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CN118812600A - 具有线粒体靶向且光动力活性的bodipy纳米光敏剂及其制备方法与应用 - Google Patents

具有线粒体靶向且光动力活性的bodipy纳米光敏剂及其制备方法与应用 Download PDF

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CN118812600A
CN118812600A CN202410836786.4A CN202410836786A CN118812600A CN 118812600 A CN118812600 A CN 118812600A CN 202410836786 A CN202410836786 A CN 202410836786A CN 118812600 A CN118812600 A CN 118812600A
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CN
China
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bodipy
mitochondrial targeting
nano
photosensitizer
photodynamic activity
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CN202410836786.4A
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林文孩
戚荟轩
李敏
钟志远
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Suzhou University
Original Assignee
Suzhou University
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Publication date
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Abstract

本发明公开了具有线粒体靶向且光动力活性的BODIPY纳米光敏剂，同时提供其制备方法与应用，属于生物医药技术领域。本发明开发的几种具有线粒体靶向功能的BODIPY光敏剂，在光照条件下可以高效产生活性氧，并有效作用于线粒体，从而杀死肿瘤细胞。不仅可以使用较低的药物浓度，也可以使用较低的光强和光照时间进行治疗。不会导致肿瘤产生药物耐受，副作用小，无刺激，在临床上拥有广阔的应用前景。

Description

具有线粒体靶向且光动力活性的BODIPY纳米光敏剂及其制备 方法与应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及到几种BODIPY纳米光敏剂的制备方法和应用，特别涉及到其在制备具有线粒体靶向能力的BODIPY光敏剂中的应用。通过靶向线粒体增强了对肿瘤细胞的光动力治疗效果。
背景技术
