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CN118813409A - 一种神经组织或脑类器官芯片模型及其构建方法和应用 - Google Patents

一种神经组织或脑类器官芯片模型及其构建方法和应用 Download PDF

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CN118813409A
CN118813409A CN202410920940.6A CN202410920940A CN118813409A CN 118813409 A CN118813409 A CN 118813409A CN 202410920940 A CN202410920940 A CN 202410920940A CN 118813409 A CN118813409 A CN 118813409A
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wire electrode
neural tissue
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沈慜
陈璞
赵稳
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Wuhan University WHU
Hainan University
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Wuhan University WHU
Hainan University
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Abstract

本申请公开了一种神经组织或脑类器官芯片模型及其构建方法和应用。本申请模型由干细胞在神经组织或脑类器官‑电极复合体芯片中培养增殖、分化、自组织形成神经组织或脑类器官，且细胞包裹在三维多电极阵列上；复合体芯片包括细胞培养芯片元件、外层绝缘的金属丝电极组、电极固定元件和底部元件，细胞培养芯片元件包括细胞培养腔和培养基加液池，两者由培养基交换孔连通；电极固定原件上设有多个走线槽和贯穿的孔洞，用于固定金属丝，形成三维多电极阵列；底部元件用于封闭电极固定原件的走线槽及孔洞。本申请模型中，神经组织或脑类器官与三维多电极阵列长期无缝共存，可实现实时、原位、长期稳定的神经组织或脑类器官内部神经电生理信号采集。

Description

一种神经组织或脑类器官芯片模型及其构建方法和应用
技术领域
本申请涉及一种神经组织或脑类器官芯片模型技术领域，特别是涉及一种神经组织或脑类器官芯片模型及其构建方法和应用。
背景技术
脑类器官是基于发育生物学原理在体外构建的三维人脑模型，具有与人脑相似的发育轨迹、细胞类型、皮层结构和神经功能，被广泛应用于神经发育和疾病相关研究。在各类神经细胞和组织功能性研究中，神经电生理信号的出现被公认为是具有神经功能的“金标准”。现有用于检测脑类器官神经电生理信号的技术主要为膜片钳技术、钙成像技术和微电极阵列(MEA)技术。膜片钳技术能够以极高的时间分辨率记录脑类器官中单个神经元的电生理活动，然而该技术主要用于记录单个神经元的电活动，并且实验操作较为复杂；钙成像技术通过同时监测成百上千个神经元内钙离子的变化来反映神经元群体的活动情况，但是脑类器官的立体性限制了钙成像技术在整体水平上的应用；MEA技术在很大程度上兼具膜片钳技术的高时间分辨率和钙成像技术的网络特性，也可以对神经元进行胞外无损刺激，是目使用最广泛的脑类器官神经电生理研究技术之一。不同形状构造的MEA在不同方面存在一些不足：
传统的MEA电极规则排布于一个二维平面上，导致其只能采集脑类器官表面的二维局部区域的电信号，无法检测脑类器官内部的神经电信号，并且在检测过程中，脑类器官需要被多次转移，使得脑类器官容易受到机械性损伤，这可能会使其神经电信号发生改变；使用针尖式MEA检测脑类器官发育过程中的神经电生理活动需要借助精密的显微操作机器进行精巧植入，并且植入过程不可避免地会对脑类器官造成损伤，影响其生长发育以及对正常发育过程中电生理活动的分析；网筛式MEA需要额外使用吊床状网状物将神经类器官悬挂在远离培养皿底板的地方进行悬浮培养，这可能会导致神经类器官在接种在MEA上时被偏心放置，导致部分电极不能接触到类器官组织，并且该MEA在检测脑类器官时未检测到神经电信号；而三维柔性MEA造价较高，工艺复杂，对操作人员的要求高，不利于推广应用，而这对于应用脑类器官研究人脑神经发育及神经相关疾病有重大影响。
