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CN118843642A - 针对FRα的结合分子 - Google Patents

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CN118843642A
CN118843642A CN202380024719.6A CN202380024719A CN118843642A CN 118843642 A CN118843642 A CN 118843642A CN 202380024719 A CN202380024719 A CN 202380024719A CN 118843642 A CN118843642 A CN 118843642A
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seq
amino acid
acid sequence
antigen
antibody
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F·尼尔
R·多德
P·弗兰克尔
J·泽隆-梅迪纳库伊兰
C·瓦尔德
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AstraZeneca AB
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Abstract

本披露提供了针对FRa的结合分子(例如抗体或其抗原结合片段)和相关的抗体‑药物缀合物，以及包含它们的药物组合物和试剂盒。还提供了使用所述结合分子和相关的抗体‑药物缀合物治疗癌症的方法。

Description

针对FRα的结合分子
技术领域
本发明涉及用于治疗癌症的针对FRα的结合分子(例如，抗体或其抗原结合片段)和相关的抗体-药物缀合物。
背景技术
尽管对癌症发病机制进行了多年研究并开发了许多潜在的抗癌药物，但癌症仍然是全球最主要的疾病之一。特别地，肺癌和卵巢癌在女性最常见的癌症中分别排第三和第五。化疗和放疗是最常见的癌症治疗。然而，这些疗法与各种负面的副作用(包括疲劳、恶心和脱发)关联。由于化疗治疗需长时间频繁施用，使得这些问题变得复杂。在过去的几十年中，已经开发并推向市场了多种针对癌症的抗体疗法，导致对多种癌症类型的常规化疗形式的需求减少。尽管在此期间生产抗体(例如，单克隆抗体)的方法的可用性已大大提高，但临床上可用的抗癌抗体相对较少，可用于靶向多种癌症类型的抗体甚至更少。此外，需要增加治疗性抗体的效力，而效力通常受限于靶抗原表达的普遍性和抗体结合后对癌细胞的后续作用。将单克隆抗体与细胞毒性分子缀合以生成抗体药物缀合物(ADC)是为恶性肿瘤递送靶向疗法的新方法。这种方法已针对特定靶点(HER2、CD30和CD79b)成功实施，使得例如德喜曲妥珠单抗(fam-trastuzumab deruxtecan-nxki)(乳腺癌和胃癌)、维布妥昔单抗(brentuximab vedotin)(霍奇金淋巴瘤)和泊洛妥珠单抗(polatuzumab vedotin-piiq)(非霍奇金淋巴瘤)等ADC分别上市。
叶酸受体(FR)是存在于细胞表面的膜结合蛋白，因此可用于开发新的ADC。FR家族包括FRα、FRβ、FRγ和FRδ。FR与叶酸分子结合并将其转运到细胞中，从而叶酸分子被递送到叶酸循环以支持核苷酸的代谢。特别地，叶酸对于DNA合成、甲基化和修复很重要(Cheung,等人,Oncotarget.[肿瘤靶点]2016；7(32):52553-52574)。
FRα是糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定膜蛋白，其对叶酸的活性形式5-甲基四氢叶酸(5-MTF)具有高亲和力。FRα由FOLR1基因表达。先前的研究表明，FRα在胚胎发生中起着至关重要的作用(Kelemen,IntJCancer.[国际癌症期刊]2006；119(2):243-250)。然而，成人的叶酸转运主要是由还原型叶酸运载体和质子偶联叶酸转运体的普遍表达驱动的(Zhao等人,Annu Rev Nutr.[营养年度回顾]2011；31:177-201)。在成人中FRα的表达分布通常局限于极化上皮细胞的顶面，如脉络丛、肾、肺和胎盘。
FRα(也称为叶酸受体1(FOLR1)或叶酸结合蛋白(FBP))的过度表达经常在肿瘤细胞例如卵巢癌、肺癌(例如非小细胞肺癌(NSCLC))和乳腺癌中观察到(Shi等人,DrugDesDevel Ther.[药物、设计开发与治疗]2015；9:4989-4996)。特别是，先前的研究发现卵巢癌患者血液中可溶性FRα的水平升高，这支持了FRα作为早期卵巢癌生物标志物的潜在应用(Basal等人，PLoS One.[公共科学图书馆：综合]2009；4(7):e6292)。临床前卵巢模型还揭示了FRα的过度表达与肿瘤进展相关，叶酸与FRα的结合可以介导促癌基因STAT3的激活(Hansen等人,CellSignal.[细胞信号传导]2015；27(7):1356-1368)。
现有技术中针对FRα的抗体存在例如内化性差、半衰期短、细胞毒性不足的缺陷。此外，在本领域中靶向FRα的ADC使用微管抑制剂，这些抑制剂在临床试验中与特定毒性相关，临床试验为例如角膜炎症(索星-米妥昔单抗(mirvetuximab soravtansine)，其由通过磺基-SPBD接头与美登木素生物碱弹头DM4缀合的抗FRα抗体M9346A组成)(Moore等人(2017)Cancer[癌症]123:3080-7)、间质性肺病(MORAb-202，其由与艾立布林(eribulin)弹头缀合的源自LK26的人源化抗体法妥组单抗(farletuzumab)组成)(Sato等人(2020)ESMO摘要https://doi.org/10.1016/j.annonc.2020.01.026)，以及神经病和嗜中性白血球减少症(STRO-002，它由与哈米特林(hemiasterlin)弹头缀合的抗FRα抗体SP8166组成)(Naumann等人(2021)J Clin Oncol[临床肿瘤学杂志]39(增刊15/abstr 5550)https://doi10.1200/JCO.2021.39.15_suppl.5550)。最近的研究还发现癌细胞可能获得对微管抑制剂的抗性(Ganguly等人,Biochim Biophys Acta.[生物化学与生物物理学报：生物膜]2011年12月；1816(2):164–171)。
此外，最近的靶向FRα的ADC使用了具有复杂结构的抗体。例如，ADC IMGN151是从ADC索星-米妥昔单抗开发而来的。IMGN151抗体是不对称、双互补位和双特异性分子，其含有杵臼结构(Knob-in-Hole)突变以实施异源二聚化。该抗体的一半由IgG1重链和轻链组成，其可变结构域与米妥昔单抗(mirvetuximab)共享。另一半由结合到FRα上第二个不同表位的scFv-Fc融合蛋白组成。IgG的修饰可能在物理化学特性(以及因此的可开发性或可制造性)和免疫原性方面具有负面影响。已知双特异性形式更倾向于降低表达滴度和增加聚集，这可能导致生产过程更复杂和商品成本增加。另一方面，对于药物的位点特异性缀合，STRO-002抗体在每条重链上的两个确定位点包括非天然氨基酸对叠氮甲基苯丙氨酸(pAMF)。虽然是特定的，但非天然氨基酸的引入可能需要大量的无细胞系或无细胞工程努力，并可能导致mAb生产滴度降低。
因此，需要开发靶向FRα的ADC，它可以将高浓度的细胞毒性有效载荷递送到靶细胞，并介导高效的肿瘤细胞杀伤，同时对患者的毒性较小。
发明内容
本发明尤其提供了针对FRα的抗体，包括核酸分子、载体、宿主细胞、包含其的药物组合物和试剂盒，以及包括治疗方法在内的其用途。
在一方面，提供了抗FRα抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含：
(a)SEQ ID NO:1的重链CDR1(SDSATWN)、SEQ ID NO:2的重链CDR2(RTYYRSKWYNDYAVSVKS)、SEQ ID NO:3的重链CDR3(GVGSFDY)、SEQ ID NO:4的轻链CDR1(RASQSISSWLA)、SEQ ID NO:5的轻链CDR2(KASGLES)、以及SEQ ID NO:6的轻链CDR3(QQYNSYSQLT)；
(b)SEQ ID NO:7的重链CDR1(SYAMS)、SEQ ID NO:8的重链CDR2(SISSGRSYIYYADSVKG)、SEQ ID NO:9的重链CDR3(EMQQLALDY)、SEQ ID NO:10的轻链CDR1(RASQGISNFLA)、SEQ ID NO:11的轻链CDR2(AASSLQS)、以及SEQ ID NO:12的轻链CDR3(QQYNSYPFT)；
(c)SEQ ID NO:13的重链CDR1(SNSAAWN)、SEQ ID NO:14的重链CDR2(RTYYRSNWYNDYTLSVKS)、SEQ ID NO:15的重链CDR3(GVGRFDS)、SEQ ID NO:16的轻链CDR1(RASQSISSWLA)、SEQ ID NO:17的轻链CDR2(KASSLES)、以及SEQ ID NO:18的轻链CDR3(QEYKTYSIFT)；
(d)SEQ ID NO:19的重链CDR1(SYNMN)、SEQ ID NO:20的重链CDR2(SISSGSSYIYYADSMKG)、SEQ ID NO:21的重链CDR3(GMTTLTFDY)、SEQ ID NO:22的轻链CDR1(RASQGISTFLA)、SEQ ID NO:23的轻链CDR2(AASSLQS)、以及SEQ ID NO:24的轻链CDR3(QQYISYPLT)；
(e)SEQ ID NO:25的重链CDR1(SYSMN)、SEQ ID NO:26的重链CDR2(SISSRSSYVYYADSVKG)、SEQ ID NO:27的重链CDR3(GMTTLTFDY)、SEQ ID NO:28的轻链CDR1(RASQGISSFLA)、SEQ ID NO:29的轻链CDR2(AASSLQS)、以及SEQ ID NO:30的轻链CDR3(QQYNSYPLT)；或
(f)SEQ ID NO:31的重链CDR1(SDSATWN)、SEQ ID NO:32的重链CDR2(RTYYRSKWYSDYAVSVKS)、SEQ ID NO:33的重链CDR3(GGAPFDY)、SEQ ID NO:34的轻链CDR1(RASQSISSWLA)、SEQ ID NO:35的轻链CDR2(KASSLES)、以及SEQ ID NO:36的轻链CDR3(QQYNSYSMYT)。
在本发明的任何方面的一些实施例中，抗FRα抗体或其抗原结合片段包含：
(a)包含与SEQ ID NO:37的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列的VH和包含与SEQ ID NO:38的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列的VL；
(b)包含与SEQ ID NO:39的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列的VH和包含与SEQ ID NO:40的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列的VL；
(c)包含与SEQ ID NO:41的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列的VH和包含与SEQ ID NO:42的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列的VL；
(d)包含与SEQ ID NO:43的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列的VH和包含与SEQ ID NO:44的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列的VL；
(e)包含与SEQ ID NO:45的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列的VH和包含与SEQ ID NO:46的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列的VL；或
(f)包含与SEQ ID NO:47的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列的VH和包含与SEQ ID NO:48的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列的VL。
在本发明的任何方面的一些实施例中，抗FRα抗体或其抗原结合片段包含：
(a)在VH的N末端(例如位置1)的L；
(b)在VH的N末端(例如位置1)的E；或
(c)在VH的N末端(例如位置1)的Q。
在本发明的任何方面的一些实施例中，抗FRα抗体或其抗原结合片段包含：
(a)SEQ ID NO:37的VH和SEQ ID NO:38的VL；
(b)SEQ ID NO:39的VH和SEQ ID NO:40的VL；
(c)SEQ ID NO:41的VH和SEQ ID NO:42的VL；
(d)SEQ ID NO:43的VH和SEQ ID NO:44的VL；
(e)SEQ ID NO:45的VH和SEQ ID NO:46的VL；或
(f)SEQ ID NO:47的VH和SEQ ID NO:48的VL。
在本发明的任何方面的一些实施例中，抗FRα抗体包含：包含与SEQ ID NO:109或111的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列的恒定重链和包含与SEQ ID NO:110的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列的恒定轻链。
在本发明的任何方面的一些实施例中，抗FRα抗体包含SEQ ID NO:109或111的恒定重链氨基酸序列和SEQ ID NO:110的恒定轻链氨基酸序列。
在本发明的任何方面的一些实施例中，抗FRα抗体包含：
(a)包含与SEQ ID NO:49的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列的重链和包含与SEQ ID NO:50的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列的轻链；
(b)包含与SEQ ID NO:51的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列的重链和包含与SEQ ID NO:52的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列的轻链；
(c)包含与SEQ ID NO:53的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列的重链和包含与SEQ ID NO:54的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列的轻链；
(d)包含与SEQ ID NO:55的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列的重链和包含与SEQ ID NO:56的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列的轻链；
(e)包含与SEQ ID NO:57的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列的重链和包含与SEQ ID NO:58的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列的轻链；或
(f)包含与SEQ ID NO:59的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列的重链和包含与SEQ ID NO:60的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列的轻链。
在本发明的任何方面的一些实施例中，抗FRα抗体包含：
(a)SEQ ID NO:49的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:50的轻链氨基酸序列；
(b)SEQ ID NO:51的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:52的轻链氨基酸序列；
(c)SEQ ID NO:53的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:54的轻链氨基酸序列；
(d)SEQ ID NO:55的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:56的轻链氨基酸序列；
(e)SEQ ID NO:57的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:58的轻链氨基酸序列；或
(f)SEQ ID NO:59的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:60的轻链氨基酸序列。
在本发明的任何方面的一些实施例中，抗原结合片段是Fab片段、Fab'片段或F(ab’)2片段。
在本发明的任何方面的一些实施例中，抗FRα抗体或其抗原结合片段是人源化的、嵌合的或全人源的，优选地其中抗FRα抗体或其抗原结合片段是全人源的。
在本发明的任何方面的一些实施例中，抗FRα抗体或其抗原结合片段是单克隆的、多克隆的、重组的或多特异性的。
在本发明的任何方面的一些实施例中，抗FRα抗体或其抗原结合片段为IgG1型、IgG2型、IgG3型或IgG4型，优选为IgG1型。
在本发明的任何方面的一些实施例中，抗FRα抗体或其抗原结合片段与一种或多种异源药剂缀合。
在本发明的任何方面的一些实施例中，该一种或多种异源药剂选自由以下组成的组：细胞毒素、抗微生物剂、治疗剂、前药、肽、蛋白质、酶、脂质、生物应答调节剂、药学药剂、淋巴因子、异源抗体、异源抗体的片段、可检测标记、聚乙二醇(PEG)、放射性同位素、或其组合。
在本发明的任何方面的一些实施例中，该异源药剂是细胞毒素。
在另一方面，提供了包含本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段的抗体药物缀合物(ADC)，其中该抗FRα抗体或其抗原结合片段与细胞毒素缀合。
在本发明的任何方面的一些实施例中，细胞毒素经由选自以下的接头RL与抗FRα抗体或其抗原结合片段连接：
(Ia):
其中Q是：
其中QX使得Q为氨基酸残基、二肽残基、三肽残基或四肽残基；
X是：
其中a＝0至5，b1＝0至16，b2＝0至16，c1＝0或1，c2＝0或1，d＝0至5，其中至少b1或b2＝0(即b1和b2中只有一个可以不是0)并且至少c1或c2＝0(即c1和c2中只有一个可以不是0)；
GL是用于连接抗FRα抗体或其抗原结合片段的接头；
(Ib)：
其中RL1和RL2独立地选自H和甲基，或与它们所结合的碳原子一起形成环丙烯或环丁烯基团；并且e是0或1；或
(Ib’)：
其中RL1和RL2独立地选自H和甲基，或与它们所结合的碳原子一起形成环丙烯或环丁烯基团。
在本发明的任何方面的一些实施例中，GL是
在本发明的任何方面的一些实施例中，RL是
在本发明的任何方面的一些实施例中，细胞毒素选自拓扑异构酶I抑制剂、微管溶素衍生物、吡咯并苯并二氮杂卓或其组合。在优选的实施例中，细胞毒素是拓扑异构酶I抑制剂。
在另一方面，提供了包含与细胞毒素连接的抗FRα抗体或其抗原结合片段的ADC，其中细胞毒素是拓扑异构酶I抑制剂。
在本发明的任何方面的一些实施例中，该拓扑异构酶I抑制剂是由式(I)表示：
及其盐和溶剂化物；
其中RL如上所定义。
在本发明的任何方面的一些实施例中，该拓扑异构酶I抑制剂是：
和/或
优选地，其中该拓扑异构酶I抑制剂是：
在本发明的任何方面的一些实施例中，药物与抗体比率(DAR)在约1至20的范围内，任选地其中DAR的范围选自约1至10、约2至10、约2至8、约2至6、以及约4至10。
在本发明的任何方面的一些实施例中，该DAR是约8或约4；优选地其中该DAR是约8。
在另一方面，提供了包含与细胞毒素连接的抗FRα抗体或其抗原结合片段的ADC，其中：
(i)该抗FRα抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:1的重链CDR1(SDSATWN)、SEQID NO:2的重链CDR2(RTYYRSKWYNDYAVSVKS)、SEQ ID NO:3的重链CDR3(GVGSFDY)、SEQ IDNO:4的轻链CDR1(RASQSISSWLA)、SEQ ID NO:5的轻链CDR2(KASGLES)、以及SEQ ID NO:6的轻链CDR3(QQYNSYSQLT)，任选地其中该抗FRα抗体或其抗原结合片段具有SEQ ID NO:37的VH和SEQ ID NO:38的VL；
(ii)该细胞毒素是拓扑异构酶I抑制剂SG3932
以及
(iii)DAR是约8。
在另一方面，提供了分离的多核苷酸，该分离的多核苷酸编码本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段。
在另一方面，提供了载体，其包含：
(a)与启动子可操作地缔合的本发明的多核苷酸；或
(b)编码本发明所定义的VH区的多核苷酸，和编码本发明所定义的VL区的多核苷酸，其中所述多核苷酸与一个或多个启动子可操作地缔合。
在一些实施例中，该载体还包含编码本发明所定义的恒定重链区的多核苷酸和编码本发明所定义的恒定轻链区的多核苷酸。
在另一方面，提供了宿主细胞，其包含本发明的多核苷酸本发明的或载体。
在另一方面，提供了用于制备本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段的方法，该方法包括以下步骤：
(a)用本发明的载体转染宿主细胞；
(b)在允许合成所述抗体或抗原结合片段的条件下培养该宿主细胞；以及
(c)从所述培养物中回收所述抗体或抗原结合片段。
在另一方面，提供了药物组合物，该药物组合物包含：本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段、或本发明的ADC以及药学上可接受的赋形剂。
在另一方面，提供了本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段、本发明的ADC或本发明的药物组合物，其用于在消除受试者中FRα阳性细胞群的方法中使用，该方法包括向该受试者施用该抗FRα抗体或其抗原结合片段、该ADC或该药物组合物。通常，FRα阳性细胞是FRα阳性癌细胞。
在相关方面，提供了在受试者中消除FRα阳性细胞群的方法，该方法包括向该受试者施用本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段、本发明的ADC、或本发明的药物组合物。通常，FRα阳性细胞是FRα阳性癌细胞。
在另一方面，提供了本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段、本发明的ADC或本发明的药物组合物，其用于在治疗与FRα表达相关的癌症中使用。
在相关方面，提供了治疗与FRα表达相关的癌症的方法，该方法包括向受试者施用本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段、本发明的ADC或本发明的药物组合物。
在本发明的任何方面的一些实施例中，癌症包含具有FRα异质表达和/或FRα低表达的癌细胞，任选地其中该癌细胞具有与Igrov-1细胞系相似的FRα表达。
在本发明的任何方面的一些实施例中，所述癌症选自卵巢癌、肺癌、子宫内膜癌、胰腺癌、胃癌、肾细胞癌(RCC)、结肠直肠癌、头颈鳞状细胞癌(HNSCC)、乳腺癌(例如TNBC)、宫颈癌和恶性胸膜间皮瘤，优选地所述癌症选自卵巢癌和肺癌。
在一些实施例中，肺癌是非小细胞肺癌(NSCLC)，任选地其中NSCLC选自鳞状NSCLC、腺癌NSCLC或其组合。
在所附权利要求书中陈述了本发明的多个方面和实施例。本文还描述了本发明的这些和其他的方面和实施例。
附图说明
现在将参考附图更详细地描述本发明，其中：
图1示出了通过HTRF测定的(A)AB1370026；(B)AB1370035；(C)AB1370049；(D)AB1370083；(E)AB1370096；和(F)AB1370117与人FRα、食蟹猴FRα、小鼠FRα、人FRβ或人FRγ的结合。
图2示出了对抗体内化至KB细胞的High ContentProfiler多参数分析，其中以纵轴为强度、以横轴为样品浓度作图。具有吸收高于由阳性对照样品(圆圈)确定的截止值的抗体被列入候选名单，并示出为灰色菱形，其中低于该截止值的抗体显示为白色菱形。6种示例性抗体的数据点在测定中一式两份运行，由黑色菱形表示并标记有样品名称。每个示例性抗体的至少一个样品高于截止值。
图3示出了6个示例性IgG与以下的HTRF表位竞争测定：(A)比较物1IgG；(B)比较物2IgG；以及(C)比较物3IgG。
图4示出了AC-SINS自身相互作用测定的结果。测定抗体在HSA(黑色柱)缓冲液中自缔合的倾向。正如预期的，阴性对照抗体展现出低水平的自身相互作用，而阳性对照抗体在HSA中表现出高水平的自身相互作用。用于标示处于风险中的抗体的阈值(>5nm)由水平虚线表示。
图5示出了抗FRα抗体内化到(A)Jeg-3细胞(具有中等FRα表达)和(B)KB细胞(具有高FRα表达)中，随着时间的推移通过CX7仪器上荧光的增加进行测量。
图6示出了从以下获得的AB1370049-SG3932 DAR8的色谱图：(A)在214nm处的UHPLC-RP(呈还原形式)；(B)在330nm处的UHPLC-RP(呈还原形式)；(C)在280nm处的UHPLC-SEC；以及(D)在214nm处的UHPLC-HIC。
图7示出了从以下获得的AB1370049-SG3932 DAR4的色谱图：(A)在214nm处的UHPLC-RP(呈还原形式)；(B)在330nm处的UHPLC-RP(呈还原形式)；(C)在280nm处的UHPLC-SEC；以及(D)在214nm处的UHPLC-HIC。
图8示出了当暴露于各种血清时化学转化为一系列DAR8 ADC的过程。观察到的化学过程是(A)去缀合，以及(B)马来酰亚胺水解。
图9示出了在以下细胞上使用先导DAR8 ADC的6天细胞毒性测定：(A)KB细胞(具有高FRα表达)；(B)Jeg-3细胞(具有中高FRα表达)；和(C)Igrov-1细胞(具有中等FRα表达)。
图10示出了AB1370049-SG3932 DAR8的旁观者杀伤活性。单独或以1:1的比率使用1nM AB1370049-SG3932 DAR8 ADC处理FRα阳性和FRα阴性KB细胞6天。6天后用流式细胞术测量细胞毒活性。
图11示出了使用先导DAR8 ADC进行的KB异种移植研究。在第6天，施用(A)1.25mg/kg或(B)5mg/kg的单次静脉内剂量。剂量施用由黑色星号表示。
图12示出了使用先导DAR8 ADC的OVCAR-3异种移植研究。在第33天，施用(A)1.25mg/kg或(B)5mg/kg的单次静脉内剂量。剂量施用由黑色星号表示。
图13示出了使用AB1370049-SG3932 DAR8的IGROV-1异种移植研究。在第33天，施用5mg/kg的单次静脉内剂量。
图14示出了使用先导DAR4 ADC进行的KB异种移植研究。在第7天，施用5mg/kg的单次静脉内剂量。
图15示出了(A)OVCAR-3和(B)CaCo-2异种移植物研究，其中以1.25、2.5和5mg/kg单剂量施用AB1370049-SG3932 DAR8或FRα-DM4 ADC。剂量施用由黑色星号表示。
图16示出了由以下导致的肿瘤生长中位百分比：(A)在51个PDX模型中5mg/kgAB1370049-SG3932 DAR8的单次施用，以及(B)在39个PDX模型中的2.5mg/kg AB1370049-SG3932 DAR8的单次施用。
图17示出了PDX模型研究，其中单剂量施用2.5mg/kg或5mg/kg的AB1370049-SG3932 DAR8，用于(A)卵巢PDX模型CTG-0711；(B)NSCLC PDX模型CTG-2367；以及(C)子宫内膜PDX模型CTG-2268。
图18示出了在以下细胞上的测量的细胞活力信号：(A)巨核细胞谱系中的祖细胞；(B)骨髓谱系中的祖细胞；(C)红细胞谱系中的祖细胞；(D)巨核细胞谱系中的扩增和分化的细胞；(E)骨髓谱系中的扩增和分化的细胞；以及(F)红细胞谱系中的扩增和分化的细胞。X轴代表药物浓度，Y轴代表存活率百分比(数值是一式三份的平均值-/+SD)。AB1370049-SG3932 DAR8在被诱导分化呈红细胞谱系、骨髓谱系或巨核细胞谱系的原代CD34+骨髓来源的造血干细胞祖细胞中，与非靶向ADC对照相比未显示出加剧的毒性。
图19示出了食蟹猴中未缀合的mAb与AB1370049-SG3932DAR8相比的浓度-时间曲线的平均值(±SD)。使用免疫捕获LC-MS/MS测定和非隔室PK收集和处理15和25mg/kg血浆样品的PK图。总mAb是完整抗体的量度(在ADC的情况下包括ADC或去缀合的mAb)。总ADC仅是完整ADC的量度。
图20示出了OVO857 PDX模型中的平均肿瘤生长百分比，其中单剂量施用1.25、2.5、5和10mg/kg的AB1370049-SG3932 DAR8或2.5和5mg/kg的FRα-DM4 ADC。
图21示出了CTG3226 PDX模型中的平均肿瘤生长百分比，其中单剂量施用1.25、2.5、5和10mg/kg的AB1370049-SG3932 DAR8或2.5和5mg/kg的FRα-DM4 ADC。
图22示出了CTG-0956PDX模型中的平均肿瘤生长百分比，其中单剂量施用0.15、0.3、0.6、1.25、2.5、5和10mg/kg的AB1370049-SG3932 DAR8。
图23示出了4只小鼠(分别指定为2_2718、4_7C2A、18_2146和27_2438)的OVCAR3异种移植模型中的平均肿瘤生长百分比，首先静脉内给药8轮Q2W 5mg/kg FRα-DM4 ADC至肿瘤复发，随后以5mg/kg Q2W静脉内用AB1370049-SG3932 DAR8重新激发，接受2轮AB1370049-SG3932 DAR8治疗。垂直虚线表示被施用至小鼠的剂量。
图24示出了OVCAR3异种移植模型中的平均肿瘤生长百分比，其中将FRα-DM4抗性肿瘤从小鼠中分离出来并重新植入新的宿主小鼠中。在肿瘤达到280-360mm3的平均大小后，小鼠被施用两次剂量(Q2W)的5mg/kg AB1370049-SG3932 DAR8或FRα-DM4。垂直虚线表示被施用至小鼠的剂量。
具体实施方式
一般定义
除非另有定义，本文所使用的所有技术和科学术语具有与本披露内容所属领域的技术人员通常所理解的相同的意义。Singleton等人,DICTIONARY OF MICROBIOLOGY ANDMOLECULAR BIOLOGY[微生物学和分子生物学词典],第20版,John Wiley and Sons[约翰威利父子公司],纽约(1994)，以及Hale和Marham,THE HARPER COLLINSDICTIONARY OFBIOLOGY[哈珀柯林斯生物学词典],Harper Perennial[哈珀永久出版社],纽约州(1991)为技术人员提供了本披露中所使用的许多术语的通用词典。
除非另有说明，否则任何核酸序列以5'至3'方向从左至右书写；氨基酸序列分别以氨基至羧基的方向从左至右书写。
必须注意的是，除非上下文另有明确规定，否则如本文和所附权利要求所使用的，单数形式“一个/种(a/an)”和“该(the)”包括复数指示物。因此，例如，提及“一种药剂”包括多种此类药剂并且提及“该药剂”包括提及本领域技术人员已知的一种或多种药剂及其等效物，等等。
“约”通常可以意指在给定测量性质或精度的情况下测量的量的可接受的误差程度。示例性误差程度在给定值或值范围的20％内、典型地在10％内、更典型地在5％内。优选地，术语“约”在本文中应被理解为所使用数字的数值的正或负(±)5％，优选±4％、±3％、±2％、±1％、±0.5％、±0.1％。本文描述为“包括/包含(comprising)”一个或多个特征的实施例也可以被认为是“由这类特征组成”的相应实施例的披露。
在本文中使用氨基酸的名称、三字母缩写或单字母缩写来指代氨基酸。如本文所使用的，术语“蛋白质”包括蛋白质、多肽和肽。如本文所使用的，术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白质”同义。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“肽”同义。术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换地使用。在本披露内容和权利要求中，可以使用氨基酸残基的常规一字母和三字母代码。氨基酸的3字母代码遵照IUPACIUB生物化学命名联合委员会(Joint Commission on Biochemical Nomenclature，JCBN)的定义。还应理解，由于遗传密码的简并性，多肽可以由多于一种核苷酸序列编码。
浓度、量、体积、百分比和其他数值能以范围形式来呈现。还应理解的是，此类范围形式仅仅是为了方便和简洁而使用，并且应该被灵活地解释为不仅包括明确列举为范围的限值的数值而且包括包含在该范围内的所有单独的数值或子范围，就像每个数值和子范围被明确地列举一样。
抗FRα抗体
诸位发明人开发了一系列示例性抗FRα抗体，其具有高亲和力并特异性结合癌细胞上的FRα(例如，不特异性结合其他FR家族成员，例如FRβ和FRγ)。诸位发明人对抗体的可开发性进行了全面评估，检查了可逆自缔合、内化、非特异性结合和疏水性的倾向以及mAb对热和光应激源的稳定性。此外，诸位发明人对一组重点mAb使用了小鼠体内PK研究，以去除任何展现出较差的体内半衰期和增加的清除率的抗体。为了降低在人类中产生抗药物抗体(ADA)应答的可能性，进行了计算机免疫原性评估，以将具有增加ADA应答的预期风险的任何抗体排除在考虑范围之外。通过上述筛选策略，诸位发明人鉴定了一组具有相似、有益特性的6种抗体。
抗体序列
本发明涵盖具有所述CDR序列或可变重链和可变轻链序列的本文定义的抗体或抗原结合片段(参考抗体)及其功能变体。功能变体结合至与参考抗体相同的靶抗原，并且优选地展现出与参考抗体相同的抗原交叉反应性。当与参考抗体相比时，这些功能变体对于靶抗原可以具有不同的亲和力，但基本上相同的亲和力是优选的。
在一些实施例中，当与相应的参考CDR序列相比时，参考抗体的功能变体在一个或多个CDR处显示序列变异。因此，功能抗体变体可以包含CDR的功能变体。在CDR序列的背景下使用术语“功能变体”时，这意味着当与相应的参考CDR序列相比时，该CDR具有最多2个、优选最多1个氨基酸差异，并且当与其余5个CDR(或其变体)组合时，使该变体抗体能够结合与参考抗体相同的靶抗原，并且优选地展现出与参考抗体相同的抗原交叉反应性。功能变体可以称为“变体抗体”。
表1-5分别示出了构建体AB1370049、AB1370026、AB1370035、AB1370083、AB1370095和AB1370117的CDR序列、VH和VL序列、重链和轻链序列、FR序列和恒定结构域序列。如有任何差异，以表格中的序列为准。
在一方面，抗FRα抗体或其抗原结合片段包含表2的构建体AB1370049、AB1370026、AB1370035、AB1370083、AB1370095或AB1370117中任一个的6个CDR，其中CDR由Kabat、Chothia或IMGT确定。
在本发明的另一个方面，提供了抗FRα抗体或其抗原结合片段，其中该抗FRα抗体或抗原结合片段包含：
SEQ ID NO:1的重链CDR1(SDSATWN)、
SEQ ID NO:2的重链CDR2(RTYYRSKWYNDYAVSVKS)、SEQ ID NO:3的重链CDR3(GVGSFDY)、
SEQ ID NO:4的轻链CDR1(RASQSISSWLA)、
SEQ ID NO:5的轻链CDR2(KASGLES)、以及
SEQ ID NO:6的轻链CDR3(QQYNSYSQLT)，
其中所述CDR中的任何一个或多个与所述序列相比包含1、2或3个保守氨基酸取代。
在一些实施例中，该抗FRα抗体或抗原结合片段包含：
SEQ ID NO:1的重链CDR1(SDSATWN)、
