CN118817928A

CN118817928A - 基于wcx固相萃取同时高灵敏度检测褪黑素和极性生物碱类化合物的方法

Info

Publication number: CN118817928A
Application number: CN202411137249.7A
Authority: CN
Inventors: 谭晓杰; 张翠萍; 季兆东; 张元媛; 耿佳欣
Original assignee: Yujing Technology Shanghai Co ltd
Current assignee: Yujing Technology Shanghai Co ltd
Priority date: 2024-08-19
Filing date: 2024-08-19
Publication date: 2024-10-22
Anticipated expiration: 2044-08-19
Also published as: CN118817928B

Abstract

本发明公开了一种基于WCX固相萃取同时高灵敏度检测褪黑素和极性生物碱类化合物的方法；包括取血浆或血清样品，加入内标溶液、醋酸铵水溶液，混匀离心取上清液；上样于WCX的SPE板；加入醋酸铵水溶液淋洗；加入酸性洗脱液洗脱，氮气下吹干；加入2％甲酸水溶液复溶，进行LC‑MS分析；以及基于标曲法计算各检测对象的含量。本发明选择同时带有C18基质特点和阳离子交换基质的WCX SPE板，通过富集流程和特定试剂的设计，综合利用每个化合物的性质，使其都能被高效吸附、富集和纯化；在实现同时检测褪黑素、胆碱、血清素、多巴胺的同时，达到了非常高的灵敏度，具体为褪黑素0.25pg/mL、胆碱2.5ng/mL、血清素0.25ng/mL、多巴胺2.5pg/mL。

Description

基于WCX固相萃取同时高灵敏度检测褪黑素和极性生物碱类化合物的方法

技术领域

本发明属于生物标记物检测技术领域，涉及一种基于WCX固相萃取的高灵敏度检测方法，具体涉及一种基于WCX固相萃取同时高灵敏度检测褪黑素和极性生物碱类化合物的方法。

背景技术

褪黑素(Melatonin)和极性生物碱类化合物，包括但不仅限于胆碱(Choline)、血清素(Serotonin)、多巴胺(Dopamine)是神经体系里非常重要的化合物。这些化合物在神经系统中发挥着关键作用，各自调控不同的生理和心理过程。褪黑素(Melatonin)是由松果体分泌的一种激素，主要负责调节睡眠-觉醒周期。它在调节昼夜节律和促进睡眠方面起着重要作用。此外，褪黑素还具有抗氧化、免疫调节和抗炎作用。极性生物碱类化合物，以胆碱，血清素和多巴胺为例，胆碱(Choline)在生物学上具有重要意义，特别是在神经递质合成方面。它是乙酰胆碱(Acetylcholine)的直接前体。乙酰胆碱是一种关键的神经递质，在神经系统中传递信号，大脑和神经系统中起着重要作用，参与调节学习、记忆和肌肉控制，有助于维持正常的神经功能，缺乏胆碱可能导致神经系统功能障碍。血清素(Serotonin)是一种神经递质，主要存在于中枢神经系统和肠道中。它在情绪调节、食欲、消化、睡眠和社会行为中扮演重要角色。低水平的血清素与抑郁症、焦虑症和其他情绪障碍有关。多巴胺(Dopamine)是一种重要的神经递质，涉及运动控制、动机和奖励机制。它在中枢神经系统的许多功能中发挥关键作用，如运动调节、情绪控制、注意力和学习。多巴胺水平的异常与帕金森病、精神分裂症和成瘾行为有关。同时检测褪黑素和极性生物碱类化合物，包括但不仅限于胆碱、血清素、多巴胺可以提供全面的神经化学状态信息，有助于：1)综合诊断：通过综合分析多个神经递质水平，帮助诊断神经系统疾病，如抑郁症、焦虑症、帕金森病等。2)精准治疗：监测多个神经递质的变化，优化药物治疗方案，提高治疗效果。3)生物标志物发现：多参数检测可以发现新的生物标志物，用于早期诊断和预后评估。

