CN118726417B

CN118726417B - 耐草甘膦转基因玉米事件kj7002及其检测方法

Info

Publication number: CN118726417B
Application number: CN202410776793.XA
Authority: CN
Inventors: 张蕾; 王长成; 董玉凤; 宋哲
Original assignee: Keji Dalong Beijing Biotechnology Co ltd
Current assignee: Keji Dalong Beijing Biotechnology Co ltd
Priority date: 2024-06-17
Filing date: 2024-06-17
Publication date: 2025-05-02
Anticipated expiration: 2044-06-17
Also published as: CN118726417A

Abstract

本发明公开了一种用于检测玉米事件KJM637002(商业名KJ7002)的核酸序列，其包含序列SEQ ID NO:1、3中的任一序列和SEQ ID NO:2、4中的任一序列；或者包含序列SEQ ID NO:7。所述核酸序列来源于包含玉米事件KJ7002的植物、种子或细胞。本发明的转基因玉米事件KJ7002能够耐受高浓度草甘膦除草剂，有利于控制田间杂草，提高耕作效率和产量，其作为抗虫耐草甘膦转基因玉米(如KJ1003等)的庇护所具有高抗草甘膦除草剂和产量高的优点。

Description

耐草甘膦转基因玉米事件KJ7002及其检测方法

技术领域

本发明属于分子生物学和植物育种技术领域，主要涉及转基因植物及其检查方法，具体是涉及一种耐受草甘膦除草剂施用的转基因玉米事件KJM637002(商业名KJ7002)和用于检测生物样品中是否包含特定转基因玉米事件KJ7002核酸序列的方法。

背景技术

玉米(Zea mays L.)在世界上很多地区都是主要的粮食作物，也是重要的饲料作物，在发展畜牧业和水产养殖业中具有战略性意义，在医药、化工方面也有广泛用途。生物技术已应用于改善玉米农艺性状和品质。

玉米一个重要的农艺性状是对除草剂(尤其是草甘膦除草剂)耐受性。在玉米生产中，田间除草工作都会消耗大量劳动力，造成种植成本增加，如除草不及时还会造成玉米减产，给玉米生产带来经济损失。N-膦酰甲基甘氨酸，也称为草甘膦，是一种内吸传导型慢性广谱灭生性除草剂。草甘膦是5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)的合成底物磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的竞争性抑制剂，可抑制PEP和3-磷酸莽草酸这两种底物在EPSPS催化下向5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸莽草酸的转化，从而阻断芳香族氨基酸合成前体-莽草酸的合成途径，使蛋白质的合成受到干扰导致植物和细菌死亡。草甘膦耐受性可以通过表达修饰的EPSPS来实现。修饰的EPSPS对草甘膦具有更低的亲和性，因而在草甘膦存在的情况下，EPSPS保持了它们的催化活性，通过转基因方法使草甘膦耐受型基因(如EPSPS)在玉米植物中表达，可以使玉米获得对草甘膦除草剂的耐受性。例如转基因玉米事件NK603、MON87427、DBN9858、nCX-1等。

已知外源基因在植物体内的表达受到它们的染色体位置的影响，可能是由于染色质结构(如异染色质)或转录调节元件(如增强子)接近整合位点。为此，通常需要筛选大量的事件才有可能鉴定出可以商业化的事件(即导入的目标基因得到最优表达的事件)。筛选出的商业化事件，具有优异的除草剂抗性，且不影响其他农艺性状，可以通过常规育种方法将转基因回交到其他遗传背景中。通过这种杂交方式产生的后代保持了原始转化体的转基因表达特征和性状表现。应用这种策略模式可以确保在许多品种中具有可靠的基因表达。

检测特定事件的方法对于后期杂交转育，鉴定后代是否包含目的基因将是有益的。此外，还将有助于遵守相关法规，产品保护。通过任何熟知的多核苷酸检测方法来检测转基因的存在都是可能的，例如利用聚合酶链式反应(PCR)或多核苷酸探针的DNA杂交。一般常利用跨越了插入的转基因和侧翼DNA的接合部位的一对引物通过PCR来鉴定转基因特定事件，具体包括位于侧翼序列的第一引物和插入序列的第二引物。

长期、大规模种植Bt作物可能导致害虫产生Bt抗性,这是影响转基因抗虫玉米可持续应用的关键因素。为了延缓害虫对Bt作物的抗性演化,“高剂量/庇护所”策略在全球被广泛应用。高剂量/庇护所”策略是在高剂量表达Bt杀虫蛋白的Bt作物区域附近,种植非Bt作物,作为敏感害虫种群的庇护所,Bt作物区域存活下来的少量抗性个体,与庇护所提供的敏感种群自由交配,所产生的抗性杂合子后代依然能够被高剂量表达Bt杀虫蛋白的Bt作物杀死,进而减少昆虫抗性基因的累积,延缓害虫抗性的发展。因此有必要针对可商业化的抗虫耐草甘膦玉米如KJ1003等转基因玉米事件为昆虫提供有效的庇护所。

发明内容

本发明的目的是提供一种转基因玉米事件KJM637002(商业名KJ7002，以下均采用商品名描述)以及用于检测玉米事件KJ7002的核酸序列及检测方法，本发明提供的玉米事件KJ7002可以作为庇护所防止抗虫耐草甘膦玉米事件推广带来的昆虫抗性，并且本发明提供的检测方法可以准确快速的鉴定生物样品中是否包含特定的转基因玉米事件KJ7002的DNA分子。

为实现上述目的，本发明提供了一种核酸序列，包括如下(1)-(2)中的一项：

(1)序列SEQ ID NO:1、3中的任一序列或其互补序列，和SEQ ID NO:2、4中的任一序列或其互补序；

(2)序列SEQ ID NO:7或其互补序列；

所述核酸序列来源于转基因玉米事件KJ7002的植物、种子或细胞，所述玉米事件的种子(拉丁学名：Zea mays L.)的代表性样本已以保藏编号CCTCC NO:P202409保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，武汉大学保藏中心，邮编430072)，保藏时间2024年3月20日。

所述SEQ ID NO:1或其互补序列为转基因玉米事件KJ7002中在插入序列的5’末端位于插入接合部位附近的一个长度为22个核苷酸的序列，所述SEQ ID NO:1或其互补序列跨越了玉米插入位点的侧翼基因组DNA序列和插入序列的5’末端的DNA序列；所述SEQ IDNO:2或其互补序列为转基因玉米事件KJ7002中在插入序列的3’末端位于插入接合部位附近的一个长度为22个核苷酸的序列，所述SEQ ID NO:2或其互补序列跨越了插入序列的3’末端的DNA序列和玉米插入位点的侧翼基因组DNA序列，包含所述SEQ ID NO:1和2或其互补序列即可鉴定为转基因玉米事件KJ7002的存在。

本发明中，所述核酸序列可以为所述SEQ ID NO:3或其互补序列中转基因插入序列的任何部分的至少11个或更多个连续多核苷酸(第一核酸序列)，或者为所述SEQ ID NO:3或其互补序列中5’侧翼玉米基因组DNA区域的任何部分的至少11个或更多个连续多核苷酸(第二核酸序列)。所述核酸序列进一步可以为同源于或互补于包含完整的所述SEQ IDNO:1的所述SEQ ID NO:3的一部分。当第一核酸序列和第二核酸序列一起使用时，这些核酸序列在产生扩增产物的DNA扩增方法中包括DNA引物对。使用DNA引物对在DNA扩增方法中产生的扩增产物是包括SEQ ID NO:1的扩增产物时，可以诊断转基因玉米事件KJ7002或其后代的存在。本领域技术人员熟知的，第一和第二核酸序列不必仅仅由DNA组成，也可包括RNA、DNA和RNA的混合物，或者DNA、RNA或其它不作为一种或多种聚合酶模板的核苷酸或其类似物的组合。此外，本发明中所述探针或引物应该是至少大约11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个连续核苷酸的长度，其可以选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4中所述的核苷酸。当选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示的核苷酸时，所述探针和引物可以为长度是至少大约21个到大约50个或更多的连续核苷酸。所述SEQ IDNO:3或其互补序列为转基因玉米事件KJ7002中在插入序列的5’末端位于插入接合部位附近的一个长度为938个核苷酸的序列，所述SEQ ID NO:3或其互补序列由624个核苷酸的5’玉米侧翼基因组DNA序列(SEQ ID NO:3的核苷酸1-624)和314个核苷酸的水稻TubA启动子DNA序列(SEQ ID NO:3的核苷酸625-938)组成，包含所述SEQ ID NO:3或其互补序列即可鉴定为转基因玉米事件KJ7002的存在。