SEQ ID NO:2的重链CDR2(RTYYRSKWYNDYAVSVKS)、SEQ ID NO:3的重链CDR3(GVGSFDY)、
SEQ ID NO:4的轻链CDR1(RASQSISSWLA)、
SEQ ID NO:5的轻链CDR2(KASGLES)、以及
SEQ ID NO:6的轻链CDR3(QQYNSYSQLT)。
在一些实施例中，抗FRα抗体或其抗原结合片段具有VH和VL，该VH包含与SEQ IDNO:37的氨基酸序列至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少97％相同、至少99％相同、或完全相同的氨基酸序列，该VL包含与SEQ ID NO:38的氨基酸序列至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少97％相同、至少99％相同或完全相同的氨基酸序列。在一些实施例中，抗FRα抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:37的VH和SEQ ID NO:38的VL。
在一些实施例中，抗FRα抗体包含重链和轻链，该重链包含与SEQ ID NO:49的氨基酸序列至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少97％相同、至少99％相同、或完全相同的氨基酸序列，该轻链包含与SEQ ID NO:50的氨基酸序列至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少97％相同、至少99％相同、或完全相同的氨基酸序列。在一些实施例中，抗FRα抗体包含：SEQ ID NO:49的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:50的轻链氨基酸序列。
在本发明的另一个方面，提供了抗FRα抗体或其抗原结合片段，其中该抗FRα抗体或抗原结合片段包含：
SEQ ID NO:7的重链CDR1(SYAMS)、
SEQ ID NO:8的重链CDR2(SISSGRSYIYYADSVKG)、
SEQ ID NO:9的重链CDR3(EMQQLALDY)、
SEQ ID NO:10的轻链CDR1(RASQGISNFLA)、
SEQ ID NO:11的轻链CDR2(AASSLQS)、以及
SEQ ID NO:12的轻链CDR3(QQYNSYPFT)，
其中所述CDR中的任何一个或多个与所述序列相比包含1、2或3个保守氨基酸取代。
在一些实施例中，该抗FRα抗体或抗原结合片段包含：
SEQ ID NO:7的重链CDR1(SYAMS)、
SEQ ID NO:8的重链CDR2(SISSGRSYIYYADSVKG)、
SEQ ID NO:9的重链CDR3(EMQQLALDY)、
SEQ ID NO:10的轻链CDR1(RASQGISNFLA)、
SEQ ID NO:11的轻链CDR2(AASSLQS)、以及
SEQ ID NO:12的轻链CDR3(QQYNSYPFT)。
在一些实施例中，抗FRα抗体或其抗原结合片段具有VH和VL，该VH包含与SEQ IDNO:39的氨基酸序列至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少97％相同、至少99％相同、或完全相同的氨基酸序列，该VL包含与SEQ ID NO:40的氨基酸序列至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少97％相同、至少99％相同、或完全相同的氨基酸序列。在一些实施例中，抗FRα抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:39的VH和SEQ ID NO:40的VL。
在一些实施例中，抗FRα抗体包含重链和轻链，该重链包含与SEQ ID NO:51的氨基酸序列至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少97％相同、至少99％相同、或完全相同的氨基酸序列，该轻链包含与SEQ ID NO:52的氨基酸序列至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少97％相同、至少99％相同、或完全相同的氨基酸序列。在一些实施例中，抗FRα抗体包含：SEQ ID NO:51的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:52的轻链氨基酸序列。
在本发明的另一个方面，提供了抗FRα抗体或其抗原结合片段，其中该抗FRα抗体或抗原结合片段包含：
SEQ ID NO:13的重链CDR1(SNSAAWN)、
SEQ ID NO:14的重链CDR2(RTYYRSNWYNDYTLSVKS)、SEQ ID NO:15的重链CDR3(GVGRFDS)、
SEQ ID NO:16的轻链CDR1(RASQSISSWLA)、
SEQ ID NO:17的轻链CDR2(KASSLES)、以及
SEQ ID NO:18的轻链CDR3(QEYKTYSIFT)，
其中所述CDR中的任何一个或多个与所述序列相比包含1、2或3个保守氨基酸取代。
在一些实施例中，该抗FRα抗体或抗原结合片段包含：
SEQ ID NO:13的重链CDR1(SNSAAWN)、
SEQ ID NO:14的重链CDR2(RTYYRSNWYNDYTLSVKS)、SEQ ID NO:15的重链CDR3(GVGRFDS)、
SEQ ID NO:16的轻链CDR1(RASQSISSWLA)、
SEQ ID NO:17的轻链CDR2(KASSLES)、以及
SEQ ID NO:18的轻链CDR3(QEYKTYSIFT)。
在一些实施例中，抗FRα抗体或其抗原结合片段具有VH和VL，该VH包含与SEQ IDNO:41的氨基酸序列至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少97％相同、至少99％相同、或完全相同的氨基酸序列，该VL包含与SEQ ID NO:42的氨基酸序列至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少97％相同、至少99％相同、或完全相同的氨基酸序列。在一些实施例中，抗FRα抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:41的VH和SEQ ID NO:42的VL。
在一些实施例中，抗FRα抗体包含重链和轻链，该重链包含与SEQ ID NO:53的氨基酸序列至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少97％相同、至少99％相同、或完全相同的氨基酸序列，该轻链包含与SEQ ID NO:54的氨基酸序列至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少97％相同、至少99％相同、或完全相同的氨基酸序列。在一些实施例中，抗FRα抗体包含：SEQ ID NO:53的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:54的轻链氨基酸序列。
在本发明的另一个方面，提供了抗FRα抗体或其抗原结合片段，其中该抗FRα抗体或抗原结合片段包含：
SEQ ID NO:19的重链CDR1(SYNMN)、
SEQ ID NO:20的重链CDR2(SISSGSSYIYYADSMKG)、
SEQ ID NO:21的重链CDR3(GMTTLTFDY)、
SEQ ID NO:22的轻链CDR1(RASQGISTFLA)、
SEQ ID NO:23的轻链CDR2(AASSLQS)、以及
SEQ ID NO:24的轻链CDR3(QQYISYPLT)，
其中所述CDR中的任何一个或多个与所述序列相比包含1、2或3个保守氨基酸取代。
在一些实施例中，该抗FRα抗体或抗原结合片段包含：
SEQ ID NO:19的重链CDR1(SYNMN)、
SEQ ID NO:20的重链CDR2(SISSGSSYIYYADSMKG)、
SEQ ID NO:21的重链CDR3(GMTTLTFDY)、
SEQ ID NO:22的轻链CDR1(RASQGISTFLA)、
SEQ ID NO:23的轻链CDR2(AASSLQS)、以及
SEQ ID NO:24的轻链CDR3(QQYISYPLT)。
在一些实施例中，抗FRα抗体或其抗原结合片段具有VH和VL，该VH包含与SEQ IDNO:43的氨基酸序列至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少97％相同、至少99％相同、或完全相同的氨基酸序列，该VL包含与SEQ ID NO:44的氨基酸序列至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少97％相同、至少99％相同、或完全相同的氨基酸序列。在一些实施例中，抗FRα抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:43的VH和SEQ ID NO:44的VL。
在一些实施例中，抗FRα抗体包含重链和轻链，该重链包含与SEQ ID NO:55的氨基酸序列至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少97％相同、至少99％相同、或完全相同的氨基酸序列，该轻链包含与SEQ ID NO:56的氨基酸序列至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少97％相同、至少99％相同、或完全相同的氨基酸序列。在一些实施例中，抗FRα抗体包含：SEQ ID NO:55的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:56的轻链氨基酸序列。
在本发明的另一个方面，提供了抗FRα抗体或其抗原结合片段，其中该抗FRα抗体或抗原结合片段包含：
SEQ ID NO:25的重链CDR1(SYSMN)、
SEQ ID NO:26的重链CDR2(SISSRSSYVYYADSVKG)、
SEQ ID NO:27的重链CDR3(GMTTLTFDY)、
SEQ ID NO:28的轻链CDR1(RASQGISSFLA)、
SEQ ID NO:29的轻链CDR2(AASSLQS)、以及
SEQ ID NO:30的轻链CDR3(QQYNSYPLT)，
其中所述CDR中的任何一个或多个与所述序列相比包含1、2或3个保守氨基酸取代。
在一些实施例中，该抗FRα抗体或抗原结合片段包含：
SEQ ID NO:25的重链CDR1(SYSMN)、
SEQ ID NO:26的重链CDR2(SISSRSSYVYYADSVKG)、
SEQ ID NO:27的重链CDR3(GMTTLTFDY)、
SEQ ID NO:28的轻链CDR1(RASQGISSFLA)、
SEQ ID NO:29的轻链CDR2(AASSLQS)、以及
SEQ ID NO:30的轻链CDR3(QQYNSYPLT)。
在一些实施例中，抗FRα抗体或其抗原结合片段具有VH和VL，该VH包含与SEQ IDNO:45的氨基酸序列至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少97％相同、至少99％相同、或完全相同的氨基酸序列，该VL包含与SEQ ID NO:46的氨基酸序列至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少97％相同、至少99％相同、或完全相同的氨基酸序列。在一些实施例中，抗FRα抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:45的VH和SEQ ID NO:46的VL。
在一些实施例中，抗FRα抗体包含重链和轻链，该重链包含与SEQ ID NO:57的氨基酸序列至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少97％相同、至少99％相同、或完全相同的氨基酸序列，该轻链包含与SEQ ID NO:58的氨基酸序列至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少97％相同、至少99％相同、或完全相同的氨基酸序列。在一些实施例中，抗FRα抗体包含：SEQ ID NO:57的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:58的轻链氨基酸序列。
在本发明的另一个方面，提供了抗FRα抗体或其抗原结合片段，其中该抗FRα抗体或抗原结合片段包含：
SEQ ID NO:31的重链CDR1(SDSATWN)、
SEQ ID NO:32的重链CDR2(RTYYRSKWYSDYAVSVKS)、SEQ ID NO:33的重链CDR3(GGAPFDY)、
SEQ ID NO:34的轻链CDR1(RASQSISSWLA)、
SEQ ID NO:35的轻链CDR2(KASSLES)、以及
SEQ ID NO:36的轻链CDR3(QQYNSYSMYT)，
其中所述CDR中的任何一个或多个与所述序列相比包含1、2或3个保守氨基酸取代。
在一些实施例中，该抗FRα抗体或抗原结合片段包含：
SEQ ID NO:31的重链CDR1(SDSATWN)、
SEQ ID NO:32的重链CDR2(RTYYRSKWYSDYAVSVKS)、SEQ ID NO:33的重链CDR3(GGAPFDY)、
SEQ ID NO:34的轻链CDR1(RASQSISSWLA)、
SEQ ID NO:35的轻链CDR2(KASSLES)、以及
SEQ ID NO:36的轻链CDR3(QQYNSYSMYT)。
在一些实施例中，抗FRα抗体或其抗原结合片段具有VH和VL，该VH包含与SEQ IDNO:47的氨基酸序列至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少97％相同、至少99％相同、或完全相同的氨基酸序列，该VL包含与SEQ ID NO:48的氨基酸序列至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少97％相同、至少99％相同、或完全相同的氨基酸序列。在一些实施例中，抗FRα抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:47的VH和SEQ ID NO:48的VL。
在一些实施例中，抗FRα抗体包含重链和轻链，该重链包含与SEQ ID NO:59的氨基酸序列至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少97％相同、至少99％相同、或完全相同的氨基酸序列，该轻链包含与SEQ ID NO:60的氨基酸序列至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少97％相同、至少99％相同、或完全相同的氨基酸序列。在一些实施例中，抗FRα抗体包含：SEQ ID NO:59的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:60的轻链氨基酸序列。
在本文所述的任何方面的一些实施例中，抗FRα抗体或其抗原结合片段包含重链VH FR1、VH FR2、VH FR3和/或VH FR4，其分别与表4中描述的构建体AB1370049、AB1370026、AB1370035、AB1370083、AB1370095或AB1370117中的任何一个的参考重链VH FR1、VH FR2、VH FR3和/或VH FR4至少80％、85％、90％或95％相同或完全相同，其中该抗体或片段能够单独结合FRα(例如以单链抗体片段的形式)。
在本文所述的任何方面的一些实施例中，抗FRα抗体或其抗原结合片段包含轻链VL FR1、VL FR2、VL FR3和/或VL FR4，其分别与表4中描述的构建体AB1370049、AB1370026、AB1370035、AB1370083、AB1370095或AB1370117中的任何一个的参考轻链VL FR1、VL FR2、VL FR3和/或VL FR4至少80％、85％、90％或95％相同或完全相同，其中该抗体或片段能够单独结合FRα(例如以单链抗体片段的形式)。
在本文所述的任何方面的一些实施例中，抗FRα抗体或其抗原结合片段包含：(a)轻链VL FR1、VL FR2、VL FR3和/或VL FR4，其分别与表4中描述的构建体AB1370049、AB1370026、AB1370035、AB1370083、AB1370095或AB1370117中的任何一个的参考重链VLFR1、VL FR2、VL FR3和/或VL FR4至少80％、85％、90％或95％相同或完全相同；以及(b)重链VH FR1、VH FR2、VH FR3和/VH FR4，其分别与表4中描述的构建体AB1370049、AB1370026、AB1370035、AB1370083、AB1370095或AB1370117中的任何一个的参考重链VH FR1、VH FR2、VH FR3和/或VH FR4至少80％、85％、90％或95％相同或完全相同。
在一些实施例中，抗FRα抗体包含恒定重链和恒定轻链，该恒定重链包含与SEQ IDNO:109的氨基酸序列至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少97％相同、至少99％相同、或完全相同的氨基酸序列，该恒定轻链包含与SEQ ID NO:110的氨基酸序列至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少97％相同、至少99％相同、或完全相同的氨基酸序列。在一些实施例中，抗FRα抗体包含：SEQ ID NO:109的恒定重链氨基酸序列和SEQ IDNO:110的恒定轻链氨基酸序列。
在本文所述的任何抗原结合片段的一些实施例中，抗FRα抗原结合片段包含恒定重链和恒定轻链，该恒定重链包含与SEQ ID NO:111的氨基酸序列至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少97％相同、至少99％相同、或完全相同的氨基酸序列，该恒定轻链包含与SEQ ID NO:110的氨基酸序列至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少97％相同、至少99％相同、或完全相同的氨基酸序列。在一些实施例中，抗FRα抗原结合片段包含：SEQ ID NO:111的恒定重链氨基酸序列和SEQ ID NO:110的恒定轻链氨基酸序列。
表1：FRα抗体CDR序列
表2：FRα抗体VH和VL序列
表3：FRα抗体重链和轻链序列
表4：FRα抗体FR区
表5：FRα抗体恒定结构域序列
预期本发明的抗体的氨基酸序列中的微小变化被涵盖于本发明，前提是氨基酸序列中的变化与本文任何地方所定义的本发明的抗体或其抗原结合片段保持至少75％，更优选至少80％、至少90％、至少95％、且最优选至少99％的序列同一性。
本发明的抗体可包括变体，其中来自一个物种的氨基酸残基在保守或非保守位置取代另一物种中的相应残基。在一些实施例中，在非保守位置的氨基酸残基被保守或非保守残基取代。特别地，预期了保守氨基酸置换。
“保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基取代的取代。具有相似侧链的氨基酸残基家族已在本领域中定义，该侧链包括碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸或组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸或谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸或半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸或色氨酸)、β-支化侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或组氨酸)。因此，如果多肽中的氨基酸被来自相同侧链家族的另一个氨基酸替代，该氨基酸取代被认为是保守性的。在本发明的抗体中包含保守修饰的变体并不排除其他形式的变体，例如多态性变体、种间同系物和等位基因。
“非保守氨基酸取代”包括如下那些，其中(i)具有阳电性侧链的残基(例如，Arg、His或Lys)取代阴电性残基(例如，Glu或Asp)或被其取代，(ii)亲水性残基(例如，Ser或Thr)取代疏水性残基(例如，Ala、Leu、Ile、Phe或Val)或被其取代，(iii)半胱氨酸或脯氨酸取代任何其他残基或被其取代，或(iv)具有大体积的疏水性或芳香族侧链的残基(例如，Val、His、Ile或Trp)取代具有更小的侧链的残基(例如，Ala或Ser)或无侧链的残基(例如，Gly)或被其取代。
除20种标准氨基酸外，非标准氨基酸(如4-羟基脯氨酸、6-N-甲基赖氨酸、2-氨基异丁酸、异缬氨酸和α-甲基丝氨酸)可以取代本发明抗体的氨基酸残基。有限数量的非保守氨基酸、不由遗传密码编码的氨基酸和非天然氨基酸可以取代氨基酸残基。本发明的抗体还可包含非天然存在的氨基酸残基。
非天然存在的氨基酸包括但不限于反式-3-甲基脯氨酸、2,4-桥亚甲基-脯氨酸、顺式-4-羟基脯氨酸、反式-4-羟基-脯氨酸、N-甲基甘氨酸、别苏氨酸、甲基-苏氨酸、羟基-乙基半胱氨酸、羟基乙基高半胱氨酸、硝基-谷氨酰胺、高谷氨酰胺、哌可酸、叔亮氨酸、正缬氨酸、2-氮杂苯丙氨酸、3-氮杂苯丙氨酸、4-氮杂苯丙氨酸和4-氟苯丙氨酸。用于将非天然存在的氨基酸残基掺入蛋白质中的若干种方法是本领域已知的。例如，可以采用体外系统，其中使用化学氨酰化的抑制型tRNA抑制无义突变。用于合成氨基酸和氨酰化tRNA的方法是本领域已知的。含有无义突变的质粒的转录和翻译在无细胞系统中进行，该无细胞系统包含大肠杆菌S30提取物以及可商购的酶和其他试剂。通过色谱纯化蛋白质。参见例如，Robertson等人,J.Am.Chem.Soc.[美国化学会志]113:2722,1991；Ellman等人,MethodsEnzymol.[酶学方法]202:301,1991；Chung等人,Science[科学]259:806-9,1993；以及Chung等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]90:10145-9,1993)。在第二种方法中，通过显微注射突变的mRNA和化学氨酰化的抑制型tRNA在爪蟾卵母细胞中进行翻译(Turcatti等人,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]271:19991-8,1996)。在第三种方法中，在不存在要替换的天然氨基酸(例如，苯丙氨酸)和存在所需的一个或多个非天然存在的氨基酸(例如，2-氮杂苯丙氨酸、3-氮杂苯丙氨酸、4-氮杂苯丙氨酸或4-氟苯丙氨酸)的情况下，培养大肠杆菌细胞。将非天然存在的氨基酸代替其天然对应物掺入多肽中。参见，Koide等人,Biochem.[生物化学]33:7470-6,1994。天然存在的氨基酸残基可以通过体外化学修饰转化为非天然存在的种类。化学修饰可以与定点诱变相结合，以进一步扩大替代范围(Wynn和Richards,Protein Sci.[蛋白质科学]2:395-403,1993)。
有限数量的非保守氨基酸、不由遗传密码编码的氨基酸、非天然存在的氨基酸和非天然氨基酸可以取代本发明抗体的氨基酸残基。
本发明抗体中的必需氨基酸可以根据本领域已知的方法鉴定，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells,Science[科学]244:1081-5,1989)。生物学相互作用位点还可通过对结构的物理分析来确定，如通过以下技术确定：核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记，连同对推定的接触位点氨基酸进行突变。参见例如，de Vos等人,Science[科学]255:306-12,1992；Smith等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]224:899-904,1992；Smith等人FEBS Lett.[欧洲生化学会联合会快报]309:59-64,1992。必需氨基酸的同一性还可以从与本发明抗体的相关组分(例如易位组分或蛋白酶组分)的同源性分析中推断出来。
可以使用已知的诱变和筛选方法来制造和测试多个氨基酸取代，这些方法如Reidhaar-Olson和Sauer(Science[科学]241:53-7,1988)或者Bowie和Sauer(Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]86:2152-6,1989)所披露的那些。简而言之，这些作者披露了用于同时随机化多肽中的两个或更多个位置、选择功能性多肽、然后对诱变的多肽进行测序以确定每个位置上允许的取代的范围的方法。可以使用的其他方法包括噬菌体展示(例如，Lowman等人,Biochem.[生物化学]30:10832-7,1991；Ladner等人,美国专利号5,223,409；Huse,WIPO公开WO 92/06204)和定区诱变(Derbyshire等人,Gene[基因]46:145,1986；Ner等人,DNA 7:127,1988)。
两个或更多个核酸或氨基酸序列之间的“序列同一性百分比”是序列共有的相同位置数目的函数。因此，％同一性可以计算为相同核苷酸/氨基酸的数量除以核苷酸/氨基酸的总数，再乘以100。％序列同一性的计算还可以考虑空位的数量，以及需要引入以优化两个或更多个序列的比对的每个空位的长度。可以使用技术人员熟悉的特定数学算法(诸如BLAST)进行两个或更多个序列之间的序列比较和同一性百分比确定。
可以使用多种序列比对方法中的任一种来确定同一性百分比，包括但不限于全局方法、局部方法和混合方法，例如像区段方法。确定同一性百分比的方案是本领域技术人员范围内的常规程序。全局方法从分子的开头到结尾比对序列，并通过将单独残基对的评分相加以及施加空位罚分来确定最佳比对。非限制性方法包括，例如，CLUSTAL W，参见例如，Julie D.Thompson等人，CLUSTAL W：Improving the Sensitivity of ProgressiveMultiple Sequence Alignment Through Sequence Weighting,Position-Specific GapPenalties and Weight Matrix Choice[通过序列加权、位置特定间隙惩罚和权重矩阵选择提高渐进多序列比对的灵敏度]22(22)Nucleic Acids Research[核酸研究]4673-4680(1994)；和迭代细化，参见例如，Osamu Gotoh，Significant Improvement in AccuracyofMultiple Protein Sequence Alignments by Iterative Refinement as Assessed byReference to Structural Alignments[通过参考结构比对评估的迭代细化显著提高多蛋白质序列比对的准确性]，264(4)J.MoI.Biol.[分子生物学杂志]823-838(1996)。局部方法通过鉴定所有输入的序列共享的一个或多个保守基序来比对序列。非限制性方法包括，例如Match-box，参见例如，Eric Depiereux和Ernest Feytmans,Match-Box:AFundamentallyNew Algorithm for the Simultaneous Alignment of Several ProteinSequences[火柴盒：一种用于同时比对多个蛋白质序列的全新算法],8(5)CABIOS 501-509(1992)；Gibbs采样，参见例如，C.E.Lawrence等人，Detecting Subtle Sequence Signals:A Gibbs Sampling Strategy for Multiple Alignment[检测细微序列信号：多重比对的Gibbs采样策略],262(5131)Science208-214(1993)；Align-M，参见例如Ivo Van WaIIe等人,Align-M-ANew Algorithm for Multiple Alignment of Highly DivergentSequences[Alin-M-用于高度多样性序列的多比对的新算法],20(9)Bioinformatics[生物信息学]:1428-1435(2004)。
序列同一性百分比可以通过常规方法确定。参见例如，Altschul等人,Bull.Math.Bio.[数学生物学公报]48:603-16,1986，以及Henikoff和Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]89:10915-19,1992。简而言之，使用空位开放罚分10、空位延伸罚分1以及如下所示的Henikoff和Henikoff(同上)的“blosum 62”评分矩阵比对两个氨基酸序列以优化比对评分(氨基酸由标准的单字母代码表示)。
在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段的重链和轻链两者中的可变结构域通过至少部分替换一个或多个CDR和/或通过部分框架区替换和序列改变而被改变。虽然CDR可以衍生自与框架区所衍生自的抗体相同的类别或甚至亚类的抗体，但是设想CDR将衍生自不同类别的抗体并且在某些实施例中衍生自不同物种的抗体。不必用来自供体可变区的完整CDR来替换所有CDR以将一个可变结构域的抗原结合能力转移至另一个。而是，只需要转移维持抗原结合位点的活性所必需的那些残基。考虑到在美国专利号5,585,089、5,693,761和5,693,762中所阐述的解释，其每一个都通过引入并入本文，本领域技术人员完全有能力通过进行常规实验获得具有减少的免疫原性的功能抗体。
在一些实施例中，该抗体或其抗原结合片段除了VH和VL之外还可以包括重链恒定区或其片段。在一些实施例中，该重链恒定区是人重链恒定区，例如人IgG恒定区，例如人IgG1恒定区。
在一些实施例(特别是在该抗体或其抗原结合片段与药剂(如细胞毒性药剂)缀合的情况下)中，将残基插入到重链恒定区域中用于位点特异性缀合。例如，在IgG1的CH2区的氨基酸S239和V240之间可能插入一个半胱氨酸残基，其可称为“239插入”或“239i”。
在一些实施例中，本文披露的抗体可被修饰来包含对三个重链恒定结构域(CH1、CH2或CH3)中的一个或多个和/或对轻链恒定结构域(CL)的改变或修饰。在一些实施例中，设想了修饰的恒定区，其中一个或多个结构域部分或全部缺失。在一些实施例中，修饰的抗体将包含缺失结构域的构建体或变体，其中整个CH2结构域被移除(ΔCH2构建体)。在一些实施例中，省略的恒定区结构域可以被短氨基酸间隔子(例如，10个残基)替换，该间隔区提供通常由不存在的恒定区所赋予的一定分子灵活性。恒定区结构域的缺失或失活(经由点突变或其他手段)可以减少循环的经修饰的抗体的Fc受体结合。在其他情况下，与本发明一致的，恒定区修饰可以缓和补体结合并且因而减少缀合的细胞毒素的血清半衰期和非特异性缔合。恒定区的另外的修饰可以用于消除二硫键或寡糖部分，从而允许由于抗原特异性或抗体灵活性增加而增强定位。在一些实施例中，该抗体或其抗原结合片段不具有抗体依赖性细胞毒性(ADCC)活性和/或不具有补体依赖性细胞毒性(CDC)活性。
在一个实施例中，该抗体或其抗原结合片段可以被工程化以将CH3结构域直接融合到相应的经修饰的抗体或其片段的铰链区。在其他构建体中，可以将肽间隔子插在铰链区与经修饰的CH2和/或CH3结构域之间。例如，可表达相容性构建体，其中CH2结构域已经缺失，且剩余的CH3结构域(经修饰的或未修饰的)与具有5-20个氨基酸的间隔子的铰链区结合。可加入此间隔子，例如以确保恒定结构域的调节元件保持游离且可接触，或者铰链区保持柔性。在一些情况中，氨基酸间隔子可被证明具有免疫原性，并引发针对构建体的非所需免疫应答。在一些实施例中，加入至构建体的任何间隔子都可以是相对无免疫原性的，或甚至被完全省略，以便维持经修饰的抗体的所希望的生物化学性质。
除了缺失整个恒定区结构域之外，本文提供的抗体或其抗原结合片段可通过恒定区中的几个或甚至单个氨基酸的部分缺失或取代来修饰。例如，CH2结构域中的选定区域中的单个氨基酸的突变可足以实质性地减少Fc结合，并且从而增加肿瘤定位。类似地，控制效应子功能(例如，补体C1Q结合)的一个或多个恒定区结构域可以完全或部分缺失。恒定区的这类部分缺失可以改进该抗体或其抗原结合片段的选定特征(例如，血清半衰期)，同时使与受试者恒定区结构域相关的其他所希望的功能保持完整。此外，该抗体及其抗原结合片段的恒定区可通过增强所得构建体特性的一个或多个氨基酸的突变或取代来修饰。在这个方面，可以干扰保守结合位点所提供的活性(例如，Fc结合)，同时基本上维持经修饰的抗体或其抗原结合片段的构型和免疫原性特性。在一些实施例中，可以向恒定区加入一个或多个氨基酸以增强期望特征，如减少或增加效应子功能，或提供更多细胞毒素或碳水化合物附接。在一些实施例中，可以期望插入或复制衍生自选定的恒定区结构域的特定序列。在一些实施例中，重链恒定区或其片段(例如，人IgG恒定区或其片段)可相对于野生型IgG恒定结构域包括一个或多个氨基酸取代，其中与具有野生型IgG恒定结构域的IgG的半衰期相比，该经修饰的IgG具有增加的半衰期。例如，IgG恒定结构域可以含有在位置251-257、285-290、308-314、385-389、和428-436处的氨基酸残基的一个或多个氨基酸取代，其中根据如Kabat中所阐明的EU索引进行氨基酸位置编号。在一些实施例中，IgG恒定结构域可以含有以下中的一个或多个取代：Kabat位置252处的氨基酸被酪氨酸(Y)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、或苏氨酸(T)取代，Kabat位置254处的氨基酸被苏氨酸(T)取代，Kabat位置256处的氨基酸被丝氨酸(S)、精氨酸(R)、谷氨酰胺(Q)、谷氨酸(E)、天冬氨酸(D)、或苏氨酸(T)取代，Kabat位置257处的氨基酸被亮氨酸(L)取代，Kabat位置309处的氨基酸被脯氨酸(P)取代，Kabat位置311处的氨基酸被丝氨酸(S)取代，Kabat位置428处的氨基酸被苏氨酸(T)、亮氨酸(L)、苯丙氨酸(F)、或丝氨酸(S)取代，Kabat位置433处的氨基酸被精氨酸(R)、丝氨酸(S)、异亮氨酸(I)、脯氨酸(P)、或谷氨酰胺(Q)取代，或Kabat位置434处的氨基酸被色氨酸(W)、甲硫氨酸(M)、丝氨酸(S)、组氨酸(H)、苯丙氨酸(F)、或酪氨酸取代。在一些实施例中，该抗FRα抗体或其抗原结合片段包含YTE突变。术语“YTE”或“YTE突变体”是指IgG1 Fc中的突变，其导致与人FcRn的结合增加并且提高了具有该突变的抗体的血清半衰期。YTE突变体包含引入IgG1的重链的三个突变M252Y/S254T/T256E的组合(EU编号，Kabat等人(1991)Sequences ofProteins ofImmunological Interest[免疫学感兴趣的蛋白质序列]，U.S.Public Health Service[美国公共卫生署]，National Institutes ofHealth[美国国立卫生研究院]，华盛顿特区)。参见美国专利号7,658,921，将其通过引用并入本文。与相同抗体的野生型相比，YTE突变体显示出增加了抗体的血清半衰期大约四倍(Dall'Acqua等人,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]281:23514-24(2006)；Robbie等人,(2013)Antimicrob.Agents Chemother.[抗微生物药剂与化学疗法]57,6147-6153)。还参见美国专利号7,083,784，将其通过引用以其全文特此并入。
在一些实施例中，该抗FRα抗体或其抗原结合片段包含：
在VH的N末端(例如位置1)的L；
在VH的N末端(例如位置1)的E；或
在VH的N末端(例如位置1)的Q。
定义及抗体形式
如本文所使用的，术语“抗体”是指特异性结合特定抗原或与特定抗原发生免疫反应的免疫球蛋白分子。