因此，如何简单有效的构建可实时、原位、长期稳定地检测神经组织或脑类器官内部电生理活动的系统，仍然是本领域的研究重点和难点。
发明内容
本申请的目的是提供一种新的神经组织或脑类器官芯片模型及其构建方法和应用。
本申请采用了以下技术方案：
本申请的第一方面公开了一种神经组织或脑类器官芯片模型，由干细胞在神经组织或脑类器官-电极复合体芯片中培养增殖、分化、自组织形成神经组织或脑类器官；并且，神经组织或脑类器官的细胞包裹在三维多电极阵列上；其中，神经组织或脑类器官-电极复合体芯片包括细胞培养芯片元件、电极固定元件、外层绝缘的金属丝电极组和底部元件；电极固定元件和底部元件为两块平行的平板，电极固定元件和底部元件围成容纳外层绝缘的金属丝电极组的金属丝电极走线槽；电极固定元件的顶部具有金属丝电极固定孔，金属丝电极固定孔与金属丝电极走线槽连通；外层绝缘的金属丝电极组由若干条外层绝缘的金属丝电极组成；金属丝电极的一端从电极固定元件顶部的金属丝电极固定孔伸出，形成三维多电极阵列；金属丝电极的另一端穿过金属丝电极走线槽延伸出电极固定元件和底部元件，用于连接外部数据采集分析设备；细胞培养芯片元件包括细胞培养腔和培养基加液池，细胞培养腔用于细胞培养，培养基加液池用于添加或者去除培养液；细胞培养腔和培养基加液池通过培养基交换孔连通；细胞培养芯片元件设置于电极固定元件的顶部，并且，使得从电极固定元件顶部伸出的三维多电极阵列伸入所述细胞培养腔中，以便于神经组织或脑类器官的细胞包裹在三维多电极阵列上。
需要说明的是，本申请的神经组织或脑类器官芯片模型，神经组织或脑类器官的细胞无缝包裹在三维多电极阵列上，能实现实时、原位、长期稳定的神经组织或脑类器官内部神经电生理信号采集，为神经组织或脑类器官内部电生理活动检测提供了一种简单有效的三维模型。
优选的，本申请的神经组织或脑类器官芯片模型，检测培养≥100天的脑类器官的神经尖峰数≥400/min，爆发数≥10/min。
优选的，本申请的神经组织或脑类器官芯片模型中，细胞培养芯片元件、电极固定元件和底部元件采用生物相容性材料制备。
优选的，生物相容性材料为亚克力(PMMA)、聚碳酸酯(PC)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、玻璃中的至少一种。其中，亚克力即聚甲基丙烯酸甲酯。
本申请的第二方面公开了本申请的神经组织或脑类器官芯片模型在检测神经组织或脑类器官的不同发育阶段的内部电生理变化中的应用。
本申请的第三方面公开了本申请的神经组织或脑类器官芯片模型在检测神经相关疾病研究中内部电生理变化中的应用。
本申请的第四方面公开了本申请的神经组织或脑类器官芯片模型的构建方法，包括以下步骤：
向细胞培养腔中加入聚二甲基硅氧烷，形成U形培养底；
向细胞培养腔和培养基加液池中加入细胞培养液，并接种干细胞进行培养，使细胞增殖、分化、自组织形成神经组织或脑类器官，包裹在三维多电极阵列上，即获得本申请的神经组织或脑类器官芯片模型。
可以理解，向细胞培养腔中加入聚二甲基硅氧烷主要是为了形成U形培养底，原则上，只要能够形成U形培养底，且具有生物相容性的材料都能够适用于本申请，不仅限于聚二甲基硅氧烷。
优选的，聚二甲基硅氧烷的加入量需要确保形成的U形培养底不堵塞培养基交换孔，并确保三维多电极阵列的金属丝电极伸出U形培养底0.15-0.2mm。
优选的，干细胞的接种量为每个细胞培养腔接种2000-4000个细胞。
优选的，干细胞为人胚胎干细胞、人诱导多能干细胞、人成体干细胞中的至少一种。
优选的，干细胞培养在精密翘板摇床中进行。
本申请的第五方面公开了一种神经组织或脑类器官-电极复合体芯片组件，包括细胞培养芯片元件、模具元件、电极固定元件、外层绝缘的金属丝电极组和底部元件；电极固定元件和底部元件为两块平行的平板，使用时，电极固定元件和底部元件围成容纳外层绝缘的金属丝电极组的金属丝电极走线槽；电极固定元件的顶部具有金属丝电极固定孔，金属丝电极固定孔与金属丝电极走线槽连通；外层绝缘的金属丝电极组由若干条外层绝缘的金属丝电极组成；使用时，金属丝电极的一端从电极固定元件顶部的金属丝电极固定孔伸出；金属丝电极的另一端穿过所述金属丝电极走线槽延伸出电极固定元件和底部元件，用于连接外部数据采集分析设备；模具元件为一平板，模具元件上开设有若干个金属丝电极走线孔；使用时，模具元件叠放在电极固定元件的顶部，金属丝电极从电极固定元件的顶部伸出后，穿过金属丝电极走线孔，伸出模具元件，对伸出模具元件的金属丝电极进行修剪，然后移除模具元件，即获得三维多电极阵列；细胞培养芯片元件包括细胞培养腔和培养基加液池，细胞培养腔用于细胞培养，培养基加液池用于添加或者去除培养液；细胞培养腔和培养基加液池通过培养基交换孔连通；使用时，细胞培养芯片元件设置于电极固定元件的顶部，并且，使得从电极固定元件顶部伸出的三维多电极阵列伸入细胞培养腔中，以便于神经组织或脑类器官的细胞包裹在三维多电极阵列上。