所述核酸序列可以为所述SEQ ID NO:4或其互补序列中转基因插入序列的任何部分的至少11个或更多个连续多核苷酸(第三核酸序列)，或者为所述SEQ ID NO:4或其互补序列中3’侧翼玉米基因组DNA区域的任何部分的至少11个或更多个连续多核苷酸(第四核酸序列)。所述核酸序列进一步可以为同源于或互补于包含完整的所述SEQ ID NO:2的所述SEQ ID NO:4的一部分。当第三核酸序列和第四核酸序列一起使用时，这些核酸序列在产生扩增产物的DNA扩增方法中包括DNA引物组。使用DNA引物对在DNA扩增方法中产生的扩增产物是包括SEQ ID NO:2的扩增产物时，可以诊断转基因玉米事件KJ7002或其后代的存在。所述SEQ ID NO:4或其互补序列为转基因玉米事件KJ7002中在插入序列的3’末端位于插入接合部位附近的一个长度为1142个核苷酸的序列，所述SEQ ID NO:4或其互补序列由444个核苷酸的水稻TubA终止子DNA序列(SEQ ID NO:4的核苷酸1-444)、59个核苷酸载体间隔序列(SEQ ID NO:4的核苷酸445-503)、和639个核苷酸的3’末端玉米整合位点侧翼基因组DNA序列(SEQ ID NO:4的核苷酸504-1142)组成，包含所述SEQ ID NO:4或其互补序列即可鉴定为转基因玉米事件KJ7002的存在。

所述SEQ ID NO:5或其互补序列为位于SEQ ID NO:3内部序列，含5’端的水稻TubA启动子DNA序列的314bp，所述SEQ ID NO:6或其互补序列为位于SEQ ID NO:4内部序列，含3’端水稻TubA终止子DNA序列的444bp和载体间隔序列59bp，合计503bp。

所述SEQ ID NO:7或其互补序列为表征转基因玉米事件KJ7002的长度为5046个核苷酸的序列，包含SEQ ID NO:1-6，包括5’玉米基因组侧翼序列、整个转基因表达盒和3’玉米基因组侧翼序列，其具体包含的基因组和遗传元件如表1所示。包含所述SEQ ID NO:7或其互补序列即可鉴定为转基因玉米事件KJ7002的存在。

表1所述SEQ ID NO:7包含的基因组和遗传元件

所述核酸序列或其互补序列可用于DNA扩增法中以产生扩增子，所述扩增子的检测诊断生物样品中转基因玉米事件KJ7002或其后代的存在；所述核酸序列或其互补序列可用于核苷酸检测法中，以检测生物样品中转基因玉米事件KJ7002或其后代的存在。

为实现上述目的，本发明还提供了一种检测样品中转基因玉米事件KJ7002的DNA存在的方法，包括：使待检测样品与至少两种引物在核酸扩增反应中接触；

进行核酸扩增反应；

检测扩增产物的存在；

所述扩增产物包括选自序列SEQ ID NO:1、3中的任一序列或其互补序列，和SEQID NO:2、4中的任一序列或其互补序列；或者包括SEQ ID NO:7或其互补序列，即表示所述检测样品包含转基因玉米事件KJ7002的DNA存在。

所述引物包括第一引物和第二引物，所述第一引物选自SEQ ID NO:1及其互补序列、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:22组成，所述第二引物由选自SEQ ID NO:2及其互补序列、SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:19；

更具体的，所述第一引物选自SEQ ID NO:1或其互补序列、SEQ ID NO:23或SEQ IDNO:22，所述第二引物选自SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:21；或者所述第一引物选自SEQ IDNO:2或其互补序列、SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:19，所述第二引物选自SEQ ID NO:25或SEQID NO:20。

为实现上述目的，本发明还提供了一种检测样品中转基因玉米事件KJ7002的DNA存在的方法，包括：

使待测样品与探针接触，所述探针包含SEQ ID NO:7的部分序列及其互补序列，所述探针在严格杂交条件下选自SEQ ID NO:1-4、7或其互补序列的核酸序列的DNA分子杂交，并在严格条件下不与不含选自SEQ ID NO:1-7或其互补序列的核酸序列的DNA分子杂交；

使所述待检测样品和所述探针在严格杂交条件下杂交；

检测所述待检测样品和所述探针的杂交情况。

所述严格条件可为在6×SSC(柠檬酸钠)、0.5％SDS(十二烷基硫酸钠)溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC、0.1％SDS和1×SSC、0.1％SDS各洗膜1次。

在一些实施方式中，所述探针包括SEQ ID NO:3或其互补序列中至少11个连续的核苷酸、或者SEQ ID NO:4或其互补序列中至少11个连续的核苷酸；

进一步地，所述探针包括SEQ ID NO:1或其互补序列中第1-11位或第12-22位连续核苷酸、SEQ ID NO:2或其互补序列中第1-11位或第12-22位连续核苷酸。

可选择地，至少一个所述探针用至少一种荧光基团标记。

使待检测样品与标记物核酸分子接触，所述标记物核酸分子包含SEQ ID NO:7的部分序列及其互补序列，所述标记物核酸分子在严格杂交条件下选自SEQ ID NO:1、3中的任一序列或其互补序列，和SEQ ID NO:2、4中的任一序列或其互补序列；或者包括SEQ IDNO:7或其互补序列的核酸序列的DNA分子杂交，并在严格条件下不与不含选自SEQ ID NO:1-7或其互补序列的核酸序列的DNA分子杂交。

使所述待检测样品和所述标记物核酸分子在严格杂交条件下杂交；

检测所述待检测样品和所述标记物核酸分子的杂交情况，进而通过标记物辅助育种分析以确定除草剂耐受性与标记物核酸分子在遗传学上是连锁的。

在一种实施方式中，所述标记物核酸分子包括SEQ ID NO:3或其互补序列中至少11个连续的核苷酸、或者SEQ ID NO:4或其互补序列中至少11个连续的核苷酸；

进一步地，所述标记物核酸分子包含选自SEQ ID NO:1或其互补序列、SEQ ID NO:2或其互补序列。

为实现上述目的，本发明还提供了一种DNA检测试剂盒，包括至少一个DNA分子，所述DNA分子包括SEQ ID NO:3的同源序列或其互补序列中至少11个连续的核苷酸、或者SEQID NO:4的同源序列或其互补序列中至少11个连续的核苷酸，其可以作为对于转基因玉米事件KJ7002或其后代具有特异性的DNA引物或探针。

进一步地，所述DNA分子包括SEQ ID NO:1或其互补序列中第1-11位或第12-22位连续核苷酸、或者SEQ ID NO:2或其互补序列中第1-11位或第12-22位连续核苷酸。

更进一步地，所述DNA分子包括SEQ ID NO:1的同源序列或其互补序列、SEQ IDNO:2的同源序列或其互补序列。

为实现上述目的，本发明提供了一种保护玉米植物免受由除草剂引起的损伤的方法，包括将含有有效剂量草甘膦除草剂施加到种植至少一种转基因玉米植物的大田中，所述转基因玉米植物在其基因组中包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQID NO:4和SEQ ID NO:7所示序列中至少一种核酸序列，所述转基因玉米植物具有对草甘膦除草剂的耐受性。具体的，所述转基因玉米植物为包含转基因玉米事件KJ7002的转基因玉米植物。

为实现上述目的，本发明还提供了一种控制种植玉米植物的大田中杂草的方法，包括将含有有效剂量草甘膦除草剂施加到种植至少一种转基因玉米植物的大田中，所述转基因玉米植物在其基因组中包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4和SEQ ID NO:7所示序列中至少一种核酸序列，所述转基因玉米植物具有对草甘膦除草剂的耐受性，具体的，所述转基因玉米植物为包含转基因玉米事件KJ7002的转基因玉米植物。