本发明的抗体通常是分离的或重组的。“分离的”，当在本文用于指多肽(例如抗体)时，已经从表达它的细胞或细胞培养物中被鉴定和分离和/或回收。通常，经分离的抗体将通过至少一个纯化步骤来制备。因此，“分离的抗体”是指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体。例如，特异性结合FRα的分离抗体基本上不含特异性结合除FRα以外的抗原的抗体。
通常，抗体包含至少两条“轻链”(LC)和两条“重链”(HC)。这种抗体的轻链和重链是由几个结构域组成的多肽。每条重链都包含重链可变区(本文缩写为“VH”)和重链恒定区(本文缩写为“CH”)。重链恒定区包含重链恒定结构域CH1、CH2和CH3(抗体类别IgA、IgD和IgG)和任选的重链恒定结构域CH4(抗体类别IgE和IgM)。每条轻链都包含轻链可变结构域(本文缩写为“VL”)和轻链恒定结构域(本文缩写为“CL”)。
在一些实施例中，该抗体是全长抗体。如本文所使用的，“完整”或“全长”抗体是指具有通过二硫键相互连接的两条重(H)链多肽和两条轻(L)链多肽的抗体。
抗体的“可变区”指单独的抗体轻链的可变区或抗体重链的可变区或它们的组合。可变区VH和VL可以进一步细分为被称为互补决定区(CDR)的高变区(也称为高变区)，其间插入被称为框架区(FR)的更保守的区域。优选地，每个VH和VL都由三个CDR和四个FR构成，从氨基末端到羧基末端按照以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。抗体的VH或VL链可以进一步包含所有的或部分的重链或轻链恒定区。
抗体与其靶抗原或表位之间的结合由CDR介导。术语“表位”是指能够结合至(例如，被结合)本发明的抗体或抗原结合片段的靶蛋白区域(例如，多肽)。CDR是抗原特异性的主要决定因素。存在至少两种用于确定CDR的技术：(1)基于种间序列变异性的方法(即，Kabat等人Sequences of Proteins of Immunological Interest[免疫学感兴趣的蛋白质序列](第5版,1991,National Institutes of Health[美国国立卫生研究院],贝塞斯达(Bethesda),马里兰州(Md))；和(2)基于抗原抗体复合物的晶体学研究的方法(anapproach based on crystallographic studies of antigen-antibody complexes)(Al-lazikani等人(1997)J.Molec.Biol.[分子生物学杂志]273:927-948)。另外，本领域有时使用这两种方法的组合来确定CDR。
CDR的序列可以通过参考本领域已知的任何编号系统来识别，例如，Kabat系统(Kabat，E.A.等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest[免疫学感兴趣的蛋白质序列],第5版,Public Health Service[美国公共卫生署],National Institutesof Health[美国国立卫生研究院],马里兰州贝塞斯达(1991)；Chothia系统(Chothia和Lesk,“Canonical Structures for the Hypervariable Regions of Immunoglobulins,[免疫球蛋白高变区的典型结构]”J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]196,901-917(1987))；或IMGT系统(Lefranc等人,“IMGT Unique Numbering for Immunoglobulin and CellReceptor Variable Domains and Ig superfamily V-like domains,[免疫球蛋白和细胞受体可变结构域和Ig超家族V样结构域的IMGT唯一编号]”Dev.Comp.Immunol.[发育与比较免疫学]27,55-77(2003))(参见表6)。
表6：CDR定义
Kabat Chothia IMGT
VHCDR1 31-35 26-32 27-38
VHCDR2 50-65 52-56 56-65
VHCDR3 95-102 95-102 105-117
VLCDR1 24-34 24-34 27-38
VLCDR2 50-56 50-56 56-65
VLCDR3 89-97 89-97 105-117
重链和轻链的“恒定结构域”(或“恒定区”)不直接参与抗体与靶标的结合，但展现出各种效应子功能。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq))的结合。
存在五种主要类别的重链恒定区，分类为IgA、IgG、IgD、IgE和IgM，每一类具有通过同种型指定的特征性效应子功能。Ig分子与多个类别的细胞受体相互作用。例如，IgG分子与三类Fcγ受体(FcγR)(即FcγRI、FcγRII和FcγRIII)相互作用，这些Fcγ受体对抗体的IgG类别具有特异性。抗体与细胞表面上的Fc受体的结合触发许多重要并且多样的生物应答，包括抗体包覆的颗粒的吞噬和破环、免疫复合物的清除、杀灭细胞溶解抗体包覆的靶细胞(称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，或ADCC)、炎症介体的释放、胎盘转移、以及对免疫球蛋白产生的控制。已报道对于IgG与FcγR受体的结合重要的序列位于CH2和CH3结构域中。
在优选的实施例中，抗FRα抗体或其抗原结合片段是IgG同种型。抗FRα抗体或抗原结合片段可以是任何IgG亚类，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型。在优选的实施例中，抗FRα抗体或其抗原结合片段是基于IgG1同种型。使用接近天然IgG的野生型人IgG1分子可能会降低可开发性和其他风险。例如，本发明的诸位发明人设计了使用人IgG1 mAb结构的ADC，被认为是不受理论的束缚，其免疫原性将低于正在开发的其他抗FRαADC，如IMGN151。
对于本发明的抗体中讨论的重链恒定区氨基酸位置，编号是根据Edelman,G.M等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]63(1969)78-85)首次描述的EU索引。Edelman的EU编号也在Kabat等人(1991)(同上)中阐述。因此，在重链上下文中的术语“Kabat中阐明的EU索引”、“EU索引”“Kabat的EU索引”或“EU编号”是指基于如Edelman等人(1991)所阐述的人IgG1 EU抗体的残基编号系统。用于轻链恒定区氨基酸序列的编号系统类似地在Kabat等人(同上)阐述。因此，如本文所使用的，“根据Kabat编号”是指Kabat等人(同上)阐明的Kabat编号系统。
术语“Fc区”、“Fc部分”和“Fc”互换地使用并且指由两条Fc链形成的天然免疫球蛋白的部分。每条“Fc链”包含恒定结构域CH2和恒定结构域CH3。每条Fc链还可包含铰链区。天然Fc区是同源二聚化的。在一些实施例中，Fc区可能是异源二聚化的，因为它可能包含实施Fc异源二聚化的修饰。Fc区含有碳水化合物部分以及用于补体和Fc受体(包括FcRn受体)的结合位点，并且没有抗原结合活性。Fc可以指分离的这个区域，或在抗体、抗体片段、或Fc融合蛋白的背景下的这个区域。已在许多Fc结构域位点中发现多态性，包括但不限于EU位置270、272、312、315、356和358，导致本申请中描述的序列与本领域已知的序列之间的微小差异。因此，每个天然存在的IgG Fc区都称为“野生型IgG Fc结构域”或“WT IgG Fc结构域”(即任何等位基因)。人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4重链序列可在各种序列数据库中获得，包括UniProt数据库(www.uniprot.org)，分别在登录号P01857(IGHG1_HUMAN)、P01859(IGHG2_HUMAN)、P01860(IGHG3_HUMAN)和P01861(IGHG4_HUMAN)下。
在一些实施例中，本发明的抗FRα抗体是单克隆抗体。“单克隆抗体”(mAb)是指涉及单一抗原决定簇或表位的高度特异性识别和结合的同源抗体群体。这与典型地包括针对不同抗原决定簇的不同抗体的多克隆抗体相反。术语“单克隆抗体”可以涵盖全长单克隆抗体以及抗体片段(诸如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、单链(scFv)突变体、包含抗体部分的融合蛋白和包含抗原识别位点的任何其他修饰的免疫球蛋白分子。此外，“单克隆抗体”是指以任何数目的方式制备的此类抗体，这些方式包括但不限于杂交瘤、噬菌体选择、重组表达、和转基因动物。更优选地，本发明的抗FRα抗体是分离的单克隆抗体。在一个更优选的实施例中，该抗体是完全人单克隆抗体。在可替代的实施例中，本发明的方法可以使用多克隆抗体。
本发明抗FRα抗体及其抗原结合片段可以通过重组手段衍生自任何物种。例如，抗体或抗原结合片段可以是小鼠、大鼠、山羊、马、猪、牛、鸡、兔、骆驼、驴、人或其嵌合形式。对于施用至人的用途，可以将非人衍生的抗体或抗原结合片段进行基因或结构改变以在施用至人患者时具有较低免疫原性。尤其优选的是人或人源化抗体，尤其是作为重组人或人源化抗体。
术语“人抗体”意指在人体中产生的抗体或具有与使用本领域已知的任何技术制备的在人体中产生的抗体对应的氨基酸序列的抗体。人抗体包括完整或全长抗体、其片段、和/或包含至少一个人重链和/或轻链多肽的抗体，例如像包含鼠轻链和人重链多肽的抗体。人抗体可以包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如在体外或基因重排期间通过随机或位点特异性诱变、或在体内通过体细胞突变引入的突变)。人抗体可以在人细胞(通过重组表达)、非人动物或可以表达功能重排的人类免疫球蛋白(如重链和轻链)基因的原核或真核细胞中制备。天然人抗体中未发现的接头肽可包括在单链人抗体中。例如，Fv可以具有连接重链可变区和轻链可变区的接头肽，例如两个至约八个甘氨酸或其他氨基酸残基。这些接头肽被认为是人类来源的。可以使用各种技术生产人抗体，包括使用源自人免疫球蛋白序列的抗体文库的噬菌体展示技术。不能表达功能性固有免疫球蛋白但可表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠也可用于制备人抗体(参见例如，PCT公开号WO 1998/24893、WO 1992/01047、WO 1996/34096、WO 1996/33735；美国专利号5,413,923、5,625,126、5,633,425、5,569,825、5,661,016、5,545,806、5,814,318、5,885,793、5,916,771、以及5,939,598，其中每一个都通过引入并入本文)。还可以使用本领域已知的各种技术来直接制备人抗体。可以产生在体外免疫的或从产生针对靶抗原的抗体的免疫个体分离的永生化人B淋巴细胞。参见例如，Cole等人,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy[单克隆抗体和癌症疗法],Alan R.Liss[奥兰李斯公司],第77页(1985)；Boemer等人,J.Immunol.[免疫学杂志]147(1):86-95(1991)；美国专利5,750,373。
术语“人源化抗体”是指：其中与亲本免疫球蛋白相比，框架或CDR已被修饰以包含不同特异性的免疫球蛋白的CDR的抗体。例如，可以将鼠CDR移植到人抗体的构架区中以制备“人源化抗体”。参见例如，Riechmann,L.等人,Nature[自然]332(1988)323-327；以及Neuberger,M.S.等人,Nature[自然]314(1985)268-270。在一些实施例中，“人源化抗体”是其中恒定区已从原始抗体的恒定区被额外地修饰或改变以产生所需特性的那些。
人源化抗体可以任选地通过使用亲本、工程化和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化和工程化产品的过程来制备。三维免疫球蛋白模型通常是可获得的并且对于本领域普通技术人员而言是熟悉的。说明并展示所选定的候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序是可获得的。检查这些展示允许分析残基在候选免疫球蛋白序列功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原诸如FRα的能力的残基。以这种方式，可以从共有序列和输入的序列中选择并且组合FR残基，这样使得所希望的抗体特征(诸如增加对一种或多种靶抗原的亲和力)得以实现。
人源化抗体可以通过在Fv框架区和/或替换的非人残基内的另外残基的取代来进一步修饰，以改善和优化抗体特异性、亲和力和/或能力。一般来讲，人源化抗体将包含基本上所有至少一个(并且典型地是两个或三个)可变结构域，该可变结构域含有对应于非人类免疫球蛋白的所有或基本上所有CDR区，而所有或基本上所有FR区是人类免疫球蛋白共有序列的那些。人源化抗体还可以包含免疫球蛋白恒定区或结构域(Fc)的至少一部分、典型地是人免疫球蛋白的恒定区或结构域。用于产生人源化抗体的方法的例子被描述于美国专利号5,225,539或5,639,641，其每一个都通过引用并入本文。
术语“嵌合抗体”是指包含来自一个来源或物种的可变区(即结合区)和衍生自不同来源或物种的至少一部分恒定区的抗体，通常通过重组DNA技术制备。包含鼠可变区和人恒定区的嵌合抗体是优选的。本发明涵盖的“嵌合抗体”的其他优选形式是其中恒定区已经从原始抗体的恒定区被修饰或改变以产生所需特性的那些。这种嵌合抗体也称为“类别转换抗体”。嵌合抗体是表达的免疫球蛋白基因的产物，其包含编码免疫球蛋白可变区的DNA片段和编码免疫球蛋白恒定区的DNA片段。涉及常规重组DNA和基因转染技术的用于产生嵌合抗体的方法是本领域熟知的。参见例如,Morrison,S.L.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]81(1984)6851-6855；美国专利号5,202,238和5,204,244，其中每一个都通过引入并入本文。
在一些实施例中，本发明的抗体是上文所述的全长抗体。可替代地，抗体可以是抗原结合片段。如本文所使用的术语“抗原结合片段”包括：包含一个、两个或三个轻链CDR和/或一个、两个或三个重链CDR的抗原结合多肽的任何天然存在或人工构建的构型，其中该多肽能够结合抗原。
在一些实施例中，本发明的抗原结合片段是Fab片段。根据本发明的抗体还可以是Fab'、Fv、scFv、Fd、VNAR结构域、IgNAR、胞内抗体、IgG CH2、微抗体、单结构域抗体、Fcab、scFv-Fc、F(ab')2、二-scFv、双特异性T细胞衔接器F(ab')3、四抗体、三抗体、双抗体、DVD-Ig、(scFv)2、mAb2或DARPin。
术语“Fab片段”和“Fab”本文可互换使用并含有单一轻链(例如恒定结构域CL和VL)和单一重链(例如恒定结构域CH1和VH)。Fab片段的重链不能与另一条重链形成二硫键。
“Fab'片段”含有单一轻链和单一重链，但除了CH1和VH之外，“Fab'片段”还含有CH1和CH2结构域之间的重链区，这是形成链间二硫键所必需的。因此，两个“Fab'片段”可以通过形成二硫键缔合以形成F(ab')2分子。
“F(ab')2片段”含有两条轻链和两条重链。每条链都包括在两条重链之间形成链间二硫键所必需的恒定区的一部分。
“Fv片段”仅含有重链和轻链的可变区。它不含有恒定区。
“单结构域抗体”是含有单个抗体结构域单元(例如，VH或VL)的抗体片段。
“单链Fv”(“scFv”)是含有抗体的VH和VL结构域的抗体片段，连接在一起形成单链。多肽接头通常用于连接scFv的VH和VL结构域。
“串联scFv”，也称为是由两个scFv以串联方向与柔性肽接头的共价键合形成的单链Fv分子。
“双特异性T细胞衔接器”是由在一条肽链上的两个单链可变片段(scFv)组成的融合蛋白。scFv中的一个经由CD3受体与T细胞结合，而另一个与肿瘤细胞抗原结合。
“双抗体”是小的二价和双特异性抗体片段，其包含：被连接到在由多肽接头连接的相同多肽链(VH-VL)上的轻链可变结构域(VL)的重链可变结构域(VH)，该肽接头太短无法允许在相同链上的两个结构域之间配对(Kipriyanov,Int.J.Cancer[国际癌症期刊]77(1998),763-772)。这迫使与另一条链的互补结构域配对，并促进具有两个功能性抗原结合位点的二聚体分子的组装。
“DARPin”是双特异性锚蛋白重复分子。DARPin源自天然锚蛋白，可在人类基因组中找到并且是最丰富的结合蛋白类型之一。DARPin库模块由天然锚蛋白重复蛋白序列定义，将229个锚蛋白重复序列用于初始设计和将另外2200个用于后续细化。该模块充当用于DARPin库的构建块。库模块类似于人类基因组序列。DARPin由4到6个模块组成。因为每个模块大约3.5kDa，平均DARPin的大小为16-21kDa。结合物的选择通过完全无细胞的核糖体展示完成，并在He M.和Taussig MJ.,Biochem Soc Trans.[生物化学学会学报]2007年11月；35(Pt 5):962-5中有所描述。
在一些实施例中，本发明的抗FRα抗体及其抗原结合片段是裸抗体。如本文所使用的术语“裸抗体”用于指未与治疗剂(例如细胞毒性药剂或放射性标记)缀合的抗体。在实施例中，抗体或其抗原结合片段是裸的单特异性抗体。在替代的优选实施例中，抗体或其抗原结合片段与一种或多种异源药剂(例如细胞毒性药剂)缀合。
在一些实施例中，该抗体或其抗原结合片段可以被进一步修饰，以含有通常不是蛋白质的一部分的另外的化学部分。那些衍生的部分可以改进蛋白质的溶解性、生物半衰期或吸收。这些部分还可以减少或消除蛋白质的任何所希望的副作用等。对那些部分的综述可以在Remington's Pharmaceutical Sciences[雷明顿药物科学],第22版,LloydV.Allen,Jr.编辑,(2012)中发现。
FRα结合
在优选的实施例中，本发明的抗FRα抗体及其抗原结合片段特异性结合至FRα。术语“特异性结合至FRα”是指能够以足够亲和力结合至确定的靶标，从而该抗体可用作靶向FRα的治疗剂。在一些实施例中，特异性结合至FRα的抗体不结合至其他抗原，或不结合至具有足够的亲和力以产生生理效应的其他抗原。在一些实施例中，本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段特异性结合人FRα(UniProt ID：P15328)和/或食蟹猴FRα(UniProt ID：A0A2K5U044)。在特别优选的实施例中，本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段特异性结合至人FRα。在优选的实施例中，本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段特异性结合至人FRα和食蟹猴FRα。
在本发明的任何方面的一些实施例中，FRα具有SEQ ID NO:112或SEQ ID NO:113的序列。在优选实施例中，FRα具有SEQ ID NO:112的序列。
SEQ ID NO:112：人FRα蛋白(预测成熟、分泌的多肽)RIAWARTELLNVCMNAKHHKEKPGPEDKLHEQCRPWRKNACCSTNTSQEAHKDVSYLYRFNWNHCGEMAPACKRHFIQDTCLYECSPNLGPWIQQVDQSWRKERVLNVPLCKEDCEQWWEDCRTSYTCKSNWHKGWNWTSGFNKCAVGAACQPFHFYFPTPTVLCNEIWTHSYKVSNYSRGSGRCIQMWFDPAQGNPNEEVARFYAAAMS
SEQ ID NO:113：食蟹猴FRα蛋白(预测成熟、分泌的多肽)RTARARTELLNVCMNAKHHKEKPGPEDKLHEQCRPWKKNACCSTNTSQEAHKDVSYLYRFNWNHCGEMAPACKRHFIQDTCLYECSPNLGPWIQQVDQSWRKERVLNVPLCKEDCEQWWEDCRTSYTCKSNWHKGWNWTSGFNKCPVGAACQPFHFYFPTPTVLCNEIWTYSYKVSNYSRGSGRCIQMWFDPAQGNPNEEVARFYAAAMS
在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段不结合至选自小鼠FRα(UniProt ID:P35846)、大鼠FRα(UniProt ID:G3V8M6)、人FRβ(UniProt ID:P14207)、人FRγ(UniProtID：P41439)或其组合的一种或多种。
术语“不结合”是指本发明的抗体或其抗原结合片段基本上不结合至所述分子(例如小鼠FRα、大鼠FRα、人FRβ、人FRγ或其组合)中的一种或多种。当在本文的结合背景下使用时，术语“基本上没有”可表示细胞培养物中表达一种或多种所述分子的细胞的少于5％、2％、1％、0.5％或0.1％被本发明的抗体或其抗原结合片段结合(在接触时)。合适地，当在本文的结合背景下使用时，术语“基本上没有”可表示没有这样的细胞被结合。
结合亲和力
“结合亲和力”通常是指分子(例如，抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如，抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，否则如本文所使用的，“结合亲和力”是指反映结合对(例如，抗体和抗原)的成员之间的1:1相互作用的固有结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以用解离常数(KD)表示。亲和力可以通过本领域已知的常见方法(包括本文所述的那些)测量。低亲和力抗体通常缓慢地结合抗原并且倾向于容易解离，而高亲和力抗体通常更快地结合抗原并且倾向于保持更长时间的结合。
合适地，本发明的抗体或抗原结合片段以足够的亲和力结合FRα分子，使得该抗体可用作靶向FRα的治疗剂或诊断试剂。
在一些实施例中，以约50nM或更小、约40nM或更小、约30nM或更小、约20nM或更小、约10nM或更小、约5nM或更小、约2nM或更小、约1nM或更小的KD，抗FRα抗体或其抗原结合片段结合至人FRα。
在一些实施例中，以约0.5至约50nM、约0.5至约40nM、约0.5至约30nM、约0.5至约20nM、约1至约50nM、约1至约40nM、约1至约30nM、约1至约20nM、约2至约50nM、约2至约40nM、约2至约30nM、约2至约20nM、约5至约50nM、约5至约40nM、约5至约30nM、约5至约20nM、约10至约50nM、约10至约40nM、约10至约30nM、或约10至约20nM的KD，抗FRα抗体或其抗原结合片段结合人FRα。
在一些实施例中，以约100nM或更小、约80nM或更小、约60nM或更小、约40nM或更小、约30nM或更小、约20nM或更小、约10nM或更小、约5nM或更小、约2nM或更小的KD，抗FRα抗体或其抗原结合片段结合至食蟹猴FRα。
在一些实施例中，以约1至约100nM、约1至约80nM、约1至约60nM、约1至约40nM、约2至约100nM、约2至约80nM，、约2至约60nM、约2至约40nM、约5至约100nM、约5至约80nM、约5至约60nM、约5至约40nM、约10至约100nM、约10至约80nM、约10至约60nM、约10至约40nM、约20至约100nM，约20至约80nM、约20至约60nM、约20至约40nM、约30至约100nM、约30至约80nM、约30至约60nM、或约30至约40nM的KD，抗FRα抗体或其抗原结合片段结合人FRα。
抗体或其抗原结合片段对抗原的亲和力或亲合力可以使用本领域熟知的任何合适的方法(例如，流式细胞术、酶联免疫吸附测定(ELISA)、或放射免疫测定(RIA)、或动力学(例如或BIACORETM分析))经实验确定。可以容易地采用直接结合测定以及竞争性结合测定形式。(参见例如,Berzofsky等人,Antibody-Antigen Interactions[抗体-抗原相互作用],于Fundamental Immunology[基础免疫学],Paul,W.E.,编辑,Raven Press[雷文出版社]:纽约,纽约州(1984)；Kuby,Immunology[免疫学],W.H.Freeman和Company出版商:纽约,纽约州(1992)；以及本文所述的方法。)
根据本发明，本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段的结合亲和力可以使用如本文所述的FRα结合亲和力测定来确定。在一些实施例中，本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段的结合亲和力由Biacore(例如25℃下的Biacore T200)确定。例如，重组人FRαECD对抗FRα抗体或其抗原结合片段的亲和力可以使用Biacore T200在25℃下测量，例如使用以下方案。使用标准胺偶联技术使在10mM乙酸钠(pH 4.0)中呈50μg/ml浓度的蛋白A共价固定于CM5芯片表面上。抗体或其抗原结合片段以10μl/min被捕获到HBS-EP+缓冲液(pH7.4)中的蛋白A表面，以确保FRαECD结合。FRαECD连续稀释(0.4nM-100nM人FRαECD、0.8nM-200nM食蟹猴FRαECD、30nM-4000nM小鼠FRαECD和大鼠FRαECD)在HBS-EP+缓冲液(pH 7.4)中，并以50μl/min流过芯片，缔合2分钟，并解离8分钟。用3M MgCl2脉冲完全再生该芯片表面，以去除捕获的抗体或其抗原结合片段，以及任何结合的FRαECD。在相同条件下进行多次仅缓冲液注射，以允许对使用Biacore T200评估软件进行分析的最终传感图集进行双重参考减法。
可替代地，本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段的结合亲和力可由Octet(例如Octet red)确定。例如，可以通过Octet red在25℃下测定抗FRα抗体的结合亲和力，例如使用以下方案。结合测定在Octet RED384(佛特比奥公司(ForteBio))上于25℃在含有PBS、0.1％v/v BSA(西格玛公司(Sigma)，A9576)、0.01％v/v Tween-20(西格玛公司，P9416)(pH7.4)的测定缓冲液中进行，使用倾斜底部黑色384孔板(佛特比奥公司，18-5076)。根据制造商的说明，使用蛋白A或抗人捕获生物传感器(AHC)(佛特比奥公司，18-5089)设置测定。将10μg/ml的抗大鼠FRαIgG(义翘神州科技股份有限公司(Sino Biological)，81073-RP01)包被到蛋白A生物传感器(佛特比奥公司，NC9490476)上，并将10μg/ml的测试人IgG上样到抗人捕获生物传感器(AHC)(佛特比奥公司，18-5089)持续180秒。通过将上样的生物传感器与500nM人FRα(内部)或500nM大鼠FRα(义翘神州科技股份有限公司，81073-R08H)一起孵育来测量缔合。在转移到测定缓冲液中后测量解离。使用Octet数据分析软件7.0版分析数据。
抗体制备
在进一步的方面，本发明提供了产生本发明的抗FRα抗体及其抗原结合片段的方法，该方法包括培养表达重链和轻链的重组宿主细胞并分离由该细胞产生的该抗体或抗原结合片段。
在优选的实施例中，用于产生抗体或其抗原结合片段的方法，该方法包括(a)培养宿主细胞和(b)从该细胞中分离所表达的抗体或其抗原结合片段。
本发明的抗体可以通过以下方式被产生：用包含编码相应抗体或片段的多核苷酸的一种或多种载体转染宿主细胞，在允许合成所述抗体分子的条件下培养宿主细胞；以及从所述培养物中回收所述抗体分子。
在一些实施例中，方法包括如下步骤：
a)用包含编码本发明抗体的重链和轻链组的多核苷酸的一种或多种载体转染宿主细胞；
b)在允许合成所述抗体分子的条件下培养该宿主细胞；以及
c)从所述培养物中回收所述抗体分子。
在优选的实施例中，方法包括如下步骤：
a)用包含编码本发明抗体的轻链和重链的多核苷酸的载体转染宿主细胞；
b)在允许合成所述抗体分子的条件下培养该宿主细胞；以及
c)从所述培养物中回收所述抗体分子。
本发明进一步包括可通过所述用于产生结合FRα多肽(例如，FRα多肽表位)的抗体或其抗原结合片段的方法获得的抗体或其抗原结合片段。
抗体或其抗原结合片段(例如，单克隆抗体)可以使用如在美国专利号4,816,567(其通过引用并入本文)中所述的重组DNA方法制备。从成熟B细胞或杂交瘤细胞，诸如通过使用寡核苷酸引物(其特异性扩增编码抗体的重链和轻链的基因)的RT-PCR分离编码单克隆抗体的多核苷酸，并且使用常规程序测定它们的序列。然后将编码重链和轻链的分离的多核苷酸克隆到适合的表达载体中，这些载体在转染进入不产生免疫球蛋白的宿主细胞，如大肠杆菌细胞、类人猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、或骨髓瘤细胞中时，通过这些宿主细胞生产单克隆抗体。此外，所希望物种的重组单克隆抗体或其抗原结合片段可以从表达所希望物种的CDR的噬菌体展示文库中分离，如以下文献所述：McCafferty等人,Nature[自然]348:552-554(1990)；Clackson等人,Nature[自然],352:624-628(1991)；以及Marks等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]222:581-597(1991)。
亲和力成熟策略和链改组策略是本领域已知的，并且可用于产生高亲和力人抗体或其抗原结合片段。参见Marks等人,BioTechnology[生物技术]10:779-783(1992)，将其通过引用以其全文并入。
已知各种用于产生抗体片段的技术。传统上，这些片段通过完整抗体的蛋白水解衍生，例如由Morimoto等人,J.Biochem.Biophys.Meth.[生物化学和生物物理方法杂志]24:107-117(1993)以及Brennan等人,Science[科学]229:81(1985)所描述的。在一些实施例中，抗FRα抗体片段是重组地产生的。所有Fab、Fv和scFv抗体片段都可以在大肠杆菌或其他宿主细胞中表达并且从其分泌，因而允许产生大量的这些片段。此类抗FRα抗体片段也可以从以上讨论的抗体噬菌体文库分离。这些抗FRα抗体片段还可以是如美国专利号5,641,870中所述的线性抗体，将其通过引用并入本文。用于产生抗体片段的其他技术对于熟练的从业人员将是清楚的。
根据本发明，技术可以经改编以产生对FRα具有特异性的单链抗体。(参见例如，美国专利号4,946,778)。此外，方法可以经改编以构建Fab表达文库，以允许快速且有效地鉴定针对FRα或其衍生物、片段、类似物或同源物具有所希望特异性的单克隆Fab片段。参见例如，Huse等人,Science[科学]246:1275-1281(1989)。通过本领域已知的技术可以生产抗体片段，包括但不限于：由抗体分子的胃蛋白酶消化产生的F(ab')2片段；通过还原F(ab')2片段的二硫键产生的Fab片段；通过用木瓜蛋白酶和还原剂处理抗体分子产生的Fab片段；或Fv片段。
抗体-药物缀合物(ADC)
还提供了包含抗FRα抗体或其抗原结合片段的ADC。
异源药剂
在一些实施例中，本发明的抗体或抗原结合片段连接至异源药剂。在优选的实施例中，该抗体或抗原结合片段与异源药剂缀合。合适地，“缀合”意指经由共价键或离子键连接。
在一些实施例中，该抗体或抗原结合片段与一种或多种异源药剂缀合，该一种或多种异源药剂选自由以下组成的组：拓扑异构酶I抑制剂(TOPOi)、微管溶素衍生物、吡咯并苯并二氮杂抗微生物剂、治疗剂、前药、肽、蛋白质、酶、脂质、生物应答调节剂、药学药剂、淋巴因子、异源抗体、异源抗体的片段、可检测标记、聚乙二醇(PEG)、放射性同位素、或其组合。
在一些实施例中，异源药剂可以药物。优选地，异源药剂是细胞毒素。例如，该抗体或抗原结合片段可以与此类异源药剂缀合以提供“抗体-药物缀合物”(ADC)。
在本发明的另一方面，提供包含根据本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段的ADC，其中该抗FRα抗体或其抗原结合片段与细胞毒素缀合。
异源药剂通常连接至该抗体或抗原结合片段或“加载到”该抗体或抗原结合片段上。药剂载量(p)是每个抗体或抗原结合片段的平均药剂数量。本领域技术人员将理解，所述药剂(例如，TOPOi)中的多于一种可以与该抗体或其抗原结合片段缀合。
在一些实施例中，每个抗体(或其抗原结合片段)的平均药剂数量在约1至20的范围内。在一些实施例中，该范围选自约1至10、约2至10、约2至8、约2至6、以及约4至10。在一些实施例中，每个抗体(或其抗原结合片段)上存在一个药剂。在一些实施例中，每个抗体(或其抗原结合片段)上的药剂数量可以表示为药剂(即，药物)与抗体的比率。这个比率被称为药物与抗体比率(DAR)。”DAR是连接至每个抗体的药物(即，药剂)的平均数量。在本发明的一些实施例中，DAR在约1至20的范围内。在一些实施例中，DAR的范围选自约1至10、约2至10、约2至8、约2至6、以及约4至10。在优选的实施例中，DAR为约4(例如3.8-4.2)或约8(例如7.6-8.4)，更优选地约8(例如7.6-8.4)。
接头
抗体或抗原结合片段可以通过接头与异源药剂(例如细胞毒性药剂)缀合。
如本文所使用的，术语“接头”或“间隔子”是指包含共价键或原子链的二价化学部分，其将抗体或其抗原结合片段共价连接至异源药剂(例如细胞毒素)以形成缀合物(例如ADC)。在一些实施例中，该接头或间隔子是肽间隔子。在一些实施例中，该接头或间隔子是非肽(例如，化学的)间隔子。合适的接头具有两个反应性末端，一个用于抗体缀合，另一个用于异源药剂缀合。由于在接头和/或异源药剂(例如细胞毒素)之间以及接头和/或抗体或其抗原结合片段之间形成键，一个或两个反应性末端将不存在或不完整(例如因为只是羧酸的羰基)。下面更详细地讨论这些缀合反应。
在优选实施例中，该接头以可裂解的方式附接(例如，缀合)至氨基残基，例如，本文所述的抗体或抗原结合片段的氨基酸。
在一些实施例中，接头在细胞内环境下是可切割的，从而允许药物单元在细胞内环境中从抗体中被释放出来。
或者，接头单元可能是不可切割的。在此类实施例中，药物被释放，例如通过抗体降解。然而，不可切割的有效负载需要在溶酶体中完全消化mAb，并且生成的含药产物可能极性太强，例如用于达到旁观者效应。
与异源药剂(例如ADC)连接的抗体在被运输或递送到细胞中之前优选是稳定且完整的，即抗体应连接到药物部分。在靶细胞之外，接头是稳定的，但在细胞内，它们可以高速率被切割。有效的接头将：(i)维持抗体的特异性结合特性；(ii)允许缀合物或药物部分的细胞内递送；(iii)保持稳定和完整(即不切割)，直到缀合物被递送或运输到其靶位点；(iv)维持细胞毒性部分的细胞杀伤或静胞效应。质谱、HPLC和分离/分析技术LC/MS的标准分析方法可用于评估与异源药剂(例如ADC)连接的抗体的稳定性。
接头可以通过例如酶促水解、光解、酸性条件下的水解、碱性条件下的水解、氧化、二硫化物还原、亲核裂解或有机金属裂解来裂解(参见例如，Leriche等人,Bioorg.Med.Chem.[生物有机与药物化学快报],20:571-582,2012)。
在酸性条件下可水解的接头包括例如腙、缩氨基脲、缩氨基硫脲、顺乌头酰胺、原酸酯、缩醛、缩酮等。(参见例如，美国专利号5,122,368、5,824,805、5,622,929，Dubowchik和Walker,1999,Pharm.Therapeutics[药理学与治疗学]83:67-123；Ohtsuka等人，1989,Biol.Chem.[生物化学杂志]264:14653-14661)。在还原条件下可切割的接头包括例如二硫化物。多种二硫化物接头是本领域已知的，包括例如可以使用SATA(N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰硫代乙酸酯)、SPDP(N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶二硫基)丙酸酯)、SPDB(N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶二硫代)丁酸酯)和SMPT(N-琥珀酰亚胺基-氧羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫基)甲苯)形成的那些(参见例如，Thorpe等人,1987,CancerRes.[癌症研究]47:5924-5931；Wawrzynczak等人，In Immunoconjugates:Antibody Conjugates in Radioimaging andTherapy of Cancer[免疫缀合物中：放射成像和癌症治疗中的抗体缀合物](C.W.Vogel编辑,Oxford U.Press[牛津大学出版社],1987))。
