功能降低改善了修饰的细胞相对于相应的未修饰细胞的至少一种特性。
在一些方面，相对于被修饰为仅降低FAS基因的表达和/或功能的相应细胞，当修饰的细胞经进一步修饰而具有降低的所述至少一种第二基因的表达和/或功能时，降低的FAS基因或其表达产物的表达和/或功能以及降低的所述至少一种第二基因或其表达产物的表达和/或功能，改善了修饰的细胞的至少一种特性。
在一些方面，相对于被修饰为仅降低所述至少一种第二基因基因的表达和/或功能的相应细胞，当修饰的细胞经进一步修饰而具有降低的所述至少一种第二基因的表达和/或功能时，降低的FAS基因或其表达产物的表达和/或功能以及降低的所述至少一种第二基因或其表达产物的表达和/或功能，改善了修饰的细胞的至少一种特性。
在一些方面，所述至少一种特性包括改善的增殖能力。在一些方面，所述至少一种特性包括改善的针对FAS介导的细胞凋亡的保护。在一些方面，修饰的细胞包括免疫细胞，并且所述至少一种特性包括改善的免疫效应细胞功能。在一些方面，改善的免疫效应细胞功能包括增加的相对效应分子表达、产生和/或分泌。在一些方面，免疫细胞包括T细胞，并且效应分子包括选自由以下组成的组的一种或多种分子：IFNγ、TNFα、颗粒酶B和FASL。
在一些方面，修饰细胞经工程化以表达异源表面抗原，任选地其中异源表面抗原能够介导相对于未经工程化以表达异源表面抗原的相应修饰细胞而言工程化修饰细胞的靶向耗尽。
本文还提供了一种刺激受试者的免疫应答的方法，其中所述方法包括向受试者施用如本文所公开的任何一种修饰的细胞。本文还提供了一种治疗受试者的癌症的方法，其中所述方法包括向受试者施用如本文所公开的任何一种修饰的细胞。在一些方面，修饰的细胞对于受试者来说是自体的。在一些方面，修饰的细胞对于受试者来说是同种异体的。
本文还提供了包含一种或多种重组核酸的重组免疫细胞，其中所述一种或多种重组核酸编码：包含启动受体的第一嵌合多肽；包含CAR的第二嵌合多肽；和长度为至少15个核苷酸的核酸序列，其中所述核酸序列选自由以下组成的组：与包含SEQ ID NO:39所示序列的编码人FAS的mRNA的核苷酸1126至1364互补的核酸序列，与包含SEQ ID NO:40所示序列的编码人PTPN2的mRNA的核苷酸518至559互补的核酸序列，和与包含SEQ ID NO:41所示序列的编码人TOX的mRNA的核苷酸1294至2141互补的核酸序列。
在一些实施方案中，核酸序列与包含SEQ ID NO:39所示序列的编码人FAS的mRNA的核苷酸1126至1364互补。在一些实施方案中，核酸序列与包含SEQ ID NO:40所示序列的编码人PTPN2的mRNA的核苷酸518至559互补。在一些实施方案中，核酸序列与包含SEQ IDNO:41所示序列的编码人TOX的mRNA的核苷酸1294至2141互补。
本文还提供了包含以非病毒方式插入细胞基因组靶区中的一种或多种重组核酸的重组免疫细胞，其中所述一种或多种重组核酸编码如本文所述的启动受体；CAR；长度为至少15个核苷酸的与包含SEQ ID NO:39所示序列的编码人FAS的mRNA互补的第一核酸序列；和长度为至少15个核苷酸的与包含SEQ ID NO:40所示序列的编码人PTPN2的mRNA互补或者与包含SEQ ID NO:41所示序列的编码人TOX的mRNA互补的第二核酸序列。本文还提供了重组免疫细胞，所述重组免疫细胞包含特异性地结合胎盘/生殖细胞碱性磷酸酶(ALPG/P)的启动受体；特异性地结合MSLN的嵌合抗原受体；长度为至少15个核苷酸的与包含SEQID NO:39所示序列的编码人FAS的mRNA互补的第一核酸序列；和长度为至少15个核苷酸的与包含SEQ ID NO:40所示序列的编码人PTPN2的mRNA互补或者与包含SEQ ID NO:41所示序列的编码人TOX的mRNA互补的第二核酸序列。
如本公开所述的在靶基因座或安全港位点处包含DNA模板插入物的细胞可称为工程化细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是可以产生多能免疫细胞的任何细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是原代免疫细胞。在一些实施方案中，免疫细胞可以是诱导型多能干细胞(iPSC)或人多能干细胞(HSPC)。在一些实施方案中，免疫细胞包括原代造血细胞或原代造血干细胞。在一些实施方案中，工程化细胞是干细胞、人细胞、原代细胞、造血细胞、适应性免疫细胞、先天免疫细胞、自然杀伤(NK)细胞、T细胞、CD8+细胞、CD4+细胞或T细胞祖细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是T细胞。在一些实施方案中，T细胞是调节性T细胞、效应T细胞或幼稚T细胞。在一些实施方案中，T细胞是CD8+T细胞。在一些实施方案中，T细胞是CD4+T细胞。在一些实施方案中，T细胞是CD4+CD8+T细胞。
在一些实施方案中，工程化细胞是干细胞、人细胞、原代细胞、造血细胞、造血干细胞、适应性免疫细胞、先天免疫细胞、T细胞或T细胞祖细胞。本公开中设想的免疫细胞的非限制性实例包括T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、NKT/iNKT细胞、巨噬细胞、骨髓细胞和树突细胞。本公开中设想的干细胞的非限制性实例包括多能干细胞(PSC)、胚胎干细胞(ESC)、诱导型多能干细胞(iPSC)、通过核移植获得的胚胎来源的胚胎干细胞(ntES；核移植ES)、雄性生殖系干细胞(GS细胞)、胚胎生殖细胞(EG细胞)、造血干细胞/祖细胞干细胞(HSPC)、体干细胞(成体干细胞)、成血管细胞、神经干细胞、间充质干细胞和其他细胞(包括骨细胞、软骨细胞、肌细胞、心肌细胞、神经元、肌腱细胞、脂肪细胞、胰腺细胞、肝细胞、肾细胞、滤泡细胞等)的干细胞。在一些实施方案中，工程化细胞是T细胞、NK细胞、iPSC和HSPC。在一些实施方案中，本公开中使用的工程化细胞是体外生长的人细胞系(例如，故意永生化的细胞系、癌细胞系等)。
本文还提供了包含多个免疫细胞的细胞群体。在一些实施方案中，细胞的至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或更多的基因组包含如本文所述的启动受体、CAR以及第一和第二核酸。
治疗癌症的方法
在另一方面，本发明提供了治疗个体的免疫相关疾患(例如，癌症)的方法，所述方法包括向个体施用有效量的包含系统的组合物，所述系统包含：特异性地结合至ALPG/P的启动受体；特异性地结合至MSLN的嵌合抗原受体；长度为至少15个核苷酸的第一核酸序列，其中所述第一核酸序列与包含SEQ ID NO:39所示序列的编码人FAS的mRNA的核苷酸1126至1364互补；和长度为至少15个核苷酸的第二核酸序列，其中所述第二核酸序列与包含SEQID NO:40所示序列的编码人PTPN2的mRNA的核苷酸518至559互补，或者与包含SEQ ID NO:41所示序列的编码人TOX的mRNA的核苷酸1294至2141互补。
在另一方面，本发明提供了增强个体的免疫应答的方法，所述方法包括向个体施用有效量的包含系统的组合物，所述系统包含：特异性地结合至ALPG/P的启动受体；特异性地结合至MSLN的嵌合抗原受体；长度为至少15个核苷酸的第一核酸序列，其中所述第一核酸序列与包含SEQ ID NO:39所示序列的编码人FAS的mRNA的核苷酸1126至1364互补；和长度为至少15个核苷酸的第二核酸序列，其中所述第二核酸序列与包含SEQ ID NO:40所示序列的编码人PTPN2的mRNA的核苷酸518至559互补，或者与包含SEQ ID NO:41所示序列的编码人TOX的mRNA的核苷酸1294至2141互补。
在一些实施方案中，重组核酸是shRNA分子。在一些实施方案中，shRNA选自由FASshRNA分子、PTPN2 shRNA分子和TOX shRNA分子组成的组。在一些实施方案中，细胞至少包含FAS shRNA分子。在一些实施方案中，细胞至少包含PTPN2 shRNA分子。在一些实施方案中，细胞至少包含TOX shRNA分子。在一些实施方案中，细胞至少包含FAS shRNA分子和PTPN2shRNA分子。在一些实施方案中，细胞至少包含FAS shRNA分子和TOX shRNA分子。在一些实施方案中，细胞至少包含PTPN2 shRNA分子和TOX shRNA分子。在另一方面，本发明提供了增强个体的免疫应答的方法，所述方法包括向个体施用有效量的包含细胞的组合物，所述细胞包含至少一种shRNA分子，其中所述shRNA分子选自由FAS shRNA分子、PTPN2 shRNA分子和TOX shRNA分子组成的组。
在一些实施方案中，本文提供的方法可用于治疗个体的免疫相关病症。在一个实施方案中，个体是人。
在一些实施方案中，本文提供的方法(诸如增强免疫应答的方法)可用于治疗癌症，因此接受本文所述的系统的个体患有癌症。在一些实施方案中，癌症是实体癌。在一些实施方案中，癌症是液体癌症。在一些实施方案中，癌症是免疫逃避性的。在一些实施方案中，癌症是免疫应答性的。在特定实施方案中，癌症是卵巢癌、输卵管癌、原发性腹膜癌、子宫癌、间皮瘤、宫颈癌或胰腺癌。在特定实施方案中，癌症是卵巢癌。
在一些实施方案中，治疗导致癌症体积或大小的减小。在一些实施方案中，与施用抗体之前的癌症体积相比，治疗有效减小癌症体积。在一些实施方案中，治疗导致癌症生长速率降低。在一些实施方案中，与施用抗体之前的癌症生长速率相比，治疗有效降低癌症生长速率。在一些实施方案中，治疗有效消除癌症。
在一些实施方案中，与非癌细胞相比，MSLN和ALPG或ALPP在癌症中以更高水平表达。MSLN、ALPG和ALPP的水平可以通过本领域中已知的任何技术来评估，所述技术包括但不限于蛋白质测定或核酸测定，诸如FACS、蛋白质印迹、ELISA、免疫沉淀、免疫组织化学、免疫荧光、放射免疫测定、斑点印迹、免疫检测方法、HPLC、表面等离子体共振、光谱法、质谱法、HPLC、qPCR、RT-qPCR、多重qPCR或RT-qPCR、RNA-seq、微阵列分析、SAGE、MassARRAY技术和FISH以及它们的组合。
免疫调节方法
施用包含系统的细胞的方法可以导致免疫应答的调节，所述系统包含：如本文所述的特异性地结合至ALPG/P的启动受体；特异性地结合至MSLN的嵌合抗原受体；长度为至少15个核苷酸的第一核酸序列，其中所述第一核酸序列与包含SEQ ID NO:39所示序列的编码人FAS的mRNA的核苷酸1126至1364互补；和长度为至少15个核苷酸的第二核酸序列，其中所述第二核酸序列与包含SEQ ID NO:40所示序列的编码人PTPN2的mRNA的核苷酸518至559互补，或者与包含SEQ ID NO:41所示序列的编码人TOX的mRNA的核苷酸1294至2141互补。调节可以是免疫应答的增加或减少。在一些实施方案中，调节是免疫应答的增加。
在一方面，施用包含系统的细胞可导致促炎分子(诸如细胞因子或趋化因子)的诱导，所述系统包含如本文所述的特异性地结合至ALPG/P的启动受体和特异性地结合至MSLN的嵌合抗原受体。一般来说，诱导的促炎分子的存在水平高于同种型对照所达到的水平。此类促炎分子进而导致抗肿瘤免疫的激活，包括但不限于T细胞激活、T细胞增殖、T细胞分化、M1样巨噬细胞激活和NK细胞激活。因此，施用包含特异性地结合至ALPG/P的启动受体和特异性地结合至MSLN的嵌合抗原受体的系统可以诱导导致肿瘤破坏的多种抗肿瘤免疫机制。
在另一方面，本文提供了增加个体的免疫应答的方法，所述方法包括向个体施用有效量的包含系统的细胞，所述系统包含特异性地结合至ALPG/P的启动受体和特异性地结合至MSLN的嵌合抗原受体。在一些实施方案中，增加受试者的免疫应答的方法包括向受试者施用包含系统的细胞，所述系统包含特异性地结合至ALPG/P的启动受体和特异性地结合至MSLN的嵌合抗原受体。
在一些实施方案中，细胞存在于还包含药学上可接受的赋形剂的药物组合物中。
在如本文所述的增加免疫应答的任何和所有方面，特征或功能方面的任何增加或减少或改变是相较于不包含含有特异性地结合至ALPG/P的启动受体和特异性地结合至MSLN的嵌合抗原受体的系统的组合物的细胞而言的。
增加免疫应答可以是增强免疫应答或诱导免疫应答。例如，增加免疫应答包括免疫应答的开始或起始，或者提高或放大正在进行的或现有的免疫应答。在一些实施方案中，治疗诱导免疫应答。在一些实施方案中，诱导的免疫应答是适应性免疫应答。在一些实施方案中，诱导的免疫应答是先天免疫应答。在一些实施方案中，治疗增强免疫应答。在一些实施方案中，增强的免疫应答是适应性免疫应答。在一些实施方案中，增强的免疫应答是先天免疫应答。在一些实施方案中，治疗增加免疫应答。在一些实施方案中，增加的免疫应答是适应性免疫应答。在一些实施方案中，增加的免疫应答是先天免疫应答。在一些实施方案中，通过施用包含系统的细胞来开始或起始免疫应答，所述系统包含特异性地结合至ALPG/P的启动受体和特异性地结合至MSLN的嵌合抗原受体。在一些实施方案中，通过施用包含系统的细胞来增强免疫应答，所述系统包含特异性地结合至ALPG/P的启动受体和特异性地结合至MSLN的嵌合抗原受体。
在另一方面，本申请提供了用系统对细胞进行基因编辑的方法，其导致细胞免疫功能的调节，所述系统包含特异性地结合至ALPG/P的启动受体；特异性地结合至MSLN的嵌合抗原受体；长度为至少15个核苷酸的与包含SEQ ID NO:39所示序列的编码人FAS的mRNA互补的第一核酸序列；和长度为至少15个核苷酸的与包含SEQ ID NO:40所示序列的编码人PTPN2的mRNA互补或者与包含SEQ ID NO:41所示序列的编码人TOX的mRNA互补的第二核酸序列。所述调节可以增加免疫应答。在一些实施方案中，调节是免疫功能的增加。在一些实施方案中，功能的调节导致MSLN CAR的表达。在一些实施方案中，功能的调节导致包含该系统的细胞的激活。
在一些实施方案中，所述细胞是自然杀伤(NK)细胞、T细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、原代T细胞或T细胞祖细胞。
在一些实施方案中，对包含如本文所述的启动受体和CAR系统的细胞的功能的调节导致细胞刺激天然和活化T细胞的能力增加，方式是例如增加表达启动受体和CAR系统的细胞的细胞因子或趋化因子分泌。在一些实施方案中，功能的调节增强或增加细胞产生细胞因子、趋化因子、CAR或共刺激或激活受体的能力。在一些实施方案中，所述调节增加表达启动受体和CAR系统的细胞的T细胞刺激功能，包括例如细胞触发T细胞受体(TCR)信号传导、T细胞增殖或T细胞细胞因子产生的能力。
在一些实施方案中，增加的免疫应答是细胞因子和趋化因子的分泌。在一些实施方案中，与同种型对照细胞相比，启动受体和CAR系统诱导细胞中至少一种细胞因子或趋化因子的表达增加。在一些实施方案中，所述至少一种细胞因子或趋化因子选自由以下组成的组：IL-2和IFNγ。在一些实施方案中，细胞因子或趋化因子是IL-2。在一些实施方案中，细胞因子或趋化因子是IFNγ。在一些实施方案中，与未处理的细胞或用同种型对照抗体处理的细胞相比，细胞因子或趋化因子分泌增加约1-100倍，1倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、1-10倍、10-20倍、20-30倍、30-40倍、40-50倍、50-60倍、60-70倍、70-80倍、80-90倍或90-100倍。在一些实施方案中，趋化因子是IL-2，并且与未处理的细胞或用同种型对照抗体处理的细胞相比，分泌增加约1-100倍，1倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、1-10倍、10-20倍、20-30倍、30-40倍、40-50倍、50-60倍、60-70倍、70-80倍、80-90倍或90-100倍。在一些实施方案中，细胞因子是IFNγ，并且与未处理的细胞或用同种型对照抗体处理的细胞相比，分泌增加约1-100倍，1倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、1-10倍、10-20倍、20-30倍、30-40倍、40-50倍、50-60倍、60-70倍、70-80倍、80-90倍或90-100倍。
在一些实施方案中，增加的免疫应答是抗肿瘤免疫细胞募集和激活。
在一些实施方案中，与同种型对照细胞相比，表达启动受体和CAR系统的细胞诱导记忆免疫应答。一般来说，记忆免疫应答是免疫系统在随后暴露于先前遇到的病原体或抗原后产生的保护性免疫应答。示例性记忆免疫应答包括感染或用抗原接种疫苗后的免疫应答。一般来说，记忆免疫应答是由诸如T细胞或B细胞等淋巴细胞介导的。在一些实施方案中，记忆免疫应答是针对癌症的保护性免疫应答，包括癌细胞生长、增殖或转移。在一些实施方案中，记忆免疫应答抑制、预防或减少癌细胞生长、增殖或转移。
降低基因表达的方法
本发明的另一个方面提供了一种用于减弱哺乳动物细胞中靶基因表达的方法，所述方法包括将与靶基因mRNA互补的重组核酸(诸如单链发夹核糖核酸(shRNA)、siRNA、dsRNA或反义寡核苷酸)引入哺乳动物细胞中。在一些实施方案中，与靶基因mRNA互补的重组核酸是shRNA。在一些实施方案中，shRNA包含形成双链体区域的19至100个核苷酸的自互补序列，所述自互补序列在细胞内条件下与靶基因mRNA转录物杂交。在一些实施方案中，shRNA包含22nt的自互补序列。在一些实施方案中，shRNA：(i)是RNaseIII酶裂解以产生双链RNA产物的底物，(ii)不产生对哺乳动物细胞的一般序列非依赖性杀伤，并且(iii)降低所述靶基因以依赖于所述互补区的序列的方式表达。在一些实施方案中，靶基因是FAS。在一些实施方案中，靶基因是人FAS。在一些实施方案中，靶基因是PTPN2。在一些实施方案中，靶基因是人PTPN2。在一些实施方案中，靶基因是TOX。在一些实施方案中，靶基因是人TOX。
包含重组核酸的免疫细胞可以具有降低的或减少的选自由FAS、PTPN2和TOX组成的组的靶基因的表达。在一些实施方案中，与不包含重组核酸分子的对照细胞相比，免疫细胞的FAS、PTPN2和/或TOX表达降低约50％-100％、50％-99％、50％-95％、50％-90％、50％-85％、50％-80％、50％-75％、50％-70％、50％-65％、50％-60％、50％-55％。在一些实施方案中，与不包含重组核酸分子的对照细胞相比，免疫细胞在免疫细胞中的FAS表达降低至少50％、55％、60％、65％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。在一些实施方案中，与不包含重组核酸分子的对照细胞相比，免疫细胞在免疫细胞中的PTPN2表达降低至少50％、55％、60％、65％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。在一些实施方案中，与不包含重组核酸分子的对照细胞相比，免疫细胞在免疫细胞中的TOX表达降低至少50％、55％、60％、65％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。
在一些实施方案中，与不包含第一核酸的对照细胞相比，免疫细胞中FAS的表达降低至少50％、55％、60％、65％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。在一些实施方案中，与不包含第二核酸的对照细胞相比，第二核酸能够将免疫细胞中PTPN2的表达降低至少50％、55％、60％、65％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。在一些实施方案中，与不包含第二核酸的对照细胞相比，免疫细胞中PTPN2的表达降低至少50％、55％、60％、65％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。
在一些实施方案中，与不包含第二核酸的对照细胞相比，第二核酸能够将免疫细胞中TOX的表达降低至少50％、55％、60％、65％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。在一些实施方案中，与不包含第二核酸的对照细胞相比，免疫细胞中TOX的表达降低至少50％、55％、60％、65％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。
在一些实施方案中，通过核酸测定或蛋白质测定来确定FAS、PTPN2和/或TOX的表达。在一些实施方案中，核酸测定包括聚合酶链式反应(PCR)、定量PCR(qPCR)、RT-qPCR、微阵列、基因阵列或RNAseq中的至少一者。
编辑细胞的方法
如本文所用，术语“基因工程化”、“基因编辑”或“基因组编辑”是指使用人工操纵的核酸酶或“分子剪刀”从基因组中插入、置换或移除DNA的一种基因操纵。它是阐明序列特异性基因或蛋白质的功能和作用或改变细胞行为(例如用于治疗目的)的有用工具。
目前可用的基因组编辑工具包括锌指核酸酶(ZFN)和转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)，以在安全港基因座(例如腺相关病毒整合位点1(AAVS1)安全港基因座)处插入基因。利用phiC31整合酶和Bxb1整合酶的DICE(双整合酶盒交换)系统是一种用于靶标整合的工具。另外，成簇规律间隔的短回文重复序列/Cas9(CRISPR/Cas9)技术可用于靶向基因插入。
位点特异性基因编辑方法可以包括同源依赖性机制或同源非依赖性机制。
在本文所述的方法中设想本领域已知的用于靶向插入基因序列的所有方法以在基因靶标或安全港基因座处插入构建体。
本文提供了在不存在病毒载体的情况下将长度大于约5千碱基的核苷酸序列插入细胞基因组中的方法。在一些实施方案中，在不存在病毒载体的情况下，可以将长度大于约5千碱基的核苷酸序列插入原代免疫细胞的基因组中。
将大核酸(例如，大小为大于5千碱基的核酸)整合到细胞中可能受到低整合效率、脱靶效应和/或细胞活力损失的限制。本文描述了用于实现将核苷酸序列(例如，大小为大于约5千碱基的核苷酸序列)整合到细胞的基因组中的方法和组合物。在一些方法中，整合效率增加，脱靶效应减少并且/或者细胞活力损失减少。
利用核酸酶，诸如CRISPR相关系统(Cas)可以将质粒引入免疫细胞中。核酸酶可以按核糖核蛋白形式与靶向免疫细胞基因组上的特定位点的指导RNA(gRNA)一起引入。核酸酶在该特定位点处切割基因组DNA。该特定位点可以是编码内源免疫细胞受体的基因组的一部分。因此，在该位点切割基因组将导致免疫细胞不再表达内源免疫细胞受体。
质粒可包括与免疫细胞基因组上的特定位点处的序列互补的5’和3’同源定向修复臂。互补序列位于被核酸酶切割的位点的两侧，这使得质粒可以并入免疫细胞基因组上的特定插入位点处。一旦并入质粒，细胞将表达启动受体。然而，正如所解释的，转基因盒的设计确保以病毒方式递送的回路系统受体在启动受体与其同源配体结合并释放可裂解的转录因子之前不表达CAR。
最初，激活T细胞。T细胞可获自患者。因此，本公开提供了从患者收获免疫细胞诸如T细胞的方法。然后将编码CAR和启动受体的质粒引入T细胞中。有利地，可以使用电穿孔引入本公开的质粒。当通过电穿孔引入质粒时，也可以引入核酸酶。通过使用电穿孔，本公开的方法避免了使用病毒载体来引入转基因，这是免疫细胞工程化中的一个已知瓶颈。然后将T细胞扩增并共同培养，以产生足够数量的工程化免疫细胞，用作治疗性治疗。
用于编辑细胞的基因组的方法可以包括：a)提供Cas9核糖核蛋白复合物(RNP)-DNA模板复合物，所述RNP-DNA模板复合物包含：(i)RNP，其中所述RNP包含Cas9核酸酶结构域和指导RNA，其中所述指导RNA与细胞的基因组的靶区特异性地杂交，并且其中所述Cas9核酸酶结构域使靶区裂解以在细胞的基因组中产生插入位点；和(ii)双链或单链DNA模板，其中所述DNA模板的大小为大于约200个核苷酸，其中所述DNA模板的5’端和3’端包含与插入位点侧翼的基因组序列同源的核苷酸序列，并且其中所述复合物中RNP与DNA模板的摩尔比为约3:1至约100:1；以及b)将所述RNP-DNA模板复合物引入细胞中。
在一些实施方案中，本文所述的方法提供至少约20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97.5％、99％、99.5％、99％或更高的RNP-DNA模板复合物递送效率。在一些情况下，效率是相对于将RNP-DNA模板引入细胞中后存活的细胞来确定的。在一些情况下，效率是相对于将RNP-DNA模板引入细胞中的细胞(活细胞或非活细胞)的总数确定的。
作为另一实例，可以通过定量细胞群体中经基因组编辑的细胞的数量来确定递送效率(与引入步骤后获得的总细胞数或总活细胞数相比较)。可以利用各种定量基因组编辑的方法。这些方法包括但不限于使用错配特异性核酸酶，诸如T7核酸内切酶I；对一个或多个靶基因座的测序(例如，通过对克隆的靶基因座扩增片段的桑格测序)；以及高通量深度测序。
在一些实施方案中，与将裸DNA引入细胞中或使用病毒载体将DNA引入细胞中后的细胞活力损失相比，细胞活力的损失减少。减少可以是减少至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或这些百分比之间的任何百分比。在一些实施方案中，与将裸DNA引入细胞中或使用病毒载体将DNA引入细胞中后的脱靶整合相比，脱靶整合效应减少。减少可以是减少至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或这些百分比之间的任何百分比。
在一些情况下，本文所述的方法提供了已引入RNP-DNA模板的细胞的高细胞活力。在一些情况下，已引入RNP-DNA模板的细胞的活力为至少约20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97.5％、99％、99.5％、99％或更高。在一些情况下，已引入RNP-DNA模板的细胞的活力为约20％至约99％、约30％至约90％、约35％至约85％或90％或更高、约40％至约85％或90％或更高、约50％至约85％或90％或更高、约50％至约85％或90％或更高、约60％至约85％或90％或更高，或约70％至约85％或90％或更高。
在本文提供的方法中，RNP与DNA模板的摩尔比可为约3:1至约100:1。例如，摩尔比可为约5:1至10:1、约5:1至约15:1、5:1至约20:1、5:1至约25:1；约8:1至约12:1、约8:1至约15:1、约8:1至约20:1，或约8:1至约25:1。
在一些实施方案中，DNA模板的浓度为约2.5pM至约25pM。例如，DNA模板的浓度可为约2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、15.5、16、16.5、17、17.5、18、18.5、19、19.5、20、20.5、21、21.5、22、22.5、23、23.5、24、24.5、25pM或这些浓度之间的任何浓度。
在一些实施方案中，DNA模板的大小或长度为大于约4.5kb、5.0kb、5.1kb、5.2kb、5.3kb、5.4kb、5.5kb、5.6kb、5.7kb、5.8kb、5.9kb、6.0kb、6.1kb、6.2kb、6.3kb、6.4kb、6.5kb、6.6kb、6.7kb、6.8kb、6.9kb、7.0kb、7.1kb、7.2kb、7.3kb、7.4kb、7.5kb、7.6kb、7.7kb、7.8kb、7.9kb、8.0kb、8.1kb、8.2kb、8.3kb、8.4kb、8.5kb、8.6kb、8.7kb、8.8kb、8.9kb、9.0kb、9.1kb、9.2kb、9.3kb、9.4kb、9.5kb、9.6kb、9.7kb、9.8kb、9.9kb或10kb或介于这些大小之间的任何DNA模板大小。例如，DNA模板的大小可为约4.5kb至约10kb、约5kb至约10kb、约5kb至约9kb、约5kb至约8kb、约5kb至约7kb、约5kb至约6kb、约kb 6至约10kb、约6kb至约9kb、约6kb至约8kb、约6kb至约7kb、约7kb至约10kb、约7kb至约9kb、约7kb至约8kb、约8kb至约10kb、约8kb至约9kb，或约9kb至约10kb。
在一些实施方案中，DNA模板的量为约1μg至约10μg。例如，DNA模板的量可为约1μg至约2μg、约1μg至约3μg、约1μg至约4μg、约1μg至约5μg、约1μg至约6μg、约1μg至约7μg、约1μg至约8μg、约1μg至约9μg、约1μg至约10μg。在一些实施方案中，DNA模板的量为约2μg至约3μg、约2μg至约4μg、约2μg至约5μg、约2μg至约6μg、约2μg至约7μg、约2μg至约8μg、约2μg至约9μg，或2μg至约10μg。在一些实施方案中，DNA模板的量为约3μg至约4μg、约3μg至约5μg、约3μg至约6μg、约3μg至约7μg、约3μg至约8μg、约3μg至约9μg，或约3μg至约10μg。在一些实施方案中，DNA模板的量为约4μg至约5μg、约4μg至约6μg、约4μg至约7μg、约4μg至约8μg、约4μg至约9μg，或约4μg至约10μg。在一些实施方案中，DNA模板的量为约5μg至约6μg、约5μg至约7μg、约5μg至约8μg、约5μg至约9μg，或约5μg至约10μg。在一些实施方案中，DNA模板的量为约6μg至约7μg、约6μg至约8μg、约6μg至约9μg，或约6μg至约10μg。在一些实施方案中，DNA模板的量为约7μg至约8μg、约7μg至约9μg，或约7μg至约10μg。在一些实施方案中，DNA模板的量为约8μg至约9μg，或约8μg至约10μg。在一些实施方案中，DNA模板的量为约9μg至约10μg。
在一些情况下，DNA模板的大小和数量足够大，足以作为裸DNA致死。在一些实施方案中，DNA模板编码异源蛋白质或其片段。在一些实施方案中，DNA模板编码至少一个基因。在一些实施方案中，DNA模板编码至少两个基因。在一些实施方案中，DNA模板编码一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个基因。
在一些实施方案中，DNA模板包括调控序列，例如启动子序列和/或增强子序列，以在插入细胞基因组中后调控异源蛋白质或其片段的表达。
在一些情况下，DNA模板是线状DNA模板。在一些情况下，DNA模板是单链DNA模板。在一些情况下，单链DNA模板是纯单链DNA模板。如本文所用，“纯单链DNA”是指实质上缺乏另一条或相反DNA链的单链DNA。“实质上缺乏”是指纯单链DNA中的一条链比另一条DNA链缺乏至少100倍。
在一些情况下，RNP-DNA模板复合物是通过将RNP与DNA模板在约20℃至约25℃的温度下孵育少于约一分钟至约三十分钟而形成的。例如，可以将RNP与DNA模板在约20℃、21℃、22℃、23℃、24℃或25℃的温度下孵育约5秒、10秒、15秒、20秒、25秒、30秒、35秒、40秒、45秒、50秒、55秒、1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、11分钟、12分钟、13分钟、14分钟、15分钟、16分钟、17分钟、18分钟、19分钟、20分钟、21分钟、22分钟、23分钟、24分钟、25分钟、26分钟、27分钟、28分钟、29分钟或30分钟或这些时间之间的任何时间量。在另一实例中，可以将RNP与DNA模板在约20℃至约25℃的温度下孵育少于约一分钟至约一分钟、少于约一分钟至约5分钟、少于约1分钟至约10分钟、约5分钟至10分钟、约5分钟至15分钟、约10至约15分钟、约10分钟至约20分钟，或约10分钟至约30分钟。在一些实施方案中，在将RNP-DNA模板复合物引入细胞中之前将RNP-DNA模板复合物和细胞混合。
在一些实施方案中，引入RNP-DNA模板复合物包括电穿孔。用于电穿孔细胞以引入RNP-DNA模板复合物的方法、组合物和装置可包括本文实施例中描述的那些。用于电穿孔细胞以引入RNP-DNA模板复合物的另外的或替代的方法、组合物和装置可包括WO/2006/001614或Kim,J.A.等人Biosen s.Bioelectron.23,1353-1360(2008)中描述的那些。用于电穿孔细胞以引入RNP-DNA模板复合物的另外的或替代的方法、组合物和装置可包括美国专利申请公布第2006/0094095号；第2005/0064596号；或第2006/0087522号中描述的那些。用于电穿孔细胞以引入RNP-DNA模板复合物的另外的或替代的方法、组合物和装置可包括Li,L.H.等人Cancer Res.Treat.1,341-350(2002)；美国专利第6,773,669号；第7,186,559号；第7,771,984号；第7,991,559号；第6485961号；第7029916号；以及美国专利申请公布第2014/0017213号；和第2012/0088842号中描述的那些，所有这些参考文献据此以引用的方式并入。用于电穿孔细胞以引入RNP-DNA模板复合物的另外的或替代的方法、组合物和装置可包括Geng,T.等人J.Control Release 144,91-100(2010)；以及Wang,J.等人Lab.Chip10,2057-2061(2010)中描述的那些，所有这些参考文献据此以引用的方式并入。