使所述玉米种子长成玉米植株；

为实现上述目的，本发明还提供了一种培养对草甘膦除草剂具有耐受性的玉米植物的方法，包括：种植至少一粒玉米种子，所述玉米种子的基因组中包括编码草甘膦除草剂耐受性CP4-EPSPS蛋白的核酸序列和特定区域的核酸序列；

使所述玉米种子长成玉米植株；

用有效剂量草甘膦除草剂喷洒所述玉米植株，收获与其他不具有特定区域的核酸序列的植株相比具有减弱的植物损伤的植株；

所述特定区域的核酸序列选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4和SEQ ID NO:7所示序列中至少一种核酸序列。具体的，所述玉米种子为转基因玉米事件KJ7002的玉米种子。

为实现上述目的，本发明还提供了一种产生对草甘膦除草剂具有耐受性的玉米植株的方法，包括向所述玉米植株的基因组中引入编码草甘膦耐受性CP4-EPSPS蛋白的核酸序列和特定区域的核酸序列，所述特定区域的核酸序列选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:7所示序列中至少一种核酸序列。

具体地，所述产生对草甘膦除草剂具有耐受性的玉米植株的方法包括：将对草甘膦除草剂具有耐受性的转基因玉米事件KJ7002第一亲本玉米植株与缺少草甘膦耐受性的第二亲本玉米植株有性杂交，从而产生大量子代植株；

用草甘膦除草剂处理所述子代植株；

选择耐受草甘膦的所述子代植株；

所述转基因玉米事件KJ7002在其基因组中包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:7所示序列中至少一种核酸序列。

为实现上述目的，本发明还提供了一种产生自转基因玉米事件KJ7002加工品，加工品为玉米粉、玉米油、玉米穗丝、玉米淀粉、玉米面筋、玉米饼、化妆品或填充剂。

在本发明用于检测玉米植物的核酸序列及其检测方法中，以下定义和方法可以更好地定义本发明和指导本领域的普通技术人员实施本发明，除非另作说明，根据本领域普通技术人员的常规的用法来理解术语。

引起外源DNA的随机整合的转化程序会导致含有不同侧翼区的转化体，所述不同侧翼区是每个转化体所特异性含有的。当重组DNA通过传统杂交被引入植物时，其侧翼区通常不会改变。转化体也会含有异源插入物DNA和基因组DNA的段之间或两段基因组DNA之间或两段异源DNA之间的独特的接合。

本发明提供了称为KJ7002的转基因玉米事件及其后代，所述转基因玉米事件KJ7002即为玉米植物KJ7002，其包括转基因玉米事件KJ7002的植物和种子及其植物细胞或其可再生部分，所述转基因玉米事件KJ7002的植物部分，包括但不限于细胞、花粉、胚珠、花、芽、根、茎、穗丝、花序、耳穗、叶和来自玉米植物KJ7002的产物，例如玉米粉、玉米面、玉米油、玉米浆、玉米穗丝、玉米淀粉和留在玉米作物田间的生物量。

本发明转基因玉米事件KJ7002包含DNA构建体，当其在植物细胞内表达时，所述转基因玉米事件KJ7002获得对草甘膦除草剂的耐受性。

在本发明的一些实施方式中，所述DNA构建体包含一个表达盒，这个表达盒包含用于在植物中表达的适合的启动子和终止子，所述启动子可操作地连接来自农杆菌cp4菌株(Agrobacteriumsp.strain CP4)的cp4-epspsp基因，CP4-EPSPS蛋白与草甘膦的亲和性小，在植物中表达CP4-EPSPS蛋白，可以在使用草甘膦时，在植物体内重建莽草酸合成途径，使转基因植物继续合成芳香族氨基酸，抵抗草甘膦除草剂。

进一步地，所述启动子可以为从植物分离的适合启动子，所述适合启动子包括但不限于水稻TubA启动子。所述终止子可以为从植物分离的适合终止子，所述终止子包括但不限于，水稻TubA终止子TubA Ter。

此外，所述表达盒还可以包括其他的遗传元件，所述遗传元件包括但不限于，增强子和信号肽/转运肽核酸编码序列。所述信号肽/转运肽包括但不限于CTP2(编码叶绿体转运肽，将CP4-EPSPS蛋白定位到叶绿体中加工成成熟蛋白)。

所述DNA构建体采用转化方法被引入到植物中，所述转化方法包括但不限于，农杆菌(Agrobacterium)介导转化法、基因枪转化法和花粉管通道转化法。

DNA构建体是DNA分子互相连接起来的组合，该组合提供了一个或多个表达盒。DNA构建体优选地是能够在细菌细胞内自我复制，而且含有不同的限制性内切酶位点的质粒，所含的限制性内切酶位点用于导入提供功能性基因元件，即启动子、内含子、前导序列、编码序列、3’终止子区域和其他序列的DNA分子。DNA构建体中所含有的表达盒包括提供信使RNA的转录所必需的基因元件，所述表达盒可以设计为在原核细胞或真核细胞中表达。本发明的表达盒被设计为最优选地在植物细胞内表达。

培养对草甘膦除草剂具有耐受性的转基因玉米事件KJ7002，通过以下步骤：首先使第一亲本玉米植物与第二亲本玉米植物有性杂交，从而产生了多样的第一代子代植株，所述第一亲本玉米植物由培育自转基因玉米事件KJ7002及其后代的玉米植物组成，该转基因玉米事件KJ7002及其后代是通过利用本发明的对草甘膦除草剂具有耐受性的表达盒进行转化而得到的，第二亲本玉米植物缺乏对草甘膦除草剂具有耐受性；然后选择对草甘膦除草剂具有耐受性的子代植株，可以培育出对草甘膦除草剂具有耐受性的玉米植物。这些步骤可以进一步包括使草甘膦耐受性的子代植株与第二亲本玉米植物或第三亲本玉米植物进行回交，然后通过用草甘膦除草剂施加或通过与性状相关的分子标记物(如包含转基因玉米事件KJ7002中插入序列的5’端和3’端鉴定出的接合位点的DNA分子)的鉴定来选择子代，从而产生对草甘膦除草剂具有耐受性的玉米植物。

还应理解的是，两种不同的转基因植物也可以杂交以产生含有两个独立的、分离式添加的外源基因的后代。适当后代的自交可以得到对两个添加的外源基因来说都是纯合子的后代植株。如前所述的对亲本植株的回交和与非转基因植物的异型杂交也是可以预期的，无性繁殖也是同样的。

术语“探针”是一段分离的核酸分子，其上面结合有常规的可检测标记或报告分子，例如，放射性同位素、配体、化学发光剂或酶类。这种探针与目标核酸的一条链是互补的，在本发明中，探针与来自转基因玉米事件KJ7002基因组的一条DNA链互补，不论该基因组DNA是来自转基因玉米事件KJ7002或种子还是来源于转基因玉米事件KJ7002的植物或种子或提取物。本发明的探针不仅包括脱氧核糖核酸或核糖核酸，还包括特异性地与目标DNA序列结合并可用于检测该目标DNA序列的存在的聚酰胺及其他探针材料。

基于本发明的侧翼基因组DNA和插入序列的引物和探针可以通过常规方法确定，例如，通过从来源于转基因玉米事件KJ7002的植物材料中分离相应的DNA分子，并确定该DNA分子的核酸序列。所述DNA分子包含转基因插入序列和玉米基因组侧翼区域，所述DNA分子的片段可以用作引物或探针。