在优选的实施例中，接头易于酶促水解。此类接头优于pH敏感的可裂解接头，后者可能不够稳定并在到达靶细胞之前过早裂解，且因此可能会观察到潜在的脱靶毒性。酶促可裂解接头可以是，例如，被细胞内肽酶或蛋白酶裂解的含肽接头，包括但不限于溶酶体或内体蛋白酶。使用治疗药物的细胞内蛋白水解释放的一个好处是药剂在缀合时通常会减弱，并且缀合物的血清稳定性通常很高。在一些实施例中，肽基接头是至少两个氨基酸长或至少三个氨基酸长。示例性氨基酸接头包括二肽、三肽、四肽或五肽。包含氨基酸缬氨酸、丙氨酸、瓜氨酸(Cit)、苯丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸和甘氨酸的肽是适当肽的实例。天然氨基酸、次要氨基酸和非天然存在的氨基酸类似物，例如瓜氨酸，都是构成氨基酸接头组分的氨基酸残基的实例。示例性二肽包括缬氨酸-瓜氨酸(VC或Val-Cit)和丙氨酸-苯丙氨酸(AF或Ala-Phe)。示例性三肽包括甘氨酸-缬氨酸-瓜氨酸(Gly-Val-Cit)和甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(Gly-Gly-Gly)。在一些实施例中，接头包括二肽，例如Val-Cit、Ala-Val或Phe-Lys、Val-Lys、Ala-Lys、Phe-Cit、Leu-Cit、Ile-Cit、Phe-Arg或Trp-Cit。
在一些实施例中，接头包含PEG。含有PEG的稳定的蛋白酶可裂解接头可以限制有效载荷的疏水性，并能够选择性地裂解和释放靶癌细胞内的游离药物。如本文所述的接头疏水性较低的性质可以使药物高负载到抗体或抗原结合片段(例如DAR8)上而不聚集，这将显著高于索星-米妥昔单抗(DAR3-4)或其衍生物，例如IMGN151(DAR3.5)。这可以使ADC通过与癌细胞上的FRα结合，可以将显著更高浓度的细胞毒素有效载荷递送到靶癌细胞。
在一些实施例中，接头包含马来酰亚胺。在接头中使用马来酰亚胺可以允许通过使用抗体中的天然链间二硫化物来生成DAR8和DAR4 ADC。这优于表面胺与赖氨酸残基的缀合，后者可能导致DAR种类和批次间变异性的混合物。如果缀合位点干扰抗原结合，也可能存在影响ADC功效的重现性问题。此外，其他缀合方法，例如涉及工程化抗体的叠氮-炔烃点击化学可能不容易达到超过4的DAR。
在某些实施例中，本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段通过选自以下的接头RL连接至异源药剂(优选细胞毒素)：
(Ia):
其中
Q是：
其中QX使得Q为氨基酸残基、二肽残基、三肽残基或四肽残基；
X是：
其中a＝0至5，b1＝0至16，b2＝0至16，c1＝0或1，c2＝0或1，d＝0至5，其中至少b1或b2＝0(即b1和b2中只有一个可以不是0)并且至少c1或c2＝0(即c1和c2中只有一个可以不是0)；
GL是用于连接至本发明的抗体或其抗原结合片段的接头；
(Ib)：
其中RL1和RL2独立地选自H和甲基，或与它们所结合的碳原子一起形成环丙烯或环丁烯基团；并且e是0或1；或
(Ib’)
其中RL1和RL2如上所定义。
通过举例的方式，将概述GL、X、QX(例如在上述Ia的接头内)和Ib的接头的优选实施例。
以下偏好可以应用本文所述的本发明的所有方面，或者可以涉及单个方面。这些偏好能以任何组合被组合在一起。
在下文提供的标题“化学定义”下提供了涉及本节中的某些术语的各种定义。
GL
GL可以选自：
其中Ar表示C5-6亚芳基基团，例如亚苯基，并且X表示C1-4烷基。
在一些实施例中，GL选自GL1-1和GL1-2。在这些实施例的一些中，GL是GL1-1。
X
X优选为：
其中a＝0至5，b1＝0至16，b2＝0至16，c＝0或1，d＝0至5，其中至少b1或b2＝0并且至少c1或c2＝0。
a可以是0、1、2、3、4或5。在一些实施例中，a是0至3。在这些实施例的一些中，a是0或1。在另外的实施例中，a是0。
b1可以是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。在一些实施例中，b1是0至12。在这些实施例的一些中，b1是0至8，并且可以是0、2、3、4、5或8。
b2可以是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。在一些实施例中，b2是0至12。在这些实施例的一些中，b2是0至8，并且可以是0、2、3、4、5或8。优选地，b1和b2中只有一个可以不是0。
c1可以是0或1。c2可以是0或1。优选地，c1和c2中只有一个可以不是0。
d可以是0、1、2、3、4或5。在一些实施例中，d是0至3。在这些实施例的一些中，d是1或2。在另外的实施例中，d是2。在另外的实施例中，d是5。
在X的一些实施例中，a是0，b1是0，c1是1，c2是0并且d是2，并且b2可以是从0至8。在这些实施例的一些中，b2是0、2、3、4、5或8。在X的一些实施例中，a是1，b2是0，c1是0，c2是0并且d是0，并且b1可以是从0至8。在这些实施例的一些中，b1是0、2、3、4、5或8。在X的一些实施例中，a是0，b1是0，c1是0，c2是0并且d是1，并且b2可以是从0至8。在这些实施例的一些中，b2是0、2、3、4、5或8。在X的一些实施例中，b1是0，b2是0，c1是0，c2是0并且a和d之一是0。a和d中另一个是从1至5。在这些实施例的一些中，a和d中另一个是1。在另一些这些实施例中，a和d中另一个是5。在X的一些实施例中，a是1，b2是0，c1是0，c2是1，d是2，并且b1可以是从0至8。在这些实施例的一些中，b2是0、2、3、4、5或8。
QX
在一些实施例中，Q是氨基酸残基。氨基酸可以是天然氨基酸或非天然氨基酸。例如，Q可以选自：Phe、Lys、Val、Ala、Cit、Leu、Ile、Arg、和Trp，其中Cit是瓜氨酸。
在一些实施例中，Q包含二肽残基。二肽中的氨基酸可以是天然氨基酸和非天然氨基酸的任何组合。在一些实施例中，二肽包含天然氨基酸。当接头是组织蛋白酶不稳定接头时，二肽是组织蛋白酶介导的切割的作用位点。然后，二肽是组织蛋白酶的识别位点。
在一些实施例中，Q选自：
NH-Phe-Lys-C＝O、
NH-Val-Ala-C＝O、
NH-Val-Lys-C＝O、
NH-Ala-Lys-C＝O、
NH-Val-Cit-C＝O、
NH-Phe-Cit-C＝O、
NH-Leu-Cit-C＝O、
NH-Ile-Cit-C＝O、
NH-Phe-Arg-C＝O、
NH-Trp-Cit-C＝O、和
NH-Gly-Val-C＝O；
其中Cit是瓜氨酸。
优选地，Q选自：
NH-Phe-Lys-C＝O、
NH-Val-Ala-C＝O、
NH-Val-Lys-C＝O、
NH-Ala-Lys-C＝O、和
NH-Val-Cit-C＝O。
更优选地，Q选自NH-Phe-Lys-C＝O、NH-Val-Cit-C＝O或NH-Val-Ala-C＝O。
其他合适的二肽组合包括：
NH-Gly-Gly-C＝O、
NH-Gly-Val-C＝O
NH-Pro-Pro-C＝O、和
NH-Val-Glu-C＝O。
可以使用其他二肽组合，包括由Dubowchik等人,Bioconjugate Chemistry[生物缀合化学],2002,13,855-869描述的那些，将其通过援引并入本文。
在一些实施例中，Q是三肽残基。三肽中的氨基酸可以是天然氨基酸和非天然氨基酸的任何组合。在一些实施例中，三肽包含天然氨基酸。当接头是组织蛋白酶不稳定接头时，三肽是组织蛋白酶介导的切割的作用位点。然后，三肽是组织蛋白酶的识别位点。特别感兴趣的三肽接头是：
NH-Glu-Val-Ala-C＝O
NH-Glu-Val-Cit-C＝O
NH-αGlu-Val-Ala-C＝O
NH-αGlu-Val-Cit-C＝O
在一些实施例中，Q是四肽残基。四肽中的氨基酸可以是天然氨基酸和非天然氨基酸的任何组合。在一些实施例中，四肽包含天然氨基酸。当接头是组织蛋白酶不稳定接头时，四肽是组织蛋白酶介导的切割的作用位点。然后，四肽是组织蛋白酶的识别位点。特别感兴趣的四肽接头是：
NH-Gly-Gly-Phe-GlyC＝O；以及
NH-Gly-Phe-Gly-GlyC＝O。
在一些实施例中，四肽是：
NH-Gly-Gly-Phe-GlyC＝O。
在上述肽残基的表示中，NH-表示残基的N末端，并且-C＝O表示残基的C末端。C末端与“药物单元”的NH(例如下面讨论的A*)结合。
Glu表示谷氨酸的残基，即：
αGlu表示当经由α链结合时的谷氨酸的残基，即：
在一些实施例中，在适当的情况下，氨基酸侧链被化学保护。侧链保护基团可以是如上所讨论的基团。被保护的氨基酸序列可被酶切割。例如，包含Boc侧链保护的Lys残基的二肽序列可被组织蛋白酶切割。
氨基酸侧链的保护基团是本领域熟知的，并且描述于Novabiochem公司目录中，并且如上所述。
接头Ib
RL1和RL2可以独立地选自H和甲基，或与它们所结合的碳原子一起形成环丙烯或环丁烯基团。
在一些实施例中，RL1和RL2两者均为H。在一些实施例中，RL1是H并且RL2是甲基。在一些实施例中，RL1和RL2两者均为甲基。
在一些实施例中，RL1和RL2与它们所键合的碳原子一起形成环丙烯基团。在一些实施例中，RL1和RL2与它们所键合的碳原子一起形成环丁烯基团。
在基团Ib中，在一些实施例中，e是0。在其他实施例中，e是1并且硝基基团可以在环的任何可用位置上。在这些实施例的一些中，它位于邻位。在这些实施例的另一些中，它位于对位。
RL
在一些实施例中，RL选自：
优选地，RL是
例如，本发明的缀合物(例如，抗体-药物缀合物)可以具有通式IV：
L–(DL)p(IV)
或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中L是本发明的抗体或其抗原结合片段，DL是“药物单位”(例如细胞毒素，例如TOPOi)，其具有连接至本发明的抗体或抗原结合物的接头RLL，其中接头优选地选自
(Ia’):
其中Q和X如上所定义，并且GLL是连接至本发明的抗体或其抗原结合片段的接头；以及
(Ib’)：
其中RL1和RL2如上所定义；以及
p是1至20的整数。
载药量由p表示，即每个抗体或其抗原结合片段的“药物单位”(例如细胞毒素，如TOPOi)的数量。每个抗体或其抗原结合片段的载药量范围可能是从1至20个药物单元(D)。对于组合物，p表示组合物中缀合物的平均载药量，并且p的范围为1至20。在一些实施例，p的范围选自1至10、2至10、2至8、2至6、以及4至10；优选地其中p是8。
GLL
GLL可以选自：
其中Ar表示C5-6亚芳基基团，例如亚苯基，并且X表示C1-4烷基。
在一些实施例中，GLL选自GLL1-1和GLL1-2。在这些实施例的一些中，GLL是GLL1-1。
在一些实施例中，RLL是衍生自上述RL基团的基团。
本领域技术人员将认识到，本文披露的任何一个或多个化学基团、部分和特征可以多种方式组合以形成可用于缀合本文披露的抗体和细胞毒素的接头。
在其中以单一对映异构体或以对映异构体富集的形式提供本文所述的化合物的一些实施例中，对映异构体富集形式具有大于60:40、70:30、80:20或90:10。在另外的实施例中，对映异构体比率大于95:5、97:3或99:1。
细胞毒素
在优选的实施例中，异源药剂是细胞毒素(也称为细胞毒性药剂)。细胞毒性药剂或细胞毒素可以是本领域中已知的任何分子，该分子抑制或阻止细胞的功能和/或造成细胞破坏(细胞死亡)、和/或发挥抗肿瘤/抗增生作用。已知许多类别的细胞毒性药剂在ADC分子中具有潜在效用。用于本发明的合适的细胞毒性药剂包括但不限于：拓扑异构酶I抑制剂(TOPOi)、鹅膏蕈碱、澳瑞他汀(auristatin)、道诺霉素、多柔比星、多卡米新、多拉司他汀、烯二炔、来红霉素(lexitropsin)、紫杉烷类、嘌呤霉素、美登木素生物碱、长春花碱、微管溶素以及吡咯并苯并二氮杂(PBD)。此类细胞毒性药剂的实例是AFP、MMAF、MMAE、AEB、AEVB、澳瑞他汀E、紫杉醇、多西他赛、CC-1065、SN-38、拓扑替康、吗啉代多柔比星、根霉素、氰基吗啉代多柔比星、多拉司他汀-10、棘霉素、康普瑞汀、杯形生长抑制素(chalicheamicin)、美登素、DM-1、长春碱、甲氨蝶呤和纺锤菌素、以及其衍生物和类似物。关于适合在ADC中使用的细胞毒素的另外的披露内容可以例如在国际专利申请公开号WO 2015/155345和WO2015/157592中发现，将其通过引用以其全文并入本文。
在一些实施例中，本发明的抗体或其抗原结合片段与选自以下的一种或多种细胞毒素缀合：拓扑异构酶I抑制剂、微管溶素衍生物、吡咯并苯并二氮杂或其组合。例如，该抗体或其抗原结合片段与一种或多种细胞毒素缀合，该一种或多种细胞毒素选自由以下组成的组：拓扑异构酶I抑制剂SG3932(也称为AZ14170133)、SG4010、SG4057或SG4052(其结构如下提供)或其组合。优选的是，该抗体或其抗原结合片段可以与拓扑异构酶I抑制剂缀合，更优选地与拓扑异构酶I抑制剂SG3932缀合。
在某些实施例中，本发明的抗体或其抗原结合片段不与如微管蛋白抑制剂(例如美登木素生物碱、澳瑞他汀)的微管抑制剂缀合，或者本发明的抗FRαADC不包含如微管蛋白抑制剂(例如美登木素生物碱、澳瑞他汀)的微管抑制剂。微管抑制剂类分子具有潜在的难以治疗的毒性，该毒性限制了剂量。
拓扑异构酶I抑制剂
本发明展示了第一个使用拓扑异构酶I抑制剂(TOPOi)有效载荷的抗FRαADC。此外，使用体内和体外模型，诸位发明人证明了抗FRαmAb在与TOPOi有效载荷缀合并部署为ADC时的稳定性和功效。
相应地，在一方面，提供了包含与TOPOi有效载荷缀合的抗FRα抗体或其抗原结合片段(例如本发明的抗体或其抗原结合片段)的ADC。在优选的实施例中，本发明的抗体或其抗原结合片段与拓扑异构酶I抑制剂缀合，或者本发明的抗FRαADC包含拓扑异构酶I抑制剂。
拓扑异构酶抑制剂是阻断拓扑异构酶(拓扑异构酶I和II)作用的化学化合物，拓扑异构酶是在正常细胞周期中通过催化DNA链的磷酸二酯骨架的断裂和重新连接来控制DNA结构变化的一种类型的酶。拓扑异构酶I抑制剂是有利的，因为它们介导高效的肿瘤细胞杀伤，对患者的毒性更少。特别地，迄今为止通常用于开发抗FRαADC的微管抑制剂等替代有效载荷已知具有毒性问题(Hinrichs等人AAPS J[AAPS期刊].2015年9月；17(5):1055-1064)。此外，使用疏水性较低的接头和效力较低的弹头(例如TOPOi)在异质性肿瘤中将有助于旁观者杀伤。虽然旁观者活性可以通过增加疏水性来增加效力和/或改善弹头渗透性来实现，但这可能会由于非特异性摄取而导致毒性增加。
合适的拓扑异构酶I抑制剂的一般实例由以下化合物表示：
所述化合物表示为A*，并且可以在本文中称为“药物单元”。
该化合物(例如，A*)优选提供有用于连接(优选缀合)至本发明的抗体或抗原结合片段的接头。在优选实施例中，该接头以可裂解的方式附接(例如，缀合)至氨基残基，例如，本发明的抗体或抗原结合片段的氨基酸。
更特别地，合适的拓扑异构酶I抑制剂的实例由具有式“I”的以下化合物：
及其盐和溶剂化物，其中RL如上所定义。
相应地，对于具有通式IV的本发明的缀合物(例如，抗体-药物缀合物)：
L–(DL)p(IV)
或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中L和p如上所定义，DL是具有接头的拓扑异构酶I抑制剂(例如，药物接头单元)并且其具有式III：
及其盐和溶剂化物，其中RLL如上所定义。
在一些实施例中，具有式I的化合物具有式IP:
及其盐和溶剂化物，其中RLP是用于连接至本发明的抗体或其抗原结合片段的接头，其中所述接头选自：
(IaP)：
其中
QP是：
其中QXP使得QP为氨基酸残基、二肽残基或三肽残基；
XP是：
其中aP＝0至5，bP＝0至16，cP＝0或1，dP＝0至5；
GL如上所定义；
(Ib)：
其中RL1和RL2独立地选自H和甲基，或与它们所结合的碳原子一起形成环丙烯或环丁烯基团；并且
e是0或1。
aP可以是0、1、2、3、4或5。在一些实施例中，aP是0至3。在这些实施例的一些中，aP是0或1。在另外的实施例中，aP是0。
bP可以是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。在一些实施例中，b是0至12。在这些实施例的一些中，bP是0至8，并且可以是0、2、4或8。
cP可以是0或1。
dP可以是0、1、2、3、4或5。在一些实施例中，dP是0至3。在这些实施例的一些中，dP是1或2。在另外的实施例中，dP是2。
在XP的一些实施例中，aP是0，cP是1并且dP是2，并且bP可以是从0至8。在这些实施例的一些中，bP是0、4或8。
上述对于具有式I的化合物的QX的偏好可以适用于QXP(例如，在适当的情况下)。
上述对于具有式I的化合物的GL、RL1、RL2和e的偏好可以适用于具有式IP的化合物。
在一些实施例中，具有式IV的缀合物具有式IVP：
L–(DLP)p(IVP)
或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中L是本发明的抗体或其抗原结合片段，DLP是拓扑异构酶I抑制剂(例如，药物接头单元)并且具有式IIIP：
RLLP是连接至该抗体或其抗原结合片段的接头，其中所述接头选自
(IaP’)：
其中QP、XP和GLL如上所定义；以及
(Ib’)：
其中RL1和RL2如上所定义；以及
p是1至20的整数。
在一些实施例中，具有式I的化合物具有式IP2：
及其盐和溶剂化物，其中RLP2是用于连接至本发明的抗体或其抗原结合片段的接头，其中所述接头选自：
(IaP2)：
其中
Q是：
其中QX使得Q为氨基酸残基、二肽残基、三肽残基或四肽残基；
XP2是：
其中aP2＝0至5，b1P2＝0至16，b2P2＝0至16，cP2＝0或1，dP2＝0至5，其中至少b1P2或b2P2＝0(即b1和b2中只有一个可以不是0)；
GL是用于连接至本发明的抗体或其抗原结合片段的接头；
(Ib)：
其中RL1和RL2独立地选自H和甲基，或与它们所结合的碳原子一起形成环丙烯或环丁烯基团；以及
e是0或1。
aP2可以是0、1、2、3、4或5。在一些实施例中，aP2是0至3。在这些实施例的一些中，aP2是0或1。在另外的实施例中，aP2是0。
b1P2可以是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。在一些实施例中，b1P2是0至12。在这些实施例的一些中，b1P2是0至8，并且可以是0、2、3、4、5或8。
b2P2可以是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。在一些实施例中，b2P2是0至12。在这些实施例的一些中，b2P2是0至8，并且可以是0、2、3、4、5或8。
优选地，b1P2和b2P2中只有一个可以不是0。
cP2可以是0或1。
dP2可以是0、1、2、3、4或5。在一些实施例中，dP2是0至3。在这些实施例的一些中，dP2是1或2。在另外的实施例中，dP2是2。在另外的实施例中，dP2是5。
在XP2的一些实施例中，aP2是0，b1P2是0，cP2是1并且dP2是2，并且b2P2可以是从0至8。在这些实施例的一些中，b2P2是0、2、3、4、5或8。在XP2的一些实施例中，aP2是1，b2P2是0，cP2是0并且dP2是0，并且b1P2可以是从0至8。在这些实施例的一些中，b1P2是0、2、3、4、5或8。在XP2的一些实施例中，aP2是0，b1P2是0，cP2是0并且dP2是1，并且b2P2可以是从0至8。在这些实施例的一些中，b2P2是0、2、3、4、5或8。在XP2的一些实施例中，b1P2是0，b2P2是0，cP2是0并且aP2和dP2之一是0。aP2和d中另一个是从1至5。在这些实施例的一些中，aP2和d中另一个是1。在这些实施例的另一些中，aP2和dP2中另一个是5。
上述对于具有式I的化合物的QX的偏好可以适用于式IaP2中的QX(例如，在适当的情况下)。
上述对于具有式I的化合物的GL、RL1、RL2和e的偏好可以适用于具有式IP2的化合物。
在一些实施例中，具有式IV的缀合物具有式IVP2：
L–(DLP2)p(IVP2)
或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中L是本发明的抗体或其抗原结合片段，DLP2是拓扑异构酶I抑制剂(例如，药物接头单元)并且具有式IIIP2：
RLLP2是连接至该抗体或其抗原结合片段的接头，其中所述接头选自
(IaP2’)：
其中Q和XP2如上所定义，并且GLL是连接至该抗体或其抗原结合片段的接头；以及
(Ib’)：
其中RL1和RL2如上所定义；并且
p是1至20的整数。
特别合适的拓扑异构酶I抑制剂包括具有以下式的那些：
和/或
SG3932是特别优选的。因此，在优选的实施例中，本发明的抗体或其抗原结合片段与具有以下式的拓扑异构酶I抑制剂(例如，SG3932)缀合：
制备拓扑异构酶I抑制剂的合成方法描述于例如WO 2020/200880中，其通过引用并入本文。
尽管如上所述优选拓扑异构酶I抑制剂，但应注意任何合适的药剂(例如，药物/细胞毒素)可连接至本发明的抗体或其抗原结合片段。下文概述了其他合适的药剂的实例。
微管溶素和吡咯并苯并二哌嗪
在一些实施例中，细胞毒素是微管溶素或微管溶素衍生物。在一些实施例中，细胞毒素是微管溶素A，其具有以下化学结构：
微管溶素是从粘细菌物种分离出的一类天然产物中的成员。作为细胞骨架相互作用剂，微管溶素是抑制微管蛋白聚合并导致细胞周期停滞和细胞凋亡的有丝分裂毒物。如本文所使用的，术语“微管溶素”共同地和单独地是指天然存在的微管溶素以及微管溶素的类似物和衍生物。微管溶素的示例性实例例如披露于WO 2004005326 A2、WO2012019123A1、WO 2009134279 A1、WO 2009055562 A1、WO 2004005327A1、US 7776841、US7754885、US20100240701、US 7816377、US20110021568和US20110263650中，将其通过引用并入本文。将理解的是此类衍生物包括，例如，包括一个或多个保护或保护基团，一个或多个连接部分的微管溶素前药或微管溶素。
在另一个实施例中，细胞毒素可以是吡咯并苯并二氮杂(PBD)或PBD衍生物。PBD转运至其中其交联DNA的细胞核中，阻止有丝分裂期间的复制，通过诱导单链断裂来损坏DNA，并且随后导致细胞凋亡。一些PBD具有识别和结合至DNA特定序列的能力；优选的序列是PuGPu。PBD具有以下通用结构：
PBD在取代基的数目、类型和位置方面，在它们的芳香族A环和吡咯并C环二者方面，以及在C环的饱和度方面不同。在B环中，在N10-C11位置处存在亚胺(N＝C)、甲醇胺(NH-CH(OH))、或甲醇胺甲基醚(NH-CH(OMe))，其是负责使DNA烷基化的亲电中心。所有已知的天然产物具有在手性C11a位置处的(S)-构型，当从C环向A环观察时，该构型向其提供了右旋扭曲。这为它们提供了合适的三维形状以与B型DNA的小沟具有等螺旋性(isohelicity)，从而在结合位点处紧密配合。它们在小沟中形成加合物的能力使得它们能够干扰DNA加工，因此将它们用作抗肿瘤剂。
第一种PBD抗肿瘤抗生素，即氨茴霉素，于1965年被发现。从那时起，已经报道了许多种天然存在的PBD，并且已经针对多种类似物开发了10多种合成路线。家族成员包括阿比霉素(abbeymycin)、奇卡霉素(chicamycin)、DC-81、甲基氨茴霉素(mazethramycin)、新氨茴霉素(neothramycin)A和B、波罗斯拉霉素(porothramycin)、prothracarcin、西班米星(sibanomicin)(DC-102)、西伯利亚霉素和托马霉素。包含它们的PBD和ADC还被描述于WO2015/155345和WO 2015/157592中，将其通过引用以其全文并入本文。
特定的ADC实施例
在一方面，本发明提供包含与细胞毒素缀合的抗FRα抗体或其抗原结合片段，或包含与细胞毒素缀合的抗FRα抗体或其抗原结合片段的ADC。
在一些实施例中，本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段与拓扑异构酶I抑制剂缀合，或者本发明的抗FRαADC包含与拓扑异构酶I抑制剂缀合的本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段，其由具有式“I”的下列化合物表示
其中RL如上所定义；
其中DAR在约1至20的范围内，任选地DAR的范围选自约1至10、约2至10、约2至8、约2至6、以及约4至10；优选地约8。
在一些实施例中，本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段与拓扑异构酶I抑制剂缀合，或者本发明的抗FRαADC包含与拓扑异构酶I抑制剂缀合的本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段，其由具有式“I”的下列化合物表示
其中RL如上所定义；
其中DAR在约1至20的范围内，任选地DAR的范围选自约1至10、约2至10、约2至8、约2至6、以及约4至10；优选地约4。
在一些实施例中，本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段与拓扑异构酶I抑制剂SG3932缀合，或者本发明的抗FRαADC包含与拓扑异构酶I抑制剂SG3932缀合的本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段
其中DAR在约1至20的范围内，任选地DAR的范围选自约1至10、约2至10、约2至8、约2至6、以及约4至10；优选地约8。
在一些实施例中，本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段与拓扑异构酶I抑制剂SG3932缀合，或者本发明的抗FRαADC包含与拓扑异构酶I抑制剂SG3932缀合的本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段
其中DAR在约1至20的范围内，任选地DAR的范围选自约1至10、约2至10、约2至8、约2至6、以及约4至10；优选地约4。
在一些实施例中，本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段与拓扑异构酶I抑制剂SG4010缀合，或者本发明的抗FRαADC包含与拓扑异构酶I抑制剂SG4010缀合的本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段
其中DAR在约1至20的范围内，任选地DAR的范围选自约1至10、约2至10、约2至8、约2至6、以及约4至10；优选地约8。
在一些实施例中，本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段与拓扑异构酶I抑制剂SG4010缀合，或者本发明的抗FRαADC包含与拓扑异构酶I抑制剂SG4010缀合的本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段
其中DAR在约1至20的范围内，任选地DAR的范围选自约1至10、约2至10、约2至8、约2至6、以及约4至10；优选地约4。
在一些实施例中，本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段与拓扑异构酶I抑制剂SG4057缀合，或者本发明的抗FRαADC包含与拓扑异构酶I抑制剂SG4057缀合的本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段
其中DAR在约1至20的范围内，任选地DAR的范围选自约1至10、约2至10、约2至8、约2至6、以及约4至10；优选地约8。
在一些实施例中，本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段与拓扑异构酶I抑制剂SG4057缀合，或者本发明的抗FRαADC包含与拓扑异构酶I抑制剂SG4057缀合的本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段
其中DAR在约1至20的范围内，任选地DAR的范围选自约1至10、约2至10、约2至8、约2至6、以及约4至10；优选地约4。
在一些实施例中，本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段与拓扑异构酶I抑制剂SG4052缀合，或者本发明的抗FRαADC包含与拓扑异构酶I抑制剂SG4052缀合的本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段
其中DAR在约1至20的范围内，任选地DAR的范围选自约1至10、约2至10、约2至8、约2至6、以及约4至10；优选地约8。
在一些实施例中，本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段与拓扑异构酶I抑制剂SG4052缀合，或者本发明的抗FRαADC包含与拓扑异构酶I抑制剂SG4052缀合的本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段
其中DAR在约1至20的范围内，任选地DAR的范围选自约1至10、约2至10、约2至8、约2至6、以及约4至10；优选地约4。
在一些实施例中，
(i)抗FRα抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:1的重链CDR1(SDSATWN)、SEQ IDNO:2的重链CDR2(RTYYRSKWYNDYAVSVKS)、SEQ ID NO:3的重链CDR3(GVGSFDY)、SEQ ID NO:4的轻链CDR1(RASQSISSWLA)、SEQ ID NO:5的轻链CDR2(KASGLES)、以及SEQ ID NO:6的轻链CDR3(QQYNSYSQLT)，任选地其中抗FRα抗体或其抗原结合片段具有VH和VL，该VH具有与SEQID NO:37的氨基酸序列至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少97％相同、至少99％相同或完全相同的氨基酸序列，该VL具有与SEQ ID NO:38的氨基酸序列至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少97％相同、至少99％相同或完全相同的氨基酸序列，任选地其中抗FRα抗体或其抗原结合片段具有重链氨基酸序列和轻链氨基酸序列，该重链氨基酸序列为与SEQ ID NO:49的氨基酸序列至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少97％相同、至少99％相同或完全相同的氨基酸序列，该轻链氨基酸序列为与SEQ IDNO:50的氨基酸序列至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少97％相同、至少99％相同或完全相同的氨基酸序列；
(ii)细胞毒素为拓扑异构酶I抑制剂，由具有式I的下列化合物表示：
其中RL如上所定义；以及
(iii)DAR在约1至20的范围内，任选地DAR的范围选自约1至10、约2至10、约2至8、约2至6、以及约4至10；优选地约8。
在一些实施例中，
(i)抗FRα抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:1的重链CDR1(SDSATWN)、SEQ IDNO:2的重链CDR2(RTYYRSKWYNDYAVSVKS)、SEQ ID NO:3的重链CDR3(GVGSFDY)、SEQ ID NO:4的轻链CDR1(RASQSISSWLA)、SEQ ID NO:5的轻链CDR2(KASGLES)、以及SEQ ID NO:6的轻链CDR3(QQYNSYSQLT)，任选地其中抗FRα抗体或其抗原结合片段具有VH和VL，该VH具有与SEQID NO:37的氨基酸序列至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少97％相同、至少99％相同或完全相同的氨基酸序列，该VL具有与SEQ ID NO:38的氨基酸序列至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少97％相同、至少99％相同或完全相同的氨基酸序列，任选地其中抗FRα抗体或其抗原结合片段具有重链氨基酸序列和轻链氨基酸序列，该重链氨基酸序列为与SEQ ID NO:49的氨基酸序列至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少97％相同、至少99％相同或完全相同的氨基酸序列，该轻链氨基酸序列为与SEQ IDNO:50的氨基酸序列至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少97％相同、至少99％相同或完全相同的氨基酸序列；
(ii)细胞毒素为拓扑异构酶I抑制剂，由具有式I的下列化合物表示：
其中RL如上所定义；以及
(iii)DAR在约1至20的范围内，任选地DAR的范围选自约1至10、约2至10、约2至8、约2至6、以及约4至10；优选地约4。
在一些实施例中，
(i)抗FRα抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:1的重链CDR1(SDSATWN)、SEQ IDNO:2的重链CDR2(RTYYRSKWYNDYAVSVKS)、SEQ ID NO:3的重链CDR3(GVGSFDY)、SEQ ID NO:4的轻链CDR1(RASQSISSWLA)、SEQ ID NO:5的轻链CDR2(KASGLES)、以及SEQ ID NO:6的轻链CDR3(QQYNSYSQLT)，任选地其中抗FRα抗体或其抗原结合片段具有VH和VL，该VH具有与SEQID NO:37的氨基酸序列至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少97％相同、至少99％相同或完全相同的氨基酸序列，该VL具有与SEQ ID NO:38的氨基酸序列至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少97％相同、至少99％相同或完全相同的氨基酸序列，任选地其中抗FRα抗体或其抗原结合片段具有重链氨基酸序列和轻链氨基酸序列，该重链氨基酸序列为与SEQ ID NO:49的氨基酸序列至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少97％相同、至少99％相同或完全相同的氨基酸序列，该轻链氨基酸序列为与SEQ IDNO:50的氨基酸序列至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少97％相同、至少99％相同或完全相同的氨基酸序列；
(ii)细胞毒素是拓扑异构酶I抑制剂SG3932
以及
(iii)DAR在约1至20的范围内，任选地DAR的范围选自约1至10、约2至10、约2至8、约2至6、以及约4至10；优选地约8。
在一些实施例中，
(i)抗FRα抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:1的重链CDR1(SDSATWN)、SEQ IDNO:2的重链CDR2(RTYYRSKWYNDYAVSVKS)、SEQ ID NO:3的重链CDR3(GVGSFDY)、SEQ ID NO:4的轻链CDR1(RASQSISSWLA)、SEQ ID NO:5的轻链CDR2(KASGLES)、以及SEQ ID NO:6的轻链CDR3(QQYNSYSQLT)，任选地其中抗FRα抗体或其抗原结合片段具有VH和VL，该VH具有与SEQID NO:37的氨基酸序列至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少97％相同、至少99％相同或完全相同的氨基酸序列，该VL具有与SEQ ID NO:38的氨基酸序列至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少97％相同、至少99％相同或完全相同的氨基酸序列，任选地其中抗FRα抗体或其抗原结合片段具有重链氨基酸序列和轻链氨基酸序列，该重链氨基酸序列为与SEQ ID NO:49的氨基酸序列至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少97％相同、至少99％相同或完全相同的氨基酸序列，该轻链氨基酸序列为与SEQ IDNO:50的氨基酸序列至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少97％相同、至少99％相同或完全相同的氨基酸序列；