光动力治疗（Photodynamic Therapy，PDT）通过光敏剂与特定波长的光相互作用，产生活性氧(reactive oxygen species，ROS)并引发细胞损伤和死亡，从而达到治疗癌症、皮肤病、眼科疾病等多种疾病的目的。由于其定位精准、非侵入性和较小的副作用等优点，在临床实践中已经得到广泛应用。光动力治疗的三要素包括光敏剂、光源和活性氧，这些要素在光动力治疗中起着关键作用。然而，光动力治疗中活性氧寿命短的缺陷也是存在的。活性氧种或自由基具有很短的半衰期，即在形成后很快会失去活性。这意味着活性氧种或自由基的作用时间有限，且扩散距离有限，可能无法对所有目标细胞进行有效杀伤，从而影响治疗效果。此外，活性氧种或自由基具有一定的非特异性，可能会对周围正常组织造成损伤，增加了治疗的风险。因此，开发能够靶向特定细胞器（细胞膜、细胞核、内质网、溶酶体和线粒体）的光敏剂用于对抗肿瘤展现出了极大的应用潜力。
发明内容
为了解决现有技术存在的不足，本发明的主要目的在于提供几种具有线粒体靶向功能的BODIPY光敏剂，同时提供其制备方法与应用。得益于分子中的离域亲脂性阳离子结构，BODIPY衍生物能够在具有负电位的线粒体内膜上聚集，光照可产生大量ROS，使之能够应用于线粒体光动力治疗。解决了现有技术中BODIPY光敏剂水溶性不足的问题，同时具备了线粒体靶向能力并增强了其光动力效果。
本发明采用如下技术方案：
一种具有线粒体靶向且光动力活性的BODIPY纳米光敏剂，其化学结构式如下所示：
；
式中，R1为含磷的芳香基团或者杂环基团、含氮的芳香基团或者杂环基团、含氮的烷基；R2、R3独立的选自氢、含磷和氧的芳香基团或者杂环基团、含氮和氧的芳香基团或者杂环基团、含氮和氧的烷基；R4为氢或者烷基。
优选的，R1为以下基团中的一种：
；
其中，X为卤素，比如氯、溴、碘，n为1～20，优选1～11；
R2、R3独立的选自氢或以下基团中的一种：
；
其中，X为卤素，比如氯、溴、碘，m为1～20，优选2～12；
R4中，烷基的碳原子数为1～6，优选1～3，比如甲基。
本发明公开了上述具有线粒体靶向且光动力活性的BODIPY纳米光敏剂的制备方法，包括以下步骤：
（1）将化合物1、含磷的芳香或者杂环化合物反应后进行碘代反应，得到所述具有线粒体靶向且光动力活性的BODIPY纳米光敏剂；
（2）将化合物2、含氮的芳香或者杂环化合物反应，得到所述具有线粒体靶向且光动力活性的BODIPY纳米光敏剂；
（3）将化合物2、含氮的烷基化合物反应，得到所述具有线粒体靶向且光动力活性的BODIPY纳米光敏剂；
化合物1的化学结构式如下：
；
其中，X为卤素，n为1～20，优选2～12；
R5、R6独立的选自氢、卤代烷氧基；R4为氢或者烷基；
化合物2的化学结构式如下：
；
其中，X为卤素，n为1～20，优选2～12；
R5、R6独立的选自氢、卤代烷氧基；R4为氢或者烷基。
优选的，含磷的芳香化合物包括三苯基膦；含氮的杂环化合物包括1-甲基咪唑；含氮的烷基化合物包括三甲胺。
优选的，卤代烷氧基中，碳原子数为1～20；比如，卤代烷氧基如下：
；
其中，X为卤素，比如氯、溴、碘，n为1～20，优选2～12。
优选的，烷基中，碳原子数为1～6。
本发明公开了一种纳米制剂，包括上述具有线粒体靶向且光动力活性的BODIPY纳米光敏剂。
本发明公开了上述纳米制剂的制备方法，包括以下步骤，将上述具有线粒体靶向且光动力活性的BODIPY纳米光敏剂的有机溶液加入水中，得到纳米制剂。优选的，有机溶剂包括丙酮、四氢呋喃、甲醇、乙醇中的一种或几种。
本发明具有线粒体靶向且光动力活性的BODIPY纳米光敏剂具有离域亲脂性阳离子结构，作为示例，该BODIPY光敏剂为BDPI-TPP，BDPI-TMA，BDPI-IMA：
其中，BDPI-TPP的制备方法，步骤如下：将化合物1与三苯基膦反应，得到带正电的BODIPY光敏剂，再与N-碘代丁二酰亚胺反应，得到带正电的碘代BODIPY光敏剂BDPI-TPP；