在一些实施方案中，Cas9蛋白可以呈活性核酸内切酶形式，使得当作为与指导RNA的复合物的一部分或作为与DNA模板的复合物的一部分与靶核酸结合时，将双链断裂引入靶核酸中。双链断裂可以通过NHEJ修复以引入随机突变，或通过HDR修复以引入特定突变。在本文所述的方法中可以利用多种Cas9核酸酶。例如，可以利用Cas9核酸酶，该酶需要紧邻指导RNA所靶向的区域的3’处的NGG原型间隔区相邻基序(PAM)。此类Cas9核酸酶可以靶向含有NGG序列的基因组的任何区域。作为另一实例，具有正交PAM基序要求的Cas9蛋白可用于靶向没有相邻NGG PAM序列的序列。具有正交PAM序列特异性的示例性Cas9蛋白包括但不限于CFP1；Nature Methods 10,1116-1121(2013)中描述的那些；以及Zetsche等人,Cell,第163卷,第3期,p759–771,2015年10月22日中描述的那些，两者据此以引用的方式并入。
在一些情况下，Cas9蛋白是切口酶，使得当作为与指导RNA的复合物的一部分与靶核酸结合时，将单链断裂或切口引入靶核酸中。一对Cas9切口酶(每个切口酶都与结构不同的指导RNA结合)可以靶向靶基因组区域的两个近端位点，从而将一对近端单链断裂引入靶基因组区域中。切口酶对可以提供增强的特异性，因为脱靶效应可能导致单个切口，这些切口一般通过碱基切除修复机制修复而没有损伤。示例性的Cas9切口酶包括具有D10A或H840A突变的Cas9核酸酶。
在一些实施方案中，RNP包含Cas9核酸酶。在一些实施方案中，RNP包含Cas9切口酶。在一些实施方案中，RNP-DNA模板复合物包含至少两个结构不同的RNP复合物。在一些实施方案中，所述至少两个结构不同的RNP复合物含有结构不同的Cas9核酸酶结构域。在一些实施方案中，所述至少两个结构不同的RNP复合物含有结构不同的指导RNA。在一些实施方案中，其中所述至少两个结构不同的RNP复合物含有结构不同的指导RNA，每个结构不同的RNP复合物包含Cas9切口酶，并且结构不同的指导RNA与靶区的相反链杂交。
在一些情况下，将包含结构不同的核糖核蛋白复合物的多个RNP-DNA模板引入细胞中。例如，Cas9蛋白可以与多个(例如，2个、3个、4个、5个或更多，例如，2-10个、5-100个、20-100个)结构不同的指导RNA复合，以在多个结构不同的靶基因组区域处靶向插入DNA模板。
在本文提供的方法和组合物中，细胞包括但不限于真核细胞、原核细胞、动物细胞、植物细胞、真菌细胞等。任选地，细胞是哺乳动物细胞，例如人细胞。细胞可以在体外，离体或在体内。细胞还可以是原代细胞、生殖细胞、干细胞或前体细胞。前体细胞可以是例如多能干细胞或造血干细胞。在一些实施方案中，细胞是原代造血细胞或原代造血干细胞。在一些实施方案中，原代造血细胞是免疫细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是T细胞。在一些实施方案中，T细胞是调节性T细胞、效应T细胞或幼稚T细胞。在一些实施方案中，T细胞是CD4+T细胞。在一些实施方案中，T细胞是CD8+T细胞。在一些实施方案中，T细胞是CD4+CD8+T细胞。在一些实施方案中，T细胞是CD4-CD8-T细胞。还提供了通过本文所述的任何方法修饰的任何细胞的群体。在一些实施方案中，所述方法还包括扩大修饰的细胞的群体。
在一些情况下，将细胞从受试者中取出，使用本文所述的任何方法进行修饰并施用至患者。在其他情况下，本文所述的任何构建体递送至患者体内。参见，例如，美国专利第9737604号和Zhang等人“Lipid nanoparticle-mediated efficient delivery ofCRISPR/Cas9 for tumor therapy,”NPG Asia Materials第9期,第e441页(2017)，两者据此以引用的方式并入。
在一些实施方案中，将RNP-DNA模板复合物引入约1x 105至约2x 106个细胞中。例如，可以将RNP-DNA模板复合物引入约1x 105至约5x 105个细胞、约1x 105至约1x 106个细胞、1x 105至约1.5x 106个细胞、1x 105至约2x 106个细胞、约1x 106至约1.5x 106个细胞或约1x 106至约2x 106个细胞中。
在一些情况下，本文所述的方法和组合物可用于产生、修饰、使用或控制重组T细胞，诸如嵌合抗原受体T细胞(CAR T细胞)。此类CAR T细胞可用于治疗或预防受试者的癌症、传染病或自身免疫性疾病。例如，在一些实施方案中，将一个或多个基因产物插入或敲入T细胞以表达异源蛋白(例如，嵌合抗原受体(CAR)或启动受体)。
基因工程化(例如，基因组编辑、核酸酶介导的编辑、CRISPR/Cas9介导的编辑等)、异源受体的工程化表达(例如，CAR和/或TCR)和RNAi(例如，反义RNA、siRNA、微小RNA、shRNA等)描述于国际公布号WO2018232356A1、WO2019084552A1、WO2019226998A1、WO2020014235A1、WO2020123871A1和WO2020186219A1中，所述公布各自出于所有目的以引用的方式并入本文。
插入位点
用于编辑T细胞基因组的方法，具体地包括编辑人T细胞基因组的方法，包括将核酸序列或构建体插入人T细胞中的TCR-α亚基(TRAC)基因的外显子1的靶区中。在一些实施方案中，靶区位于TRAC基因的恒定结构域的外显子1中。在其他实施方案中，靶区位于外显子1、外显子2或外显子3中，在编码TCR-α跨膜结构域的序列开始之前。
用于编辑T细胞基因组的方法还包括编辑人T细胞基因组的方法，包括将核酸序列或构建体插入人T细胞中的TCR-β亚基(TRBC)基因的外显子1的靶区中。在一些实施方案中，靶区位于TRBC1或TRBC2基因的外显子1中。
用于编辑T细胞基因组的方法，具体地包括编辑人T细胞基因组的方法，包括将核酸序列或构建体插入基因组安全港(GSH)位点的靶区中。
用于编辑T细胞基因组的方法还包括编辑人T细胞基因组的方法，包括将核酸序列或构建体插入GS94靶区(基因座chr11：128340000-128350000)中。
在一些实施方案中，靶区是GS94基因座。
基因编辑疗法包括，例如，载体整合和位点特异性整合。位点特异性整合是病毒载体随机整合的一种有前景的替代方法，因为它降低了插入诱变或插入瘤形成的风险(Kolb等人Trends Biotechnol.2005 23:399-406；Porteus等人Nat Biotechnol.2005 23:967-973；Paques等人Curr Gen Ther.2007 7:49-66)。然而，位点特异性整合仍然面临着诸如低敲入效率、插入瘤形成风险、相邻基因或转基因的不稳定和/或异常表达、低可及性(例如相邻基因的20kB以内)等挑战。这些挑战可以部分地通过确定和使用安全港基因座或安全港位点(SHS)来解决，这些位点是可以在不破坏相邻基因的表达或调控的情况下整合基因或遗传元件的位点。
最广泛使用的推定人安全港位点是染色体19q上的AAVS1位点，该位点最初被确定为用于复发性腺相关病毒插入的位点。已在同源性的基础上鉴定出其他潜在的SHS，这些位点首先是在其他物种(例如，允许的鼠Rosa26基因座的人同系物)或在越来越多的在某些情况下显得非必需的人基因中鉴定出来的。这种类型的一种推定的SHS是CCR5趋化因子受体基因，该基因当被破坏时赋予对人免疫缺陷病毒感染的抵抗力。在病毒整合位点作图或基因陷阱分析的基础上，已在人和其他细胞类型中鉴定出其他潜在的基因组SHS，就像最初的小鼠Rosa26基因座一样。三个位居前位的SHS、AAVS1、CCR5和Rosa26与许多蛋白质编码基因和调控元件非常接近。(参见Sadelain,M.等人(2012).Safe harbours for theintegration of new DNA in the human genome.Nature reviews Cancer,12(1),51-58，其相关公开内容以引用的方式整体并入本文)。
人19号染色体上的AAVS1(也称为PPP1R12C基因座)是一个已知的用于承载具有预期功能的转基因(例如DNA转基因)的SHS。它处于位置19q13.42处。它具有开放的染色质结构并且具有转录能力。AAVS1的规范SHS基因座是chr19：55,625,241-55,629,351。参见Pellenz等人“New Human Chromosomal Sites with"Safe Harbor"Potential forTargeted Transgene Insertion.”Human gene therapy vol.30,7(2019):814-828，其相关公开内容以引用的方式并入本文。下文提供了示例性AAVS1靶gRNA和靶序列：
·AAVS1-gRNA序列：ggggccactagggacaggatGTTTTAGAGCTAGAAAT AGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCAC CGAGTCGGTGCTTTTTTT(SEQ ID NO:212)
·AAVS1靶序列：ggggccactagggacaggat(SEQ ID NO:213)
CCR5位于3号染色体的位置3p21.31，编码HIV-1的主要共受体。CCR 5基因中该位点的破坏有利于HIV/AIDS疗法，并促进了靶向其第三外显子的锌指核酸酶的开发。CCR5的规范SHS基因座是chr3：46,414,443-46,414,942。参见Pellenz等人“New HumanChromosomal Sites with"Safe Harbor"Pot ential for Targeted TransgeneInsertion.”Human gene therapy vol.30,7(2019):814-828，其相关公开内容以引用的方式并入本文。
小鼠Rosa26基因座对于基因修饰特别有用，因为它可以被高效靶向并在大多数测试细胞类型中表达。Irion等人2007("Identification and targeting of the ROSA26locus in human embryonic stem cells."Nature biotechnology25.12(2007):1477-1482，其相关公开内容以引用的方式并入本文)鉴定了3号染色体(位置3p25.3)中的人同系物，人ROSA26。人Rosa26(hRosa26)的规范SHS基因座是chr3：9,415,082-9,414,043。参见Pellenz等人“New Huma n Chromosomal Sites with"Safe Harbor"Potential forTargeted Transgene Insertion.”Human gene therapy vol.30,7(2019):814-828，其相关公开内容以引用的方式并入本文。
安全港位点的另外实例提供于Pellenz等人“New Human Chromosomal Siteswith"Safe Harbor"Potential for Targeted Transgene Insertion.”Huma n genetherapy vol.30,7(2019):814-828，其相关公开内容以引用的方式并入本文。另外的整合位点的实例提供于表D中。
在一些实施方案中，安全港位点允许转基因高表达(足以实现转基因功能性或对目标疾病的治疗)和转基因在数天、数周或数月内的稳定表达。在一些实施方案中，安全港基因座处基因的敲除赋予细胞功能益处，或者安全港基因座处的基因在细胞内没有已知功能。在一些实施方案中，安全港基因座使得：在有或没有CD3/CD28刺激的情况下转基因在体外稳定表达，如通过iGuide-Seq或CRISPR-Seq所检测脱靶裂解可忽略不计，如通过iGuide-Seq或CRISPR-Seq所检测相对于其他基因座脱靶裂解减少，转基因非依赖性细胞毒性可忽略不计，转基因非依赖性细胞因子表达可忽略不计，转基因非依赖性嵌合抗原受体表达可忽略不计，附近基因的失调控或沉默可忽略不计，以及定位于癌相关基因之外。
如所用，“附近基因”可以指代距离安全港基因座(整合位点)约100kB、约125kB、约150kB、约175kB、约200kB、约225kB、约250kB、约275kB、约300kB、约325kB、约350kB、约375kB、约400kB、约425kB、约450kB、约475kB、约500kB、约525kB、约550kB内的基因。
在一些实施方案中，本公开设想包含一个或多个转基因的插入物。转基因可以编码治疗性蛋白、抗体、肽或任何其他目标基因。转基因整合可以导致例如增强的治疗特性。如本文所用，这些增强的治疗特性是指与相同正常细胞类型的典型免疫细胞相比，细胞的增强的治疗特性。例如，与典型的、未修饰的和/或天然存在的T细胞相比，具有“增强的治疗特性”的T细胞具有增强的、改善的和/或增加的治疗结果。免疫细胞的治疗特性可以包括但不限于细胞移植、运输、归巢、活力、自我更新、持久性、免疫应答控制和调控、存活和细胞毒性。免疫细胞的治疗特性还表现为：抗原靶向受体表达；HLA呈递或缺乏；对瘤内微环境的耐受性；旁观者免疫细胞的诱导和免疫调节；减量下靶特异性提高；对治疗诸如化学疗法的抗性。
如本文所用，术语“插入物大小”是指整合(插入)到靶基因座或安全港位点处的核苷酸序列的长度。在一些实施方案中，插入物大小包括至少约4.5千碱基对(kb)至约10千碱基对(kb)。在一些实施方案中，插入物大小包括约5000个核苷酸或更多碱基对。在一些实施方案中，插入物大小包括多达4.5、4.8、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20kbp(千碱基对)或介于之间的大小。在一些实施方案中，插入物大小为大于4.5、4.8、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20kbp或介于之间的大小。在一些实施方案中，插入物大小在4.5-15kbp的范围内或者是该范围内的任何数字。在一些实施方案中，插入物大小在4.8-8.3kbp的范围内或者是该范围内的任何数字。在一些实施方案中，插入物大小在5-8.3kbp的范围内或者是该范围内的任何数字。在一些实施方案中，插入物大小在5-15kbp的范围内或者是该范围内的任何数字。在一些实施方案中，插入物大小在4.5-20kbp的范围内或者是该范围内的任何数字。在一些实施方案中，插入物大小为5-10kbp。在一些实施方案中，插入物大小为4.5-10、5-10、6-10、7-10、8-10、9-10kbp。在一些实施方案中，插入物大小为4.5-11、6-11、7-11、8-11、9-11或10-11kbp。在一些实施方案中，插入物大小为4.5-12、6-12、7-12、8-12、9-12、10-12或11-12kbp。在一些实施方案中，插入物大小为4.5-13、6-13、7-13、8-13、9-13、10-13、11-13或12-13kbp。在一些实施方案中，插入物大小为4.5-14、6-14、7-14、8-14、9-14、10-14、11-14、12-14或13-14kbp。在一些实施方案中，插入物大小为4.5-15、6-15、7-15、8-15、9-15、10-15、11-15、12-15、13-15或14-15kbp。在一些实施方案中，插入物大小为4.5-16、6-16、7-16、8-16、9-16、10-16、11-16、12-16、13-16、14-16或15-16kbp。在一些实施方案中，插入物大小为4.5-17、6-17、7-17、8-17、9-17、10-17、11-17、12-17、13-17或14-17、15-17或16-17kbp。在一些实施方案中，插入物大小为4.5-18、6-18、7-18、8-18、9-18、10-18、11-18、12-18、13-18、14-18、15-18、16-18或17-18kbp。在一些实施方案中，插入物大小为4.5-19、6-19、7-19、8-19、9-19、10-19、11-19、12-19、13-19、14-19、15-19、16-19、17-19或18-19kbp。在一些实施方案中，插入物大小为4.5-20、6-20、7-20、8-20、9-20、10-20、11-20、12-20、13-20、14-20、15-20、16-20、17-20、18-20或19-20kbp。
本公开的插入物是指插入到靶基因座或安全港位点处的核酸分子或多核苷酸。在一些实施方案中，核苷酸序列是DNA分子例如基因组DNA，或者包含脱氧核糖核苷酸。在一些实施方案中，插入物包含较小的DNA片段，诸如质体DNA、线粒体DNA，或以质粒、福斯质粒、粘粒、细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)和/或DNA的任何其他亚基因组区段形式分离的DNA。在一些实施方案中，插入物是RNA分子或者包含核糖核苷酸。插入物中的核苷酸被认为是天然存在的核苷酸、非天然存在的核苷酸和修饰的核苷酸。如本领域技术人员将容易理解的，核苷酸可进行化学或生物化学修饰，或者可含有非天然或衍生化的核苷酸碱基。此类修饰包括例如标记、甲基化、用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸、核苷酸间修饰。多核苷酸可以是任何拓扑构象，包括单链构象、双链构象、部分双链构象、三链构象、发夹式构象、环状象和本领域所设想的其他三维构象。
插入物可以具有编码和/或非编码区。插入物可以包含非编码序列(例如，控制元件，例如启动子序列)。在一些实施方案中，插入物编码转录因子。在一些实施方案中，插入物编码抗原结合受体，诸如单一受体、T细胞受体(TCR)、启动受体、CAR、mAb等。在一些实施方案中，插入物是人序列。在一些实施方案中，插入物是模拟物。在一些实施方案中，插入物是多基因/多模块治疗性盒。多基因/多模块治疗性盒是指具有一种或超过一种受体(例如，合成受体)、其他外源蛋白编码序列、非编码RNA、转录调控元件和/或隔离子序列(insulator sequence)等的插入物或盒。
在一些实施方案中，将核酸序列通过非病毒递送插入T细胞的基因组中。在非病毒递送方法中，核酸可以是裸DNA，或在非病毒质粒或载体中。如本文所述或本领域普通技术人员已知的，非病毒递送技术可以是位点特异性整合技术。用于整合到安全港基因座中的位点特异性技术的实例包括但不限于使用核酸酶的同源依赖性工程化和使用Cas9或其他CRISPR核酸内切酶的同源非依赖性靶向插入。
在一些实施方案中，通过向工程化细胞中引入以下各项将插入物整合到安全港位点处：(a)使安全港位点中的靶区裂解而产生插入位点的靶向核酸酶；和(b)核酸序列(插入物)，其中插入物通过例如HDR并入插入位点。可用于本公开的方法中的非病毒递送技术的实例提供于美国申请第16/568,116号和第16/622,843号中，其相关公开内容以引用的方式整体并入本文。
设想的整合位点的实例提供于表D中。
表D：sgRNA序列
CRISPR-Cas编辑
基因编辑的一个有效实例是CRISPR-Cas方法(例如CRISPR-Cas9)。该方法结合使用指导多核苷酸(例如指导核糖核酸或gRNA)和cas核酸内切酶(例如Cas9核酸内切酶)。
如本文所用，称为“Cas核酸内切酶”或具有“Cas核酸内切酶活性”的多肽是指由Cas基因编码的CRISPR相关(Cas)多肽，其中Cas多肽是当可操作地连接至一个或多个指导多核苷酸时可以被裂解的靶DNA序列(参见，例如，美国专利第8,697,359号)。该定义还包括保留指导多核苷酸依赖性核酸内切酶活性的Cas核酸内切酶的变体。在本文详述的供体DNA插入方法中使用的Cas核酸内切酶是将双链断裂引入DNA中的靶位点处(例如，靶基因座内或安全港位点处)的核酸内切酶。
如本文所用，术语“指导多核苷酸”涉及能够与Cas核酸内切酶复合并允许Cas核酸内切酶识别并裂解DNA靶位点的多核苷酸序列。指导多核苷酸可以是单分子或双分子。指导多核苷酸序列可以是RNA序列、DNA序列或它们的组合(RNA-DNA组合序列)。仅包含核糖核酸的指导多核苷酸也称为“指导RNA”。在一些实施方案中，使用指导RNA(gRNA)与cas核酸内切酶(例如Cas9核酸内切酶)的组合将多核苷酸供体构建体插入安全港基因座处。
指导多核苷酸包括与靶DNA中的核苷酸序列互补的第一核苷酸序列结构域(也称为可变靶向结构域或VT结构域)，以及与Cas核酸内切酶多肽相互作用的第二核苷酸。它可以是包含序列结构域(称为Cas核酸内切酶识别结构域或CER结构域)的双分子(也称为双链指导多核苷酸)。这种双分子指导多核苷酸的CER结构域包含两个沿着互补区杂交的独立分子。两个独立分子可以是RNA序列、DNA序列和/或RNA-DNA组合序列。
使用CRISPR-Cas方法的基因组编辑依赖于由RNA指导的Cas核酸内切酶(例如Cas9核酸内切酶)诱导的位点特异性DNA双链断裂(DSB)的修复。对这些DSB的同源定向修复(HDR)使得能够通过引入限定的基因组变化(包括碱基取代、序列插入和缺失)实现基因组的精确编辑。常规的基于HDR的CRISPR/Cas9基因组编辑涉及用Cas9、gRNA和含有与目标基因组基因座匹配的同源臂的供体DNA转染细胞。
HITI(同源非依赖性靶向插入)使用基于非同源末端接合(NHEJ)的同源非依赖性策略，并且该方法比HDR更有效。指导RNA(gRNA)靶向插入位点。对于HITI，供体质粒缺乏同源臂，并且DSB修复不会通过HDR途径发生。供体多核苷酸构建体可以经工程化以包括位于待插入基因或序列侧翼的Cas9裂解位点。这导致Cas9在供体质粒和基因组靶序列处裂解。靶标和供体都有平端，线状供体DNA质粒被NHEJ途径所用，导致整合到基因组DSB位点中。(参见，例如，Suzuki,K.等人(2016).In vivo genome editing via CRISPR/Cas9mediatedhomology-independent targeted integration.Nature,540(7631),144-149，其相关公开内容整体并入本文)。
使用CRISPR-Cas方法进行基因编辑的方法是本领域普通技术人员已知的。(参见，例如，美国申请第US16/312,676号、第US15/303,722号和第US15/628,533号，其公开内容以引用的方式整体并入本文)。另外，核酸内切酶用于将转基因插入安全港基因座中的用途描述于例如美国申请第13/036,343号中，其公开内容以引用的方式整体并入本文。
编码核酸内切酶的指导RNA和/或mRNA(或DNA)可以化学连接至一个或多个增强寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞摄取的部分或缀合物。此类部分的非限制性实例包括脂质部分(诸如胆固醇部分)、胆酸、硫醚、巯基胆固醇、脂族链(例如，十二烷二醇或十一烷基残基)、磷脂(例如二-十六烷基-外消旋-甘油或三乙基铵1,2-二-O-十六烷基-外消旋-甘油-3-H-膦酸酯)、聚胺或聚乙二醇链、金刚烷乙酸、棕榈基部分和十八胺或己基氨基-羰基-t-羟胆固醇部分。参见例如美国专利公布第20180127786号，其公开内容以引用的方式整体并入本文。
治疗应用
对于治疗应用，将工程化细胞、其群体或其组合物以有效量施用至受试者，一般是哺乳动物，一般是人。可通过输注(例如，在一段时间内连续输注)或本领域普通技术人员已知的其他施用方式将工程化细胞施用至受试者。
本文提供的工程化细胞不仅可用于基因疗法，还可用于非药物用途，诸如例如动物模型的产生以及表达目标蛋白质的重组细胞系的产生。
本公开的工程化细胞可以是已通过在本文所述的安全港基因座处整合转基因而经修饰的任何细胞，一般是哺乳动物细胞，一般是人细胞。重组细胞部分提供了示例性细胞。
本公开的工程化细胞、组合物和方法可用于治疗应用，诸如CAR T细胞疗法和TCRT细胞疗法。在一些实施方案中，在安全港基因座内插入编码转基因的序列相对于没有插入时的情况保持TCR表达，并在保持TCR功能的同时实现转基因表达。
在一些实施方案中，本公开提供了通过向需要治疗的受试者施用包含本文所述的任何工程化细胞的组合物来治疗受试者的方法。在一些实施方案中，工程化细胞组合物的施用导致所需药理和/或生理作用。该作用可以是疾病的部分或完全治愈和/或由疾病引起的副作用。在一些实施方案中，治疗涵盖对受试者(例如，哺乳动物，例如人)疾病的任何治疗。此外，治疗可以稳定或减少受试者(例如，患者)的不良临床症状。本文提供的细胞、其群体或其组合物可在疾病发生期间或之后施用。
在某些实施方案中，受试者患有可以通过细胞疗法治疗和/或改善的疾病、疾患和/或损伤。在一些实施方案中，需要细胞疗法的受试者是具有损伤、疾病或疾患的受试者，从而引起细胞疗法(例如，将细胞物质施用至受试者的疗法)。然而，设想有可能治疗、改善与损伤、疾病或疾患相关的至少一种症状和/或降低其严重性。
施用方法
可施用有效量的包含所述系统的免疫细胞来治疗癌症。包含所述系统的免疫细胞的适当剂量可基于待治疗的癌症类型、包含该系统的免疫细胞的类型、癌症的严重性和病程、个体的临床状况、个体的临床病史和对治疗的应答以及主治医生的判断来确定。
药物组合物
本文提供的工程化重组细胞可以作为药物组合物的一部分来施用。除重组细胞中的一者或多者以外，这些组合物还可包含药学上可接受的赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂或为本领域技术人员所熟知的其他物质。所述物质应是无毒的，并且不应干扰活性成分的功效。载体或其他物质的确切性质可取决于施用途径，例如口服、静脉内、经皮肤或皮下、经鼻、肌肉内、腹膜内途径。药物组合物可包含一种或多种药物赋形剂。可使用任何适合药物赋形剂，并且本领域普通技术人员能够选择适合药物赋形剂。因此，以下提供的药物赋形剂旨在说明而非限制。另外的药物赋形剂包括例如描述于以下中的那些：Handbook ofPharmaceutical Excipients,Rowe等人(编)第6版(2009)，其以引用的方式整体并入。
本文设想了施用另外治疗剂的各种模式。在一些实施方案中，通过任何适合施用模式施用另外的治疗剂。
视待治疗的疾患而定，组合物可单独施用，或与其他治疗进行组合，同时或依序加以施用。
药盒和制品
本申请提供了包含本文所述的任何一种或多种系统或细胞组合物以及使用说明书的药盒。使用说明可以作为包装插页存在于药盒中，存在于药盒容器或其部件的标签中，或者可以呈数字形式(例如，在CD-ROM上，通过互联网上的链接)。药盒可以包括一种或多种基因组靶向核酸、编码基因组靶向核酸的多核苷酸、定点多肽和/或编码定点多肽的多核苷酸。还设想了药盒内的另外组分，例如缓冲液(诸如复原缓冲液、稳定缓冲液、稀释缓冲液)和/或一种或多种对照载体。
在一些实施方案中，药盒还包含选自二抗、免疫组织化学分析试剂、药学上可接受的赋形剂和说明书中的任一者以及它们的任意组合的组成部分。在一个特定实施方案中，药盒包括包含本文所述的抗体组合物中的任何一者或多者以及一种或多种药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
本申请还提供了包括本文所述的抗体组合物或药盒中的任一者的制品。制品的实例包括小瓶(包括密封小瓶)。
另外的实施方案
实施方案1一种或多种重组核酸，其中所述一种或多种重组核酸编码：
包含启动受体的第一嵌合多肽；
包含嵌合抗原受体(CAR)的第二嵌合多肽；和
至少一个长度为至少15个核苷酸的核酸序列，其中所述至少一个核酸序列包含以下一项或多项：(1)第一核酸序列，所述第一核酸序列与包含SEQ ID NO:39所示序列的编码人Fas细胞表面死亡受体(FAS)的mRNA的核苷酸1126至1364互补，(2)第二核酸序列，所述第二核酸序列与包含SEQ ID NO:40所示序列的编码人非受体型蛋白酪氨酸磷酸酶2(PTPN2)的mRNA的核苷酸518至559互补；和(3)第三核酸序列，所述第三核酸序列与包含SEQ ID NO:41所示序列的编码人胸腺细胞选择相关高迁移率族盒(TOX)的mRNA的核苷酸1294至2141互补。
实施方案2如实施方案1所述的重组核酸，其中所述启动受体包含特异性地结合至生殖细胞碱性磷酸酶(ALPG/P)的第一细胞外抗原结合结构域。
实施方案3如实施方案2所述的重组核酸，其中所述第一细胞外抗原结合结构域包含可变重(VH)链序列和可变轻(VL)链序列，所述可变重(VH)链序列包含三个重链CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述可变轻(VL)链序列包含三个轻链CDR序列CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中：
CDR-H1包含SEQ ID NO:1所示的序列，
CDR-H2包含SEQ ID NO:2所示的序列，
CDR-H3包含SEQ ID NO:3所示的序列，
CDR-L1包含SEQ ID NO:4所示的序列，
CDR-L2包含SEQ ID NO:5所示的序列，并且
CDR-L3包含SEQ ID NO:6所示的序列。
实施方案4如实施方案3所述的重组核酸，其中所述CAR包含特异性地结合至间皮素(MSLN)的第二细胞外抗原结合结构域，并且其中所述第二细胞外抗原结合结构域包含可变重(VH)链序列，所述可变重(VH)链序列包含三个重链CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中：
CDR-H1包含SEQ ID NO:14所示的序列，
CDR-H2包含SEQ ID NO:15所示的序列，并且
CDR-H3包含SEQ ID NO:16所示的序列。
实施方案5如实施方案4所述的重组核酸，其中所述至少一个核酸序列包含以下各项：(1)第一核酸序列，所述第一核酸序列与包含SEQ ID NO:39所示序列的编码人FAS的mRNA的核苷酸1126至1364互补；和(2)第二核酸序列，所述第二核酸序列与包含SEQ ID NO:40所示序列的编码人PTPN2的mRNA的核苷酸518至559互补。
实施方案6如实施方案1-3中任一项所述的重组核酸，其中所述CAR包含特异性地结合至间皮素(MSLN)的第二细胞外抗原结合结构域。
实施方案7如实施方案6所述的重组核酸，其中所述第二细胞外抗原结合结构域包含可变重(VH)链序列，所述可变重(VH)链序列包含三个重链CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中：
CDR-H1包含SEQ ID NO:14所示的序列，
CDR-H2包含SEQ ID NO:15所示的序列，并且
CDR-H3包含SEQ ID NO:16所示的序列。
实施方案8如实施方案6所述的重组核酸，其中所述第二细胞外抗原结合结构域包含单结构域抗体，所述单结构域抗体包含可变重(VHH)链序列，所述可变重(VHH)链序列包含三个重链CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中：
CDR-H1包含SEQ ID NO:10所示的序列，
CDR-H2包含SEQ ID NO:11所示的序列，并且
CDR-H3包含SEQ ID NO:12所示的序列。
实施方案9一种或多种重组核酸，其中所述一种或多种重组核酸编码：
包含启动受体的第一嵌合多肽，所述启动受体包含特异性地结合胎盘/生殖细胞碱性磷酸酶(ALPG/P)的第一细胞外抗原结合结构域，其中所述第一细胞外抗原结合结构域包含可变重(VH)链序列和可变轻(VL)链序列，所述可变重(VH)链序列包含三个重链CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述可变轻(VL)链序列包含三个轻链CDR序列CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中：
CDR-H1包含SEQ ID NO:1所示的序列，
CDR-H2包含SEQ ID NO:2所示的序列，
CDR-H3包含SEQ ID NO:3所示的序列，
CDR-L1包含SEQ ID NO:4所示的序列，
CDR-L2包含SEQ ID NO:5所示的序列，并且
CDR-L3包含SEQ ID NO:6所示的序列；
包含嵌合抗原受体(CAR)的第二嵌合多肽；
第一核酸序列，所述第一核酸序列与包含SEQ ID NO:39所示序列的编码人FAS的mRNA的核苷酸1126至1364互补，以及
第二核酸序列，所述第二核酸序列与包含SEQ ID NO:40所示序列的编码人PTPN2的mRNA的核苷酸518至559互补，或者与包含SEQ ID NO:41所示序列的编码人TOX的mRNA的核苷酸1294至2141互补。
实施方案10如实施方案3-9中任一项所述的重组核酸，其中所述第一细胞外抗原结合结构域VH链序列包含SEQ ID NO:7所示的序列。