(ii)细胞毒素是拓扑异构酶I抑制剂SG3932
以及
(iii)DAR在约1至20的范围内，任选地DAR的范围选自约1至10、约2至10、约2至8、约2至6、以及约4至10；优选地约4。
在一些实施例中，
(i)抗FRα抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:1的重链CDR1(SDSATWN)、SEQ IDNO:2的重链CDR2(RTYYRSKWYNDYAVSVKS)、SEQ ID NO:3的重链CDR3(GVGSFDY)、SEQ ID NO:4的轻链CDR1(RASQSISSWLA)、SEQ ID NO:5的轻链CDR2(KASGLES)、以及SEQ ID NO:6的轻链CDR3(QQYNSYSQLT)，任选地其中抗FRα抗体或其抗原结合片段具有VH和VL，该VH具有与SEQID NO:37的氨基酸序列至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少97％相同、至少99％相同或完全相同的氨基酸序列，该VL具有与SEQ ID NO:38的氨基酸序列至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少97％相同、至少99％相同或完全相同的氨基酸序列，任选地其中抗FRα抗体或其抗原结合片段具有重链氨基酸序列和轻链氨基酸序列，该重链氨基酸序列为与SEQ ID NO:49的氨基酸序列至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少97％相同、至少99％相同或完全相同的氨基酸序列，该轻链氨基酸序列为与SEQ IDNO:50的氨基酸序列至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少97％相同、至少99％相同或完全相同的氨基酸序列；
(ii)细胞毒素是拓扑异构酶I抑制剂SG4010
以及
(iii)DAR在约1至20的范围内，任选地DAR的范围选自约1至10、约2至10、约2至8、约2至6、以及约4至10；优选地约8。
在一些实施例中，
(i)抗FRα抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:1的重链CDR1(SDSATWN)、SEQ IDNO:2的重链CDR2(RTYYRSKWYNDYAVSVKS)、SEQ ID NO:3的重链CDR3(GVGSFDY)、SEQ ID NO:4的轻链CDR1(RASQSISSWLA)、SEQ ID NO:5的轻链CDR2(KASGLES)、以及SEQ ID NO:6的轻链CDR3(QQYNSYSQLT)，任选地其中抗FRα抗体或其抗原结合片段具有VH和VL，该VH具有与SEQID NO:37的氨基酸序列至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少97％相同、至少99％相同或完全相同的氨基酸序列，该VL具有与SEQ ID NO:38的氨基酸序列至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少97％相同、至少99％相同或完全相同的氨基酸序列，任选地其中抗FRα抗体或其抗原结合片段具有重链氨基酸序列和轻链氨基酸序列，该重链氨基酸序列为与SEQ ID NO:49的氨基酸序列至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少97％相同、至少99％相同或完全相同的氨基酸序列，该轻链氨基酸序列为与SEQ IDNO:50的氨基酸序列至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少97％相同、至少99％相同或完全相同的氨基酸序列；
(ii)细胞毒素是拓扑异构酶I抑制剂SG4010
以及
(iii)DAR在约1至20的范围内，任选地DAR的范围选自约1至10、约2至10、约2至8、约2至6、以及约4至10；优选地约4。
在一些实施例中，
(i)抗FRα抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:1的重链CDR1(SDSATWN)、SEQ IDNO:2的重链CDR2(RTYYRSKWYNDYAVSVKS)、SEQ ID NO:3的重链CDR3(GVGSFDY)、SEQ ID NO:4的轻链CDR1(RASQSISSWLA)、SEQ ID NO:5的轻链CDR2(KASGLES)、以及SEQ ID NO:6的轻链CDR3(QQYNSYSQLT)，任选地其中抗FRα抗体或其抗原结合片段具有VH和VL，该VH具有与SEQID NO:37的氨基酸序列至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少97％相同、至少99％相同或完全相同的氨基酸序列，该VL具有与SEQ ID NO:38的氨基酸序列至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少97％相同、至少99％相同或完全相同的氨基酸序列，任选地其中抗FRα抗体或其抗原结合片段具有重链氨基酸序列和轻链氨基酸序列，该重链氨基酸序列为与SEQ ID NO:49的氨基酸序列至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少97％相同、至少99％相同或完全相同的氨基酸序列，该轻链氨基酸序列为与SEQ IDNO:50的氨基酸序列至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少97％相同、至少99％相同或完全相同的氨基酸序列；
(ii)细胞毒素是拓扑异构酶I抑制剂SG4057
以及
(iii)DAR在约1至20的范围内，任选地DAR的范围选自约1至10、约2至10、约2至8、约2至6、以及约4至10；优选地约8。
在一些实施例中，
(i)抗FRα抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:1的重链CDR1(SDSATWN)、SEQ IDNO:2的重链CDR2(RTYYRSKWYNDYAVSVKS)、SEQ ID NO:3的重链CDR3(GVGSFDY)、SEQ ID NO:4的轻链CDR1(RASQSISSWLA)、SEQ ID NO:5的轻链CDR2(KASGLES)、以及SEQ ID NO:6的轻链CDR3(QQYNSYSQLT)，任选地其中抗FRα抗体或其抗原结合片段具有VH和VL，该VH具有与SEQID NO:37的氨基酸序列至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少97％相同、至少99％相同或完全相同的氨基酸序列，该VL具有与SEQ ID NO:38的氨基酸序列至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少97％相同、至少99％相同或完全相同的氨基酸序列，任选地其中抗FRα抗体或其抗原结合片段具有重链氨基酸序列和轻链氨基酸序列，该重链氨基酸序列为与SEQ ID NO:49的氨基酸序列至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少97％相同、至少99％相同或完全相同的氨基酸序列，该轻链氨基酸序列为与SEQ IDNO:50的氨基酸序列至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少97％相同、至少99％相同或完全相同的氨基酸序列；
(ii)细胞毒素是拓扑异构酶I抑制剂SG4057
以及
(iii)DAR在约1至20的范围内，任选地DAR的范围选自约1至10、约2至10、约2至8、约2至6、以及约4至10；优选地约4。
在一些实施例中，
(i)抗FRα抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:1的重链CDR1(SDSATWN)、SEQ IDNO:2的重链CDR2(RTYYRSKWYNDYAVSVKS)、SEQ ID NO:3的重链CDR3(GVGSFDY)、SEQ ID NO:4的轻链CDR1(RASQSISSWLA)、SEQ ID NO:5的轻链CDR2(KASGLES)、以及SEQ ID NO:6的轻链CDR3(QQYNSYSQLT)，任选地其中抗FRα抗体或其抗原结合片段具有VH和VL，该VH具有与SEQID NO:37的氨基酸序列至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少97％相同、至少99％相同或完全相同的氨基酸序列，该VL具有与SEQ ID NO:38的氨基酸序列至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少97％相同、至少99％相同或完全相同的氨基酸序列，任选地其中抗FRα抗体或其抗原结合片段具有重链氨基酸序列和轻链氨基酸序列，该重链氨基酸序列为与SEQ ID NO:49的氨基酸序列至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少97％相同、至少99％相同或完全相同的氨基酸序列，该轻链氨基酸序列为与SEQ IDNO:50的氨基酸序列至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少97％相同、至少99％相同或完全相同的氨基酸序列；
(ii)细胞毒素是拓扑异构酶I抑制剂SG4052
以及
(iii)DAR在约1至20的范围内，任选地DAR的范围选自约1至10、约2至10、约2至8、约2至6、以及约4至10；优选地约8。
在一些实施例中，
(i)抗FRα抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:1的重链CDR1(SDSATWN)、SEQ IDNO:2的重链CDR2(RTYYRSKWYNDYAVSVKS)、SEQ ID NO:3的重链CDR3(GVGSFDY)、SEQ ID NO:4的轻链CDR1(RASQSISSWLA)、SEQ ID NO:5的轻链CDR2(KASGLES)、以及SEQ ID NO:6的轻链CDR3(QQYNSYSQLT)，任选地其中抗FRα抗体或其抗原结合片段具有VH和VL，该VH具有与SEQID NO:37的氨基酸序列至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少97％相同、至少99％相同或完全相同的氨基酸序列，该VL具有与SEQ ID NO:38的氨基酸序列至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少97％相同、至少99％相同或完全相同的氨基酸序列，任选地其中抗FRα抗体或其抗原结合片段具有重链氨基酸序列和轻链氨基酸序列，该重链氨基酸序列为与SEQ ID NO:49的氨基酸序列至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少97％相同、至少99％相同或完全相同的氨基酸序列，该轻链氨基酸序列为与SEQ IDNO:50的氨基酸序列至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少97％相同、至少99％相同或完全相同的氨基酸序列；
(ii)细胞毒素是拓扑异构酶I抑制剂SG4052
以及
(iii)DAR在约1至20的范围内，任选地DAR的范围选自约1至10、约2至10、约2至8、约2至6、以及约4至10；优选地约4。
内化
内化可能是ADC的有用特性。例如，内化允许将有效载荷递送到细胞。诸位发明人已经示出，本发明的抗体和ADC展现出快速内化和溶酶体运输。
在一些实施例中，本发明的抗FRα抗体或其抗原片段，或抗FRαADC与在细胞表面上的FRα结合，并被内化到细胞中。在一些实施例中，在约4小时或更少、约5小时或更少、约6小时或更少、约7小时或更少、约8小时或更少、约9小时或更少、约10小时或更少、约11小时或更少、或约12小时或更少之内，本发明的抗原或其抗体片段或抗FRαADC进入表达FRα细胞的内化被饱和。
细胞毒性
在一些实施例中，相对于不存在该抗体或其抗原结合片段(例如，抗FRαADC)下的抑制或阻抑水平，本发明的抗FRαADC抗体抑制或阻抑增殖(例如，肿瘤的增殖)至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％或约100％(优选至少40％)。细胞增殖可以使用本领域公认的技术测定，这些技术测量细胞分裂速率、和/或经历细胞分裂的细胞在细胞群中的分数、和/或由于终末分化或细胞死亡(例如，胸苷掺入)自细胞群的细胞损失的速率。
在一些实施例中，以在约1000ng/ml或更少、约500ng/ml或更少、约400ng/ml或更少、约300ng/ml或更少、约290ng/ml或更少、约280ng/ml或更少、约270ng/ml或更少、约260ng/ml或更少、或约250ng/ml或更少的EC50值，本发明的抗FRαADC对表达FRα的细胞发挥细胞毒性。
在一些实施例中，以在约100μg/ml或更少、约50μg/ml或更少、约25μg/ml或更少、约10μg/ml或更少、约5μg/ml或更少、约2.5μg/ml或更少、约1μg/ml或更少、约0.75μg/ml或更少、约0.5μg/ml或更少、约0.25μg/ml或更少、约0.1μg/ml或更少、约0.075μg/ml或更少、约0.05μg/ml或更少、约0.025μg/ml或更少、约0.01μg/ml或更少的IC50值，本发明的抗FRαADC对表达FRα的细胞发挥细胞毒性。
在一些实施例中，本发明的抗-FRαADC抑制或阻抑具有FRα异质表达和/或FRα低表达的细胞群的增殖。在一些实施例中，本发明的抗FRαADC抑制或阻抑具有中度FRα表达的细胞群(例如Jeg-3、OVCAR-3细胞系或具有相似或等同水平的FRα表达的细胞)的增殖，具有中高度FRα表达的细胞群(例如Igrov-1细胞系或具有相似或等同水平的FRα表达的细胞)的增殖，具有高表达FRα的细胞群(例如KB细胞系或具有相似或等同水平的FRα表达的细胞)的增殖。
与异源药剂连接的ADC或抗体的制备
可以使用已知的有机化学反应、条件和试剂以多种方式制备本披露的连接至异源药剂(例如ADC)的抗体，例如：(1)使抗体或抗原结合片段的反应性取代基与二价接头试剂反应，然后与异源试剂(例如细胞毒素，优选拓扑异构酶I抑制剂)反应；(2)使异源药剂(例如细胞毒素，优选拓扑异构酶I抑制剂)的反应性取代基与二价接头药剂反应，然后与本发明的抗体或其抗原结合片段的反应性取代基反应。
如本文所披露的抗体或其抗原结合片段之内可能存在的反应性取代基包括但不限于亲核基团，例如(i)N末端氨基，(ii)侧链氨基，例如赖氨酸，(iii)侧链硫醇基团，例如半胱氨酸，和(iv)其中抗体被糖基化的糖羟基或氨基。可存在于如本文所披露的抗体或其抗原结合片段内的反应性取代基，包括但不限于丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基的羟基部分；赖氨酸残基的氨基部分；天冬氨酸和谷氨酸残基的羧基部分；和半胱氨酸残基的硫醇部分，以及非天然氨基酸的炔丙基、叠氮基、卤代芳基(例如，氟代芳基)、卤代杂芳基(例如，氟代杂芳基)、卤代烷基和卤代杂烷基部分。在一些实施例中，存在于如本文所披露的抗体或其抗原结合片段中的反应性取代基包括氨部分或硫醇部分。某些抗体具有半胱氨酸桥，这是可还原的链间二硫化物。通过用还原剂(例如DL-二硫苏糖醇(DTT)和三(2-羧乙基)膦(TCEP))处理抗体，可以使它们具有反应性以与接头药剂缀合。每个半胱氨酸桥理论上都会导致形成两个反应性硫醇亲核试剂。赖氨酸与2-亚氨基硫烷(Traut试剂)的反应导致氨转化为硫醇，可用于将额外的亲核基团引入抗体。一个、两个、三个、四个或更多个半胱氨酸残基可用于将反应性硫醇基团插入抗体(或其片段)中(例如，制备包含一个或多个非天然半胱氨酸氨基酸残基的突变抗体)。美国专利号7,521,541描述了具有反应性半胱氨酸氨基酸的工程抗体，通过引用并入本文。
在另一方面，抗体或其抗原结合片段可以具有一个或多个碳水化合物基团，其可以被化学改变以含有一个或多个巯基。然后通过巯基的硫原子缀合形成与异源药剂连接的抗体(例如ADC)。
在又一方面，抗体可以含有一个或多个碳水化合物基团，其可以被氧化以产生醛基(-CHO)(参见例如，Laguzza等人,J.Med.Chem.[药物化学杂志]1989,32(3),548-55)。通过相应的醛缀合导致形成与异源药剂连接的抗体(例如ADC)。在Coligan等人,CurrentProtocols in Protein Science[最新蛋白质科学实验指南],第2卷,John Wiley&Sons[约翰威利父子公司](2002)。发现了用于将接头-药物部分与细胞靶向蛋白(如抗体、免疫球蛋白或其片段)缀合的方法，例如，在美国专利号5,208,020、美国专利号6,441,163、WO 2005/037992、WO 2005/081711、以及WO 2006/034488，其中每一个都通过引入并入本文。
用于抗体或其抗原结合片段的常规的缀合策略依赖于通过赖氨酸或半胱氨酸将有效载荷任意或随机缀合至抗体或片段。在一些实施例中，将该抗体或其抗原结合片段随机与异源药剂(例如细胞毒素，优选拓扑异构酶I抑制剂)缀合，例如，通过对该抗体或片段进行部分还原，随后与所期望的药剂反应，其中接头部分被附接或不被附接。可以使用DTT或其他还原剂还原抗体或片段以进行类似的还原，例如TCEP。然后可以在DMSO的存在下，将接头部分附接或未附接的药剂以摩尔过量加入至经还原的抗体或片段中。缀合后，可以加入淬灭剂如N-乙酰基-L-半胱氨酸以淬灭未反应的药剂。然后可以纯化反应混合物(通过例如TFF、SEC-FPLC、CHT、旋转过滤器离心)并将缓冲液交换成PBS或其他相关配制缓冲液。
在一些实施例中，药剂(例如，细胞毒素)通过位点特异性缀合与抗体或其抗原结合片段缀合。在一些实施例中，使用在具体位置处的反应性氨基酸残基进行治疗部分与抗体的位点特异性缀合产生了具有一致化学计量的均质ADC制剂。
该位点特异性缀合可以通过半胱氨酸残基或非天然氨基酸进行。在优选的实施例中，该异源药剂(优选细胞毒素)通过至少一个半胱氨酸残基与该抗体或其抗原结合片段缀合。半胱氨酸氨基酸可在抗体(或其抗原结合片段)中的反应位点处被工程化，并且优选地不形成链内或分子间二硫键(Junutula等人,2008b Nature Biotech.[自然生物技术],26(8):925-932；Dornan等人,(2009)Blood[血液]114(13):2721-2729；US 7521541；US7723485；WO 2009/052249)。在一些实施例中，该药剂(例如细胞毒素)通过位置239、248、254、273、279、282、284、286、287、289、297、298、312、324、326、330、335、337、339、350、355、356、359、360、361、375、383、384、389、398、400、413、415、418、422、440、441、442、443，以及446中至少一处的半胱氨酸取代与抗体或其抗原结合片段缀合，其中该编号对应于Kabat中的EU索引。在一些实施例中，该具体的Kabat位置是239、442、或二者。在一些实施例中，具体的位置是Kabat位置442，Kabat位置239和240之间的氨基酸插入，或二者。在一些实施例中，该异源药剂(优选细胞毒素)通过硫醇-马来酰亚胺键与该抗体或其抗原结合片段缀合。在一些方面，该氨基酸侧链是巯基侧链。
当抗体或其抗原结合片段的一个以上亲核或亲电基团与药剂反应，然后所得产物可以是与异源药剂连接的抗体(例如ADC)的混合物，其中附接在抗体上的药剂单元分布为例如1、2、3等。液相色谱法(如疏水相互作用(HIC))可以通过药剂载量来分离混合物中的化合物。可以分离与具有单一药剂载量(p)的异源药剂连接的抗体(例如ADC)制剂。
来自缀合反应的ADC制剂中每个抗体(或抗原结合片段)上的平均药剂数量可以通过常规方式进行表征，这些方式例如UV、反相HPLC、HIC、质谱、ELISA测定和电泳。也可以确定依据p的ADC的定量分布。通过ELISA，可以确定与异源药剂连接的抗体(例如ADC)的特定制剂中p的平均值(Hamblett等人(2004)Clin.Cancer Res.[临床癌症研究]10:7063-7070；Sanderson等人(2005)Clin.Cancer Res.[临床癌症研究]11:843-852)。在一些情况下，与异源药剂(例如ADC)连接的同源抗体的分离、纯化和表征，其中p是来自抗体与其他药剂的某个值，可以通过反相HPLC、电泳、TFF、SEC-FPLC、CHT、旋转过滤器离心等方式实现。此类技术也适用于其他类型的缀合物。
化学定义
以下定义尤其适用于上述拓扑异构酶I抑制剂的描述。
C5-6亚芳基：如本文所使用的，术语“C5-6亚芳基”涉及通过从芳香族化合物的芳香族环原子上除去两个氢原子而获得的二价部分。
在本文中，前缀(例如C5-6)表示环原子的数量或环原子数量的范围，无论是碳原子还是杂原子。
环原子可以都是碳原子，如“碳亚芳基基团”中那样，在这种情况下，该基团是亚苯基(C6)。
可替代地，环原子可以包括一个或多个杂原子，如“杂亚芳基基团”中那样。杂亚芳基基团的实例包括但不限于衍生自如下的那些：
N1：吡咯(氮杂茂(azole))(C5)、吡啶(吖嗪(azine))(C6)；
O1：呋喃(氧杂环戊二烯(oxole))(C5)；
S1：噻吩(硫杂环戊二烯(thiole))(C5)；
N1O1：噁唑(C5)、异噁唑(C5)、异噁嗪(isoxazine)(C6)；
N2O1：噁二唑(呋咱)(C5)；
N3O1：噁三唑(C5)；
N1S1：噻唑(C5)、异噻唑(C5)；
N2：咪唑(1,3-二唑)(C5)、吡唑(1,2-二唑)(C5)、哒嗪(1,2-二嗪)(C6)、嘧啶(1,3-二嗪)(C6)(例如胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶)、吡嗪(1,4-二嗪)(C6)；以及
N3：三唑(C5)、三嗪(C6)。
C1-4烷基：如本文所使用的，术语“C1-4烷基”涉及通过从具有从1至4个碳原子的烃基化合物的碳原子上除去氢原子而获得的单价部分，该烃基化合物可以是脂肪族或脂环族，并且可以是饱和或不饱和的(例如部分不饱和、完全不饱和)。如本文所使用的，术语“C1-n烷基”涉及通过从具有从1至n个碳原子的烃基化合物的碳原子上除去氢原子而获得的单价部分，该烃基化合物可以是脂肪族或脂环族，并且可以是饱和或不饱和的(例如部分不饱和、完全不饱和)。因此，术语“烷基”包括以下讨论的亚类：烯基、炔基、环烷基等。
饱和烷基基团的实例包括但不限于甲基(C1)、乙基(C2)、丙基(C3)和丁基(C4)。
饱和直链烷基基团的实例包括但不限于甲基(C1)、乙基(C2)、正丙基(C3)和正丁基(C4)。
饱和支链烷基基团的实例包括异丙基(C3)、异丁基(C4)、仲丁基(C4)和叔丁基(C4)。
C2-4烯基：如本文所使用的，术语“C2-4烯基”涉及具有一个或多个碳-碳双键的烷基基团。
不饱和烯基基团的实例包括但不限于乙烯基(ethenyl、vinyl)(-CH＝CH2)、1-丙烯基(-CH＝CH-CH3)、2-丙烯基(烯丙基，-CH-CH＝CH2)、异丙烯基(1-甲基乙烯基，-C(CH3)＝CH2)和丁烯基(C4)。
C2-4炔基：如本文所使用的，术语“C2-4炔基”涉及具有一个或多个碳-碳三键的烷基基团。
不饱和炔基基团的实例包括但不限于乙炔基(-C≡CH)和2-丙炔基(炔丙基，-CH2-C≡CH)。
C3-4环烷基：如本文所使用的，术语“C3-4环烷基”涉及还是环基基团的烷基基团；即，通过从环状烃基(碳环)化合物的脂环族环原子上除去氢原子而获得的一价部分，该部分具有从3至7个碳原子，包括从3至7个环原子。
环烷基基团的实例包括但不限于衍生自如下的那些：
饱和单环烃基化合物：
环丙烷(C3)和环丁烷(C4)；以及
不饱和单环烃基化合物：
环丙烯(C3)和环丁烯(C4)。
连接标记：在式中，上标C(＝O)和NH表示原子所键合的基团。例如，NH基团显示与羰基(其不是所示部分的一部分)结合，并且羰基显示与NH基团(其不是所示部分的一部分)结合。
盐
可以方便地或令人希望地制备、纯化、和/或处理活性化合物/药剂的对应的盐，例如药学上可接受的盐。药学上可接受的盐的实例在Berge等人,J.Pharm.Sci.[药物科学杂志],66,1-19(1977)中讨论。
例如，如果化合物是阴离子的、或具有可以是阴离子的官能团(例如-COOH可以是-COO-)，则可以与适当的阳离子形成盐。合适的无机阳离子的实例包括但不限于碱金属离子例如Na+和K+、碱土金属阳离子例如Ca2+和Mg2+、以及其他阳离子例如Al+3。合适的有机阳离子的实例包括但不限于铵离子(即NH4 +)和经取代的铵离子(例如NH3R+、NH2R2 +、NHR3 +、NR4 +)。一些合适的经取代铵离子的实例是衍生自以下的那些：乙胺、二乙胺、二环己胺、三乙胺、丁胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪、苄胺、苯基苄胺、胆碱、葡甲胺和氨丁三醇、以及氨基酸(如赖氨酸和精氨酸)。常见的季铵离子的实例是N(CH3)4 +。
如果化合物是阳离子的、或具有可以是阳离子的官能团(例如-NH2可以是-NH3 +)，则可以与适当的阴离子形成盐。合适的无机阴离子的实例包括但不限于衍生自以下无机酸的那些：盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、亚硫酸、硝酸、亚硝酸、磷酸和亚磷酸。
合适的有机阴离子的实例包括但不限于衍生自以下有机酸的那些：2-乙酰氧基苯甲酸、乙酸、抗坏血酸、天冬氨酸、苯甲酸、樟脑磺酸、肉桂酸、柠檬酸、乙二胺四乙酸(edetic)、乙二磺酸(ethanedisulfonic)、乙磺酸、富马酸、葡庚糖酸(glucheptonic)、葡糖酸、谷氨酸、乙醇酸、羟基马来酸、羟基萘甲酸、羟基乙磺酸、乳酸、乳糖酸、月桂酸、马来酸、苹果酸、甲磺酸、粘液酸、油酸、草酸、棕榈酸、双羟萘酸、泛酸、苯乙酸、苯磺酸、丙酸、丙酮酸、水杨酸、硬脂酸、琥珀酸、磺胺酸、酒石酸、甲苯磺酸、三氟乙酸和戊酸。合适的聚合有机阴离子的实例包括但不限于衍生自以下聚合酸的那些：单宁酸、羧甲基纤维素。
溶剂化物
可以方便地或令人希望地制备、纯化、和/或处理活性化合物的对应的溶剂化物。术语“溶剂化物”在本文中以常规意义使用，是指溶质(例如活性化合物、活性化合物的盐)和溶剂的复合物。如果溶剂是水，则溶剂化物可以方便地称为水合物，例如一水合物、二水合物、三水合物等。
异构体
本发明的某些化合物/药剂能以一种或多种特定的几何、光学、对映异构、非对映异构、差向异构、阻转异构、立体异构、互变异构、构象或异头形式(anomeric form)存在，包括但不限于顺式和反式形式；E-和Z-形式；c-、t-、和r-形式；内-和外-形式；R-、S-、和内消旋-形式；D-和L-形式；d-和l-形式；(+)和(-)形式；酮-、烯醇-、和烯醇化物-形式；顺式-和反式-形式；向斜-和背斜-形式；α-和β-形式；轴向和赤道形式；船型-、椅型-、扭曲-、信封型-、和半椅型-形式；及其组合，在下文中统称为“异构体”(或“异构形式”)。
除非另有说明，否则对特定化合物的引用包括所有此类异构体形式，包括(全部或部分)外消旋体及其其他混合物。此类异构体形式的制备(例如，不对称合成)和分离(例如，分级结晶和色谱方式)的方法在本领域中是已知的，或者通过以已知方式采用本文教导的方法或已知方法是容易地获得的。
多核苷酸、载体和宿主细胞
在一些方面，提供了编码本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段的多核苷酸。多核苷酸可以是表7-8中的任何核苷酸序列。如有任何差异，以表格中的序列为准。
在另一方面，多核苷酸包含编码(a)VL以及(b)VH的序列，该VL与如表7中所述的构建体AB1370049、AB1370026、AB1370035、AB1370083、AB1370095或AB1370117中任一个的参考VL核苷酸序列至少80％、85％、90％或95％相同或完全相同；该VH与如表7中所述的构建体AB1370049、AB1370026、AB1370035、AB1370083、AB1370095或AB1370117中任一个的参考VH核苷酸序列至少80％、85％、90％或95％相同或完全相同。
在另一方面，其多核苷酸其包含编码(a)轻链以及(b)重链的序列，该轻链与如表8所述构建体AB1370049、AB1370026、AB1370035、AB1370083、AB1370095或AB1370117中任一个的参考轻链核苷酸序列至少80％、85％、90％或95％相同或完全相同；该重链分别与如表8所述的构建体AB1370049、AB1370026、AB1370035、AB1370083、AB1370095或AB1370117中的任何一个的参考重链核苷酸序列至少80％、85％、90％或95％相同或完全相同。
表7：FRα抗体VH和VL核苷酸序列
表8：FRα抗体重链和轻链核苷酸序列
在一些实施例中，多核苷酸是分离的多核苷酸。
本发明的一个或多个序列(例如一个或多个多核苷酸序列)包括已经从其天然存在的环境中取出的序列、重组或克隆的(例如DNA)分离物、以及化学合成的类似物或通过异源系统生物合成的类似物。
本发明的一个或多个序列(例如一个或多个多核苷酸序列)可以通过本领域已知的任何方式制备。例如，可以通过在合适的宿主细胞中复制和/或表达来产生大量的序列。编码所需片段的天然或合成DNA片段通常会掺入重组核酸构建体，通常是DNA构建体，能够引入原核或真核细胞并在其中复制。通常，DNA构建体适用于在单细胞宿主(如酵母或细菌)中自主复制，但也可用于引入和整合到培养的细菌、昆虫、哺乳动物、植物或其他真核细胞系的基因组中。
本发明的一个或多个序列(例如一个或多个多核苷酸序列)还可以通过化学合成产生(例如通过亚磷酰胺法或三酯法合成多核苷酸)，并且可以在商业自动化寡核苷酸合成仪上进行。双链(例如DNA)片段可以从化学合成的单链产物中获得，该化学合成是通过合成互补链并在适当条件下使链退火在一起或者通过使用具有适当引物序列的DNA聚合酶加入互补链而进行的。
当应用于本发明的序列(例如多核苷酸序列)时，术语“分离的”优选表示该序列已从其天然遗传环境中取出，因此不含其他外来或不需要的编码序列(但可以包括天然存在的5'和3'非翻译区，如启动子和终止子)，并且其形式适合在基因工程蛋白质生产系统中使用。此类分离的分子是那些从其自然环境中分离的分子。
本发明涵盖本文所述多核苷酸的变体。多核苷酸变体可以在编码区、非编码区或两者中含有改变。在一些实施例中，多核苷酸变体包含产生沉默取代、加入或缺失而不改变所编码的多肽的特性或活性的改变。在一些实施例中，多核苷酸变体由归因于遗传密码的简并性的沉默取代产生。多核苷酸变体可以因为各种原因而产生，例如，为了优化特定宿主的密码子表达(将人mRNA中的密码子改变成细菌宿主如大肠杆菌优选的那些密码子)。
在一些方面，还提供了包含多核苷酸的载体。载体可以是表达载体。表达载体可以含有一个或多个额外的序列，例如但不限于调节序列(例如，启动子、增强子)、选择标记和聚腺苷酸化信号。用于转染多种宿主细胞的载体是熟知的，包括但不限于质粒、噬菌粒、粘粒、杆状病毒、杆粒、细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)以及其他细菌、酵母和病毒载体。
载体可以包含控制多核苷酸的表达的一种或多种核酸序列。在一些实施例中，该载体包含与启动子可操作地缔合的本发明多核苷酸。例如，载体可以包含编码本发明抗体的VH区的多核苷酸和编码本发明抗体的VL区的多核苷酸，其中所述多核苷酸与一个或多个启动子可操作地缔合。如本文所使用的，术语“启动子”意指通过驱动多核苷酸的转录调控多核苷酸的表达的任何核酸序列。如本文所使用的，术语“可操作地缔合的”和“可操作地连接的”意指启动子相对于其调控的多核苷酸处于正确的功能位置和/或取向以控制该序列的转录起始和/或表达。在一些实施例中，编码VH区和VL区的多核苷酸与相同启动子可操作地缔合。在一些实施例中，编码VH区和VL区的多核苷酸每一个都与单独的启动子可操作地缔合。在一些实施例中，单独的启动子是相同类型的启动子。在一些实施例中，单独的启动子是不同类型的启动子。
在一些实施例中，载体包含增强子和阻遏子序列中的一种或多种。如本文所使用的，术语“增强子”意指结合一种或多种蛋白质以增加多核苷酸的激活的核酸序列。如本文所使用的，术语“阻遏子”意指结合一种或多种蛋白质以减少多核苷酸的激活的核酸序列。
在一些方面，本发明提供了表达载体，其包含以下可操作地连接的元件中的一个或多个：转录启动子；编码本发明的抗体或抗原结合片段的重链的多核苷酸；编码本发明的抗体或抗原结合片段的轻链的多核苷酸；和转录终止子。
本文提供的另一方面是包含多核苷酸的宿主细胞，所述多核苷酸包含编码本发明的抗体或其抗原结合片段的核酸序列。
在进一步的方面，提供表达和能够表达本发明的载体的宿主细胞。这些细胞可以是哺乳动物细胞(如293F细胞、CHO细胞)、昆虫细胞(如草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞)、酵母细胞(如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)和毕氏酵母(Pichia pastoris))、植物细胞或细菌细胞(如大肠杆菌)。在优选的实施例中，细胞是哺乳动物细胞，优选CHO细胞。
药物组合物
术语“药物组合物”是指如下制剂，该制剂处于允许活性成分的生物活性有效的形式，并且不含有另外的、对组合物将要施用的受试者具有不可接受的毒性的组分。这种组合物可以是无菌的并且可以包含药学上可接受的运载体，诸如生理盐水。合适的药物组合物可以包含一种或多种缓冲液(例如，乙酸盐、磷酸盐或柠檬酸盐缓冲液)、表面活性剂(例如，聚山梨酯)、稳定剂(例如，人白蛋白)、防腐剂(例如，苄醇)、以及增强生物利用度的吸收促进剂、和/或其他常规的增溶剂或分散剂。
如本文所使用的，术语“药学上可接受的”意指由联邦政府或州政府的监管机构批准的或在美国药典、欧洲药典或其他普遍认可的药典中列出的，用于在动物体内并且更特别地在人体内使用。
本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段或本发明的ADC可以作为药物组合物被施用至受试者。相应地，本发明还提供了药物组合物，其包含：本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段、或本发明的ADC以及药学上可接受的赋形剂。
在另一方面，根据本发明并且用于根据本发明使用的药物组合物除了活性成分(例如本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段、本发明的ADC))以外，还可以包含药学上可接受的赋形剂、运载体、缓冲液、稳定剂或本领域技术人员熟知的其他材料。这些材料应无毒并且不应干扰活性成分的功效。运载体或其他材料的确切性质将取决于施用途径，该途径可以是口服、或通过(例如皮肤、皮下或静脉内)注射。
在一些实施例中，本发明药物组合物可以包含药学上可接受的无毒的无菌运载体，诸如生理盐水、无毒缓冲剂、防腐剂等。在本文披露的治疗方法中使用的适合的配制品描述于Remington'sPharmaceutical Sciences[雷明顿药物科学],第22版,LloydV.Allen,Jr.编辑(2012)中。
合适的赋形剂的实例包括水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等中的一种或多种，以及它们的任何组合。在许多情况下，优选的是在组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇或氯化钠。
本领域技术人员会理解，用于本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段或本发明的ADC一起应用的一种赋形剂或多种赋形剂的适当选择，将取决于药物组合物的所需特性。
在一些实施例中，本发明药物组合物可以包含在一种或多种配制品中，该一种或多种配制品选自胶囊、片剂、水性悬浮液、溶液、鼻气雾剂、冻干粉末(其可以在使用前重新构成悬浮液或溶液)或其组合。