BDPI-TMA和BDPI-IMA的制备方法，步骤如下：将化合物2分别与三甲胺和1-甲基咪唑反应，得到带正电的碘代BODIPY光敏剂BDPI-TMA、BDPI-IMA。
本发明纳米制剂中，具有线粒体靶向且光动力活性的BODIPY纳米光敏剂的终浓度为50～200µg/mL。
上述纳米制剂的制备方法，包括以下步骤：将具有线粒体靶向且光动力活性的BODIPY纳米光敏剂溶解在有机溶剂中，得到溶液，将溶液滴入超纯水，室温下搅拌至有机溶剂完全挥发，得到的溶液即为纳米制剂。
本发明中，具有线粒体靶向且光动力活性的BODIPY纳米光敏剂的有机溶液中，有机溶剂为丙酮、四氢呋喃、甲醇或乙醇；具有线粒体靶向且光动力活性的BODIPY纳米光敏剂的浓度为0.2～2mg/mL；有机溶液和超纯水的体积比为1∶（2～10）。
本发明公开了具有线粒体靶向且光动力活性的BODIPY纳米光敏剂或者纳米制剂在制备具有线粒体靶向功能的光敏剂中的应用。
本发明具有线粒体靶向且光动力活性的BODIPY纳米光敏剂或纳米制剂在制备具有线粒体靶向功能的光敏剂中的应用时，可对多种细胞系的线粒体进行靶向，具有普适性，还可以靶向线粒体，通过光动力治疗进行抗肿瘤治疗，具有普适性。具体的，所述多种细胞系包括但不限于Hela细胞、4T1细胞、B16-F10细胞。
本发明公开了一种线粒体靶向试剂，包括上述具有线粒体靶向且光动力活性的BODIPY纳米光敏剂或者上述纳米制剂。
本发明公开了上述具有线粒体靶向且光动力活性的BODIPY纳米光敏剂或者上述纳米制剂在制备线粒体靶向试剂中的应用。
本发明公开了上述具有线粒体靶向且光动力活性的BODIPY纳米光敏剂或者上述纳米制剂在制备光动力治疗药物的应用。其中，光动力治疗药物包括治疗癌症、皮肤病、眼科疾病等多种疾病的药物。
优选的是所述应用至少包括以下一项：
（1）所述具有离域亲脂性阳离子结构的BODIPY光敏剂或纳米制剂在对多种细胞系线粒体进行靶向中的应用；
（2）所述具有离域亲脂性阳离子结构的BODIPY光敏剂或纳米制剂在通过光动力治疗对抗肿瘤中的应用；
优选的是，可对多种细胞系线粒体进行靶向及光动力治疗，具有普适性。线粒体作为细胞内的“动力车间”，是细胞有氧呼吸的主要场所，负责产生绝大多数的ATP，为细胞内的各种生命活动供给能量。同时，线粒体也是大部分ROS的产生场所，在调节细胞内氧化还原稳态、细胞凋亡和坏死等过程中起重要作用。当线粒体中ROS过表达时，会引起线粒体氧化应激，进而导致线粒体功能障碍，杀伤细胞。线粒体是由双层膜结构包被形成的细胞器，其自身结构具有突出特点。电子传递链在线粒体内膜上进行，使得膜两侧质子（H+）和其他离子具有不对称性，所以拥有不同于其他细胞器的膜负电位。因此，线粒体是PDT的理想靶标细胞器，可以产生大量ROS导致线粒体功能障碍，进而引发细胞凋亡等过程。
优选的是，所述多种细胞系包括但不限于Hela细胞、4T1细胞、B16-F10细胞等。
有益效果：
1.本发明中使用的BODIPY光敏剂结构简单，合成容易，生产成本低。
2.本发明开发的几种具有线粒体靶向功能的BODIPY光敏剂，荧光量子产率较低，单线态氧量子产量较高。这有益于他们作为光敏剂进行PDT。不仅可以使用较低的药物浓度，也可以使用较低的光强和光照时间进行治疗，病人的耐受性和顺应性均较好。
3. 本发明开发的几种具有线粒体靶向功能的BODIPY光敏剂在光照条件下可以高效产生活性氧，并有效作用于线粒体，从而选择性地杀死肿瘤细胞。不会导致肿瘤产生药物耐受，副作用小，无刺激，在临床上拥有广阔的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1中，A、B分别为实施例中BDPI-TPP、BDPI-TMA的核磁共振氢谱。