优选的，本申请的神经组织或脑类器官-电极复合体芯片组件中，细胞培养芯片元件、电极固定元件和底部元件采用生物相容性材料制备。
优选的，生物相容性材料为聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、聚二甲基硅氧烷和玻璃中的至少一种。
本申请的第六方面公开了一种神经组织或脑类器官-电极复合体芯片，包括细胞培养芯片元件、电极固定元件、外层绝缘的金属丝电极组和底部元件；电极固定元件和底部元件为两块平行的平板，电极固定元件和底部元件围成容纳外层绝缘的金属丝电极组的金属丝电极走线槽；电极固定元件的顶部具有金属丝电极固定孔，金属丝电极固定孔与金属丝电极走线槽连通；外层绝缘的金属丝电极组由若干条外层绝缘的金属丝电极组成；金属丝电极的一端从电极固定元件顶部的金属丝电极固定孔伸出，形成三维多电极阵列；金属丝电极的另一端穿过金属丝电极走线槽延伸出电极固定元件和底部元件，用于连接外部数据采集分析设备；细胞培养芯片元件包括细胞培养腔和培养基加液池，细胞培养腔用于细胞培养，培养基加液池用于添加或者去除培养液；细胞培养腔和培养基加液池通过培养基交换孔连通；细胞培养芯片元件设置于所述电极固定元件的顶部，并且，使得从电极固定元件顶部伸出的三维多电极阵列伸入细胞培养腔中，以便于神经组织或脑类器官的细胞包裹在三维多电极阵列上。
优选的，本申请的神经组织或脑类器官-电极复合体芯片中，细胞培养芯片元件、电极固定元件和底部元件采用生物相容性材料制备。
优选的，生物相容性材料为聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、聚二甲基硅氧烷和玻璃中的至少一种。
本申请的有益效果在于：
本申请神经组织或脑类器官芯片模型，能实现实时、原位、长期稳定的神经组织或脑类器官内部神经电生理信号采集，为神经组织或脑类器官内部电生理活动检测提供了一种简单有效的三维模型。
附图说明
图1示出了本申请实施例的神经组织或脑类器官-电极复合体芯片的结构示意图；
图2示出了本申请实施例的神经组织或脑类器官-电极复合体芯片组件的分解结构示意图；
图3示出了本申请实施例的细胞培养芯片元件的结构示意图；
图4示出了本申请实施例的模具元件的结构示意图；
图5示出了本申请实施例的电极固定元件的结构示意图。
具体实施方式
针对现有的三维柔性微电极阵列造价较高、工艺复杂，对操作人员的要求高，不利于推广应用的问题。本申请创造性的研发了一种新的可实时、原位、长期稳定地检测脑类器官内部电生理活动的系统，以便分析不同发育阶段脑类器官内部神经电生理信号变化。
本申请首先研发了一种神经组织或脑类器官-电极复合体芯片组件，包括细胞培养芯片元件、模具元件、电极固定元件、外层绝缘的金属丝电极组和底部元件；电极固定元件和底部元件为两块平行的平板，使用时，电极固定元件和底部元件围成容纳外层绝缘的金属丝电极组的金属丝电极走线槽；电极固定元件的顶部具有金属丝电极固定孔，金属丝电极固定孔与金属丝电极走线槽连通，电极固定元件用于固定金属丝电极；外层绝缘的金属丝电极组由若干条外层绝缘的金属丝电极组成；使用时，金属丝电极的一端从电极固定元件顶部的金属丝电极固定孔伸出；金属丝电极的另一端穿过所述金属丝电极走线槽延伸出电极固定元件和底部元件，用于连接外部数据采集分析设备；模具元件为一平板，模具元件上开设有若干个金属丝电极走线孔；使用时，模具元件叠放在电极固定元件的顶部，金属丝电极从电极固定元件的顶部伸出后，穿过金属丝电极走线孔，伸出模具元件，对伸出模具元件的金属丝电极进行修剪，然后移除模具元件，即获得三维多电极阵列；细胞培养芯片元件包括细胞培养腔和培养基加液池，细胞培养腔用于细胞培养，培养基加液池用于添加或者去除培养液；细胞培养腔和培养基加液池通过培养基交换孔连通；使用时，细胞培养芯片元件设置于电极固定元件的顶部，并且，使得从电极固定元件顶部伸出的三维多电极阵列伸入细胞培养腔中，以便于神经组织或脑类器官的细胞包裹在三维多电极阵列上。