同时检测这些神经相关的化合物面临多个技术挑战：1)除了褪黑素，其他极性生物碱类化合物，包括但不仅限于胆碱、血清素、多巴胺的Log P都很小甚至是负数，特别是胆碱，Log P非常低，这些化合物都不能被C18基质的SPE所萃取。但是褪黑素的富集方法所有的公开报道均是采用C18基质的SPE方法，例如HLB、C18、RP-C8、ODS等等，虽然名称不同，但都是C18基质原理的SPE方法。而血清素、多巴胺的SP E方法，多采用WCX(Weak CationExchange，弱阳离子交换)或者强阳离子交换(SCX,Strong Cation Exchange，强阳离子交换)基质的SPE方法，因为血清素、多巴胺的极性太强，不能被C18基质的SPE所保留。胆碱更加特殊，胆碱是季铵盐，在任何pH值下都是正离子状态，胆碱的强极性使其很难保留在C18的SPE板上，同时有很难从阳离子的SPE板子上洗脱下来。2)褪黑素和极性生物碱类化合物，包括但不仅限于胆碱、血清素、多巴胺这些化合物在体内的含量都很低，对检测灵敏度的要求很高，以褪黑素为例，健康人在白天褪黑素的最低浓度达到了2pg/mL以下，因此检测技术必须要能够至少测定到2pg/mL以下的浓度才能满足临床检测的要求，否则就会出现大量的人群血浆中褪黑素不能检出的情况，健康人都不能检出，特殊的病人褪黑素的含量会更低，那就更不能判断，因此不能满足检测的要求，考虑到病人的话，褪黑素的检测限应该越低越好。胆碱、血清素、多巴胺也有类似的问题存在，神经递质因为其生物学特性的特殊性，对检测的灵敏度要求很高，之前的方法很难达到检测要求，因为其实际应用没有开展；3)褪黑素、胆碱、血清素、组胺、多巴胺这些化合物是最关键的指标，临床上要求一起检测。其实单独检测这些化合物是容易的，如果可以单独检测这些化合物，实际上每种化合物都可以挑选最适合他们的方法，以提高灵敏度为目标进行大量的针对性的优化。但是遗憾的是，这是不现实的，如果单独检测这些化合物，就会造成临床报告时间“TAT”大大增加，"TAT"(Turnaround Time)表示从收到样本到发出报告所需的时间，这些化合物的TAT要求很高，因为这些化合物在体内变化很快，必须要尽快检测，多次检测完全不能满足临床TAT的要求。

除了褪黑素以外，其他化合物的LogP都很低甚至是负值，这样的特点决定了他们不能被C18基质的SPE所萃取。

化合物	Log P值
		褪黑素(Melatonin)	1.48
胆碱(Choline)	-2.17
		血清素(Serotonin)	-0.36
多巴胺(Dopamine)	-0.61

。

褪黑素、胆碱、血清素、多巴胺结构式如下：

有报道采用C18基质的SPE板来测定褪黑素的报道，也有采用WCX用来测定多巴胺的报道，但是把褪黑素放在一起，和生物胺类化合物如血清素、多巴胺等一起，采用WCX的SPE板进行一起富集和纯化的方法，从来未见公开报道，进一步，把褪黑素和胆碱一起实现高灵敏度检测也未见公开报道。本发明申请解决了采用同一类型的SPE板，在纯化富集血清素、和多巴胺等生物胺类化合物的同时，同时富集胆碱，同时纯化富集褪黑素的难题，实现了褪黑素与“胆碱、血清素、多巴胺等极性生物碱类化合物”在一锅中进行检测。

另外，这些化合物在体内的含量很低，因此对检测的灵敏度要求很高，例如多巴胺的健康人水平是在27pg/mL以下，很多人都在10pg/mL上下，因此多巴胺的检测灵敏度必须达到10pg/mL以下，进一步，褪黑素在健康人体内含量很低，很多人都在2pg/mL以下，因此至少需要检测到1pg/mL以下的浓度才能满足临床的要求。因此在同时检测的同时，需要达到很高的灵敏度，才能满足临床的需要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于WCX固相萃取同时高灵敏度检测褪黑素、胆碱、血清素和多巴胺的方法。本发明通过流程的设计实现了褪黑素、胆碱、血清素、和多巴胺的高灵敏度的同时检测，实现了褪黑素0.25pg/mL、胆碱2.5ng/mL、血清素0.25ng/mL、多巴胺2.5pg/mL的检测灵敏度。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