图2中，A、B分别为实施例中BDPI-IMA的核磁共振氢谱、BDPI-IMA的质谱。
图3中，A-F分别示出了BODIPY光敏剂及其纳米制剂的吸收光谱和荧光光谱。
图4中，A 和B 分别示出了BDPI光敏剂及其纳米制剂在溶液中活性氧的产生情况，C示出了BDP光敏剂在溶液中活性氧的产生情况。
图5中，示出了BODIPY在黑暗以及光照下细胞内活性氧的产生情况。
图6中，示出了BODIPY(5µM)和商业染料Mito-Tracker对Hela细胞共染色的CLSM图像。
图7中，示出了BODIPY在光照下对线粒体膜电位的影响。
图8中，示出了不同BODIPY浓度对Hela细胞的活力影响结果。
图9中，示出了不同BODIPY浓度对4T1细胞活力影响结果。
图10中，示出了不同BODIPY浓度对B16-F10细胞的活力影响结果。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面将结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，但是本领域技术人员将会理解，下列所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供具有线粒体靶向功能的BODIPY光敏剂，结构式如下：
；
式中，R1为含磷的芳香基团或者杂环基团、含氮的芳香基团或者杂环基团、含氮的烷基；R2、R3独立的选自氢、含磷和氧的芳香基团或者杂环基团、含氮和氧的芳香基团或者杂环基团、含氮和氧的烷基；R4为氢或者烷基。
优选的，R1为以下基团中的一种：
；
其中，X为卤素，比如氯、溴、碘，n为1～20，优选1～11；
R2、R3独立的选自氢或以下基团中的一种：
；
其中，X为卤素，比如氯、溴、碘，m为1～20，优选2～12；
R4中，烷基的碳原子数为1～6，优选1～3。
优选的，所述具有线粒体靶向功能的BODIPY光敏剂的结构式为BDPI-TPP或BDPI-TMA或BDPI-IMA：
本发明将化合物1与三苯基膦反应，得到带正电的BODIPY光敏剂，再与N-碘代丁二酰亚胺反应，得到带正电的碘代BODIPY光敏剂BDPI-TPP；优选的，反应溶剂为乙腈。
本发明将化合物2分别与三甲胺和1-甲基咪唑反应，得到带正电的BODIPY光敏剂BDPI-TMA和BDPI-IMA；优选的，BDPI-TMA制备反应的溶剂为乙醇，BDPI-IMA制备反应的溶剂为乙腈。
所述化合物1的结构式如下：
；
所述化合物2的结构式如下：
；
其中，X为卤素，n为1～20，优选2～12；
R5、R6独立的选自氢、卤代烷氧基；R4为氢或者烷基。
优选的，含磷的芳香化合物包括三苯基膦；含氮的杂环化合物包括1-甲基咪唑；含氮的烷基化合物包括三甲胺。
优选的，卤代烷氧基中，碳原子数为1～20；比如，卤代烷氧基如下：
其中，X为卤素，比如氯、溴、碘，n为1～20，优选2～12。
优选的，烷基中，碳原子数为1～6。
本发明还提供含有上述具有线粒体靶向功能的BODIPY光敏剂的纳米制剂。
优选的，所述纳米制剂中，具有线粒体靶向功能的BODIPY光敏剂的终浓度为50-200µg/mL。
本发明还提供上述纳米制剂的制备方法，步骤如下：将具有线粒体靶向功能的BODIPY光敏剂溶解在有机溶剂中，得到溶液，将溶液滴入超纯水，室温下搅拌至有机溶剂完全挥发，得到的溶液即为纳米制剂。
优选的，有机溶剂为丙酮、四氢呋喃、甲醇或乙醇；有机溶液中，具有线粒体靶向功能的BODIPY光敏剂的浓度为0.2~2mg/mL；有机溶液和超纯水的体积比为1：（2~10）。
本发明还提供上述具有线粒体靶向功能的BODIPY光敏剂在制备具有线粒体靶向功能的光敏剂中的应用。