实施方案11如实施方案3-10中任一项所述的重组核酸，其中所述第一细胞外抗原结合结构域VL链序列包含SEQ ID NO:8所示的序列。
实施方案12如实施方案3-11中任一项所述的重组核酸，其中所述第一细胞外抗原结合结构域包含SEQ ID NO:9所示的序列。
实施方案13如实施方案9-12中任一项所述的重组核酸，其中所述CAR包含特异性地结合至间皮素(MSLN)的第二细胞外抗原结合结构域。
实施方案14如实施方案13所述的重组核酸，其中所述第二细胞外抗原结合结构域包含可变重(VH)链序列，所述可变重(VH)链序列包含三个重链CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中：
CDR-H1包含SEQ ID NO:14所示的序列，
CDR-H2包含SEQ ID NO:15所示的序列，并且
CDR-H3包含SEQ ID NO:16所示的序列。
实施方案15如实施方案4-8和13-14中任一项所述的重组核酸，其中所述第二细胞外抗原结合结构域VH包含如SEQ ID NO:17所示的序列。
实施方案16如实施方案13所述的重组核酸，其中所述第二细胞外抗原结合结构域包含单结构域抗体，所述单结构域抗体包含可变重(VHH)链序列，所述可变重(VHH)链序列包含三个重链CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中：
CDR-H1包含SEQ ID NO:10所示的序列，
CDR-H2包含SEQ ID NO:11所示的序列，并且
CDR-H3包含SEQ ID NO:12所示的序列。
实施方案17如实施方案4-8、13和16中任一项所述的重组核酸，其中所述第二细胞外抗原结合结构域VHH链序列包含SEQ ID NO:13所示的序列。
实施方案18如实施方案1至17中任一项所述的重组核酸，其中所述第二核酸序列与包含SEQ ID NO:40所示序列的编码人PTPN2的mRNA的核苷酸518至559互补。
实施方案19如实施方案1至17中任一项所述的重组核酸，其中所述重组核酸包含选自由SEQ ID NO:168、167或166所示序列组成的组的序列。
实施方案20如实施方案1至17中任一项所述的重组核酸，其中所述第二核酸序列与包含SEQ ID NO:41所示序列的编码人TOX的mRNA的核苷酸1294至2141互补。
实施方案21一种重组核酸，所述重组核酸包含长度为至少15个核苷酸的核酸序列，所述核酸序列与包含SEQ ID NO:39所示序列的编码人FAS的mRNA的核苷酸1126至1364互补。
实施方案22一种重组核酸，所述重组核酸包含长度为至少15个核苷酸的核酸序列，所述核酸序列与包含SEQ ID NO:40所示序列的编码人非受体型蛋白酪氨酸磷酸酶2(PTPN2)的mRNA的核苷酸518至559互补。
实施方案23一种重组核酸，所述重组核酸包含长度为至少15个核苷酸的核酸序列，所述核酸序列与包含SEQ ID NO:41所示序列的编码人胸腺细胞选择相关高迁移率族盒(TOX)的mRNA的核苷酸1294至2141互补。
实施方案24一种或多种重组核酸，所述重组核酸包含长度为至少15个核苷酸的第一核酸序列，所述第一核酸序列与包含SEQ ID NO:39所示序列的编码人FAS的mRNA的核苷酸1126至1364互补；和长度为至少15个核苷酸的第二核酸序列，所述第二核酸序列与包含SEQ ID NO:40所示序列的编码人PTPN2的mRNA的核苷酸518至559互补。
实施方案25一种或多种重组核酸，所述重组核酸包含长度为至少15个核苷酸的第一核酸，所述第一核酸与包含SEQ ID NO:39所示序列的编码人FAS的mRNA的核苷酸1126至1364互补；和长度为至少15个核苷酸的第二核酸，所述第二核酸与包含SEQ ID NO:41所示序列的编码人TOX的mRNA的核苷酸1294至2141互补。
实施方案26如实施方案1至25中任一项所述的重组核酸，其中所述第一和第二核酸序列的长度为至少16个、17个、18个、19个、20个、21个或22个核苷酸。
实施方案27如实施方案1至26中任一项所述的重组核酸，其中所述第一和第二核酸是短发夹RNA(shRNA)、小干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)或反义寡核苷酸。
实施方案28如实施方案27所述的重组核酸，其中所述第一和第二核酸是shRNA。
实施方案29如实施方案1-28中任一项所述的重组核酸，其中所述第一核酸序列包含选自由SEQ ID NO:42-71所示序列组成的组的序列。
实施方案30如实施方案29所述的重组核酸，其中所述第一核酸序列包含SEQ IDNO:49所示的序列。
实施方案31如实施方案1-30中任一项所述的重组核酸，其中与不包含所述核酸的对照细胞相比，所述第一核酸将免疫细胞中FAS的表达降低至少50％、55％、60％、65％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。
实施方案32如实施方案1-31中任一项所述的重组核酸，其中所述第二核酸序列包含选自由SEQ ID NO:72-97所示序列组成的组的序列。
实施方案33如实施方案32所述的重组核酸，其中所述第二核酸序列包含SEQ IDNO:82所示的序列。
实施方案34如实施方案1-33中任一项所述的重组核酸，其中所述第一核酸序列包含选自由SEQ ID NO:42至71所示序列组成的组的序列；并且所述第二核酸序列包含选自由SEQ ID NO:72至97所示序列组成的组的序列。
实施方案35如实施方案1-34中任一项所述的重组核酸，其中所述第一核酸序列包含SEQ ID NO:49所示的序列，并且所述第二核酸序列包含SEQ ID NO:82所示的序列。
实施方案36如实施方案1-35中任一项所述的重组核酸，其中与不包含所述核酸的对照细胞相比，所述第二核酸将免疫细胞中PTPN2的表达降低至少50％、55％、60％、65％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。
实施方案37如实施方案1-31中任一项所述的重组核酸，其中所述第二核酸序列包含选自由SEQ ID NO:98-125所示序列组成的组的序列。
实施方案38如实施方案37所述的重组核酸，其中所述第二核酸序列包含SEQ IDNO:99或104所示的序列。
实施方案39如实施方案1-31或37-38中任一项所述的重组核酸，其中所述第一核酸序列包含选自由SEQ ID NO:42至71所示序列组成的组的序列；并且所述第二核酸序列包含选自由SEQ ID NO:98至125所示序列组成的组的序列。
实施方案40如实施方案39所述的重组核酸，其中所述第一核酸序列包含SEQ IDNO:49所示的序列，并且所述第二核酸序列包含SEQ ID NO:SEQ ID NO:99或104所示的序列。
实施方案41如实施方案1-31或37-40中任一项所述的重组核酸，其中与不包含所述核酸的对照细胞相比，所述第二核酸将免疫细胞中TOX的表达降低至少50％、55％、60％、65％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。
实施方案42如实施方案1-41中任一项所述的重组核酸，其中所述第一、第二和/或第三核酸序列在重组核酸的至少一个内含子区域中编码。
实施方案43一种或多种重组核酸，其中所述一种或多种重组核酸编码：
第一嵌合多肽，其包含启动受体，
第二嵌合多肽，其包含嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体(CAR)包含特异性地结合至间皮素(MSLN)的细胞外抗原结合结构域，其中所述细胞外抗原结合结构域包含单结构域抗体，所述单结构域抗体包含可变重(VHH)链序列，所述可变重(VHH)链序列包含三个重链CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中：
CDR-H1包含SEQ ID NO:10所示的序列，
CDR-H2包含SEQ ID NO:11所示的序列，并且
CDR-H3包含SEQ ID NO:12所示的序列；和
长度为至少15个核苷酸的第一核酸序列，其中所述第一核酸序列与包含SEQ IDNO:39所示序列的编码人FAS的mRNA的核苷酸1126至1364互补；和
第二核酸序列，其中所述第二核酸序列与包含SEQ ID NO:40所示序列的编码人PTPN2的mRNA的核苷酸518至559互补，或者与包含SEQ ID NO:41所示序列的编码人TOX的mRNA的核苷酸1294至2141互补。
实施方案44如实施方案43所述的重组核酸，其中所述VHH链序列包含SEQ ID NO:13所示的序列。
实施方案45一种或多种重组核酸，其中所述一种或多种重组核酸编码：
第一嵌合多肽，其包含启动受体，
第二嵌合多肽，其包含嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体(CAR)包含特异性地结合至间皮素(MSLN)的细胞外抗原结合结构域，其中所述第二细胞外抗原结合结构域包含可变重(VH)链序列，所述可变重(VH)链序列包含三个重链CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中：
CDR-H1包含SEQ ID NO:14所示的序列，
CDR-H2包含SEQ ID NO:15所示的序列，并且
CDR-H3包含SEQ ID NO:16所示的序列；和
长度为至少15个核苷酸的第一核酸序列，其中所述第一核酸序列与包含SEQ IDNO:39所示序列的编码人FAS的mRNA的核苷酸1126至1364互补；和
第二核酸序列，其中所述第二核酸序列与包含SEQ ID NO:40所示序列的编码人PTPN2的mRNA的核苷酸518至559互补，或者与包含SEQ ID NO:41所示序列的编码人TOX的mRNA的核苷酸1294至2141互补。
实施方案46如实施方案45所述的重组核酸，其中所述VH包含如SEQ ID NO:17所示的序列。
实施方案47一种或多种重组核酸，其中所述一种或多种重组核酸编码：
第一嵌合多肽，其包含启动受体，所述启动受体包含特异性地结合至生殖细胞碱性磷酸酶(ALPG/P)的第一细胞外抗原结合结构域；和
第二嵌合多肽，其包含CAR，所述CAR包含特异性地结合至间皮素(MSLN)的第二细胞外抗原结合结构域；
长度为至少15个核苷酸的第一核酸序列，其中所述第一核酸序列与包含SEQ IDNO:39所示序列的编码人FAS的mRNA的核苷酸1126至1364互补；和
第二核酸序列，其中所述第二核酸序列与包含SEQ ID NO:40所示序列的编码人PTPN2的mRNA的核苷酸518至559互补，或者与包含SEQ ID NO:41所示序列的编码人TOX的mRNA的核苷酸1294至2141互补。
实施方案48如实施方案43-47中任一项所述的重组核酸，其中所述第二核酸序列与包含SEQ ID NO:40所示序列的编码人PTPN2的mRNA的核苷酸518至559互补。
实施方案49如实施方案43-48中任一项所述的重组核酸，其中所述重组核酸包含选自由SEQ ID NO:168、167或166所示序列组成的组的序列。
实施方案50如实施方案43-47中任一项所述的重组核酸，其中所述第二核酸序列与包含SEQ ID NO:41所示序列的编码人TOX的mRNA的核苷酸1294至2141互补。
实施方案51如实施方案43至50中任一项所述的重组核酸，其中所述第一和第二核酸序列的长度为至少16个、17个、18个、19个、20个、21个或22个核苷酸。
实施方案52如实施方案43至51中任一项所述的重组核酸，其中所述第一和第二核酸是短发夹RNA(shRNA)、小干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)或反义寡核苷酸。
实施方案53如实施方案52所述的重组核酸，其中所述第一和第二核酸是shRNA。
实施方案54如实施方案43-53中任一项所述的重组核酸，其中所述第一核酸序列包含选自由SEQ ID NO:42-71所示序列组成的组的序列。
实施方案55如实施方案54所述的重组核酸，其中所述第一核酸序列包含SEQ IDNO:49所示的序列。
实施方案56如实施方案43-55中任一项所述的重组核酸，其中与不包含所述核酸的对照细胞相比，所述第一核酸将免疫细胞中FAS的表达降低至少50％、55％、60％、65％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。
实施方案57如实施方案43-56中任一项所述的重组核酸，其中所述第二核酸序列包含选自由SEQ ID NO:72-97所示序列组成的组的序列。
实施方案58如实施方案57所述的重组核酸，其中所述第二核酸序列包含SEQ IDNO:82所示的序列。
实施方案59如实施方案43-58中任一项所述的重组核酸，其中与不包含所述核酸的对照细胞相比，所述第二核酸将免疫细胞中PTPN2的表达降低至少50％、55％、60％、65％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。
实施方案60如实施方案43-56中任一项所述的重组核酸，其中所述第二核酸序列包含选自由SEQ ID NO:98-125所示序列组成的组的序列。
实施方案61如实施方案60所述的重组核酸，其中所述第二核酸序列包含SEQ IDNO:99或104所示的序列。
实施方案62如实施方案43-56、60或61中任一项所述的重组核酸，其中与不包含所述核酸的对照细胞相比，所述第二核酸将免疫细胞中TOX的表达降低至少50％、55％、60％、65％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。
实施方案63如实施方案43-62中任一项所述的重组核酸，其中所述第一、第二和/或第三核酸序列在重组核酸的至少一个内含子区域中编码。
实施方案64如实施方案1-63所述的重组核酸，其中所述启动受体从N末端至C末端包含：
第一细胞外抗原结合结构域；
包含一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点的第一跨膜结构域；和
包含人或人源化转录效应物的细胞内结构域，其中ALPG/P与第一细胞外抗原结合结构域的结合导致在所述一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点处的裂解。
实施方案65如实施方案64所述的重组核酸，其中所述启动受体还包含定位于所述第一细胞外抗原结合结构域与所述第一跨膜结构域之间的第一铰链结构域。
实施方案66如实施方案65所述的重组核酸，其中所述第一铰链结构域包含CD8α或截短的CD8α铰链结构域。
实施方案67如实施方案66所述的重组核酸，其中所述第一铰链包含如SEQ ID NO:18所示的序列。
实施方案68如实施方案1-67所述的重组核酸，其中所述第一跨膜结构域包含Notch1跨膜结构域。
实施方案69如实施方案68所述的重组核酸，其中所述第一跨膜结构域包含如SEQID NO:19所示的序列。
实施方案70如实施方案64-69中任一项所述的重组核酸，其中所述细胞内结构域包含HNF1a/p65结构域或Gal4/VP64结构域。
实施方案71如实施方案70所述的重组核酸，其中所述细胞内结构域包含如SEQ IDNO:23所示的序列。
实施方案72如实施方案1-71中任一项所述的重组核酸，其中所述启动受体还包含在所述第一跨膜结构域与所述细胞内结构域之间的终止转移序列。
实施方案73如实施方案72所述的重组核酸，其中所述终止转移序列包含如SEQ IDNO:20所示的序列。
实施方案74如实施方案1-73中任一项所述的重组核酸，其中所述启动受体包含如SEQ ID NO:24所示的序列。
实施方案75如实施方案1至74中任一项所述的重组核酸，其中所述CAR从N末端至C末端包含：
第二细胞外抗原结合结构域；
第二跨膜结构域；
细胞内共刺激结构域；和
细胞内激活结构域。
实施方案76如实施方案75所述的重组核酸，其中所述第二细胞外抗原结合结构域特异性地结合至间皮素(MSLN)，其中所述第二细胞外抗原结合结构域包含单结构域抗体，所述单结构域抗体包含可变重(VHH)链序列，所述可变重(VHH)链序列包含三个重链CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中：
CDR-H1包含SEQ ID NO:10所示的序列，
CDR-H2包含SEQ ID NO:11所示的序列，并且
CDR-H3包含SEQ ID NO:12所示的序列。
实施方案77如实施方案76所述的重组核酸，其中所述VHH链序列包含SEQ ID NO:13所示的序列。
实施方案78如实施方案75所述的重组核酸，其中所述第二细胞外抗原结合结构域特异性地结合至间皮素(MSLN)，其中所述细胞外抗原结合结构域包含可变重(VH)链序列，所述可变重(VH)链序列包含三个重链CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中：
CDR-H1包含SEQ ID NO:14所示的序列，
CDR-H2包含SEQ ID NO:15所示的序列，并且
CDR-H3包含SEQ ID NO:16所示的序列。
实施方案79如实施方案78所述的重组核酸，其中所述VH链序列包含SEQ ID NO:17所示的序列。
实施方案80如实施方案1-79中任一项所述的重组核酸，其中所述CAR包含第二铰链结构域。
实施方案81如实施方案80所述的重组核酸，其中所述第二铰链结构域包含CD8α或截短的CD8α铰链结构域。
实施方案82如实施方案75-81中任一项所述的重组核酸，其中所述第二跨膜结构域包含CD8α跨膜结构域。
实施方案83如实施方案75-82中任一项所述的重组核酸，其中所述细胞内共刺激结构域包含4-1BB结构域。
实施方案84如实施方案75-83中任一项所述的重组核酸，其中所述细胞内激活结构域包含CD3ζ结构域。
实施方案85如实施方案1-84中任一项所述的重组核酸，其中所述CAR包含如SEQID NO:30或31所示的序列。
实施方案86如实施方案1-72中任一项所述的重组核酸，其中如果单个靶细胞表达ALPG/P和MSLN每一者，则所述启动受体和所述CAR能够结合至所述靶细胞。
实施方案87如实施方案86所述的重组核酸，其中所述靶细胞是人细胞。
实施方案88如实施方案86或87所述的重组核酸，其中所述靶细胞是癌细胞。
实施方案89如实施方案88中任一项所述的重组核酸，其中所述癌细胞是固体癌细胞或液体癌细胞。
实施方案90如实施方案88-89中任一项所述的重组核酸，其中所述癌细胞是卵巢癌、输卵管癌、原发性腹膜癌、子宫癌、间皮瘤、宫颈癌或胰腺癌。
实施方案01如实施方案1-90中任一项所述的重组核酸，其中所述重组核酸包含两个或更多个核酸片段。
实施方案92如实施方案1-91中任一项所述的重组核酸，其中所述重组核酸还包含可操作地连接至编码所述CAR的核苷酸序列的诱导型启动子。
实施方案93如实施方案1-92中任一项所述的重组核酸，其中所述重组核酸还包含可操作地连接至编码所述启动受体的核苷酸序列的第一组成型启动子。
实施方案94如实施方案1-93中任一项所述的重组核酸，其中所述重组核酸还包含可操作地连接至编码所述嵌合抗原受体的核苷酸序列的诱导型启动子和可操作地连接至编码所述启动受体的核苷酸序列的组成型启动子。
实施方案95如实施方案1-94中任一项所述的重组核酸，其中所述重组核酸还包含可操作地连接至编码与人FAS互补的第一核酸的核苷酸序列的第二组成型启动子。
实施方案96如实施方案1-94中任一项所述的重组核酸，其中所述重组核酸还包含可操作地连接至编码与人PTPN2或TOX互补的第二核酸的核苷酸序列的第二组成型启动子。
实施方案97如实施方案1-96中任一项所述的重组核酸，其中所述重组核酸还包含可操作地连接至编码与人FAS互补的第一核酸或与人PTPN2或TOX互补的第二核酸的核苷酸序列的第二组成型启动子。
实施方案98如实施方案1-97中任一项所述的重组核酸，其中所述重组核酸在5’至3’方向上包含：
所述第一组成型启动子；
编码所述启动受体的核苷酸序列；
所述第二组成型启动子；
编码与人FAS、人PTPN2或人TOX互补的第一核酸的核苷酸序列；
所述诱导型启动子；和
编码所述嵌合抗原受体的核苷酸序列。
实施方案99如实施方案1-97中任一项所述的重组核酸，其中所述重组核酸在5’至3’方向上包含：
所述第一组成型启动子；
编码所述启动受体的核苷酸序列；
所述第二组成型启动子；
编码与人FAS互补的第一核酸的核苷酸序列；
编码与人PTPN2或TOX互补的第二第一核酸的核苷酸序列；
所述诱导型启动子；和
编码所述嵌合抗原受体的核苷酸序列。
实施方案100如实施方案1-97中任一项所述的重组核酸，其中所述重组核酸在5’至3’方向上包含：
所述诱导型启动子；
编码所述嵌合抗原受体的核苷酸序列；
所述第二组成型启动子；
编码与人FAS互补的第一核酸的核苷酸序列；
编码与人PTPN2或TOX互补的第二第一核酸的核苷酸序列；
所述第一组成型启动子；和
编码所述启动受体的核苷酸序列。
实施方案101如实施方案1-100中任一项所述的重组核酸，其中编码所述启动受体的核苷酸序列包含SEQ ID NO:36所示的序列。
实施方案102如实施方案1-101中任一项所述的重组核酸，其中编码所述嵌合抗原受体的核苷酸序列包含SEQ ID NO:37或38所示的序列。
实施方案103如实施方案1-102中任一项所述的重组核酸，其中所述重组核酸还包含与宿主细胞染色体中的插入位点互补的5'同源定向修复臂和/或3'同源定向修复臂。
实施方案104如实施方案1-103中任一项所述的重组核酸，其中所述重组核酸还包含编码自切除2A肽(P2A)的核苷酸序列。
实施方案105如实施方案1-104中任一项所述的重组核酸，其中所述P2A处于编码嵌合抗原受体的核苷酸序列的3’端。
实施方案106如实施方案1-104中任一项所述的重组核酸，其中所述P2A处于编码启动受体的核苷酸序列的3’端。
实施方案107如实施方案1-106中任一项所述的重组核酸，其中所述重组核酸还包含土拨鼠肝炎病毒翻译后调控元件(WPRE)。
实施方案108如实施方案107所述的重组核酸，其中所述WPRE处于编码嵌合抗原受体的核苷酸序列的3’端和编码启动受体的核苷酸序列的5’端，或者其中所述WPRE处于编码启动受体的核苷酸序列的3’端和编码嵌合抗原受体的核苷酸序列的5’端。
实施方案109如实施方案1-107中任一项所述的重组核酸，其中所述重组核酸还包含SV40多聚A元件。
实施方案110如实施方案1至109中任一项所述的重组核酸，其中所述核酸并入表达盒或表达载体中。
实施方案111如实施方案110所述的重组核酸，其中所述表达载体是非病毒载体。
实施方案112一种表达载体，所述表达载体包含实施方案1-111中任一项所述的重组核酸。
实施方案113如实施方案112所述的载体，其中所述重组核酸的5’端和3’端包含与原代细胞的基因组中的插入位点侧翼的基因组序列同源的核苷酸序列。
实施方案114如实施方案113所述的载体，其中所述插入位点位于T细胞受体α恒定(TRAC)基因座或基因组安全港(GSH)基因座。
实施方案115如实施方案114所述的载体，其中所述GHS基因座是GS94基因座。
实施方案116一种结合至胎盘/生殖细胞碱性磷酸酶(ALPG/P)的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含可变重(VH)链序列和可变轻(VL)链序列，所述可变重(VH)链序列包含三个重链CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述可变轻(VL)链序列包含三个轻链CDR序列CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中：
CDR-H1包含SEQ ID NO:1所示的序列，
CDR-H2包含SEQ ID NO:2所示的序列，
CDR-H3包含SEQ ID NO:3所示的序列，
CDR-L1包含SEQ ID NO:4所示的序列，
CDR-L2包含SEQ ID NO:5所示的序列；并且
CDR-L3包含SEQ ID NO:6所示的序列。
实施方案117如实施方案116所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述VH链序列包含SEQ ID NO:7所示的序列。
实施方案118如实施方案116或117所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述VL包含SEQ ID NO:8所示的序列。
实施方案119如实施方案116-118中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述细胞外结构域包含SEQ ID NO:9所示的序列。
实施方案120一种启动受体，所述启动受体包含特异性地结合胎盘/生殖细胞碱性磷酸酶(ALPG/P)的细胞外抗原结合结构域；包含一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点的跨膜结构域；和包含人或人源化转录效应物的细胞内结构域，其中所述细胞外抗原结合结构域包含可变重(VH)链序列和可变轻(VL)链序列，所述可变重(VH)链序列包含三个重链CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述可变轻(VL)链序列包含三个轻链CDR序列CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中：
CDR-H1包含SEQ ID NO:1所示的序列，
CDR-H2包含SEQ ID NO:2所示的序列，
CDR-H3包含SEQ ID NO:3所示的序列，
CDR-L1包含SEQ ID NO:4所示的序列，
CDR-L2包含SEQ ID NO:5所示的序列；并且
CDR-L3包含SEQ ID NO:6所示的序列。
实施方案121如实施方案120所述的启动受体，其中所述VH链序列包含SEQ ID NO:7所示的序列。
实施方案122如实施方案120或121所述的启动受体，其中所述VL包含SEQ ID NO:8所示的序列。
实施方案123如实施方案120-122中任一项所述的启动受体，其中所述细胞外结构域包含SEQ ID NO:9所示的序列。
实施方案124一种嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体(CAR)包含特异性地结合至间皮素(MSLN)的细胞外抗原结合结构域，其中所述细胞外抗原结合结构域包含可变重(VH)链序列，所述可变重(VH)链序列包含三个重链CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中：
CDR-H1包含SEQ ID NO:14所示的序列，
CDR-H2包含SEQ ID NO:15所示的序列，并且
CDR-H3包含SEQ ID NO:16所示的序列。
实施方案125如实施方案124所述的嵌合抗原受体，其中所述VH链序列包含SEQ IDNO:17所示的序列。
实施方案126一种嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体(CAR)包含特异性地结合至间皮素(MSLN)的细胞外抗原结合结构域，其中所述细胞外抗原结合结构域包含单结构域抗体，所述单结构域抗体包含可变重(VHH)链序列，所述可变重(VHH)链序列包含三个重链CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中：
CDR-H1包含SEQ ID NO:10所示的序列，
CDR-H2包含SEQ ID NO:11所示的序列，并且
CDR-H3包含SEQ ID NO:12所示的序列。
实施方案127如实施方案126所述的嵌合抗原受体，其中所述VHH链序列包含SEQID NO:13所示的序列。
实施方案128一种包含第一嵌合多肽和第二嵌合多肽的系统，其中
所述第一嵌合多肽包含启动受体，所述启动受体包含特异性地结合胎盘/生殖细胞碱性磷酸酶(ALPG/P)的第一细胞外抗原结合结构域，其中所述第一细胞外抗原结合结构域包含可变重(VH)链序列和可变轻(VL)链序列，所述可变重(VH)链序列包含三个重链CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述可变轻(VL)链序列包含三个轻链CDR序列CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中：
CDR-H1包含SEQ ID NO:1所示的序列，
CDR-H2包含SEQ ID NO:2所示的序列，
CDR-H3包含SEQ ID NO:3所示的序列，
CDR-L1包含SEQ ID NO:4所示的序列，
CDR-L2包含SEQ ID NO:5所示的序列，并且
CDR-L3包含SEQ ID NO:6所示的序列；并且
所述第二嵌合多肽包含嵌合抗原受体(CAR)。
实施方案129如实施方案128所述的系统，其中所述VH链序列包含SEQ ID NO:7所示的序列。
实施方案130如实施方案128或129所述的系统，其中所述VL链序列包含SEQ IDNO:8所示的序列。
实施方案131如实施方案128所述的系统，其中所述第一细胞外抗原结合结构域包含SEQ ID NO:9所示的序列。
实施方案132如实施方案128所述的系统，其中所述CAR包含特异性地结合至间皮素(MSLN)的第二细胞外抗原结合结构域。
实施方案133如实施方案132所述的系统，其中所述第二细胞外抗原结合结构域包含可变重(VH)链序列，所述可变重(VH)链序列包含三个重链CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中：
CDR-H1包含SEQ ID NO:14所示的序列，
CDR-H2包含SEQ ID NO:15所示的序列，并且
CDR-H3包含SEQ ID NO:16所示的序列。
实施方案134如实施方案133所述的系统，其中所述VH包含如SEQ ID NO:17所示的序列。
实施方案135如实施方案132所述的系统，其中所述第二细胞外抗原结合结构域包含单结构域抗体，所述单结构域抗体包含可变重(VHH)链序列，所述可变重(VHH)链序列包含三个重链CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中：
CDR-H1包含SEQ ID NO:10所示的序列，
CDR-H2包含SEQ ID NO:11所示的序列，并且
CDR-H3包含SEQ ID NO:12所示的序列。
实施方案136如实施方案135所述的系统，其中所述VHH链序列包含SEQ ID NO:13所示的序列。
实施方案137一种包含第一嵌合多肽和第二嵌合多肽的系统，其中
所述第一嵌合多肽包含启动受体，并且
所述第二嵌合多肽包含嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体(CAR)包含特异性地结合至间皮素(MSLN)的细胞外抗原结合结构域，其中所述细胞外抗原结合结构域包含单结构域抗体，所述单结构域抗体包含可变重(VHH)链序列，所述可变重(VHH)链序列包含三个重链CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中：
CDR-H1包含SEQ ID NO:10所示的序列，
CDR-H2包含SEQ ID NO:11所示的序列，并且
CDR-H3包含SEQ ID NO:12所示的序列。
实施方案138如实施方案137所述的系统，其中所述VHH链序列包含SEQ ID NO:13所示的序列。
实施方案139一种包含第一嵌合多肽和第二嵌合多肽的系统，其中
所述第一嵌合多肽包含启动受体，并且
所述第二嵌合多肽包含嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体(CAR)包含特异性地结合至间皮素(MSLN)的细胞外抗原结合结构域，其中所述第二细胞外抗原结合结构域包含可变重(VH)链序列，所述可变重(VH)链序列包含三个重链CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中：
CDR-H1包含SEQ ID NO:14所示的序列，
CDR-H2包含SEQ ID NO:15所示的序列，并且
CDR-H3包含SEQ ID NO:16所示的序列。
实施方案140如实施方案138所述的系统，其中所述VH包含如SEQ IDNO:17所示的序列。
实施方案141一种包含第一嵌合多肽和第二嵌合多肽的系统，其中
所述第一嵌合多肽包含启动受体，所述启动受体包含特异性地结合至生殖细胞碱性磷酸酶(ALPG/P)的第一细胞外抗原结合结构域；并且