在此基础上，通过神经组织或脑类器官-电极复合体芯片组件，本申请先组装了神经组织或脑类器官-电极复合体芯片，即电极固定元件和底部元件围成容纳外层绝缘的金属丝电极组的金属丝电极走线槽；电极固定元件的顶部具有金属丝电极固定孔，金属丝电极固定孔与金属丝电极走线槽连通；外层绝缘的金属丝电极组由若干条外层绝缘的金属丝电极组成；金属丝电极的一端从电极固定元件顶部的金属丝电极固定孔伸出，形成三维多电极阵列；金属丝电极的另一端穿过金属丝电极走线槽延伸出电极固定元件和底部元件，用于连接外部数据采集分析设备；细胞培养芯片元件包括细胞培养腔和培养基加液池，细胞培养腔用于细胞培养，培养基加液池用于添加或者去除培养液；细胞培养腔和培养基加液池通过培养基交换孔连通；细胞培养芯片元件设置于所述电极固定元件的顶部，并且，使得从电极固定元件顶部伸出的三维多电极阵列伸入细胞培养腔中，以便于神经组织或脑类器官的细胞包裹在三维多电极阵列上。
然后，向细胞培养腔中加入聚二甲基硅氧烷，形成U形培养底；
向细胞培养腔和培养基加液池中加入细胞培养液，并接种干细胞进行培养，使细胞增殖、分化、自组织形成神经组织或脑类器官，包裹在三维多电极阵列上，即获得本申请的神经组织或脑类器官芯片模型。
本申请的神经组织或脑类器官芯片模型，与现有技术相比，具有以下优点：
1、本申请通过在立体的三维多电极阵列接种干细胞，干细胞通过增殖、分化、自组织形成脑类器官，并在培养过程中无缝地包裹三维多电极阵列，即形成固定位置的神经组织或脑类器官-电极复合体，即神经组织或脑类器官芯片模型，避免在后续检测过程中多次转移样本所导致的样本受损。
2、本申请通过结合具有细胞培养腔、培养基加液池和培养基交换孔的细胞培养芯片元件，通过精密翘板摇床提供重力流，有利于细胞培养腔中培养基营养物质的平衡，减少了更换培养基次数。
3、基于本申请的神经组织或脑类器官芯片模型，能够实现脑类器官与三维多电极阵列的长期、稳定、无缝地共存，可检测脑类器官内部电生理活动及不同发育阶段脑类器官的电生理复杂度的变化。
4、本申请的神经组织或脑类器官-电极复合体芯片和模型，材料便宜、结构简单，并适用于多种品牌的多通道电生理采集系统，便于相关领域人员操作，具有巨大的应用前景和商业价值。
下面通过具体实施例对本申请作进一步详细说明，以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。下述实施例中所用的部分材料和试剂如表1所示，其余材料和试剂如无特别说明，均可从商业途径得到，下述实施例中所使用的实验方法如无特别说明，均为常规方法。
表1主要材料和试剂
实施例一
本例的神经组织或脑类器官-电极复合体芯片组件，如图1至图5所示，包括细胞培养芯片元件1、模具元件2、电极固定元件3、外层绝缘的金属丝电极组4和底部元件5。
电极固定元件3和底部元件5为两块平行的平板，使用时，电极固定元件3和底部元件5围成容纳外层绝缘的金属丝电极组4的金属丝电极走线槽11；电极固定元件3的顶部具有金属丝电极固定孔12，金属丝电极固定孔12与金属丝电极走线槽11连通。本例的电极固定元件3，长为62mm、宽为28.4mm、高为1mm；包含了多个矩形的金属丝电极固定孔阵列，每个孔洞直径为0.1mm；金属丝电极走线槽，宽为0.15mm，深为0.5mm。本例的底部元件5，长为62mm、宽为28.4mm、高为0.2mm。
外层绝缘的金属丝电极组4由若干条外层绝缘的金属丝电极组成；使用时，金属丝电极的一端从电极固定元件3顶部的金属丝电极固定孔12伸出；金属丝电极的另一端经过金属丝电极走线槽11延伸出电极固定元件3和底部元件5，用于连接外部数据采集分析设备。本例的外层绝缘的金属丝电极的横截面半径为0.05mm、长为100mm。
模具元件2为一平板，模具元件2上开设有若干个金属丝电极走线孔10；使用时，模具元件2叠放在所述电极固定元件3的顶部，金属丝电极从电极固定元件3的顶部伸出后，穿过金属丝电极走线孔10，伸出模具元件2，对伸出模具元件2的金属丝电极进行修剪，然后移除模具元件2，即获得三维多电极阵列。本例的模具元件2大小与电极固定元件3一致，即长为62mm、宽为28.4mm、高为1mm。