本发明的具有离域亲脂性阳离子结构的BODIPY光敏剂通过简单的化学反应制得，通过在BODIPY结构中引入离域亲脂性阳离子结构，赋予其线粒体靶向能力。
具体的，结构式为BDPI-TPP的具有离域亲脂性阳离子结构BODIPY光敏剂的制备方法，步骤如下：将化合物1与三苯基膦反应，得到带正电的BODIPY光敏剂，再与N-碘代丁二酰亚胺反应，得到带正电的碘代BODIPY光敏剂。
结构式为BDPI-TMA和BDPI-IMA的具有离域亲脂性阳离子结构的BODIPY光敏剂的制备方法，步骤如下：将化合物2分别与三甲胺和1-甲基咪唑反应，得到带正电的BODIPY光敏剂。
本发明的具有离域亲脂性阳离子结构BODIPY光敏剂的纳米制剂；优选纳米制剂中，具有离域亲脂性阳离子结构的BODIPY光敏剂的终浓度为50-200µg/mL。
本发明的纳米制剂的制备方法，步骤如下：将具有离域亲脂性阳离子结构的BODIPY光敏剂溶解在有机溶剂中，得到溶液，将溶液以滴入超纯水，室温下搅拌至有机溶剂完全挥发，得到的溶液即为纳米制剂。优选有机溶剂为丙酮、四氢呋喃、甲醇或乙醇；有机溶液中，具有离域亲脂性阳离子结构的BODIPY光敏剂的浓度为0.2~2mg/mL；有机溶液和超纯水的体积比为1：（2~10）。
本发明的具有离域亲脂性阳离子结构的BODIPY光敏剂与其纳米制剂在制备具有线粒体靶向功能的光敏剂中的应用。应用包括但不限于（1）所述具有离域亲脂性阳离子结构的BODIPY光敏剂或纳米制剂在对多种细胞系线粒体进行靶向中的应用；（2）所述具有离域亲脂性阳离子结构的BODIPY光敏剂或纳米制剂在通过光动力治疗对抗肿瘤中的应用。
本发明的具有离域亲脂性阳离子结构的BODIPY光敏剂与其纳米制剂可对多种细胞系线粒体进行靶向及光动力治疗，具有普适性。具体的细胞系包括但不限于Hela细胞、4T1细胞、B16-F10细胞等。
在本发明中所使用的术语，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义，除非另有说明。为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面将结合实施例对本发明作进一步的详细介绍。
在以下实施例中，未详尽描述的各种过程以及测试是本领域中公知的常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、装置、仪器、设备等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
以下结合实施例进一步说明本发明。
实施例1 BDPI-TPP的合成
将BDP-Br（151mg,0.3mmol）和三苯基膦（105mg.0.4mmol）加入圆底烧瓶中，15mL乙腈溶解，氮气氛围下85℃回流24h。除去溶剂，硅胶柱层析纯化，所得化合物即为BDP-TPP。
将BDP-TPP（38mg,0.05mmol）和N-碘代丁二酰亚胺（NIS,45mg,0.2mmol）加入圆底烧瓶中，加入15mL二氯甲烷，室温反应6小时。反应结束后，以二氯甲烷和乙醇作为洗脱剂，硅胶柱层析提纯，得到产物BDPI-TPP，收率36%。
具体合成路线如下所示：
实施例2 BDPI-TPP纳米制剂的制备
将实施例1制备得BDPI-TPP（1mg）溶解于5mL丙酮中，将溶液在搅拌条件下滴入10mL超纯水，室温搅拌8h，有机溶剂完全挥发，所得溶液即为BDPI-TPP的纳米制剂BDPI-TPPNPs。
对比例1
将实施例1制备的BDP-TPP（1mg）溶解于5mL丙酮中，将溶液在搅拌条件下滴入10mL超纯水，室温搅拌8h，有机溶剂完全挥发，所得溶液即为BDP纳米制剂BDP-TPP NPs。