所述第二嵌合多肽包含CAR，所述CAR包含特异性地结合至间皮素(MSLN)的第二细胞外抗原结合结构域。
实施方案142如实施方案128-141中任一项所述的系统，其中所述启动受体从N末端至C末端包含：
第一细胞外抗原结合结构域；
包含一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点的第一跨膜结构域；和
包含人或人源化转录效应物的细胞内结构域，其中ALPG/P与第一细胞外抗原结合结构域的结合导致在所述一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点处的裂解。
实施方案143如实施方案142所述的系统，其中所述启动受体还包含定位于所述第一细胞外抗原结合结构域与所述第一跨膜结构域之间的第一铰链结构域。
实施方案144如实施方案142所述的系统，其中所述第一铰链结构域包含CD8α或截短的CD8α铰链结构域。
实施方案145如实施方案144所述的系统，其中所述第一铰链包含如SEQ ID NO:18所示的序列。
实施方案146如实施方案142-145中任一项所述的系统，其中所述第一跨膜结构域包含Notch1跨膜结构域。
实施方案147如实施方案146所述的系统，其中所述第一跨膜结构域包含如SEQ IDNO:19所示的序列。
实施方案148如实施方案142-147中任一项所述的系统，其中所述细胞内结构域包含HNF1a/p65结构域或Gal4/VP64结构域。
实施方案149如实施方案148所述的系统，其中所述细胞内结构域包含如SEQ IDNO:23所示的序列。
实施方案150如实施方案128-149中任一项所述的系统，其中所述启动受体还包含在所述第一跨膜结构域与所述细胞内结构域之间的终止转移序列。
实施方案151如实施方案150所述的系统，其中所述终止转移序列包含如SEQ IDNO:20所示的序列。
实施方案152如实施方案128-151中任一项所述的系统，其中所述启动受体包含如SEQ ID NO:24所示的序列。
实施方案153如实施方案128-152中任一项所述的系统，其中所述CAR从N末端至C末端包含：
第二细胞外抗原结合结构域；
第二跨膜结构域；
细胞内共刺激结构域；和
细胞内激活结构域。
实施方案154如实施方案153所述的系统，其中所述第二细胞外抗原结合结构域特异性地结合至间皮素(MSLN)，其中所述第二细胞外抗原结合结构域包含单结构域抗体，所述单结构域抗体包含可变重(VHH)链序列，所述可变重(VHH)链序列包含三个重链CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中：
CDR-H1包含SEQ ID NO:10所示的序列，
CDR-H2包含SEQ ID NO:11所示的序列，并且
CDR-H3包含SEQ ID NO:12所示的序列。
实施方案155如实施方案154所述的系统，其中所述VHH链序列包含SEQ ID NO:13所示的序列。
实施方案156如实施方案153所述的系统，其中所述第二细胞外抗原结合结构域特异性地结合至间皮素(MSLN)，其中所述细胞外抗原结合结构域包含可变重(VH)链序列，所述可变重(VH)链序列包含三个重链CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中：
CDR-H1包含SEQ ID NO:14所示的序列，
CDR-H2包含SEQ ID NO:15所示的序列，并且
CDR-H3包含SEQ ID NO:16所示的序列。
实施方案157如实施方案156所述的嵌合抗原受体，其中所述VH链序列包含SEQ IDNO:17所示的序列。
实施方案158如实施方案128-157中任一项所述的系统，其中所述CAR包含第二铰链结构域。
实施方案159如实施方案158所述的系统，其中所述第二铰链结构域包含CD8α或截短的CD8α铰链结构域。
实施方案160如实施方案153-159中任一项所述的系统，其中所述第二跨膜结构域包含CD8α跨膜结构域。
实施方案161如实施方案153-160中任一项所述的系统，其中所述细胞内共刺激结构域包含4-1BB结构域。
实施方案162如实施方案153-161中任一项所述的系统，其中所述细胞内激活结构域包含CD3ζ结构域。
实施方案163如实施方案128-162中任一项所述的系统，其中所述CAR包含如SEQID NO:30或31所示的序列。
实施方案164如实施方案128-163中任一项所述的系统，其中如果相同靶细胞表达ALPG/P和MSLN，则所述启动受体和所述CAR能够结合至所述靶细胞。
实施方案165如实施方案164所述的系统，其中所述靶细胞是人细胞。
实施方案166如实施方案164或165所述的系统，其中所述靶细胞是癌细胞。
实施方案167如实施方案166中任一项所述的系统，其中所述癌细胞是固体癌细胞或液体癌细胞。
实施方案168如实施方案166或167所述的系统，其中所述癌细胞是卵巢癌、输卵管癌、原发性腹膜癌、子宫癌、间皮瘤、宫颈癌或胰腺癌。
实施方案169一种免疫细胞，所述免疫细胞包含：
至少一种实施方案1至111中任一项所述的重组核酸；和/或
实施方案116-168中任一项所述的抗体或抗原结合片段、启动受体、CAR或系统；和/或
实施方案112-114中任一项所述的载体。
实施方案170如实施方案169所述的细胞，其中所述免疫细胞是原代人免疫细胞。
实施方案171如实施方案170所述的细胞，其中所述原代人免疫细胞是自体免疫细胞。
实施方案172如实施方案169-171中任一项所述的细胞，其中所述原代免疫细胞是自然杀伤(NK)细胞、T细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、原代T细胞或T细胞祖细胞。
实施方案173如实施方案169-172中任一项所述的细胞，其中所述原代免疫细胞是原代T细胞。
实施方案174如实施方案169-173中任一项所述的细胞，其中所述原代免疫细胞是原代人T细胞。
实施方案175如实施方案169-174中任一项所述的细胞，其中所述原代免疫细胞是无病毒的。
实施方案176如实施方案169-174中任一项所述的细胞，其中所述免疫细胞是自体免疫细胞。
实施方案177如实施方案169-174中任一项所述的细胞，其中所述免疫细胞是同种异体免疫细胞。
实施方案178一种原代免疫细胞，所述原代免疫细胞包含至少一种重组核酸，所述重组核酸包含
启动受体，所述启动受体包含特异性地结合至ALPG/P的第一细胞外抗原结合结构域；
嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包含特异性地结合至MSLN的第二细胞外抗原结合结构域；
长度为至少15个核苷酸的第一核酸序列，其中所述第一核酸序列与包含SEQ IDNO:39所示序列的编码人FAS的mRNA的核苷酸1126至1364互补；和长度为至少15个核苷酸的第二核酸序列，其中所述第二核酸序列：
与包含SEQ ID NO:40所示序列的编码人PTPN2的mRNA的核苷酸518至559互补，或者
与包含SEQ ID NO:41所示序列的编码人TOX的mRNA的核苷酸1294至2141互补；
其中所述重组核酸插入所述原代免疫细胞的基因组的靶区中，并且其中所述原代免疫细胞不包含用于将所述重组核酸引入所述原代免疫细胞中的病毒载体。
实施方案179一种原代免疫细胞，所述原代免疫细胞包含至少一种重组核酸，所述重组核酸包含：包含SEQ ID NO:49所示序列的第一核酸；和包含SEQ ID NO:82所示序列的第二核酸，所述重组核酸插入所述原代免疫细胞的基因组的靶区中，并且其中所述原代免疫细胞不包含用于将所述重组核酸引入所述原代免疫细胞中的病毒载体。
实施方案180一种原代免疫细胞，所述原代免疫细胞包含至少一种重组核酸，所述重组核酸包含：包含SEQ ID NO:49所示序列的第一核酸；和包含SEQ ID NO:SEQ ID NO:99或104所示序列的第二核酸，所述重组核酸插入所述原代免疫细胞的基因组的靶区中，并且其中所述原代免疫细胞不包含用于将所述重组核酸引入所述原代免疫细胞中的病毒载体。
实施方案181一种活的无病毒的原代细胞，所述活的无病毒的原代细胞包含核糖核蛋白(RNP)-重组核酸复合物，其中所述RNP包含核酸酶结构域和指导RNA，并且其中所述重组核酸编码：
启动受体，所述启动受体包含特异性地结合至ALPG/P的第一细胞外抗原结合结构域；
嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包含特异性地结合至MSLN的第二细胞外抗原结合结构域；
长度为至少15个核苷酸的第一核酸序列，其中所述第一核酸序列与包含SEQ IDNO:39所示序列的编码人FAS的mRNA的核苷酸1126至1364互补；和长度为至少15个核苷酸的第二核酸序列，其中所述第二核酸序列
与包含SEQ ID NO:40所示序列的编码人PTPN2的mRNA的核苷酸518至559互补，或者
与包含SEQ ID NO:41所示序列的编码人TOX的mRNA的核苷酸1294至2141互补；并且
其中所述重组核酸的5’端和3’端包含与所述原代细胞的基因组中的插入位点侧翼的基因组序列同源的核苷酸序列。
实施方案182一种活的无病毒的原代细胞，所述活的无病毒的原代细胞包含核糖核蛋白复合物(RNP)-重组核酸复合物，其中所述RNP包含核酸酶结构域和指导RNA，其中重组核酸包含：包含SEQ ID NO:49所示序列的第一核酸；和包含SEQ ID NO:82所示序列的第二核酸，并且其中所述重组核酸的5’端和3’端包含与所述原代细胞的基因组中的插入位点侧翼的基因组序列同源的核苷酸序列。
实施方案183一种活的无病毒的原代细胞，所述活的无病毒的原代细胞包含核糖核蛋白复合物(RNP)-重组核酸复合物，其中所述RNP包含核酸酶结构域和指导RNA，其中重组核酸包含：包含SEQ ID NO:49所示序列的第一核酸；和包含SEQ ID NO:SEQ ID NO:99或104所示序列的第二核酸，并且其中所述重组核酸的5’端和3’端包含与所述原代细胞的基因组中的插入位点侧翼的基因组序列同源的核苷酸序列。
实施方案184如实施方案169-183中任一项所述的细胞，其中所述细胞包含选自由SEQ ID NO:168、167或166所示序列组成的组的序列。
实施方案185如实施方案169-184中任一项所述的细胞，其中与不包含所述第一核酸的对照细胞相比，所述第一核酸将免疫细胞中FAS的表达降低至少50％、55％、60％、65％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。
实施方案186如实施方案184所述的细胞，其中与不包含所述第一核酸的对照细胞相比，免疫细胞中FAS的表达降低至少50％、55％、60％、65％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。
实施方案187如实施方案169-186中任一项所述的细胞，其中与不包含所述第二核酸的对照细胞相比，所述第二核酸将免疫细胞中PTPN2的表达降低至少50％、55％、60％、65％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。
实施方案188如实施方案187所述的细胞，其中与不包含所述第二核酸的对照细胞相比，免疫细胞中PTPN2的表达降低至少50％、55％、60％、65％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。
实施方案189如实施方案169-186中任一项所述的细胞，其中与不包含所述第二核酸的对照细胞相比，所述第二核酸将免疫细胞中TOX的表达降低至少50％、55％、60％、65％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。
实施方案190如实施方案189所述的细胞，其中与不包含所述第二核酸的对照细胞相比，免疫细胞中TOX的表达降低至少50％、55％、60％、65％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。
实施方案191如实施方案184-190中任一项所述的细胞，其中通过核酸测定或蛋白质测定来确定FAS、PTPN2和/或TOX的表达。
实施方案192如实施方案191所述的细胞，其中所述核酸测定包括聚合酶链式反应(PCR)、定量PCR(qPCR)、RT-qPCR、微阵列、基因阵列或RNAseq中的至少一者。
实施方案193如实施方案191所述的细胞，其中所述蛋白质测定包括免疫印迹、荧光激活细胞分选、流式细胞术、磁激活细胞分选或基于亲和力的细胞分离中的至少一者。
实施方案194一种细胞群体，所述细胞群体包含多个实施方案169-193中任一项所述的免疫细胞。
实施方案195一种药物组合物，所述药物组合物包含实施方案169至193中任一项所述的免疫细胞或实施方案194所述的细胞群体，以及药学上可接受的赋形剂。
实施方案196一种药物组合物，所述药物组合物包含实施方案1-111中任一项所述的重组核酸或实施方案112-114中任一项所述的载体，以及药学上可接受的赋形剂。
实施方案197一种编辑免疫细胞的方法，所述方法包括：
提供核糖核蛋白(RNP)-重组核酸复合物，其中所述RNP包含核酸酶结构域和指导RNA，其中所述重组核酸包含实施方案1至111中任一项所述的重组核酸，并且其中所述重组核酸的5’端和3’端包含与所述免疫细胞的基因组中的插入位点侧翼的基因组序列同源的核苷酸序列；
以非病毒方式将所述RNP-重组核酸复合物引入所述免疫细胞中，其中所述指导RNA与所述原代免疫细胞的基因组的靶区特异性地杂交，并且其中所述核酸酶结构域使所述靶区裂解以产生在所述免疫细胞的基因组中的所述插入位点；以及
通过将实施方案1至111中任一项所述的重组核酸插入所述免疫细胞的基因组中的所述插入位点中来编辑所述免疫细胞。
实施方案198如实施方案197所述的方法，其中以非病毒方式引入包括电穿孔。
实施方案199如实施方案197或198所述的方法，其中所述核酸酶结构域包含CRISPR相关核酸内切酶(Cas)，任选地是Cas9核酸酶。
实施方案200如实施方案197至199中任一项所述的方法，其中所述细胞的基因组的所述靶区是T细胞受体α恒定(TRAC)基因座或基因组安全港(GSH)基因座。
实施方案201如实施方案200所述的方法，其中所述GSH基因座是GS94基因座。
实施方案202如实施方案197至201中任一项所述的方法，其中所述重组核酸是双链重组核酸或单链重组核酸。
实施方案203如实施方案197至202中任一项所述的方法，其中所述重组核酸是线状重组核酸或环状重组核酸，任选地其中所述环状重组核酸是质粒。
实施方案204如实施方案197至203中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞是原代人免疫细胞。
实施方案205如实施方案197至204中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞是同种异体免疫细胞。
实施方案206如实施方案197至204中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞是自体免疫细胞。
实施方案207如实施方案197至206中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞是自然杀伤(NK)细胞、T细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、原代T细胞或T细胞祖细胞。
实施方案208如实施方案197至207中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞是原代T细胞。
实施方案209如实施方案197至208中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞是原代人T细胞。
实施方案210如实施方案197至209中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞是无病毒的。
实施方案211如实施方案197至210中任一项所述的方法，所述方法还包括从患者获得所述免疫细胞以及在体外引入所述重组核酸。
实施方案212一种治疗受试者的疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用实施方案169-194中任一项所述的免疫细胞或实施方案195或196所述的药物组合物。
实施方案213如实施方案212所述的方法，其中所述疾病是癌症。
实施方案214如实施方案213所述的方法，其中所述癌症是实体癌或液体癌。
实施方案215如实施方案213或214所述的方法，其中所述癌症是卵巢癌、输卵管癌、原发性腹膜癌、子宫癌、间皮瘤、宫颈癌或胰腺癌。
实施方案216如实施方案213-215中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞的施用增强所述受试者中的免疫应答。
实施方案217如实施方案216所述的方法，其中所述增强的免疫应答是适应性免疫应答。
实施方案218如实施方案216所述的方法，其中所述增强的免疫应答是先天免疫应答。
实施方案219如实施方案213-218中任一项所述的方法，其中所述增强的免疫应答是增加的至少一种细胞因子或趋化因子的表达。
实施方案220如实施方案219所述的方法，其中所述至少一种细胞因子或趋化因子是IL-2或IFNγ。
实施方案221如实施方案212-215中任一项所述的方法，所述方法还包括与所述免疫细胞同时或在所述免疫细胞之后向所述受试者施用免疫疗法。
实施方案222一种用于抑制受试者中的靶细胞的方法，所述方法包括向所述受试者施用实施方案169-194中任一项所述的免疫细胞，其中所述免疫细胞抑制所述靶细胞。
实施方案223如实施方案222所述的方法，其中所述靶细胞表达ALPG/P和MSLN。
实施方案224如实施方案222或223所述的方法，其中所述靶细胞是癌细胞。
实施方案225一种诱导免疫细胞中嵌合抗原受体与启动受体的表达的方法，所述方法包括：
获得免疫细胞，所述免疫细胞包含
实施方案1-111中任一项所述的重组核酸；和/或
实施方案116-168中任一项所述的抗体或抗原结合片段、启动受体、CAR或系统；和/或
实施方案112-114中任一项所述的载体；以及
使所述免疫细胞与表达ALPG/P和MSLN的靶细胞接触，其中所述启动受体与所述靶细胞上的ALPG/P的结合诱导所述启动受体的激活和所述嵌合抗原受体的表达。
实施方案226一种调节免疫细胞的活性的方法，所述方法包括：
获得免疫细胞，所述免疫细胞包含
实施方案1-111中任一项所述的重组核酸；和/或
实施方案116-168中任一项所述的抗体或抗原结合片段、启动受体、CAR或系统；和/或
实施方案112-114中任一项所述的载体；以及
使所述免疫细胞与表达ALPG/P和MSLN的靶细胞接触，其中所述启动受体与所述靶细胞上的ALPG/P的结合诱导所述启动受体的激活和所述嵌合抗原受体的表达，并且其中所述嵌合抗原受体与所述靶细胞上的MSLN的结合调节所述免疫细胞的活性。
实施方案227如实施方案226所述的方法，其中所述免疫细胞活性的调节包括增强免疫应答。
实施方案228如实施方案227所述的方法，其中所述增强的免疫应答是适应性免疫应答。
实施方案229如实施方案227所述的方法，其中所述增强的免疫应答是先天免疫应答。
实施方案230如实施方案226-229中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞活性是增加的至少一种细胞因子或趋化因子的表达。
实施方案231如实施方案230所述的方法，其中所述至少一种细胞因子或趋化因子是IL-2或IFNγ。
实施方案232如实施方案197-231中任一项所述的方法，其中与不包含所述第一核酸的对照细胞相比，免疫细胞中FAS的表达降低至少50％、55％、60％、65％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。
实施方案233如实施方案197-232中任一项所述的方法，其中与不包含所述第二核酸的对照细胞相比，免疫细胞中PTPN2的表达降低至少50％、55％、60％、65％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。
实施方案234如实施方案197-232中任一项所述的方法，其中与不包含所述第二核酸的对照细胞相比，免疫细胞中TOX的表达降低至少50％、55％、60％、65％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。
实施方案235如实施方案232-234中任一项所述的方法，其中通过核酸测定或蛋白质测定来确定免疫细胞中FAS、PTPN2和/或TOX的表达。
实施方案236如实施方案235所述的方法，其中所述核酸测定包括聚合酶链式反应(PCR)、定量PCR(qPCR)、RT-qPCR、微阵列、基因阵列或RNAseq中的至少一者。
实施方案237如实施方案235所述的方法，其中所述蛋白质测定包括免疫印迹、荧光激活细胞分选、流式细胞术、磁激活细胞分选或基于亲和力的细胞分离中的至少一者。
在一方面，本文提供了启动受体，所述启动受体包含特异性地结合胎盘/生殖细胞碱性磷酸酶(ALPG/P)的细胞外抗原结合结构域；包含一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点的跨膜结构域；和包含人或人源化转录效应物的细胞内结构域，其中所述细胞外抗原结合结构域包含可变重(VH)链序列和可变轻(VL)链序列，所述可变重(VH)链序列包含三个重链CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述可变轻(VL)链序列包含三个轻链CDR序列CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中：
CDR-H1包含SEQ ID NO:1所示的序列，
CDR-H2包含SEQ ID NO:2所示的序列，
CDR-H3包含SEQ ID NO:3所示的序列，
CDR-L1包含SEQ ID NO:4所示的序列，
CDR-L2包含SEQ ID NO:5所示的序列；并且
CDR-L3包含SEQ ID NO:6所示的序列。
在一些实施方案中，VH链序列包含SEQ ID NO:7所示的序列。
在一些实施方案中，VL包含SEQ ID NO:8所示的序列。
在一些实施方案中，细胞外结构域包含SEQ ID NO:9所示的序列。
在另一方面，本文提供了嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体(CAR)包含特异性地结合至间皮素(MSLN)的细胞外抗原结合结构域，其中所述细胞外抗原结合结构域包含可变重(VH)链序列，所述可变重(VH)链序列包含三个重链CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中：
CDR-H1包含SEQ ID NO:14所示的序列，
CDR-H2包含SEQ ID NO:15所示的序列，并且
CDR-H3包含SEQ ID NO:16所示的序列。
在一些实施方案中，VH链序列包含SEQ ID NO:17所示的序列。
在另一方面，本文提供了嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体(CAR)包含特异性地结合至间皮素(MSLN)的细胞外抗原结合结构域，其中所述细胞外抗原结合结构域包含单结构域抗体，所述单结构域抗体包含可变重(VHH)链序列，所述可变重(VHH)链序列包含三个重链CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中：
CDR-H1包含SEQ ID NO:10所示的序列，
CDR-H2包含SEQ ID NO:11所示的序列，并且
CDR-H3包含SEQ ID NO:12所示的序列。
在一些实施方案中，VHH链序列包含SEQ ID NO:13所示的序列。
在另一方面，本文提供了包含第一嵌合多肽和第二嵌合多肽的系统，其中所述第一嵌合多肽包含启动受体，所述启动受体包含特异性地结合胎盘/生殖细胞碱性磷酸酶(ALPG/P)的第一细胞外抗原结合结构域，其中所述第一细胞外抗原结合结构域包含可变重(VH)链序列和可变轻(VL)链序列，所述可变重(VH)链序列包含三个重链CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述可变轻(VL)链序列包含三个轻链CDR序列CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中：
CDR-H1包含SEQ ID NO:1所示的序列，
CDR-H2包含SEQ ID NO:2所示的序列，
CDR-H3包含SEQ ID NO:3所示的序列，
CDR-L1包含SEQ ID NO:4所示的序列，
CDR-L2包含SEQ ID NO:5所示的序列，并且
CDR-L3包含SEQ ID NO:6所示的序列；并且
所述第二嵌合多肽包含嵌合抗原受体(CAR)。
在一些实施方案中，VH链序列包含SEQ ID NO:7所示的序列。
在一些实施方案中，VL链序列包含SEQ ID NO:8所示的序列。
在一些实施方案中，第一细胞外抗原结合结构域包含SEQ ID NO:9所示的序列。
在一些实施方案中，CAR包含特异性地结合至间皮素(MSLN)的第二细胞外抗原结合结构域。
在一些实施方案中，第二细胞外抗原结合结构域包含可变重(VH)链序列，所述可变重(VH)链序列包含三个重链CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中：
CDR-H1包含SEQ ID NO:14所示的序列，
CDR-H2包含SEQ ID NO:15所示的序列，并且
CDR-H3包含SEQ ID NO:16所示的序列。
在一些实施方案中，VH包含如SEQ ID NO:17所示的序列。
在一些实施方案中，第二细胞外抗原结合结构域包含单结构域抗体，所述单结构域抗体包含可变重(VHH)链序列，所述可变重(VHH)链序列包含三个重链CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中：
CDR-H1包含SEQ ID NO:10所示的序列，
CDR-H2包含SEQ ID NO:11所示的序列，并且
CDR-H3包含SEQ ID NO:12所示的序列。
在一些实施方案中，VHH链序列包含SEQ ID NO:13所示的序列。
在另一方面，本文提供了一种包含第一嵌合多肽和第二嵌合多肽的系统，其中：
所述第一嵌合多肽包含启动受体，并且
所述第二嵌合多肽包含嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体(CAR)包含特异性地结合至间皮素(MSLN)的细胞外抗原结合结构域，其中所述细胞外抗原结合结构域包含单结构域抗体，所述单结构域抗体包含可变重(VHH)链序列，所述可变重(VHH)链序列包含三个重链CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中：
CDR-H1包含SEQ ID NO:10所示的序列，
CDR-H2包含SEQ ID NO:11所示的序列，并且
CDR-H3包含SEQ ID NO:12所示的序列。
在一些实施方案中，VHH链序列包含SEQ ID NO:13所示的序列。
在另一方面，本文提供了一种包含第一嵌合多肽和第二嵌合多肽的系统，其中
所述第一嵌合多肽包含启动受体，并且
所述第二嵌合多肽包含嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体(CAR)包含特异性地结合至间皮素(MSLN)的细胞外抗原结合结构域，其中所述第二细胞外抗原结合结构域包含可变重(VH)链序列，所述可变重(VH)链序列包含三个重链CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中：
CDR-H1包含SEQ ID NO:14所示的序列，
CDR-H2包含SEQ ID NO:15所示的序列，并且
CDR-H3包含SEQ ID NO:16所示的序列。
在一些实施方案中，VH包含如SEQ ID NO:17所示的序列。
在另一方面，本文提供了一种包含第一嵌合多肽和第二嵌合多肽的系统，其中
所述第一嵌合多肽包含启动受体，所述启动受体包含特异性地结合至生殖细胞碱性磷酸酶(ALPG/P)的第一细胞外抗原结合结构域；并且
所述第二嵌合多肽包含CAR，所述CAR包含特异性地结合至间皮素(MSLN)的第二细胞外抗原结合结构域。
在一些实施方案中，启动受体从N末端至C末端包含：
第一细胞外抗原结合结构域；
包含一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点的第一跨膜结构域；和
包含人或人源化转录效应物的细胞内结构域，其中ALPG/P与第一细胞外抗原结合结构域的结合导致在所述一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点处的裂解。
在一些实施方案中，启动受体还包含定位于第一细胞外抗原结合结构域与第一跨膜结构域之间的第一铰链结构域。
在一些实施方案中，第一铰链结构域包含CD8α或截短的CD8α铰链结构域。
在一些实施方案中，第一铰链包含如SEQ ID NO:18所示的序列。
在一些实施方案中，第一跨膜结构域包含Notch1跨膜结构域。
在一些实施方案中，第一跨膜结构域包含如SEQ ID NO:19所示的序列。
在一些实施方案中，细胞内结构域包含HNF1a/p65结构域或Gal4/VP64结构域。
在一些实施方案中，细胞内结构域包含SEQ ID NO:23所示的序列。
在一些实施方案中，启动受体还包含在第一跨膜结构域与细胞内结构域之间的终止转移序列。
在一些实施方案中，终止转移序列包含如SEQ ID NO:20所示的序列。
在一些实施方案中，启动受体包含如SEQ ID NO:24所示的序列。
在一些实施方案中，CAR从N末端至C末端包含：
第二细胞外抗原结合结构域；
第二跨膜结构域；
细胞内共刺激结构域；和
细胞内激活结构域。
在一些实施方案中，第二细胞外抗原结合结构域特异性地结合至间皮素(MSLN)，其中所述第二细胞外抗原结合结构域包含单结构域抗体，所述单结构域抗体包含可变重(VHH)链序列，所述可变重(VHH)链序列包含三个重链CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中：
CDR-H1包含SEQ ID NO:10所示的序列，
CDR-H2包含SEQ ID NO:11所示的序列，并且
CDR-H3包含SEQ ID NO:12所示的序列。
在一些实施方案中，VHH链序列包含SEQ ID NO:13所示的序列。
在一些实施方案中，第二细胞外抗原结合结构域特异性地结合至间皮素(MSLN)，其中所述细胞外抗原结合结构域包含可变重(VH)链序列，所述可变重(VH)链序列包含三个重链CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中：
CDR-H1包含SEQ ID NO:14所示的序列，
CDR-H2包含SEQ ID NO:15所示的序列，并且
CDR-H3包含SEQ ID NO:16所示的序列。
在一些实施方案中，VH链序列包含SEQ ID NO:17所示的序列。
在一些实施方案中，CAR包含第二铰链结构域。
在一些实施方案中，第二铰链结构域包含CD8α或截短的CD8α铰链结构域。
在一些实施方案中，第二跨膜结构域包含CD8α跨膜结构域。
在一些实施方案中，细胞内共刺激结构域包含4-1BB结构域。
在一些实施方案中，细胞内激活结构域包含CD3ζ结构域。
在一些实施方案中，CAR包含如SEQ ID NO:30或31所示的序列。
在一些实施方案中，如果相同靶细胞表达ALPG/P和MSLN，则所述启动受体和所述CAR能够结合至所述靶细胞。
在一些实施方案中，靶细胞是人细胞。
在一些实施方案中，靶细胞是癌细胞。
在一些实施方案中，癌细胞是固体癌细胞或液体癌细胞。
在一些实施方案中，癌细胞是卵巢癌、输卵管癌、原发性腹膜癌、子宫癌、间皮瘤、宫颈癌或胰腺癌。
在另一方面，本文提供了结合至间皮素(MSLN)的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含单结构域抗体，所述单结构域抗体包含可变重(VHH)链序列，所述可变重(VHH)链序列包含三个重链CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中：CDR-H1包含SEQ ID NO:10所示的序列，CDR-H2包含SEQ ID NO:11所示的序列，并且CDR-H3包含SEQ ID NO:12所示的序列。