细胞培养芯片元件1包括细胞培养腔8和培养基加液池7，细胞培养腔8用于细胞培养，培养基加液池7用于添加或者去除培养液；细胞培养腔8和培养基加液池7通过培养基交换孔9连通；使用时，细胞培养芯片元件1设置于电极固定元件3的顶部，并且，使得从电极固定元件3顶部伸出的三维多电极阵列伸入细胞培养腔8中，以便于神经组织或脑类器官的细胞包裹在三维多电极阵列上。本例的细胞培养芯片元件1，长为31mm、宽为31mm、高为8mm；其中，细胞培养腔8为圆柱形腔体，半径2.5～3mm，高4～16mm即可，本例具体的半径为2.5mm，高为8mm，三维多电极阵列的面积为0.0025～16mm2，三维多电极阵列高度为0.1～0.2mm；在圆柱形腔体的细胞培养腔8的两侧各有一个半圆形的培养基加液池。
基于本例的神经组织或脑类器官-电极复合体芯片组件，本例的神经组织或脑类器官芯片模型的构建方法包括：
步骤1，设计神经组织或脑类器官-电极复合体芯片组件
步骤1.1，通过CAD软件设计细胞培养芯片元件1、模具元件2、电极固定元件3和底部元件5的图案，然后使用激光雕刻机将图案加工成亚克力(PMMA)元件；
步骤2，构建神经组织或脑类器官-电极复合体芯片
步骤2.1，使用PDMS将粘合细胞培养芯片元件；
步骤2.2，将模具元件和电极固定元件堆叠并保持边缘一致，确保模具元件的金属丝电极走线孔10与电极固定元件的金属丝电极固定孔12位置保持一致，得到模具-电极固定元件复合体；
步骤2.3，将外层绝缘的金属丝同时穿过步骤2.2得到的模具-电极固定元件复合体上的孔洞；
步骤2.4，将电极固定元件下方的外层绝缘金属丝电极嵌入金属丝电极走线槽11中；
步骤2.5，将模具元件上方的多余长度的外层绝缘金属丝电极沿模具元件修剪至高度一致后，向上移除模具元件，形成三维的多电极阵列；
步骤2.6，使用PDMS将电极固定元件与底部元件粘合；
步骤2.7，将细胞培养芯片元件置于电极固定元件顶部上方，使立体外层绝缘金属丝电极阵列，即三维多电极阵列，位于细胞培养腔的中心，使用PDMS将细胞培养芯片元件和电极固定元件粘合；
步骤3，构建神经组织或脑类器官芯片模型
步骤3.1，使用一次性注射器向细胞培养腔中滴入适量PDMS，静置形成低黏附性U形培养底，且不堵塞培养基交换孔，同时确保外层绝缘金属丝电极高度为0.15-0.2mm；
步骤3.2，对步骤3.1得到的芯片装置进行紫外灭菌，灭菌时≥24小时，并使用灭菌水清洗细胞培养腔；
步骤3.3，培养人胚胎干细胞(H9 Feeder Free)(SCSP-307,20230822,P42)，当细胞面积占培养瓶面积约80％时，使用Accutase消化(Thermo，A11105-01)，1000rpm离心2分钟，吸弃含有Accutase的培养基后，加入新鲜NCTarget培养基重悬并稀释细胞，按照每孔3000个活细胞进行种板，置于37℃、5％ CO2细胞培养箱中静置培养；
步骤3.4，进行细胞扩增(D0-D5)：每48小时更换一次AⅠ阶段培养基，放置于细胞培养箱中水平静置培养。AⅠ阶段培养基成分为NCTarget培养基，其中含有4ng/mL bFGF；培养5天；
步骤3.5，进行神经诱导(D6-D11)：每48小时更换一次AⅡ阶段培养基，放置于细胞培养箱中水平静置培养，使细胞汇聚成神经小球，形成拟胚体(EB)；该阶段拟胚体逐渐包裹三维多电极阵列；所述AⅡ阶段培养基成分包括：DMEM/F12、N2(100×)、1×GlutaMax(100×)、MEM-NEAA(Non-Essential Amino Acid,100×)、Heparin solution(1mg/mL)、1％penicillin-streptomycin(100×)；从第6天培养至第11天；
步骤3.6，神经分化(D12-D15)：第12天时，在光学显微镜下观察脑类器官出现神经花环，使用移液枪吸弃细胞培养芯片元件中的AⅡ阶段培养基，向细胞培养腔中加入1-10mg/mL的Matrigel，使Matrigel完全包裹脑类器官；此过程Matrigel需一直放置在冰盒上；将神经组织或脑类器官-电极复合体芯片置于细胞培养箱中孵育5-10分钟，使Matrigel充分交联；最后重新取出神经组织或脑类器官-电极复合体芯片，加入1.5mL AⅢ培养基，再次放置于细胞培养箱中的精密翘板摇床上培养，每36小时更换一次AⅢ培养基；该阶段脑类器官逐渐包裹三维多电极阵列；AⅢ阶段培养基成分包括：50％DMEM/F12，50％NeurobasalMedium，1×N2(100×)，1×B27-vitamin A(50×)，1×GlutaMax(100×)，1×NEAA(NonEssential Amino Acid,100×)，1×penicillin-streptomycin(100×)，0.05mMβ-Mercaptoethanol；从第12天培养至第15天；