本发明提供一种基于WCX固相萃取同时高灵敏度检测褪黑素和极性生物碱类化合物的方法，所述方法包括如下步骤：

S1、取血浆或血清样品，加入内标溶液、醋酸铵水溶液，混匀离心取上清液；

S2、所述上清液上样于WCX的SPE板；

S3、加入醋酸铵水溶液淋洗；

S4、加入酸性洗脱液洗脱，氮气下吹干；

S5、加入2％-5％(体积比)甲酸水溶液复溶，进行LC-MS分析；

S6、基于标准曲线法计算样品中褪黑素和极性生物碱类化合物的含量。

作为本发明的一个实施方案，所述极性生物碱类化合物LogP≦1.0。

作为本发明的一个实施方案，所述极性生物碱类化合物包括胆碱、血清素、多巴胺、γ-氨基丁酸、谷氨酰胺、5-羟基吲哚-3-乙酸、左旋多巴、犬尿氨酸、色胺、谷氨酸、色氨酸中至少一种。

作为本发明的一个实施方案，所述极性生物碱类化合物为胆碱、血清素、多巴胺。

作为本发明的一个实施方案，所述内标溶液中内标为褪黑素和极性生物碱类化合物的同位素内标。

作为本发明的一个实施方案，样品和内标溶液的体积比为100-200:10。在一些实施示例中，内标溶液中使用褪黑素、胆碱、血清素和多巴胺的同位素内标，浓度分别为0.05ng/mL、1500ng/mL、1.5ng/mL、0.5ng/mL。

作为本发明的一个实施方案，所述醋酸铵水溶液浓度为20-60mM，

和/或，所述酸性洗脱液为5％-10％(体积比)甲酸乙腈溶液。

作为本发明的一个实施方案，步骤S1、S3中，所述样品与醋酸铵水溶液的体积比为100-200:100-400；

和/或，样品与酸性洗脱液的体积比为100-200:100-200。

作为本发明的一个实施方案，步骤S1中，混匀离心是涡旋混匀(转速1000-1500转)，高速离心(14,000rpm，4℃)。

作为本发明的一个实施方案，步骤S5中，复溶溶剂的甲酸浓度为2％-5％(体积比)；

和/或，样品与甲酸水溶液(2％-5％，体积比)的体积比为100-200:30-60。

作为本发明的一个实施方案，所述WCX的SPE板为同时带有C18基质特点和阳离子交换基质的WCX SPE板。

在一些实施示例中，上样180-600微升于WCX SPE板。

作为本发明的一个实施方案，LC-MS分析时，液相条件如下：

色谱条件：

色谱柱：BEH C18色谱柱

流动相A相：甲醇

流动相B相：0.1％甲酸水溶液

梯度条件：

时间/分钟	A相/％	B相/％	梯度曲线
				0	98	2	/
5	5	95	6
				6	5	95	1
7	98	2	1

和/或，质谱条件如下：

作为本发明的一个实施方案，步骤S6中，标准曲线法对应褪黑素的线性回归方程为Y＝94.89x+0.017；

和/或，血清素的线性回归方程为y＝0.0512x-0.0012；

和/或，胆碱的线性回归方程为y＝0.00397x+0.25；

和/或，多巴胺的线性回归方程为y＝0.00090x+5.74×10^-5。

本发明在具体实施方式中仅选择了褪黑素、胆碱、血清素、多巴胺作为例子，需要说明的是，发明WCX固相萃取用于高灵敏度同时检测该类型化合物的方法，一样的方法可以用于其他神经递质类化合物的检测，包括但不限于γ-氨基丁酸、谷氨酰胺、5-羟基吲哚-3-乙酸、左旋多巴、犬尿氨酸、色胺、谷氨酸、色氨酸等，技术的核心是实现了褪黑素和其他的这些高极性化合物的高灵敏度同时分析。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1)选择同时带有C18基质特点和阳离子交换基质的WCX SPE板，结合特定pH调节溶液，替换传统的C18基质的SPE板和阳离子交换板，综合利用每个化合物的性质，使每个化合物都能被吸附在SPE板上。实现了在特定的SPE上结合pH调节溶剂保留住褪黑素和“血清素、多巴胺等极性的生物碱”。

2)改变了传统的WCX SPE纯化和富集步骤，传统的WCX SPE纯化和富集步骤如下：甲醇和水活化、加入淋洗剂(WASH，碱性溶液，通常为稀氨水溶液)，加入洗脱剂1(Elute1,100％甲醇或者乙腈)，加入洗脱剂2(Elute 2,酸性有机溶液，通常为含有甲酸的甲醇溶液)。本发明首先选择了合适的淋洗剂，采用醋酸铵水溶液代替了稀氨水水溶液，然后跳过了洗脱剂1，直接进入了洗脱剂2。通过试剂和步骤的改变，使得褪黑素、胆碱、血清素、多巴胺能够很好的保留在SPE板上，而其他的干扰成分能够有效地去除，最终使褪黑素、胆碱、血清素、多巴胺获得最高的灵敏度。