实施例3 BDPI-TMA的合成
将BDP-Br（503.2mg,1mmol）和N-碘代丁二酰亚胺（NIS,89.9mg,4mmol）加入圆底烧瓶中，加入15mL二氯甲烷，室温反应6小时。反应结束后，用饱和食盐水洗涤，并用无水NaSO4干燥，然后抽滤，得滤液。减压蒸馏除去溶剂。最后经硅胶柱层析提纯，得到产物BDPI-Br。
将BDPI-Br（113mg,0.15mmol）加入圆底烧瓶中，20mL乙醇溶解，室温搅拌下加入三甲胺（0.1mL,0.3mmol），60℃回流24h。反应结束后，除去溶剂，乙醚沉降，得到产物，即为BDPI-TMA。收率39%。
具体合成路线如下所示：
实施例4 BDPI-TMA纳米制剂的制备
将实施例3制备的BDPI-TMA（1mg）溶解于5mL丙酮中，将溶液在搅拌条件下滴入10mL超纯水，室温搅拌8h至有机溶剂完全挥发，所得溶液即为BDPI-TMA的纳米制剂BDPI-TMA NPs。
对比例2
将BDP-Br（76mg,0.15mmol）加入圆底烧瓶中，20mL乙醇溶解，室温搅拌下加入三甲胺（0.1mL,0.3mmol），80℃回流12h。反应结束后，除去溶剂，乙醚沉降，得到产物，即为BDP-TMA。
将制备的BDP-TMA（1mg）溶解于5mL丙酮中，将溶液在搅拌条件下滴入10mL超纯水，室温搅拌8h至有机溶剂完全挥发，所得溶液即为BDP-TMA的纳米制剂BDP-TMA NPs。
实施例5 BDPI-IMA的合成
将BDPI-Br（226.5mg,0.3mmol）和1-甲基咪唑（0.24mL,3mmol）加入圆底烧瓶中，45mL乙腈溶解，氮气氛围下85℃回流12h。除去溶剂，柱层析得化合物BDPI-IMA。收率65%。
具体合成路线如下所示：
实施例6 BDPI-IMA纳米制剂的制备
将实施例3制备的BDPI-IMA（1mg）溶解于5mL丙酮中，将溶液在搅拌条件下滴入10mL超纯水，室温搅拌8h至有机溶剂完全挥发，所得溶液即为BDPI-IMA的纳米制剂BDPI-IMA NPs。
对比例3
将BDP-Br（151mg,0.3mmol）和1-甲基咪唑（0.24mL,3mmol）加入圆底烧瓶中，45mL乙腈溶解，氮气氛围下85℃回流24h。除去溶剂，柱层析得化合物BDP-IMA。
将制备的BDP-IMA（1mg）溶解于5mL丙酮中，将溶液在搅拌条件下滴入10mL超纯水，室温搅拌8h至有机溶剂完全挥发，所得溶液即为BDP-IMA的纳米制剂BDP-IMA NPs。
测试表征
对实施例1制备的BDPI-TPP、实施例3制备的BDPI-TMA和实施例5制备的BDPI-IMA进行核磁分析，对BDPI-IMA进行质谱分析。通过核磁共振氢谱和质谱测试证明了BDPI-TPP（图1中A）、BDPI-TMA（图1中B）和BDPI-IMA（图2中A、B）的结构和纯度。
实施例7 光物理性质检测
检测BODIPY光敏剂在DMSO中以及对应纳米制剂在水中的吸收光谱和发射光谱。结果如图3所示，可以看出，BODIPY光敏剂在DMSO中吸收波长在501nm，发射波长在560nm左右。表1收集了BODIPY光敏剂的最大吸收波长和发射波长，斯托克斯位移以及相应的荧光量子产率（φ）和纳米制剂的单线态氧量子产率（Φ）。
表1 不同BODIPY光敏剂的光物理性质
其中，λabs＝吸收光谱峰值；λem＝荧光光谱峰值；Stokes shift=斯托克斯位移；φ＝荧光量子产率，以罗丹明6G作为参比；Φ=单线态氧量子产率，以二氯甲烷中亚甲基蓝（MB）作为参比。
实施例8 活性氧检测