步骤3.7，神经成熟(D16-长期)：该阶段脑类器官中神经逐渐成熟且长期存活，从第22天开始，每天更换一次AⅣ阶段培养基；该阶段脑类器官无缝地包裹三维多电极阵列；AⅣ阶段培养基成分包括：50％DMEM/F12，50％Neurobasal Medium，1×N2(100×)，1×B27+vitamin A(50×)，1×GlutaMax(100×)，1×NEAA(Non-Essential Amino Acid,100×)，1×penicillin-streptomycin(100×)，0.05mMβ-Mercaptoethanol。
在培养第50天，将三维多电极阵列另一端外层绝缘金属丝引出细胞培养箱，并通过焊接的方式与Intan RHS 32通道电生理信号检测仪(Intan Technologies)进行连接，对脑类器官进行持续检测。当第一次检测出脑类器官的spike信号后，需每天在相同时间段进行电生理信号的检测和记录，记录时间为每次5分钟，随着培养时间的延长，脑类器官自发放电频率逐渐增加，spike信号幅值逐渐增大，表明脑类器官成熟度在不断提高。
实施例二
本例采用人诱导型多能干细胞DYR0100(SCSP-1301)替换实施例一的人胚胎干细胞(H9 Feeder Free)，其余与实施例一基本相同，具体包括：
基于本例的神经组织或脑类器官-电极复合体芯片组件，本例的神经组织或脑类器官芯片模型的构建方法包括：
步骤1，设计神经组织或脑类器官-电极复合体芯片组件
步骤1.1，通过CAD软件设计细胞培养芯片元件1、模具元件2、电极固定元件3和底部元件5的图案，然后使用激光雕刻机将图案加工成亚克力(PMMA)元件；
步骤2，构建神经组织或脑类器官-电极复合体芯片
步骤2.1，使用PDMS将粘合细胞培养芯片元件；
步骤2.2，将模具元件和电极固定元件堆叠并保持边缘一致，确保模具元件的金属丝电极走线孔10与电极固定元件的金属丝电极固定孔12位置保持一致，得到模具-电极固定元件复合体；
步骤2.3，将外层绝缘的钨丝同时穿过步骤2.2得到的模具-电极固定元件复合体上的孔洞；
步骤2.4，将电极固定元件下方的外层绝缘钨丝电极嵌入金属丝电极走线槽11中；
步骤2.5，将模具元件上方的多余长度的外层绝缘钨丝电极沿模具元件修剪至高度一致后，向上移除模具元件，形成三维的多电极阵列；
步骤2.6，使用PDMS将电极固定元件与底部元件粘合；
步骤2.7，将细胞培养芯片元件置于电极固定元件顶部上方，使立体外层绝缘钨丝电极阵列，即三维多电极阵列，位于细胞培养腔的中心，使用PDMS将细胞培养芯片元件和电极固定元件粘合；
步骤3，构建神经组织或脑类器官芯片模型
步骤3.1，使用一次性注射器向细胞培养腔中滴入适量PDMS，静置形成低黏附性U形培养底，且不堵塞培养基交换孔，同时确保外层绝缘金属丝电极高度为0.15-0.2mm；
步骤3.2，对步骤3.1得到的芯片装置进行紫外灭菌，灭菌时≥24小时，并使用灭菌水清洗细胞培养腔；
步骤3.3，培养人诱导型多能干细胞DYR0100(SCSP-1301)，当细胞面积占培养瓶面积约80％时，使用Accutase消化(Thermo，A11105-01)，1000rpm离心2分钟，吸弃含有Accutase的培养基后，加入新鲜NCTarget培养基重悬并稀释细胞，按照每孔5000个活细胞进行种板，置于37℃、5％ CO2细胞培养箱中静置培养；
步骤3.4，进行细胞扩增(D0-D5)：每48小时更换一次AⅠ阶段培养基，放置于细胞培养箱中水平静置培养。AⅠ阶段培养基成分为NCTarget培养基，其中含有4ng/mL bFGF；培养5天；
步骤3.5，进行神经诱导(D6-D11)：每48小时更换一次AⅡ阶段培养基，放置于细胞培养箱中水平静置培养，使细胞汇聚成神经小球，形成拟胚体(EB)；该阶段拟胚体逐渐包裹三维多电极阵列；所述AⅡ阶段培养基成分包括：DMEM/F12、N2(100×)、1×GlutaMax(100×)、MEM-NEAA(Non-Essential Amino Acid,100×)、Heparin solution(1mg/mL)、1％penicillin-streptomycin(100×)；从第6天培养至第11天；