在一些实施方案中，VHH链序列包含SEQ ID NO:13所示的序列。
在一方面，本文提供了重组核酸，所述重组核酸包含长度为至少15个核苷酸的核酸序列，所述核酸序列与包含SEQ ID NO:39所示序列的编码人FAS的mRNA的核苷酸1126至1364互补。
在一方面，本文提供了重组核酸，所述重组核酸包含长度为至少15个核苷酸的核酸序列，所述核酸序列与包含SEQ ID NO:40所示序列的编码人非受体型蛋白酪氨酸磷酸酶2(PTPN2)的mRNA的核苷酸518至559互补。
在一方面，本文提供了重组核酸，所述重组核酸包含长度为至少15个核苷酸的核酸序列，所述核酸序列与包含SEQ ID NO:41所示序列的编码人胸腺细胞选择相关高迁移率族盒(TOX)的mRNA的核苷酸1294至2141互补。
在一些实施方案中，核酸序列的长度为至少16个、17个、18个、19个、20个、21个或22个核苷酸。
在一些实施方案中，核酸是短发夹RNA(shRNA)、小干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)或反义寡核苷酸。
在一些实施方案中，核酸是shRNA。
在一些实施方案中，核酸包含选自由SEQ ID NO:42至71所示序列组成的组的序列。
在一些实施方案中，核酸包含SEQ ID NO:49所示的序列。
在一些实施方案中，与不包含所述核酸的对照细胞相比，所述核酸将免疫细胞中FAS的表达降低至少50％、55％、60％、65％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。
在一些实施方案中，核酸包含选自由SEQ ID NO:72至97所示序列组成的组的序列。
在一些实施方案中，核酸包含SEQ ID NO:82所示的序列。
在一些实施方案中，与不包含所述核酸的对照细胞相比，所述核酸将免疫细胞中PTPN2的表达降低至少50％、55％、60％、65％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。
在一些实施方案中，核酸包含选自由SEQ ID NO:98至125所示序列组成的组的序列。
在一些实施方案中，核酸包含SEQ ID NO:SEQ ID NO:99或104所示的序列。
在一些实施方案中，与不包含所述核酸的对照细胞相比，所述核酸将免疫细胞中TOX的表达降低至少50％、55％、60％、65％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。
在一些实施方案中，重组核酸还包含编码启动受体的核苷酸序列，所述启动受体包含特异性地结合至第一抗原的第一细胞外抗原结合结构域；和编码嵌合抗原受体(CAR)的核苷酸序列，所述嵌合抗原受体(CAR)包含特异性地结合至第二抗原的第二细胞外抗原结合结构域，其中所述第一抗原和所述第二抗原是不同的。
在一些实施方案中，重组核酸在5’至3’方向上包含：CAR；如本文所公开的核酸；和启动受体。
在一些实施方案中，核酸在5'至3'方向上包含：启动受体；如本文所公开的核酸；和CAR。
在一些实施方案中，重组核酸还包含与宿主细胞染色体中的插入位点互补的5'同源定向修复臂和/或3'同源定向修复臂。
在一些实施方案中，重组核酸包含5'同源定向修复臂和3'同源定向修复臂。
在一些实施方案中，将重组核酸并入表达盒或表达载体中。
在一些实施方案中，表达盒或表达载体还包含在重组核酸上游的组成型启动子。
在一方面，本文提供了一种或多种重组核酸，所述重组核酸包含长度为至少15个核苷酸的第一核酸序列，所述第一核酸序列与包含SEQ ID NO:39所示序列的编码人FAS的mRNA的核苷酸1126至1364互补；和长度为至少15个核苷酸的第二核酸序列，所述第二核酸序列与包含SEQ ID NO:40所示序列的编码人PTPN2的mRNA的核苷酸518至559互补。
在一方面，本文提供了一种或多种重组核酸，所述重组核酸包含长度为至少15个核苷酸的第一核酸，所述第一核酸与包含SEQ ID NO:39所示序列的编码人FAS的mRNA的核苷酸1126至1364互补；和长度为至少15个核苷酸的第二核酸，所述第二核酸与包含SEQ IDNO:41所示序列的编码人TOX的mRNA的核苷酸1294至2141互补。
在一些实施方案中，第一和第二核酸是shRNA、siRNA、dsRNA或反义寡核苷酸。
在一些实施方案中，第一和第二核酸各自是shRNA。
在一些实施方案中，第一核酸包含选自由SEQ ID NO:42至71所示序列组成的组的序列。
在一些实施方案中，第一核酸包含SEQ ID NO:49所示的序列。
在一些实施方案中，与不包含第一核酸的对照细胞相比，所述第一核酸将免疫细胞中FAS的表达降低至少50％、55％、60％、65％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。
在一些实施方案中，第二核酸包含选自由SEQ ID NO:72至97所示序列组成的组的序列。
在一些实施方案中，第二核酸包含SEQ ID NO:82所示的序列。
在一些实施方案中，与不包含第二核酸的对照细胞相比，所述第二核酸将免疫细胞中PTPN2的表达降低至少50％、55％、60％、65％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。
在一些实施方案中，第一核酸包含选自由SEQ ID NO:42至71所示序列组成的组的序列；并且第二核酸包含选自由SEQ ID NO:72至97所示序列组成的组的序列。
在一些实施方案中，第一核酸包含SEQ ID NO:49所示的序列，并且第二核酸包含SEQ ID NO:82所示的序列。
在一些实施方案中，第二核酸包含选自由SEQ ID NO:98至125所示序列组成的组的序列。
在一些实施方案中，第二核酸包含SEQ ID NO:SEQ ID NO:99或104所示的序列。
在一些实施方案中，与不包含第二核酸的对照细胞相比，所述第二核酸将免疫细胞中PTPN2的表达降低至少50％、55％、60％、65％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。
在一些实施方案中，第一核酸包含选自由SEQ ID NO:42至71所示序列组成的组的序列；并且第二核酸包含选自由SEQ ID NO:98至125所示序列组成的组的序列。
在一些实施方案中，第一核酸包含SEQ ID NO:49所示的序列，并且第二核酸包含SEQ ID NO:SEQ ID NO:99或104所示的序列。
在一些实施方案中，第一核酸还包含与宿主细胞染色体中的插入位点互补的5'同源定向修复臂和/或3'同源定向修复臂。
在一些实施方案中，第二核酸包含5'同源定向修复臂和/或3'同源定向修复臂。
在一些实施方案中，第一核酸和第二核酸在单个核酸上编码。
在一些实施方案中，第一核酸包含5'同源定向修复臂，并且第二核酸包含3'同源定向修复臂。
在一些实施方案中，第一核酸和第二核酸在不同的核酸上编码。
在一些实施方案中，核酸还包含编码启动受体的核苷酸序列，所述启动受体包含特异性地结合至第一抗原的第一细胞外抗原结合结构域；和编码嵌合抗原受体(CAR)的核苷酸序列，所述嵌合抗原受体(CAR)包含特异性地结合至第二抗原的第二细胞外抗原结合结构域，其中所述第一抗原和所述第二抗原是不同的。
在一些实施方案中，核酸在5'至3'方向上包含：CAR；第一核酸；第二核酸；和启动受体。
在一些实施方案中，将第一核酸并入表达盒或表达载体中。
在一些实施方案中，将第二核酸并入表达盒或表达载体中。
在一些实施方案中，将第一核酸和第二核酸并入单个表达盒或单个表达载体中。
在一些实施方案中，表达盒或表达载体还包含在第一核酸上游和/或第二核酸上游的组成型启动子。
在一些实施方案中，表达载体是非病毒载体。
在一方面，本文提供了包含如本文所公开的重组核酸的表达载体。
在一些实施方案中，表达载体是非病毒载体。
在一些实施方案中，重组核酸的5'端和3'端包含与原代细胞基因组中插入位点侧翼的基因组序列同源的一个或多个核苷酸序列。
在一些实施方案中，插入位点位于T细胞受体α恒定(TRAC)基因座或基因组安全港(GSH)基因座。
在一些实施方案中，GSH基因座是GS94基因座。
在一方面，本文提供了免疫细胞，所述免疫细胞包含长度为至少15个核苷酸的第一核酸序列，其中所述第一核酸序列与包含SEQ ID NO:39所示序列的编码人FAS的mRNA的核苷酸1126至1364互补；和长度为至少15个核苷酸的第二核酸序列，其中所述第二核酸序列与包含SEQ ID NO:40所示序列的编码人PTPN2的mRNA的核苷酸518至559互补，或者与包含SEQ ID NO:41所示序列的编码人TOX的mRNA的核苷酸1294至2141互补。
在一些实施方案中，第二核酸序列与包含SEQ ID NO:40所示序列的编码人PTPN2的mRNA的核苷酸518至559互补。
在一些实施方案中，第二核酸序列与包含SEQ ID NO:41所示序列的编码人TOX的mRNA的核苷酸1294至2141互补。
在一方面，本文提供了免疫细胞，所述免疫细胞包含长度为至少15个核苷酸的第一核酸序列，其中所述第一核酸序列与包含SEQ ID NO:39所示序列的编码人FAS的mRNA的核苷酸1126至1364互补；和长度为至少15个核苷酸的第二核酸序列，其中所述第二核酸序列与包含SEQ ID NO:40所示序列的编码人PTPN2的mRNA的核苷酸518至559互补。
在一方面，本文提供了免疫细胞，所述免疫细胞包含长度为至少15个核苷酸的第一核酸序列，其中所述第一核酸序列与包含SEQ ID NO:39所示序列的编码人FAS的mRNA的核苷酸1126至1364互补；和长度为至少15个核苷酸的第二核酸序列，其中所述第二核酸序列与包含SEQ ID NO:41所示序列的编码人TOX的mRNA的核苷酸1294至2141互补。
在一些实施方案中，第一和第二核酸是shRNA、siRNA、dsRNA或反义寡核苷酸。
在一些实施方案中，第一和第二核酸是shRNA。
在一些实施方案中，第一核酸包含选自由SEQ ID NO:42至71所示序列组成的组的序列。
在一些实施方案中，第一核酸包含SEQ ID NO:49所示的序列。
在一些实施方案中，第二核酸包含选自由SEQ ID NO:72至97所示序列组成的组的序列。
在一些实施方案中，第二核酸包含SEQ ID NO:82所示的序列。
在一些实施方案中，第一核酸包含选自由SEQ ID NO:42至71所示序列组成的组的序列；并且第二核酸序列包含选自由SEQ ID NO:72至97所示序列组成的组的序列。
在一些实施方案中，第一核酸包含SEQ ID NO:49所示的序列，并且第二核酸包含SEQ ID NO:82所示的序列。
在一些实施方案中，第二核酸包含选自由SEQ ID NO:98至125所示序列组成的组的序列。
在一些实施方案中，第二核酸包含SEQ ID NO:SEQ ID NO:99或104所示的序列。
在一些实施方案中，第一核酸包含选自由SEQ ID NO:42至71所示序列组成的组的序列；并且第二核酸包含选自由SEQ ID NO:98至125所示序列组成的组的序列。
在一些实施方案中，第一核酸包含SEQ ID NO:49所示的序列，并且第二核酸包含SEQ ID NO:SEQ ID NO:99或104所示的序列。
在一些实施方案中，与不包含第一核酸的对照细胞相比，所述第一核酸将免疫细胞中FAS的表达降低至少50％、55％、60％、65％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。
在一些实施方案中，与不包含第一核酸的对照细胞相比，免疫细胞中FAS的表达降低至少50％、55％、60％、65％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。
在一些实施方案中，与不包含第二核酸的对照细胞相比，所述第二核酸将免疫细胞中PTPN2的表达降低至少50％、55％、60％、65％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。
在一些实施方案中，与不包含第二核酸的对照细胞相比，免疫细胞中PTPN2的表达降低至少50％、55％、60％、65％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。
在一些实施方案中，与不包含第二核酸的对照细胞相比，所述第二核酸将免疫细胞中TOX的表达降低至少50％、55％、60％、65％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。
在一些实施方案中，与不包含第二核酸的对照细胞相比，免疫细胞中TOX的表达降低至少50％、55％、60％、65％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。
在一些实施方案中，通过核酸测定或蛋白质测定来确定FAS、PTPN2和/或TOX的表达。
在一些实施方案中，核酸测定包括聚合酶链式反应(PCR)、定量PCR(qPCR)、RT-qPCR、微阵列、基因阵列或RNAseq中的至少一者。
在一些实施方案中，蛋白质测定包括免疫印迹、荧光激活细胞分选、流式细胞术、磁激活细胞分选或基于亲和力的细胞分离中的至少一者。
在一些实施方案中，细胞还包含启动受体，所述启动受体包含特异性地结合至第一抗原的第一细胞外抗原结合结构域；和嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体(CAR)包含特异性地结合至第二抗原的第二细胞外抗原结合结构域。
在一些实施方案中，所述免疫细胞是原代人免疫细胞。
在一些实施方案中，原代免疫细胞是自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、T细胞、γδT细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、原代T细胞、T细胞祖细胞或诱导性多能干细胞(iPSC)。
在一些实施方案中，所述原代免疫细胞是原代T细胞。
在一些实施方案中，所述原代免疫细胞是原代人T细胞。
在一些实施方案中，免疫细胞是无病毒的。
在一些实施方案中，免疫细胞是自体免疫细胞。
在一些实施方案中，免疫细胞是同种异体免疫细胞。
在一方面，本文提供了原代免疫细胞，所述原代免疫细胞包含至少一种重组核酸，所述重组核酸包含：包含SEQ ID NO:49所示序列的第一核酸；和包含SEQ ID NO:82所示序列的第二核酸，所述重组核酸插入所述原代免疫细胞的基因组的靶区中，并且其中所述原代免疫细胞不包含用于将所述重组核酸引入所述原代免疫细胞中的病毒载体。
在一方面，本文提供了原代免疫细胞，所述原代免疫细胞包含至少一种重组核酸，所述重组核酸包含：包含SEQ ID NO:49所示序列的第一核酸；和包含SEQ ID NO:SEQ IDNO:99或104所示序列的第二核酸，所述重组核酸插入所述原代免疫细胞的基因组的靶区中，并且其中所述原代免疫细胞不包含用于将所述重组核酸引入所述原代免疫细胞中的病毒载体。
在一方面，本文提供了活的无病毒的原代细胞，所述活的无病毒的原代细胞包含核糖核蛋白复合物(RNP)-重组核酸复合物，其中所述RNP包含核酸酶结构域和指导RNA，其中重组核酸包含：包含SEQ ID NO:49所示序列的第一核酸；和包含SEQ ID NO:82所示序列的第二核酸，并且其中所述重组核酸的5’端和3’端包含与所述原代细胞的基因组中的插入位点侧翼的基因组序列同源的核苷酸序列。
在一方面，本文提供了活的无病毒的原代细胞，所述活的无病毒的原代细胞包含核糖核蛋白复合物(RNP)-重组核酸复合物，其中所述RNP包含核酸酶结构域和指导RNA，其中重组核酸包含：包含SEQ ID NO:49所示序列的第一核酸；和包含SEQ ID NO:SEQ ID NO:99或104所示序列的第二核酸，并且其中所述重组核酸的5’端和3’端包含与所述原代细胞的基因组中的插入位点侧翼的基因组序列同源的核苷酸序列。
在一些实施方案中，细胞还包含启动受体，所述启动受体包含特异性地结合至第一抗原的第一细胞外抗原结合结构域；和嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体(CAR)包含特异性地结合至第二抗原的第二细胞外抗原结合结构域，其中所述第一抗原和所述第二抗原是不同的。
在一方面，本文提供了包含多个如本文所公开的免疫细胞的细胞群体。
在一方面，本文提供了药物组合物，所述药物组合物包含如本文所公开的免疫细胞或如本文所公开的细胞群体，以及药学上可接受的赋形剂。
在一方面，本文提供了药物组合物，所述药物组合物包含如本文所公开的重组核酸、如本文所公开的一种或多种重组核酸或如本文所公开的载体，以及药学上可接受的赋形剂。
在一方面，本文提供了编辑免疫细胞的方法，所述方法包括：提供核糖核蛋白(RNP)-重组核酸复合物，其中所述RNP包含核酸酶结构域和指导RNA，其中所述重组核酸包含如本文所公开的重组核酸，并且其中所述重组核酸的5'端和3'端包含与免疫细胞基因组中插入位点侧翼的基因组序列同源的核苷酸序列；以非病毒方式将RNP-重组核酸复合物引入免疫细胞中，其中所述指导RNA与原代免疫细胞基因组的靶区特异性地杂交，并且其中核酸酶结构域使靶区裂解以产生在免疫细胞基因组中的插入位点；以及通过将如本文所公开的重组核酸插入免疫细胞基因组中的插入位点中来编辑免疫细胞。
在一些实施方案中，以非病毒方式引入包括电穿孔。
在一些实施方案中，所述核酸酶结构域包含CRISPR相关核酸内切酶(Cas)，任选地是Cas9核酸酶。
在一些实施方案中，所述细胞的基因组的所述靶区是T细胞受体α恒定(TRAC)基因座或基因组安全港(GSH)基因座。
在一些实施方案中，重组核酸是双链重组核酸或单链重组核酸。
在一些实施方案中，重组核酸是线状重组核酸或环状重组核酸，任选地其中所述环状重组核酸是质粒。
在一些实施方案中，所述免疫细胞是原代人免疫细胞。
在一些实施方案中，免疫细胞是自体免疫细胞。
在一些实施方案中，免疫细胞是同种异体免疫细胞。
在一些实施方案中，免疫细胞是自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、T细胞、γδT细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、原代T细胞、T细胞祖细胞或诱导性多能干细胞(iPSC)。
在一些实施方案中，免疫细胞是原代T细胞。
在一些实施方案中，免疫细胞是原代人T细胞。
在一些实施方案中，免疫细胞是无病毒的。
在一些实施方案中，所述方法还包括从患者获得免疫细胞以及在体外引入重组核酸。
在一方面，本文提供了治疗受试者的疾病的方法，所述方法包括向受试者施用如本文所公开的免疫细胞或如本文所公开的药物组合物。
在一些实施方案中，所述疾病是癌症。
在一些实施方案中，癌症是实体癌或液体癌。
在一些实施方案中，癌症是卵巢癌、输卵管癌、原发性腹膜癌、子宫癌、间皮瘤、宫颈癌或胰腺癌。
在一些实施方案中，施用细胞增强免疫应答。
在一些实施方案中，增强的免疫应答是适应性免疫应答。
在一些实施方案中，增强的免疫应答是先天免疫应答。
在一方面，本文提供了增强受试者中的免疫应答的方法，所述方法包括向受试者施用如本文所公开的免疫细胞或如本文所公开的药物组合物。
在一些实施方案中，增强的免疫应答是适应性免疫应答。
在一些实施方案中，增强的免疫应答是先天免疫应答。
在一些实施方案中，与不包含第一核酸的对照细胞相比，免疫细胞中FAS的表达降低至少50％、55％、60％、65％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。
在一些实施方案中，与不包含第二核酸的对照细胞相比，免疫细胞中PTPN2的表达降低至少50％、55％、60％、65％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。
在一些实施方案中，与不包含第二核酸的对照细胞相比，免疫细胞中TOX的表达降低至少50％、55％、60％、65％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。
在一些实施方案中，通过核酸测定或蛋白质测定来确定免疫细胞中FAS、PTPN2和/或TOX的表达。
在一些实施方案中，核酸测定包括聚合酶链式反应(PCR)、定量PCR(qPCR)、RT-qPCR、微阵列、基因阵列或RNAseq中的至少一者。
在一些实施方案中，蛋白质测定包括免疫印迹、荧光激活细胞分选、流式细胞术、磁激活细胞分选或基于亲和力的细胞分离中的至少一者。
在一些实施方案中，所述方法还包括与免疫细胞同时或在免疫细胞之后向所述受试者施用免疫疗法。
在一方面，本文提供了修饰的细胞，其中所述细胞经修饰而相对于相应的未修饰的细胞具有降低的FAS基因的表达和/或降低的FAS基因产物的功能，任选地其中所述修饰的细胞是造血细胞。
在一些实施方案中，修饰的细胞经进一步修饰而相对于相应的未修饰细胞具有降低的至少一种第二基因的表达和/或降低的至少一种第二基因的产物的功能。
在一方面，本文提供了修饰的工程化细胞，其中所述工程化细胞经修饰而相对于相应的未修饰的工程化细胞具有降低的FAS基因的表达和/或降低的FAS基因产物的功能，任选地其中所述修饰的工程化细胞被设计来表达异源免疫受体。
在一些实施方案中，修饰的工程化细胞经进一步修饰而相对于相应的未修饰的工程化细胞具有降低的至少一种第二基因的表达和/或降低的至少一种第二基因的产物的功能。
在一方面，本文提供了修饰的细胞，其中所述细胞经修饰而具有：(a)降低的FAS基因的表达和/或降低的FAS基因产物的功能；以及(b)降低的至少一种第二基因的表达和/或降低的所述至少一种第二基因的产物的功能；其中每个基因的降低的表达是相对于相应的未修饰的细胞而言的，任选地其中修饰的细胞是造血细胞。
在一些实施方案中，降低表达的修饰包括对细胞的基因组进行基因工程化以破坏FAS基因和任选地所述至少一种第二基因。
在一些实施方案中，基因工程化包括核酸酶介导的编辑，任选地其中核酸酶介导的编辑包括CRISPR/Cas9介导的编辑。
在一些实施方案中，降低表达的修饰包括RNAi介导的FAS基因和任选地所述至少一种第二基因的靶向，任选地其中RNAi介导的靶向包括短发夹RNA(shRNA)介导的敲低。
在一些实施方案中，RNAi介导的靶向包括工程化细胞以表达能够介导FAS基因和任选地所述至少一种第二基因的敲低的RNA多核苷酸。
在一些实施方案中，修饰的细胞包括造血细胞。
在一些实施方案中，造血细胞包括造血干细胞。
在一些实施方案中，造血细胞包括免疫细胞。
在一些实施方案中，免疫细胞包括适应性免疫细胞、先天免疫细胞、T细胞、NK细胞、巨噬细胞。
在一些实施方案中，修饰的细胞包括工程化细胞。
在一些实施方案中，工程化细胞经工程化以表达异源受体。
在一些实施方案中，异源受体包括免疫受体。
在一些实施方案中，异源免疫受体包括嵌合抗原受体(CAR)、T细胞受体或NK细胞受体。
在一些实施方案中，工程化细胞包括T细胞或能够分化成T细胞的细胞，并且其中异源受体插入内源TCR基因座，任选地T细胞受体α(TRAC)基因座中。
在一些实施方案中，异源受体包含一个或多个抗原结合结构域，任选地其中一个或多个抗原结合结构域能够结合至肿瘤抗原或与癌症相关的抗原。
在一些实施方案中，FAS基因或其表达产物的表达和/或功能降低改善了修饰的细胞相对于相应的未修饰细胞的至少一种特性。
在一些实施方案中，相对于被修饰为仅降低FAS基因的表达和/或功能的相应细胞，当修饰的细胞经进一步修饰而具有降低的所述至少一种第二基因的表达和/或功能时，降低的FAS基因或其表达产物的表达和/或功能以及降低的所述至少一种第二基因或其表达产物的表达和/或功能，改善了修饰的细胞的至少一种特性。
在一些实施方案中，相对于被修饰为仅降低所述至少一种第二基因基因的表达和/或功能的相应细胞，当修饰的细胞经进一步修饰而具有降低的所述至少一种第二基因的表达和/或功能时，降低的FAS基因或其表达产物的表达和/或功能以及降低的所述至少一种第二基因或其表达产物的表达和/或功能，改善了修饰的细胞的至少一种特性。
在一些实施方案中，所述至少一种特性包括改善的增殖能力。
在一些实施方案中，所述至少一种特性包括改善的针对FAS介导的细胞凋亡的保护。
在一些实施方案中，修饰的细胞包括免疫细胞，并且所述至少一种特性包括改善的免疫效应细胞功能。
在一些实施方案中，改善的免疫效应细胞功能包括增加的相对效应分子表达、产生和/或分泌。
在一些实施方案中，免疫细胞包括T细胞，并且效应分子包括选自由以下组成的组的一种或多种分子：IFNγ、TNFα、颗粒酶B和FASL。
在一些实施方案中，修饰细胞经工程化以表达异源表面抗原，任选地其中异源表面抗原能够介导相对于未经工程化以表达异源表面抗原的相应修饰细胞而言工程化修饰细胞的靶向耗尽。
在一方面，本文提供了刺激受试者的免疫应答的方法，其中所述方法包括向受试者施用如本文所公开的任何一种修饰的细胞。
在一方面，本文提供了治疗受试者的癌症的方法，其中所述方法包括向受试者施用如本文所公开的任何一种修饰的细胞。
在一些实施方案中，修饰的细胞对于受试者来说是自体的。
在一些实施方案中，修饰的细胞对于受试者来说是同种异体的。
在一方面，本文提供了一种或多种重组核酸，其中所述一种或多种重组核酸编码：包含启动受体的第一嵌合多肽，所述启动受体包含特异性地结合至生殖细胞碱性磷酸酶(ALPG/P)的细胞外抗原结合结构域的第一嵌合多肽；和包含嵌合抗原受体(CAR)的第二嵌合多肽，所述嵌合抗原受体(CAR)包含特异性地结合至间皮素(MSLN)的第二细胞外抗原结合结构域。
在一些实施方案中，第一细胞外抗原结合结构域包含可变重(VH)链序列和可变轻(VL)链序列，所述可变重(VH)链序列包含三个重链CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述可变轻(VL)链序列包含三个轻链CDR序列CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中：CDR-H1包含SEQID NO:1所示的序列，CDR-H2包含SEQ ID NO:2所示的序列，CDR-H3包含SEQ ID NO:3所示的序列，CDR-L1包含SEQ ID NO:4所示的序列，CDR-L2包含SEQ ID NO:5所示的序列，并且CDR-L3包含SEQ ID NO:6所示的序列。
在一些实施方案中，第二细胞外抗原结合结构域包含可变重(VH)链序列，所述可变重(VH)链序列包含三个重链CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中：CDR-H1包含SEQ IDNO:14所示的序列，CDR-H2包含SEQ ID NO:15所示的序列，并且CDR-H3包含SEQ ID NO:16所示的序列。
在一方面，本文提供了一种或多种重组核酸，其中所述一种或多种重组核酸编码至少一个长度为至少15个核苷酸的核酸序列，其中所述至少一个核酸序列包含以下一项或多项：(1)第一核酸序列，所述第一核酸序列与包含SEQ ID NO:39所示序列的编码人Fas细胞表面死亡受体(FAS)的mRNA的核苷酸1126至1364互补，(2)第二核酸序列，所述第二核酸序列与包含SEQ ID NO:40所示序列的编码人非受体型蛋白酪氨酸磷酸酶2(PTPN2)的mRNA的核苷酸518至559互补；和(3)第三核酸序列，所述第三核酸序列与包含SEQ ID NO:41所示序列的编码人胸腺细胞选择相关高迁移率族盒(TOX)的mRNA的核苷酸1294至2141互补。
在一些实施方案中，所述一种或多种重组核酸序列的长度为至少16个、17个、18个、19个、20个、21个或22个核苷酸。
在一些实施方案中，其中所述一种或多种重组核酸序列是短发夹RNA(shRNA)、小干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)或反义寡核苷酸。
在一些实施方案中，所述一种或多种重组核酸包含与包含SEQ ID NO:39所示序列的编码人FAS的mRNA的核苷酸1126至1364互补的第一核酸序列和与包含SEQ ID NO:40所示序列的编码人PTPN2的mRNA的核苷酸518至559互补的第二核酸序列。
在一些实施方案中，第一核酸序列包含选自由SEQ ID NO:42-71所示序列组成的组的序列。
在一些实施方案中，第一核酸序列包含SEQ ID NO:49所示的序列。
在一些实施方案中，与不包含第一核酸序列的对照免疫细胞相比，所述第一核酸序列将免疫细胞中FAS的表达降低至少50％、55％、60％、65％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。
在一些实施方案中，第二核酸序列包含选自由SEQ ID NO:72-97所示序列组成的组的序列。
在一些实施方案中，第二核酸序列包含SEQ ID NO:82所示的序列。
在一些实施方案中，与不包含第二核酸序列的对照免疫细胞相比，所述第二核酸序列将免疫细胞中PTPN2的表达降低至少50％、55％、60％、65％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。
在一些实施方案中，第一核酸序列包含选自由SEQ ID NO:42至71所示序列组成的组的序列；并且第二核酸序列包含选自由SEQ ID NO:72至97所示序列组成的组的序列。
在一些实施方案中，第一核酸序列包含SEQ ID NO:49所示的序列，并且第二核酸序列包含SEQ ID NO:82所示的序列。
在一些实施方案中，核酸包含选自由SEQ ID NO:168、167和166所示序列组成的组的序列。
在一些实施方案中，第三核酸序列包含选自由SEQ ID NO:98-125所示序列组成的组的序列。
在一方面，本文提供了一种或多种包含本文公开的重组核酸的表达载体。
在一方面，本文提供了包含本文公开的一种或多种重组核酸的细胞。
在一些实施方案中，细胞是原代人免疫细胞。
在一方面，本文提供了包含本文公开的重组核酸和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
在一方面，本文提供了抑制受试者中的靶细胞的方法，所述方法包括施用细胞，所述细胞包含：包含启动受体的第一嵌合多肽，所述启动受体包含特异性地结合至胎盘/生殖细胞碱性磷酸酶(ALPG/P)的第一细胞外抗原结合结构域；和包含嵌合抗原受体(CAR)的第二嵌合多肽，其中所述CAR包含特异性地结合至间皮素(MSLN)的第二细胞外抗原结合结构域。
在一方面，本文提供了抑制受试者中的靶细胞的方法，所述方法包括施用细胞，所述细胞包含至少一个长度为至少15个核苷酸的核酸序列，其中所述至少一个核酸序列包含以下一项或多项：(1)第一核酸序列，所述第一核酸序列与包含SEQ ID NO:39所示序列的编码人Fas细胞表面死亡受体(FAS)的mRNA的核苷酸1126至1364互补，(2)第二核酸序列，所述第二核酸序列与包含SEQ ID NO:40所示序列的编码人非受体型蛋白酪氨酸磷酸酶2(PTPN2)的mRNA的核苷酸518至559互补；和(3)第三核酸序列，所述第三核酸序列与包含SEQID NO:41所示序列的编码人胸腺细胞选择相关高迁移率族盒(TOX)的mRNA的核苷酸1294至2141互补。
在一些实施方案中，靶细胞是癌细胞，任选地是固体癌细胞或液体癌细胞。
在一方面，本文提供了治疗受试者的疾病的方法，所述方法包括向受试者施用本文公开的细胞。
实施例
以下是用于进行本发明的特定实施方案的实施例。实施例仅出于说明性目的而提供，并且不意图以任何方式限制本发明的范围。已努力确保关于所用数值(例如，数量、温度等)的准确性，但当然应允许一些实验误差和偏差。
除非另外指示，否则本发明的实施将采用属于本领域的技能的常规蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术和药理学方法。此类技术充分说明于文献中。参见，例如，T.E.Creighton,Proteins:Structures and Molecular Properties(W.H.Freeman andCompany,1993)；A.L.Lehninger,Biochemistry(Worth Publishers,Inc.,本期新增)；Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版,1989)；Methods InEnzymology(S.Colowick和N.Kaplan编,Academic Press,Inc.)；Remington'sPharmaceutical Sciences,第18版(Easton,Pennsylvania:Mack Publishing Company,1990)；Carey和Sundberg Advanced Organic Chemistry第3版(Plenum Press)第A和B卷(1992)。
实施例1：ALPG/P和MSLN逻辑门的产生和体外表征
材料和方法
用于体外研究的非病毒T细胞工程化.