通过对1,3-二苯基异苯并呋喃(DPBF)吸光度的变化来检测BODIPY光敏剂及其纳米粒子体外产生活性氧的能力。以DPBF作为探针分子，通过检测DPBF的荧光猝灭来确定BODIPY光敏剂的活性氧产生能力。将DPBF的二甲基亚砜（DMSO）溶液加入到BODIPY溶液中，并以DMSO中的DPBF作为对照。混合溶液用绿光（10 mW/cm2）照射70s，每隔10s测量一次混合溶液的吸收光谱。用同样的方法测试BODIPY纳米制剂体外产生活性氧的能力。如图4所示，结果表明，BODIPY光敏剂都能高效地产生活性氧，其中BDPI-IMA的性能最出色，相同时间内活性氧的产生量是其他光敏剂的2倍以上。而图4C可见，相同浓度及测试条件下，不含碘化合物仅显示出可忽略不计的活性氧生成能力。
实施例9 细胞内活性氧检测
为了测定细胞内活性氧产生以及对癌细胞的抑制情况。首先选用DCFH-DA探针进行ROS测定。选择Hela细胞以10万细胞/mL铺板，37℃孵育过夜后给药（1 µg/mL），共同孵育30分钟，在避光的环境下加入新鲜配置的DCFH-DA探针溶液，置于培养箱37℃下共同孵育30分钟。然后置于黑暗或者绿光下照射3分钟。最后，通过激光共聚焦显微镜成像。实验结果如图5所示，不同的BODIPY光敏剂均能产生活性氧，且BDPI-IMA组的荧光亮度显著高于其他组，说明BDPI-IMA具备更强的活性氧产生能力，同溶液中的检测结果相吻合。
实施例10 线粒体靶向实验
选择Hela细胞以10万细胞/mL铺板，37℃孵育过夜后给药（5 µg/mL），共同孵育30分钟后去除培养液，加入新鲜配置的含Mito-Tracker（线粒体荧光探针）的培养基，共孵育25分钟后通过激光共聚焦显微镜成像。如图6所示。在BODIPY的绿色荧光区域，线粒体结构清晰可见，表明BODIPY定位于活细胞的线粒体。皮尔逊相关系数表示两个变量之间的线性依赖程度，用于量化BODIPY和市售Mito-Tracker之间的染色区域重叠。可以看出，两种不同通道的荧光信号几乎完全重叠，皮尔逊相关系数均达90%以上。
实施例11 线粒体膜电位检测
为了确定BODIPY光敏剂对细胞线粒体功能的影响，选择JC-1荧光探针对线粒体膜电位进行了检测。选择Hela细胞以10万细胞/mL铺板，37℃孵育过夜后给药（1 µg/mL），共同孵育30分钟，绿光下照射7分钟，随后用JC-1进行染色，再通过激光共聚焦显微镜成像。实验结果如图7所示，BODIPY光敏剂处理后的细胞中JC-1均从红色荧光转变为绿色荧光，说明线粒体膜电位均出现下降。因此，BODIPY光敏剂能有效引发线粒体功能障碍，并导致早期的细胞凋亡。
实施例12 细胞毒性实验
使用MTT检测方法评估了BODIPY的对不同细胞系的细胞毒性，见图8、图9以及图10。分别示出了不同BODIPY浓度对Hela细胞、4T1细胞、B16-F10细胞的活力影响结果。在96孔板中以3000细胞/孔铺板，37℃孵育过夜后向培养液中加入不同浓度的BODIPY的纳米制剂。黑暗组在保持黑暗条件下孵育24小时后检测细胞活力；光照组孵育18小时后，用绿光（10mW/cm2）照射25min，继续孵育4小时后检测细胞活力。结果表明，黑暗组细胞活力无明显变化，细胞存活率均可达80%以上；光照组有明显PDT效果，细胞活力随BODIPY光敏剂的浓度增加而梯度下降。表2收集了BODIPY光敏剂对不同细胞系的半抑制浓度（IC50）。不含碘的化合物BDP NPs即使在大浓度下，也未表现出明显的细胞毒性，不具有光动力活性。
表2 BODIPY光敏剂对不同细胞系的半抑制浓度（IC50）。