3)选择了酸性的复溶剂(如，含有2％-5％甲酸的水溶液)，最大程度的增加了化合物的响应。

4)本发明实现了一锅法检测褪黑素、胆碱、血清素、多巴胺，褪黑素与“胆碱、血清素、多巴胺等极性生物碱类化合物”在一锅中进行检测的方法从来未见报道，更进一步，在实现同时检测褪黑素、胆碱、血清素、多巴胺的同时，还达到了非常高的灵敏度，具体为褪黑素0.25pg/mL、胆碱2.5ng/mL、血清素0.25ng/mL、多巴胺2.5pg/mL这样的灵敏度从来未见报道。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为本发明对的方法中采用C18的SPE板萃取对应的多巴胺的色谱图；

图2为不同pH值调节剂对于多巴胺的效果对比图；

图3为不同洗脱液成分配比和不同的步骤设计情况下(改变洗脱液1成分配比以及改变洗脱步骤)褪黑素的峰面积，横坐标1,2,3,4分别代表1-采用甲醇作为洗脱液1，2-采用乙腈作为洗脱液1，3-舍去洗脱步骤1-第1次测试，4-舍去洗脱步骤1-第2次测试；

图4为采用水溶液复溶-多巴胺色谱图；

图5为利用2％甲酸水溶液复溶-多巴胺色谱图；

图6为典型色谱图；从上至下分别为褪黑素、血清素、多巴胺、胆碱色谱图；

图7为褪黑素在标曲最低点的色谱图(保留时间4.23分钟)；

图8为血清素在标曲最低点的色谱图(保留时间3.06分钟)；

图9为多巴胺在标曲最低点的色谱图(保留时间3.02分钟)；

图10为胆碱在标曲最低点的色谱图(保留时间1.73分钟)；

图11为褪黑素标准曲线；

图12为血清素标准曲线；

图13为多巴胺标准曲线；

图14为胆碱标准曲线。

具体实施方式

本发明通过下述实施例进一步阐明，但任何实施例或其组合不应当理解为对本发明的范围或实施方式的限制。在不偏离本发明的精神和范围的前提下，本领域技术人员可以对本发明的技术方案进行任何修改或改变，这种修改和改变也包含在本发明的范围内。

实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所有试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购的常规产品。为了更好地说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在另外一些实施例中，对于本领域技术人员熟知的方法、手段、器材和步骤未作详细描述，以便凸显本发明的主旨。

本发明提供一种基于固相萃取同时检测褪黑素、胆碱、血清素和多巴胺的方法；步骤可以如下：

步骤一、精密吸取100-200微升血浆(或者血清或者标曲)样本，加入10微升内标溶液(褪黑素、胆碱、血清素和多巴胺的同位素内标，浓度分别为0.05ng/mL、1500ng/mL、1.5ng/mL、0.5ng/mL)。

步骤二、加入醋酸铵水溶液100-400微升，浓度为20-60mM，涡旋混匀，高速离心，移取上清液。

步骤三、取步骤二中的上清液上样180-600微升于WCX的SPE板；

步骤四、加入100-200微升醋酸铵水溶液淋洗；

步骤五、加入100-200微升5％甲酸乙腈溶液洗脱至96孔板中，氮气下吹干；

步骤六、加入2-5％甲酸水溶液50微升复溶，注入LC-MS进行分析；

液相条件如下：

色谱条件：

色谱柱：BEH C18色谱柱

流动相A相：甲醇

流动相B相：0.1％甲酸水溶液

梯度条件：

。

质谱条件如下：

上述方法中，

第一部分：选择合适的SPE的固相萃取板，选择合适的pH调节试剂，使得褪黑素、胆碱、血清素、多巴胺可以保留在该SPE的固相填料上，不能从柱子上洞穿。

第一部分涉及发明中的步骤一到步骤三，详细说明和数据如下：

步骤一、精密吸取100-200微升血浆(或者血清或者标曲)样本，加入10微升内标溶液(褪黑素、胆碱、血清素、多巴胺的同位素内标，浓度分别为0.05ng/mL、1500ng/mL、1.5ng/mL、0.5ng/mL)。