在一些实施例中，该药物组合物包含多于一种类型的本发明的抗体或抗原结合片段。例如，药物组合物可包含选自抗体、抗原结合片段、与细胞毒素缀合的抗体或其抗原结合片段(例如本发明的ADC)、或其组合中的两种或更多种。
在一些实施例中，药物组合物可以包含缓冲液(例如，乙酸盐、磷酸盐或柠檬酸盐缓冲液)、表面活性剂(例如，聚山梨酯)、任选的稳定剂药剂(例如，人白蛋白)等。
本文披露的药物组合物用于但不限于在诊断、检测或监测病症中使用，在预防、治疗、控制或改善病症或其一种或多种症状中使用，和/或在研究中使用。本文揭露的药物组合物可能适用于兽医用途或人类的药物用途。
本发明的药物组合物可以通过任何合适的全身或局部施用途径施用于患者。例如，施用可以是口服、口腔、舌下、眼部、鼻内、气管内、肺部、局部、透皮、泌尿生殖道、直肠、皮下、静脉内、动脉内、腹膜内、肌内、颅内、鞘内、硬膜外、心室内或肿瘤内。
可以配制本发明的药物组合物用于通过任何合适的方式的施用，例如通过表皮或透皮贴剂、软膏、洗剂、乳膏或凝胶；通过雾化器、汽化器或吸入器；通过注射或输液；或以胶囊、片剂、液体溶液或水或非水介质中的悬浮液、滴剂、栓剂、灌肠剂、喷雾剂或粉末的形式。在任何给定情况下最合适的施用途径将取决于受试者的身体和精神状况、疾病的性质和严重程度以及配制品的所需特性。
用于口服施用的药物组合物可以是片剂、胶囊、粉末或液体形式。片剂可包含固体运载体或佐剂。液体药物组合物总体上包含液体运载体，例如水、石油、动物油或植物油、矿物油或合成油。可包括生理盐水溶液、右旋糖或其他糖类溶液或二醇，例如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。胶囊剂可包含固体运载体，例如明胶。
对于静脉内、皮肤或皮下注射，或病痛部位的注射，活性成分将处于肠胃外可接受的水性溶液形式，该水性溶液为无热原的并且具有合适pH、等渗性以及稳定性。本领域技术人员完全能够使用例如等渗媒介物，例如氯化钠注射液、林格氏注射液、乳酸盐林格氏注射液来制备合适溶液。需要时，可以包括防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其他添加剂。
疗法
本发明包括疗法，其涉及向受试者施用本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段、ADC或药物组合物，用于预防、治疗或改善与疾病、病症或感染相关的症状。
“治疗”是指治愈、减慢已诊断的病理性病症或障碍，减轻已诊断的病理性病症或障碍的症状，和/或停止已诊断的病理性病症或障碍的进展的治疗性措施。因此，需要治疗的人包括已患有障碍的那些人。在一些实施例中，如果患者显示例如全部、部分或者瞬时减轻或消除了与疾病或障碍(优选癌症)相关的症状，则受试者根据本文提供的方法成功地“治疗”了该疾病或障碍(优选癌症)。
“预防”是指预防和/或减缓靶向性病理性病症或障碍发展的防御性或预防性措施。因此，需要预防的人包括倾向于患有或易患障碍的那些人。在一些实施例中，如果相比于未经受本发明方法的患者，患者瞬时或永久地表现出例如与疾病或障碍相关的更少或不太严重的症状，或与该疾病或障碍相关的症状的更迟的发作，则根据本文提供的方法成功地预防了该疾病或障碍(优选癌症)。
术语“受试者”、“个体”和“患者”在本文中可互换使用以指哺乳动物受试者。在一些实施例中，该“受试者”是人、家畜、农场动物、竞赛动物和动物园动物，例如人、非人灵长类动物、狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛等。在一些实施例中，该受试者是食蟹猴(cynomolgus monkey/Macacafascicularis)。在一个优选的实施例中，该受试者是人。在本发明的方法中，该受试者先前可能未被诊断为患有癌症。可替代地，该受试者可能先前已被诊断为患有癌症。该受试者也可以是展现出疾病风险因素的人，或没有癌症症状的人。该受试者也可以是患有癌症或有患癌症的风险的人。在一些实施例中，该受试者先前已经施用癌症疗法。
因此，在一些方面，提供了本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段、本发明的ADC或药物组合物，用于治疗中使用，例如用于治疗疾病或病症(例如，癌症)。还提供了治疗疾病或病症(例如癌症)的方法，包括向受试者施用治疗有效量的本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段、ADC或药物组合物。在一方面，提供了预防疾病或病症(例如癌症)发作的方法，包括向受试者施用治疗有效量的本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段、ADC或药物组合物。
术语“治疗有效量”是足够向患者显示益处的量。这种益处可以是至少减轻至少一种症状。施用的实际量以及施用的速率和时程将取决于正治疗的疾病的性质和严重度。治疗处方(例如剂量的确定)属于全科医生和其他医生的职责。
在一方面，提供了本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段、ADC或药物组合物，其用于治疗与FRα表达相关的癌症中使用。在另一方面，提供了治疗与FRα表达相关的癌症的方法，该方法包括向受试者施用本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段、ADC或药物组合物。换言之，本文提及的癌症可包含表达FRα的癌细胞。所述癌细胞可包含在肿瘤内。在一些实施例中，癌症包含具有FRα异质表达和/或FRα低表达的癌细胞。
优选地，癌症选自卵巢癌、肺癌(例如肺腺癌)、子宫内膜癌、乳腺癌(例如TNBC)、宫颈癌、胰腺癌、胃癌、肾细胞癌(RCC)、结肠直肠癌、头颈癌鳞状细胞癌(HNSCC)和恶性胸膜间皮瘤。更优选地，癌症是卵巢癌或肺癌。在一些实施例中，癌症是一种或多种非小细胞肺癌(NSCLC)，其优选地选自鳞状NSCLC、腺癌NSCLC、或其组合。
癌症的其他实例包括但不限于良性、恶变前和恶性细胞增殖，包括但不限于赘生物和肿瘤(例如组织细胞瘤、神经胶质瘤、星形细胞瘤、骨瘤)、癌症(例如卵巢癌、肺癌、非小细胞肺癌(鳞状细胞癌或腺癌)、子宫内膜癌、胰腺癌、胃癌、结肠直肠癌、头颈部鳞状细胞癌、恶性胸膜间皮瘤、乳腺癌(例如TNBC)和肾癌。可以治疗任何类型的细胞，包括但不限于肺、胃肠道、乳腺(乳房)、卵巢、肾(renal)和胰腺。
在一方面，本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段、ADC或药物组合物是用于在消除受试者中FRα阳性细胞群的方法中使用，该方法包括向该受试者施用该抗FRα抗体或其抗原结合片段、该ADC或该药物组合物。在另一方面，提供了在受试者中消除FRα阳性细胞群的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段、ADC、或药物组合物。在一些实施例中，FRα阳性细胞具有FRα异质表达和/或FRα低表达。
抗体的其他应用
抗体或抗原结合片段在体外和体内对FRα均具有高亲和力，因此可有利地用于检测FRα表位的方法和相关的诊断方法中。
本发明的抗体或其抗原结合片段可用于通过本领域已知的任何方法进行的免疫特异性结合的测定中。可以使用的免疫测定包括但不限于使用诸如以下技术的竞争性和非竞争性测定系统：蛋白质印迹、RIA、ELISA、ELISPOT、“夹心”免疫测定、免疫沉淀测定、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散测定、凝集测定、补体固定测定、免疫放射测定、荧光免疫测定和蛋白质A免疫测定。
可以在组织学上使用本发明的抗体或其抗原结合片段，如在免疫荧光法、免疫电子显微术、或非免疫学测定中，例如用于原位检测FRα或其保守变体或肽片段。原位检测可通过以下来实现：从患者取出组织学样品并对其施加经标记的本发明的抗体或其抗原结合片段，例如，通过使经标记的抗体或其抗原结合片段覆盖在生物样品而施加。通过使用这一程序，不仅可确定FRα或保守变体或肽片段的存在，还可确定其在检查的组织中的分布。使用本发明，普通技术人员将容易地知道，可以修改多种组织学方法中的任一种(诸如染色程序)以实现这种原位检测。
可以标记抗体或其抗原结合片段、或抗体-药物缀合物，例如以帮助检测细胞结合(体外或体内)。标记可以是生物素标记。在另一个实施例中，该标记可以是放射性同位素。在另一个实施例中，该标记可以是荧光团。
在一方面，提供了用于检测样品中FRα多肽(例如，FRα多肽表位)是否存在的方法，该方法包括：
(a)使样品与本发明的抗体或其抗原结合片段或药物组合物接触，以提供抗体-抗原复合物；以及
(b)检测所述抗体-抗原复合物是否存在；
其中抗体-抗原复合物的存在证实了FRα多肽(例如FRα多肽表位)的存在或抗体-抗原复合物的不存在证实了FRα多肽(例如FRα多肽表位)的不存在。
制造物品和试剂盒
在进一步的方面，本文提供了包含一种或多种本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段、或本发明的ADC、或本发明的药物组合物的制品。
在另外的方面，本文提供了药物包装或试剂盒，该药物包装或试剂盒包含填充有本发明的药物组合物的一种或多种成分，如本发明的一种或多种抗体或其抗原结合片段或ADC。任选地，与这样一个或多个容器相关联的可以是由管理药物或生物制品的制造、使用或销售的政府机构规定的形式的公告，该公告反映该机构针对人类施用，对制造、使用或销售的许可。例如，关于如何使用提供的药物组合物治疗癌症的说明，例如卵巢癌、肺癌(例如NSCLC)、子宫内膜癌、乳腺癌(例如TNBC)、宫颈癌、胰腺癌、胃癌、肾癌细胞癌、结肠直肠癌、头颈鳞状细胞癌(HNSCC)和恶性胸膜间皮瘤也可能包括在内或可供患者或医疗服务提供者使用。
在一方面，提供了包含本发明的抗体或抗原结合片段或ADC或药物组合物的试剂盒。进一步涵盖所述试剂盒在本发明方法中的用途。
在一些实施例中，试剂盒可单独提供抗原或抗原-片段以及异源(例如，细胞毒素未与抗体或抗原结合片段缀合，而是处于适合与其缀合的形式)；任选地，其中该试剂盒进一步提供了用于将该异源药剂与该抗体或抗原结合片段缀合的说明书和/或试剂。在一些实施例中，该试剂盒包含进行检测测定的必要和/或足够的所有组件，这些组件包括所有对照、用于进行测定的指导、以及用于分析和呈现结果的任何必要的软件。
本披露内容并不受本文所披露的示例性方法和材料的限制，并且与本文所述的那些方法和材料相似或等同的任何方法和材料都可以用于本披露内容的实施例的实践或测试。
上述实施例被理解为说明性实例。设想了另外的实施例。应当理解的是，关于任何一些实施例描述的任何特征可以单独方面使用，或者与所描述的其他特征结合使用，并且还可以与任何其他实施例或方面的一个或多个特征，或者任何其他实施例或方面的任何组合结合使用方面。此外，在不脱离由所附权利要求书限定的本发明的范围的情况下，也可以采用上面未描述的等效物和修改。
在本发明的上下文中，本文所述的抗体和方法的其他实例和变化对于本领域技术人员而言是显而易见的。如在所附权利要求书中所示的，其他实例和变化在本发明的范围内。
本文引用的所有文献均通过引用以其全文并入本文，包括引用文献中呈现的所有数据、表、附图和文本。
实例
实例1-抗FRα抗体的产生
目标
使用人源化转基因小鼠进行杂交瘤运动以获得与叶酸受体α(FRα)结合的高亲和力、全人源的抗体。
材料和方法
用于免疫的人FRα的生产
将人FRα基因插入到pDEST12.2 OriP载体中。对应于叶酸受体的可溶性区域的序列进一步被克隆，带有N末端CD33前导序列和C末端Avi和His6标签。负责GPI锚定的序列被移除，生成可溶性构建体。
使用标准方法表达和纯化人FRα蛋白。简而言之，制备质粒DNA并使用PEI介导的递送将其转染到自身悬浮适应的CHO细胞系中，转染点的细胞密度为4x 106个细胞/ml。细胞在34℃、5％CO2、140rpm、70％湿度培养7天。使用5ml HisTrap excel柱(Cytiva)收获和纯化条件培养基以进行亲和捕获，然后在DPBS中平衡的HiLoad Superdex 7516/600pg柱(Cytiva)上精炼。通过SDS-PAGE分析级分的纯度，合并并通过UV吸光度确定其浓度，并在储存于-80℃之前在液氮中快速冷冻。为了在其Avi标签上对蛋白质进行位点特异性生物素化，将蛋白质与重组BirA酶、ATP和生物素一起孵育，然后如上所述在尺寸排阻色谱上进行纯化。如针对靶抗原所述将抗体表达，并使用蛋白A色谱纯化。
免疫
采用重复免疫多位点(RIMMS)策略，其中Del-1人源化小鼠和CD1野生型小鼠被免疫如下：
--4天：出血前
-0天：初始免疫
-7天：第二次加强
-13天：第一次出血
-15天：第三次加强
-20天：第二次出血
-22天：第四次加强
-24天：第五次加强
-28天：终末出血和脾脏(SP)和淋巴结(LN)融合
为了免疫，将6只人源化Del-1小鼠和4只CD1野生型小鼠分成两组(第1组：Del-1小鼠1-6，第2组：CD1小鼠7-10)。如上所讨论，用重组人FRα细胞外结构域对动物进行免疫。将重组FRα在PBS中稀释，用等体积的完全弗氏佐剂乳化，并在两个部位注射到小鼠体内。对于后续的三次注射，在弗氏不完全佐剂中乳化免疫原，并且如上述进行注射。最终的加强在第24天通过腹膜内注射在PBS中的重组蛋白进行。
在免疫前、第一次免疫后第13天和第二次免疫后第20天从小鼠获得尾静脉血。通过血清ELISA确定针对人FRα的IgG滴度。
评估小鼠对FRα的免疫反应(血清ELISA)
使用标准技术在96孔微量滴定板中通过ELISA确定针对人FRα和阴性蛋白质对照的血清IgG滴度。使用HRP标记的多克隆山羊抗小鼠IgG特异性二抗(Jackson Immunolabs)检测抗体，并使用TMB底物(西格玛公司)开发测定，然后加入0.5M硫酸以终止反应。然后使用珀金埃尔默公司(PerkinElmer)EnVision 2103多标记读板仪读取板。
绘制针对人FRα和阴性蛋白对照的血清滴定曲线，并且计算对应的曲线下面积(AUC)。
单克隆小鼠IgG分离(杂交瘤生成)
在最后一次加强后四天，无菌地收获淋巴结，并且通过机械破坏分离细胞，然后对其计数。将这些细胞与SP2/0骨髓瘤细胞混合，并且使用电融合装置融合。将所得融合物与基于甲基纤维素的半固体培养基混合，并且铺板至OmniTray板中。将半固体培养基中的细胞在5％CO2培养箱中在37℃下培养13天。在此孵育期间，克隆集落由单个祖细胞杂交瘤细胞形成。这些集落分泌IgG，该IgG被存在于半固体培养基中的FITC缀合抗IgG捕获在集落附近。当通过ClonePix FL集落采集器(分子装置公司(MolecularDevices))可视化时，在作为荧光‘卤素’的细胞周围可以观察到所得免疫复合物形成。然后，将这些卤素化的集落挑选至96孔微量滴定板中。在培养3-5天后，收获挑选集落的上清液并且针对人FRα结合进行筛选。
小鼠IgG的DNA测序
使用磁性寡核苷酸(dT)颗粒从杂交瘤细胞中提取信使RNA(mRNA)并反转录成cDNA。使用对所有小鼠IgG亚类具有特异性的聚C和恒定区VH或VL引物进行PCR扩增。通过Sanger测序对PCR扩增子进行测序。
小鼠IgGPhynexus纯化
细胞在24孔板中繁殖，以及10天后，将上清液转移至96孔主封闭液中，并且使用珀金埃尔默公司Minitrack在ProPlus树脂(Phynexus)上将小鼠IgG的全部亚类的(IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3)从过度生长的细胞培养上清液中纯化。将所捕获的小鼠IgG用100mMHEPES、140mM NaCl pH 3.0洗脱，以及然后用等体积的200mM HEPES pH 8.0中和。在UV-Star 384孔板中在280nm下使用吸光度读取对纯化的IgG进行定量。
对小鼠IgG的重整
对于每种杂交瘤，对小鼠杂交瘤IgG克隆进行分子重整以产生表达小鼠VH和VL结构域和相关小鼠IgG恒定结构域的构建体，基本上如Persi等人,Gene[基因]187:9-18,1997所述。将VH结构域克隆至含有小鼠重链恒定结构域和调控元件的相关载体中以在哺乳动物细胞中表达完整IgG1重链。相似地，将VL结构域克隆至用于表达适当小鼠轻链(λ或κ)恒定结构域和调控元件的载体中以在哺乳动物细胞中表达完整IgG轻链。为了获得IgG，将哺乳动物悬浮液CHO细胞用重链和轻链IgG载体转染。IgG被表达并且分泌至培养基中。使用MabSelect SuRe色谱柱(通用医疗生命科学公司(GE Healthcare Lifesciences)目录号：11003493(用于1ml柱)；11003495(用于5ml柱))和来自通用医疗生命科学公司的AktaXpressTM纯化系统，从澄清的上清液中纯化IgG。使用PD-10脱盐柱(通用医疗生命科学公司；目录号：17085101)将洗脱的材料缓冲液交换到PBS中。使用基于IgG氨基酸序列的消光系数以分光光度法确定IgG的浓度(Pace等人,Protein Sci.[蛋白质科学]4:2411-2423,1995)，并使用SDS-PAGE和HP SEC分析对纯化的IgG的纯度进行分析。
结果
免疫后血清抗FRαIgG滴度
许多方法可用于mAb发现，包括噬菌体展示、免疫和结合谱的使用(这将涉及识别与叶酸竞争结合FRα的mAb)。在这里，使用双重方法通过免疫生成抗FRα抗体。第一种途径涉及人类转基因小鼠(即Del-1)的免疫，该小鼠在Ig基因座中含有完整的人类VH和Vk结构域。这确保了，mAb的高度多样性将会产生，并且此外将是全人源化的，并且可以在不需要人源化的情况下用于开发。第二种途径涉及非转基因小鼠(即CD-1)的免疫，其中将需要mAb的人源化。
在免疫方案的第4天(出血前)、第13天(出血1)和第20天(出血2)，从所有小鼠收集血清样本并测试抗FRα特异性抗体的存在。所有小鼠都对免疫应答，产生抗FRα特异性抗体。
杂交瘤的产生
总共产生了10510个杂交瘤克隆，其中2586个被鉴定为分泌IgG的克隆。将分泌IgG的集落挑选至96孔微量滴定板中。在培养3-5天后，收获挑选集落的上清液并且针对人FRα结合进行筛选。生成的先导抗体(参见实例2)均获自Del-1转基因小鼠。
实例2-抗FRα抗体的物种交叉反应性
目标
生成的抗体特征在于与靶标的结合强度、直向同源物和旁系同源物特异性。
材料和方法
用于测定的抗原的产生
表9表明蛋白质来源的物种、构建体被克隆到其中的载体、信号肽和与蛋白质融合的表位标签。表10进一步示出了每个插入物的序列。在每种情况下，对应于每种叶酸受体的可溶性区域的序列被克隆，带有N末端CD33前导序列和C末端Avi和His6标签。负责GPI锚定的序列被移除，生成可溶性构建体。
表9：克隆的插入物的总结
表10：插入物的序列
使用如实例1中针对人FRα所讨论的方法表达和纯化表10中的所有蛋白质。
HTRF测定
HTRF测定在384孔白色浅孔非结合板(Corning，4513)中在缓冲液中进行，该缓冲液含有磷酸盐缓冲盐水(PBS)(Life Technologies，14190)、0.1％v/v牛血清白蛋白(BSA)(西格玛公司，A9576)和0.4M氟化钾(VWR International，26820)。在指定的孵育期后，在Envision(珀金埃尔默公司)读板器上以320nm激发后测量590和665nm的时间分辨荧光。(665nm发射/590nm发射)×10,000的比率值用于根据以下等式计算％ΔF：
阴性对照率来自非特异性结合(NSB)对照孔。使用GraphPad Prism软件，使用四参数逻辑曲线拟合方程，分析曲线。
HTRF抗原结合测定
将含有来自杂交瘤细胞的小鼠IgG的上清液，以25％的最终测定稀释度与0.5nM链霉亲和素穴状化合物(CisBio，610SAKLB)、抗小鼠IgG AF647(Jackson ImmunoResearch,115-605-164)和1nM生物素化人FRα、食蟹猴FRα、小鼠FRα、人FRβ或人FRγ，以得到10μl的最终测定体积，在荧光被测定之前在室温孵育4小时。
大鼠FRα的抗原结合测定
物种结合测定使用倾斜底部黑色384孔板(佛特比奥公司，18-5076)，在OctetRED384(佛特比奥公司)上于25℃在含有PBS、0.1％v/v BSA(西格玛公司，A9576)、0.01％v/v Tween-20(西格玛公司，P9416)(pH 7.4)的测定缓冲液中进行。根据制造商的说明，使用蛋白A或抗人捕获生物传感器(AHC)(佛特比奥公司，18-5089)设置测定。将10μg/ml的抗大鼠FRαIgG(义翘神州科技股份有限公司，81073-RP01)包被到蛋白A生物传感器(佛特比奥公司，NC9490476)上，并将10μg/ml的测试人IgG上样到抗人捕获生物传感器(AHC)(佛特比奥公司，18-5089)持续180秒。通过将上样的生物传感器与500nM人FRα(内部)或500nM大鼠FRα(义翘神州科技股份有限公司，81073-R08H)一起孵育来测量缔合。在转移到测定缓冲液中后测量解离。使用Octet数据分析软件7.0版分析数据。
结果
以HTRF测定形式测试了2586个杂交瘤上清液与人FRα、食蟹猴FRα、小鼠FRα、人FRβ或人FRγ的结合。进行该实验以分离与食蟹猴FRα交叉反应的抗体，同时确保未观察到与旁系同源物：FRβ和FRγ的结合。为了确定人叶酸受体与旁系同源物和直向同源物的序列相似性，使用Clustal Omega v1.2.2算法确定了多重序列比对。人FRα与旁系同源物(表11)和直向同源物(表12)的序列同源性如下所示。
表11：成熟人FRβ和FRγ与FRα多肽的序列同一性百分比
N/A–不适用
表12：成熟人、食蟹猴、小鼠和大鼠FRα的序列同一性百分比
N/A–不适用
结合物被定义为具有>30％ΔF测定信号的IgG。总共129个IgG显示仅与人和食蟹猴FRα结合，9个IgG显示仅与人、食蟹猴和小鼠FRα结合，另外30个IgG显示仅与人、食蟹猴或小鼠FRα结合。6个先导IgG的数据显示在表13中。
表13：6个先导IgG的HTRF IgG结合测定
在杂交瘤上清液筛选中鉴定的168个杂交瘤IgG被制成Phynexus纯化的IgG。这些在抗原结合测定中以IgG的4个稀释度进行测试。115个IgG被鉴定为人和食蟹猴FRα交叉反应性且不结合人FRβ和FRγ的IgG。6个先导IgG的数据如图1A-1F所示。
此外，对于大鼠FRα抗原结合测定，6种先导IgG也显示与人FRα结合但不与大鼠FRα结合。
总的来说，已经证明，通过广泛和高通量的抗体生成和筛选活动，可以生成各种不同的抗FRαIgG抗体。
实例3-高通量内化测定
目标
生成的抗体的特征在于它们的内化率。
材料和方法
来自杂交瘤输出的PhyNexus纯化IgG样品在内化测定中进行了评估。在加入IgG样品之前，将KB细胞的冷冻储存液接种过夜。使用固定采集方法运行测定，固定前孵育2.5小时。该测定使用pHrodo Green标记的检测试剂和Cell MaskRed(赛默飞世尔科技公司，Thermo Fisher Scientific)运行。
第1天
将冷冻的小瓶KB细胞解冻，在培养基中稀释，离心并在计数前重新悬浮在新鲜培养基中。细胞以10,000个细胞/孔接种在MEM+NEAA+10％FCS(Thermo Fisher Scientific)中，将已准备的板在37℃、5％CO2的加湿培养箱中孵育过夜。
第2天
制备抗体和二级检测试剂，室温预孵育30min。从细胞中去除培养基并加入预混合的抗体和检测试剂。在37℃将板孵育2.5小时。孵育后，加入30μl/孔7.2％甲醛(赛默飞世尔科技公司)+Hoechst(赛默飞世尔科技公司)1:5000稀释的溶液，以得到3.7％甲醛固定和1:10000稀释的核染色。将板在室温下孵育20分钟，然后用1x HBSS(赛默飞世尔科技公司)洗涤，然后加入30μl/孔的cell mask red(1:5000稀释到0.1％Triton X-100(Merck))。将板在室温下在黑暗中孵育20分钟，用HBSS洗涤两次并在Opera High Content Imaging[高内涵成像]系统上成像(参见表14的Opera采集参数)。
表14：Opera采集的参数
结果
运行高通量内化测定以测定抗体内化进入KB细胞的速率。Phynexus纯化的抗体被标记，加入到KB细胞中，并在2.5小时的时间过程后固定细胞。使用Columbus进行图像分析，并在Spotfire中的High Content Profiler之内分析输出，允许对采集的图像数据进行多参数分析，并开发含有展现出增强摄取率的mAb的“命中列表”(图2)。所有6个先导抗体均显示内化高于由阳性对照样品确定的截止值。
实例4-生成抗FRα抗体的表位分类
目标
该实验的目的是对生成的抗FRα抗体(特别是6种示例性抗体)进行表位分类。
材料和方法
根据制造商的说明使用微型DyLight 650抗体标记试剂盒(赛默飞世尔科技公司，84536)，标记三个基准抗FRαIgG用于在均相时间分辨荧光(HTRF)测定中使用(对于HTRF测定的一般设置，参见实例2)。
使用测试IgG、1nM链霉亲和素穴状化合物、生物素化人FRα和DyLight 650标记的IgG的滴定至10μl的测定体积来建立HTRF表位竞争测定。对于比较抗体1和比较抗体2测定，使用0.5nM生物素化人FRα和0.5nM DyLight 650标记的比较抗体1或比较抗体2。对于比较抗体3测定，使用1.25nM生物素化人FRα和1.25nM DyLight650标记的比较抗体3。在荧光测量之前，将测定板在室温下孵育3-4小时。
结果
在三个HTRF表位竞争测定中分析了115个人/食蟹猴叶酸受体特异性杂交瘤IgG，以确定表位多样性。8个IgG在所有测定中均抑制，41个在比较抗体1和比较抗体2测定中，39个在比较抗体2和比较抗体3测定中，12个在比较抗体1和比较抗体3测定中，仅4个在比较抗体1测定中，仅6个在比较抗体3测定中，而5个IgG在任何测定中均未抑制。
将6种示例性抗体重整、表达和纯化为人IgG1，并在HTRF表位竞争测定中进行分析以确认效力。特别地，所有先导的示例性抗体都可以抑制比较抗体2竞争测定。AB1370117和AB1370035在所有3个表位竞争测定中均受到抑制。AB1370026、AB1370083和AB1370095仅在比较抗体1和比较抗体2表位竞争测定中抑制。AB1370049仅在比较抗体2和比较抗体3竞争测定中抑制(参见表15和图3)。
表15：HTRF表位竞争分析中IC50分析的总结
结论
通过表位竞争测定，对6种抗体进行分析。观察到一系列行为和表位多样性，一些分子与所有三种比较抗体竞争，而其他分子仅与一个子集竞争。AB1370049未显示与比较抗体1的竞争，并且展示与比较抗体2的竞争最弱，同时与比较抗体3竞争。
实例5-生成的抗FRα抗体的抗原结合亲和力
目标
使用表面等离子共振分析，确定一组生成的抗体(特别是6种示例性抗体)与人和食蟹猴FRα的结合动力学和平衡解离常数。
材料和方法
在25℃下用Biacore T200表面等离子体共振系统(Cytiva)测量对人和食蟹猴FRα蛋白的抗体亲和力。使用标准胺偶联技术将蛋白A在10mM乙酸钠(pH 4.0)中以50μg/ml的浓度共价固定到CM5芯片表面。抗体以10μl/min被捕获到HBS-EP+缓冲液(pH 7.4)中的蛋白A表面，以确保FRαECD结合。FRαECD连续稀释(0.4nM-100nM人FRαECD、0.8nM-200nM食蟹猴FRαECD、30nM-4000nM小鼠FRαECD和大鼠FRαECD)在HBS-EP+缓冲液(pH 7.4)中，并以50μl/min流过芯片，缔合2分钟，并解离8分钟。用3M MgCl2脉冲完全再生该芯片表面，以去除捕获的抗体，以及任何结合的FRαECD。在相同条件下进行多次仅缓冲液注射，以允许对使用Biacore T200评估软件进行分析的最终传感图集进行双重参考减法，以得出平衡解离常数。
结果
通过SPR测量一组抗体对人和食蟹猴FRα蛋白的抗体亲和力。所有抗体都结合人和食蟹猴蛋白。对人FRα的亲和力在1-16nM范围内，对食蟹猴FRα的亲和力在1-37nM范围内。下表16总结了6种示例性抗体的动力学结合参数。
表16：抗体亲和力数据总结
结论
6种抗体都具有低nM范围内的解离常数，并且在所有情况下，与食蟹猴FRα结合的亲和力是与人FRα结合的亲和力的2.5倍以内。因此，从亲和力的角度来看，所有6种示例性抗体似乎都适合作为治疗剂进一步开发。
实例6-生成的抗FRα抗体的物理化学性质
目标
生成可开发并对齐制造要求的治疗性抗体需要抗体的理化特性的全面评估。在此实验中，评估了一组生成的抗体的表达滴度、稳定性和可逆自缔合倾向。
材料和方法
疏水相互作用色谱(HIC)HPLC
UHPLC-HIC分析在岛津(Shimadzu)Prominence系统上进行，使用Sepax ProteomixHIC Butyl-NP55μm无孔4.6x 35mm柱，在约1mg/ml的每个先导mAb样品(用在25mM磷酸钠中的1.5M硫酸铵(pH 7.40)缓冲液中按1:1稀释)上，用1.5M至0M硫酸铵和在25mM磷酸钠中的0至20％乙腈(pH 7.40)梯度洗脱。物质的疏水性越强，洗脱越晚，因此保留时间越长。
亲和捕获自相互作用纳米颗粒光谱(AC-SINS)
将捕获抗体(山羊抗人IgG Fcγ片段特异性，Jackson ImmunoResearch)缓冲液交换为结合缓冲液(20mM醋酸钾，pH 4.3)和捕获纳米颗粒(柠檬酸盐稳定的20nm金纳米颗粒(OD＝1)，Innova Biosciences)通过在室温下与抗体以0.4mg/ml孵育1小时来制备。通过在室温下与100nM PEG 2000(Merck)孵育1小时来封闭纳米颗粒并随后浓缩10倍。在96孔板中，以在含有12μl捕获纳米颗粒和20mM组氨酸、120mM蔗糖、80mM精氨酸、pH 6(HSA)缓冲液的溶液中的45μg/ml的终浓度总体积为120μl制备用于分析的抗体。将样品在室温下孵育20分钟，然后将一式两份50μl等分试样转移到384孔聚苯乙烯板(Nunc 384孔透明聚苯乙烯板，赛默飞世尔科技公司)。在读板器中测量样品吸光度，并与仅缓冲液对照孔相比，确定每个样品的波长红移。>5nm的偏移被标示为存在自缔合的风险。
杆状病毒ELISA
如Hotzel等人所述(Hotzel等人2012mAbs[单克隆抗体]4:6,753-760)，通过ELISA测定抗体与杆状病毒颗粒的非特异性结合。在PBS(Gibco公司14190-086)+0.5％BSA(西格玛公司A9576)中以100nM或10nM制备每种抗体的制剂，并将其一式两份用于96孔NuncMaxisorp F板上的ELISA测定，该板在4℃下用50μl/孔的50mM碳酸钠中的1％杆状病毒提取物(BV板)或用50mM碳酸钠(空白板)涂覆过夜。在用PBS洗涤后，将板在室温下用300μl/孔的PBS+0.5％BSA封闭1小时，并用PBS洗涤三次。加入50μl/孔的PBS+0.5％BSA(背景)或测试抗体稀释液，并且在室温下孵育1h。在PBS中洗涤三次后，以50μl/孔加入在PBS+0.5％BSA中以1:5000稀释的检测抗体(抗人Fc-特异性-HRP西格玛公司A0170)。将样品在室温下孵育1小时并且将板在PBS中洗涤三次。然后以50μl/孔加入HRP底物–TMB(SureBlue Reserve，KPL53-00-03)，并且在颜色变化后，通过加入50μl/孔的0.5M硫酸来终止反应。在450nm处测量吸光度。BV分数是通过对每个抗体样品在10nM和100nM浓度下的450nm吸光度进行平均，然后仅除以次要的对照样品来计算的。BV分数>5可能表示由于非特异性结合而导致清除增加的风险。
加速热稳定性测定
将IgG在PBS中稀释至1mg/ml，然后在4℃或45℃下孵育2周，然后使用过滤离心柱(密理博公司(Millipore)，UFC30HVNB)过滤。通过将70μl的IgG上样到TSKgel G3000SWXL 5μm，7.8mm x 300mm柱上，使用1ml/min的流速和0.1M无水磷酸氢二钠和0.1M硫酸钠，pH 6.8作为等度运行缓冲液进行高效尺寸排阻色谱(HP-SEC)。与较小的分子相比，较大的分子在更大程度上从尺寸排阻柱的孔被排除，并因此更早洗脱。将早于单体峰洗脱的峰记录为聚集体。将在单体峰后洗脱的峰(不包括缓冲液相关峰)记录为片段。同时，在HTRF表位竞争测定中分析抗体的效力变化。
结果
疏水相互作用色谱(HIC)HPLC
较高的HIC保留时间对应于增加的疏水性，这可能表明由于非特异性摄取而导致聚集和清除增加的风险。此外，疏水性更强的mAb可能会产生疏水性更强的ADC，这可能导致缀合过程中的聚集、作为ADC的不稳定，以及可能更多地非特异性摄取到正常组织中，从而导致毒性。
通过HPLC-HIC，生成的一组抗体显示保留时间在约2.0-2.8分钟的范围内。特别地，与测试的组的抗体相比，6种示例性抗体展现出可接受的低保留时间(参见表17)。
表17：HIC-HPLC数据的总结
样品 通过HIC-HPLC的保留时间(min)
AB1370026hIgG1 1.96
AB1370035hIgG1 2.25
AB1370049hIgG1 2.27
AB1370083hIgG1 2.27
AB1370095hIgG1 2.12
AB1370117hIgG1 2.27
亲和捕获自相互作用纳米颗粒光谱(AC-SINS)
还通过亲和捕获自相互作用纳米颗粒光谱(AC-SINS)测试了抗体的自相互作用倾向。这种行为是如可逆自缔合、聚集、粘性、乳光和相分离的非期望特性的基础或与之相关。通过监测包被抗体的金颗粒的峰值吸收波长(等离子体波长)，AC-SINS间接测量蛋白质在模拟高蛋白质浓度的环境中自相互作用的倾向。示例性抗体的红移表明所有测试抗体在HSA缓冲液中的自我相互作用水平可忽略不计，而阴性和阳性对照抗体表现如预期(图4)。这些结果表明，对于所有测试的6种示例性抗体，自缔合的风险都很低。
杆状病毒ELISA
为了测试可以指示体内清除率增加的非特异性结合，以ELISA形式测定了抗体与杆状病毒颗粒的结合水平。在所有情况下，抗体都显示出可忽略不计的非特异性结合水平，所有这些都低于5的截止测定阈值。有利地，这表明体内清除不良的风险较低。
加速热稳定性测定
通过HP-SEC评估一组6种示例性抗体的热稳定性，并且平行地在HTRF表位竞争测定中评估效力变化(表18)。在所有情况下，任何效力变化均<2倍且单体减少<3％，表明所有抗体在测试条件下都是热稳定的。
表18：加速稳定性研究数据的总结
结论
所有6种先导mAb都显示出良好的热稳定性、低自缔合风险、可忽略的非特异性结合和低疏水性，因此所有先导mAb都显示出可接受的可开发性参数。
实例7-在SCID小鼠中生成的抗FRα抗体的药代动力学
目标
为了研究单次静脉内剂量施用后在野生型SCID小鼠中生成的抗FRα抗体的药代动力学。
材料和方法
使野生型SCID小鼠(每组n＝3)静脉内(推注)给药示例性抗FRα抗体(5mg/kg)。在给药后15分钟、4小时、1天、2天、3天、6天、10天、14天和21天取血液样品，离心以获得血浆并分析总抗体。使用Phoenix 64软件(Certara)确定药代动力学参数。
通过通用ELISA IgG测定，确定血浆抗体浓度。
结果
尽管通过基于上述实例的筛选过程显得很有示范性，但在小鼠中的更广泛的小组之内观察到了一系列PK曲线。通过PK筛选，去除了具有不期望的高清除率和短半衰期的先导化合物。
所测试的组抗体给出了约5-25ml/kg/天范围内的清除率和约4-20天范围内的半衰期。在所测试的抗体中，6种示例性抗FRα抗体表现出相对较低的清除率和长的半衰期。表19显示了6种示例性抗FRα抗体在小鼠中的药代动力学参数。
表19：野生型SCID小鼠中示例性抗FRα抗体(总抗体)的药代动力学参数
C最大＝最大观察血浆浓度
AUC最后一次＝血浆浓度与时间曲线(一直到最后一次可测量时间点)下的面积；
CL＝血浆清除率
Vss＝稳态分布容积
t1/2＝消除相半衰期
结论
示例性抗FRα抗体在野生型SCID小鼠中展现出一系列药代动力学特性，其中AB1370035在该模型中表现出最长的半衰期，紧随其后的是AB1370049，其清除率与AB1370117一样最低。
实例8-AB1370049在hFcRnTg32小鼠中的药代动力学
目标
研究单次静脉内施用后AB1370049在hFcRn Tg32小鼠中的药代动力学。
材料和方法
人FcRn Tg32小鼠(每组n＝3)静脉内(推注)给药AB1370049(5mg/kg)。在给药后15分钟、4小时、1天、2天、3天、6天、10天、14天和21天取血液样品，离心以获得血浆并分析总抗体。使用Phoenix 64软件(Certara)确定药代动力学参数。
用免疫捕获LC-MS/MS测定，测量抗体浓度。简而言之，将多克隆抗人抗体与磁珠缀合。然后将25μl血浆样品稀释在TBS中并与磁珠一起孵育。在捕获后，磁珠经过多次洗涤，然后在内标存在下用胰蛋白酶消化。加入酸淬灭消化。然后将胰蛋白酶消化的液体内容物的等分试样转移到注射板，用于通过LC-MS/MS进行抗体分析。