其中，BDP NPs指BDP-TPP NPs、BDP-TMA NPs和BDP-IMA NPs，不含碘化合物的纳米制剂BDP NPs即使在大浓度下，也未表现出明显的细胞毒性，不具有光动力活性。
目前为止，有基于有机荧光团开发出来的线粒体靶向试剂，如花菁、罗丹明和香豆素等。其中，花菁染料光稳定性差，其应用受到极大的阻碍；罗丹明染料疏水性强，且光谱调制困难；香豆素衍生物通常吸收和发射波长较短，导致其组织穿透性差，同时存在潜在的生物毒性。相比之下，本发明的提供的BODIPY衍生物不仅解决了以上问题，且与同类线粒体特异性探针相比，同时具备更出色的线粒体靶向能力和光动力活性，
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种具有线粒体靶向且光动力活性的BODIPY纳米光敏剂，其特征在于，所述具有线粒体靶向且光动力活性的BODIPY纳米光敏剂的化学结构式如下所示：
；
R1为含磷的芳香基团或者杂环基团、含氮的芳香基团或者杂环基团、含氮的烷基；R2、R3独立的选自氢、含磷和氧的芳香基团或者杂环基团、含氮和氧的芳香基团或者杂环基团、含氮和氧的烷基；R4为氢或者烷基。
2.根据权利要求1所述具有线粒体靶向且光动力活性的BODIPY纳米光敏剂，其特征在于，R1为以下基团中的一种：
；
其中，X为卤素，n为1～20；
R2、R3独立的选自氢或以下基团中的一种：
；
其中，X为卤素，m为1～20；
R4中，烷基的碳原子数为1～6。
3.权利要求1所述具有线粒体靶向且光动力活性的BODIPY纳米光敏剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将化合物1、含磷的芳香或者杂环化合物反应后进行碘代反应，得到所述具有线粒体靶向且光动力活性的BODIPY纳米光敏剂；
（2）将化合物2、含氮的芳香或者杂环化合物反应，得到所述具有线粒体靶向且光动力活性的BODIPY纳米光敏剂；
（3）将化合物2、含氮的烷基化合物反应，得到所述具有线粒体靶向且光动力活性的BODIPY纳米光敏剂；
化合物1的化学结构式如下：
；
其中，X为卤素，n为1～20；
R5、R6独立的选自氢、卤代烷氧基；R4为氢或者烷基；
化合物2的化学结构式如下：
；
其中，X为卤素，n为1～20；
R5、R6独立的选自氢、卤代烷氧基；R4为氢或者烷基。
4.根据权利要求3所述具有线粒体靶向且光动力活性的BODIPY纳米光敏剂的制备方法，其特征在于，含磷的芳香化合物包括三苯基膦；含氮的杂环化合物包括1-甲基咪唑；含氮的烷基化合物包括三甲胺；卤代烷氧基中，碳原子数为1～20；烷基中，碳原子数为1～6。
5.一种纳米制剂，其特征在于，包括权利要求1所述具有线粒体靶向且光动力活性的BODIPY纳米光敏剂。
6.权利要求5所述纳米制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤，将权利要求1所述具有线粒体靶向且光动力活性的BODIPY纳米光敏剂的有机溶液加入水中，得到纳米制剂。
7.根据权利要求6所述纳米制剂的制备方法，其特征在于，有机溶剂包括丙酮、四氢呋喃、甲醇、乙醇中的一种或几种。
8.一种线粒体靶向试剂，包括权利要求1所述具有线粒体靶向且光动力活性的BODIPY纳米光敏剂或者权利要求5所述纳米制剂。
9.权利要求1所述具有线粒体靶向且光动力活性的BODIPY纳米光敏剂或者权利要求5所述纳米制剂在制备线粒体靶向试剂中的应用。
10.权利要求1所述具有线粒体靶向且光动力活性的BODIPY纳米光敏剂或者权利要求5所述纳米制剂在制备光动力治疗药物的应用。
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