步骤三、取步骤二中的上清液上样180-600微升于WCX的SPE板；

1)作用：选择同时带有C18基质特点和阳离子交换基质的SPE板，结合特定pH调节溶液，替换传统的C18基质的SPE板和阳离子交换板，综合利用每个化合物的性质，使每个化合物都能被吸附在SPE板上；

2)和传统方法的对比和差别：传统的SPE要不然就不能吸附褪黑素，要不然就不能吸附胆碱、血清素、多巴胺等极性的生物碱，造成褪黑素和“胆碱、血清素、多巴胺等极性的生物碱”只能分别采用至少2种不同的SPE板，至少2-3种方法来分别测定，导致报告时间大大提高；

3)价值：先在特定的SPE上结合pH调节溶剂保留住褪黑素和“胆碱、血清素、多巴胺等极性的生物碱”；

4)关键技术：选择了能同时保留褪黑素、胆碱、血清素、多巴胺，选择了合适的pH调节溶液，实现了褪黑素、胆碱、血清素、多巴胺在SPE上的同时保留；

A.按照以上步骤，取等量的样本，尝试不同的SPE板。其中，尝试C18基质的SPE板步骤如下，步骤一，取200微升标曲样本，加入10微升内标溶液(0.05ng/mL褪黑素-D4、1500ng/mL胆碱-D4、1.5ng/mL5-羟基色胺-D4、0.5ng/mL多巴胺-D4)；步骤二，加入醋酸铵水溶液400微升，浓度为40mM，涡旋混合，高速离心，移取上清液；步骤三，取步骤二中的上清液上样600微升于C18的SPE板；步骤四，200微升水淋洗C18的SPE板；步骤五，90％乙腈200微升洗脱；步骤六，取步骤五的洗脱液氮气下吹干，加入50微升水复溶，注入液相色谱质谱联用仪进行分析。尝试WCX基质的SPE板步骤如下，其中，步骤一、精密吸取200微升血浆样本，加入10微升内标溶液(0.05ng/mL褪黑素-D4、1500ng/mL胆碱-D4、1.5ng/mL5-羟基色胺-D4、0.5ng/mL多巴胺-D4)。步骤二、加入醋酸铵水溶液400微升，浓度为40mM，涡旋混匀，高速离心，移取上清液。步骤三、取步骤二中的上清液600微升上样于WCX的SPE板；步骤四、加入200微升醋酸铵水溶液淋洗；步骤五、加入200微升5％甲酸乙腈溶液洗脱至96孔板中，氮气下吹干；步骤六、加入50微升水复溶，注入LC-MS进行分析。结果表明只有混合型的WCX板能同时保留褪黑素、胆碱、血清素、多巴胺。其余的SPE板，或者只能看到褪黑素，或者只能看到血清素、多巴胺，或者全都看不到。采用C18的SPE板，多巴胺的色谱图如图1所示，在C18基质的SPE板处理过的样品，多巴胺不能被检测到。

B.按照以上步骤，取等量的样本，只改变上样时样品的pH值的调节剂，考察不同的pH值调节剂对于褪黑素、胆碱、血清素、多巴胺和SPE的结合效果，基本步骤同“尝试WCX基质的SPE板步骤”，结果表明醋酸铵水溶液的效果最好。仅以2种典型的pH调节剂，醋酸铵水溶液和硫酸锌水溶液来解释说明和展示效果，其中乙酸铵水溶液为40mM，硫酸锌水溶液为200mM。理论上，应该是硫酸锌水溶液200mM能够获得更好的效果，原因是WCX SPE板通常在低pH值下具有更强的阳离子交换能力，因为低pH值可以使弱碱性化合物质子化，从而更容易被捕获。而硫酸锌溶液的pH值约为4-5，这使得它具有更酸性的环境，有利于使弱碱性化合物质子化，更有利于它们与WCX SPE板结合。而乙酸铵溶液的pH值接近中性，可能不太有利于使弱碱性化合物质子化，从而可能影响其与WCX SPE板的结合效果。但是实际结果表明(如图2)，在多种pH调节剂中，乙酸铵水溶液配合混合型的WCX的SPE板子，使目标的化合物即褪黑素、胆碱、血清素、多巴胺获得了最优的灵敏度。