使用Lymphoprep(STEMCELL Technologies)和EasySep人T细胞分离试剂盒(STEMCELL Technologies)从获自正常供体Leukopaks(STEMCELL Te chnologies)获得的外周血单核细胞(PBMC)富集T细胞。随后将T细胞在补充有3％人AB血清(Gemini Bio)和12.5ng/ml人IL-7和IL-15(Miltenyi优质级)的TexMACS培养基(Miltenyi 130-197-196)中用CD3/CD28 Dynabead以1:1珠粒:细胞比(ThermoFisher，40203D)激活，在37℃、5％ CO2下培养48小时，然后电穿孔。
通过将120μM靶向DNA序列的sgRNA(Synthego)GAGCCATGCTTG GCTTACGA(GS94，SEQID NO:307)、62.5μM sNLS-SpCas9-sNLS(Al devron)和P3缓冲液(Lonza)以5:1:3:6的体积比组合来制备CRISPR RNP，并将其在室温下孵育15分钟。将通过剂量滴定实验确定的优化量的质粒DNA(范围为0.25-3微克)与3.5μl RNP混合。对T细胞进行计数、去珠粒、以90X G离心10分钟，并以10^6个细胞/14.5μl添加有补充剂的P3(Lonza)重悬。将14.5μl T细胞悬浮液添加到DNA/RNP混合物中，转移到Lonza 384孔核比色皿条中，并在代码为EH-115的LonzaHT Nucleofector System中进行脉冲处理。使细胞在室温下静置15分钟，接着转移至96孔板(Sarsted t)中的补充有12.5ng/ml人IL-7和IL-15(Miltenyi优质级)的TexMACS培养基中。
通过用抗Myc抗体(Cell Signaling Technology，克隆9B11)和抗Flag抗体(RnDsystems，克隆1042E)染色检测转基因表达，并在Attune NxT流式细胞仪上进行分析。所使用的其他抗体是活/死Fixable Near-IR(Thermo Fisher)、TCRα/β抗体(BioLegend，克隆IP26)、CD4抗体(BioLegend，克隆RPA-T4)、CD8抗体(BioLegend，克隆SK1)。
FLAG-标签MSLN CAR 1：抗MSLN人VH-CD8a铰链-CD8a-TMD-4-1BB共刺激结构域-CD3z激活结构域。
FLAG-标签MSLN CAR 3：抗MSLN人VHH-CD8a铰链-CD8a-TMD-4-1BB共刺激结构域-CD3z激活结构域。
Myc标签ALPG/P启动受体：抗ALPG/P scFv-CD8a铰链-Notch1TMD-Notch1 STS-HNF1aDBD-p65激活结构域。
T细胞刺激
使用体外方法制造工艺，对来自两例供体的T细胞进行工程化，使其表达两种不同MSLN结合剂与ALPG/P启动受体的CAR格式组合的逻辑门系统。LG1是MSLN CAR1与ALPG/P启动受体的组合，并且LG3是MSLN CAR3与ALPG/P启动受体的组合。将T细胞在初始激活后第9天冷冻并低温保存。在测定之前，将工程化T细胞解冻，并在包含12.5ng/mL人IL-7和IL-15的培养基中静置过夜。在测定当天，对表达LG1或LG3的T细胞进行计数，并将2e4个总T细胞铺板到96孔圆底板的每孔中的不含IL-7和IL-15的200uL培养基中。以技术重复将工程化T细胞单独铺板(“静息T细胞”条件)或与抗CD3/抗CD28 Dynabead以1:5珠粒:细胞比(“+TCR刺激”条件)铺板。将准备好的含有T细胞的板以300g离心沉降2分钟，然后在37℃下孵育24小时。在24小时共培养后，分别使用抗myc PE和抗FLAG APC对T细胞进行染色以确定PrimeR和CAR表达，并通过流式细胞术在Attune NxT上进行分析。
体外双抗原依赖性杀伤测定
使用非病毒制造工艺，对来自两例供体的T细胞进行工程化，使其表达LG1或LG3(或匹配的组成型CAR对照)，并在初始激活后第9天进行冷冻和低温保存。在测定之前，将来自同一供体的工程化T细胞和仅RNP对照T细胞解冻，并在包含12.5ng/mL人IL-7和IL-15的培养基中静置过夜。在测定当天，对工程化T细胞进行计数并分别使用抗myc PE和抗FLAGAPC进行染色以确定PrimeR和CAR表达，并通过流式细胞术进行分析。对于每例供体，通过添加仅RNP细胞来稀释高于最低KI％的工程化细胞群体，将所有工程化T细胞群体以该供体内的最低KI％作归一化。在归一化后，将T细胞重悬于不含IL-7和IL-15的培养基中，并进行连续稀释，然后添加到96孔平底白壁测定板中。在以技术重复每孔添加1e4个靶细胞后，连续稀释T细胞产生以下共培养KI+效应物:靶标(E:T)比：3:1、1:1、1:3、1:9、1:27和1:81。将每个T细胞群体与四种不同的K562共培养，这些K562具有不同的启动抗原ALPG和溶细胞抗原MSLN表达组合：K562、K562-ALPG、K562-MSLN和K562-ALPG/MSLN。将准备好的含有T细胞和靶细胞的板以300g离心沉降2分钟，然后在37℃下孵育72小时，每个板上盖有透气膜。使用终点荧光素酶测定测量72小时共培养结束时的细胞毒性。
细胞毒性动力学
使用非病毒制造工艺，对来自三例供体的T细胞进行工程化，使其表达LG1或LG3(或匹配的组成型CAR对照)，并在初始激活后第9天进行冷冻和低温保存。在测定之前，将来自同一供体的工程化T细胞和仅RNP对照T细胞解冻，并在包含12.5ng/mL人IL-7和IL-15的培养基中静置过夜。在测定当天，对工程化T细胞进行计数并分别使用抗myc PE和抗FLAGAPC进行染色以确定PrimeR和CAR表达，并通过流式细胞术进行分析。对于每例供体，通过添加仅RNP细胞来稀释高于最低KI％的工程化细胞群体，将所有工程化T细胞群体以该供体内的最低KI％作归一化。在归一化后，将T细胞重悬于不含IL-7和IL-15的培养基中，并连续稀释，然后添加到已预先包被聚L-赖氨酸(50uL/孔，在室温下，吸干并干燥30分钟)的96平底透明测定板中。在以技术重复将6e3个K562-ALPG/MSLN靶细胞轻轻添加到每个孔中后，连续稀释T细胞产生以下共培养KI+效应物:靶标(E:T)比：3:1、1:1和1:3。在测定培养基中包含膜联蛋白V染料以标记凋亡细胞。将准备好的含有T细胞和靶细胞的板在室温下不受干扰地静置30分钟，然后用易透气膜覆盖。然后将板加载到Incucyte活细胞成像仪中，并在72小时内每2小时成像一次，通过测量K562中的GFP信号和膜联蛋白V凋亡标志物来跟踪随时间变化的细胞毒活性。
细胞因子产生
对取自经工程化以表达不同ALPG和MSLN组合(参见“体外双抗原依赖性杀伤”)的K562肿瘤细胞细胞毒性测定的共培养孔中的上清液中的细胞因子产生进行评价。使用Luminex测定分析上述细胞毒性测定中在72小时从1:1KI+E:T孔收集的上清液的IL-2产生。
针对患者相关ALPG和MSLN水平的模型细胞系工程化
通过慢病毒对逻辑门T细胞共培养实验中使用的所有K562靶细胞进行工程化，使其表达具有靶抗原和蛋白质的构建体。细胞表达与卵巢癌原发肿瘤样本中常见的启动抗原ALPG和溶细胞抗原MSLN的表达水平相匹配。亲本K562细胞来源于ATCC。通过使用Fugene HD(Promega#E2312)用转基因表达载体和病毒包装质粒psPAX2和pMD2.G转染Lenti-X 293T细胞来产生泛性VSV-G假型慢病毒。使用Lenti-X浓缩器(Takara Bio#631231)进一步浓缩慢病毒。在测定中使用的所有K562细胞均用含有表达GFP和荧光素酶的“EFG”构建体的慢病毒转导。通过FACS ARIA II进行FACS分选，将GFP用作分选标志物，以产生纯的转导细胞群体，并在基于流或Incucyte的测定中作为靶细胞的标志物，荧光素酶基因用于读出细胞毒性测定。
在对K562-EFG系进行分选和保存后，进一步转导该细胞系以表达启动抗原ALPG和溶细胞抗原MSLN的组合。利用用于双顺反子表达的一起表达由2A序列分开的ALPG、MSLN或ALPG和MSLN的慢病毒构建体转导K562-EFG系。
针对CAR表达诱导的启动受体敏感性测定
使用如上所述的工程化方法，对来自一例供体的T细胞进行工程化，使其表达LG1，LG1具有与LG3完全相同的PrimeR。在激活后第9天，对LG1T细胞进行计数，并将2e4个总T细胞铺板到96孔圆底板的每孔中的不含IL-7和IL-15的200uL培养基中。以技术重复将工程化T细胞单独(“单独T细胞”条件)、与K562-ALPG低或与K562-ALPG高细胞以1:1KI+E:T铺板。将准备好的含有T细胞的板以300g离心沉降2分钟，然后在37℃下孵育72小时。在72小时共培养后，分别使用抗myc PE和抗FLAG APC对T细胞进行染色以确定PrimeR和CAR表达，并通过流式细胞术在Attune NxT上进行分析。为了使用FlowJo在流式分析中特异性分析活T细胞，使用活力染料和K562中的GFP表达来排除门控中的死细胞和靶细胞。
接下来，使用利用SKOV3-WT细胞的体外应激模型。使用如上所述的工程化方法，对来自两例供体的T细胞进行工程化，使其表达LG1或LG3(或匹配的组成型CAR对照)。将细胞在初始激活后第9天进行低温保存。在测定之前，将来自同一供体的工程化T细胞和仅RNP对照T细胞解冻，并在包含12.5ng/mL人IL-7和IL-15的培养基中静置过夜。在测定当天，对工程化T细胞进行计数并分别使用抗myc PE和抗FLAG APC进行染色以确定PrimeR和CAR表达，并通过流式细胞术进行分析。对于每例供体，通过添加仅RNP细胞来稀释高于最低KI％的工程化细胞群体，将所有工程化T细胞群体以该供体内的最低KI％作归一化。在归一化后，将T细胞重悬于不含IL-7和IL-15的培养基中，并以1:1KI+E:T与内源表达ALPG和MSLN的1e4个SKOV3卵巢癌细胞一起添加到96孔平底白壁测定板中。将准备好的含有T细胞和靶细胞的板以300g离心沉降2分钟，然后在37℃下孵育72小时，每个板上盖有透气膜。在72小时收集上清液，并使用Luminex测定分析IFNγ和IL-2的产生。
原发性和转移性癌症样本中的表达
为了评估特定适应症样本中的抗原水平，通过IHC分析评价原发性和转移性卵巢癌肿瘤样本中逻辑门靶抗原ALPG(启动抗体)和MSLN(溶细胞抗原)的表达。通过IHC分析原发性卵巢癌肿瘤样本(n＝22)和转移瘤样本(n＝11)的ALPG和MSLN表达，并对每个样本的每种抗原阳性肿瘤细胞百分比以及抗原表达强度进行评分。
异质性细胞毒性测定
为了评估诱导回路T细胞完全清除肿瘤所需的先导抗原阳性细胞的最小比例，开发了一种直接控制肿瘤抗原异质性的细胞毒性测定。使用如上所述的工程化方法，对来自两例供体的T细胞进行工程化，使其表达LG1或LG3(或匹配的组成型CAR对照)。将细胞在初始激活后第9天冷冻并低温保存。在测定之前，将来自同一供体的工程化T细胞和仅RNP对照T细胞解冻，并在包含12.5ng/mL人IL-7和IL-15的培养基中静置过夜。在测定当天，对工程化T细胞进行计数并分别使用抗myc PE和抗FLAG APC进行染色以确定PrimeR和CAR表达，并通过流式细胞术进行分析。对于每例供体，通过添加仅RNP细胞来稀释高于最低KI％的工程化细胞群体，将所有工程化T细胞群体以该供体内的最低KI％作归一化。在归一化后，将T细胞重悬于不含IL-7和IL-15的培养基中，并以1:1KI+E:T与以不同比率混合以模拟不同水平的启动抗原异质性的1e4个K562-MSLN和K562-ALPG/MSLN一起添加到96孔圆底透明测定板中。将准备好的含有T细胞和靶细胞的板以300g离心沉降2分钟，然后在37℃下孵育72小时，每个板上盖有透气膜。使用终点荧光素酶测定测量72小时共培养结束时的细胞毒性。
可溶性蛋白抑制测定
MSLN以可溶形式(sMSLN)从细胞中脱落，其可充当沉降物并抑制抗MSLN CAR T细胞与癌细胞表面上呈递的MSLN结合，从而抑制靶细胞杀伤。另外，已知可溶性蛋白CA125与MSLN相互作用，并且如果抗MSLN结合剂和CAR靶向可被CA125结合封闭的表位，则可以阻断它们的结合。可以使用测定将增加水平的可溶性蛋白滴定到与CAR T细胞和MSLN阳性靶癌细胞的共培养物中并测量T细胞激活/靶标杀伤，从而筛选候选抗MSLN CAR设计的抵抗在生理相关水平上发现的sMSLN和CA125抑制的能力。开发了一种利用K562-ALPG/MSLN靶细胞和IL-2细胞因子产生作为T细胞激活量度的测定，以检测可溶性蛋白对抗MSLN CAR T细胞的抑制作用，其中M912CAR显示出CA125的抑制作用。在使用组成型CAR T细胞对照验证可溶性蛋白CAR抑制测定后，该测定随后用于测试逻辑门LG1和LG3。
使用如上所述的工程化方法，对来自两例供体的T细胞进行工程化，使其表达LG1或LG3(或匹配的组成型CAR对照)。将细胞在初始激活后第9天冷冻并低温保存。在测定之前，将来自同一供体的工程化T细胞和仅RNP对照T细胞解冻，并在包含12.5ng/mL人IL-7和IL-15的培养基中静置过夜。在测定当天，对工程化T细胞进行计数并分别使用抗myc PE和抗FLAG APC进行染色以确定PrimeR和CAR表达，并通过流式细胞术进行分析。对于每例供体，通过添加仅RNP细胞来稀释高于最低KI％的工程化细胞群体，将所有工程化T细胞群体以该供体内的最低KI％作归一化。在归一化后，将T细胞重悬于不含IL-7和IL-15的培养基中，并在存在不同浓度的可溶性CA125或sMSLN的情况下以1:1KI+E:T与2e4个K562-ALPG/MSLN靶细胞一起添加到96孔平底透明测定板中。将准备好的含有T细胞和靶细胞的板以300g离心沉降2分钟，然后在37℃下孵育48小时。在48小时收集上清液，并使用Luminex测定分析IL-2的产生。
结果
T细胞编辑和刺激
测定图解显示于图1中。结果示于图2中。在“静息T细胞”条件下，表达两个逻辑门(LG1和LG3)的T细胞在没有刺激的情况下显示出PrimeR表达，但CAR表达极少(图2)。在通过抗CD3/抗CD28 Dynabead进行TCR刺激后，相对于“静息T细胞”条件下的相同T细胞，现在活化T细胞显示出增加的PrimeR MFI和PrimeR+％(图2)。然而，TCR刺激并没有增加还表达CAR的PrimeR+细胞的百分比。这些结果表明，即使在强TCR和共刺激信号传导情形下，LG1和LG3的CAR表达也依赖于与PrimeR抗原的结合。
体外双抗原依赖性杀伤
两个逻辑门都在体外展示了双抗原依赖性杀伤。用逻辑门1或逻辑门3工程化的T细胞被编程为特异性地识别并激活对表达启动抗原ALPG和溶细胞抗原MSLN的癌细胞的细胞毒性应答。逻辑门T细胞的双抗原特异性与常规组成型CAR T细胞形成对比，常规组成型CAR T细胞可能由于与表达溶细胞抗原的健康组织发生中靶脱肿瘤交叉反应而导致毒性。表达组成型抗MSLN CAR的T细胞杀伤K562-MSLN和K562-ALPG/MSLN细胞(图3C和图3D)，而来自表达逻辑门的T细胞的细胞毒性对双抗原K562-ALPG/MSLN具有特异性(图3D)，并且即使在最高E:T比下也只表现出针对单抗原阳性K562-ALPG或K562-MSLN细胞系的极少活性(图3B和图3C)。从阴性对照仅RNP T细胞中未观察到细胞毒性(图3A)。在表达逻辑门的T细胞中观察到肿瘤特异性活性(图3D)。在针对K562-MSLN细胞系的仅CAR T细胞中观察到中靶脱组织毒性(图3C)。总之，这些数据表明，逻辑门T细胞针对溶细胞抗原阳性细胞的细胞毒性仅限于同时存在启动抗原ALPG的共培养条件。
细胞毒性动力学
逻辑门1在体外表现出比逻辑门3更快的杀伤动力学。T细胞与K562-ALPG/MSLN靶细胞的共培养物的动态成像显示，用不同逻辑门或匹配的组成型CAR对照工程化的T细胞以不同的动力学杀伤其靶标。用组成型CAR 1或CAR 3工程化的T细胞在与靶细胞铺板后显示出快速启动的细胞毒活性，其中CAR 1的杀伤速度最快。逻辑门T细胞的细胞毒性在组成型CAR对照开始细胞毒性后约24小时开始。不希望受理论束缚，逻辑门的延迟细胞毒性可能是基于它们的机制，即PrimeR首先需要结合其抗原，然后T细胞才能触发足以达到能够诱导细胞毒性的表面水平的CAR表达。相对于逻辑门3T细胞，逻辑门1T细胞显示出更快速和更完全的K562-ALPG/MSLN靶细胞杀伤(图4)。从阴性对照仅RNP T细胞中未观察到细胞毒性。逻辑门1T细胞相对于逻辑门3T细胞更快的杀伤动力学与T细胞激活和靶标杀伤的其他量度很好地对应，表明逻辑门1是更有效的候选者。
细胞因子产生
为了进一步证明逻辑门T细胞的特异性和功能活性，评估了细胞因子产生。与细胞毒性数据一致，逻辑门T细胞的细胞因子产生限于存在双抗原K562-ALPG/MSLN靶细胞的孔(图5D)。相比之下，带有组成型CAR对照的T细胞在与K562-MSLN(图5B)或K562-ALPG/MSLN(图5D)靶细胞共培养时产生IL-2。逻辑门和组成型CAR T细胞均不响应于不表达溶细胞抗原的K562(图5A)或K562-ALPG(图5C)靶细胞系产生IL-2。阴性对照仅RNP T细胞在与任何靶细胞系共培养时均不产生细胞因子(图5A)。不希望受理论束缚，这些数据进一步支持了这样一种假设，即逻辑门T细胞的功能输出仅限于同时存在启动抗原和溶细胞抗原的条件。
针对患者相关ALPG和MSLN水平的模型细胞系工程化
通过FACS产生K562-ALPG、K562-MSLN和K562-ALPG/MSLN系，其抗原表达水平与ASPC-1细胞系相匹配，ASPC-1细胞系是一种来源于ATCC的胰腺癌细胞系，具有ALPG和MSLN的内源抗原表达。基于流式细胞术对分选后建立的K562细胞系和ASPC-1细胞系对照上ALPG和MSLN表达的评估表明，FACS成功产生了具有与对照相匹配的表达的工程化K562细胞系(图6A和图7A)。重要的是，对细胞团块和异种移植肿瘤样本(取自NSG小鼠并经福尔马林固定)中ASPC-1细胞中ALPG和MSLN表达的IHC分析发现，与相同的实验中分析的原发性卵巢癌肿瘤样本中这些抗原的中低表达水平相匹配(图6B和图7B)。综上所述，该数据支持这些测定中使用的K562靶系表达生理相关的靶抗原ALPG和MSLN水平，与典型卵巢癌患者肿瘤样本中发现的水平相匹配。
针对CAR表达诱导的启动受体敏感性测定
接下来，使用CAR诱导测定来评估该PrimeR对低密度ALPG的敏感性。抗ALPG结合剂PrimeR对ALPG水平的敏感性是AsPC-1参考系的1/4。LG1和LG3利用相同的PrimeR和抗ALPG结合剂。生成K562-ALPG高和K562-ALPG低细胞系，以与AsPC-1参考肿瘤细胞系的抗原表达相匹配。对功能测定中使用的K562-ALPG/MSLN靶细胞进行分选，使其ALPG表达与CAR诱导测定中使用的K562-ALPG高系相匹配。对K562-ALPG高系上ALPG表面分子的定量表明，与参考细胞系相比，这些细胞上存在更多数量的抗原(图8A、图8B、图8C)。相比之下，K562-ALPG低系显示出明显低于“高”系的ALPG表达，并且抗原定量显示K562-ALPG低系的ALPG表达是参考ASPC-1细胞系的1/4(图8A、图8B、图8C)。因此，K562-ALPG低系具有生理相关的ALPG表达，并且可能低于人癌症患者卵巢癌肿瘤中发现的水平。重要的是，用LG1和抗ALPG结合剂PrimeR工程化的T细胞响应于K562-ALPG低和K562-ALPG高细胞显示出相同的引物依赖性CAR诱导水平(图8C)。不希望受理论束缚，这些结果证明，LG1 T细胞能够响应于等于或低于人癌症患者卵巢癌肿瘤样本中通常发现的表达水平的ALPG水平而诱导CAR表达，并表明肿瘤ALPG密度不会成为LG1 T细胞清除ALPG+/MSLN+癌细胞的能力的限制因素。
接下来，使用SKOV3-WT细胞的体外应激模型来评价用两个候选逻辑门工程化的T细胞如何响应具有低且异质性的ALPG和MSLN表达的SKOV3卵巢癌细胞系(图9A和图9B)。不希望受理论束缚，鉴于LG1和LG3利用相同的PrimeR，但各自诱导用不同MSLN结合剂构建的基于41BBζ的CAR的表达，这些逻辑门T细胞对不同双抗原阳性靶细胞的应答差异可能由不同回路内两个MSLN CAR的不同活性驱动。有趣的是，在两例供体中，测试的LG1 T细胞响应于SKOV3靶细胞产生的细胞因子明显多于LG3 T细胞，其中对IL-2的影响尤其显著(图9C和图9D)。另外，表达LG1的T细胞比组成型CAR1 T细胞产生显著更多的细胞因子(同样，对于IL-2更显著)(图9C和图9D)。不希望受理论束缚，该数据表明LG1 T细胞响应于具有低且异质性的ALPG和MSLN表达的卵巢癌靶细胞能够诱导强烈的细胞因子产生。
原发性和转移性癌症样本中的表达
发现几乎所有的原发性和转移性卵巢癌样本都表达MSLN，并且绝大多数原发性肿瘤样本在100％的癌细胞上表达MSLN(图10B)。在绝大多数患者样本中也发现了启动抗原ALPG的表达，尽管不是在所有转移瘤中(图10A)。虽然ALPG存在于大多数卵巢癌样本中，但对于许多患者来说，每个样本中表达ALPG的癌细胞百分比相比MSLN更具异质性。ALPG阳性样本均>5％ALPG+，其中大多数含有至少10％ ALPG+癌细胞。因此，ALPG和MSLN在绝大多数卵巢癌患者样本中共表达，在许多样本中在所有细胞上MSLN表达显得更为均质，而ALPG存在，但表达更具异质性。
异质性细胞毒性测定
肿瘤是癌细胞的异质混合物，这种异质性延伸到抗原表达。通过以与门方式靶向两种抗原，primeR/CAR逻辑门回路有可能通过提高肿瘤靶向相对于健康组织的精度，相对于现有癌症疗法显著减少毒副作用。然而，有了这种更特异性的靶向，这些回路是否能够清除仅在少数细胞上表达启动抗原的异质肿瘤一直是一个问题，这可能是许多患者肿瘤中的情况。该测定的结果表明，两个逻辑门均表现出完全的靶细胞清除率，有低至仅5％的启动抗原阳性癌细胞(ALPG)，其中LG1在存在最少启动抗原的情况下显示出最有效的应答(图10C)。无论ALPG表达如何，组成型CAR对照T细胞都能同样良好地杀伤所有MSLN+靶细胞条件。从阴性对照仅RNP T细胞中未观察到细胞毒性。结合分析卵巢癌患者样本中抗原表达的IHC数据，启动抗原异质性细胞毒性测定的结果表明，逻辑门T细胞能够消除仅在少数细胞上表达启动抗原的异质性癌细胞群体。
可溶性蛋白测定
LG1和LG3(或它们匹配的组成型CAR对照)均不受生理相关水平的可溶性CA125或sMSLN的抑制(图11A和图11B)。RNP T细胞未显示出阴性对照预期的细胞因子释放。这些结果表明，LG1和LG3均含有对卵巢癌患者中可能遇到的可溶性CA125和sMSLN水平的抑制具有抵抗力的CAR。
实施例2：体内ALPG/P和MSLN逻辑门表征
材料和方法
使用上文实施例1中描述的工程化方法，对来自两例供体的T细胞进行工程化，使其表达LG1或LG3(或匹配的组成型CAR对照)。将细胞在初始激活后第9天冷冻并低温保存。对于质量控制(QC)测定，将来自同一供体的工程化T细胞和仅RNP对照T细胞解冻，并在包含12.5ng/mL人IL-7和IL-15的培养基中静置过夜。接下来，对工程化T细胞进行计数并分别使用抗myc PE和抗FLAG APC进行染色以确定PrimeR和CAR表达，并通过流式细胞术进行分析以评估KI％。
K526双侧腹体内研究
在NSG双MHC KO(NSG DKO)品系(Jackson Laboratories,025216)的左侧腹各植入1e6个K562-MSLN细胞，在右侧腹植入K562-ALPG/MSLN细胞，两种细胞均在50％ Matrigel溶液中。在K562细胞接种后第三天，使用测量荧光素酶信号以定量工程化肿瘤细胞的生物发光成像(BLI)，将小鼠随机分为肿瘤大小相匹配的治疗组，每个治疗条件分配7只小鼠。在分期和归一化的同一天，将工程化T细胞和匹配的RNP对照解冻，并在包含12.5ng/mL人IL-7和IL-15的培养基中静置过夜。在K562植入后第4天，对于每例供体，通过添加仅RNP的细胞来稀释高于最低KI％的工程化细胞群体，将所有工程化T细胞群体以该供体内的最低KI％作归一化。经尾静脉给小鼠静脉内注射5e6个KI+T细胞。通过卡尺每周两次监测双侧肿瘤体积以及体重。
MSTO
给NSG双MHC KO(NSG DKO)品系(Jackson Laboratories，025216)植入在50％Matrigel溶液中的各1e6个MSTO-211H细胞，这些细胞经工程化以与ASPC-1参考系匹配的水平表达ALPG和MSLN。在MSTO细胞接种后第九天，基于卡尺测量结果，将小鼠随机分为肿瘤大小相匹配的治疗组，每个治疗条件分配7只小鼠。在分期和归一化的同一天，将工程化T细胞和匹配的RNP对照解冻，并在包含12.5ng/mL人IL-7和IL-15的培养基中静置过夜。在MSTO植入后第10天，对于每例供体，通过添加仅RNP的细胞来稀释高于最低KI％的工程化细胞群体，将所有工程化T细胞群体以该供体内的最低KI％作归一化。经尾静脉给小鼠静脉内注射2e6、7e5或2.3e5个KI+T细胞。通过卡尺每周2-3次监测肿瘤体积以及体重。
结果
双侧腹体内实验模拟了临床上观察到的中靶脱肿瘤毒性，其中组成型CAR T细胞靶向也由健康器官表达的肿瘤抗原，而肿瘤仅表达代表这种正常组织的细胞溶解。在这些实验中，K562MSLN肿瘤模拟了表达MSLN的健康器官(例如，间皮内层)，而对侧腹的K562ALPG /MSLN肿瘤则模拟了卵巢癌肿瘤。表达LG1或LG3的T细胞均表现出对双抗原K562ALPG/MSLN肿瘤细胞的特异性杀伤，而对脱靶K562MSLN肿瘤细胞没有可测量的活性(图12A至图12F)。在每幅图中，较低的线显示用指示T细胞治疗后的肿瘤体积，较高的线显示用对照T细胞治疗后的肿瘤体积。用组成型CAR治疗后K562MSLN肿瘤和K562ALPG/MSLN肿瘤中的肿瘤体积分别示于图12A和图12B中。用LG1治疗后K562MSLN肿瘤和K562ALPG/MSLN肿瘤中的肿瘤体积分别示于图12C和图12D中。用LG3治疗后K562MSLN肿瘤和K562ALPG/MSLN肿瘤中的肿瘤体积分别示于图12E和图12F中。LG1 T细胞表现出比LG3 T细胞更强的中靶抗肿瘤活性。因此，LG1和LG3都指导工程化T细胞特异性地靶向并杀伤ALPG+/MSLN+肿瘤，而忽略在同一只小鼠中仅几厘米之外的MSLN+肿瘤。这些实验的结果显示了如何使用逻辑门T细胞在体内特异性地靶向双抗原肿瘤。
在工程化的MSTO-2H11ALPG/MSLN异种移植肿瘤模型中，2e6个LG1或LG3 T细胞的剂量诱导有效的肿瘤杀伤和完全应答。LG1或LG3逻辑门T细胞增强了抗实体瘤CAR效力。低剂量、应激剂量和高剂量T细胞剂量反应分别示于图13A、图13B和图13C中。在具有组成型LG1 MSLN-CAR表达的7e5个常规CAR-T细胞的应激测试剂量下，肿瘤生长仅被部分抑制(图13B)。相比之下，ALPG PrimeR逻辑门控T细胞(LG1或LG3 T细胞)在相同剂量下产生优异的肿瘤生长抑制作用(图13B)。另外，基于通过流式细胞术获取的血液中工程化T细胞计数，与组成型表达CAR-T相比，表达逻辑门的T细胞在血液样本中显示出更强劲的扩增(图13D)。对外周血中发现的T细胞的流式分析显示逻辑门T细胞的CAR表达极少，证明了逻辑门限制CAR表达和对中靶肿瘤活性的保真度(图14A至图14D)。因此，逻辑门不仅通过门控CAR T细胞在启动抗原存在时的活性来增强CAR T细胞的特异性和安全性，而且还提高了T细胞疗法相对于组成型CAR的效力。
实施例3：体外shRNA表征
材料
mRNA水平敲低(qPCR)
对来自至少2例供体的T细胞进行工程化，以单独表达FMC63 CAR，或与指示的FAS、TOX、PTPN2或ZC3H12A shRNA模块一起表达。将来自供体的T细胞从leukopack中分离出来并激活(第0天)。在激活后48小时，对T细胞进行工程化(第2天)。为了对T细胞进行工程化，将靶向GS94的sgRNA与sNLS-SpCas9-sNLS核酸酶在室温下复合10分钟，形成核糖核蛋白混合物。将单独含有FMC63 CAR或含有FAS、TOX、PTPN2或ZC3H12AshRNA模块的质粒和补充Primary P3溶液添加到核糖核蛋白中并混合。将混合物添加到活化T细胞中并进行电穿孔。在电穿孔后，使用补充有12.5ng/mL IL-7和IL-15的新鲜培养基恢复工程化T细胞。在第3天和第5天，用补充有12.5ng/mL IL-7和IL-15的新鲜培养基补充工程化T细胞。
在编辑后六天，使用Dynabeads MyOne Streptavidin T1和生物素化抗EGFRt抗体进行磁富集。使高纯度的经编辑的T细胞群体溶解，并使用Dynabeads mRNA Direct纯化试剂盒提取mRNA。在提取后，使用Quant-it RiboGreen RNA测定试剂盒对mRNA进行定量，并使用SuperScript IV第一链合成试剂盒合成cDNA。然后使用cDNA，利用TaqMan FastAdvanced Master Mix以及RPL13A、FAS、PTPN2、ZC3H12A和TOX TaqMan测定进行实时定量逆转录PCR。
蛋白质水平敲低(流式细胞术)
使用R&D制造工艺，对来自至少2例供体的T细胞进行工程化，使其单独表达FMC63CAR或与指示的FAS shRNA模块一起表达。在编辑后六天，分别使用抗EGFRt PE和抗FASAF647对T细胞进行染色以确定EGFRt和FAS表达，并通过流式细胞术在Attune NxT流式细胞仪上进行分析。通过取EGFRt+细胞与EGFRt-细胞的FAS gMFI之比定量相对FAS表达。然后将该值以对照组的相对FAS表达作归一化以计算敲低。
针对双重shRNA敲低的T细胞工程化
使用Lymphoprep(STEMCELL Technologies)和EasySep人T细胞分离试剂盒(STEMCELL Technologies)从获自正常供体Leukopaks(STEMCELL Te chnologies)获得的外周血单核细胞(PBMC)富集T细胞。随后将T细胞在补充有3％人AB血清(Gemini Bio)和12.5ng/ml人IL-7和IL-15(Miltenyi优质级)的TexMACS培养基(Miltenyi 130-197-196)中用CD3/CD28 Dynabead以1:1珠粒:细胞比(ThermoFisher，40203D)激活，在37℃、5％ CO2下培养48小时，然后电穿孔。
通过将120μM靶向DNA序列的sgRNA(Synthego)GAGCCATGCTTG GCTTACGA(GS94，SEQID NO:307)、62.5μM sNLS-SpCas9-sNLS(Al devron)和P3缓冲液(Lonza)以5:1:3:6的体积比组合来制备CRISPR RNP，并将其在室温下孵育15分钟。将通过剂量滴定实验确定的最佳量的编码目标shRNA序列的质粒DNA(范围为0.5-3微克)与3.5μl RNP混合。对T细胞进行计数、去珠粒、以90X G离心10分钟，并以10^6个细胞/14.5μl添加有补充剂的P3(Lonza)重悬。将14.5μl T细胞悬浮液添加到DNA/RNP混合物中，转移到Lonza 384孔核比色皿条中，并在代码为EH-115的Lonza HT Nucleofector System中进行脉冲处理。使细胞在室温下静置15分钟，接着转移至96孔板(Sarstedt)中的补充有12.5ng/ml人IL-7和IL-15(Miltenyi优质级)的TexMACS培养基中。
使用上述非病毒电穿孔方法，对来自三例供体的T细胞进行工程化，使其单独表达抗间皮素(MSLN)CAR，或与双荧光素酶对照shRNA模块、FAS shRNA、FAS-TOX shRNA、TOX-PTPN2 shRNA、FAS-PTPN2 shRNA、ZC3H12A-PTPN2或FAS-NR4A1 shRNA一起表达。将细胞在初始激活后第9天冷冻并低温保存。在低温保存之前，从每种条件下取出等份细胞，并分别使用抗EGFRt和抗myc对T细胞进行染色以确定EGFRt和CAR表达，并通过流式细胞术在AttuneNxT上进行分析。
在下面和序列表中提供了shRNA的序列和示例性shRNA-mir模块：
FAS_11：TTAAGAATCTTTTCAAACACTA(SEQ ID NO:49)
FAS_13：TAATCTTAATCTTTCATCCTCT(SEQ ID NO:51)
PTPN2_14：TCTGACAAGAGCTTCACACTGA(SEQ ID NO:82)
PTPN2_1：TATAATACGACTTCACATCTTC(SEQ ID NO:72)
TOX_9：TAGGTGAGGATTCATTCCCGGT(SEQ ID NO:104)
TOX_4：TATGACTGCTACATCAAGCCAT(SEQ ID NO:99)
ZC3H12A：TTATTAAGAAGCATCTTGCTTA(SEQ ID NO:126)
NR4A1：TTAATCAGAAAAGTCACATACT(SEQ ID NO:144)