将人抗体Fc区上的标志性胰蛋白酶肽(VVSVLTVLHQDWLNGK)用于计算所选基质中总抗体的浓度。使用反相色谱(RPLC)分离来自免疫亲和富集样品的胰蛋白酶消化物，然后使用多反应监测(MRM)检测特征肽。本实验中使用的内标是同位素标记的肽。分析物与内标的峰面积比用于根据通过在所需基质中加入ADC参考材料创建的标准曲线进行计算。
标准曲线和QC是通过将不同浓度的靶标化合物(ADC参考物质)加入到与样品基质相同的基质中来制备的。定量范围涵盖100ng/ml-12,000ng/ml，稀释QC覆盖高达50倍稀释。标准曲线拟合线性回归，权重为1/x2。
结果
表20显示了在hFcRn Tg32小鼠中的AB1370049的药代动力学参数。
表20：AB1370049在hFcRn Tg32小鼠中的药代动力学参数
C最大＝最大观察血浆浓度
AUC最后一次＝血浆浓度与时间曲线(一直到最后一次可测量时间点)下的面积；
CL＝血浆清除率
Vss＝稳态分布容积
t1/2＝消除相半衰期
结论
AB1370049在hFcRn Tg32和野生型SCID小鼠中展现出相似的药代动力学特性。hFcRn Tg32小鼠是转基因小鼠模型，其中小鼠FcRn已经被敲除，并且人FcRn已经被敲入。因此，它代表了特别适合预测AB1370049的人体药代动力学的模型。基于hFcRn Tg32小鼠的药代动力学，AB1370049的人体清除率可能较低，半衰期与其他临床使用的抗体相似，因此有望实现方便的给药。
实例9-示例性抗FRα抗体在SCID小鼠中的内化/溶酶体运输
目标
评估先导FRαmAb到FRα阳性KB和JEG-3细胞中的内化。
材料和方法
KB和Jeg-3细胞用cell trace violet(赛默飞世尔科技公司)染色并接种在96孔板中并孵育过夜。在加入到铺板细胞之前，将单克隆抗体与50nM的Fab-pHast人(ATS bio，Carlsbad)在室温下孵育。在CellInsight CX7高内涵筛选平台(赛默飞世尔科技公司)中，每30分钟拍摄细胞图像(20x)并自动分析荧光区域长达48小时。
结果
所有测试的先导抗体迅速内化到表达FRα的细胞系中，在JEG-3细胞(图5A)中大约6-7小时饱和，在KB细胞中大约5小时饱和(图5B)。
结论
尽管与KB细胞(3700万个FRα受体/细胞)相比，JEG-3(绒毛膜癌)细胞(990,000个FRα受体/细胞)表面上的FRα表达较低，但测试的抗体被迅速内化到两种细胞类型中，表明了它们呈ADC形式的潜在效用。
实例10-DAR8形式的ADC生成
目标
为生成具有SG3932有效载荷的先导mAb的DAR8 ADC，用于先导选择的体外和体内活性评估。
材料和方法
将三(2-羧乙基)膦(TCEP，Pierce)在磷酸盐缓冲盐水pH 7.4(PBS，Gibco)中的50mM溶液加入(50摩尔当量/抗体，16.7微摩尔，333μl)到抗体(AB1370049先导、AB1370026、AB1370035、AB1370083、AB1370095或AB1370117；每个50mg，333纳摩尔)在含有PBS和1mM乙二胺四乙酸(EDTA，Molekula)的还原缓冲液中的20ml溶液(最终抗体浓度为2.5mg/ml)中。使还原混合物在孵育的定轨振荡器中于+37℃下轻微(60rpm)摇动下加热2小时(或直到通过UHPLC观察到完全还原)。冷却至室温后，使用15ml Amicon Ultracell 50kDa MWCO旋转过滤器通过旋转过滤器离心去除过量还原剂至PBS+1mM EDTA。将SG3932作为DMSO溶液(12-24摩尔当量/抗体，4.8-9.0微摩尔，在2.0-2.3ml DMSO中)加入至18-19ml的该还原的抗体溶液(37.0-46.9mg，247-313纳摩尔)中，以2.0-2.5mg/ml，最终DMSO浓度为10％(v/v)。将溶液在室温下混合1-18小时，然后通过加入N-乙酰半胱氨酸(22.2-45.2微摩尔，222-452μl，以100mM)在室温下>30分钟淬灭缀合，无菌过滤，然后通过旋转过滤(PBS，然后是20mM组氨酸+240mM蔗糖pH 6.0)进行纯化，并使用15ml Amicon Ultracell 30KDa MWCO旋转过滤器进行浓缩，无菌过滤并进行分析。
结果
使用赛默飞世尔科技公司MAbPac 50mm x 2.1mm柱在岛津Prominence系统上进行UHPLC-RP分析，用水和乙腈进行梯度洗脱，在ADC的还原样品(SG3932特异性)上在214nm和330nm处显示未缀合的轻链(L0)的混合物、与SG3932的单个分子附接的轻链(L1)、未缀合的重链(H0)和与高达三个分子的SG3932附接的重链(H1、H2、H3)，其中主要种类是L1和H3，根据214nm色谱峰积分在下面的公式中计算，与每个抗体7.58-7.94个SG3932分子的药物/抗体比率(DAR)一致。游离NAC淬灭的有效负载<LOD/LOQ。AB1370049-SG3932 DAR8的代表性UHPLC-RP色谱图如图6A-6B所示，显示DAR为7.82。
使用东曹生命科学TSKgel SuperSW mAb HTP 4μm 4.6x 150mm柱(带有4μm 3.0x20mm保护柱)在岛津Prominence系统上进行UHPLC-SEC分析，用0.3ml/分钟的无菌过滤的SEC缓冲液(含200mM磷酸钾pH 6.95、250mM氯化钾和10％异丙醇(v/v))洗脱，在ADC样品上在280nm处显示单体纯度为98.5％-99.5％。AB1370049-SG3932 DAR8的代表性UHPLC-SEC色谱图如图6C所示。
在岛津Prominence系统上的UHPLC-HIC分析，使用Sepax Proteomix HIC Butyl-NP55μm无孔4.6x 35mm柱，在ADC的样品上用在25mM磷酸钠中的1.5M至0M硫酸铵和0至20％乙腈(pH7.40)梯度洗脱，在214nm处的示出了对应于DAR8物种的复杂的单峰，保留时间为2.98-3.11分钟。AB1370049-SG3932 DAR8的代表性UHPLC-SEC色谱图如图6D所示。
UV(Nanodrop，Thermo)得出最终ADC在5.0-6.0ml中的浓度为0.92-3.10mg/ml，获得的ADC质量为11.0-37.0mg(23％-74％产率)。
结论
先导抗体均适用于DAR8缀合，表现出高缀合效率DAR>7.5，纯化过程中无DAR损失，制造过程中无聚集/断裂，单体纯度>98％。因此，本发明的ADC通过与癌细胞上的FRα结合，能够将显著更高浓度的细胞毒素有效载荷递送到靶癌细胞。DAR8 ADC也是均质的，并提供重现性和制造过程中有限的批次间差异的优势。这将允许在保持耐受性的同时向靶标癌细胞递送更高数量的效力较低的药物(例如TOPOi)。
此外，生成的ADC相对较低的疏水性可能导致正常组织的非特异性摄取较少，因此与递送疏水性更强的药物(例如索星-米妥昔单抗或IMGN151)的比较ADC相比，可能会导致提高耐受性。
然后进一步评估示例性先导ADC的热稳定性和血清稳定性、小鼠体内PK以及体外和体内功效(参见下面的实例)。
实例11-DAR4形式的ADC生成
目标
为生成具有SG3932有效载荷的先导mAb的DAR4 ADC，用于先导选择的体外和体内活性评估和与DAR8 ADC比较。
材料和方法
将三(2-羧乙基)膦(TCEP，Pierce)在磷酸盐缓冲盐水pH 7.4(PBS，Gibco)中的5mM溶液加入(2.7-2.9摩尔当量/抗体，416-588纳摩尔，83.2-117.7μl)到抗体(AB1370049先导、AB1370026、AB1370035、AB1370083、AB1370095或AB1370117；每个23-30mg，153-200纳摩尔)在含有PBS和1mM乙二胺四乙酸(EDTA，Molekula)的还原缓冲液中的9.2-12ml溶液(最终抗体浓度为2.5mg/ml)中。使还原混合物在孵育的定轨振荡器中于+37℃下轻微(60rpm)摇动下加热3小时。在冷却至室温后，将SG3932作为DMSO溶液(7摩尔当量/抗体，2.91-4.12微摩尔，在1.02-1.33ml DMSO中)加入至该还原的抗体溶液(23-30mg，153-200纳摩尔)中，最终DMSO浓度为10％(v/v)。将溶液在室温下混合17小时，然后通过在室温加入N-乙酰基半胱氨酸(5.4-7.1微摩尔，在100mM下54-71μl)持续>30分钟淬灭缀合，然后使用通用医疗公司(GE Healthcare)HiLoadTM 26/600柱(填充有Superdex 200PG)在AKTATM Start FPLC上进行纯化，用2.6ml/min PBS洗脱。将对应于ADC单体峰的级分合并，使用15ml AmiconUltracell 30KDa MWCO旋转过滤器浓缩，进行无菌过滤并分析。
结果
使用赛默飞世尔科技公司MAbPac 50mm x 2.1mm柱在岛津Prominence系统上进行UHPLC-RP分析，用水和乙腈进行梯度洗脱，在ADC的还原样品(SG3932特异性)上在214nm和330nm处显示未缀合的轻链(L0)的混合物、与SG3932的单个分子附接的轻链(L1)、未缀合的重链(H0)和与高达三个分子的SG3932附接的重链(H1、H2、H3)，如实例10计算，与每个抗体4.13-4.27个分子的SG3932的药物/抗体比率(DAR)一致。游离NAC淬灭的有效负载<LOD。AB1370049-SG3932 DAR4的代表性UHPLC-RP色谱图如图7A-7B所示，显示DAR为4.24。
使用东曹生命科学TSKgel SuperSW mAb HTP 4μm 4.6x 150mm柱(带有4μm 3.0x20mm保护柱)在岛津Prominence系统上进行UHPLC-SEC分析，用0.3ml/分钟的无菌过滤的SEC缓冲液(含200mM磷酸钾pH 6.95、250mM氯化钾和10％异丙醇(v/v))洗脱，在ADC样品上在280nm处显示单体纯度为>99.5％。AB1370049-SG3932 DAR4的代表性UHPLC-SEC色谱图如图7C所示。
UHPLC-HIC分析在岛津Prominence系统，使用Sepax Proteomix HIC Butyl-NP55μm无孔4.6x 35mm柱，用1.5M至0M硫酸铵和在25mM磷酸钠中的0至20％乙腈(pH约7.40)梯度洗脱，在ADC样品上在214nm处示出对应于平均DAR约为4的DAR种类的混合物。AB1370049-SG3932 DAR4的代表性UHPLC-SEC色谱图如图7D所示。
UV(Stunner,Unchained Labs)分析得出最终ADC在5.0-6.0ml中的浓度为3.59-4.06mg/ml，获得的ADC质量为18.0-24.0mg(68％-79％产率)。
结论
先导抗体都适用于调整TCEP等价物以进行随机DAR4缀合，在纯化过程中没有DAR损失，在制造过程中没有聚集/分裂，>99％的单体纯度和高产量。
然后进一步评估示例性先导ADC的小鼠体内PK以及体内功效(参见下面的实例)。
实例12-示例性ADC的体外血清稳定性/去缀合
目标
确定AB1370049-SG3932 DAR8和其他先导DAR8 ADC针对一系列血清的稳定性。
材料和方法
人血清的IgG消除
将人血清(100ml)两次通过填充有MabSelect SuReTM LX蛋白A树脂(42ml，1CV)并在PBS中平衡的柱子，每次收集人血清。每次通过用柠檬酸盐缓冲液(100mM柠檬酸钠，pH3.0，210ml，5CV)洗涤来再生柱。
在血清中孵育ADC
将ADC(1.00mg/ml，根据需要用PBS稀释)掺入血清((小鼠(ab7486，abcam)、大鼠(C13SDZ，BioRad)、IgG消除的人(DHP-2001，Access Biologicals)和食蟹猴(定制订单，BioIVT)，ADC在血清中的20倍稀释)。将所得混合物(1.8ml)等分(200μl)到96孔板(SterileNuncTM)中。板用AeraSealTM薄膜密封，盖上微孔板盖(NuncTM)，并在5％CO2培养箱中于37℃下孵育。在不同的时间点(0、1、3和7天)取出样品等分样品，并在分析前将样品储存在-80℃下。
捕获树脂的制备
PureProteomeTM链霉亲和素磁珠(4.90ml)在PBS中洗涤(5次)并加入CaptureSelectTM人IgG-Fc PK生物素缀合物(750μl的1.0mg/ml溶液)。在上下混合(3小时，40rpm)之前，用PBS(60μl，pH 7.4)进一步稀释混合物。去除残留的CaptureSelect，在PBS中洗涤磁珠(5次)，用PBS补足至原始体积，并在后续使用前储存在2-8℃。
从血清中捕获ADC
解冻的血清样品(每个200μl)用PBS(每个样品7.2μl)稀释，并用PNGaseF(P0704L，NEB)(每个样品0.8μl)处理6小时。与此同时，在KingFisher Flex磁珠处理系统上，捕获树脂(每个样品50μl)依次用SN1缓冲液(1×TBS pH 7.4、0.05％TWEEN20、0.1％BSA，每个样品2×300μl)洗涤，使用PierceTM IgG洗脱缓冲液(每个样品100μl)，然后再次使用SN1缓冲液(每个样品3×300μl)。通过将样品与准备好的树脂等分试样一起孵育(15分钟)来执行ADC捕获。然后用PBS洗涤树脂(每个样品3×300μl)，通过在IgG洗脱缓冲液中孵育树脂(25min，每个样品50μl)洗脱ADC，并使用MultiScreenHTS HV过滤板过滤洗脱的ADC溶液(0.45μm，透明，未灭菌)。
使用还原混合物的反应混合物(1.0M磷酸钠pH 6.0、150mM硼酸钠pH 8.4、1.0MDTT和LC-MS级水，按15:20:6:10的比率混合)，还原样品(每个样品17μl)在37℃下持续15分钟。通过在50％v/v乙腈水溶液中加入2％甲酸(每个样品40μl)进行淬灭，提供了在LC-MS分析之前以最终状态制备的样品。
LC-MS分析
提交样品在LC-MS系统上进行分析，该系统由配备可变波长检测器(VWD)的UltiMate 3000HPLC堆栈组成，耦合到Exactive Plus EMR Orbitrap质谱仪(赛默飞世尔科技公司)。将样品(78μl)注入MAbPac RP柱(2.1×50mm，4μm，赛默飞世尔科技公司，088648)并按分段梯度分离(含0.03％三氟乙酸的乙腈水溶液，30秒内5％-25％，然后在2分钟内25％-60％)。在VWD和质谱仪(MS)的EMR Full MS模式下，在280nm检测分析物。MS调谐文件参数：鞘气流速：35，辅助气体流速：10，扫气流速：0，喷涂电压：3.5kV，毛细管温度：300℃，S镜头RF水平：200，辅助气体加热器温度：300。质谱方法参数：极性：阳性，源内CID：20.0eV，显微扫描：10，分辨率17500，AGC目标：3e6，最大IT：自动，扫描范围：1000-4000m/z。
质谱数据分析
使用Thermo BioPharma Finder对质谱进行解卷积。解卷积光谱中被认为具有化学显著性的峰提取了它们的百分比高度值，以便可以确定每个样品的DAR和显著化学修饰的百分比。随着时间的推移比较给定血清中给定ADC的DAR值，可以确定每个样品的去缀合百分比。
结果
所有ADC在所有血清中均显示出低程度的有效载荷去缀合(图8A)。这在一定程度上得益于所有ADC显示出显著水平的马来酰亚胺水解，至少在小鼠、大鼠和食蟹猴血清中是这样(图8B)。马来酰亚胺水解在化学上稳定了缀合的有效载荷，防止它们从ADC的抗体上去缀合。然而，在IgG消除的人血清中，马来酰亚胺水解的发生率较低。因此，此处由马来酰亚胺水解作用赋予的降低的保护作用，证明了这些ADC对去缀合的内在稳定性。
结论
所有ADC对所有血清均表现出良好的整体稳定性。
实例13-AB1370049-SG3932 DAR8的体内稳定性/去缀合
目标
在整个食蟹猴DRF研究时间范围内的体内条件下评估AB1370049-SG3932 DAR8抗体完整性和弹头去缀合。
材料和方法
雄性食蟹猴(N＝3)静脉内施用2次单次(间隔3周，即第1天和第22天)剂量的AB1370049-SG3932 DAR8。
通过静脉穿刺取血液样品，并离心以获得血浆。通过LBA-LCMS方法实施总抗体和ADC测定。AB1370049-SG3932 DAR8由与磁珠缀合的生物素化抗人抗体免疫捕获，将进一步经过多次洗涤步骤。然后进行胰蛋白酶消化，将一份上清液注入LCMS用于总抗体测定。使另一等分试样用木瓜蛋白酶进行进一步酶促裂解，并将该溶液用于ADC测定。使用反相色谱(RPLC)分离注入的样品，然后使用多反应监测(MRM)进行检测。分析物与内标的峰面积比用于根据通过在所需基质中加入ADC参考材料创建的标准曲线进行计算。
对于总抗体测定，使用AB1370049-SG3932 DAR8抗体上的两个特征性胰蛋白酶肽来计算所选基质中总抗体的浓度：重链(VVSVLTVLHQDWLNGK)和轻链(DSTYSLSSTLTLSK)。对于ADC测定，木瓜蛋白酶释放的弹头用于计算浓度。同位素标记的肽或弹头用作内标。
结果
ADC与总抗体的比率约为1，表明体内没有显著的弹头去缀合。
结论
在体内条件下，AB1370049-SG3932 DAR8 ADC保持稳定，没有观察到明显的降解。
实例14-在SCID小鼠中的示例性DAR8 ADC的药代动力学
目标
为了研究单次静脉内剂量施用后在野生型SCID小鼠中6种示例性抗FRαDAR8 ADC的药代动力学。
材料和方法
使野生型SCID小鼠(每组n＝3)静脉内(推注)给药示例性抗FRαADC(5mg/kg)。在给药后15分钟、4小时、1天、2天、3天、6天、10天、14天和21天取血液样品，离心以获得血浆并分析总ADC。使用Phoenix 64软件(Certara)确定药代动力学参数。
用免疫捕获LC-MS/MS测定，测量总ADC浓度。简而言之，将多克隆抗人抗体与磁珠缀合。然后将25μl血浆样品稀释在TBS中并与磁珠一起孵育。在捕获后，磁珠经过多次洗涤，然后用胰蛋白酶消化。在存在内标的情况下，用木瓜蛋白酶对等分的胰蛋白酶消化的上清液进行酶消化过夜。在通过LC-MS/MS分析之前，通过加入酸来淬灭消化的样品。
木瓜蛋白酶释放的弹头用于计算ADC的浓度。本实验中使用的内标是同位素标记的弹头。使用反相色谱(RPLC)分离来自免疫亲和富集样品的胰蛋白酶消化物，然后使用多反应监测(MRM)检测释放的弹头。分析物与内标的峰面积比用于根据通过在所需基质中加入ADC参考材料创建的标准曲线进行计算。
标准曲线和QC是通过将不同浓度的靶标化合物(ADC参考物质)加入到与样品基质相同的基质中来制备的。对于啮齿动物研究(FcRn和Tg32)，定量范围涵盖100ng/ml-12,000ng/ml，稀释QC覆盖高达50倍稀释。标准曲线拟合线性回归，权重为1/x2。
结果
表21显示了示例性抗FRαDAR8 ADC在小SCID鼠中的药代动力学参数。
表21：DAR8 ADC在SCID小鼠中的药代动力学参数
C最大＝最大观察血浆浓度
AUC最后一次＝血浆浓度与时间曲线(一直到最后一次可测量时间点)下的面积；
CL＝血浆清除率
Vss＝稳态分布容积
t1/2＝消除相半衰期
结论
示例性抗FRαADC在野生型SCID小鼠中展现出一系列药代动力学特性。所有示例性抗体的SCID小鼠药代动力学展现出在SCID小鼠中的低血浆清除率和长血浆半衰期。
实例15-由AB1370049和SG3932形成的DAR4和DAR8 ADC在hFcRnTg32小鼠中的药代 动力学
目标
研究单次静脉内剂量施用后由AB1370049和SG3932形成的DAR4和DAR8 ADC在hFcRn Tg32小鼠中的药代动力学。
材料和方法
向人FcRn Tg32小鼠(每组n＝3)静脉内(推注)给药由AB1370049和SG3932形成的DAR4和DAR8 ADC(5mg/kg)。在给药后15分钟、4小时、1天、2天、3天、6天、10天、14天和21天取血液样品，离心以获得血浆并分析总ADC。使用Phoenix 64软件(Certara)确定药代动力学参数。
用免疫捕获LC-MS/MS测定，测量AB1370049-SG3932 DAR4或AB1370049-SG3932DAR8浓度。简而言之，将多克隆抗人抗体与磁珠缀合。然后将25μl血浆样品稀释在TBS中并与磁珠一起孵育。在捕获后，磁珠经过多次洗涤，然后用胰蛋白酶消化。在存在内标的情况下，用木瓜蛋白酶对等分的胰蛋白酶消化的上清液进行酶消化过夜。在通过LC-MS/MS分析之前，通过加入酸来淬灭消化的样品。
木瓜蛋白酶释放的弹头用于计算DAR4或DAR8 ADC的浓度。本实验中使用的内标是同位素标记的弹头。使用反相色谱(RPLC)分离来自免疫亲和富集样品的胰蛋白酶消化物，然后使用多反应监测(MRM)检测释放的弹头。分析物与内标的峰面积比用于根据通过在所需基质中加入DAR4或DAR8 ADC参考材料创建的标准曲线进行计算。
标准曲线和QC是通过将不同浓度DAR4或DAR8 ADC(ADC参考物质)加入到与样品基质相同的基质中来制备的。定量范围涵盖100ng/ml-12,000ng/ml，稀释QC覆盖高达50倍稀释。标准曲线拟合线性回归，权重为1/x2。
结果
表22显示了在hFcRn Tg32小鼠中的DAR4或DAR8 ADC的药代动力学参数。
表22：DAR4或DAR8形式的AB1370049-SG3932在hFcRn Tg32小鼠中的药代动力学参数(平均ADC)
C最大＝最大观察血浆浓度
AUC最后一次＝血浆浓度与时间曲线(一直到最后一次可测量时间点)下的面积；
CL＝血浆清除率
Vss＝稳态分布容积
t1/2＝消除相半衰期
结论
AB1370049-SG3932 DAR8在hFcRn Tg32中展现出比在野生型SCID小鼠中略高的清除率和较低的半衰期。hFcRn Tg32小鼠是转基因小鼠模型，其中小鼠FcRn已经被敲除，并且人FcRn已经被敲入。因此，它代表了适合预测AB1370049-SG3932 DAR8的人体药代动力学的模型。基于hFcRn Tg32小鼠药代动力学，AB1370049-SG3932DAR8的人体清除率可能较低，半衰期将与其他临床使用的ADC相同，应该能够方便地给药。该数据与用本发明的示例性mAb获得的药代动力学数据一致。DAR4 ADC在hFcRn Tg32小鼠中展现出稍长的半衰期，这是由略低的血浆清除率驱动的。
实例16-示例性DAR8 ADC的体外细胞杀伤活性
目标
评估示例性抗FRαDAR8 ADC对表达不同水平FRα的癌细胞系的细胞毒活性。
材料和方法
具有不同水平FRα表达的癌细胞系获自ATCC(美国组织培养物保藏中心(AmericanTissue Culture collection))。KB细胞是带有HeLa污染物的宫颈癌细胞系，而IGROV-1是卵巢癌细胞系，而JEG-3是绒毛膜癌细胞系。将细胞一式两份接种到96孔板上。孵育24小时后，用范围为0-66.66nM(0-10μg/ml)的先导ADC或非靶向ADC对照NIP228处理细胞6天。在第6天，将细胞与CellTiter-Glo试剂一起孵育10min，并使用96孔板读数器测量发光。在没有细胞的培养基中测量背景发光并从实验值中减去。IC50值是在Graph Pad Prism上计算的。
结果
示例性ADC在具有不同FRα表达水平的多种癌细胞系中进行了测试：KB(高)、IGROV-1(高-中)和JEG-3(中)。如图9A-9C所示，所有示例性ADC在3种测试的FRα阳性细胞系中均具有细胞毒活性。ADC先导候选物在高FRα表达细胞系KB(IC50＝0.13至0.23μg/ml)和呈中等的JEG-3(IC50＝0.01-0.14μg/ml)中更有效。
结论
所有ADC在这些体外细胞杀伤测定中均显示出高效力，表明它们在治疗过表达FRα的癌症中的潜在功效。特别地，AB1370049-SG3932 DAR8在全部3种表达FRα的细胞系中具有最佳的细胞毒活性。
实例17-AB1370049-SG3932 DAR8的旁观者杀伤
目标
评估AB1370049-SG3932 DAR8在与FRα阳性和阴性KB细胞共培养实验中的旁观者活性。
材料和方法
为了评估AB1370049-SG3932 DAR8的旁观者活性，抗原阳性KB细胞(KB WT)和抗原阴性KB FRα敲除带有GFP标签的细胞(KB FRαk/o GFP)的混合物在存在AB1370049-SG3932DAR8的情况下孵育。培养6天后，使用胰蛋白酶收集剩余的细胞群并通过流式细胞术进行分析。识别、计数抗原阳性和抗原阴性的活细胞，并与未处理的样品进行比较。
结果
在表达FRα和FRα阴性KB细胞的1:1共培养实验中混合时，AB1370049-SG3932 DAR8显示出有效的旁观者杀伤活性(图10)。
结论
AB1370049-SG3932 DAR8不仅可以在同源表达FRα的肿瘤中诱导凋亡及最终的细胞死亡，而且可以在异质表达的肿瘤中诱导，如共培养实验所示，其中50％的细胞表达FRα，50％不表达。ADC在FRα阳性细胞中被内化，游离弹头被释放并杀死靶标癌细胞。游离弹头还可以扩散到邻近的不表达FRα的癌细胞中，也可以杀死它们。
实例18-示例性ADC在细胞来源的异种移植模型中的体内抗癌活性
目标
评估在人类癌症的一系列CDX模型(代表一系列靶标表达水平)中示例性ADC(尤其是AB1370049-SG3932 DAR8)的抗肿瘤活性。
材料和方法
对于KB异种移植模型，将6x 106个细胞/小鼠皮下接种到雌性CB17-SCID小鼠(Charles River Laboratories)中。当肿瘤达到接近150-200mm3时，将小鼠随机分组。6种先导DAR8 ADC中的每一种都以0.3125mg/kg、0.625mg/kg、1.25mg/kg、2.5mg/kg、5mg/kg和10mg/kg的单次剂量(第7天)静脉内施用和DAR4 ADC与具有相应剂量水平的同种型对照NIP228一起以0.625mg/kg、1.25mg/kg、2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg和20mg/kg施用。
对于Caco-2异种移植模型，将在50％Matrigel中的5x 106个细胞/小鼠皮下接种到雌性无胸腺裸鼠(Harlon Laboratories)中。当肿瘤达到约150mm3时，将小鼠随机分成组。AB1370049-SG3932 DAR8以1.25mg/kg、2.5mg/kg、5mg/kg的单剂量(第17天)静脉内施用，相应的同种型对照NIP228以1.25mg/kg、5mg/kg施用，和FRα-DM4ADC(“索星-米妥昔单抗的生物类似物”，具有DAR约为3)以1.25mg/kg、2.5mg/kg和5mg/kg施用，及相应的同种型对照NIP228以1.25mg/kg和5mg/kg施用。
对于IGROV-1异种移植模型，将在50％Matrigel中的1x 107个细胞/小鼠皮下接种到雌性严重联合免疫缺陷小鼠(SCID)小鼠(Envigo)中。当肿瘤达到约285mm3时(第32天)，基于肿瘤体积将小鼠随机分成组。对照动物接受100ul静脉内剂量的媒介物，而治疗动物接受一次静脉内剂量为1.25mg/kg、2.5mg/kg、5mg/kg的AB1370049-SG3932 DAR8，以4ml/kg给药，相应的同种型对照NIP228以1.25mg/kg、2.5mg/kg、5mg/kg，和FRα-DM4 ADC(“索星-米妥昔单抗的生物类似物”，具有DAR约为3)以5mg/kg，以及相应的同种型对照NIP228以5mg/kg。
对于OVCAR3异种移植模型，AB1370049-SG3932 DAR8以1.25mg/kg、2.5mg/kg、5mg/kg单一剂量施用，和FRα-DM4 ADC(“索星-米妥昔单抗生物类似物”，具有DAR约为3)以1.25mg/kg、2.5mg/kg和5mg/kg施用。
每周两次用卡尺测量肿瘤体积。
结果
对于所有测试的DAR 8ADC，在5mg/kg(KB和OVCAR-3)和1.25mg/kg(仅OVCAR-3)下观察到完全肿瘤消退(图11-12)。在具有中高度FRα表达的IGROV-1异种移植物中，AB1370049-SG3932DAR8在5mg/kg下具有活性，在肿瘤开始再生前的70天内部分肿瘤消退(图13)。选择先导ADC AB1370049-SG3932 DAR8是因为与其他先导候选物相比它具有更持久的应答，特别是在KB和OVCAR-3异种移植模型中。
先导DAR4 ADC也在KB模型中进行了测试(图14)。所有测试的ADC在5mg/kg时实现了完全肿瘤消退，表明DAR4 ADC也展现出良好的疗效。
AB1370049-SG3932 DAR8还在具有中低FRα表达的异种移植模型OVCAR-3和CaCo-2中针对FRα-DM4 ADC(索星-米妥昔单抗的生物类似物，具有DAR约为3)进行了测试(图15A-15B)。在这些模型中，AB1370049-SG3932 DAR8在较低剂量浓度(1.25和2.5mg/kg)下更有效，并且比FRα-DM4具有更持久的抗肿瘤活性。
结论
示例性先导ADC在各种不同的异种移植模型和不同剂量下均表现出强大的抗肿瘤活性。抗肿瘤活性与比较分子FRα-DM4相似或更好。
实例19-AB1370049-SG3932DAR8在Champions和内部的患者衍生异种移植模型中 的体内抗癌活性
目标
为了评估AB1370049-SG3932 DAR8在代表一系列靶标表达水平的人非小细胞肺癌、卵巢癌、结肠直肠癌和子宫内膜癌的低传代Champions PDX模型和内部PDX模型中的抗肿瘤活性。
材料和方法
Champions模型
选择了30个PDX模型(19个NSCLC模型、9个卵巢癌模型和2个子宫内膜癌模型)用于研究。将肿瘤组织碎片皮下植入6-8周龄雌性无胸腺裸Foxn1nu原种小鼠。当足够的原种动物达到1000–1500mm3时，收获肿瘤并将碎片植入研究前动物体内。当肿瘤达到150-300mm3的平均体积时，根据肿瘤体积将动物随机分为5组。第1组未接受治疗，第2组和第4组分别接受5mg/kg或2.5mg/kg的AB1370049-SG3932 DAR8。第3组和第5组分别接受5mg/kg或2.5mg/kg的同种型对照抗体NIP228-SG3932。所有给药动物在第0天静脉内接受一剂。
每天观察动物并且每周两次测量和记录肿瘤尺寸和体重。通过数字卡尺测量肿瘤体积，并使用以下公式计算肿瘤体积：肿瘤体积＝[长(mm)x宽(mm)2x 0.52，其中长和宽分别为肿瘤的最长和最短直径。
当对照组的平均肿瘤体积达到1200mm3，或者如果未达到最大肿瘤体积则最多60天，在所有模型中进行研究终点。如果1200mm3体积出现在第28天之前，则测量治疗组直至第28天。将动物随机分配到研究后，每个模型使用3只动物来收集肿瘤样品。收集大约400-600mm3的肿瘤，其中一半肿瘤处理用于免疫组织化学分析，另一半被处理用于基因组分析。
内部模型
使用不同的肿瘤模型(如卵巢癌、结肠癌、子宫内膜癌、非小细胞肺癌)，实施了内部体内患者衍生异种移植(PDX)疗效研究。使用套管针将这些PDX模型的肿瘤碎片皮下植入雌性NOD-SCID小鼠(Envigo)中。当肿瘤达到大约150-200mm3时，将小鼠随机分组。AB1370049-SG3932 DAR8以2.5mg/kg、5mg/kg的单一剂量与相应剂量水平的同种型对照NIP228静脉内施用。每周两次用卡尺测量肿瘤体积。使用公式1/2 x L x W2(L＝长度；W＝宽度)计算肿瘤生长。每周测量两次体重以评估治疗的耐受性。
抗肿瘤应答的确定
从初始肿瘤体积(ITV)到最终肿瘤体积(FTV)的应答是在导致自初始肿瘤体积开始减少最多的时间计算的。使用以下公式计算每只荷瘤小鼠的抗肿瘤应答：
肿瘤生长(％)＝[(FTV-ITV)/ITV]x 100
计算研究组中每只动物的肿瘤生长(％)，并将组应答计算为所有治疗小鼠的中值应答。
对于每个治疗组，确定对测试药剂是否有应答。应答标准基于RECIST 1.1，其中应答基于肿瘤体积从基线肿瘤测量值减少30％。
结果
表23和图16A总结了在51个PDX模型中单次施用5.0mg/kg AB1370049-SG3932DAR8或NIP228-SG3932导致的中位肿瘤生长百分比。在单剂量的5.0mg/kg AB1370049-SG3932 DAR8后观察到肿瘤生长抑制，其中54％的模型(54个中的29个)展现出肿瘤体积从基线减小30％或更多。在22％(49个中的11个)测试的模型中达到30％或更高，单一剂量5.0mg/kg NIP228-SG3932导致肿瘤体积自基线减少。在测试的卵巢癌PDX模型中，在78.3％(23个中的18个，95％CI 58％-91％)测试的模型中，5.0mg/kg AB1370049-SG3932 DAR8导致肿瘤体积自基线减少30％或更高。在43.5％(23个中的10个，95％CI 26％-63％)测试的模型中，5.0mg/kg NIP228-SG3932导致肿瘤体积自基线减少30％或更高。
表23：54个模型(30个Champions模型和24个内部模型)中的对AB1370049-SG3932DAR8(5.0mg/kg)的体内抗肿瘤应答的评估结果
表24和图16B总结了在39个PDX模型中单次施用2.5mg/kg AB1370049-SG3932DAR8或NIP228-SG3932导致的中位肿瘤生长百分比。在49％的测试PDX模型(39个中的19个)中，单次静脉注射2.5mg/kg AB1370049-SG3932 DAR8后观察到特异性肿瘤生长抑制，而51％的模型没有应答(39个中的20个)。37个测试模型中只有两个模型对相同剂量的非靶向ADC NIP228-SG3932 DAR8有应答。非靶向ADC的活性是剂量依赖性的，因为较少的模型在较低的剂量浓度下对NIP228-SG3932 DAR8(5％)有应答。
表24：39个模型(10个内部模型)中的对AB1370049-SG3932 DAR8(2.5mg/kg)的体内抗肿瘤应答的评估结果
AB1370049-SG3932 DAR8已在卵巢癌、NSCLC、CRC和子宫内膜癌4种适应症的多种模型中表现出抗肿瘤应答。图17A-17C显示了来自模型CTG-0711(卵巢癌)、CTG-2367(NSCLC)和CTG-2268(子宫内膜)的代表性研究。
卵巢癌的客观缓解率为80％，NSCLC为30％，CRC为20％，子宫内膜癌为50％。AB1370049-SG3932 DAR8的FRα表达与活性呈正相关。
结论
AB1370049-SG3932 DAR8在高、中、中低表达水平的FRα表达肿瘤中非常有效。通常，AB1370049-SG3932 DAR8的抗肿瘤活性与FRα表达水平呈正相关。
实例20-使用示例性ADC的体外安全性研究
目标
AB1370049-SG3932 DAR8的体外安全性使用原代造血干细胞和祖细胞(HSPC)分化为红系、髓系和巨核细胞进行了评估。
材料和方法
将冷冻保存的人骨髓CD34+祖细胞(龙沙(Lonza)公司)解冻，并在含有25ng/mlSCF、50ng/ml TPO和50ng/ml Flt3-L人重组蛋白(均为派普泰克(Peprotech)公司)的维持培养基(StemSpan SFEMII(干细胞技术公司))中于37℃、含5％CO2的湿润培养箱中过夜。第二天，在药物的存在下，将细胞重悬于能够支持红系细胞分化(Preferred Cell Systems[优选细胞系统]，SEC-BFU1-40H)、髓系细胞分化(Preferred Cell Systems[优选细胞系统]，SEC-GM1-40H)或巨核细胞分化(Stem Cell Technologies[干细胞技术]，09707)的Cell Expand培养基中，红系细胞和髓系细胞的浓度为5000个细胞/ml，或巨核细胞的浓度为15000个细胞/ml。
将细胞(100μl)一式三份接种到白壁、透明底部的96孔组织培养板(Corning)中，其中加入了示例性ADC(例如，AB1370049-SG3932DAR8)或NIP228同种型对照ADC(200、66.66、22.22、7.4、2.47、0.82、0.27、0.091、0.03和0μg/ml)，并在37℃、5％CO2的加湿培养箱中培养5天。
此外，评估了示例性ADC对扩增和分化细胞的影响。为此，将细胞以5000个细胞/ml的浓度接种到红系细胞分化中5天，然后一式三份接种到白壁、透明底部的96孔组织培养板中5天，其中加入示例性ADC(例如AB1370049-SG3932 DAR8)、非靶向FRα的NIP228对照ADC或未缀合的mAb(分别为NIP228和AB1370049)，在以下浓度200、66.66、22.22、7.4、2.47、0.82、0.27、0.091、0.03和0μg/ml下在37℃、5％CO2的加湿培养箱中培养5天。对于骨髓细胞分化或巨核细胞分化，细胞分别以10000个细胞/ml和15000个细胞/ml接种5天，然后在分别以10000个细胞/ml和30000个细胞/ml离心并接种到新鲜培养基中再培养5天，然后在存在AB1370049-SG3932 DAR8(200、66.66、22.22、7.4、2.47、0.82、0.27、0.091、0.03和0μg/ml)的情况下以20000个细胞/ml和30000个细胞/ml接种在骨髓分化培养基或巨核细胞中4天。