步骤3.6，神经分化(D12-D15)：第12天时，在光学显微镜下观察脑类器官出现神经花环，使用移液枪吸弃细胞培养芯片元件中的AⅡ阶段培养基，向细胞培养腔中加入1-10mg/mL的Matrigel，使Matrigel完全包裹脑类器官；此过程Matrigel需一直放置在冰盒上；将神经组织或脑类器官-电极复合体芯片置于细胞培养箱中孵育5-10分钟，使Matrigel充分交联；最后重新取出神经组织或脑类器官-电极复合体芯片，加入1.5mL AⅢ培养基，再次放置于细胞培养箱中的精密翘板摇床上培养，每36小时更换一次AⅢ培养基；该阶段脑类器官逐渐包裹三维多电极阵列；AⅢ阶段培养基成分包括：50％DMEM/F12，50％NeurobasalMedium，1×N2(100×)，1×B27-vitamin A(50×)，1×GlutaMax(100×)，1×NEAA(NonEssential Amino Acid,100×)，1×penicillin-streptomycin(100×)，0.05mMβ-Mercaptoethanol；从第12天培养至第15天；
步骤3.7，神经成熟(D16-长期)：该阶段脑类器官中神经逐渐成熟且长期存活，从第22天开始，每天更换一次AⅣ阶段培养基；该阶段脑类器官无缝地包裹三维多电极阵列；AⅣ阶段培养基成分包括：50％DMEM/F12，50％Neurobasal Medium，1×N2(100×)，1×B27+vitamin A(50×)，1×GlutaMax(100×)，1×NEAA(Non-Essential Amino Acid,100×)，1×penicillin-streptomycin(100×)，0.05mMβ-Mercaptoethanol。
在培养第50天，将三维多电极阵列另一端外层绝缘钨丝引出细胞培养箱，并通过焊接PCB转接板的方式与Neuralynx ATLAS系统(Neuralynx)进行连接，对脑类器官进行持续检测。当第一次检测出脑类器官的spike信号后，需每天在相同时间段进行电生理信号的检测和记录，记录时间为每次5分钟，随着培养时间的延长，脑类器官自发放电频率逐渐增加，spike信号幅值逐渐增大，表明脑类器官成熟度在不断提高。
以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。

Claims (10)

1.一种神经组织或脑类器官芯片模型，其特征在于：由干细胞在神经组织或脑类器官-电极复合体芯片中培养增殖、分化、自组织形成神经组织或脑类器官；并且，神经组织或脑类器官的细胞包裹在三维多电极阵列上；
所述神经组织或脑类器官-电极复合体芯片包括细胞培养芯片元件(1)、电极固定元件(3)、外层绝缘的金属丝电极组(4)和底部元件(5)；
所述电极固定元件(3)和底部元件(5)为两块平行的平板，电极固定元件(3)和底部元件(5)围成容纳所述外层绝缘的金属丝电极组(4)的金属丝电极走线槽(11)；
所述电极固定元件(3)的顶部具有金属丝电极固定孔(12)，金属丝电极固定孔(12)与金属丝电极走线槽(11)连通；
所述外层绝缘的金属丝电极组(4)由若干条外层绝缘的金属丝电极组成；金属丝电极的一端从电极固定元件(3)顶部的金属丝电极固定孔(12)伸出，形成三维多电极阵列；金属丝电极的另一端穿过所述金属丝电极走线槽(11)延伸出电极固定元件(3)和底部元件(5)，用于连接外部数据采集分析设备；
所述细胞培养芯片元件(1)包括细胞培养腔(8)和培养基加液池(7)，细胞培养腔(8)用于细胞培养，培养基加液池(7)用于添加或者去除培养液；细胞培养腔(8)和培养基加液池(7)通过培养基交换孔(9)连通；
所述细胞培养芯片元件(1)设置于所述电极固定元件(3)的顶部，并且，使得从电极固定元件(3)顶部伸出的三维多电极阵列伸入所述细胞培养腔(8)中，以便于神经组织或脑类器官的细胞包裹在三维多电极阵列上。
2.根据权利要求1所述的神经组织或脑类器官芯片模型，其特征在于：检测培养≥100天的脑类器官的神经尖峰数≥400/min，爆发数≥10/min。
3.根据权利要求1或2所述的神经组织或脑类器官芯片模型，其特征在于：所述细胞培养芯片元件(1)、电极固定元件(3)和底部元件(5)采用生物相容性材料制备；
优选的，所述生物相容性材料为聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、聚二甲基硅氧烷和玻璃中的至少一种。
4.权利要求1-3任一项所述的神经组织或脑类器官芯片模型在检测神经组织或脑类器官的不同发育阶段的内部电生理变化中的应用，或者在检测神经相关疾病研究中内部电生理变化中的应用。
5.权利要求1-3任一项所述的神经组织或脑类器官芯片模型的构建方法，其特征在于：包括以下步骤；