FAS_11-PTPN_14shRNA-miR模块：GTAAGTCGACTCGTTGGATCCCCACTACCCGGATCAACGCCCTAGGTTTATGTTTGGATGAACTGACATACGCGTATCCGTCTTAAGAATCTTTTCAAACACTAGTAGTGAAATATATATTAAACTAGTGTTTGAAAAGATTCTTATTACGGTAACGCGGAATTCGCAACTATTTTATCAATTTTTTGCGTCGACACTTCAAGGGGCTTGCGGCCGCAACCATCTCCATGGCTGTTTGAATGAGGCTTCAGTACTTTACAGAATCGTTGCCTGCACATCTTGGAAACACTTGCTGGGATTACTTCGACTTCTTAACCCAACAGAAGGCTCGAGAAGGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGCCAGTGTGAAGCTCTTGTCAGATAGTGAAGCCACAGATGTATCTGACAAGAGCTTCACACTGATGCCTACTGCCTCGGACTTCAAGGGGCTAGAATTCGAGCAATTATCTTGTTTACTAAAACTGAATACCTTGCTATCTCTTTGATACATTTTTACAAAGCTGAATTAAAATGGTATAAATTAAATCACTTTTTCATCTGACCAGTAGTGGACTAGTGTGACGCTGCTGACCCCTTTCTTTCCCTTCTACAG(SEQ ID NO:157)
在序列表中提供了另外的shRNA miR模块。
还将T细胞工程化以具有FAS和PTPN2双重敲除。
静息条件下的mRNA敲低
使用上述制造工艺，对来自四例供体的T细胞进行工程化，使其单独表达MSLNCAR，或与双荧光素酶对照shRNA、FAS-NR4A1 shRNA、FAS-TOX shRNA、FAS-PTPN2 shRNA、PTPN2-TOX shRNA或PTPN2-ZC3H12A shRNA模块一起表达。在编辑后六天，使用DynabeadsMyOne Streptavidin T1和生物素化抗EGFRt抗体进行磁富集。使高纯度的经编辑的T细胞群体溶解，并使用Dynabeads mRNA Direct纯化试剂盒提取mRNA。在提取后，使用Quant-itRiboGreen RNA测定试剂盒对mRNA进行定量，并使用SuperScript IV第一链合成试剂盒合成cDNA。然后使用cDNA，利用TaqMan Fast Advanced Master Mix以及RPL13A、FAS、PTPN2、TOX和ZC3H12A TaqMan测定进行实时定量逆转录PCR(RT-qPCR)。
静息条件下的蛋白质敲低
流式细胞术：使用制造工艺，对来自2例供体的T细胞进行工程化，使其单独表达MSLN CAR，或与双荧光素酶对照shRNA、FAS-NR4A1 shRNA、FAS-TOX shRNA、FAS-PTPN2shRNA、PTPN2-TOX shRNA或PTPN2-ZC3H12A shRNA模块一起表达。在编辑后六天以及此后六周每周一次，分别使用抗EGFRt PE和抗FAS FITC对T细胞进行染色以确定EGFRt和FAS表达，并通过流式细胞术在Attune NxT上进行分析。通过取EGFRt+细胞与EGFRt-细胞的FAS gMFI之比定量相对FAS表达。然后将该值以对照组的相对FAS表达作归一化。
蛋白质印迹：使用制造工艺，对来自4例供体的T细胞进行工程化，使其单独表达MSLN CAR，或与双荧光素酶对照shRNA、FAS-NR4A1 shRNA、FAS-TOX shRNA、FAS-PTPN2shRNA、PTPN2-TOX shRNA或PTPN2-ZC3H12A shRNA模块一起表达。在编辑后六天，使用Dynabeads MyOne Streptavidin T1和生物素化抗EGFRt抗体进行磁富集。然后使高纯度的经编辑的T细胞群体溶解并煮沸，以减少蛋白质并使蛋白质变性。使用Pierce BCA蛋白测定试剂盒定量总蛋白。然后将归一化的溶解物加载到SDS-PAGE凝胶中并运行。然后将蛋白质从凝胶转移至PVDF膜，封闭并针对RPL13A(对照)、FAS、NR4A1或PTPN2一抗和HRP缀合二抗进行染色。然后用Bio-Rad ChemiDoc对印迹进行成像，并对相对PTPN2表达进行定量。
慢性刺激条件下的mRNA敲低
使经编辑的CD3+T细胞接受MSLN+K562重复刺激14天，静息48小时，并进行RNA测序。
FAS介导的细胞凋亡
使用制造工艺，对来自6例供体的T细胞进行工程化，使其单独表达MSLN CAR，或与双荧光素酶对照shRNA、FAS-NR4A1 shRNA、FAS-TOX shRNA、FAS-PTPN2 shRNA、PTPN2-TOXshRNA或PTPN2-ZC3H12A shRNA模块一起表达。在编辑后六天，将T细胞与0、0.2、2或20ug/mL的抗FAS激活抗体一起培养24小时。将T细胞用EGFRt、活/死(live/dead)和Apotracker染色，并通过流式细胞术在Attune NxT上进行分析。经编辑的活细胞的频率计算为EGFRt+细胞中活/死-Apotracker-的百分比，然后将这些频率以使用0ug/mL抗FAS激活抗体的对照条件下的活细胞百分比作归一化。
细胞因子非依赖性生长测定
使用制造工艺，对来自2例供体的T细胞进行工程化，使其单独表达MSLN CAR，或与双荧光素酶对照shRNA、FAS-NR4A1 shRNA、FAS-TOX shRNA、FAS-PTPN2 shRNA、PTPN2-TOXshRNA或PTPN2-ZC3H12A shRNA模块一起表达。在编辑后十一天，将T细胞与12.5ng/mL IL-7和IL-15一起培养，或者在不存在外源细胞因子的情况下进行培养，并在细胞因子停用后第0、2、4和8天对经编辑的细胞的频率和活细胞的绝对数量进行定量。每一条件使用相对于第0天的经编辑的活细胞的倍数变化来作归一化。
细胞毒性测定
Incucyte：使用制造工艺，对来自三例供体的T细胞进行工程化，使其单独表达MSLN CAR，或与双荧光素酶对照shRNA、FAS-NR4A1 shRNA、FAS-TOX shRNA、FAS-PTPN2shRNA、PTPN2-TOX shRNA或PTPN2-ZC3H12A shRNA模块一起表达，并在初始激活后第9天进行冷冻和低温保存。在进行测定之前，将细胞解冻并在含有12.5ng/mL IL-7和IL-15的培养基中恢复。通过添加回经编辑的仅RNP T细胞，将经编辑的细胞的频率以最低编辑效率作归一化。然后将T细胞与经或未经工程化以表达CAR靶抗原MSLN的K562细胞以一比一比率共培养。在48小时的过程中，使用Incucyte对细胞培养物进行成像，并通过将活K562细胞数除以K562细胞总数，从1减去商并乘以100来计算杀伤百分比。
荧光素酶：使用CiTE制造工艺，对来自三例供体的T细胞进行工程化，使其单独表达SS1 CAR，或与双荧光素酶对照shRNA模块或FAS-PTPN2shRNA模块一起表达，并在初始激活后第9天进行冷冻和低温保存。在进行测定之前，将细胞解冻并在含有12.5ng/mL IL-7和IL-15的培养基中恢复。通过添加回经编辑的仅RNP T细胞，将经编辑的细胞的频率以最低编辑效率作归一化。然后将T细胞与经工程化以表达CAR靶抗原MSLN的MSTO细胞以指示比率共培养。在48小时后，进行Luc-Screen测定，并通过将每个样本的发光值除以仅肿瘤对照孔的发光值，从1减去商并乘以100来计算靶细胞杀伤百分比。
RSA
使用制造工艺，对来自三例供体的T细胞进行工程化，使其单独表达MSLN CAR，或与双荧光素酶对照shRNA、FAS-NR4A1 shRNA、FAS-TOX shRNA、FAS-PTPN2 shRNA、PTPN2-TOXshRNA或PTPN2-ZC3H12A shRNA模块一起表达，并在初始激活后第9天进行冷冻和低温保存。在进行测定之前，将细胞解冻并在含有12.5ng/mL IL-7和IL-15的培养基中恢复。在编辑后六天，使用Dynabeads MyOne Streptavidin T1和生物素化抗EGFRt抗体进行磁富集。通过流式细胞术在Attune NxT上用CountBright Plus Absolute计数珠粒对富集的编辑细胞进行计数。将85,000个经编辑的T细胞分配到96孔平底板的孔中，并通过以规定的效应物:靶标比分配K562来启始共培养。在初始富集后的第2、5、7、9和12天，通过流式细胞术对T细胞进行定量，并通过使用TTP LabTech Dragonfly液体处理仪分配K562细胞，将共培养物重新设置为所需的E:T比。在初始富集后第14天，通过如上所述进行基于抗EGFRt抗体的富集，对经编辑的T细胞进行RNAseq，使用流式细胞术将20,000个T细胞分配到384孔板的孔中，然后使用内部3’条形码计数批量RNAseq制备。使用Beckman Echo声学液体处理仪分配样本条形码化oligo-dT逆转录引物；进行逆转录，并使用Illumina Nextera XT区段化试剂盒将RT-PCR产物转化为测序文库，并在Illumina NovaSeq DNA测序仪上进行测序。通过EMDMillipore Luminex多重细胞因子试剂盒对第14天上清液中的细胞因子产生进行定量。
结果
mRNA水平敲低(qPCR)
FAS、PTPN2、TOX和ZC3H12A的mRNA敲低示于图18A至图18D中。实时定量逆转录PCR结果显示，在制造结束时针对FAS(图36A)、TOX(图36B)和PTPN2(图36C)的shRNA序列在经编辑的细胞中提供超过50％的敲低。ZC3H12A的最大敲低约为55％(图36D)。选择shRNA序列FAS_11、FAS_13、PTPN2_1、PTPN2_14、TOX_9、TOX_4、ZC3H12A_12、ZC3H12A_1、NR4A1_12和NR4A1_19(未显示)进行另外的表征。
蛋白质水平敲低(流式细胞术)
在制造结束时，靶向FAS的shRNA模块在经编辑的细胞中提供了超过50％的FAS蛋白敲低(图37)。
针对双重shRNA敲低的T细胞工程化
在制造结束时未观察到编辑效率或经编辑细胞收率的差异。shRNA-miR模块在9天细胞生产过程中不影响细胞扩增(图15A和图15B)。
静息条件下的mRNA敲低
多个shRNA在组合使用时表现出两种基因的稳健靶基因敲低(图16)。FAS-PTPN2模块在静息条件下对经编辑细胞中的FAS和PTPN2 mRNA的敲低超过50％(图16)。
静息条件下的蛋白质敲低
靶向FAS、PTPN2和TOX的shRNA模块在静息条件下在编辑后至少7周内提供稳定的FAS敲低(图17A)。在编辑后6天，FAS、PTPN2和NR4A1蛋白水平也显著降低(图17B)。当FASshRNA与PTPN2或TOX组合时，FAS蛋白减少至不到25％，当NR4A1 shRNA与FAS组合时，NR4A1蛋白减少至不到50％，并且当PTPN2 shRNA与FAS、TOX或ZC3H12A shRNA组合时，PTPN2蛋白减少至约或不到12％。因此，FAS、PTPN2和NR4A1的shRNA基因敲低在稳态条件下是稳健且持久的。
慢性刺激条件下的mRNA敲低
在整个慢性刺激过程中维持靶基因敲低(图18)。因此，FAS、PTPN2和NR4A1的shRNA基因敲低在慢性刺激条件下是稳健且持久的。
FAS介导的细胞凋亡
靶向FAS的shRNA模块导致足够的敲低，使对FAS介导的细胞凋亡的敏感性降低至少100倍(图19A和图19B)。图19A显示shRNA在细胞中有强烈的FAS敲低。图19B显示，在用抗FAS激活抗体处理24小时后，如以仅具有对照shRNA的T细胞作归一化，具有FAS敲低的T细胞保留超过80％的活力。因此，FAS shRNA-miR可防止FAS介导的T细胞凋亡。
细胞因子非依赖性生长测定
所有工程化T细胞在缺乏细胞因子支持的情况下死亡，并且未观察到细胞因子依赖性生长。因此，用组合shRNA模块工程化的T细胞没有表现出转化风险增加的证据(图20)，如细胞因子停用后工程化T细胞的死亡所表明的。
细胞毒性测定
所有敲低组合在体外均表现出相同的靶细胞杀伤。在用表达靶抗原的K562细胞系进行的48小时incucyte测定中，用组合shRNA模块工程化的T细胞或对照FAS-PTPN2敲除细胞(FAS-PTPN2 dKO)没有表现出细胞毒活性降低的证据(图21)。
另外，所有shRNA敲低组合在体外都表现出相当的杀伤动力学。在用表达靶抗原的MSTO细胞系进行的48小时荧光素酶测定中，用shRNA敲低模块工程化的T细胞没有表现出细胞毒活性降低的证据(图22)。
RSA
通过shRNA的PTPN2敲低增加了慢性抗原刺激期间的T细胞扩增(图23)。所有双shRNA模块在慢性抗原刺激期间增加IFNγ产生，Wilcoxon检验****＝p<0.0001，***＝p<0.001，ns＝p>0.05(图25)。PTPN2敲低T细胞还在慢性抗原刺激后表现出细胞周期特征(图24A和图24B)，并且在慢性抗原刺激后保留效应物特征(图26A和26B)。
因此，相对于表达靶向不相关对照基因的shRNA模块的对照工程化T细胞，用FAS-PTPN2 shRNA模块工程化的T细胞表现出约8倍的扩增(图23)、约2倍的干扰素γ表达(图25)以及强的效应T细胞功能(图26A和图26B)和细胞周期(图24A和图24B)特征。Wilcoxon检验****＝p<0.0001，***＝p<0.001，ns＝p>0.05。
实施例4：体内shRNA表征
材料
使用上述制造工艺，对来自三例供体的T细胞进行工程化，使其单独表达MSLNCAR，或与双荧光素酶对照shRNA模块或FAS-PTPN2 shRNA模块一起表达，并在初始激活后第9天进行冷冻和低温保存。在进行测定之前，将细胞解冻并在培养基中恢复，并使用经编辑的仅RNP T细胞以最低编辑效率作归一化。为了评价单独用MSLN CAR或用双荧光素酶对照shRNA模块或FAS-PTPN2 shRNA模块工程化的T细胞的功效，在间皮瘤皮下模型中进行体内测定。给NSG-MHC I/II dKO小鼠注射过表达MSLN的MSTO211H细胞。将100uL磷酸盐缓冲盐水(PBS)和Matrigel的1:1悬浮液中的MSTO211H细胞注入小鼠右侧腹。根据肿瘤体积将动物随机分为治疗组，并以0.25x106、0.5x106和2x106剂量将T细胞注射到尾静脉中。在治疗前和治疗开始后每周两次测量肿瘤体积，并计算为V＝(长度×宽度2)/2。
通过多参数流式细胞术监测已治疗小鼠外周血中SS1 CAR-T细胞的存在、扩增和持久性。在治疗后第7、14、21和28天从每只小鼠收集50uL血液。用ACK溶解缓冲液溶解血液以去除红细胞，并用针对以下物质的荧光标记抗体进行染色：鼠CD45和GR1；人CD3、CD4、CD8a、CCR7、CD27、CD45RA、EGFR、CD95和flag。接下来，将标记的样本加入计数珠粒进行归一化，之后通过Attune流式细胞仪进行流式细胞术分析。使用FlowJo软件对收集的FACS数据分析。
在第14天，从每组注射高CAR-T剂量的小鼠亚群(n＝3)中分离脾脏和肿瘤，并进行FAC以表征和定量CAR-T表型。
结果
在输注动物的同时，对每种条件进行表型分析以比较细胞的分化状态。如图13所示，T细胞中shRNA的表达没有改变工程化T细胞群体中的CD4或CD8％T细胞百分比，或T效应细胞(Te)、T效应记忆细胞(Tem)、T中央记忆细胞(Tcm)或记忆干T细胞(Tscm)的相对量，但DKO FAS/PTPN2修饰除外(图27)。因此，shRNA模块没有改变输注前T细胞的分化状态。
在体内治疗后，用FAS-PTPN2 shRNA-miR模块工程化的T细胞表现出改善的肿瘤控制(图28A)，并增加了外周(图28B)和肿瘤内经编辑的T细胞的积聚。表达CAR、或FAS、FAS/TOX或FS/PTPN2 shRNA的经编辑的T细胞在体内显著减少肿瘤体积(图28A)。与不含shRNA的单独CAR T细胞相比，FAS-PTPN2 shRNA T细胞显示出在外周血中10倍的扩增和增强的持久性(图28B)。因此，FAS-PTPN2敲低可增加T细胞扩增和肿瘤控制。
在剂量实验中，0.5x106剂量FAS-PTPN2 shRNA敲低T细胞和FAS-TOX shRNA敲低T细胞表现出比单独2x106 CAR更好或相当的肿瘤控制，表明在四分之一剂量下观察到了相当的肿瘤控制(图29)。因此，FAS和PTPN2或TOX敲低可以降低相似肿瘤治疗的剂量。
FAS-PTPN2驱动所有T细胞亚群的扩增，包括效应细胞和祖细胞。FAS-PTPN2和FAS-TOX组合导致脾脏中具有记忆表型的细胞频率更高，并且肿瘤中亚群的比例相似(图30A和图30B)。
此外，没有证据表明有与T细胞扩增增加相关的总毒性(图31)，如试验过程中小鼠体重所示。所有实验条件均未导致小鼠体重减轻。
实施例5：体外shRNA与ALPG/P和MSLN逻辑门共表达
材料和方法
双抗原依赖性细胞毒性测定
使用非病毒制造工艺，对来自四例供体的T细胞进行工程化，使其单独表达逻辑门1而不表达shRNA，或使完全优化的引导整合回路T细胞(ICT)结合表达逻辑门1与FAS/PTPN2shRNA盒(AB-1015，SEQ ID NO:168)，并在初始激活后第9天冷冻并低温保存。在测定之前，将来自同一供体的工程化T细胞和仅RNP对照T细胞解冻，并在包含12.5ng/mL人IL-7和IL-15的培养基中静置过夜。在测定当天，对工程化T细胞进行计数并分别使用抗myc PE和抗FLAG APC进行染色以确定PrimeR和CAR表达，并通过流式细胞术进行分析。对于每例供体，通过添加仅RNP细胞来稀释高于最低KI％的工程化细胞群体，将所有工程化T细胞群体以该供体内的最低KI％作归一化。在归一化后，将T细胞重悬于不含IL-7和IL-15的培养基中，并进行连续稀释，然后添加到96孔平底白壁测定板中。在以技术重复每孔添加1e4个靶细胞后，连续稀释T细胞产生以下共培养KI+效应物:靶标(E:T)比：3:1、1:1、1:3、1:9和1:27。将每个T细胞群体与K562-MSLN和K562-ALPG/MSLN共培养。将准备好的含有T细胞和靶细胞的板以300g离心沉降2分钟，然后在37℃下孵育72小时，每个板上盖有透气膜。使用终点荧光素酶测定测量72小时共培养结束时的细胞毒性。使用各受体抗原的标签化型式进行初级染色来定量PrimeR和CAR的表达，然后用荧光缀合二抗进行检测，并通过流式细胞术进行分析。
静息条件下的蛋白质敲低
流式细胞术：使用制造工艺，对来自2例供体的T细胞进行工程化，使其单独表达LG1(ALPG/P启动受体和MSLN CAR)(LG1 HTLV对照)，或与FAS-PTPN2 shRNA模块一起表达。在编辑后五天，分别使用ALPG-AF647和抗FAS FITC对T细胞进行染色以确定ALPG/P和FAS表达，并通过流式细胞术在Attune NxT上进行分析。流式细胞术直方图中显示了相对FAS表达。
结果
ALPG/P和MSLN逻辑门与FAS/PTPN2 shRNA的共表达在体外维持了逻辑门保真度和效力。如图32所示，表达逻辑门和shRNA的T细胞的孵育不诱导仅表达CAR抗原的K562-MSLN细胞的溶解。然而，与表达启动受体靶标ALPG的K562细胞一起孵育会导致靶细胞出现显著的剂量依赖性溶解，在最高比率下100％的靶细胞溶解。因此，shRNA与逻辑门的共表达并不影响启动受体和CAR的功能。
另外，相对于不含shRNA的LG1对照细胞，shRNA还表现出强的FAS敲低(图33)。因此，启动受体和CAR与shRNA的共表达不影响shRNA的功能。
实施例6：体内shRNA与ALPG/P和MSLN逻辑门共表达
材料和方法
使用上文实施例1中描述的工程化方法，对来自两例供体的T细胞进行工程化，使其表达LG1和FAS/PTPN2 shRNA(AB-1015，SEQ ID NO:168)或LG1和FAS/TOX shRNA。将细胞在初始激活后第9天冷冻并低温保存。对于质量控制(QC)测定，将来自同一供体的仅RNP对照T细胞解冻，并在包含12.5ng/mL人IL-7和IL-15的培养基中静置过夜。接下来，对工程化T细胞进行计数并分别使用抗myc PE和抗FLAG APC进行染色以确定PrimeR和CAR表达，并通过流式细胞术进行分析以评估KI％。
K526双侧腹体内研究
在NSG双MHC KO(NSG DKO)品系(Jackson Laboratories,025216)的左侧腹各植入1e6个K562-MSLN细胞，在右侧腹植入K562-ALPG/MSLN细胞，两种细胞均在50％ Matrigel溶液中。在K562细胞接种后第三天，使用测量荧光素酶信号以定量工程化肿瘤细胞的生物发光成像(BLI)，将小鼠随机分为肿瘤大小相匹配的治疗组，每个治疗条件分配7只小鼠。在分期和归一化的同一天，将工程化T细胞和匹配的RNP对照解冻，并在包含12.5ng/mL人IL-7和IL-15的培养基中静置过夜。在K562植入后第4天，对于每例供体，通过添加仅RNP的细胞来稀释高于最低KI％的工程化细胞群体，将所有工程化T细胞群体以该供体内的最低KI％作归一化。经尾静脉给小鼠静脉内注射5e6个KI+T细胞。通过卡尺每周两次监测双侧肿瘤体积以及体重。
结果
在体内双肿瘤NSG模型(图34A(供体二)和图34B(供体三))中，相对于LG1+双LucshRNA对照回路，将FAS/PTPN2 shRNA并入LG1回路中产生更大的抗肿瘤效力和同等的保真度。针对仅表达CAR抗原MSLN的细胞，未观察到肿瘤减小。当肿瘤细胞同时表达ALPG和MSLN时，观察到肿瘤体积减小。与仅ALPG/MSLN逻辑门相比，当工程化T细胞共表达FAS/PTPN2sRNA时观察到更大的肿瘤体积减小(图34A和图34B)。
在体内双肿瘤NSG模型(图35A(供体二)和图35B(供体三))中，LG1+FAS/TOX shRNA回路显示出与LG1+FAS/PTPN2回路相似的保真度和抗肿瘤效力。针对仅表达CAR抗原MSLN的细胞，未观察到肿瘤减小。当肿瘤细胞同时表达ALPG和MSLN时，观察到肿瘤体积减小。当工程化T细胞共表达FAS/TOX shRNA或FAS/PTPN2 sRNA时，观察到更大的肿瘤体积减小。在用共表达FAS/TOX shRNA或FAS/PTPN2 sRNA的T细胞治疗后，观察到相似的肿瘤体积减小(图35A和图35B)。
实施例7：体内卵巢肿瘤模型测定
使用上文实施例1中描述的工程化方法，对来自3例供体的T细胞进行工程化，使其表达AB-1015盒，其包括LG1(ALPG/P启动受体和MSLN CAR)以及FAS-PTPN2 shRNA模块。将T细胞在初始激活后第9天冷冻并低温保存。对于质量控制(QC)测定，将来自同一供体的仅RNP对照T细胞解冻，并在包含12.5ng/mL人IL-7和IL-15的培养基中静置过夜。对工程化T细胞进行计数并分别使用ALPG-AF647和MSLN-Bio一抗/链霉亲和素-PE二抗进行染色以确定启动受体和CAR表达，并通过流式细胞术进行分析以评估KI％。
向NSG双重MHC KO(NSG DKO)品系(Jackson Laboratories，025216)腹膜内植入表达ALPG和MSLN的OVCAR3-ALPG卵巢癌适应症特异性细胞系各1e7个细胞。如图56A所示，在肿瘤细胞接种后五天，基于OVCAR3-ALPG靶细胞表达的荧光素酶的生物发光测量，将小鼠随机分为肿瘤大小相匹配的治疗组，每个治疗条件分配10只小鼠。在分期和归一化的同一天，将工程化T细胞和匹配的RNP对照解冻，并在包含12.5ng/mL人IL-7和IL-15的培养基中静置过夜。在卵巢癌细胞系植入后第六天，经尾静脉给小鼠静脉内注射7.5e6个KI+T细胞(或匹配的RNP对照细胞总数)。通过发光测量每周2-3次监测肿瘤体积以及体重。
如图56B所示，AB-1015T细胞(LG1+FAS-PTPN2 shRNA模块)在卵巢癌细胞系肿瘤模型中诱导肿瘤杀伤和肿瘤生长抑制。与RNP对照细胞相比，AB-1015T细胞产生增强的肿瘤生长抑制。另外，图56C显示用AB-1015T细胞治疗不会导致体重减轻，并且小鼠耐受性良好。不希望受理论束缚，在体内小鼠异种移植肿瘤实验中，用全LG1+FAS/PTPN2回路工程化的T细胞驱动针对卵巢癌特异性模型的强效应答。
实施例8：FAS和其他基因的敲低和敲除改善了工程化造血细胞的特性
方法
FAS敲除(KO)与另外的基因测定的组合
用CD3/CD28磁珠刺激CD8 T细胞48小时。根据制造商的说明，使用Lonza 384孔Nucleofector系统，用靶向单个基因或两个基因组合的第一编码外显子的复合Cas9/crRNA/tracrRNA RNP转染500,000个细胞。crRNA文库总共靶向18个单独的基因，将这些基因在总共171个独立条件下以所有成对组合运行。以技术重复将每一条件在两个独立供体中运行，并且实验进行两次。显示的数据是两次实验的累积结果。在用RNP转染后，将细胞静置4天，然后用CD3/CD28磁珠以5:1的珠粒:细胞比刺激。在转染后第一次刺激后2、5、7、9和12天，将细胞去珠，通过流式细胞术计数，并用CD3/CD28珠以5:1珠/细胞比重新铺板。在测定结束时，通过流式细胞术定量活T细胞的数量，并通过nPlex ELISA定量上清液中细胞因子和其他效应分子的水平。
shRNA敲低测定
使用生物素化抗EGFRt(克隆528Thermo)和链霉亲和素缀合磁珠(MyOne T1Dynabeads)富集CAR T细胞。随后使富集的T细胞(>＝70％EGFRt+)溶解，并根据制造商的方案使用Dynabeads mRNA DIRECT试剂盒提取总RNA。使用Ribogreen定量-IT对纯化的RNA进行定量，并在使用SuperScript IV第一链合成系统合成cDNA之前进行归一化。然后使用合成的cDNA，使用TaqMan Fast Advanced Master Mix和用于每个各自的shRNA靶标的TaqMan探针进行qRT-PCR。用于RPL13A的TaqMan探针用于进一步归一化cDNA输入。捕获Cq值并采用Δ-Δ法来定量表达。敲低百分比以((1-ddCq)*100)计算。
FAS介导的细胞凋亡测定
将ICT细胞解冻并使用ALPG-Fc试剂和Protein G结合磁珠富集。随后将富集的T细胞(约50％ PrimeR+)与增加浓度的(0、0.2、2、20ug/mL)的FAS交联抗体(克隆CH11)一起培养22小时。将ICT细胞用ALPG、Apotracker和活力染料染色，并通过流式细胞术定量活细胞频率。将各剂量下的活力以0ug/mL激活抗FAS抗体下的样本作归一化，计算活细胞的相对频率。
体内双重敲低测定
将大量T细胞在CTS扩增珠粒中激活2天，并用CAS9蛋白、crRNA:tracrRNA复合物和CD19(FMC63-41BBz)HDR模板进行电穿孔，以产生具有或不具有FAS和另一目标基因的组合缺失的TRAC KI CAR T细胞。在电穿孔后，将细胞在含有3％人血清和重组IL-7和IL-15细胞因子的TexMAC中扩增8天。在扩增第4天，所有条件下的残余CD3+细胞均被耗尽。在激活后第10天，收集细胞，以CD3阴性T细胞作归一化，并重悬于TexMAC培养基中，以确保不同条件下的细胞密度和CAR+频率等同。将2.5e5个CAR T细胞静脉内过继转移至雄性NSG动物(n＝7/条件)中，这些动物在4天前接种了带有萤火虫报告基因的0.5e6个NALM6白血病细胞。在输注CAR T细胞前1天，通过生物发光成像(BLI)评估接种NALM6的动物的肿瘤负荷，以适当随机分组。每天监测动物的健康迹象，并使用IVIS光谱仪每周两次测量BLI。根据IACUC指南，当发现小鼠垂死时对其实施安乐死。
结果
如图38所示，敲除FAS改善了增殖和效应功能。FAS和其他基因的组合敲除相对于单独FAS(例如，相对于单独FAS，FAS+基因A/B/C/D的效应分子产生)或相对于其他基因(例如，相对于单独基因A/B/C，FAS+基因A/B/C增殖)也改善了增殖和效应功能。
如图39B所示，使用shRNA对FAS和其他靶标的稳健双重敲低(>50％)与维持的转基因表达一起得到证明。shRNA-miR模块提供了超过50％的对每个目标靶标的敲低，并且对EGFRt转基因的表达无有害影响。图39A提供了敲低系统的图解和示例性shRNA-CAR双构建体的图解。
如图40B所示，FAS敲低提供了>2倍改善的免于FAS介导的细胞凋亡的保护。在该测定中，shRNA-miR模块提供了几乎完全的免于FAS介导的细胞凋亡的保护。显示了三例代表性供体的平均值和SEM。示例性对照和shFAS系统的图解提供于图40A中。
如图41所示，在系统性NALM6模型中，FAS和其他基因的双重敲低增强了CAR T细胞(CD19-41BBZ敲入TRAC基因座中)的体内功效。与单独的对照CAR T细胞相比，FAS和其他基因双重敲低下的小鼠治疗提高小鼠的生存率。
实施例9：另外的shRNA和逻辑门构建体的表征
材料和方法
使用上文实施例1、实施例3和实施例4中描述的工程化方法，对来自三例供体(ABXFC_ICT 6、9、10)的T细胞进行工程化，使其表达三种LG1和FAS/PTPN2 shRNA构建体。通过慢病毒工程化产生表达SS1-CAR和TC-210(对照CAR基准)的对照细胞。未处理的细胞(UNT)用作阴性对照。将细胞在初始激活后第9天冷冻并低温保存。对于质量控制(QC)测定，将来自同一供体的工程化T细胞和对照T细胞解冻，并在包含12.5ng/mL人IL-7和IL-15的培养基中静置过夜。在第二天，对T细胞进行计数，洗涤，用Zombie-Aqua活力染料染色，分别使用ALPG-AF647和MSLN-Bio一抗/链霉亲和素-PE二抗进行染色以确定PrimeR和CAR表达，并通过流式细胞术用Attune NxT进行分析以评估KI％。流式细胞术测定结果表明，在制造后，AB-X逻辑门/shRNA构建体在测试的三例供体中的10％-20％的活T细胞中表达。
构建体的构建如下表1中所述。图42A提供了构建体布局的图解。
静息条件下的mRNA敲低
在编辑后六天，使用Dynabeads MyOne Streptavidin T1和生物素化抗EGFRt抗体进行磁富集。使高纯度的经编辑的T细胞群体溶解，并使用Dynabeads mRNA Direct纯化试剂盒提取mRNA。在提取后，使用Quant-it RiboGreen RNA测定试剂盒对mRNA进行定量，并使用SuperScript IV第一链合成试剂盒合成cDNA。然后使用cDNA，利用TaqMan FastAdvanced Master Mix以及FAS和PTPN2 TaqMan测定进行实时定量逆转录PCR(RT-qPCR)。
蛋白质水平敲低(流式细胞术)
在编辑后六天，分别使用抗EGFRt PE和抗FAS AF647对T细胞进行染色以确定EGFRt和FAS表达，并通过流式细胞术在Attune NxT流式细胞仪上进行分析。通过取EGFRt+细胞与EGFRt-细胞的FAS gMFI之比定量相对FAS表达。然后将该值以对照组的相对FAS表达作归一化以计算敲低。
蛋白质水平敲低(蛋白质印迹)
在编辑后六天，使用Dynabeads MyOne Streptavidin T1和生物素化抗EGFRt抗体进行磁富集。然后使高纯度的经编辑的T细胞群体溶解并煮沸，以减少蛋白质并使蛋白质变性。使用Pierce BCA蛋白测定试剂盒定量总蛋白。然后将归一化的溶解物加载到SDS-PAGE凝胶中并运行。然后将蛋白质从凝胶转移至PVDF膜，封闭并针对PTPN2一抗和HRP缀合二抗进行染色。然后用Bio-Rad ChemiDoc对印迹进行成像，并对相对PTPN2表达进行定量。
CD4和CD8比率和扩增
将根据上述方法制备的低温保存的T细胞解冻并在包含12.5ng/mL人IL-7和IL-15的培养基中静置过夜。在第二天，对T细胞进行计数，洗涤，用Zombie-Aqua活力染料染色，用FMO针对CD4和CD8染色作为门控对照，并通过流式细胞术用Attune NxT进行分析。
记忆表型分型
通过流式细胞术用细胞表面T细胞亚群标志物对如上所述用shRNA和逻辑门回路编辑的供体T细胞进行表型分析。将低温保存的T细胞解冻，计数，洗涤，并用Zombie-Aqua活力染料染色，或用FMO针对CD4、CD8、CD45RA和CCR7染色作为门控对照。通过流式细胞术用Attune NxT分析细胞。在FlowJo中，通过SSC和FSC选择单个活淋巴细胞，并使用CCR7和CD45RA组合进行亚群分析来鉴定CD4+和CD8+亚群体上的干细胞记忆-(SCM：CD45RA+CCR7+)、中央记忆-(CD45RA-CCR7+)、效应记忆-(CD45RA-CC R7-)或终末效应-(TEMRA：CD45RA+CCR7-)T细胞。
CAR转化
使用上述制造工艺，对来自两例供体(ABXFC_ICT 9、10)的T细胞进行工程化，使其表达三种LG1和FAS/PTPN2 shRNA构建体。将细胞在初始激活后第9天冷冻并低温保存。在测定之前，将工程化T细胞解冻，并在包含12.5ng/mL人IL-7和IL-15的培养基中静置过夜。然后，通过为期两天的基于MACS的过程，将PrimeR+T细胞富集至>95％的纯度。然后对T细胞进行计数，并以技术重复将5e4个T细胞铺板到96孔平底板的每孔中的含有500pg/mL IL-7和IL-15的200uL培养基中，之后以1:1E:T比添加K562ALPG细胞。将通过K562ALPG细胞进行PrimeR抗原刺激之前的单独T细胞样本以及在上述条件(每2-3天更换1/2培养基)下共培养24、96和144小时后收集的样本洗涤，用Zombie-Aqua活力染料染色，分别使用ALPG-AF647和MSLN-Bio一抗/链霉亲和素-PE二抗进行染色以确定PrimeR和CAR表达，并通过流式细胞术用Attune NxT进行分析。CAR转化％＝(％CAR+tx/％PrimeR+t0)*100