本发明的核酸探针和引物在严格条件下与目标DNA序列杂交。任何常规的核酸杂交或扩增方法都可以用于鉴定样品中来源于转基因玉米事件KJ7002的DNA的存在。核酸分子或其片段在一定情况下能够与其他核酸分子进行特异性杂交。如本发明使用的，如果两个核酸分子能形成反平行的双链核酸结构，就可以说这两个核酸分子彼此间能够进行特异性杂交。如果两个核酸分子显示出完全的互补性，则称其中一个核酸分子是另一个核酸分子的“互补物”。如本发明使用的，当一个核酸分子的每一个核苷酸都与另一个核酸分子的对应核苷酸互补时，则称这两个核酸分子显示出“完全互补性”。如果两个核酸分子能够以足够的稳定性相互杂交从而使它们在至少常规的“低度严格”条件下退火且彼此结合，则称这两个核酸分子为“最低程度互补”。类似地，如果两个核酸分子能够以足够的稳定性相互杂交从而使它们在常规的“高度严格”条件下退火且彼此结合，则称这两个核酸分子具有“互补性”。从完全互补性中偏离是可以允许的，只要这种偏离不完全阻止两个分子形成双链结构。为了使一个核酸分子能够作为引物或探针，仅需保证其在序列上具有充分的互补性，以使得在所采用的特定溶剂和盐浓度下能形成稳定的双链结构。

如本发明使用的，基本同源的序列是一段核酸分子，该核酸分子在高度严格条件下能够和相匹配的另一段核酸分子的互补链发生特异性杂交。促进DNA杂交的适合的严格条件，例如，大约在45℃条件下用6.0×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)处理，然后在50℃条件下用2.0×SSC洗涤，这些条件对本领域技术人员是公知的。例如，在洗涤步骤中的盐浓度可以选自低度严格条件的约2.0×SSC、50℃到高度严格条件的约0.2×SSC、50℃。此外，洗涤步骤中的温度条件可以从低度严格条件的室温约22℃，升高到高度严格条件的约65℃。温度条件和盐浓度可以都发生改变，也可以其中一个保持不变而另一个变量发生改变。优选地，本发明的一个核酸分子可以在中度严格条件下，例如在约2.0×SSC和约65℃下与SEQ ID NO:1-4、7中一个或多个核酸分子或其互补序列，或者上述序列的任一片段发生特异性杂交。更优选地，发明的一个核酸分子在高度严格条件下与SEQ ID NO:1-4、7中一个或多个核酸分子或其互补序列，或者上述序列的任一片段发生特异性杂交。本发明中，优选的标记物核酸分子具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4或其互补序列，或者上述序列的任一片段。

SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4可以用作植物育种方法中的标记物以鉴定遗传杂交的后代。探针与目标DNA分子的杂交可以通过任何一种为本领域技术人员所熟知的方法进行检测，这些方法包括但不限于，荧光标记、放射性标记、抗体类标记和化学发光标记。

关于使用特定的扩增引物对目标核酸序列进行的扩增(例如，通过PCR)，“严格条件”指的是在DNA热扩增反应中仅允许引物对目标核酸序列发生杂交的条件，具有与目标核酸序列相应的野生型序列(或其互补序列)的引物，能够与所述目标核酸序列结合，并且优选产生唯一的扩增产物，扩增产物即扩增子。

术语“特异性结合(目标序列)”是指在严格杂交条件下探针或引物仅与包含目标序列的样品中的目标序列发生杂交。

如本发明使用的，“经过扩增的DNA”或“扩增子”是指作为核酸模板一部分的目标核酸序列的核酸扩增产物。例如，为了确定玉米植物是否由含有本发明转基因玉米事件KJ7002通过有性杂交方式产生，或采集自田地的玉米样品是否包含转基因玉米事件KJ7002，或玉米提取物，例如粗粉、粉或油是否包含转基因玉米事件KJ7002，从玉米植物组织样品或提取物提取的DNA可以通过使用引物对的核酸扩增方法以产生对于转基因玉米事件KJ7002的DNA的存在是诊断性的扩增子。所述引物对包括一个来源于植物基因组中与插入的外源DNA插入位点相邻的侧翼序列的第一引物，和来源于插入的外源DNA的第二引物。扩增子具有一定长度和序列，所述序列对所述转基因玉米事件KJ7002也是诊断性的。扩增子的长度范围可以是引物对的结合长度加上一个核苷酸碱基对，优选加上约五十个核苷酸碱基对，更优选加上约两百五十个核苷酸碱基对，最优选加上约四百五十个核苷酸碱基对或更多。

可选的，引物对可以来源于插入DNA两侧的侧翼基因组序列，以产生包括整个插入核苷酸序列的扩增子。来源于植物基因组序列的引物对中的一个可以位于距插入DNA序列一定距离处，该距离的范围可以为一个核苷酸碱基对到约两万个核苷酸碱基对。术语“扩增子”的使用特别排除了在DNA热扩增反应中形成的引物二聚体。

插入的外源DNA序列和来自转基因玉米事件KJ7002的侧翼DNA序列可以通过利用所提供的引物序列对转基因玉米事件KJ7002的基因组进行扩增，扩增后对PCR扩增子或克隆的DNA进行标准的DNA测序。

基于DNA扩增方法的DNA检测试剂盒含有DNA引物分子，它们在适当的反应条件下特异性杂交到目标DNA上并扩增诊断性扩增子。试剂盒可提供基于琼脂糖凝胶的检测方法或者现有技术已知的检测诊断性扩增子的许多方法。含有与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的玉米基因组区的任何部分同源或互补的、以及与SEQ ID NO:7的转基因插入区的任何部分同源或互补的DNA引物的试剂盒是本发明所提供的。这些方法所产生的扩增子可以通过多种技术进行检测。其中一个方法是Genetic Bit Analysis，该方法设计了一个跨越插入DNA序列和相邻的侧翼基因组DNA序列的DNA寡核苷酸链。将该寡核苷酸链固定在一个微孔板的微孔内，在对目标区域进行PCR扩增后(在插入序列内和相邻的侧翼基因组序列中各使用一个引物)，单链PCR产物可与固定的寡核苷酸链进行杂交，并且作为单碱基延伸反应的模板，该延伸反应使用了DNA聚合酶和为下一个预期的碱基特定标记的ddNTPs。可以通过荧光或ELISA类方法得到结果。信号代表了插入/侧翼序列的存在，其说明扩增、杂交和单碱基延伸反应是成功的。

另一种方法是Pyrosequencing(焦磷酸测序)技术。该方法设计了一个跨越插入DNA序列和相邻的基因组DNA结合部位的寡核苷酸链。将该寡核苷酸链和目标区域的单链PCR产物(在插入序列内和相邻的侧翼基因组序列中各使用一个引物)进行杂交，然后和DNA聚合酶、ATP、硫酰基酶、荧光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶、腺苷-5’-磷硫酸盐和萤光素一起进行温育。分别加入dNTPs，测量产生的光信号。光信号代表了插入/侧翼序列的存在，其说明扩增、杂交、和单碱基或多碱基延伸反应是成功的。

Chen等(基因组研究(Genome Res.)9:492-498，1999)描述的荧光偏振现象也是可以用于检测本发明扩增子的一种方法。使用这种方法需要设计一个跨越插入DNA序列和相邻的基因组DNA结合部位的寡核苷酸链。将该寡核苷酸链和目标区域的单链PCR产物(在插入序列内和相邻的侧翼基因组序列中各使用一个引物)进行杂交，然后和DNA聚合酶以及一种荧光标记的ddNTP一起进行温育。单碱基延伸会导致插入ddNTP。这种插入可以利用荧光仪测量其偏振的改变。偏振的改变代表了插入/侧翼序列的存在，其说明扩增、杂交和单碱基延伸反应是成功的。

Taqman被描述为一种检测和定量分析DNA序列存在的方法，该方法在制造商所提供的使用说明中有详细介绍。现简要举例说明如下，设计一个跨越插入DNA序列和相邻的基因组侧翼结合部位的FRET寡核苷酸探针。该FRET探针和PCR引物(在插入序列内和相邻的侧翼基因组序列中各使用一个引物)在热稳定聚合酶和dNTPs存在下进行循环反应。FRET探针的杂交导致FRET探针上荧光部分和淬灭部分的分裂以及荧光部分的释放。荧光信号的产生代表了插入/侧翼序列的存在，其说明扩增和杂交是成功的。

基于杂交原理，用于检测来源于转基因玉米事件KJ7002的植物材料的适合技术还可以包括Southern印迹杂交、Northern印迹杂交和原位杂交。特别地，所述适合技术包括温育探针和样品，洗涤以移除未结合的探针和检测探针是否已经杂交。所述的检测方法取决于探针所附标记的类型，例如，通过X光片曝光和显影可以检测放射性标记的探针，或通过底物转化实现颜色变化可以检测酶标记的探针。