向所述细胞培养腔(8)中加入聚二甲基硅氧烷，形成U形培养底；
向所述细胞培养腔(8)和培养基加液池(7)中加入细胞培养液，并接种干细胞进行培养，使干细胞增殖、分化、自组织形成神经组织或脑类器官，包裹在三维多电极阵列上，即获得所述神经组织或脑类器官芯片模型。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于：所述聚二甲基硅氧烷的加入量需要确保形成的U形培养底不堵塞培养基交换孔(9)，并确保三维多电极阵列的金属丝电极伸出U形培养底0.15-0.2mm。
7.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于：所述干细胞的接种量为每个细胞培养腔接种2000-4000个细胞；
优选的，所述干细胞为人胚胎干细胞、人诱导多能干细胞、人成体干细胞中的至少一种。
8.一种神经组织或脑类器官-电极复合体芯片组件，其特征在于：包括细胞培养芯片元件(1)、模具元件(2)、电极固定元件(3)、外层绝缘的金属丝电极组(4)和底部元件(5)；
所述电极固定元件(3)和底部元件(5)为两块平行的平板，使用时，电极固定元件(3)和底部元件(5)围成容纳所述外层绝缘的金属丝电极组(4)的金属丝电极走线槽(11)；
所述电极固定元件(3)的顶部具有金属丝电极固定孔(12)，金属丝电极固定孔(12)与金属丝电极走线槽(11)连通；
所述外层绝缘的金属丝电极组(4)由若干条外层绝缘的金属丝电极组成；使用时，金属丝电极的一端从电极固定元件(3)顶部的金属丝电极固定孔(12)伸出；金属丝电极的另一端穿过所述金属丝电极走线槽(11)延伸出电极固定元件(3)和底部元件(5)，用于连接外部数据采集分析设备；
所述模具元件(2)为一平板，模具元件(2)上开设有若干个金属丝电极走线孔(10)；使用时，模具元件(2)叠放在所述电极固定元件(3)的顶部，金属丝电极从电极固定元件(3)的顶部伸出后，穿过所述金属丝电极走线孔(10)，伸出模具元件(2)，对伸出模具元件(2)的金属丝电极进行修剪，然后移除模具元件(2)，即获得三维多电极阵列；
所述细胞培养芯片元件(1)包括细胞培养腔(8)和培养基加液池(7)，细胞培养腔(8)用于细胞培养，培养基加液池(7)用于添加或者去除培养液；细胞培养腔(8)和培养基加液池(7)通过培养基交换孔(9)连通；使用时，细胞培养芯片元件(1)设置于所述电极固定元件(3)的顶部，并且，使得从电极固定元件(3)顶部伸出的三维多电极阵列伸入所述细胞培养腔(8)中，以便于神经组织或脑类器官的细胞包裹在三维多电极阵列上。
9.一种神经组织或脑类器官-电极复合体芯片，其特征在于：包括细胞培养芯片元件(1)、电极固定元件(3)、外层绝缘的金属丝电极组(4)和底部元件(5)；
所述电极固定元件(3)和底部元件(5)为两块平行的平板，电极固定元件(3)和底部元件(5)围成容纳所述外层绝缘的金属丝电极组(4)的金属丝电极走线槽(11)；
所述电极固定元件(3)的顶部具有金属丝电极固定孔(12)，金属丝电极固定孔(12)与金属丝电极走线槽(11)连通；
所述外层绝缘的金属丝电极组(4)由若干条外层绝缘的金属丝电极组成；金属丝电极的一端从电极固定元件(3)顶部的金属丝电极固定孔(12)伸出，形成三维多电极阵列；金属丝电极的另一端穿过所述金属丝电极走线槽(11)延伸出电极固定元件(3)和底部元件(5)，用于连接外部数据采集分析设备；
所述细胞培养芯片元件(1)包括细胞培养腔(8)和培养基加液池(7)，细胞培养腔(8)用于细胞培养，培养基加液池(7)用于添加或者去除培养液；细胞培养腔(8)和培养基加液池(7)通过培养基交换孔(9)连通；
所述细胞培养芯片元件(1)设置于所述电极固定元件(3)的顶部，并且，使得从电极固定元件(3)顶部伸出的三维多电极阵列伸入所述细胞培养腔(8)中，以便于神经组织或脑类器官的细胞包裹在三维多电极阵列上。
10.根据权利要求8所述神经组织或脑类器官-电极复合体芯片组件或权利要求9所述的神经组织或脑类器官-电极复合体芯片，其特征在于：所述细胞培养芯片元件(1)、电极固定元件(3)和底部元件(5)采用生物相容性材料制备；
优选的，所述生物相容性材料为聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、聚二甲基硅氧烷和玻璃中的至少一种。
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