使用来自Promega(普洛麦格公司)的CellTiter-Glo 2.0(使用10μl/孔的优化体积)测定活力，其中使用Envision板读取器(珀金埃尔默(Perkin Elmer)公司)检测发光。在GraphPad软件(Prism)中将相对发光信号相对于对照百分比归一化，其中对照等于100，并且最大细胞死亡等于0。
结果
2D体外培养系统用于测量原代人CD34+造血干细胞和祖细胞(HSPC)的毒性。在一种或多种化合物存在的情况下，HSPC沿着红细胞、巨核细胞和骨髓(粒细胞/单核细胞)谱系增殖和分化。使用ATP量化作为细胞活力的替代指标来确定抑制作用。使用该方法，评估了AB1370049-SG3932 DAR8及其相关的非靶向FRα的ADC对照诱导的毒性，以评估AB1370049-SG3932 DAR8的任何加剧毒性。
AB1370049-SG3932 DAR8展现与携带相同有效载荷的非靶向FRα的ADC分子相似的毒性水平(图18A-18F)。这一观察见于分化为任何谱系的原代CD34+骨髓细胞，无论它们的分化水平如何。当与相同的TOPOi有效负载缀合时，用本发明的其他示例性ADC(包括mAbAB1370095、AB1370026和AB1370117)观察到类似的结果。当在与AB1370049-SG3932 DAR8所述相似的培养条件下给药时，未缀合的mAb(AB1370049)没有诱导HSPC中ATP水平的任何显著降低。此外，通过与相同的TOPOi有效载荷(在DAR4)缀合的AB1370049处理的HSPC，显示出与用非靶向FRα的ADC DAR4处理的HSPC相当的毒性水平。
结论
结果表明，与非靶向FRα的ADC分子相比，没有靶向介导的毒性，也没有由先导抗体驱动的毒性加剧。
实例21-使用AB1370049和AB1370049-SG3932 DAR8的体内药代动力学研究
目标
在食蟹猴中进行了AB1370049-SG3932 DAR8的血浆药代动力学(PK)分析，包括峰值和总暴露量、清除率和半衰期。针对先导ADC候选物和未缀合抗体，从不同剂量水平的食蟹猴收集PK样品。进行非房室分析以估计PK参数。
材料和方法
AB1370049和AB1370049-SG3932DAR8对食蟹猴的施用
雄性食蟹猴(N＝3)被静脉内施用2次单次(间隔3周，即第1天和第22天)剂量的以15mg/kg的AB1370049或以15和25mg/kg的AB1370049-SG3932 DAR8。
在给药前、第1天和第22天给药后0.04、0.25、1、3、7、14和21天通过静脉穿刺取血液样品，离心获得血浆并分析总抗体、总ADC和未缀合弹头。使用Phoenix 64软件(Certara)确定药代动力学参数。
总抗体和ADC测定
总ADC和总抗体浓度用免疫捕获LC-MS/MS测定进行测量。简而言之，将多克隆抗人抗体与磁珠缀合。然后将40μl血浆样品稀释在TBS中并与磁珠一起孵育。在捕获后，磁珠经过多次洗涤，然后在内标存在下用胰蛋白酶消化。加入酸淬灭消化。然后将胰蛋白酶消化的液体内容物的等分试样转移到注射板，用于总Ab分析。
对于ADC测定，在存在内标的情况下，用木瓜蛋白酶对等分的胰蛋白酶消化的上清液进行酶消化过夜。在通过LC-MS/MS分析之前，通过加入酸来淬灭消化的样品。木瓜蛋白酶释放的弹头用于计算浓度。本实验中使用的内标是同位素标记的弹头。使用反相色谱(RPLC)分离来自免疫亲和富集样品的胰蛋白酶消化物，然后使用多反应监测(MRM)检测释放的弹头。分析物与内标的峰面积比用于根据通过在所需基质中加入ADC参考材料创建的标准曲线进行计算。
用于总Ab测定，人抗体Fc区上的标志性胰蛋白酶肽(VVSVLTVLHQDWLNGK)用于计算所选基质中总抗体的浓度。使用反相色谱(RPLC)分离来自免疫亲和富集样品的胰蛋白酶消化物，然后使用多反应监测(MRM)检测特征肽。本实验中使用的内标是同位素标记的肽。分析物与内标的峰面积比用于根据通过在所需基质中加入ADC参考材料创建的标准曲线进行计算。
标准曲线和QC是通过将不同浓度的靶标化合物(ADC参考物质)加入到与样品基质相同的基质中来制备的。对于NHP研究，定量范围为100-15000ng/ml，稀释倍数高达100倍。标准曲线符合线性回归，加权为1/x2，除LLOQ(25％)外，所有水平的测定准确度和精确度均在20％以内。
未缀合的弹头测定
未缀合的弹头测定通过沉淀程序进行。本实验中使用的内标是同位素标记的弹头。使用含有高百分比有机溶剂并掺入内标的缓冲液沉淀样品。然后将上清液在氮气下干燥，然后再配制到用于注射到LCMS的适当缓冲液中。然后使用反相色谱(RPLC)分离样品，然后使用多反应监测(MRM)进行检测。分析物与内标的峰面积比用于根据通过在所需基质中加入ADC参考材料创建的标准曲线进行计算。
标准曲线和QC是通过将以不同浓度的未缀合弹头加入到与样品基质相同的基质中来制备的。对于NHP研究，测定的定量范围为0.059-29.5ng/ml。标准曲线拟合线性回归。除在LLOQ(20％)外，所有水平的测定准确度和精密度均在15％以内。
结果
基于非房室分析(NCA)的平均PK参数总结于表25中。未缀合的mAb(AB1370049)在食蟹猴中以15mg/kg展现出线性PK，其半衰期和清除率与猴子中人IgG的文献一致。ADC(AB1370049-SG3932 DAR8)在食蟹猴中以15mg/kg和25mg/kg展示出线性PK，具有与剂量成比例的暴露(Cmax和AUC)，观察到可比较的CL和t1/2。与剂量匹配的ADC相比，未缀合抗体的暴露量更高；其中相比ADC清除速度更慢，半衰期更长，这可能是因为加入了八个细胞毒性弹头。然而，ADC的PK完全在食蟹猴ADC的可接受标准内。
表25：单次施用后猴子中未缀合mAb和缀合mAb的平均NCA PK参数
在第一次和第二次剂量之间没有看到显著的ADC积累，并且在第二次剂量之后暴露没有下降，表明没有形成显著的中和抗药物抗体(图19)。从第0天到第42天，对于AB1370049-SG3932 DAR8(25mg/kg)样品测量的总抗体和总ADC水平与未缀合的mAb(15mg/kg)样品的水平相似。对于AB1370049-SG3932 DAR8(15mg/kg)样品测量的总抗体和总ADC水平相对较低。总之，组内的总抗体和总ADC相似，因此在整个时间过程中看到的游离弹头最少——所有这些都表明有限的去缀合和高体内稳定性。
结论
DAR8 ADC(AB1370049-SG3932 DAR8)被推进到猴子的剂量范围发现研究中，其中看到剂量依赖性暴露具有持续较长的半衰期和缓慢的清除，如先前在小鼠PK研究中所示。
特别地，AB1370049-SG3932 DAR8比本领域最先进的FRαADC表现出更长的半衰期和更慢的清除率(Olga等人Cancer Res[癌症研究]2020年8月15日(80)(增刊16)2890；DOI:10.1158/1538-7445.AM2020-2890；WO 2020223221A1)。本发明中描述的ADC的毒性特征可以导致更耐受的治疗和潜在的临床优势。
实例22-AB1370049-SG3932 DAR8在患者来源的异种移植模型(OVO857_CIS和 CTG3226)中的体内抗癌活性
目标
为了评估AB1370049-SG3932 DAR8与抗FRα-DM4 ADC在具有中等和中低FRα表达的卵巢PDX模型中的抗肿瘤活性。
材料和方法
使用2种不同的卵巢PDX模型OVO857_CIS(“OVO0875”)和CTG3226实施了内部体内患者衍生异种移植物(PDX)疗效研究。将6-8周龄雌性NSG(NOD-SCID IL2Rγ空)作为原种小鼠皮下植入肿瘤组织碎片。当足够的原种动物达到1000–1500mm3时，收获肿瘤并将碎片植入研究动物体内。当肿瘤达到接近约150-250mm3时，将小鼠随机分配到不同组(每组n＝3只小鼠)。一组没有接受任何治疗。四组分别静脉内施用10、5、2.5和1.25mg/kg AB1370049-SG3932DAR8。两组分别静脉内施用5和2.5mg/kg FRα-DM4 ADC(“索星-米妥昔单抗的生物类似药”，DAR约为3)。在OVO857_CIS模型的第39天和CTG3226 PDX模型的第46天，所有给药动物以10ml/kg的单剂量静脉内接受药物。
通过数显卡尺测量肿瘤体积且使用以下公式计算肿瘤体积：肿瘤体积＝长(mm)x宽(mm)2x 0.52，其中长和宽分别为肿瘤的最长和最短直径。每周测量两次体重以评估治疗的耐受性。
每个实验组中肿瘤的生长表示为所用动物数量的平均肿瘤体积(mm3)±SEM。
通过将每个治疗组与未治疗的对照组进行比较来计算肿瘤生长抑制(TGI)。使用以下公式从组平均值计算抑制百分比：
TGI(％)＝(C-T)/C x 100。
其中C是未治疗对照组的平均肿瘤体积，T是治疗组的平均肿瘤体积。
FRα表达的肿瘤样品的免疫组织化学染色
用于免疫组织化学(IHC)的抗兔FRα单克隆抗体(克隆[EPR20277])购自Abcam(目录号ab221543)，并在抗体稀释剂中用背景还原剂(安捷伦，目录号S3022)稀释。IHC在Ventana Discovery Ultra仪器(Roche Diagnostics，Indianapolis，IN，USA)上进行。将福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织切片切成4μm，置于显微镜载玻片上，并加载到自动染色机上。使用Ultra Cell Conditioning1(Roche Diagnostic，目录号05424569001)对载玻片进行抗原修复，并用抑制剂CM(Roche Diagnostics，目录号05266645001)封闭。然后，将切片与一抗孵育，用DISCOVERY抑制剂(Roche，目录号07017944001)阻断HRP，并用抗兔IgGHRP二抗(Roche Diagnostics，目录号05269717001)孵育样品。使用DISCOVERY ChromoMap DAB试剂盒(Roche Diagnostics，目录号05266645001)通过棕色3,3'二氨基联苯胺(DAB)使染色可视化。切片用苏木精II(Roche Diagnostics，目录号05277965001)和发蓝试剂(Roche Diagnostics，目录号05266769001)复染。最后，将切片在分级乙醇中脱水，在二甲苯中清除，并盖玻片。
FRα染色由病理学家评估、量化和分类在以下范围内：无染色(0+)、低(1+)、中(2+)或高(3+)。
肿瘤样品上FRα表达的数字量化
来自FRαIHC测定的数字图像经过分析、计算量化并由病理学家验证，以确认可分析肿瘤区域(ATA)的正确识别，该区域应至少包含组织样品中存在的侵袭性肿瘤的80％。计算细胞的膜光密度(OD)值，例如总体平均值和中值(即第50个分位数)OD值。膜OD值范围从0至255。对于每个模型，靶标表达表示为从独立的、未治疗的研究小鼠收集的三种肿瘤的中值膜OD。
结果
根据2+的IHC评分和41的中值OD，OVO875肿瘤被归类为中等FRα表达者。
根据1+至2+的IHC评分和28的中值OD，CTG3226肿瘤被归类为中低等FRα表达者。
两种卵巢癌PDX模型OVO875(中等FRα表达)和CTG3226(中低等FRα表达)被施用单次静脉注射剂量的AB1370049-SG3932DAR8(10、5、2.5或1.25mg/kg)或FRα-DM4(5或2.5mg/kg)。在68天内监测肿瘤体积和体重。
在用10、5和2.5mg/kg(TGI％分别为98.5、96.4、94.5)的AB1370049-SG3932 DAR8治疗后，观察到OVO857的几乎完全抑制肿瘤，而在1.25mg/kg(67的TGI％)时看到部分应答。形成鲜明对比的是，FRα-DM4的效果显著降低，TGI在5mg/kg时为24％，在2.5mg/kg时为2％(表26和图20)。
表26：OVO875卵巢癌PDX模型中的肿瘤生长抑制(TGI％)
ap值<0.05表示平均肿瘤体积中的显著差异。
对于模型CTG3226，AB1370049-SG3932 DAR8在剂量水平为10、5和2.5mg/kg(TGI％分别为97.7、96.8、93.6)时实现了接近完全的应答，而在1.25mg/kg(TGI％为74％)仅看见部分应答。FRα-DM4在5mg/kg时有活性，TGI％的部分反应为76.5，但在较低剂量2.5mg/kg时没有活性(表27和图21)。
表27：CTG3226卵巢癌PDX模型中的肿瘤生长抑制(TGI％)
ap值<0.05表示平均肿瘤体积中的显著差异。
在第二组实验中，使用相同的OVO875和CTG3226 PDX模型并遵循与本实例中上述相同的方法，同时使用0.15mg/kg、0.3mg/kg和0.6mg/kg AB1370049-SG3932 DAR8分别治疗其他小鼠组，即使在非常低的剂量下也观察到部分应答。例如，在OVO875模型中，10、5和2.5mg/kg AB1370049-SG3932 DAR8导致几乎完全应答，TGI％分别为98.5、96.4和94.52。在低至0.3mg/kg(TGI为41％)的剂量下看到部分但实质性的应答，0.6mg/kg具有与0.3mg/kg剂量和1.25mg/kg剂量(引起的TGI为67％)相似的应答水平。在CTG3226 PDX模型中，观察到跨剂量范围的类似TGI幅度的类似观察。
结论
来自这些额外的卵巢癌PDX模型的数据进一步表明，AB1370049-SG3932 DAR8在治疗表达FRα的肿瘤方面非常有效，并且即使对于以中等和中低表达水平表达FRα的癌症也能实现接近完全的肿瘤生长抑制。在一系列AB1370049-SG3932 DAR8剂量中证明了显著的TGI。此外，AB1370049-SG3932 DAR8在这些模型中的功效实质上优于FRα-DM4比较ADC。
实例23-AB1370049-SG3932 DAR8在患者来源的异种移植模型CTG-0956中的体内 抗癌活性
目标
为了评估AB1370049-SG3932 DAR8在展现中高FRα表达水平的卵巢PDX模型CTG-0956中的抗肿瘤活性。
材料和方法
将肿瘤组织碎片皮下植入6-8周龄雌性无胸腺裸Foxn1nu原种小鼠。当足够的原种动物达到1000–1500mm3时，收获肿瘤并将碎片植入研究前动物体内。当肿瘤达到213-325mm3的平均体积时，根据肿瘤体积将动物随机分为8组。第1组(n＝8只动物)未接受治疗，第2组至第8组(n＝3只动物)分别接受10mg/kg、5mg/kg、2.5mg/kg、1.25mg/kg、0.6mg/kg、0.3为mg/kg和0.15mg/kg的AB1370049-SG3932 DAR8。所有给药动物在第0天以4ml/kg静脉内接受一剂。每天观察动物并且每周两次测量和记录肿瘤尺寸和体重。如实例22中所述测量和计算肿瘤体积和TGI。研究终点在第49天进行，当时对照组的平均肿瘤体积达到1200mm3。
如实例22中所述进行CTG-0956肿瘤细胞上FRα表达的数字量化。
结果
根据143中值OD，CTG-0956肿瘤被归类为中高FRα表达者。
荷瘤无胸腺裸鼠用单次iv剂量(剂量范围0.15mg/kg、0.3mg/kg、0.6mg/kg、1.25mg/kg、2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg)的ADC处理。在第45天，计算不同剂量水平组的肿瘤生长抑制：在10mg/kg(TGI％96.6)和5mg/kg(95.6％)的剂量水平下看到几乎完全的应答，在范围从69.5％到23.7％TGI的所有其他剂量水平下看到部分应答(图22和表28)。
表28：CTG-0956卵巢癌PDX模型中的肿瘤生长抑制(TGI％)
结论
来自该额外的卵巢癌PDX模型的数据进一步表明，AB1370049-SG3932 DAR8在治疗表达FRα的肿瘤时非常有效，并且在较高剂量下实现了近乎完全的肿瘤生长抑制，在AB1370049-SG3932 DAR8剂量的整个范围内都表明了显著的TGI。
实例24-在激发和观察到对FRα-DM4 ADC的抗性后AB1370049-SG3932 DAR8在CDX 模型中的功效
目标
为了评估AB1370049-SG3932 DAR8在FRα-DM4抗性OVCAR-3细胞系模型中的抗肿瘤活性。
材料和方法
为了开发OVCAR3异种移植模型，将10x 106个细胞/小鼠在50％基质胶中皮下接种到雌性6-8周龄雌性NSG(NOD-SCID IL2Rγ空)中。当肿瘤体积达到200-600mm3范围内时，每2周一次(Q2W)给小鼠静脉内给药5mg/kg的FRα-DM4 ADC(“索星-米妥昔单抗的生物类似物”，DAR约为3)，持续不断，直到肿瘤复发并尺寸开始再次变大。在8轮Q2W给药后复发的小鼠中，选择4只小鼠并以5mg/kg Q2W静脉内用再次激发AB1370049-SG3932 DAR8，接受2轮AB1370049-SG3932 DAR8治疗。
另外，从另一只小鼠身上切除复发的肿瘤并皮下重新植入雌性6-8周龄NSG(NOD-SCID IL2Rγ空)小鼠体内。当肿瘤达到280-360mm3的平均体积时，随后以5mg/kg的AB1370049-SG3932 DAR8或FRα-DM4 ADC(“索星-米妥昔单抗的生物类似物”，DAR约为3)Q2W静脉内治疗小鼠，接受2轮相应的治疗。
通过数显卡尺测量肿瘤体积且使用以下公式计算肿瘤体积：肿瘤体积＝长(mm)x宽(mm)2x 0.52，其中长和宽分别为肿瘤的最长和最短直径。每周测量两次体重以评估治疗的耐受性。
每个实验组中肿瘤的生长表示为所用动物数量的平均肿瘤体积(mm3)±SEM。
结果
OVCAR-3荷瘤小鼠最初用FRα-DM4 Q2W治疗。在对ADC的初步应答后，一些小鼠逃脱了治疗并重新长出肿瘤。这些肿瘤随后用AB1370049-SG3932 DAR8再次激发，并且在所有处理的小鼠中观察到肿瘤生长抑制，4只小鼠中有3只几乎完全应答(图23)。这表明FRα-DM4抗性不是由FRα下调引起的。
在后续实验中，从小鼠体内分离出FRα-DM4抗性肿瘤，并将其重新植入新的宿主小鼠体内。在肿瘤达到280-360mm3的平均大小后，小鼠被施用两次剂量(Q2W)的5mg/kgAB1370049-SG3932 DAR8或FRα-DM4。只有用AB1370049-SG3932 DAR8治疗的小鼠对治疗有接近完全的应答(TGI％92.3)，而FRα-DM4治疗的动物仍然对治疗有抵抗力(图24)。
结论
这些结果证明了，AB1370049-SG3932 DAR8在肿瘤(包括那些显示出对FRα-DM4比较ADC产生耐药性的肿瘤)中实现近乎完全的肿瘤生长抑制的能力。

Claims (37)

1.一种抗FRα抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含：
(a)SEQ ID NO:1的重链CDR1(SDSATWN)、SEQ ID NO:2的重链CDR2(RTYYRSKWYNDYAVSVKS)、SEQ ID NO:3的重链CDR3(GVGSFDY)、SEQ ID NO:4的轻链CDR1(RASQSISSWLA)、SEQ ID NO:5的轻链CDR2(KASGLES)、以及SEQ ID NO:6的轻链CDR3(QQYNSYSQLT)；
(b)SEQ ID NO:7的重链CDR1(SYAMS)、SEQ ID NO:8的重链CDR2(SISSGRSYIYYADSVKG)、SEQ ID NO:9的重链CDR3(EMQQLALDY)、SEQ ID NO:10的轻链CDR1(RASQGISNFLA)、SEQ IDNO:11的轻链CDR2(AASSLQS)、以及SEQ ID NO:12的轻链CDR3(QQYNSYPFT)；
(c)SEQ ID NO:13的重链CDR1(SNSAAWN)、SEQ ID NO:14的重链CDR2(RTYYRSNWYNDYTLSVKS)、SEQ ID NO:15的重链CDR3(GVGRFDS)、SEQ ID NO:16的轻链CDR1(RASQSISSWLA)、SEQ ID NO:17的轻链CDR2(KASSLES)、以及SEQ ID NO:18的轻链CDR3(QEYKTYSIFT)；
(d)SEQ ID NO:19的重链CDR1(SYNMN)、SEQ ID NO:20的重链CDR2(SISSGSSYIYYADSMKG)、SEQ ID NO:21的重链CDR3(GMTTLTFDY)、SEQ ID NO:22的轻链CDR1(RASQGISTFLA)、SEQ ID NO:23的轻链CDR2(AASSLQS)、以及SEQ ID NO:24的轻链CDR3(QQYISYPLT)；
(e)SEQ ID NO:25的重链CDR1(SYSMN)、SEQ ID NO:26的重链CDR2(SISSRSSYVYYADSVKG)、SEQ ID NO:27的重链CDR3(GMTTLTFDY)、SEQ ID NO:28的轻链CDR1(RASQGISSFLA)、SEQ ID NO:29的轻链CDR2(AASSLQS)、以及SEQ ID NO:30的轻链CDR3(QQYNSYPLT)；或
(f)SEQ ID NO:31的重链CDR1(SDSATWN)、SEQ ID NO:32的重链CDR2(RTYYRSKWYSDYAVSVKS)、SEQ ID NO:33的重链CDR3(GGAPFDY)、SEQ ID NO:34的轻链CDR1(RASQSISSWLA)、SEQ ID NO:35的轻链CDR2(KASSLES)、以及SEQ ID NO:36的轻链CDR3(QQYNSYSMYT)。
2.根据权利要求1所述的抗FRα抗体或其抗原结合片段，其中该抗FRα抗体或其抗原结合片段包含：
(a)包含与SEQ ID NO:37的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列的VH和包含与SEQID NO:38的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列的VL；
(b)包含与SEQ ID NO:39的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列的VH和包含与SEQID NO:40的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列的VL；
(c)包含与SEQ ID NO:41的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列的VH和包含与SEQID NO:42的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列的VL；
(d)包含与SEQ ID NO:43的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列的VH和包含与SEQID NO:44的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列的VL；
(e)包含与SEQ ID NO:45的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列的VH和包含与SEQID NO:46的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列的VL；或
(f)包含与SEQ ID NO:47的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列的VH和包含与SEQID NO:48的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列的VL。
3.根据权利要求2所述的抗FRα抗体或其抗原结合片段，其中该抗FRα抗体或其抗原结合片段包含：
(a)在该VH的N末端(例如位置1)的L；
(b)在该VH的N末端(例如位置1)的E；或
(c)在该VH的N末端(例如位置1)的Q。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的抗FRα抗体或其抗原结合片段，其中该抗FRα抗体或其抗原结合片段包含：
(a)SEQ ID NO:37的VH和SEQ ID NO:38的VL；
(b)SEQ ID NO:39的VH和SEQ ID NO:40的VL；
(c)SEQ ID NO:41的VH和SEQ ID NO:42的VL；
(d)SEQ ID NO:43的VH和SEQ ID NO:44的VL；
(e)SEQ ID NO:45的VH和SEQ ID NO:46的VL；或
(f)SEQ ID NO:47的VH和SEQ ID NO:48的VL。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的抗FRα抗体或其抗原结合片段，其中该抗FRα抗体包含：包含与SEQ ID NO:109或111的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列的恒定重链和包含与SEQ ID NO:110的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列的恒定轻链。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的抗FRα抗体或其抗原结合片段，其中该抗FRα抗体包含：SEQ ID NO:109或111的恒定重链氨基酸序列和SEQ ID NO:110的恒定轻链氨基酸序列。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的抗FRα抗体，其中该抗FRα抗体包含：
(a)包含与SEQ ID NO:49的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列的重链和包含与SEQ ID NO:50的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列的轻链；
(b)包含与SEQ ID NO:51的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列的重链和包含与SEQ ID NO:52的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列的轻链；
(c)包含与SEQ ID NO:53的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列的重链和包含与SEQ ID NO:54的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列的轻链；
(d)包含与SEQ ID NO:55的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列的重链和包含与SEQ ID NO:56的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列的轻链；
(e)包含与SEQ ID NO:57的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列的重链和包含与SEQ ID NO:58的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列的轻链；或
(f)包含与SEQ ID NO:59的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列的重链和包含与SEQ ID NO:60的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列的轻链。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的抗FRα抗体，其中该抗FRα抗体包含：
(a)SEQ ID NO:49的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:50的轻链氨基酸序列；
(b)SEQ ID NO:51的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:52的轻链氨基酸序列；
(c)SEQ ID NO:53的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:54的轻链氨基酸序列；
(d)SEQ ID NO:55的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:56的轻链氨基酸序列；
(e)SEQ ID NO:57的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:58的轻链氨基酸序列；或
(f)SEQ ID NO:59的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:60的轻链氨基酸序列。
9.根据权利要求1-6中任一项所述的抗原结合片段，其中该抗原结合片段是Fab片段、Fab'片段或F(ab’)2片段。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的抗FRα抗体或其抗原结合片段，其中该抗FRα抗体或其抗原结合片段是人源化的、嵌合的或全人源的，优选地其中该抗FRα抗体或其抗原结合片段是全人源的。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的抗FRα抗体或其抗原结合片段，其中该抗FRα抗体或其抗原结合片段是单克隆的、多克隆的、重组的或多特异性的。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的抗FRα抗体或其抗原结合片段，其中该抗FRα抗体或其抗原结合片段为IgG1型、IgG2型、IgG3型或IgG4型，优选为IgG1型。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的抗FRα抗体或其抗原结合片段，其中该抗FRα抗体或其抗原结合片段与一种或多种异源药剂缀合。
14.根据权利要求13所述的抗FRα抗体或其抗原结合片段，其中该一种或多种异源药剂选自由以下组成的组：细胞毒素、抗微生物剂、治疗剂、前药、肽、蛋白质、酶、脂质、生物应答调节剂、药学药剂、淋巴因子、异源抗体、异源抗体的片段、可检测标记、聚乙二醇(PEG)、放射性同位素、或其组合。
15.根据权利要求14所述的抗FRα抗体或其抗原结合片段，其中该异源药剂是细胞毒素。
16.一种抗体药物缀合物(ADC)，该抗体药物缀合物包含根据权利要求1-12中任一项所述的抗FRα抗体或其抗原结合片段，其中该抗FRα抗体或其抗原结合片段与细胞毒素缀合。
17.根据权利要求14-15中任一项所述的抗FRα抗体或其抗原结合片段或根据权利要求16所述的ADC，其中该细胞毒素经由选自以下的接头RL与该抗FRα抗体或其抗原结合片段连接：
(Ia):
其中Q是：
其中QX使得Q为氨基酸残基、二肽残基、三肽残基或四肽残基；
X是：
其中a＝0至5，b1＝0至16，b2＝0至16，c1＝0或1，c2＝0或1，d＝0至5，其中至少b1或b2＝0(即b1和b2中只有一个可以不是0)并且至少c1或c2＝0(即c1和c2中只有一个可以不是0)；
GL是用于连接该抗FRα抗体或其抗原结合片段的接头；
(Ib)：
其中RL1和RL2独立地选自H和甲基，或与它们所结合的碳原子一起形成环丙烯或环丁烯基团；并且e是0或1；或
(Ib’)：
其中RL1和RL2独立地选自H和甲基，或与它们所结合的碳原子一起形成环丙烯或环丁烯基团。
18.根据权利要求17所述的抗FRα抗体或其抗原结合片段或根据权利要求17所述的ADC，其中GL是
19.根据权利要求17或权利要求18所述的抗FRα抗体或其抗原结合片段或根据权利要求17或权利要求18所述的ADC，其中RL是
20.根据权利要求14-15或17-19中任一项所述的抗FRα抗体或其抗原结合片段或根据权利要求16-19中任一项所述的ADC，其中该细胞毒素选自拓扑异构酶I抑制剂、微管溶素衍生物、吡咯并苯并二氮杂卓或其组合；优选地其中该细胞毒素是拓扑异构酶I抑制剂。
21.一种ADC，该ADC包含与细胞毒素连接的抗FRα抗体或其抗原结合片段，其中该细胞毒素是拓扑异构酶I抑制剂。
22.根据权利要求20所述的抗FRα抗体或其抗原结合片段或根据权利要求20或21所述的ADC，其中该拓扑异构酶I抑制剂由式(I)表示：
及其盐和溶剂化物；
其中RL是根据权利要求17-19中任一项所定义的。
23.根据权利要求20或22所述的抗FRα抗体或其抗原结合片段或根据权利要求20-22中任一项所述的ADC，其中该拓扑异构酶I抑制剂是：
和/或
优选地，其中该拓扑异构酶I抑制剂是：
24.根据权利要求14-15、17-20或22-23中任一项所述的抗FRα抗体或其抗原结合片段或根据权利要求16-23中任一项所述的ADC，其中药物与抗体比率(DAR)在约1至20的范围内，任选地其中DAR的范围选自约1至10、约2至10、约2至8、约2至6、以及约4至10。
25.根据权利要求24所述的抗FRα抗体或其抗原结合片段或根据权利要求24所述的ADC，其中该DAR是约8或约4，优选地其中该DAR是约8。
26.一种ADC，该ADC包含与细胞毒素连接的抗FRα抗体或其抗原结合片段，其中：
(i)该抗FRα抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:1的重链CDR1(SDSATWN)、SEQ IDNO:2的重链CDR2(RTYYRSKWYNDYAVSVKS)、SEQ ID NO:3的重链CDR3(GVGSFDY)、SEQ ID NO:4的轻链CDR1(RASQSISSWLA)、SEQ ID NO:5的轻链CDR2(KASGLES)、以及SEQ ID NO:6的轻链CDR3(QQYNSYSQLT)，任选地其中该抗FRα抗体或其抗原结合片段具有SEQ ID NO:37的VH和SEQ ID NO:38的VL；
(ii)该细胞毒素是拓扑异构酶I抑制剂SG3932
以及
(iii)该DAR是约8。
27.一种分离的多核苷酸，该分离的多核苷酸编码根据权利要求1-15、17-20或22-25中任一项所述的抗FRα抗体或其抗原结合片段。
28.一种载体，该载体包含：
(a)与启动子可操作地缔合的根据权利要求27所述的多核苷酸；或
(b)编码根据权利要求2-4中任一项所定义的VH区的多核苷酸和编码根据权利要求2-4中任一项所定义的VL区的多核苷酸，其中所述多核苷酸与一个或多个启动子可操作地缔合。
29.根据权利要求28所述的载体，该载体进一步包含编码根据权利要求5或6所定义的恒定重链区的多核苷酸和编码根据权利要求5或6所定义的恒定轻链区的多核苷酸。
30.一种宿主细胞，该宿主细胞包含根据权利要求27所述的多核苷酸或根据权利要求28或29所述的载体。
31.一种制备根据权利要求1-15、17-20或22-25中任一项所述的抗FRα抗体或其抗原结合片段的方法，该方法包括如下步骤：
(a)用根据权利要求28或权利要求29所述的载体转染宿主细胞；
(b)在允许合成所述抗体或抗原结合片段的条件下培养该宿主细胞；以及
(c)从所述培养物中回收所述抗体或抗原结合片段。
32.一种药物组合物，该药物组合物包含根据权利要求1-15、17-20或22-25中任一项所述的抗FRα抗体或其抗原结合片段或根据权利要求16-26中任一项所述的ADC，以及药学上可接受的赋形剂。
33.根据权利要求1-15、17-20或22-25中任一项所述的抗FRα抗体或其抗原结合片段、根据权利要求16-26中任一项所述的ADC、或根据权利要求32所述的药物组合物，其用于在消除受试者中FRα阳性细胞群的方法中使用，该方法包括向该受试者施用该抗FRα抗体或其抗原结合片段、该ADC或该药物组合物；任选地，其中这些FRα阳性细胞是FRα阳性癌细胞。
34.根据权利要求1-15、17-20或22-25中任一项所述的抗FRα抗体或其抗原结合片段或根据权利要求16-26中任一项所述的ADC，或根据权利要求32所述的药物组合物，其用于在治疗与FRα表达相关的癌症中使用。
35.用于根据权利要求34所述使用的抗FRα抗体或其抗原结合片段、ADC或药物组合物，其中该癌症包含具有FRα异质表达和/或FRα低表达的癌细胞；任选地，其中该癌细胞具有与Igrov-1细胞系相似的FRα表达。
36.用于根据权利要求34-35中任一项所述使用的抗FRα抗体或其抗原结合片段、ADC或药物组合物，其中所述癌症选自卵巢癌、肺癌、子宫内膜癌、胰腺癌、胃癌、肾细胞癌(RCC)、结肠直肠癌、头颈鳞状细胞癌(HNSCC)、乳腺癌(例如TNBC)、宫颈癌和恶性胸膜间皮瘤，优选地其中所述癌症选自卵巢癌和肺癌。
37.用于根据权利要求36所述使用的抗FRα抗体或其抗原结合片段、ADC或药物组合物，其中该肺癌是非小细胞肺癌(NSCLC)，任选地其中该NSCLC选自鳞状NSCLC、腺癌NSCLC或其组合。
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