第二部分：改变了传统的WCX SPE纯化和富集步骤，传统的WCX SPE纯化和富集步骤如下：甲醇和水活化、加入淋洗剂(WASH，碱性溶液，通常为稀氨水溶液)，加入洗脱剂1(Elute 1,100％甲醇或者乙腈)，加入洗脱剂2(Elute 2,酸性有机溶液，通常为含有甲酸的甲醇溶液)。本发明首先选择了合适的淋洗剂，采用醋酸铵水溶液代替了稀氨水水溶液，保证了褪黑素、胆碱、血清素、多巴胺最大程度的无损失。然后跳过了洗脱剂1，直接进入了洗脱剂2。

进一步，步骤六中通过加入2％的甲酸水溶液进一步提高了检测的灵敏度，实现了高灵敏度地检测。

第二部分涉及发明中的步骤四和步骤五，详细说明和数据如下：

步骤四、加入100-200微升醋酸铵水溶液淋洗；

步骤六、加入2％甲酸水溶液50微升复溶，注入LC-MS进行分析；

其中，步骤五、加入100-200微升5％甲酸乙腈溶液洗脱至86孔板中；

1)作用：通过试剂和步骤的改变，使得褪黑素、胆碱、血清素、多巴胺能够很好的保留在SPE板上，而其他的干扰成分能够有效地去除，最终使褪黑素、胆碱、血清素、多巴胺获得最高的灵敏度；

2)和传统方法的对比和差别：溶剂不同，步骤不同；

3)价值：实现了褪黑素、胆碱、血清素、多巴胺可以在同一个SPE板被纯化和富集，并大大提高了灵敏度；

4)关键技术：加入的淋洗溶液是醋酸铵水溶液，浓度为10-40mM，加入量为200微升；接下来需要跳过传统的WCX SPE纯化和富集的洗脱1的步骤，直接进入洗脱2的步骤；

C.按照以上步骤，取等量的样本，只改变加入洗脱液成分配比或者是否舍去该步骤，其余条件均不改变，以褪黑素的峰面积为例(本发明的难点是和褪黑素和生物胺类化合物一起检测。其中，步骤一、精密吸取200微升血浆样本，加入10微升内标溶液(0.05ng/mL褪黑素-D4、1500ng/mL胆碱-D4、1.5ng/mL5-羟基色胺-D4、0.5ng/mL多巴胺-D4)。步骤二、加入醋酸铵水溶液400微升，浓度为40mM，涡旋混匀，高速离心，移取上清液。步骤三、取步骤二中的上清液600微升上样于WCX的SPE板；步骤四、加入200微升醋酸铵水溶液淋洗；步骤五、加入200微升5％甲酸乙腈溶液洗脱至96孔板中，氮气下吹干；步骤六、加入2％甲酸水溶液50微升复溶，注入LC-MS进行分析。由于褪黑素是其中关键，此处以褪黑素的数据分析，只要褪黑素可以满足要求，其余化合物即可满足要求)展示结果如图3及下表，结果表明舍去洗脱步骤1能够达到最佳灵敏度。理论上，当保留洗脱1的时候，才能够实现最佳的纯化和富集功能，实际上并不可以，传统的洗脱步骤严重的影响了褪黑素的富集效果。

注，编号1、2对应的是在步骤五、加入200微升5％甲酸乙腈溶液洗脱之前，增加洗脱液1洗脱的步骤。

D.按照以上步骤(同C中步骤)，取等量的样本，只改变复溶溶液，考察不同的复溶溶液灵敏度的影响，如图4、5，结果表明2％FA水溶液复溶的效果最好。

实施例1

配置多巴胺系列标准曲线，浓度分别为2.5,5,10,20,50,100,200,500,1000,2000,5000pg/mL；配置胆碱系列标准曲线，浓度分别为2.5,15,30,60,150,300,600,1500,3000,6000,15000ng/mL；配置血清素系列标准曲线，浓度分别为0.25,0.5,1,2,5,10,20,50,100,200,500ng/mL；配置褪黑素系列标准曲线，浓度分别为0.00025,0.0005,0.001,0.002,0.005,0.01,0.02,0.05,0.1,0.2,0.5ng/mL。