Tyangi等(自然生物技术(Nat.Biotech.)14:303-308，1996)介绍了分子标记在序列检测中的应用。简要说明如下，设计一个跨越插入DNA序列和相邻的基因组侧翼结合部位的FRET寡核苷酸探针。该FRET探针的独特结构导致其含有二级结构，该二级结构能够在近距离内保持荧光部分和淬灭部分。该FRET探针和PCR引物(在插入序列内和相邻的侧翼基因组序列中各使用一个引物)在热稳定聚合酶和dNTPs存在下进行循环反应。经过成功的PCR扩增，FRET探针和目标序列的杂交导致探针二级结构的丧失，从而使荧光部分和淬灭部分在空间上发生分离，产生荧光信号。荧光信号的产生代表了插入/侧翼序列的存在，其说明扩增和杂交是成功的。

其他描述的方法，例如微流体(microfluidics)提供了分离和扩增DNA样品的方法和设备。光染料用于检测和测定特定的DNA分子。包含用于检测DNA分子的电子传感器或结合特定DNA分子的纳珠并因而可被检测的纳试管(nanotube)设备对于检测本发明的DNA分子是有用的。

可以使用本发明所述的引物对和DNA检测领域描述的或已知的方法来开发DNA检测试剂盒。所述试剂盒有利于鉴定样品中是否存在转基因玉米事件KJ7002的DNA，还可以用于培育含有转基因玉米事件KJ7002的DNA的玉米植物。所述试剂盒可以含有DNA引物或探针，其同源于或互补于SEQ ID NO:1、2、3、4或7的至少一部分，或含有其它DNA引物或探针，其同源于或互补于转基因遗传元件中所含的DNA，这些DNA序列可以用于DNA扩增反应，或作为DNA杂交方法中的探针。

在DNA扩增方法中，作为引物的DNA分子可以是来源于转基因玉米事件KJ7002中转基因插入序列的任何部分，也可以是来源于转基因玉米事件KJ7002中侧翼玉米基因组的DNA区域的任何部分。

转基因玉米事件KJ7002可以与其他转基因玉米品种组合，例如除草剂(如草铵膦、麦草畏等)耐受性的玉米，或携带其他抗虫基因的转基因玉米品种。所有这些不同转基因事件的各种组合，与本发明的转基因玉米事件KJ7002一起育种，可以提供抗多种虫害并抗多种除草剂的改良杂种转基因玉米品种。这些品种相比于非转基因品种和单性状的转基因品种可以表现出产量提升等更优异的特征。

本发明提供了一种用于检测玉米植物的核酸序列及检测方法，转基因玉米事件KJ7002耐受含草甘膦的农业除草剂的植物毒性作用。

该性状的玉米植株表达土壤杆菌属菌株CP4的草甘膦抗性的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)蛋白，其赋予植物对草甘膦的耐受性。耐除草剂性状玉米能够耐受高浓度草甘膦除草剂，使玉米种植者在种植过程中使用高效、广谱、廉价的草甘膦进行便捷的杂草管理，降低劳动力成本。

按照国际惯例，庇护所占种植面积的5-20％。耐草甘膦性状转基因玉米事件KJ7002可以作为抗虫耐草甘膦除草剂转基因玉米的庇护所，其具有抗高浓度草甘膦的特性，在虫害不严重的年份，庇护所玉米还可收获理想的产量。

此外，编码草甘膦耐受性性状的基因存在于转基因玉米事件KJ7002基因组的单一基因座上，这一点提供了增强的育种效率并使得能够用分子标记来追踪繁殖群体及其子代中的转基因插入片段。同时本发明检测方法中提供的DNA引物或探针可以产生诊断为转基因玉米事件KJ7002或其后代的扩增产物，能够快速、准确、稳定的鉴定出来源于转基因玉米事件KJ7002的植物材料的存在。

附图说明

图1为本发明用于检测玉米植物KJ7002的核酸序列及其检测方法的转基因插入序列与玉米基因组结合部位的结构示意图；

图2为本发明用于检测玉米植物KJ7002的核酸序列及其检测方法的重组表达载体pk0637的结构示意图；

图3为插入序列3’端侧翼序列在数据库中的比对结果；

图4为转化体KJ7002的3’端插入位点序列验证结果，其中M：分子量Marker，1：受体对照玉米B104基因组DNA为模板的扩增产物；2：空白对照，以水为模板扩增产物；3：以pK0637质粒DNA为模板的扩增产物；4：以转化体KJ7002基因组DNA为模板的扩增产物；

图5为转化体KJ7002的3’端插入位点序列验证结果，其中M：分子量Marker，1：受体对照玉米B104基因组DNA为模板的扩增产物；2：空白对照，以水为模板扩增产物；3：以pK0637质粒DNA为模板的扩增产物；4：以转化体KJ7002基因组DNA为模板的扩增产物；

图6为转化体KJ7002的5’端特异性PCR检测电泳图，其中，M：marker，1：阳性对照，以pK0637质粒为模板扩增产物，2：阴性对照，以非转基因对照玉米(受体B104)基因组DNA为模板扩增产物，3：空白对照，以水为模板扩增产物，4：其他转化体对照，转化体KJM637004植株基因组DNA为模板扩增产物，5-7、8-10、11-13、14-16：分别为KJ7002转化体T3、T4、T5、T6代玉米植株基因组DNA为模板扩增产物；

图7为转化体KJ7002的3’端特异性PCR检测电泳图，其中，M：marker，1：阳性对照，以pK0637质粒为模板扩增产物，2：阴性对照，以非转基因对照玉米(受体B104)基因组DNA为模板扩增产物，3：空白对照，以水为模板扩增产物，4：其他转化体对照，转化体KJM637004植株基因组DNA为模板扩增产物，5-7、8-10、11-13、14-16：分别为KJ7002转化体T3、T4、T5、T6代玉米植株基因组DNA为模板扩增产物；

图8为cp4-epsps基因探针的Southern杂交图谱，其中A：为EcoRⅠ酶切后杂交图，B：EcoRⅤ酶切后杂交图，C：电泳迁移率偏差示意图，1：Marker，2:空白，3：CK+(pK0637质粒EcoRⅠ酶切)，4：CK-阴性对照(受体B104)，5：KJ7002 T₄代，6：KJ7002 T₅代，7：KJ7002 T₆代；C中左侧为地高辛标记Marker，右侧为1kb Marker(Thermo)；

图9为本发明的包含转基因玉米事件KJ7002的转基因玉米在喷施1、2、4倍剂量草甘膦除草剂两周后的田间效果图；

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行进一步说明和描述，但所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明和实施例中，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他发明和实施例，都属于本发明保护的范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、克隆与转化

1.1载体克隆

使用标准的基因克隆技术构建重组表达载体pK0637(如图2所示)。所述载体pK0637包含1个转基因表达盒，由水稻TubA启动子，可操作地连接到叶绿体转运肽CTP2，将CP4-EPSPS蛋白定位到叶绿体中加工成成熟蛋白，可操作地连接到土壤杆菌属CP4菌株的草甘膦耐受性的5-烯醇-丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(CP4-EPSPS)上，并可操作地连接到水稻TubA终止子。将所述载体pK0637用液氮法转化到农杆菌LBA4404(Invitrgen，Chicago，USA；Cat.No：18313-015)中，并且以5-烯醇-丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)为选择标记对转化细胞进行筛选。

1.2植物转化

采用常规的农杆菌侵染法进行转化，将无菌培养的玉米(玉米自交系B104)幼胚与农杆菌共培养，以将构建的重组表达载体pK0637中的T-DNA转入到玉米染色体组中，以产生转基因玉米事件KJ7002，具体操作如下：

1)准备pK0637农杆菌菌液将-80℃冰箱中保存的菌液涂在添加抗生素利福平和卡那霉素的YEB培养基上，28℃黑暗培养48h。使用前，用接种环收集平板上生长的农杆菌，用inf-AS培养基悬浮，稀释菌液，OD₆₀₀为0.5。