异质性细胞毒性测定
使用上述制造工艺，对来自三例供体(ABXFC_ICT 9、10)的T细胞进行工程化，使其表达三种LG1和FAS/PTPN2 shRNA构建体。将细胞在初始激活后第9天冷冻并低温保存。在测定之前，将来自同一供体的工程化T细胞和单独RNP对照T细胞解冻，并在包含12.5ng/mL人IL-7和IL-15的培养基中静置过夜。在测定当天，对工程化T细胞进行计数，并分别使用ALPG-AF647和MSLN-Bio一抗/链霉亲和素-PE二抗进行染色以确定PrimeR和CAR表达，并通过流式细胞术用Attune NxT进行分析。对于每例供体，通过添加仅RNP细胞来稀释高于最低KI％的工程化细胞群体，将所有工程化T细胞群体以该供体内的最低KI％作归一化。在归一化后，将T细胞重悬于不含IL-7和IL-15的培养基中，并以1:1KI+E:T与以不同比率混合以模拟不同水平的启动抗原异质性的1x104个K562MSLN和K562ALPG/MSLN一起添加到96孔平底白壁测定板中。将准备好的含有T细胞和靶细胞的板以300g离心沉降2分钟，然后在37℃下孵育72小时，每个板上盖有透气膜。使用终点荧光素酶测定测量72小时共培养结束时的细胞毒性。
结果
对于每个构建体观察到相似的转基因敲入效率(图42B)。由于暴露于ALPG+靶细胞时逻辑门对门CAR表达的功能，表达PrimeR的T细胞具有极少的CAR表达(图42C)。这些结果表明，使用所描述的制造工艺稳健地产生了表达AB-X逻辑门/shRNA回路构建体的T细胞。
所有工程化T细胞的KI+群体(或慢病毒转导的群体)以及RNP和未转导(UNT)对照的大量T细胞群体的CD4/CD8组成示于图42D中。对于所有逻辑门/shRNA回路和单独逻辑门，CD4:CD8比率相似。这些结果表明，与单独逻辑门相比，逻辑门和shRNA模块的整合没有改变表达逻辑门/shRNA全回路候选物的T细胞的CD4/CD8组成或扩增动力学(图42D)。
记忆表型分型显示LG1和FAS/PTPN2 shRNA回路具有一致的表型，与慢病毒基准(UNT、TC-210和SSI-CAR样本)相比差异较小(图43)。在所有三例供体中，编辑没有促进终末分化T细胞的扩增，因为两个亚群体中T细胞的主要亚群保留了CD45RA和CCR7的阳性表达(图43)。这表明经编辑的T细胞具有在体内扩增、存活和持续存在的能力。结果还表明，与单独逻辑门相比，逻辑门和shRNA模块的整合没有改变表达逻辑门/shRNA全回路候选物的T细胞的记忆表型组成。因此，经编辑的T细胞具有在体内扩增、存活和持续存在的能力。
所有构建体均展示出FAS(图44A)和PTPN2(图44B)的等同敲低。
三种逻辑门/shRNA回路(AB-1013、AB-1014和AB-1015)诱导ALPG依赖性CAR表达(图45)。在用PrimeR抗原刺激约100小时后，AB-X逻辑门/shRNA回路的ALPG依赖性CAR转化达到峰值，在不同候选物中观察到激活动力学相似，但CAR诱导程度不同。在ALPG接合后，AB-1015表现出PrimeR信号向CAR表达的最大相对转化(图45)。
在异质性测定中，三种逻辑门/shRNA回路以不同的效力杀伤启动抗原异源靶细胞群体(图46)。例如，AB-1015在存在最少启动抗原的情况下显示出最强效的应答(图46)。无论ALPG表达如何，组成型CAR对照T细胞都能同样良好地杀伤所有MSLN+靶细胞条件。从阴性对照仅RNP T细胞中未观察到细胞毒性。结合分析卵巢癌患者样本中抗原表达的IHC数据和启动抗原异质性细胞毒性测定的结果，表明逻辑门/shRNA T细胞能够消除仅在少数细胞上表达启动抗原的异质性癌细胞群体。
实施例10：另外的shRNA和LG回路的体内表征
材料和方法
使用上文实施例1中描述的工程化方法，对来自两例供体的T细胞进行工程化，使其表达如实施例9所述的三种LG1和FAS/PTPN2 shRNA回路。将细胞在初始激活后第9天冷冻并低温保存。对于质量控制(QC)测定，将来自同一供体的仅RNP对照T细胞解冻，并在包含12.5ng/mL人IL-7和IL-15的培养基中静置过夜。接下来，对工程化T细胞进行计数并分别使用抗myc PE和抗FLAG APC进行染色以确定PrimeR和CAR表达，并通过流式细胞术进行分析以评估KI％。
K526双侧腹体内研究
在NSG双MHC KO(NSG DKO)品系(Jackson Laboratories,025216)的左侧腹各植入1e6个K562-MSLN细胞，在右侧腹植入K562-ALPG/MSLN细胞，两种细胞均在50％ Matrigel溶液中。在K562细胞接种后第三天，使用测量荧光素酶信号以定量工程化肿瘤细胞的生物发光成像(BLI)，将小鼠随机分为肿瘤大小相匹配的治疗组，每个治疗条件分配7只小鼠。在分期和归一化的同一天，将工程化shRNA+LG1回路T细胞和匹配的仅CAR T细胞、仅逻辑门T细胞或RNP对照解冻，并在包含12.5ng/mL人IL-7和IL-15的培养基中静置过夜。在K562植入后第4天，对于每例供体，通过添加仅RNP的细胞来稀释高于最低KI％的工程化细胞群体，将所有工程化T细胞群体以该供体内的最低KI％作归一化。在第4天，经尾静脉给小鼠静脉内注射7.5x106个shRNA+LG1回路T细胞、仅CAR T细胞或仅逻辑门T细胞。通过卡尺每周两次监测双侧肿瘤体积以及体重。该研究于第24天终止。
结果
如图47A和图47B所示，仅CAR T细胞抑制MSLN/ALPG(图47B)和仅MSLN肿瘤(图47A)的生长。因此，MSLN CAR靶向表达MSLN的细胞。
另外，每个全shRNA+LG1回路T细胞在体内具有特异性并抑制K562MSLN/ALPG肿瘤的肿瘤生长(图47D)。全回路T细胞不抑制仅MSLN肿瘤细胞的生长(图47C)，并且因此显示出对双重表达MSLN和ALPG的细胞的选择性。
实施例11：另外的体外表征
材料和方法
连续刺激测定
使用ALPG-Fc试剂和Protein G Dynabeads将表达LG1回路、全shRNA+逻辑门回路或对照SS1-CAR或TC-210的经编辑的T细胞富集至>70％纯度。将经编辑的T细胞以8.5x104T个细胞/孔的浓度作归一化，并铺板到96孔板的250uL补充有3％人血清和50U/mL人IL-2的TexMacs培养基(Miltenyi)中，并以2:1效应物:靶标比与过表达ALPG和MSLN的K562共培养。在培养开始后第2、5、7、9和12天，通过流式细胞术对T细胞和靶标进行计数，并稀释孔以将T细胞数量重置为8.5x104，并且根据需要添加新鲜靶细胞以重置2:1E:T比。将T细胞扩增和靶标对照分别以共培养物中T细胞和K562细胞的累积扩增倍数定量。值为中位数±sem。Wilcoxon检验****<0.0001，ns>0.05
与CAR T细胞的比较测定
使用上文实施例1中描述的工程化方法，对来自三例供体(ABXFC_ICT 6、9、10)的T细胞进行工程化，使其表达如实施例9所述的三种LG1和FAS/PTPN2 shRNA回路。将细胞在初始激活后第9天冷冻并低温保存。在测定之前，将来自同一供体的工程化T细胞和对照T细胞解冻，并在包含12.5ng/mL人IL-7和IL-15的培养基中静置过夜。在测定当天，对工程化T细胞进行计数，并分别使用ALPG-AF647和MSLN-Bio一抗/链霉亲和素-PE二抗进行染色以确定PrimeR和CAR表达，并通过流式细胞术用Attune NxT进行分析。在归一化后，将T细胞重悬于不含IL-7和IL-15的培养基中，并进行连续稀释，然后添加到96孔平底白壁测定板中。在以技术重复每孔添加1e4个靶细胞后，连续稀释T细胞产生以下共培养KI+效应物:靶标(E:T)比：3:1、1:1、1:3、1:9、1:27和1:81。将每个T细胞群体分别与K562MSLN和K562ALPG/MSLN靶细胞共培养。将准备好的含有T细胞和靶细胞的板以300g离心沉降2分钟，然后在37℃下孵育72小时，每个板上盖有透气膜。使用终点荧光素酶测定测量72小时共培养结束时的细胞毒性。
为了进一步证明逻辑门/shRNA回路T细胞的特异性和功能活性，对取自细胞毒性测定中与K562肿瘤细胞的共培养孔中的上清液中的细胞因子产生进行评价，所述K562肿瘤细胞经工程化以表达不同的ALPG和MSLN组合(如上所述)。使用Luminex测定，分析上述细胞毒性测定中在72小时从1:1KI+E:T孔收集的上清液的IFNγ产生。与细胞毒性数据一致，AB-X逻辑门/shRNA候选T细胞的IFNγ产生仅限于存在双抗原K562ALPG/MSLN靶细胞的孔。相比之下，当与K562MSLN或K562ALPG/MSLN靶细胞共培养时，带有组成型CAR对照的T细胞产生IFNγ。这些数据进一步支持了这样一种观点：即AB-X逻辑门/shRNA候选T细胞的功能输出仅限于同时存在启动抗原和溶细胞抗原的条件。
细胞因子测定
对取自细胞毒性测定中与K562肿瘤细胞的共培养孔中的上清液中的细胞因子产生进行评价，所述K562肿瘤细胞经工程化以表达不同的ALPG和MSLN组合(如上所述)。使用Luminex测定，分析上述细胞毒性测定中在72小时从1:1KI+E:T孔收集的上清液的IFNγ产生。
多细胞系细胞毒性测定
将每个T细胞群体分别与K562-ALPG/MSLN、MSTO-ALPG/MSLN和SKOV3-ALPG/MSLN靶细胞共培养，以评估针对这三种不同中靶细胞系的T细胞应答效力。在以技术重复每孔添加1e4个靶细胞后，连续稀释T细胞产生以下共培养KI+效应物:靶标(E:T)比：3:1、1:1、1:3、1:9、1:27和1:81。将准备好的含有T细胞和靶细胞的板以300g离心沉降2分钟，然后在37℃下孵育72小时，每个板上盖有透气膜。使用终点荧光素酶测定测量72小时共培养结束时的细胞毒性。
细胞转化测定
将表达AB-1014、AB-1013或AB-1015shRNA+LG1回路的1x106个T细胞以0.56/ml的密度接种于24孔GRex板的一个孔中。将细胞在含有或不含细胞因子的TexMACS完全培养基(+3％HS)中培养5天。在第0、3、5和7天记录细胞数量和活力。作为阳性对照，在不含细胞因子的培养基中平行培养1x106个Jurkat细胞。
结果
仅表达LG1(AB-X逻辑门)的细胞显示出比SS1-CAR更好的肿瘤控制以及与TC-210等同的肿瘤控制(图48)。然而，与LG1 T细胞相比，三种shRNA+LG1回路T细胞(AB-1013、AB-1014和AB-1015)在连续刺激测定中显示出改善的T细胞扩增和肿瘤控制(例如，较少的肿瘤扩大)(图49)。每个供体以AB-X逻辑门的中值作归一化。
图50A显示，表达组成型抗MSLN CAR的T细胞杀伤K562MSLN和K562ALPG/MSLN细胞两者，而shRNA+逻辑门T细胞(AB-1013、AB-1014和AB-1015)的细胞毒性仅对双抗原K562ALPG/MSLN细胞具有特异性。在图50A中，针对K562MSLN细胞的细胞毒性用虚线显示，针对K562ALPG/MSLN细胞的细胞毒性用实线显示。从阴性对照仅RNP T细胞中未观察到细胞毒性。因此，逻辑门T细胞针对溶细胞抗原阳性细胞的细胞毒性仅限于同时存在启动抗原的条件。另外，将shRNA模块与逻辑门合并入全回路中没有导致逻辑门结合其靶抗原的特异性丧失。
与细胞毒性数据一致，逻辑门/shRNA回路T细胞的IFNγ产生仅限于具有双抗原K562ALPG/MSLN靶细胞的样本(图50B)。相比之下，当与K562MSLN或K562ALPG/MSLN靶细胞共培养时，带有组成型CAR对照的T细胞产生IFNγ。在将三种shRNA+LG1回路、CAR T细胞、LG1 T细胞或对照T细胞与对照K562或K652ALPG细胞一起孵育后，未观察到IFNγ表达(数据未显示)。因此，在细胞毒性和细胞因子测定中，逻辑门/shRNA回路T细胞均表现出相对于CAR T细胞提高的安全特性。不希望受理论束缚，该数据指示，逻辑门/shRNA回路T细胞的功能输出仅限于同时存在启动抗原和溶细胞抗原的条件。
与AB-1013和AB-1014相比，AB-1015的效力增加与K562MSLN细胞中ALPG非依赖性杀伤活性的适度增加以及IFNγ表达的增加相关(图51)。比较不同T细胞群体对K562-MSLN靶细胞的细胞毒性测定数据显示，相对于组成型CAR T细胞，LG1 T细胞对这些启动抗原阴性靶细胞的杀伤显著减少。在最高3:1E:T下，观察到相对于其他AB-X逻辑门/shRNA候选物，AB-1015对K562-MSLN靶标的杀伤持续增加。类似地，在与K562-MSLN靶标1:1E:T下，AB-1015和AB-1014均显示出小幅但显著的IFNγ分泌增加；然而，达到的水平是组成型CAR对照产生的水平的约1/100。总之，这些结果表明，相对于组成型CAR对照，逻辑门/shRNA回路显示的治疗窗口(针对K562-ALPG/MSLN靶细胞与K562-MSLN靶细胞的活性差异)显著改善。
还在另外的细胞系(MSTOALPG/MSLN和SKOV3ALPG/MSLN细胞)中评估了三种shRNA+LG1回路T细胞的活性。该细胞毒性测定的结果表明，三种逻辑门/shRNA回路的中靶效力(通过T细胞剂量的EC50计算)有明确的等级顺序。如图52所示，所有三种shRNA+逻辑门回路T细胞均诱导靶标杀伤。然而，AB-1015构建体对多种靶细胞系具有最强效的体外细胞毒性。在不同的靶向细胞系中，AB-1015T细胞的效力始终是AB-1013T细胞的约2-3倍，而AB-1014显示出相对中等的效力。总之，这些结果表明，逻辑门/shRNA回路可经工程化而具有可调的靶向效力。
另外，在用三种shRNA+LG1回路(AB-1013、AB-1014或AB-1015)编辑的T细胞中未观察到细胞转化(图53)。虽然阳性对照Jurkat细胞在整个测定过程中在没有细胞因子的情况下保持良好的活力和扩增，但shRNA+LG1回路T细胞在第3天后没有增殖或存活，表明shRNA+LG1回路T细胞没有被转化。
实施例12：MSLN CAR T细胞结合特异性
方法
细胞毒性测定
使用实施例1中描述的制造工艺，对来自四例供体的T细胞进行工程化，使其组成型表达MSLN CAR(LG1 CAR)，并在初始激活后第9天冷冻并低温保存。在测定之前，将工程化T细胞或仅RNP对照解冻，并在包含12.5ng/mL人IL-7和IL-15的培养基中静置过夜。在测定当天，对MSLN CAR和仅RNP对照T细胞进行计数，并将其重悬于不含IL-7和IL-15的培养基中，并连续稀释并添加到96孔平底白壁测定板中。在以技术重复每孔添加1e4个THP-1或K562(阴性对照)、K562-MSLN(阳性对照)和K562-GP2靶细胞后，连续稀释T细胞产生以下共培养效应物:靶标(E:T)比：3:1、1:1、1:3。将准备好的含有T细胞和靶细胞的板在37℃下孵育24小时，每个板上盖有透气膜。使用终点荧光素酶测定测量24小时共培养结束时的细胞毒性。
多反应性测定
对来自四例供体的T细胞进行工程化，使其表达如上所述的MSLN CAR。以技术重复将CAR T细胞与三种不同细胞系A498和H1975共培养，最终效应物:靶标(E:T)比为3:1、1:1、1:3。将准备好的含有T细胞和靶细胞的板在37℃下孵育24小时，每个板上盖有透气膜。使用终点荧光素酶测定测量24小时共培养结束时的细胞毒性。
结果
如图54A所示，MSLN CAR T细胞未识别SLC2A9+细胞(THP-1细胞)。另外，如图54D所示，MSLN CAR T细胞未识别GP2+细胞或K562阴性对照细胞(图54B)，但确实与表达MSLN的阳性对照细胞结合(图54C)。此外，未观察到MSLN CAR细胞针对A498细胞或H1975细胞的多反应性的证据(图55)。
尽管本发明已参考优选实施方案和各种替代性实施方案进行特定显示和描述，但相关领域技术人员将了解可在不脱离本发明的精神和范围下在其中进行各种形式和细节变化。
在本说明书的主体内引用的所有参考文献、授权专利和专利申请都据此出于所有目的以引用的方式整体并入。
非正式序列表

Claims (32)

1.一种或多种重组核酸，其中所述一种或多种重组核酸编码：
a.包含启动受体的第一嵌合多肽，所述启动受体包含特异性地结合胎盘/生殖细胞碱性磷酸酶(ALPG/P)的第一细胞外抗原结合结构域，其中所述第一细胞外抗原结合结构域包含可变重(VH)链序列和可变轻(VL)链序列，所述可变重(VH)链序列包含三个重链CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述可变轻(VL)链序列包含三个轻链CDR序列CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中：
i.CDR-H1包含SEQ ID NO:1所示的序列，
ii.CDR-H2包含SEQ ID NO:2所示的序列，
iii.CDR-H3包含SEQ ID NO:3所示的序列，
iv.CDR-L1包含SEQ ID NO:4所示的序列，
v.CDR-L2包含SEQ ID NO:5所示的序列，并且
vi.CDR-L3包含SEQ ID NO:6所示的序列；
b.包含嵌合抗原受体(CAR)的第二嵌合多肽，所述嵌合抗原受体(CAR)包含特异性地结合至间皮素(MSLN)的第二细胞外抗原结合结构域，并且其中所述第二细胞外抗原结合结构域包含可变重(VH)链序列，所述可变重(VH)链序列包含三个重链CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中：
i.CDR-H1包含SEQ ID NO:14所示的序列，
ii.CDR-H2包含SEQ ID NO:15所示的序列，并且
iii.CDR-H3包含SEQ ID NO:16所示的序列；或者
iv.CDR-H1包含SEQ ID NO:10所示的序列，
v.CDR-H2包含SEQ ID NO:11所示的序列，并且
vi.CDR-H3包含SEQ ID NO:12所示的序列；
c.第一核酸序列，所述第一核酸序列与包含SEQ ID NO:39所示序列的编码人FAS的mRNA的核苷酸1126至1364互补，以及
d.第二核酸序列，所述第二核酸序列与包含SEQ ID NO:40所示序列的编码人PTPN2的mRNA的核苷酸518至559互补，或者与包含SEQ ID NO:41所示序列的编码人TOX的mRNA的核苷酸1294至2141互补。
2.如权利要求1所述的重组核酸，其中所述第一细胞外抗原结合结构域VH链序列包含SEQ ID NO:7所示的序列。
3.如权利要求1或2所述的重组核酸，其中所述第一细胞外抗原结合结构域VL链序列包含SEQ ID NO:8所示的序列。
4.如权利要求1-3中任一项所述的重组核酸，其中所述第一细胞外抗原结合结构域包含SEQ ID NO:9所示的序列。
5.如权利要求1-4中任一项所述的重组核酸，其中所述第二细胞外抗原结合结构域VH包含如SEQ ID NO:17所示的序列。
6.如权利要求1-4中任一项所述的重组核酸，其中所述第二细胞外抗原结合结构域VHH链序列包含SEQ ID NO:13所示的序列。
7.如权利要求1-6中任一项所述的重组核酸，其中所述重组核酸包含选自由SEQ IDNO:168、167或166所示序列组成的组的序列。
8.一种重组核酸，所述重组核酸包含长度为至少15个核苷酸的核酸序列，所述核酸序列与包含SEQ ID NO:39所示序列的编码人FAS的mRNA的核苷酸1126至1364互补。
9.一种重组核酸，所述重组核酸包含长度为至少15个核苷酸的核酸序列，所述核酸序列与包含SEQ ID NO:40所示序列的编码人非受体型蛋白酪氨酸磷酸酶2(PTPN2)的mRNA的核苷酸518至559互补。
10.一种重组核酸，所述重组核酸包含长度为至少15个核苷酸的核酸序列，所述核酸序列与包含SEQ ID NO:41所示序列的编码人胸腺细胞选择相关高迁移率族盒(TOX)的mRNA的核苷酸1294至2141互补。
11.一种或多种重组核酸，所述重组核酸包含长度为至少15个核苷酸的第一核酸序列，所述第一核酸序列与包含SEQ ID NO:39所示序列的编码人FAS的mRNA的核苷酸1126至1364互补；和长度为至少15个核苷酸的第二核酸序列，所述第二核酸序列与包含SEQ ID NO:40所示序列的编码人PTPN2的mRNA的核苷酸518至559互补。
12.一种或多种重组核酸，所述重组核酸包含长度为至少15个核苷酸的第一核酸，所述第一核酸与包含SEQ ID NO:39所示序列的编码人FAS的mRNA的核苷酸1126至1364互补；和长度为至少15个核苷酸的第二核酸，所述第二核酸与包含SEQ ID NO:41所示序列的编码人TOX的mRNA的核苷酸1294至2141互补。
13.一种结合至胎盘/生殖细胞碱性磷酸酶(ALPG/P)的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含可变重(VH)链序列和可变轻(VL)链序列，所述可变重(VH)链序列包含三个重链CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述可变轻(VL)链序列包含三个轻链CDR序列CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中：
a.CDR-H1包含SEQ ID NO:1所示的序列，
b.CDR-H2包含SEQ ID NO:2所示的序列，
c.CDR-H3包含SEQ ID NO:3所示的序列，
d.CDR-L1包含SEQ ID NO:4所示的序列，
e.CDR-L2包含SEQ ID NO:5所示的序列；并且
f.CDR-L3包含SEQ ID NO:6所示的序列。
14.一种启动受体，所述启动受体包含特异性地结合胎盘/生殖细胞碱性磷酸酶(ALPG/P)的细胞外抗原结合结构域；包含一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点的跨膜结构域；和包含人或人源化转录效应物的细胞内结构域，其中所述细胞外抗原结合结构域包含可变重(VH)链序列和可变轻(VL)链序列，所述可变重(VH)链序列包含三个重链CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述可变轻(VL)链序列包含三个轻链CDR序列CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中：
g.CDR-H1包含SEQ ID NO:1所示的序列，
h.CDR-H2包含SEQ ID NO:2所示的序列，
i.CDR-H3包含SEQ ID NO:3所示的序列，
j.CDR-L1包含SEQ ID NO:4所示的序列，
k.CDR-L2包含SEQ ID NO:5所示的序列；并且
l.CDR-L3包含SEQ ID NO:6所示的序列。
15.一种嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体(CAR)包含特异性地结合至间皮素(MSLN)的细胞外抗原结合结构域，其中所述细胞外抗原结合结构域包含可变重(VH)链序列，所述可变重(VH)链序列包含三个重链CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中：
a.CDR-H1包含SEQ ID NO:14所示的序列，
b.CDR-H2包含SEQ ID NO:15所示的序列，并且
c.CDR-H3包含SEQ ID NO:16所示的序列。
16.一种嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体(CAR)包含特异性地结合至间皮素(MSLN)的细胞外抗原结合结构域，其中所述细胞外抗原结合结构域包含单结构域抗体，所述单结构域抗体包含可变重(VHH)链序列，所述可变重(VHH)链序列包含三个重链CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中：
a.CDR-H1包含SEQ ID NO:10所示的序列，
b.CDR-H2包含SEQ ID NO:11所示的序列，并且
c.CDR-H3包含SEQ ID NO:12所示的序列。
17.一种包含第一嵌合多肽和第二嵌合多肽的系统，其中
a.所述第一嵌合多肽包含启动受体，所述启动受体包含特异性地结合胎盘/生殖细胞碱性磷酸酶(ALPG/P)的第一细胞外抗原结合结构域，其中所述第一细胞外抗原结合结构域包含可变重(VH)链序列和可变轻(VL)链序列，所述可变重(VH)链序列包含三个重链CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述可变轻(VL)链序列包含三个轻链CDR序列CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中：
i.CDR-H1包含SEQ ID NO:1所示的序列，
ii.CDR-H2包含SEQ ID NO:2所示的序列，
iii.CDR-H3包含SEQ ID NO:3所示的序列，
iv.CDR-L1包含SEQ ID NO:4所示的序列，
v.CDR-L2包含SEQ ID NO:5所示的序列，并且
vi.CDR-L3包含SEQ ID NO:6所示的序列；并且
b.所述第二嵌合多肽包含嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体(CAR)包含特异性地结合间皮素(MSLN)的第二细胞外抗原结合结构域，其中所述第二细胞外抗原结合结构域包含可变重(VH)链序列，所述可变重(VH)链序列包含三个重链CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中：
i.CDR-H1包含SEQ ID NO:14所示的序列，
ii.CDR-H2包含SEQ ID NO:15所示的序列，并且
iii.CDR-H3包含SEQ ID NO:16所示的序列；或者
iv.CDR-H1包含SEQ ID NO:10所示的序列，
v.CDR-H2包含SEQ ID NO:11所示的序列，并且
vi.CDR-H3包含SEQ ID NO:12所示的序列。
18.一种表达载体，所述表达载体包含实施方案1至12中任一项所述的重组核酸。
19.一种免疫细胞，所述免疫细胞包含：
a.至少一种权利要求1至12中任一项所述的重组核酸；和/或
b.权利要求13-17中任一项所述的抗体或抗原片段、启动受体、CAR或系统；和/或
c.权利要求18所述的载体。
20.一种原代免疫细胞，所述原代免疫细胞包含至少一种重组核酸，所述重组核酸包含
a.启动受体，所述启动受体包含特异性地结合至ALPG/P的第一细胞外抗原结合结构域；
b.嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包含特异性地结合至MSLN的第二细胞外抗原结合结构域；
c.长度为至少15个核苷酸的第一核酸序列，其中所述第一核酸序列与包含SEQ ID NO:39所示序列的编码人FAS的mRNA的核苷酸1126至1364互补；和长度为至少15个核苷酸的第二核酸序列，其中所述第二核酸序列：
i.与包含SEQ ID NO:40所示序列的编码人PTPN2的mRNA的核苷酸518至559互补，或者
ii.与包含SEQ ID NO:41所示序列的编码人TOX的mRNA的核苷酸1294至2141互补；
其中所述重组核酸插入所述原代免疫细胞的基因组的靶区中，并且其中所述原代免疫细胞不包含用于将所述重组核酸引入所述原代免疫细胞中的病毒载体。
21.一种原代免疫细胞，所述原代免疫细胞包含至少一种重组核酸，所述重组核酸包含：包含SEQ ID NO:49所示序列的第一核酸；和包含SEQ ID NO:82所示序列的第二核酸，所述重组核酸插入所述原代免疫细胞的基因组的靶区中，并且其中所述原代免疫细胞不包含用于将所述重组核酸引入所述原代免疫细胞中的病毒载体。
22.一种原代免疫细胞，所述原代免疫细胞包含至少一种重组核酸，所述重组核酸包含：包含SEQ ID NO:49所示序列的第一核酸；和包含SEQ ID NO:SEQ ID NO:99或104所示序列的第二核酸，所述重组核酸插入所述原代免疫细胞的基因组的靶区中，并且其中所述原代免疫细胞不包含用于将所述重组核酸引入所述原代免疫细胞中的病毒载体。
23.一种活的无病毒的原代细胞，所述活的无病毒的原代细胞包含核糖核蛋白(RNP)-重组核酸复合物，其中所述RNP包含核酸酶结构域和指导RNA，并且其中所述重组核酸编码：
a.启动受体，所述启动受体包含特异性地结合至ALPG/P的第一细胞外抗原结合结构域；
b.嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包含特异性地结合至MSLN的第二细胞外抗原结合结构域；
c.长度为至少15个核苷酸的第一核酸序列，其中所述第一核酸序列与包含SEQ ID NO:39所示序列的编码人FAS的mRNA的核苷酸1126至1364互补；和长度为至少15个核苷酸的第二核酸序列，其中所述第二核酸序列
i.与包含SEQ ID NO:40所示序列的编码人PTPN2的mRNA的核苷酸518至559互补，或者
ii.与包含SEQ ID NO:41所示序列的编码人TOX的mRNA的核苷酸1294至2141互补；并且
d.其中所述重组核酸的5’端和3’端包含与所述原代细胞的基因组中的插入位点侧翼的基因组序列同源的核苷酸序列。
24.一种活的无病毒的原代细胞，所述活的无病毒的原代细胞包含核糖核蛋白复合物(RNP)-重组核酸复合物，其中所述RNP包含核酸酶结构域和指导RNA，其中重组核酸包含：包含SEQ ID NO:49所示序列的第一核酸；和包含SEQ ID NO:82所示序列的第二核酸，并且其中所述重组核酸的5’端和3’端包含与所述原代细胞的基因组中的插入位点侧翼的基因组序列同源的核苷酸序列。
25.一种活的无病毒的原代细胞，所述活的无病毒的原代细胞包含核糖核蛋白复合物(RNP)-重组核酸复合物，其中所述RNP包含核酸酶结构域和指导RNA，其中重组核酸包含：包含SEQ ID NO:49所示序列的第一核酸；和包含SEQ ID NO:SEQ ID NO:99或104所示序列的第二核酸，并且其中所述重组核酸的5’端和3’端包含与所述原代细胞的基因组中的插入位点侧翼的基因组序列同源的核苷酸序列。
26.一种细胞群体，所述细胞群体包含多个权利要求19至25中任一项所述的免疫细胞。
27.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求19至25中任一项所述的免疫细胞或权利要求26所述的细胞群体，以及药学上可接受的赋形剂。
28.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1至12中任一项所述的重组核酸或权利要求18所述的载体，以及药学上可接受的赋形剂。
29.一种编辑免疫细胞的方法，所述方法包括：
a.提供核糖核蛋白(RNP)-重组核酸复合物，其中所述RNP包含核酸酶结构域和指导RNA，其中所述重组核酸包含权利要求1至12中任一项所述的重组核酸，并且其中所述重组核酸的5’端和3’端包含与所述免疫细胞的基因组中的插入位点侧翼的基因组序列同源的核苷酸序列；
b.以非病毒方式将所述RNP-重组核酸复合物引入所述免疫细胞中，其中所述指导RNA与所述原代免疫细胞的基因组的靶区特异性地杂交，并且其中所述核酸酶结构域使所述靶区裂解以产生在所述免疫细胞的基因组中的所述插入位点；以及
c.通过将权利要求1至12中任一项所述的重组核酸插入所述免疫细胞的基因组中的所述插入位点中来编辑所述免疫细胞。
30.一种治疗受试者的疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用权利要求18-26中任一项所述的免疫细胞或权利要求27或28所述的药物组合物。
31.一种诱导免疫细胞中嵌合抗原受体与启动受体的表达的方法，所述方法包括：
a.获得免疫细胞，所述免疫细胞包含
i.1至12中任一项所述的重组核酸；和/或
ii.权利要求18所述的载体；以及
b.使所述免疫细胞与表达ALPG/P和MSLN的靶细胞接触，其中所述启动受体与所述靶细胞上的ALPG/P的结合诱导所述启动受体的激活和所述嵌合抗原受体的表达。
32.一种调节免疫细胞的活性的方法，所述方法包括：
a.获得免疫细胞，所述免疫细胞包含
i.权利要求1至12中任一项所述的重组核酸；和/或
ii.权利要求18所述的载体；以及
b.使所述免疫细胞与表达ALPG/P和MSLN的靶细胞接触，其中所述启动受体与所述靶细胞上的ALPG/P的结合诱导所述启动受体的激活和所述嵌合抗原受体的表达，并且其中所述嵌合抗原受体与所述靶细胞上的MSLN的结合调节所述免疫细胞的活性。
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