按照以下步骤测定褪黑素、血清素、胆碱和多巴胺的定量范围。

步骤一、精密吸取200微升血浆(或者血清)样本，加入10微升内标溶液(褪黑素、胆碱、血清素、多巴胺的同位素内标褪黑素-D4、胆碱-D4、5-羟基色胺-D4、多巴胺-D4，浓度分别为0.05ng/mL、1500ng/mL、1.5ng/mL、0.5ng/mL)。

步骤二、加入醋酸铵水溶液200微升，浓度为60mM，涡旋混匀(转速1200转)，高速离心(14,000rpm，4℃)，移取上清液。

步骤三、取步骤二中的上清液上样380微升于WCX的SPE板；

步骤四、加入200微升30mM醋酸铵水溶液淋洗；

步骤五、加入200微升5％(体积比)甲酸乙腈溶液洗脱至96孔板中，氮气下吹干；

步骤六、加入2％(体积比)甲酸水溶液50微升复溶，注入LC-MS进行分析；液相条件如下：

色谱条件：

色谱柱：BEH C18色谱柱

流动相A相：甲醇

流动相B相：0.1％甲酸水溶液

梯度条件：

。

质谱条件如下：

褪黑素、血清素、多巴胺、胆碱的典型色谱见图6；测定结果如下；其中，褪黑素、血清素、多巴胺、胆碱在表中所示标曲最低点的色谱图如图7-10所示；褪黑素、血清素、多巴胺、胆碱的标准曲线如图11-14所示，其中y为待测物峰面积和相应的内标峰面积的比值，x为待测物的浓度。

实施例2

取30个受试者的血液样品，按照以下步骤测定褪黑素、胆碱、血清素、多巴胺的含量。

步骤二、加入醋酸铵水溶液200微升，浓度为60mM，涡旋混匀，高速离心，移取上清液。

步骤三、取步骤二中的上清液上样380微升于WCX的SPE板；

步骤四、加入200微升醋酸铵水溶液淋洗；

步骤五、加入200微升5％甲酸乙腈溶液洗脱至96孔板中，氮气下吹干；

步骤六、加入2％(体积比)甲酸水溶液50微升复溶，注入LC-MS进行分析；液相条件和质谱条件同实施例1；

检测结果如下：

由上述表格数据可以确认，测定结果和国际上公认的褪黑素、多巴胺、血清素和胆碱的含量高度一致，证明该方法可以准确的测定褪黑素，多巴胺、血清素和胆碱，没有受到干扰物质的干扰。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims

1.一种基于WCX固相萃取同时高灵敏度检测褪黑素和极性生物碱类化合物的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

S2、所述上清液上样于WCX的SPE板；

S3、加入醋酸铵水溶液淋洗；

S4、加入酸性洗脱液洗脱，氮气下吹干；

S5、加入2％-5％甲酸水溶液复溶，进行LC-MS分析；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述极性生物碱类化合物LogP≦1.0。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述极性生物碱类化合物包括胆碱、血清素、多巴胺、γ-氨基丁酸、谷氨酰胺、5-羟基吲哚-3-乙酸、左旋多巴、犬尿氨酸、色胺、谷氨酸、色氨酸中至少一种。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述极性生物碱类化合物为胆碱、血清素、多巴胺。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述内标溶液中内标为褪黑素和极性生物碱类化合物的同位素内标。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述醋酸铵水溶液浓度为20-60mM，

和/或，所述酸性洗脱液为5％-10％甲酸乙腈溶液。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1、S3中，所述样品与醋酸铵水溶液的体积比为100-200:100-400；

和/或，样品与酸性洗脱液的体积比为100-200:100-200；

和/或，样品与甲酸水溶液的体积比为100-200:30-60。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述WCX的SPE板为同时带有C18基质特点和阳离子交换基质的WCX SPE板。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，LC-MS分析时，液相条件如下：

色谱条件：

色谱柱：BEH C18色谱柱

流动相A相：甲醇

流动相B相：0.1％甲酸水溶液

梯度条件：

时间/分钟 A相/％ B相/％梯度曲线 0 98 2 / 5 5 95 6 6 5 95 1 7 98 2 1

和/或，质谱条件如下：

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S6中，标准曲线法对应褪黑素的线性回归方程为Y＝94.89x+0.017；

和/或，血清素的线性回归方程为y＝0.0512x-0.0012；

和/或，胆碱的线性回归方程为y＝0.00397x+0.25；

和/或，多巴胺的线性回归方程为y＝0.00090x+5.74×10^-5。