2)准备幼胚取授粉后约12天的玉米果穗。脱去包叶，75％酒精表面处理30sec，1％次氯酸钠处理40min，无菌水洗三次。室温剥取幼胚，放入装有2mL inf培养基的离心管中。用新的inf洗液洗涤两次，最后在管内留少部分inf恰好能浸没幼胚。

3)幼胚预处理将上述装有幼胚的离心管放入45℃水浴锅，处理5min。水浴完成后，迅速取出离心管冰浴2min。

4)农杆菌侵染幼胚将上述离心管中剩余的inf吸掉，加入1mL配好的农杆菌菌液，上下颠倒离心管20次，静置5分钟。

5)共培养侵染完成后，幼胚和侵染液转移到共培养基，将培养基上多余的农杆菌悬浮液残液用移液器吸净，调整幼胚摆放方向，使其胚轴面接触培养基，即盾片朝上。封口膜将培养皿密封，28℃暗培养3天。

6)恢复培养共培养3天后，幼胚转接到恢复培养基上28℃黑暗培养14天。

7)筛选培养将恢复培养14天的幼胚转入筛选培养基，28℃黑暗培养14天。14天后，用同样的培养基继代一次。

8)分化培养将筛选两轮后，生长旺盛的愈伤转到分化培养基，28℃光照培养14天。

9)再生苗生根经分化培养后，将分化出的约2cm的幼苗转入盛有生根培养基的生根罐，28℃光照培养14天。

10)幼苗移栽经14天生根培养，将长有发达根系的幼苗移栽温室小盆，罩罩子保湿，3天后去除罩子。经2周缓苗和PCR检测后，将阳性植株移栽大盆，26℃16h光照培养，直至开花结种。

1.3转基因事件的鉴定和筛选

通过TaqMan^TM分析(参见实施例2)检测再生的转基因玉米植株是否存在cp4-epsps基因，并表征草甘膦除草剂耐受性品系的拷贝数。根据插入序列的拷贝数、良好的草甘膦除草剂耐受性和农艺性状表现(参见实施例5)，通过筛选，从375个单独转基因事件中选定了事件KJ7002是优异的，其具有单拷贝转基因、良好的草甘膦除草剂耐受性和农艺性状表现。

实施例2、用TaqMan^TM进行转基因玉米事件KJ7002检测

取转基因玉米事件KJ7002的叶片20mg，提取其基因组DNA。通过Taqman探针荧光定量PCR方法检测cp4-epsps的拷贝数,所用引物及探针序列如下表2中所示。同时以野生型玉米植株作为对照，按照上述方法进行检测分析。

表2检测cp4-epsps用引物探针序列

反应体系10ul如下：

每毫升50×引物探针混合物包含1mM浓度的每种引物各15μL、100μM浓度的探针50ul、无菌水920ul，并且在4℃、在棕色避光试管中贮藏。

扩增程序如下：

利用软件QuantStudio Design&Analysis Software(AppliedBiosystems)分析数据，获得单拷贝的转基因玉米事件。

实施例3、转化体KJ7002插入位点分析及转化体特异性PCR检测

1.试验目的

通过Tail-PCR技术扩增转化体目的基因插入位点的侧翼序列，根据侧翼序列信息建立KJ7002的转化体特异性PCR检测体系。

2.试验材料

目的基因插入位点的分析试验材料以转化体KJ002的基因组DNA为模板，进行Tail-PCR实验分析插入位点信息，同时根据得到的插入位点侧翼序列信息进行特异性PCR验证，以受体B104为非转基因对照。

3.试验方法

1)基因组的提取：

采用CTAB法提取植物叶片DNA

2)插入序列3’端侧翼序列分析方法：

根据文献设计特异引物(参考文献：Liu Y G,High-efficiency thermalasymmetric interlaced PCR for amplification of unknown flankingsequences.Biotechniques,2007)设计特异引物pk0637-R1-1、pk0637-R2-1和pk0637-R3-1，设计Tail-PCR简并引物LAD1、LAD2、LAD3、LAD4和AC1(表3)，以转化体基因组DNA为模板，以pk0637-R1-1引物分别与LAD1、LAD2、LAD3、LAD4进行第一轮Tail-PCR反应；以第一轮扩增产物为模板，pk0637-R2-1和AC1为引物进行第二轮Tail-PCR反应；以第二轮扩增产物为模板，pk0637-R3-1和AC1为引物进行第三轮Tail-PCR反应。经过三轮扩增后，将Tail PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，并对目标带进行回收，以pk0637-R3-1为测序引物进行测序，获得目的基因的插入位点侧翼序列，并通过特异性PCR检测引物确认该插入位点的准确性。

表3引物名称及序列

表4第一轮Tail-PCR的扩增体系

表5第一轮Tail-PCR的扩增程序

表6第二轮Tail-PCR的扩增体系

表7第二轮Tail-PCR的扩增程序

表8第三轮Tail-PCR扩增体系

表9第三轮Tail-PCR扩增程序

2)3’端侧翼序列分析方法：

根据Tail PCR获得的3’端侧翼序列信息在基因组和插入序列上分别设计引物637-3-F(SEQ ID NO：20)和637-3-R(SEQ ID NO：19)，以KJ7002基因组DNA为模板进行扩增，并对扩增产物进行测序和分析，验证Tail PCR结果的准确性，确定目的基因插入位点的具体信息及其侧翼序列的真实情况。

表10T-DNA 3’端插入位置特异PCR检测引物

表11T-DNA 3’端插入位置特异PCR检测扩增体系

组分	组分起始浓度	用量(μl)
			KOD one	2X	25
637-3-R	10μM	1.5
			637-3-F	10μM	1.5
ddH₂O		20
			DNA		2
总体积		50

表12T-DNA 3’端插入位置特异PCR检测反应程序

4)5’端侧翼序列分析方法：

在目的基因插入序列3’端已经找到的插入位点Chr6：70988211的位置的上游(相对于插入序列的上游)和插入序列5’末端序列分别设计引物637-5-F(SEQ ID NO：22)和637-5-R(SEQ ID NO：21)表13，以KJ7002基因组DNA为模板进行扩增，扩增产物进行测序和比对分析，确定目的基因的5’端边界位置及其侧翼序列。

表13T-DNA 5’端插入位置特异PCR检测引物

表14T-DNA 5’端插入位置特异PCR检测扩增体系

组分	组分起始浓度	用量(μl)
			KOD one mix	2X	25
637-5-R	10μM	1.5
			637-5-F	10μM	1.5
ddH₂O		19
			DNA		3
总体积		50

表15T-DNA 5’端插入位置特异PCR检测扩增程序

5)转化体特异性PCR方法的建立

根据获得的转化体KJ7002具体插入序列及其侧翼序列，设计特异性PCR检测所用的5’端和3’端特异性的检测引物，用以定性鉴定转化体KJ7002。5’端特异性检测引物：225-5-F(SEQ ID NO:23)和225-5-R(SEQ ID NO:24)，预期扩增长度259bp；3’端特异性检测引物：225-3-F(SEQ ID NO:25)和225-3-R(SEQ ID NO:26)，预期扩增长度249bp。

根据获得的转化体KJ7002具体插入序列及其旁侧序列，设计特异性PCR检测所用的5’端和3’端特异性的检测引物如表所示。

表16特异性PCR检测引物

特异性PCR反应

根据表17所示体系配制不同模板(植物材料或水)、不同引物对的特异性PCR体系。置于PCR仪中按照表18程序进行反应。

表17特异性PCR反应体系

组分	组分起始浓度	用量(μL)
			KOD one Mix	2×	10
上游引物	10μM	0.6
			下游引物	10μM	0.6
样品总DNA		1
			ddH₂O		5.8
GC enhancer		2
			总体积		20μL

表18特异性PCR程序

4.实验结果

1)插入序列3’端插入位点

根据Tail PCR产物测序结果确定了T-DNA的3’端边界情况：使用数据库B104 ISU_USDA 0.1assembly比对，发现载体序列的第468位正向插入Chr6基因组第70988211的位置(图3)。

根据Tail PCR获得的3’端侧翼序列信息在基因组和插入序列上分别设计引物637-3-R(SEQ ID NO：19)和637-3-F(SEQ ID NO：20)，以KJ7002基因组DNA为模板进行扩增，得到937bp的条带(图4)，对扩增产物进行测序和分析，确定目的基因(T-DNA序列)反向插入到基因组的第6号染色体上，具体位置为Chr6：70988211，与之相连的目的基因序列对应载体序列的第468bp。

2)插入序列5’端插入位点

在目的基因插入序列3’端已经找到的插入位点Chr6：70988211的位置的上游(相对于插入序列的上游)和插入序列5’末端序列分别设计引物637-5-F和637-5-R，以KJ7002基因组DNA为模板进行扩增，扩增得到938bp的PCR产物(图5)，经测序和比对分析，确定目的基因的5’端边界位置为T-DNA的TubA promoter，插入到玉米基因组6号染色体的第70988187bp处。

3)转化体特异性PCR检测结果

随机选取喷洒草甘膦后生长良好的转化体玉米材料KJ7002转化体的T₃、T₄、T₅、T₆代植株各3株为检测样本，以pK0637质粒作为阳性对照，非转基因对照玉米(受体B104)作为阴性对照，以水为模板作为空白对照，以转化体KJM637004作为其他转化体对照，分别利用5’端(SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24)、3’端特异性检测引物(SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26)进行特异性PCR检测。

如图6和图7所示，在T₃-T₆代随机抽取的各3个植株中均能扩增到与理论值大小一致的259bp和249bp目标片段，其他所有对照中均没有扩增出条带，说明转化体的5’端特异性PCR检测和3’端特异性PCR检测体系均具有特异性检测转化体KJ7002的作用，检测结果同时显示KJ7002转化体的外源基因在第6染色体Chr6:70988187-70988211的整合是能够稳定遗传的。

实施例4、通过Southern印迹杂交进行转基因玉米事件KJ7002检测

以载体质粒pk0637作为阳性对照，非转基因玉米受体B104作为阴性对照，以转化体KJ7002不同世代植物作为样本，进行Southern杂交，获得具有转化体特异性的分子杂交图谱。利用Southern杂交分析转基因玉米KJ7002外源插入序列的拷贝数，以及该事件不同世代之间的稳定性。

1.用于Southern印迹杂交的DNA提取

取2g待测样品叶片，加入石英砂、液氮，充分研磨后，将粉末倒入50ml离心管中；

待离心管中液氮挥发完全后，加入10ml DNA提取Buffer，室温下剧烈振荡10-15min；

加入5ml苯酚，轻摇5～10min；再加入5ml氯仿，继续轻摇10～15min；

垂直转头8000rpm，水平转头3800rpm，室温离心10min；

吸取上清，加入等体积异丙醇，轻柔晃动离心管，使异丙醇与上清液充分混匀，可见白色絮状DNA；

将DNA沉淀挑入一新的1.5ml离心管中，加入1ml 70％的乙醇，洗涤沉淀；

沉淀干燥后加入800ul无菌水(含终浓度50μg/ml的RnaseA)溶解，37℃消化RNA0.5～1hr；每管取1ul跑电泳，观察Rnase是否已经被除净；

每管加入蛋白酶K(20mg/ml)10ul，加入10x蛋白酶K buffer稀释至1x，充分混匀。37℃反应1小时；

等体积苯酚/氯仿、氯仿各抽提一次；轻摇10～15min，12000rpm，离心15min；

上清加入1/10倍体积3M NaAC，充分混匀，再加入2.5倍体积预冷的无水乙醇，混匀后，于-20℃放置30min以上，12，500rpm，4℃离心15min，弃上清；

70％乙醇洗涤DNA沉淀，干燥后溶于适量TE或水300μL中；

取少许DNA，琼脂糖凝胶上检查其质量并进行DNA量的标定，其余DNA样品保存在-20℃备用。

2.探针设计

根据pK0637载体中的目的基因序列信息设计目的基因检测的探针引物如19所示。

表19制备探针所用引物信息

3.限制酶消化

取10g待测植株及野生型对照植株的DNA样品用120μl体系进行酶切，所用的酶包括(EcoRⅠ和EcoRⅤ)加入300μl内切酶，酶切过夜，第二天补加75μl内切酶，继续酶切3h。

4.凝胶电泳

a.制备0.7％琼脂糖凝胶，需加EB；制大板胶，用大孔梳子；

b.酶切完后，将酶切产物加入500μl超纯水，加入600μl异丙醇，-20℃沉淀2h，12000rmp离心10min；

c.弃上清，加入75％乙醇洗涤，6000rpm，3min。放置于超净台吹干；

d.加入50μl超纯水溶解，加入6μl 10*lording buffer，56℃水浴3min；

e.上样，静置2min，20V电泳过夜。阳性对照的上样量为10ng。

5.杂交

a.转膜：将胶照相，切掉多余的胶，在右上角切一个角；用去离子水冲洗，放入变性缓冲液中，震荡45min，用去离子水短暂浸泡，再放入中和缓冲液中，震荡30min，倒掉，换新的中和缓冲液，震荡15min；裁滤纸，18×38cm两张，胶块大小两张，尼龙膜胶块大小一张。尼龙膜用去离子水润湿5-10min；找一个白瓷盘，上面放一块玻璃板(先用洗涤剂洗净晾干，再用酒精擦干净)，在白瓷盘中倒入20×SSC，将两张滤纸盖到玻璃板上，用20×SSC润湿且赶走气泡。在滤纸上一次放胶块(倒置)、尼龙膜跟胶块同一位置剪一个角、两张滤纸，每次放都需赶净气泡。用保鲜袋封住四周，然后放上吸水纸，吸水纸上放一块玻璃板，玻璃板用重物压住。转膜1天。

b.DNA固定：转膜结束后，将尼龙膜与胶块接触的一面用铅笔写个正字。将膜用10×SSC冲洗一下，紫外交联仪交联2min。然后用去离子水冲洗，室温晾干。

c.预杂交:预热适量DIG Easy Hyb(10ml/100cm²膜)。同时将膜放入杂交管中，胶联DNA的一面朝上，加入10ml(膜的面积小于100cm²)DIG Easy Hyb，25℃预杂交30min，同时旋转杂交管。

d.杂交：将DIG标记的探针用DIG Easy Hyb稀释至25ng/ml，(3.5ml/100cm²膜)沸水煮5min，迅速放入冰浴；将稀释后的探针加入到预热后的DIG Easy Hyb中，混匀但同时要避免产生气泡；倒掉预杂交液，加入混匀后的探针，42℃杂交过夜，同时旋转杂交管。

e.洗膜：将杂交液倒掉或回收，加20ml 2×SSC含0.1％ SDS，25℃在杂交炉中旋转洗涤5min×2；弃废液，加20ml 0.5×SSC含0.1％ SDS，65℃在杂交炉中旋转洗涤15min×2；当杂交并洗膜后，弃废液，加入20ml Washing buffer，37℃在杂交炉中旋转洗涤5min；弃废液，加100ml Blocking solution 37℃在杂交炉中旋转孵育30min；弃废液，加20mlAntibody solution 37℃在杂交炉中旋转孵育30min；弃废液，加100ml Washing buffer37℃在杂交炉中旋转孵育15min×2；弃废液，加10ml Detection buffer 37℃在杂交炉中旋转孵育5min；将杂交袋剪开，将有DNA的一面朝上放到杂交袋上，加1ml CSPD ready-to-use到膜上，马上用杂交袋第二页盖上，不要有气泡，室温孵育5min；挤出多余液体，如有气泡要挤出，然后用封边机封边；将膜放于37℃反应10min以加强发光反应。

f.成像：将膜放天能发光成像系统中，调整曝光时间1-15min，以获得最佳Southern杂交照片。

6.结果与讨论

cp4-epsps基因的特异性探针杂交结果汇总于表20。

(1)阳性对照的杂交结果：pK0637载体质粒经过只有一个单酶切位点的EcoRI酶切后，以目的基因cp4-epsps特异性探针进行Southern杂交，只检测到一个约10.5kb条带，与预期一致(参见图8中A和B，注：图8中琼脂糖凝胶浓度为1.5％)。由于使用的Marker预先用地高辛标记过，在电泳过程中，其迁移速率比未经标记的样本DNA略慢，导致其指示的条带大小比实际偏小，具体偏差程度见图8中C。

(2)KJ7002事件cp4-epsps基因的特异性探针杂交结果分析

如图8中A所示，当采用EcoRⅠ酶切时，KJ7002转化体T₄、T₅和T₆代材料杂交条带均为15kb左右一条杂交条带，符合大于4.1kb的预期，阴性对照(受体B104)没有任何杂交条带；如图8中B所示，当采用EcoRⅤ酶切时，KJ7002转化体T₄、T₅和T₆代材料杂交条带均只有一条杂交条带位于2322-4361bp正中间，Southern杂交所用Marker为DIG标记，迁移率变慢，电泳迁移率差异对比如图8中C，该图所示2322-4361bp两条带正中间所对应的无DIG标记1kbMarker条带大小为4000bp，因此推断EcoRⅤ酶切时，KJ7002 T₄、T₅和T₆代材料杂交条带大小为约4kb，符合大于3.9kb的预期。对获得侧翼序列进行内切酶酶切位点分析，发现确实在3'端侧翼发现EcoRⅤ酶切位点，且与插入序列EcoRⅤ酶切位点的间距为3956bp，印证了这一条约4kb的Southern杂交条带。阴性对照(受体B104)没有任何杂交条带。两种酶切都表明cp4-epsps基因在基因组中的整合是单拷贝。

表20cp4-epsps基因的特异性探针杂交结果

综上所述，cp4-epsps探针杂交结果表明载体pK0637的T-DNA区域已经以单拷贝的形式整合到事件KJ7002基因组当中，且在不同世代中能够稳定遗传。

实施例5、KJ7002事件的除草剂耐受性检测

1.试验材料和方法

(1)植物材料：转基因玉米事件KJ7002和非转基因玉米受体对照B104。

(2)除草剂：孟山都公司生产41％农达(商家推荐使用剂量：150～250ml/亩，以200ml/亩为1×，400ml为2×，以下类推)

(3)转化体和对照各种植3个重复，相互间隔距离1米以上，行距60cm，株距25cm，按照夏玉米常规播种时间、播种方式和播种量进行播种。设置农药标签推荐剂量4倍中量及清水对照，兑水量450L/公顷，进行苗后茎叶处理，在玉米3-5叶期喷施草甘膦，使用压力恒定、可以记步记时并带有扇形喷头的喷雾器进行除草剂或清水的茎叶喷雾，各除草剂剂量与对照的用水量一致。其他按照当地常规方法管理。

(4)调查和记录

分别在用药后1周、2周和4周调查和记录成苗率、植株高度、药害症状，药害症状包括：生长抑制、褪绿、枯斑、畸形等。

成苗率：喷药前调查小区出苗数，喷药后，调查存活植株数。

植株高度：选取最高的5株。

药害症状：选取药害最轻的5株。

药害症状分级标准按农办农〔2022〕3号执行，具体如下：

0级：生长正常，无任何药害症状，与喷施清水的对照生长一致；

1级：微见药害，心叶发黄或药害斑点占叶面积10％以下；

2级：轻度生长抑制或失绿，药害斑点占叶面积1/4以下；

3级：中等药害，对生长发育影响大，植株矮化或叶畸形或药害斑点占叶面积1/2以下；

4级：药害较重，对生长发育影响大，植株明显矮化或叶严重畸形或药害斑点占叶面积3/4以下；

5级：药害极重，植株死亡或药害斑点占叶面积大于3/4。

玉米收获后，取每小区中间2行选取10穗进行室内考种，测定玉米产量相关的农艺性状。

(3)数据处理

受害率按所示公式计算：

注：X—受害率，单位为百分数(％)；N—同级受害株数；S—级别数；T—总株数；M—最高级别。计算结果保留小数点后两位有效数字。

用方差分析方法比较不同处理的转基因玉米、非转基因对照玉米在成苗率、受害率和株高方面的差异。判别转基因玉米对靶标除草剂草甘膦的耐受水平。

2.结果与分析

(1)成苗率

整个试验阶段，转化体KJ7002和受体对照B104在喷清水条件下的成苗率均为100％。如表21所示，在喷4×草甘膦的条件下，转基因玉米在药后1周、2周、4周调查的成苗率为100％，与清水对照没有差异；受体对照全部死亡，成苗率为0，显著低于清水对照。

表21草甘膦处理不同时间的成苗率(％)

注：数据表示为平均数±标准差。

(2)受害率

表22对转化体KJ7002喷施4倍草甘膦后受害率

注：数据表示为平均数±标准差。

如表22和图9所示，喷施清水后，转基因玉米和非转基因玉米材料均无受害株；转化体KJ7002在喷施4倍量浓度处理下，在1周、2周和4周，能够基本保持良好的生长状态，没有叶片失绿、萎蔫、畸形、株高变矮、生长减缓甚至停滞等中等药害症状产生，计算受害率均在0.9-3.19％之间，都属于轻微药害，4周后受害率降低，植株大部分恢复正常。非转基因玉米在喷施1倍量草甘膦处理3天后即失绿，随时间推移所有植株逐渐萎蔫、干枯、死亡，药害率为100％。因此，根据GB/T19780.42判定转基因玉米KJ7002的草甘膦耐受性级别为高抗。

(3)产量

对转化体KJ7002喷施草甘膦后的产量相关性状进行了跟踪测试，结果如表23所示，表明：转基因玉米KJ7002在喷施4倍浓度草甘膦后，主要产量相关的性状(穗长、穗粗、穗行数、百粒重)与清水对照的转基因材料和清水的非转基因对照相比均有提高，说明即使在喷施4倍浓度草甘膦的情况下，转基因玉米KJ7002的穗部及产量性状也略有改善。由此，进一步表明转基因玉米事件KJ7002具有良好的除草剂(草甘膦)耐受性。

表23转化体KJ7002的产量相关性状

注：数据表示为平均数±标准差，差异显著性分析，使用Turkey’s模型检验，n＝15，小写英文字母相同表示同列数据中差异不显著(P<0.05)，“--”表示植株死亡，无法测量。

Claims

1.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的序列包括序列SEQ ID NO:7或其互补序列；

所述核酸分子来源于转基因玉米事件KJ7002的植物、种子或细胞，所述事件的种子的代表性样本已以保藏编号CCTCC NO:P202409保藏于中国典型培养物保藏中心。

2.一种检测转基因玉米事件KJ7002存在用的DNA引物对，所述引物对包含第一引物和第二引物，其特征在于，所述第一引物为SEQ ID NO:1，所述第二引物为SEQ ID NO:2的互补序列；或者所述第一引物为SEQ ID NO:1的互补序列，所述第二引物为SEQ ID NO:2；并且所述事件的种子的代表性样本已以保藏编号CCTCC NO:P202409保藏于中国典型培养物保藏中心。

3.一种DNA检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求2所述的DNA引物对。

4.一种保护玉米植物免受除草剂引起的损伤的方法，其特征在于，种植至少一种包含转基因玉米事件KJ7002的转基因玉米植物，所述事件的种子的代表性样本已以保藏编号CCTCC NO:P202409保藏于中国典型培养物保藏中心，所述除草剂为草甘膦除草剂。

5.一种控制玉米植物的大田中杂草的方法，其特征在于，包括将有效剂量的草甘膦除草剂施加到种植至少一种包含转基因玉米事件KJ7002的转基因玉米植物的大田中，所述事件的种子的代表性样本已以保藏编号CCTCC NO:P202409保藏于中国典型培养物保藏中心。

6.一种培养对草甘膦除草剂具有耐受性的玉米植物的方法，其特征在于，包括：

将转基因玉米事件KJ7002作为第一亲本玉米植株与缺少对草甘膦除草剂具有耐受性的第二亲本玉米植株有性杂交，从而产生大量子代植株；用有效剂量的草甘膦除草剂喷洒所述玉米植株，收获与其他不具有所述转基因玉米事件KJ7002的植株相比具有减弱的植物损伤的植株；所述事件的种子的代表性样本已以保藏编号CCTCC NO:P202409保藏于中国典型培养物保藏中心。